【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、電極に固定化された遺伝子検出用プローブと検査対象遺伝子とのハイブリダイゼーション操作を行った後、電極に電位を与え、得られた電荷応答量を測定することからなる検査対象遺伝子と遺伝子検出用プローブとのミスマッチ対を検出する方法、より詳細にはヒトなどのゲノムにおける一塩基多型（ＳＮＰｓ）を検出するための方法に関する。また、本発明は、そのための遺伝子検出用プローブ、それが固定化された電極、当該電極を含むＤＮＡチップ、及びそれを用いた一塩基多型（ＳＮＰｓ）を検出するための装置に関する。
【０００２】
【従来の技術】
ヒトゲノムの全塩基配列の解読終了とともに、ゲノム研究の中心は遺伝子の発現機構の解明を目的とした機能ゲノミクスに移行し、塩基配列情報にもとづいた遺伝子診断、遺伝子治療、およびゲノム創薬、さらには、ゲノム塩基配列の個人差（ＳＮＰｓ：一塩基多型）に応じたテーラーメイド医療、への応用が期待されている。例えば、抗癌剤の場合、薬剤の不活性化や活性化にかかわる酵素の遺伝子多型によって、個人個人でこれらの酵素の活性やその産生量に大きな違いの生ずることが報告されている。たとえば、５‐ＦＵ（フルオロウラシル）を不活性化する酵素では個人間の活性の差が１０倍、６‐ＭＰ（メルカプトプリン）やアザチオプリンでは３０倍以上、塩酸イリノテカンでは５０倍以上もの差が遺伝子の差によって生じていると報告されている。ＴＰＭＴ（チオプリンメチルトランスフェラーゼ）の場合、正常な遺伝暗号に対して酵素活性の低下をきたす６種類の遺伝子多型がこれまでに見出されており、副作用を避けるために遺伝子診断（ＳＮＰｓ診断）による投与量の調節が提唱されている。一般に薬剤の濃度は、その代謝酵素の働きが大きく影響し、薬剤代謝酵素遺伝子やトランスポーターやレセプターの遺伝子の違いにより、その効果や副作用に違いが生じることが知られている。
【０００３】
したがって、特定の塩基配列を検出、識別する方法は、これらの目的を達成するうえでの基本技術として重要である。特に、固相表面にあらかじめ塩基配列の分かっているオリゴヌクレオチドを高密度に固定化したＤＮＡチップは、多数の遺伝子を同時並行的に分析することが可能であり、ＤＮＡ塩基配列を調べるツールとして非常に注目されている。しかしながら、現在の蛍光測定を基盤としたＤＮＡチップは、その作製とＤＮＡハイブリダイゼーションの検出に特殊な装置や試薬を必要とし、さらに複雑な操作を必要とすることから、より簡便で効率の良い検出法の開発が期待されている。
近年、ＤＮＡの特定の塩基配列を検出する新しい手法として電気化学応答を基盤とした方法が注目され、様々なアプローチが試みられてきた。ＤＮＡ２本鎖に対して親和性を有するレドックス活性な化学種を利用して、ＤＮＡとの相互作用に起因する電気化学応答をモニターして検出を行う方法が報告されている。竹中らは、ＤＮＡインターカレーターであるフェロセン化ナフタレンジイミドは金電極上に固定化されたＤＮＡ１本鎖と比較してＤＮＡ２本鎖に対して高い親和性を有することを示し、これを利用した電気化学的なＤＮＡハイブリダイゼーションの検出法を報告している（非特許文献１参照）。バートン（Ｂａｒｔｏｎ）らは、ＤＮＡを経由する電子移動を利用したミスマッチ検出のためのプローブとして、ダウノマイシンやメチレンブルーを利用する方法を報告している（非特許文献２参照）。また、別のアプローチとして、レドックス活性分子をオリゴヌクレオチドの特定の部位に共有結合で導入し電気化学フローブとして用いる方法が報告されている（非特許文献３参照）。
【０００４】
このような状況のもと、すでにわれわれは、典型的なレドックス応答分子でなおかつＤＮＡインターカレーターの両者の性質をあわせ持つアントラキノンを特定のＤＮＡ糖部位に導入する一般的かつ効率の良い方法を開発してきた（非特許文献４−５参照）。そして、アントラキノン修飾核酸が、標的ＤＮＡと極めて安定な２重らせんを形成し、これにともなう特異なレドックス変化の観測に成功してきた（非特許文献６−７参照）。また、アントラキノン修飾ＤＮＡをプローブとして用いるＤＮＡセンシング法としてアントラキノン修飾ＤＮＡを表面に固定化した金電極をＤＮＡチップに用いることを計画した（非特許文献８参照）。
【０００５】
【非特許文献１】
Ｓ．Ｔａｋｅｎａｋａ， Ｋ．Ｙａｍａｓｈｉｔａ， ｅｔ ａｌ．， ａＮＡＬ． Ｃｈｅｍ．， ７２， １３３４ （２０００）
【非特許文献２】
Ｅ．Ｍ．Ｂｏｏｎ， Ｊ．Ｋ．Ｂａｒｔｏｎ， ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．， １８，１０９６ （２０００）
【非特許文献３】
Ｃ．Ｊ．Ｙｕ， Ｈ．Ｙｏｗａｎｔｏ， ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ａｍ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ．， １２２， ６７６７ （２０００）
【非特許文献４】
Ｋ．Ｙａｍａｎａ， Ｙ．Ｎｉｓｈｉｊｉｍａ， ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．， １， ３１９−３２４（１９９０）
【非特許文献５】
Ｋ．Ｙａｍａｎａ， Ｔ．Ｍｉｔｓｕｉ， ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， ７， ７１５−７２０（１９９６）
【非特許文献６】
Ｋ．Ｙａｍａｎａ， Ｓ．Ｋｕｍａｍｏｔｏ， ｅｔ ａｌ．， Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｌｅｔｔ．， １１３２−１１３３（２００１）
【非特許文献７】
Ｓ．Ｋｕｍａｍｏｔｏ， Ｈ．Ｎａｋａｎｏ， ｅｔ ａｌ．， Ｅｌｅｃｔｒｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， ７０， ７８９−７９４（２００２）
【非特許文献８】
Ｋ．Ｙａｍａｎａ， Ｓ．Ｋｕｍａｍｏｔｏ， ｅｔ ａｌ．， Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｌｅｔｔ．， ５０６−５０７（２００２）
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、検出用プローブと被検用の核酸をハイブリダイズさせたときに、塩基対にミスマッチが生じているか否かを簡便な方法で精度よく検出、同定することができる方法を提供する。より詳細には、電気化学的方法によりミスマッチを簡便に検出できる方法を提供する。また、本発明は、そのためのプローブ、当該プローブを固定化した電極、プローブを固定化した電極を含むＤＮＡチップ、及びそれらを用いたミスマッチを検出するための装置を提供する。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、すでに、レドックス応答分子や蛍光発色団をＤＮＡ中の所定の位置に特異的に導入する一般的かつ簡便な手法を開発するとともに、得られる標識ＤＮＡ誘導体と対象となる遺伝子の複合体形成に伴う特異なレドックス応答や蛍光挙動について基本的な知見を集積してきた。
本発明者らの開発してきた電気化学的特性を有するＤＮＡチップの特徴は、表面構造を制御した基板上にプローブとなる修飾ＤＮＡを比較的高密度に整列固定化することに加えて、ＤＮＡ２重螺旋の特定の塩基対間にインターカレーターとしての性質と電気化学活性の両性質を有するレドックス分子を配置することにある。これらにより初めて、分子サイズで構造を制御した電極表面の作成が可能となり、ＤＮＡ塩基配列やπ電子構造と電子移動反応の関連を明らかにすることが可能であると考えられた。
そして、この手法を応用することにより電気化学的手段によりフルマッチＤＮＡとミスマッチＤＮＡの識別が可能であるか否かを検討してきたところ、この手法を応用することにより、極めて簡便な方法で電極に固定化した検出用プローブと被検用の核酸とのフルマッチとミスマッチとを識別することができることを見出し、簡便な一塩基多型（ＳＮＰｓ）の検出方法を完成した。
【０００８】
即ち、本発明は、電極に固定化された遺伝子検出用プローブと検査対象遺伝子とのハイブリダイゼーション操作を行った後、電極に電位を与え、得られた電荷応答量を測定することからなる検査対象遺伝子と遺伝子検出用プローブとのミスマッチ対を検出する方法に関する。より詳細には、酸化還元性ユニットを含む遺伝子検出用プローブの酸化還元性ユニットが結合した箇所と、電極との間に存在するミスマッチ対を検出する方法に関する。
また、本発明は、酸化還元性ユニットを含む直鎖状の核酸からなる遺伝子検出用プローブ、より詳細には、酸化還元性ユニットを含む直鎖状の核酸からなる一塩基多型（ＳＮＰｓ）を検出するための遺伝子検出用プローブに関する。
さらに、本発明は、当該遺伝子検出用プローブが金属表面に固定化された金属電極、当該遺伝子検出用プローブが金属表面に固定化された金属電極を有するＤＮＡチップ、及びそれらを用いた一塩基多型（ＳＮＰｓ）を検出するための装置に関する。
【０００９】
本発明者らは、酸化還元性ユニットとしてアントラキノンを有するアントラキノン修飾ＤＮＡを検討してきた。次式（Ｉ）
【００１０】
【化１】
【００１１】
で表される２−メチル−アントラキノン（Ｍｅ−ＡＱ）を用いて、これを核酸の２’位に結合させるために次式（ＩＩ）
【００１２】
【化２】
【００１３】
で表されるアントラキノン修飾ウリジンアミダイド（Ｕ（２’ＡＱ）アミダイド）とし、アミダイド試薬を用いて核酸の２’位に結合させて、次式（ＩＩＩ）
【００１４】
【化３】
【００１５】
で表されるアントラキノン修飾核酸（ＡＱ−ＯＤＮ）を製造した。そしてこのアントラキノン修飾核酸（ＡＱ−ＯＤＮ）を用いて一連の測定を行い、その電気化学的挙動を比較検討してきた。ここで使用したオリゴヌクレオチドは、
ＡＱ−ＯＤＮ； ５’−ＡＣＡＵ（２’ＡＱ）ＧＣＡＧＴＧＴＴＧＡＴ−３’であり、標的となる核酸としては、
標的核酸； ３’−ＴＧＴＡＣＧＴＣＡＣＡＡＣＴＡ−５’
であった。
これらの試料を用いてサイクリックボルタンメトリーの測定を行ってきた。この結果１本鎖の場合と２本鎖になった場合ではピーク電位差（ΔＥ）及びＥ１／２については相補鎖の濃度依存的な変化を観察できることを見出してきた。
【００１６】
これらの実験では、フルマッチのみを対象としてきたが、ミスマッチがある場合についても電気化学的な測定ができるか否かについてさらに検討した。さらに、電極に固定化させてミスマッチの検出ができるか否かを検討した。
前記したアントラキノン修飾ヌクレオシドアミダイトと市販のチオールモディファイヤーを利用してＤＮＡ自動合成機によりアルカンチオールを末端にもつアントラキノン修飾ＤＮＡ（ＯＤＮ−Ａ）及び（ＯＤＮ−Ｂ）を合成した。目的とする修飾ＤＮＡは、高速液体クロマトグラフィーにより精製した。
【００１７】
ＯＤＮ−Ａ；
ＨＳ−（ＣＨ２）６−５’−ＡＣＡＴＧＣＡＧＴＧＴＵ（２’ＡＱ）ＧＡＴ−３’
ＯＤＮ−Ｂ；
ＨＳ−（ＣＨ２）６−５’−ＡＣＡＵ（２’ＡＱ）ＧＣＡＧＴＧＴＴＧＡＴ−３’
このアルカンチオールを末端にもつアントラキノン修飾ＤＮＡを単結晶シリコンウェーハー表面に常法により金を真空蒸着した金電極に固定化した。
被検用の核酸（オリゴヌクレオチド）として次のものを用いた。
＊
３’−ＴＧＴＡＣＡＴＣＡＣＡＡＣＴＡ−５’
（＊印はミスマッチ部を示す。）
また、対照としてフルマッチする核酸を使用した。
【００１８】
これらの試料を用いてクロノクロノメトリー測定を行った。
ＯＤＮ−Ａ及び被検用の核酸を用いた場合の結果を図１に示し、ＯＤＮ−Ｂ及び被検用の核酸を用いた場合の結果を図２に示す。図１及び図２の上段は、電極に固定化された検出用プローブと被検用の核酸がハイブリダイズしている様子を模式的に示しており、図中の×はミスマッチの箇所を模式的に示しており、細長い丸印はアントラキノンがインターカーレートしている箇所を模式的に示している。図１及び図２の下段は、クロノクロノメトリー測定の結果を示している。縦軸は電荷（μＣ）であり、横軸は積分時間（秒）を示している。各図の上側（Ｆｕｌｌｍａｔｃｈ）はフルマッチの核酸を用いた場合を示し、下側（Ｍｉｓｍａｔｃｈ）はミスマッチの核酸を使用した場合を示す。
ＤＮＡ担持量は、ＯＤＮ−Ｂを使用した場合の方がＯＤＮ−Ａを使用した場合よりも約１．５倍多く電極に担持させた。また、いずれの系においても完全鎖ＤＮＡとミスマッチＤＮＡいずれも同等の固定化量であることをサイクリックボルタンメトリー（ＣＶ）の測定により確認した。
コントロール実験となるＯＤＮ−Ｂを用いた系（図２）では、ミスマッチ部を含むＤＮＡと完全鎖ＤＮＡでクロノクロノメトリー測定により区別されないのに対して、ＯＤＮ−Ａを用いた系（図１）では、クロノクロノメトリー測定によりＤＮＡのミスマッチの検出が可能であることを明らかにしている。
【００１９】
このように、核酸中にインターカーレートしている酸化還元性ユニットと、電極の間にミスマッチが生じた場合には、電荷の移動が急激に減少し、クロノクロノメトリーの測定によりミスマッチが生じていることを高精度で簡便に測定し得ることが明らかにされた。
このような結果は、ＤＮＡのπ電子構造を介した電子の移動が塩基対のミスマッチにより大きく変化することによるものと考えられる。したがって、遺伝子検出用プローブ中に設けられた酸化還元性ユニットと電極との間にミスマッチが生じた場合には、電子の移動が大きく変化するが（図１参照）、酸化還元性ユニットと電極との間にミスマッチが無い場合には電子の移動の大きな変動は観察されなかった（図２参照）。
この方法は、電極に固定化された検出用プローブを有する電極とクロノクロノメトリーの測定装置さえあれば、ミスマッチの有無を確実に検出することができることを示しており、本発明の方法により一塩基多型（ＳＮＰｓ）の有無を極めて簡便に検出することが可能となる。
【００２０】
本発明の遺伝子検出用プローブとしては、酸化還元性ユニットを有する１本鎖の核酸であり、その長さには特に制限はないが、酸化還元性ユニットを結合することができる少なくとも１個の塩基部分を有し、正常なハイブリダイズができる塩基配列部分を有し、かつミスマッチの可能性のある塩基配列部分を有するものであればよい。このプローブを金属電極に固定化するためのリンカーは、塩基配列の末端部分に有るのがこのましいが、これに限定されるものではない。ミスマッチの可能性のある塩基配列部分は、電極に固定化するためのリンカーを結合した部分と酸化還元性ユニットを有する部分の間となるように設計するのが好ましい。
本発明のこのようなプローブの好ましい長さとしては、例えば、１０〜１００−ｍｅｒ、好ましくは１０〜５０−ｍｅｒ、より好ましくは１０〜２０−ｍｅｒの塩基長を有するオリゴヌクレオチドが挙げられる。本発明のオリゴヌクレオチドはＤＮＡであってもよりし、ＲＮＡであってもよい。また、天然の核酸の塩基と正常にハイブリダイズできるものであるなら、非天然型の核酸であってもよい。
【００２１】
本発明の酸化還元性ユニットとしては、前記で例示してきたアントラキノン誘導体に限定されるものではなく、例えば、＋１．０〜−１．０Ｖの酸化還元電位を有する物質であって、塩基配列の中に比較的安定にインターカーレートできる平面状の分子であって、ミスマッチの存在によりπ電子の電荷移動に変化が生じる物質であれば特に制限はない。さらに、塩基対間に平衡挿入してインターカーレートするものが好ましい。このような酸化還元性ユニットを形成できる物質としては、アントラキノンなどのキノン類、フェロセンなどのメタロセン類、リボフラビンなどのフラビン類、ポルフィリン類、金属錯体類などが挙げられる。本発明の酸化還元性ユニットとしては、これらの物質の１種又は２種以上を用いることができるが、通常は１つの電極に対して１個の酸化還元性ユニットを使用するのが好ましい。
本発明の酸化還元性ユニットを遺伝子検出用プローブに導入する方法も特に制限はないが、核酸の糖鎖部分に導入するのが好ましい。好ましい位置としては糖残基の２’位が挙げられるが、これに限定されるものではない。本発明の酸化還元性ユニットは、リンカーとなる基を介して糖残基に結合されるのが好ましい。このようなリンカー基としては、炭素数１〜１０、好ましくは１〜５程度のアルキレン基が挙げられる。当該アルキレン基は１個以上の炭素原子が硫黄原子、窒素原子、酸素原子などの異種原子で置換されたものであってもよいし、水酸基、アミノ基、カルボキシル基、アミド基などの官能基を形成する原子団となっていてもよい。酸化還元性ユニットに適当なカルボキシル基や水酸基などの官能基を介してリンカーを結合させ、リンカーの他の端を核酸の糖残基に結合させることにより、酸化還元性ユニットを含む核酸を製造することができる。このようにして製造された核酸を市販のＤＮＡ／ＲＮＡ合成機により目的の核酸（オリゴヌクレオチド）を製造することができる。製造された合成オリゴヌクレオチドを更に他の核酸と結合させて、より長鎖のオリゴヌクレオチドを製造することもできる。
このようにして得られた遺伝子検出用プローブの電気化学的な特性は、当該プローブに完全にハイブリダイズする相補鎖を用いて検証して確認することもできる。
【００２２】
本発明の遺伝子検出用プローブは、電極、好ましくは金属電極に固定化して使用される。電極へ固定化する方法としては公知の任意な方法を採用することができる。例えば、チオール基のような金属表面に吸着できる官能基を有するリンカー基を結合させることにより金属表面に固定化することができる。リンカー基として使用できる物質としては、炭素数１〜１５、好ましくは３〜１０の直鎖状又は分枝状のメルカプトアルカノールが挙げられる。例えば、６−メルカプトヘキサノール、８−メルカプトオクタノールなどが挙げられる。
電極としては、前記した遺伝子検出用プローブを表面に固定化できるものであれば特に制限はない。電極の材料としては、グラファイト、グラシーカーボン等の炭素電極、白金、金、パラジウム、ロジウム等の貴金属電極、酸化チタン、酸化スズ、酸化マンガン、酸化鉛等の酸化物電極、Ｓｉ、Ｇｅ、ＺｎＯ、ＣｄＳ等の半導体電極、チタンなどの電子伝導体を挙げることができるが、前記した遺伝子検出用プローブを表面に容易に固定化できるものが好ましい。好ましい電極としては、少なくとも表面の一部が金である金属電極が挙げられる。
【００２３】
電極を配置する担体または基板としては、疎水性または低親水性の電気絶縁性の材料を用いることが好ましく、このような材料としては、ガラス、セメント、陶磁器等のセラミックスもしくはニューセラミックス、ポリエチレンテレフタレート、酢酸セルロース、ビスフェノールＡのポリカーボネート、ポリスチレン、ポリメチルメタクリレート等のポリマー、シリコン、活性炭、多孔質ガラス、多孔質セラミックス、多孔質シリコン、多孔質活性炭、織編物、不織布、癖紙、短繊維、メンブレンフィルタ等の多孔質物質などを挙げることができるが、各種ポリマー、ガラスもしくはシリコンであることが特に好ましい。これは、表面処理の容易さや電気化学的方法による解析の容易さによるものである。電気絶縁性の担体または基板の厚さは、特に限定されない。
前記した遺伝子検出用プローブが表面に固定化された電極を担体または基板に複数配置することによりミスマッチの検出用のＤＮＡチップとすることができる。この場合には、各電極は、互いに接しないように、かつ規則的に該担体または基板の上に配置されていることが好ましい。電極を設ける前に、該担体または基板上に、電荷を有する親水性の高分子物質からなる層や架橋剤からなる層を設けてもよい。このような層を設けることによって該担体または基板の凹凸を軽減することができる。また、担体または基板の種類によっては、その物質中に電荷を有する親水性の高分子物質を含ませることも可能であり、このような処理を施した担体または基板も好ましく用いることができる。
このようにして製造されたＤＮＡチップを使用することにより、各電極に固定化された遺伝子検出用プローブに対応したミスマッチ（ＳＮＰｓ）を一度に同時に検出可能となる。
【００２４】
本発明は、電極に固定化された遺伝子検出用プローブと検査対象遺伝子とのハイブリダイゼーション操作を行った後、電極に電位を与え、得られた電荷応答量を測定することからなる検査対象遺伝子と遺伝子検出用プローブとのミスマッチ対を簡便かつ高精度で検出する方法を提供するものである。本発明のこのような検出方法は、単一の電極を用いて個別にミスマッチを検出することもできるが、前記したようなＤＮＡチップを用いて、一度に大量のミスマッチを同時に検出することも包含されている。
本発明の検出方法は、電極に固定化された遺伝子検出用プローブと検査対象となる１本鎖の状態の遺伝子（検査対象遺伝子）とを、緩衝液中などでハイブリダイゼーション操作を行い、十分にハイブリダイズさせ、電極に電位を与え、得られた電荷応答量を測定することからなるものである。ハイブリダイゼーションの条件は遺伝子検出用プローブと検査対象遺伝子とが十分にハイブリダイズする条件であればよい。検査対象遺伝子としては、ヒトの遺伝子をはじめ各種の動物や植物、微生物の遺伝子が挙げられる。これらのＤＮＡやＲＮＡを遺伝子検出用プローブの相補鎖として、本発明の検査対象遺伝子とすることができる。
【００２５】
本発明の検出方法としては、電荷応答量を測定できるものであればよく、例えば、クロノクロメトリーのような流れる電流を積算できるものであればよい。測定に当たっては、フルマッチの遺伝子を対照として同時に測定し、フルマッチの遺伝子の測定値と、検査対象遺伝子との測定値とを比較し、両者の差を計測する方法が測定条件の相違に基づく誤差を少なくすることができることから、好ましいが、これに限定されるものではない。図１に示されるように本発明のミスマッチの測定は、積算時間に対応して大きくなることから、予めフルマッチの標準値を設定しておりて、一定の積算時間後に検査対象遺伝子の測定値と比較することにより電荷応答量の相違を測定することもできる。
前記したようなＤＮＡチップを用いて測定した場合には、どの遺伝子検出用プローブが固定化されている電極でミスマッチが生じているかということが、短時間でわかるので、この結果を画像処理して画像により表示することもできる。
したがって、本発明のミスマッチ検出装置は、遺伝子検出用プローブが固定化された電極、電極に電位を与えるための電源装置、電荷応答量を測定するための装置を有するものであるが、遺伝子検出用プローブが固定化された電極として前記してきＤＮＡチップを使用した場合には、さらに電荷応答量を測定した情報を処理する装置、処理結果を表示する装置を含むこともできる。さらに、本発明のミスマッチ検出装置は、ミスマッチの結果として一塩基多型（ＳＮＰｓ）を検出することができるので、一塩基多型（ＳＮＰｓ）を検出するための装置としても使用することができる。
【００２６】
本発明のＤＮＡチップは、実用的な観点からも種々の長所を有している。すなわち、現在用いられている蛍光検出を基盤とするＤＮＡチップは、スタンピング法あるいは光パターニングとＤＮＡ合成の組み合わせ技術で基盤表面にプローブＤＮＡを固定化する方法で作成され、いずれも高価で特殊な装置を必要とするのに対し、本発明のプローブはアルカンチオールの金表面への自己組織化を利用するので単にチオール修飾ＤＮＡプローブ溶液を金電極に侵せきさせるだけでチップの作成が可能である。蛍光ＤＮＡチップでは検出対象となる遺伝子を蛍光標識する必要があるのに対し、本ＤＮＡチップは、電気化学標識したプローブＤＮＡを固定化したものであるため、検出対象ＤＮＡの特別な標識を必要としない。さらに、いままで報告されている電気化学ＤＮＡチップは、ＤＮＡハイブリダイゼーションのモニターとＤＮＡ変異の両方を同時に効率良く検出することが比較的困難であり、いずれの検出にも特別な試薬の添加が必要である。これに対して、本発明のＤＮＡチップは、両者のいずれに対しても有効で、検出の際に特に新たに検出用試薬を加える必要がないことが挙げられる。
【００２７】
【実施例】
以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれら実施例により何ら限定されるものではない。
【００２８】
実施例１ （遺伝子検出用プローブの調製）
アミダイト試薬およびＣＰＧサポートを含むすべてのＤＮＡ合成用試薬は、Ｃｒｕａｃｈｅｍ社のものを使用した。
５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−２’−Ｏ−（２‐アントラキノリルメチル）ウリジンホスホアミダイドの合成は、山名らの方法（Ｋ．Ｙａｍａｎａ， ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．， ７， ７１５ （１９９６））に準じて行った。
ＤＮＡ合成用のアセトニトリルは水素化カルシウム存在下窒素雰囲気中で蒸留を行い、３Ａモレキュラーシーブ上で保存したものを用いた。塩化メチレンは上記と同様の方法で蒸留し、水素化カルシウム上で保存したものを使用した。精製水（ρ＝１７．５ＭΩｃｍ）は、Ｂａｒｎｓｔｅａｄ Ｅａｓｙ Ｐｕｒｅによって作製した。その他の試薬は、すべて特級のものを使用した。
オリゴヌクレオチドの合成は、ＤＮＡ自動合成機（ＡＢＩ３９４ ＤＮＡ／ＲＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ）を用いて行った。得られたオリゴヌクレオチドはアンモニア処理による固相担体からの切り出したのち、２０％変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動により精製した。合成したオリゴヌクレオチドは、酵素分解法により塩基組成の分析を行い、目的のオリゴヌクレオチドであることを確認した。
次のＯＤＮ−Ａ及びＯＤＮ−Ｂの２種類のオリゴヌクレオチドを製造した。
ＯＤＮ−Ａ； ５’−ＡＣＡＴＧＣＡＧＴＧＴＵ（２’ＡＱ）ＧＡＴ−３’
ＯＤＮ−Ｂ； ５’−ＡＣＡＵ（２’ＡＱ）ＧＣＡＧＴＧＴＴＧＡＴ−３’
【００２９】
実施例２ （レドックス修飾ＤＮＡを固定化した金電極の作成）
（１）チオール基を有するアントラキノン修飾ＤＮＡの合成
アルカンチオールを末端にもつアントラキノン修飾ＤＮＡは、実施例１で製造したそれぞれのアントラキノン修飾ヌクレオシドアミダイトと市販のチオールモディファイヤーを利用してＤＮＡ自動合成機により合成した。目的とする修飾ＤＮＡは、高速液体クロマトグラフィーにより精製した。
（２）裸金電極
金電極は、単結晶シリコンウェーハー表面に常法により金を真空蒸着することにより作成した。
（３）修飾ＤＮＡ固定化金電極
前記（２）で作成した金表面を、３０％過酸化水素水−濃硫酸（７：３、体積比）混合溶液で処理したのち、純水およびリン酸緩衝液で洗浄した。金表面（０．０２ｃｍ−２）をチオール基をもつアントラキノン修飾ＤＮＡ（０．１ｍＭ）とメルカプトエタノール（０．５ｍＭ）を含む緩衝溶液（０．１Ｍ ＮａＣｌ、０．１Ｍ ＭｇＣｌ２、０．０１Ｍ ｓｏｄｉｕｍ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）に１２時間含侵してＤＮＡ固定化金電極を作成した。
金表面に固定化されたオリゴヌクレオチドは次のとおりである。
【００３０】
実施例３ （電気化学測定）
電気化学測定（測定機器ＢＡＳ ＣＶ−５０Ｗ）は、作用電極に修飾金電極、参照電極にＡｇ／ＡｇＣｌ、対象電極に白金線を用いた一般的な３電極方式により、脱気したリン酸緩衝液（０．１Ｍ ＮａＣｌ、０．０１Ｍ ｓｏｄｉｕｍ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ、ｐＨ＝７．０）中室温で行った。
ミスマッチを有するオリゴヌクレオチドとして、
３’−ＴＧＴＡＣＡＴＣＡＣＡＡＣＴＡ−５’
を使用し、フルマッチのオリゴヌクレオチドとしては、
３’−ＴＧＴＡＣＧＴＣＡＣＡＡＣＴＡ−５’
を使用した。
結果を図１及び図２二それぞれ示す。図２では、アントラキノンと金表面に変異が存在しないのに対し、図１ではレドックス中心と電極表面間に変異が存在するよう設定した。
ＤＮＡ担持量は、ＯＤＮ−Ｂの方がＯＤＮ−Ａよりも約１．５倍多いこと、また、いずれの系においても完全鎖ＤＮＡとミスマッチＤＮＡいずれも同等の固定化量であることをＣＶ測定により確認した。
コントロール実験となる図２の系では、変異を含むＤＮＡと完全鎖ＤＮＡでクロノクロノメトリー測定により区別されないのに対して、図１の系では、クロノクロノメトリー測定によりＤＮＡ変異の検出が可能であることが明らかにされている。
【００３１】
【発明の効果】
本発明は、酸化還元性ユニットを含む直鎖状のプローブを遺伝子検出用プローブとして用いた電気化学的な手法による核酸のミスマッチを検出する方法に関する。より詳細には、本発明は、遺伝子検出用プローブ中の酸化還元性ユニットと電極との間に存在するミスマッチをクロノクロノメトリー測定などの電気化学的な手法により簡便、正確、かつ短時間に検出する方法を提供するものである。本発明の方法は、ミスマッチの検出により、一塩基多型（ＳＮＰｓ）を検出方法として特に有用である。
現在用いられている一塩基多型（ＳＮＰｓ）を検出方法としては、インベーダー法などの蛍光の検出に基づくものであり、消光剤や特殊な酵素処理を必要とし極めて煩雑な処理が必要であるが、本発明の方法は、電気化学的に電荷応答を測定するだけであり、極めて簡便である。また、ＤＮＡチップは、スタンピング法あるいは光パターニングとＤＮＡ合成の組み合わせ技術で基板表面にプローブＤＮＡを固定化する方法で作成されいずれも高価で特殊な装置を必要とするのに対し、本発明のＤＮＡチップはアルカンチオールの金表面への自己組織化を利用するので単にチオール修飾ＤＮＡプローブ溶液を金電極に侵せきさせるだけでチップの作成が可能であり、チップの製造面からみても極めて簡便に行うことができる。さらに、本発明の方法は、電荷応答の積算値を測定するものであることから、ミスマッチの有無を極めて正確に判別することができ、測定中にも煩雑な処理を必要としないので極めて短時間で正確な判別が可能となる。
このような本発明の酸化還元性ユニットを含む直鎖状の核酸プローブを利用した電気化学的な遺伝子変異の検出方法は、一塩基多型の検出だけでなく、電気化学式のＤＮＡチップやタンパク質センサー等への応用が可能である。
【００３２】
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】図１の上段は、本発明の電極に固定化された遺伝子検出用プローブと被検用の核酸とがハイブリダイズしている様子を模式的に示すものであり、図１の下段はこれらのクロノクロノメトリー測定による結果を示したものである。この結果、フルマッチとミスマッチでは測定結果が大きく異なることが示された。
【図２】図２の上段は、電極に固定化された遺伝子検出用プローブと被検用の核酸とがハイブリダイズしている様子を模式的に示すものであり、図２の下段はこれらのクロノクロノメトリー測定による結果を示したものである。この結果、フルマッチとミスマッチでは測定結果に大きな差が見出せないことが示された。[0001]
TECHNICAL FIELD OF THE INVENTION
The present invention provides a test gene comprising: performing a hybridization operation between a gene detection probe immobilized on an electrode and a test gene; applying a potential to the electrode; and measuring an obtained charge response amount. The present invention relates to a method for detecting a mismatch pair with a probe for gene detection, and more particularly to a method for detecting single nucleotide polymorphisms (SNPs) in a genome of a human or the like. The present invention also relates to a probe for detecting the gene, an electrode to which the probe is immobilized, a DNA chip including the electrode, and an apparatus for detecting single nucleotide polymorphisms (SNPs) using the probe.
[0002]
[Prior art]
With the completion of the decoding of the entire nucleotide sequence of the human genome, the focus of genomic research has shifted to functional genomics to elucidate the mechanism of gene expression, and gene diagnosis, gene therapy, and genomic drug discovery based on nucleotide sequence information, It is expected to be applied to tailor-made medicine according to individual differences in genome base sequences (SNPs: single nucleotide polymorphisms). For example, in the case of an anticancer drug, it has been reported that the activity and production of these enzymes vary greatly in individuals depending on the gene polymorphism of the enzyme involved in the inactivation or activation of the drug. For example, the enzyme that inactivates 5-FU (fluorouracil) has a 10-fold difference in activity between individuals, 6-MP (mercaptopurine) or azathioprine has a 30-fold or greater difference, and irinotecan hydrochloride has a 50-fold or greater difference in gene activity. Reportedly due to differences. In the case of TPMT (thiopurine methyltransferase), six types of gene polymorphisms that cause a decrease in enzyme activity with respect to the normal genetic code have been found so far, and genetic diagnosis (SNPs diagnosis) to avoid side effects. It has been proposed to adjust the dose by In general, it is known that the concentration of a drug is greatly affected by the action of its metabolic enzyme, and the effect and side effect of the drug are different due to differences in the drug metabolizing enzyme gene, transporter and receptor genes.
[0003]
Therefore, a method for detecting and identifying a specific base sequence is important as a basic technique for achieving these objects. In particular, a DNA chip in which oligonucleotides whose base sequences are known in advance are immobilized on a solid phase surface at a high density enables a large number of genes to be analyzed simultaneously and in parallel. Has been noted. However, DNA chips based on current fluorescence measurements require special equipment and reagents for their production and detection of DNA hybridization, and require more complicated operations, making detection simpler and more efficient. The development of the law is expected.
In recent years, a method based on electrochemical response has attracted attention as a new method for detecting a specific base sequence of DNA, and various approaches have been attempted. A method has been reported in which a redox-active chemical species having an affinity for a double-stranded DNA is used to monitor and detect an electrochemical response caused by an interaction with DNA. Takenaka et al. Have shown that a DNA intercalator, ferrocene-naphthalenediimide, has a higher affinity for a double-stranded DNA than a single-stranded DNA immobilized on a gold electrode. A typical method for detecting DNA hybridization is reported (see Non-Patent Document 1). Barton et al. Have reported a method using daunomycin or methylene blue as a probe for mismatch detection using electron transfer via DNA (see Non-Patent Document 2). As another approach, a method has been reported in which a redox active molecule is covalently introduced into a specific site of an oligonucleotide and used as an electrochemical frobe (see Non-Patent Document 3).
[0004]
Under these circumstances, we have already developed a general and efficient method to introduce anthraquinone, which is a typical redox-responsive molecule and has both properties of a DNA intercalator, into a specific DNA sugar site. (See Non-Patent Documents 4-5). Then, the anthraquinone-modified nucleic acid forms an extremely stable double helix with the target DNA, and has succeeded in observing a specific redox change accompanying this (see Non-Patent Documents 6-7). In addition, as a DNA sensing method using an anthraquinone-modified DNA as a probe, a gold electrode having an anthraquinone-modified DNA immobilized on its surface was planned to be used for a DNA chip (see Non-Patent Document 8).
[0005]
[Non-patent document 1]
S. Takenaka, K .; Yamashita, et al. , ANAL. Chem. , 72, 1334 (2000)
[Non-patent document 2]
E. FIG. M. Boon, J.M. K. Barton, et al. , Nat. Biotechnol. , 18, 1096 (2000)
[Non-Patent Document 3]
C. J. Yu, H .; See Wantant, et al. , J. et al. Am. Chem. Soc. , 122, 6767 (2000)
[Non-patent document 4]
K. Yamana, Y .; Nishijima, et al. , Bioconjugate Chem. , 1, 319-324 (1990).
[Non-Patent Document 5]
K. Yamana, T .; Mitsui, et al. , Bioconjugate Chemistry, 7, 715-720 (1996).
[Non-Patent Document 6]
K. Yamana, S.M. Kumamoto, et al. , Chemistry Lett. , 1132-1133 (2001).
[Non-Patent Document 7]
S. Kumamoto, H .; Nakano, et al. , Electrochemistry, 70, 789-794 (2002).
[Non-Patent Document 8]
K. Yamana, S.M. Kumamoto, et al. , Chemistry Lett. , 506-507 (2002).
[0006]
[Problems to be solved by the invention]
The present invention provides a method capable of accurately detecting and identifying whether or not a mismatch has occurred in a base pair when a detection probe and a nucleic acid to be tested are hybridized. More specifically, the present invention provides a method for easily detecting a mismatch by an electrochemical method. The present invention also provides a probe therefor, an electrode on which the probe is immobilized, a DNA chip including the electrode on which the probe is immobilized, and an apparatus for detecting a mismatch using them.
[0007]
[Means for Solving the Problems]
The present inventors have already developed a general and simple method for specifically introducing a redox-responsive molecule or a fluorescent chromophore to a predetermined position in DNA, and have obtained a labeled DNA derivative and a target gene. We have accumulated basic knowledge on the unique redox response and fluorescence behavior associated with complex formation.
The features of the DNA chip having electrochemical characteristics developed by the present inventors are that, in addition to aligning and immobilizing a modified DNA serving as a probe on a substrate whose surface structure is controlled at a relatively high density, a DNA duplex is also provided. It consists in arranging a redox molecule having both properties as an intercalator and electrochemical activity between specific base pairs of the helix. For the first time, it was thought that it was possible to create an electrode surface whose structure was controlled by molecular size, and it was possible to clarify the relationship between the DNA base sequence and the π-electron structure and the electron transfer reaction.
We have examined whether it is possible to discriminate between full-matched DNA and mismatched DNA by electrochemical means by applying this method. By applying this method, we can fix the DNA to the electrodes in a very simple manner. The present inventors have found that a full match and a mismatch between a converted detection probe and a test nucleic acid can be distinguished, and completed a simple method for detecting single nucleotide polymorphisms (SNPs).
[0008]
That is, the present invention provides a test object comprising performing a hybridization operation between a gene detection probe immobilized on an electrode and a gene to be tested, applying a potential to the electrode, and measuring the obtained charge response amount. The present invention relates to a method for detecting a mismatch pair between a gene and a gene detection probe. More specifically, the present invention relates to a method for detecting a mismatch pair existing between a site where a redox unit of a gene detection probe including a redox unit is bonded and an electrode.
The present invention also provides a gene detection probe comprising a linear nucleic acid containing a redox unit, more specifically, a single nucleotide polymorphism (SNPs) comprising a linear nucleic acid containing a redox unit. The present invention relates to a gene detection probe for detection.
Further, the present invention provides a metal electrode having the gene detection probe immobilized on a metal surface, a DNA chip having the metal electrode having the gene detection probe immobilized on a metal surface, and a single-nucleotide using the same. Device for detecting types (SNPs).
[0009]
The present inventors have studied anthraquinone-modified DNA having anthraquinone as a redox unit. The following formula (I)
[0010]
Embedded image
Using 2-methyl-anthraquinone (Me-AQ) represented by the following formula (II) to bind it to the 2′-position of the nucleic acid:
[0012]
Embedded image
An anthraquinone-modified uridine amidite (U (2′AQ) amidide) represented by the formula (III), which is bound to the 2′-position of the nucleic acid using an amidide reagent;
[0014]
Embedded image
An anthraquinone-modified nucleic acid (AQ-ODN) represented by A series of measurements have been performed using this anthraquinone-modified nucleic acid (AQ-ODN), and the electrochemical behavior thereof has been compared and studied. The oligonucleotide used here is
AQ-ODN; 5′-ACAU (2′AQ) GCAGTGTTGAT-3 ′, and as a target nucleic acid,
Target nucleic acid; 3′-TGTACGTCACAACTA-5 ′
Met.
Cyclic voltammetry has been measured using these samples. As a result, the peak potential difference (ΔE) and E 1/2 Has been found to be able to observe a concentration-dependent change in the complementary strand.
[0016]
In these experiments, only the full match was targeted, but it was further examined whether electrochemical measurement can be performed even when there is a mismatch. Furthermore, it was examined whether or not a mismatch could be detected by immobilization on an electrode.
Using an anthraquinone-modified nucleoside amidite and a commercially available thiol modifier, anthraquinone-modified DNAs (ODN-A) and (ODN-B) having alkanethiol-terminated terminals were synthesized by a DNA automatic synthesizer. The target modified DNA was purified by high performance liquid chromatography.
[0017]
ODN-A;
HS- (CH 2 ) 6 -5'-ACATGCAGTGTU (2'AQ) GAT-3 '
ODN-B;
HS- (CH 2 ) 6 -5'-ACAU (2'AQ) GCAGTGTTGAT-3 '
The anthraquinone-modified DNA having alkanethiol at the end was immobilized on a gold electrode obtained by vacuum-depositing gold on the surface of a single-crystal silicon wafer by a conventional method.
The following were used as test nucleic acids (oligonucleotides).
*
3'-TGTACATCACAACTA-5 '
(* Indicates a mismatched part.)
In addition, a nucleic acid that fully matches was used as a control.
[0018]
Chronochronometric measurement was performed using these samples.
FIG. 1 shows the results in the case where ODN-A and the nucleic acid for test are used, and FIG. 2 shows the results in the case of using ODN-B and nucleic acid for test. The upper part of FIG. 1 and FIG. 2 schematically shows a state in which the detection probe immobilized on the electrode and the nucleic acid to be tested are hybridized, and x in the figure schematically shows the mismatched portion. , And an elongated circle schematically shows a place where anthraquinone intercalates. The lower part of FIG. 1 and FIG. 2 shows the result of the chronochronometric measurement. The vertical axis indicates the charge (μC), and the horizontal axis indicates the integration time (second). The upper side (Fullmatch) of each figure shows the case where a full-matched nucleic acid was used, and the lower side (Mismatch) shows the case where a mismatched nucleic acid was used.
The amount of DNA carried on the electrode was approximately 1.5 times greater when ODN-B was used than when ODN-A was used. In addition, it was confirmed by cyclic voltammetry (CV) that the amounts of immobilization of both the completely stranded DNA and the mismatched DNA were the same in all systems.
In the system using ODN-B, which is a control experiment (FIG. 2), the DNA containing the mismatch and the full-strand DNA are not distinguished by chronochronometric measurement, whereas the system using ODN-A (FIG. 1). Discloses that it is possible to detect DNA mismatch by chronochronometric measurement.
[0019]
As described above, when a mismatch occurs between the redox unit intercalating in the nucleic acid and the electrode, the charge transfer is sharply reduced, and the mismatch occurs due to the chronochronometric measurement. It has been clarified that the measurement can be easily and accurately performed.
Such a result is considered to be due to the fact that the transfer of electrons via the π-electron structure of DNA greatly changes due to base pair mismatch. Therefore, when a mismatch occurs between the redox unit and the electrode provided in the probe for gene detection, the transfer of electrons greatly changes (see FIG. 1). When there was no mismatch between the two, no large fluctuation in electron transfer was observed (see FIG. 2).
This method shows that it is possible to reliably detect the presence or absence of a mismatch with only an electrode having a detection probe immobilized on the electrode and a chronochronometric measurement device. The presence or absence of polymorphisms (SNPs) can be detected extremely easily.
[0020]
The probe for gene detection of the present invention is a single-stranded nucleic acid having a redox unit, and its length is not particularly limited, but at least one base capable of binding the redox unit is used. It is sufficient if it has a portion, a base sequence portion capable of normal hybridization, and a base sequence portion having a possibility of mismatch. The linker for immobilizing the probe on the metal electrode is preferably at the terminal of the base sequence, but is not limited thereto. It is preferable that the base sequence portion having a possibility of mismatch is designed so as to be between a portion to which a linker for immobilization to an electrode is bonded and a portion having an oxidation-reduction unit.
The preferred length of such a probe of the present invention includes, for example, an oligonucleotide having a base length of 10 to 100-mer, preferably 10 to 50-mer, more preferably 10 to 20-mer. The oligonucleotide of the present invention may be DNA or RNA. In addition, a non-natural nucleic acid may be used as long as it can normally hybridize with a base of a natural nucleic acid.
[0021]
The redox unit of the present invention is not limited to the anthraquinone derivative exemplified above, and may be, for example, a substance having a redox potential of +1.0 to -1.0 V, and There is no particular limitation as long as it is a planar molecule that can be intercalated relatively stably, and the charge transfer of π electrons changes due to the presence of a mismatch. Furthermore, it is preferable to intercalate by inserting equilibrium between base pairs. Examples of the substance capable of forming such a redox unit include quinones such as anthraquinone, metallocenes such as ferrocene, flavins such as riboflavin, porphyrins, and metal complexes. One or more of these substances can be used as the redox unit of the present invention, but it is usually preferable to use one redox unit for one electrode.
The method for introducing the redox unit of the present invention into a probe for gene detection is not particularly limited, but is preferably introduced into a sugar chain portion of a nucleic acid. Preferred positions include, but are not limited to, the 2 'position of the sugar residue. The redox unit of the present invention is preferably bonded to a sugar residue via a linker group. Examples of such a linker group include an alkylene group having 1 to 10, preferably about 1 to 5 carbon atoms. The alkylene group may be one in which one or more carbon atoms are substituted with a different atom such as a sulfur atom, a nitrogen atom, an oxygen atom, or a functional group such as a hydroxyl group, an amino group, a carboxyl group, or an amide group. It may be an atomic group to be formed. A nucleic acid containing a redox unit is produced by attaching a linker to the redox unit via a suitable functional group such as a carboxyl group or a hydroxyl group, and attaching the other end of the linker to a sugar residue of the nucleic acid. be able to. The nucleic acid thus produced can be used to produce a target nucleic acid (oligonucleotide) using a commercially available DNA / RNA synthesizer. The produced synthetic oligonucleotide can be further bound to another nucleic acid to produce a longer oligonucleotide.
The electrochemical properties of the thus-obtained probe for gene detection can also be verified and verified using a complementary strand that completely hybridizes to the probe.
[0022]
The probe for gene detection of the present invention is used by being immobilized on an electrode, preferably a metal electrode. Any known method can be employed as the method of immobilizing the electrode. For example, it can be immobilized on the metal surface by bonding a linker group having a functional group capable of adsorbing to the metal surface such as a thiol group. Examples of the substance that can be used as a linker group include a linear or branched mercaptoalkanol having 1 to 15, preferably 3 to 10 carbon atoms. For example, 6-mercaptohexanol, 8-mercaptooctanol and the like can be mentioned.
The electrode is not particularly limited as long as the above-described gene detection probe can be immobilized on the surface. Examples of the material of the electrode include a carbon electrode such as graphite and glassy carbon; a noble metal electrode such as platinum, gold, palladium, and rhodium; an oxide electrode such as titanium oxide, tin oxide, manganese oxide, and lead oxide; Si, Ge, and ZnO. And a semiconductor electrode such as CdS, and an electron conductor such as titanium, but those which can easily immobilize the gene detection probe on the surface are preferable. As a preferable electrode, a metal electrode whose surface is at least partly gold is exemplified.
[0023]
As the carrier or substrate on which the electrodes are arranged, it is preferable to use a hydrophobic or low hydrophilic electrically insulating material, such as glass, cement, ceramics such as ceramics or new ceramics, polyethylene terephthalate, Cellulose acetate, polymers such as bisphenol A polycarbonate, polystyrene, polymethyl methacrylate, silicon, activated carbon, porous glass, porous ceramics, porous silicon, porous activated carbon, woven or knitted fabric, nonwoven fabric, habit paper, short fiber, membrane filter And the like. Among them, various polymers, glass and silicon are particularly preferable. This is due to the ease of surface treatment and the ease of analysis by electrochemical methods. The thickness of the electrically insulating carrier or substrate is not particularly limited.
A DNA chip for mismatch detection can be obtained by arranging a plurality of electrodes having the above-described gene detection probes immobilized on the surface thereof on a carrier or a substrate. In this case, it is preferable that the respective electrodes are regularly arranged on the carrier or the substrate so as not to contact each other. Before the electrodes are provided, a layer made of a charged hydrophilic polymer substance or a layer made of a crosslinking agent may be provided on the carrier or the substrate. By providing such a layer, unevenness of the carrier or the substrate can be reduced. In addition, depending on the type of the carrier or the substrate, it is possible to include a charged hydrophilic polymer substance in the substance, and a carrier or a substrate subjected to such a treatment can also be preferably used.
By using the DNA chip manufactured in this way, mismatches (SNPs) corresponding to the gene detection probes immobilized on each electrode can be simultaneously detected.
[0024]
The present invention provides a test gene comprising: performing a hybridization operation between a gene detection probe immobilized on an electrode and a test gene; applying a potential to the electrode; and measuring an obtained charge response amount. An object of the present invention is to provide a method for simply and accurately detecting a mismatch pair with a probe for gene detection. Such a detection method of the present invention can individually detect mismatches using a single electrode, but also includes simultaneously detecting a large amount of mismatches at a time using a DNA chip as described above. Have been.
In the detection method of the present invention, a probe for gene detection immobilized on an electrode and a single-stranded gene to be tested (gene to be tested) are subjected to a hybridization operation in a buffer or the like to sufficiently Hybridization is performed, a potential is applied to the electrode, and the obtained charge response amount is measured. Hybridization conditions may be any conditions under which the gene detection probe and the gene to be tested sufficiently hybridize. Examples of the gene to be tested include genes of various animals, plants, and microorganisms, including human genes. These DNAs and RNAs can be used as the test target gene of the present invention as a complementary strand of the probe for gene detection.
[0025]
The detection method of the present invention may be any method capable of measuring the amount of charge response, and for example, any method capable of integrating a flowing current such as chronochromometry. In the measurement, the full-matched gene is measured simultaneously as a control, the measured value of the full-matched gene is compared with the measured value of the test target gene, and the method of measuring the difference between the two is based on the error based on the difference in the measurement conditions. It is preferable because it can be reduced, but is not limited thereto. As shown in FIG. 1, since the mismatch measurement of the present invention increases in accordance with the integration time, a full-match standard value is set in advance, and after a certain integration time, the measured value of the test target gene and By comparing, the difference in the amount of charge response can be measured.
When the measurement is performed using a DNA chip as described above, it is possible to know in a short time which mismatch detection occurs on the electrode on which the gene detection probe is immobilized. It can also be displayed as an image.
Therefore, the mismatch detection device of the present invention has an electrode to which a gene detection probe is immobilized, a power supply device for applying a potential to the electrode, and a device for measuring the amount of charge response. When the DNA chip described above is used as an electrode to which a probe is immobilized, an apparatus for processing information obtained by measuring the amount of charge response and an apparatus for displaying a processing result may be further included. Furthermore, since the mismatch detection device of the present invention can detect single nucleotide polymorphisms (SNPs) as a result of a mismatch, it can be used as a device for detecting single nucleotide polymorphisms (SNPs).
[0026]
The DNA chip of the present invention has various advantages from a practical viewpoint. That is, a DNA chip based on fluorescence detection currently used is produced by a method of immobilizing probe DNA on a substrate surface by a stamping method or a combined technique of photopatterning and DNA synthesis, all of which are expensive and specialized devices. On the other hand, the probe of the present invention utilizes self-assembly of alkanethiol on the gold surface, so that a chip can be prepared simply by infiltrating the thiol-modified DNA probe solution into the gold electrode. While a fluorescent DNA chip needs to label a gene to be detected with a fluorescent label, the present DNA chip has an immobilized electrochemically labeled probe DNA, and thus requires a special labeling of the DNA to be detected. do not do. Furthermore, it has been relatively difficult for the electrochemical DNA chips reported so far to simultaneously and efficiently detect both DNA hybridization monitoring and DNA mutation, and any detection requires the addition of special reagents. It is. On the other hand, the DNA chip of the present invention is effective for both of them, and there is no need to newly add a detection reagent particularly at the time of detection.
[0027]
【Example】
Hereinafter, the present invention will be described more specifically with reference to examples, but the present invention is not limited to these examples.
[0028]
Example 1 (Preparation of probe for gene detection)
All reagents for DNA synthesis, including the amidite reagent and CPG support, were from Cruchem.
The synthesis of 5'-O-dimethoxytrityl-2'-O- (2-anthraquinolylmethyl) uridine phosphoramidite was carried out by the method of Yamana et al. (K. Yamana, et al., Bioconjugate Chem., 7, 715 ( 1996)).
Acetonitrile for DNA synthesis was distilled in a nitrogen atmosphere in the presence of calcium hydride and used after storage on a 3A molecular sieve. The methylene chloride was distilled in the same manner as described above, and used was stored on calcium hydride. Purified water (ρ = 17.5 MΩcm) was made by Barnstead Easy Pure. All other reagents were of special grade.
Oligonucleotide synthesis was performed using an automatic DNA synthesizer (ABI394 DNA / RNA Synthesizer). The resulting oligonucleotide was cut out of the solid support by ammonia treatment, and then purified by 20% denaturing polyacrylamide gel electrophoresis. The base composition of the synthesized oligonucleotide was analyzed by an enzymatic decomposition method, and it was confirmed that the oligonucleotide was the target oligonucleotide.
The following two types of oligonucleotides, ODN-A and ODN-B, were produced.
ODN-A; 5'-ACATGCAGTGTU (2'AQ) GAT-3 '
ODN-B; 5'-ACAU (2'AQ) GCAGTGTTGAT-3 '
[0029]
Example 2 (Preparation of gold electrode on which redox-modified DNA was immobilized)
(1) Synthesis of anthraquinone-modified DNA having thiol group
An anthraquinone-modified DNA having an alkanethiol at the end was synthesized by an automatic DNA synthesizer using each of the anthraquinone-modified nucleoside amidites prepared in Example 1 and a commercially available thiol modifier. The target modified DNA was purified by high performance liquid chromatography.
(2) Bare gold electrode
The gold electrode was formed by vacuum-depositing gold on the surface of a single-crystal silicon wafer by an ordinary method.
(3) Modified DNA-immobilized gold electrode
The gold surface prepared in the above (2) was treated with a mixed solution of 30% aqueous hydrogen peroxide and concentrated sulfuric acid (7: 3, volume ratio), and then washed with pure water and a phosphate buffer. Gold surface (0.02cm -2 ) Is a buffer solution (0.1 M NaCl, 0.1 M MgCl) containing anthraquinone-modified DNA having a thiol group (0.1 mM) and mercaptoethanol (0.5 mM). 2 , 0.01M sodium phosphate for 12 hours to prepare a DNA-immobilized gold electrode.
The oligonucleotides immobilized on the gold surface are as follows.
[0030]
Example 3 (Electrochemical measurement)
Electrochemical measurement (measuring instrument BAS CV-50W) is a phosphate buffer degassed by a general three-electrode method using a modified gold electrode as a working electrode, Ag / AgCl as a reference electrode, and a platinum wire as a target electrode. (0.1 M NaCl, 0.01 M sodium phosphate, pH = 7.0) at room temperature.
As an oligonucleotide having a mismatch,
3'-TGTACATCACAACTA-5 '
Using as a full-matched oligonucleotide,
3'-TGTACGTCACAACTA-5 '
It was used.
The results are shown in FIGS. 1 and 2, respectively. In FIG. 2, the mutation is not present on the anthraquinone and gold surfaces, whereas in FIG. 1, the mutation is set between the redox center and the electrode surface.
The DNA carrying amount of ODN-B was about 1.5 times larger than that of ODN-A, and that the immobilized amount of both the full-strand DNA and the mismatched DNA was the same in all systems by CV measurement. Confirmed by
In the system of FIG. 2, which is a control experiment, the DNA containing the mutation and the full-strand DNA are not distinguished by chronochronometric measurement, whereas in the system of FIG. 1, the DNA mutation can be detected by chronochronometric measurement. It has been revealed.
[0031]
【The invention's effect】
The present invention relates to a method for detecting a nucleic acid mismatch by an electrochemical method using a linear probe containing a redox unit as a probe for gene detection. More specifically, the present invention provides a simple, accurate, and short-time detection of a mismatch existing between a redox unit and an electrode in a probe for gene detection by an electrochemical method such as chronochronometric measurement. To provide a way to: The method of the present invention is particularly useful as a method for detecting single nucleotide polymorphisms (SNPs) by detecting mismatches.
Currently used methods for detecting single nucleotide polymorphisms (SNPs) are based on the detection of fluorescence such as the invader method, and require a quencher or a special enzyme treatment, and require extremely complicated processing. The method of the present invention is very simple because it only measures the charge response electrochemically. DNA chips are prepared by a method of immobilizing probe DNA on a substrate surface by a stamping method or a combined technique of photo-patterning and DNA synthesis, each of which requires an expensive and special apparatus, whereas the DNA chip of the present invention Since the chip utilizes self-assembly of alkanethiol on the gold surface, it is possible to create a chip simply by infiltrating the thiol-modified DNA probe solution into the gold electrode, and it is extremely simple in terms of chip production. be able to. Furthermore, since the method of the present invention measures the integrated value of the charge response, the presence or absence of a mismatch can be determined very accurately. Thus, accurate discrimination becomes possible.
Such a method for detecting an electrochemical gene mutation using a linear nucleic acid probe containing a redox unit according to the present invention can be used not only for detecting single nucleotide polymorphisms, but also for electrochemical DNA chips and protein sensors. It is possible to apply to etc.
[0032]
[Sequence list]
[Brief description of the drawings]
FIG. 1 is an upper diagram schematically showing a state in which a gene detection probe immobilized on an electrode of the present invention and a test nucleic acid are hybridized, and the lower diagram in FIG. Shows the results of these chronochronometric measurements. As a result, it was shown that the measurement results differ greatly between the full match and the mismatch.
FIG. 2 is a schematic diagram showing a state in which a probe for gene detection immobilized on an electrode and a nucleic acid to be tested are hybridized, and the lower diagram in FIG. It shows the result of chronochronometry measurement. As a result, it was shown that a large difference was not found in the measurement result between the full match and the mismatch.
