JPWO2004035829A1 - Gene detection probe and electrochemical gene detection method - Google Patents

Gene detection probe and electrochemical gene detection method Download PDF

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啓一郎 金谷
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存方 吉田
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Abstract

末端に酸化還元性ユニットを含み、ヘアピン構造をとりうる遺伝子検出用プローブを電極上に固定しDNAチップとして利用することで、試料を標識することなく、簡便かつ高S/N比で標的遺伝子の検出を行う。標的遺伝子の認識に伴うヘアピン構造から二本鎖構造への変化を、電気化学的な系の変化を利用して検出する系を開発した。A gene detection probe containing a redox unit at the end and capable of taking a hairpin structure is immobilized on an electrode and used as a DNA chip, so that the target gene can be easily and at a high S / N ratio without labeling the sample. Perform detection. We have developed a system that detects changes from the hairpin structure to the double-stranded structure associated with target gene recognition using changes in the electrochemical system.

Description

本発明は、電気化学的な核酸の検出を可能にするヘアピン型プローブ、及びこれを固定した標的遺伝子検出用チップ、並びにこれらを用いた電気化学的な核酸の検出法に関する。  The present invention relates to a hairpin probe that enables electrochemical nucleic acid detection, a target gene detection chip on which the hairpin probe is immobilized, and an electrochemical nucleic acid detection method using the same.

ハイブリダイゼーションに基づく遺伝子の解析法として、様々な方法が用いられている。サザンハイブリダイゼーションやノーザンハイブリダイゼーションでは、ゲル電気泳動により分離したDNAやRNAをナイロン膜等に転写し、標識したプローブとのハイブリダイゼーションを行う。DNAチップまたはDNAマイクロアレイ法は、ガラス等の基板に配列の分かっている一群のDNAを高密度に整列化させた状態で固定し、これらをプローブとして、検査対象となるDNAやRNAに対してハイブリダイゼーションを行うことで、ハイスループットな遺伝子解析を可能とする。これらのハイブリダイゼーションによる解析では、プローブまたは検査対象となる核酸のいずれかを放射性化合物または蛍光物質で標識することが一般的である。放射性化合物による標識の場合は、管理区域内での操作が前提であり、利用可能な施設が限られる。一方、蛍光物質による標識では、一般の実験室で操作が可能である反面、検出にレーザー光を用いるため、検出機器が大型化しコストがかかるといった問題点がある。
DNAチップまたはDNAマイクロアレイにおいて、蛍光測定に代わる検出手段として、電気化学的検出法が用いられるようになっている。例えば特許2573443号明細書に開示された方法は、核酸プローブを電極表面に固定化して用いることと、二本鎖核酸に特異的に結合し、かつ電気化学的に活性な二本鎖認識体(挿入剤)を反応系に添加することを特徴とし、核酸プローブと目的遺伝子からなる二本鎖核酸に結合した挿入剤に由来する酸化還元電流を測定するものである。この方法においては検査対象の核酸分子をあらかじめ標識する必要はないが、ハイブリダイゼーションに続いて、測定系への挿入剤の添加、ならびに過剰な挿入剤の除去といった操作が必要となる。また、このような方法では、測定系において、核酸分子に対する挿入剤の結合量を厳密に制御できない。さらに、一つの電極上でプローブごとに異なった挿入剤を用いるなどの測定系の高度な制御は難しいと考えられる。
Various methods are used as gene analysis methods based on hybridization. In Southern hybridization or Northern hybridization, DNA or RNA separated by gel electrophoresis is transferred to a nylon membrane or the like and hybridized with a labeled probe. In the DNA chip or DNA microarray method, a group of DNAs whose sequences are known are fixed on a substrate such as glass in a densely aligned state, and these are used as probes to increase the DNA or RNA to be examined. Hybridization enables high-throughput gene analysis. In these analyzes by hybridization, it is common to label either a probe or a nucleic acid to be examined with a radioactive compound or a fluorescent substance. In the case of labeling with radioactive compounds, operation within the controlled area is premised, and the facilities that can be used are limited. On the other hand, the labeling with a fluorescent substance can be operated in a general laboratory, but uses a laser beam for detection, so that there is a problem that the detection device becomes large and expensive.
In a DNA chip or a DNA microarray, an electrochemical detection method is used as a detection means instead of fluorescence measurement. For example, the method disclosed in Japanese Patent No. 2573443 uses a nucleic acid probe immobilized on the electrode surface, a double-stranded nucleic acid that binds specifically to a double-stranded nucleic acid and is electrochemically active ( An insertion agent) is added to the reaction system, and a redox current derived from the insertion agent bound to a double-stranded nucleic acid comprising a nucleic acid probe and a target gene is measured. In this method, it is not necessary to label the nucleic acid molecule to be examined in advance, but operations such as addition of an intercalating agent to the measurement system and removal of an excessive intercalating agent are required following hybridization. Also, with such a method, the amount of intercalating agent binding to the nucleic acid molecule cannot be strictly controlled in the measurement system. Furthermore, it is considered difficult to perform high-level control of the measurement system, such as using different insertion agents for each probe on one electrode.

本発明は電極に固定した遺伝子検出用プローブに対して、検査対象の核酸を加える他に特別な手続き(検査対象核酸の標識、挿入剤等の添加、酵素の添加など)を必要としない簡便でかつS/N比のよい手法を提供することを課題とする。本発明はまた、単一電極上に複数種の遺伝子検出用プローブを固定し、これらの標的遺伝子の同時検出が可能な手法を提供することも同時に課題とする。
上記課題を解決するために、本発明では、標的遺伝子の認識に伴うヘアピン構造(閉じた構造)から二本鎖構造(開いた構造)への変化を積極的に利用した。すなわち、分子内に互いに相補的な逆向き繰り返し配列とこれらに挟まれた標的遺伝子の認識配列を含むDNA分子を利用した。該DNA分子は、標的遺伝子が存在しない状況では、相補的な逆向き繰り返し配列により安定な分子内二本鎖を形成し、分子全体としてヘアピン状の閉じた構造をとる。標的遺伝子が存在すると、ヘアピン構造におけるループに位置する認識配列により該標的遺伝子を認識し、互いに二本鎖を形成し、開いた構造となる。この過程において、該DNA分子の高次構造は、ヘアピン状態の単独分子から標的遺伝子との二本鎖(ヘアピンの崩壊)へと大きく変化する。
さらに、該DNA分子の一方の末端に酸化還元性ユニットを結合させて、上記のヘアピンの崩壊状態を電気化学的な反応を利用して検出する系を開発した。例えば、上記のヘアピン構造をとる一本鎖核酸からなるプローブの一方の端部に酸化還元性ユニットを結合させ、他方の端部を電極に固定し、これを標的遺伝子とハイブリダイゼーションさせるとヘアピン構造が崩壊して、該電極上での電気化学的な系が変化する。この変化は、電極に固定されたプローブは、標的遺伝子が存在しない状況では、ヘアピン構造をとるため、末端に結合された酸化還元性ユニットが電極表面に近接しているが、標的遺伝子を認識して二本鎖を形成すると、ヘアピン構造が開いて該酸化還元性ユニットが電極表面から遠ざかることによって生じるものと考えられる。この変化を電流等の電気信号の変化として測定し、標的遺伝子の存在を確認できる。
このように、標的遺伝子の認識に際して構造的に最も大きく変化するプローブの末端に酸化還元性ユニットを結合させることで、酸化還元性ユニット−電極間の距離を変化させることにより、酸化還元性ユニットに由来する電気応答を変化させる手法を開発し、本発明を完成させた。
すなわち、本発明は以下のとおりである。
(1)標的遺伝子を認識し得る認識配列を含み、かつ核酸及び核酸類似物の少なくとも一方からなる直鎖状分子と、酸化還元性ユニットと、を有する標的遺伝子検出用のプローブであって、
単独では、二本鎖ステムと一本鎖ループとからなり、該一本鎖ループが該二本鎖ステムにより閉じられたヘアピン構造を形成し、標的遺伝子の存在を示す被検出配列と前記認識配列とが二本鎖を形成することにより、該ヘアピン構造が開かれて、該プローブの一部に被検出配列との2本鎖部分が形成されるために必要な配列を有し、かつ
前記酸化還元性ユニットは、前記ヘアピン構造が形成された場合に前記一本鎖ループ以外で結合または近接する二本の鎖の一方に結合している
ことを特徴とする標的遺伝子検出用のプローブ。
(2)前記ヘアピン構造を形成し得る配列が、互いに相補的な2つの逆向き繰り返し配列と、これらの繰り返し配列の間に設けられた被検出配列に相補的な配列からなる標的遺伝子認識配列と、を有する上記(1)項に記載の標的遺伝子検出用のプローブ。
(3)前記一本鎖分子の少なくとも一部がDNAまたはRNAである上記(1)項または(2)項に記載の標的遺伝子検出用のプローブ。
(4)前記一本鎖分子の少なくとも一部がペプチド核酸であることを特徴とする上記(1)または(2)項に記載の遺伝子検出用のプローブ。
(5)前記酸化還元性ユニットが、次のa)及びb)のいずれかの位置に含まれる上記(1)項〜(4)項のいずれかに記載の遺伝子検出用のプローブ。
a)前記二本鎖ステムを構成する2つの鎖のいずれか一方の鎖。
b)前記直鎖状の分子の一方の末端。
(6)酸化還元性ユニットが、キノン化合物、メタロセン化合物、フラビン化合物及びポルフィリン化合物、金属または金属化合物である上記(1)〜(6)項のいずれかに記載の遺伝子検出用のプローブ。
(7)電極表面を有する担体と、該電極表面に結合した上記(1)項〜(6)項のいずれかに記載の標的遺伝子検出用のプローブとを有する標的遺伝子検出用のチップであって、
前記ヘアピン構造が形成された場合に、前記一本鎖ループ以外で結合または近接する二本の鎖のうちの前記還元性ユニットが結合していない方の鎖の末端領域が前記電極と結合している
ことを特徴とする標的遺伝子検出用のチップ。
(8)異なる複数の標的遺伝子のそれぞれを特定し得る異なる複数のプローブが、各プローブごとに前記電極表面に固定され、かつ、前記複数の標的遺伝子ごとに電気的応答の異なる酸化還元性ユニットが各プローブに結合している上記(7)項に記載の標的遺伝子検出用のチップ。
(9)標的遺伝子をプローブを用いて検出する方法において、
上記(7)項に記載の標的遺伝子検出用のチップの電極表面に、該電極表面に固定された該プローブが前記ヘアピン構造をし得る反応系を形成する工程と、
該反応系中で、試料と前記プローブとを、該試料中に被検出配列が含まれている場合に、該プローブと該被検出配列とのハイブリダイゼーションにより二本鎖を形成させて、該プローブのヘアピン構造が開かれて一本鎖に変換し得る条件下で反応させる工程と、
該反応を経たチップの電極に電位を与え、得られた電流値に基づいて該プローブと該被検出配列とのハイブリダイゼーションの状態を判定する工程と
を有することを特徴とする標的遺伝子の検出方法。
(10)異なる複数の標的遺伝子を認識する複数のプローブを、それぞれのプローブごとに異なる電極に固定したプローブを用いる上記(9)項に記載の標的遺伝子の検出方法。
(11)標的遺伝子をプローブを用いて検出する方法において、
上記(8)項に記載の標的遺伝子検出用のチップの電極表面に、該電極表面に固定された該プローブが前記ヘアピン構造をし得る反応系を形成する工程と、
該反応系中で、試料と前記プローブとを、該試料中に異なる複数の標的遺伝子に対応する被検出配列の少なくとも1種が含まれている場合に、該プローブと該被検出配列とのハイブリダイゼーションによる二本鎖を形成させて、該プローブのヘアピン構造が開かれて二本鎖部分を持たない一本鎖に変換し得る条件下で反応させる工程と、
該反応を経たチップの電極に電位を与え、得られた電流値に基づいて該プローブと該被検出配列とのハイブリダイゼーションの状態を判定する工程と
を有することを特徴とする複数標的遺伝子の同時検出方法。
なお、上記のハイブリダイゼーションの状態とは、通常は、二本鎖を形成しヘアピン構造が崩れたか、ヘアピン構造のままかということを表す。
本発明の遺伝子検出用プローブ及び電気化学的遺伝子検出法を用いることにより、試料となる核酸を調製すること以外に特別な操作をすることなく、目的とする遺伝子を簡便かつ迅速に検出することが可能となる。また、本発明では、標的遺伝子の存否によって、遺伝子検出用プローブ自身の高次構造が変化するため、検出のS/N比が大きく、信頼性の高い検出結果を与えることができる。したがって、微量な遺伝子の検出や、SNPの検出等に有効である。
また、標的遺伝子が異なるプローブのそれぞれについて、電気的応答性が異なる酸化還元性ユニットを用いることにより、これらのプローブを単一電極に固定したDNAチップを構成することが可能である。該DNAチップを用いれば、複数の遺伝子についての同時検出が、簡便かつ低コストで行えるようになる。
本発明の手法は、ヘアピン構造を取りうるDNA分子の末端を酸化還元性ユニットで修飾する以外は、特別な処置を必要とせず、極めて簡便である。プローブと標的遺伝子とのハイブリダイゼーションの条件を設定することにより、標的遺伝子のわずかな配列差異等を高感度に検出することが可能となる。
また、酸化還元性ユニットを配列の種類によって付け替えることができるので、異なる酸化還元電位を有するユニットを連結した種々の配列からなるプローブをひとつの電極上に固定化することによって、複数の標的遺伝子を簡便に検出することができる。
The present invention is simple and does not require special procedures (labeling of test target nucleic acid, addition of intercalating agent, addition of enzyme, etc.) in addition to adding the test target nucleic acid to the gene detection probe fixed to the electrode. It is another object of the present invention to provide a technique having a good S / N ratio. Another object of the present invention is to provide a technique capable of fixing a plurality of types of gene detection probes on a single electrode and simultaneously detecting these target genes.
In order to solve the above problems, in the present invention, a change from a hairpin structure (closed structure) to a double-stranded structure (open structure) associated with recognition of a target gene was positively utilized. That is, a DNA molecule containing reverse repeat sequences complementary to each other in the molecule and a target gene recognition sequence sandwiched between them was used. In the situation where the target gene does not exist, the DNA molecule forms a stable intramolecular double strand by a complementary inverted repeat sequence, and has a hairpin-like closed structure as a whole molecule. When the target gene is present, the target gene is recognized by the recognition sequence located in the loop in the hairpin structure, forms a double strand with each other, and becomes an open structure. In this process, the higher-order structure of the DNA molecule greatly changes from a single molecule in the hairpin state to a double strand (hairpin collapse) with the target gene.
Furthermore, a system has been developed in which a redox unit is bonded to one end of the DNA molecule to detect the decay state of the hairpin using an electrochemical reaction. For example, when a redox unit is bound to one end of a probe composed of a single-stranded nucleic acid having the above hairpin structure, the other end is fixed to an electrode, and this is hybridized with a target gene, the hairpin structure Collapses and the electrochemical system on the electrode changes. This change is due to the fact that the probe fixed to the electrode takes a hairpin structure in the situation where the target gene does not exist, so that the redox unit bound to the end is close to the electrode surface, but the target gene is recognized. When the double strand is formed, it is considered that the hairpin structure is opened and the redox unit is moved away from the electrode surface. This change can be measured as a change in an electrical signal such as a current to confirm the presence of the target gene.
In this way, by coupling the redox unit to the end of the probe that undergoes the largest structural change upon recognition of the target gene, the distance between the redox unit and the electrode is changed, thereby changing the redox unit to the redox unit. A technique for changing the derived electrical response was developed and the present invention was completed.
That is, the present invention is as follows.
(1) A probe for detecting a target gene comprising a linear molecule comprising a recognition sequence capable of recognizing a target gene and comprising at least one of a nucleic acid and a nucleic acid analog, and a redox unit,
Independently, it comprises a double-stranded stem and a single-stranded loop, the single-stranded loop forms a hairpin structure closed by the double-stranded stem, and the detected sequence indicating the presence of the target gene and the recognition sequence Forming a double strand, the hairpin structure is opened, and a portion of the probe has a sequence necessary to form a double-stranded portion with a detected sequence, and the oxidation The reducing unit is a probe for detecting a target gene, wherein when the hairpin structure is formed, the reducing unit is bound to one of two strands that are bound or adjacent to each other except the single-stranded loop.
(2) The sequence capable of forming the hairpin structure is composed of two inverted repeat sequences complementary to each other, and a target gene recognition sequence comprising a sequence complementary to the detected sequence provided between these repeat sequences The probe for detecting a target gene according to the above item (1), comprising:
(3) The probe for detecting a target gene according to (1) or (2) above, wherein at least a part of the single-stranded molecule is DNA or RNA.
(4) The gene detection probe according to (1) or (2) above, wherein at least a part of the single-stranded molecule is a peptide nucleic acid.
(5) The gene detection probe according to any one of (1) to (4) above, wherein the redox unit is contained at any one of the following positions a) and b).
a) One of the two strands constituting the double-stranded stem.
b) One end of the linear molecule.
(6) The gene detection probe according to any one of (1) to (6), wherein the redox unit is a quinone compound, a metallocene compound, a flavin compound, a porphyrin compound, a metal, or a metal compound.
(7) A chip for detecting a target gene comprising a carrier having an electrode surface and the probe for detecting a target gene according to any one of (1) to (6) above bound to the electrode surface. ,
When the hairpin structure is formed, the end region of the strand that is not bound to the reducing unit of the two strands that are bound or adjacent to each other other than the single-stranded loop is bound to the electrode. A chip for detecting a target gene.
(8) A plurality of different probes capable of specifying each of a plurality of different target genes is fixed to the electrode surface for each probe, and redox units having different electrical responses for the plurality of target genes The chip for detecting a target gene according to (7), which is bound to each probe.
(9) In a method for detecting a target gene using a probe,
Forming a reaction system on the electrode surface of the chip for detecting a target gene according to (7) above, in which the probe fixed on the electrode surface can form the hairpin structure;
In the reaction system, when the sample and the probe contain a sequence to be detected, a double strand is formed by hybridization of the probe and the sequence to be detected. A step of reacting under the condition that the hairpin structure of can be opened and converted into a single strand;
A method of detecting a target gene, comprising: applying a potential to the electrode of the chip that has undergone the reaction, and determining a state of hybridization between the probe and the sequence to be detected based on the obtained current value .
(10) The method for detecting a target gene according to (9), wherein a plurality of probes that recognize a plurality of different target genes are fixed to different electrodes for each probe.
(11) In a method for detecting a target gene using a probe,
Forming a reaction system on the electrode surface of the chip for target gene detection described in (8) above, in which the probe fixed on the electrode surface can form the hairpin structure;
In the reaction system, when the sample and the probe contain at least one kind of detected sequences corresponding to a plurality of different target genes, the probe and the detected sequence are high. Forming a double strand by hybridization, and reacting under a condition in which the hairpin structure of the probe is opened and converted into a single strand having no double-stranded portion;
Applying the potential to the electrode of the chip that has undergone the reaction, and determining the state of hybridization between the probe and the sequence to be detected based on the obtained current value. Detection method.
The above-mentioned hybridization state usually indicates whether the hairpin structure is broken by forming a double strand or whether the hairpin structure remains.
By using the gene detection probe and electrochemical gene detection method of the present invention, the target gene can be detected easily and quickly without any special operation other than preparing a nucleic acid as a sample. It becomes possible. In the present invention, since the higher order structure of the gene detection probe itself changes depending on the presence or absence of the target gene, the detection S / N ratio is large, and a highly reliable detection result can be provided. Therefore, it is effective for detecting a very small amount of genes, detecting SNPs, and the like.
In addition, by using a redox unit having different electrical responsiveness for each probe having a different target gene, a DNA chip in which these probes are fixed to a single electrode can be constructed. By using the DNA chip, simultaneous detection of a plurality of genes can be performed easily and at low cost.
The technique of the present invention does not require any special treatment except that the end of a DNA molecule capable of taking a hairpin structure is modified with a redox unit, and is extremely simple. By setting the conditions for hybridization between the probe and the target gene, it is possible to detect a slight sequence difference or the like of the target gene with high sensitivity.
In addition, since the redox unit can be changed depending on the type of sequence, a plurality of target genes can be obtained by immobilizing probes consisting of various sequences linked with units having different redox potentials on one electrode. It can be easily detected.

図1は、本発明における代表的な遺伝子検出用プローブの模式図である。
図2は、本発明における代表的な遺伝子検出のフローを示す図である。
図3は、本発明の遺伝子検出プローブを用いた単一電極・多元検出型のDNAチップの模式図である。プローブ1は酸化還元ユニット1を有し、プローブ2は酸化還元ユニット2を有する。
図4は、アントラキノン修飾型ウリジンヌクレオチドの合成フロー図である。
図5は、ODN2(WT)を検体とした場合のディファレンシャルパルスボルタモグラム(ODN1の標的遺伝子の認識配列に完全にマッチする配列を有する場合)を示す。
図6は、ODN3(G178MU)を検体とした場合のディファレンシャルパルスボルタモグラム(ODN1の標的遺伝子の認識配列とマッチしない配列からなる場合)を示す。
図7は、ODN4(F508)を検体とした場合のディファレンシャルパルスボルタモグラム(ODN1の標的遺伝子の認識配列とマッチしない配列からなる場合)を示す。
図8は、WT、G178MU、F508の3検体について、ディファレンシャルパルスボルタムグラフィーにおける電流量を相対化したグラフである。
図9は、WT、G178MU、F508の3検体について、ディファレンシャルパルスボルタムグラフィーにおけるピーク電流値を相対化したグラフである。
図10は、ODN5の製造工程を示す図であり、DMSOはジメチルスルホキシドを、DTTはジチオスレイトールを示す。
図11は、プローブODN5を用い、ODN2(WT)を検体とした場合のDPV結果を示す。
図12は、プローブODN5を用い、ODN3(G178MU)を検体として用いた場合のDPV結果を示す。
図13は、プローブODN5を用い、ODN4(F508)を検体とした場合のDPV結果を示す。
図14は、S/N比の算定結果を示す。
図15は、実施例4における10サイクル繰り返した場合の電流値の結果を示す。
FIG. 1 is a schematic diagram of a typical gene detection probe in the present invention.
FIG. 2 is a diagram showing a typical gene detection flow in the present invention.
FIG. 3 is a schematic diagram of a single electrode / multiple detection type DNA chip using the gene detection probe of the present invention. The probe 1 has a redox unit 1 and the probe 2 has a redox unit 2.
FIG. 4 is a synthesis flow diagram of an anthraquinone modified uridine nucleotide.
FIG. 5 shows a differential pulse voltammogram when ODN2 (WT) is used as a specimen (when it has a sequence that perfectly matches the recognition sequence of the target gene of ODN1).
FIG. 6 shows a differential pulse voltammogram when ODN3 (G178MU) is used as a specimen (when it consists of a sequence that does not match the recognition sequence of the target gene of ODN1).
FIG. 7 shows a differential pulse voltammogram when ODN4 (F508) is used as a specimen (when it consists of a sequence that does not match the recognition sequence of the target gene of ODN1).
FIG. 8 is a graph in which the amount of current in differential pulse voltamography is relativized for three specimens of WT, G178MU, and F508.
FIG. 9 is a graph in which peak current values in differential pulse voltamgraphy are relativized for three samples of WT, G178MU, and F508.
FIG. 10 is a diagram showing a production process of ODN5, DMSO indicates dimethyl sulfoxide, and DTT indicates dithiothreitol.
FIG. 11 shows the DPV result when the probe ODN5 is used and ODN2 (WT) is used as a sample.
FIG. 12 shows a DPV result when the probe ODN5 is used and ODN3 (G178MU) is used as a sample.
FIG. 13 shows the DPV result when the probe ODN5 is used and ODN4 (F508) is used as a sample.
FIG. 14 shows the calculation result of the S / N ratio.
FIG. 15 shows the results of current values when 10 cycles in Example 4 were repeated.

以下、本発明を詳細に説明する。
本発明における「標的遺伝子検出用プローブ」とは、ハイブリダイゼーション反応に基づいて、検出対象としての標的遺伝子を特定するための配列を有する核酸分子の試料中での存在を検出するための分子をいう。本発明における遺伝子検出用プローブは、酸化還元性ユニットを含む、直鎖状の分子からなり、単独では二本鎖ステムと一本鎖ループからなる閉じたヘアピン構造を取るが、標的遺伝子が存在する条件では該標的遺伝子と二本鎖を形成することにより開いた構造となるような配列的特徴を有しているものである。このようなヘアピン構造を形成し得る構造としては、例えば、分子内に、互いに相補的な逆向き繰り返し配列、ならびに該繰り返し配列の間に標的遺伝子を認識し得る配列をそれぞれ含むものを挙げることができる。
「直鎖状の分子」には、オリゴヌクレオチド等の核酸(DNAまたはRNA)や、化学的に修飾されたヌクレオチド単位からなる核酸類似物(修飾された核酸)や、DNAとRNAを含むいわゆるキメリックヌクレオチド、ペプチド核酸(PNA)の他、ハイブリダイゼーション反応において核酸分子と同様の挙動をし得る他の人工的な直鎖状の分子が含まれる。直鎖状の核酸は例えばDNA合成機等で合成する事が出来、必要により合成されたものをPCRにより増幅してもよい。直鎖状の核酸に類似した分子もそれ自体公知の方法で調製可能である。
「二本鎖ステム」とは、分子内に形成された二本鎖をいい、「一本鎖ループ」とは、二本鎖ステムの形成に伴い、ループ状となった一本鎖の部分をいう。「閉じた構造」とは二本鎖ステムと一本鎖ループからなるヘアピン状の構造をいい、「開いた構造」とは二本鎖ステムが解離した状態をいう。なお、「一本鎖ループ」は必ずしもループ状である必要はなく、ランダムな構造を取り得るが、「閉じた構造」の安定化には寄与しない。
「相補的な逆向き繰り返し配列」とは、ワトソン−クリックの塩基対形成により、分子内で安定した二本鎖を形成しうるものであって、かつ標的遺伝子に対して関連のない任意の配列の組であることが好ましく、その繰り返し単位は3塩基以上であることが好ましく、より好ましい長さは5〜8塩基であるが、一部の適用においてはさらに長い繰り返し単位が適している。また、該繰り返し単位は、遺伝子検出用プローブ分子の両方の末端、ないしは末端近傍に夫々配置されることが好ましい。
「標的遺伝子を認識し得る認識配列」または標的遺伝子の認識配列とは、検出したい遺伝子を特定する被検出配列(塩基配列)と相補的な配列をいい、好ましい長さの範囲は7〜40塩基である。本発明の遺伝子検出用プローブでは、標的遺伝子の認識配列は、相補的な逆向き繰り返し配列の各繰り返し単位の間に挟まれて配置される。このような配列の特徴から、本発明の遺伝子検出用プローブは、標的遺伝子が存在しないか、あるいは標的遺伝子との間でのハイブリダイゼーションの条件が十分でない場合は、相補的な逆向き繰り返し配列同士がハイブリダイズすることにより形成される二本鎖ステム構造と、標的遺伝子の認識配列からなる一本鎖ループ構造より構成される閉じた分子構造を形成する。
従って、「分子内に、互いに相補的な逆向き繰り返し配列、ならびに該繰り返し配列の間に標的遺伝子を認識し得る配列をそれぞれ含む」ことは、「単独では二本鎖ステムと一本鎖ループからなる閉じた構造を取るが、標的遺伝子が存在する条件では該標的遺伝子と二本鎖を形成することにより開いた構造となるような配列的特徴」の典型的な例ということができる。
標的遺伝子を認識し得る配列は、一本鎖ループ構造に位置させることが好ましく、上記の繰り返し配列(ステムを構成する部分)の一方または両方の一部または全部が標的遺伝子を認識し得る配列の一部に含まれる場合があってもよい。
なお、標的遺伝子を特定する被検出配列とは、実際にプローブとのハイブリダイゼーション反応に用いられる分子が含む配列である。この被検出配列は、検出したい標的遺伝子そのものでもよいし、標的遺伝子中に含まれるその標的遺伝子に特有の部分の相補配列でもよい。このような部分配列は、単離した遺伝子から直接得られる断片でもよいし、標的遺伝子の塩基配列から選択した部分配列に基づいて合成されたものでもよい。
このような二本鎖ステム構造と一本鎖ループからなる構造は、一般にヘアピン構造とも呼ばれるが、その構造の安定性は、プローブ分子がDNAやRNAの場合、分子内二本鎖形成にかかわる相補的繰り返し配列の種類と長さの他、該プローブが存在する緩衝液の温度や塩濃度によって影響を受ける。例えば、27塩基からなるオリゴヌクレオチド分子における、5’−TTGAG−3’/5’−CTCAA−3’なる5塩基の相補的な逆向き繰り返し配列の場合、分子内二本鎖形成にかかわるTm値は、50mMのNaClを含む緩衝液中では、実測値に基づき、約54℃と推定される。プローブ分子と標的遺伝子との二本鎖形成におけるTm値は、標的遺伝子の認識配列の種類と長さによって決まり、該配列が20mer以下のときは、Wallaceの法則に従い、Tm値は次式により近似的に与えられる。Tm(℃)=2×(AまたTの数)+4×(GまたはCの数)。20merより大きな配列の場合は、Nearest−neighbor法等、いくつかの計算法が適用されている。
本発明の遺伝子検出用プローブによって標的遺伝子の存在を検出する場合、プローブ分子と標的遺伝子との二本鎖形成におけるTm値は、プローブ分子内の二本鎖形成におけるTm値と同じかそれ以上に設定することが好ましい。標的遺伝子の認識配列の好ましい長さは15から18merであるが、目的に応じてこれより短いものや、長いものも利用可能である。
本発明の標的遺伝子の分析方法では、プローブ単独ではヘアピン構造が維持され、被検出配列を有する分子とプローブとがハイブリダイズした場合にヘアピン構造が解消される条件で試料とプローブとの反応を行う。
緩衝液の塩濃度については、プローブ分子がDNAやRNAである場合は、ハイブリダイゼーションに影響する。陽イオンの存在により二本鎖が安定化されるため、一般に高いイオン強度の場合はTm値が高くなる。一方、プローブ分子がペプチド核酸から成る場合は、イオン強度の影響は少なくなる。
本発明の遺伝子検出用プローブにおいて、標的遺伝子の認識配列をデザインする場合、標的遺伝子そのものの塩基配列、または標的遺伝子が属する遺伝子ファミリーのコンセンサス配列などの配列情報が必要である。配列情報の中から、適切なTm値をもった認識配列を選び出す作業は、目視によっても可能であるが、市販のプライマー設計プログラム、または公共機関等が提供するオンラインのプログラム、例えば Oligo Calculator(http://mbcf.dfci.harvard.edu/docs/oligocalc.html)などが利用可能である。
これに対し、相補的な逆向き繰り返し配列は標的遺伝子とは関係なく任意に設定が可能である。一般には、安定なヘアピン構造の形成に寄与する配列であること、標的遺伝子の認識配列に対して相補性のない配列であること、分子内二本鎖形成におけるTm値が、標的遺伝子との二本鎖形成におけるTm値と同じか、またはそれより低い値を与える配列であることが好ましいが、目的によっては、該繰り返し配列の一方または両方について、その一部または全部が標的遺伝子の認識配列の一部に含まれる場合がある。
各種のプライマー設計プログラムの多くは、分子内二本鎖の形成のしやすさを計算することが可能であるので、配列決定の目安として利用が可能である。
本発明の標的遺伝子検出用プローブでは、酸化還元性ユニットは二本鎖ステムを形成している状態において、この二本鎖ステムを構成する一方の鎖に結合させる。また、二本鎖ステムを構成する二本の鎖が二本鎖ステムの一本鎖ループと反対側に二本鎖ステムからの延長部分を有する場合は、この延長部分の一方に酸化還元性ユニットを結合させてもよい。例えば、酸化還元ユニットは、次のa)及びb)のいずれかの位置に含まれることことが好ましい。
a)二本鎖ステムと一本鎖ループからなる閉じた構造の形成に際して、二本鎖ステムを構成するいずれか一方の鎖上。
b)直鎖状の核酸またはこれに類似した分子のいずれかの末端。
本発明の遺伝子検出用プローブは、単独では二本鎖ステムと一本鎖ループからなる閉じた構造を取りえるが、標的遺伝子を特定するための被検出配列が存在する条件では該被検出配列と二本鎖を形成することにより開いた構造となることを特徴とする。このような標的遺伝子の認識の前後において、構造的に最も大きく変化するのは二本鎖ステムを形成する領域である。本発明においては、このような構造的な変化を電気的な信号の変化として利用することを特徴とする。したがって、酸化還元性ユニットは、本発明の遺伝子検出用プローブにおいて、二本鎖ステムを形成する一方の鎖上に含まれることが好ましく、このような方法としては、互いに相補的な逆向き繰り返し配列の一方の繰り返し単位上に配置するのが好ましい。本発明の遺伝子検出用プローブでは、互いに相補的な逆向き繰り返し配列をプローブの両末端に配置することが好ましいため、プローブを構成する直鎖状の核酸またはこれに類似した分子のいずれかの末端に酸化還元性ユニットを含むことがより好ましい。ここで、「末端」とは、厳密に末端である必要はなく、ヌクレオチド単位で3〜5個分の幅が許容される。すなわち、分子の末端から5番目のヌクレオチドに酸化還元性ユニットを結合させたような場合も「末端」に含むものとみなす。また、目的に応じて直鎖状の核酸またはこれに類似した分子の末端にリンカー分子等を結合させた場合は、該リンカー中に酸化還元性ユニットを含ませてもよい。
酸化還元性ユニットがプローブ分子中に含まれる好ましい形態としては、直鎖状の核酸またはこれに類似した分子(核酸類似物)に直接、あるいはリンカー分子を介して、共有結合的に結合させる場合が挙げられるが、これに限定されない。
本発明の遺伝子検出用プローブに結合させる酸化還元性ユニットは、単独測定(プローブなどと結合していない状態での測定)において、+1.0〜−1.0Vの酸化還元電位を有する物質であることが好ましい。さらに好ましくは、キノン及びその誘導体などのキノン化合物、フラビン及びその誘導体などのフラビン化合物、ポルフィリン及びその誘導体などのポルフィリン化合物、フェロセンなどのメタロセン化合物に代表される有機金属錯体、金属及び金属化合物から選択したものを用いることができる。キノン化合物としては、アントラキノン及びピロロキノリンキノンを挙げることができる。必要に応じて、1つのプローブに複数の酸化還元性ユニットを結合させてもよい。
本発明の代表的な遺伝子検出用プローブについてその模式的構造及び一般的な化学式を図1に示す。化学式においてNは任意のヌクレオチド、Aはアデノシンヌクレオチド、Uはウリジンヌクレオチドを夫々示す。Redoxは酸化還元性ユニットを示す。図中の1はプローブ分子本体を示し、2及び8は相補的な逆向き繰り返し配列を示す。また、3は標的遺伝子の認識配列であり、ヘアピン構造の形成におりて一本鎖ループをなす。10がオリゴヌクレオチドからなる分子であるのに対し、9は6−メルカプトヘキサノールからなるリンカーを示している。4に示す酸化還元性ユニットは、ウリジンヌクレオチドのウラシル塩基に共有結合していることを示している。
プローブ分子(本発明の遺伝子検出用プローブの酸化還元性ユニットを含まない部分)がDNAまたはRNAから成る場合は、市販のDNA/RNA合成機によりこれを合成することが可能である。DNAまたはRNAヌクレオチドに類似した各種の修飾ヌクレオチドを含む核酸から成る場合についても多くの場合、市販のDNA/RNA合成機を利用して合成することが可能である。
プローブ分子にペプチド核酸を含む場合は、ペプチドと同様に液相法や固相法によって合成することができ、合成されたものは市販もされている。ペプチド核酸の合成法については、特表平6−509063号の明細書、米国特許2758988号の明細書、P.E.Nielsen et al.,Journal of American Chemical Society,114,1895−1987(1992)、P.E.Nielsen et al.,Journal of American Chemical Society,114,9677−9678(1992)などに詳細が記載されている。
図2に、本発明の代表的な電気化学的遺伝子検出法について説明する。本発明におけるもっとも好ましい遺伝子検出の形態は、本発明の遺伝子検出用プローブを電極表面に固定した状態で行うものであり、さらに好ましくは、複数種の遺伝子検出用プローブを担体または基板上に配置した電極に固定したDNAチップの状態で行うものである。
図2において、プローブ分子は9の6−メルカプトヘキサノールからなるリンカーの末端に位置する6のチオール基を介して5の電極表面に結合している。標的遺伝子7を認識することによりヘアピン構造が開いて、7と1からなる二本鎖が形成される。このような構造変化に伴い、4の酸化還元性ユニットは電極表面からの距離を変化させ、該距離の変化が電流値の変化として測定されることになる。
本発明の「標的核酸検出用のチップ」とは、適当な担体、例えば基板や各種形状の基体の表面に配置した電極表面に単一種、または複数種からなる本発明の遺伝子検出用プローブを固定したものをいい、複数種のプローブを用いる場合は、単一の電極にこれらを固定してもよいし、あるいは各々のプローブの位置情報がトレースできるように整然と配置された状態で、個別の電極に固定する方法が利用できる。
複数の異なるプローブを用いる場合は、異なる標的遺伝子を認識する異なる複数のプローブ毎に酸化還元ユニットの電気応答性を変えることで、得られる電気応答性から、どのプローブに被検出配列がハイブリダイズしたかを検出することができ、被検出配列とハイブリダイズしたプローブの標的遺伝子認識配列に関する情報に基づいて標的遺伝子を特定することができる。例えば、第1及び第2の2つの標的遺伝子を検出できる系を得るには、第1の標的遺伝子を特定できる第1の被検出配列を有する核酸分子と相補的な配列を有する第1のプローブと、第2の標的遺伝子を特定できる第2の被検出配列を有する核酸分子と相補的な配列を有し、第1のプローブと電気応答の異なる酸化還元ユニットを有する第2のプローブとを、単一電極、またはそれぞれ独立した2つの電極に、領域を分けて固定し、試料と反応させる。試料中に第1の被検出配列を有する核酸分子が存在する場合は、第1のプローブの有する酸化還元ユニットの電気応答の変化により第1の標的遺伝子の検出が可能となり、試料中に第2の被検出配列を有する核酸分子が存在する場合は、第2のプローブの有する酸化還元ユニットの電気応答の変化により第2の標的遺伝子の検出が可能となる。試料にこれらの第1及び第2の被検出配列を有する核酸分子の両方が存在する場合は、第1のプローブの有する酸化還元ユニットの電気応答の変化と、これと異なる第2のプローブの有する酸化還元ユニットの電気応答の変化と、に基づいて第1及び第2の標的遺伝子の検出が可能となる。
本発明のDNAチップでは、本発明の遺伝子検出用プローブが、次のc)及びd)のいずれかの部位と電極表面との結合により、電極表面に固定されていることが好ましい。
c)二本鎖ステム部分と一本鎖ループ部からなる閉じた構造の形成に際して、二本鎖ステムを構成する二本の鎖のうち、酸化還元性ユニットを含まない一方の鎖。
d)直鎖状の核酸またはこれに類似した分子の酸化還元性ユニットを含まない末端。
本発明の遺伝子検出用プローブは、単独では二本鎖ステム部分と一本鎖ループ部からなる閉じた構造を取るが、標的遺伝子を特定する被検出配列が存在する条件では該標的遺伝子と二本鎖を形成することにより開いた構造となることを特徴とする。本発明のDNAチップでは、標的遺伝子の認識の前後において、酸化還元性ユニットの電極に対する距離の変化を電流値として読み取ることにより、遺伝子検出を行うことを特徴とする。従って、当該距離の変化が最も大きくなるようにプローブを固定することが好ましく、このためには、二本鎖ステムを構成する二本の鎖のうち、酸化還元性ユニットを含まない一方の鎖か、プローブを構成する直鎖状の核酸またはこれに類似した分子の酸化還元性ユニットを含まない末端を電極に固定することが好ましい。ここでも「末端」とは厳密に末端である必要はなく、ヌクレオチド単位で3〜5個分の幅が許容される。また、目的に応じて直鎖状の核酸またはこれに類似した分子の末端にリンカー分子等を結合させた場合は、該リンカーと電極表面とを結合させることよって固定することができる。図1に示すプローブの場合、ヌクレオチド鎖の3’端に結合させた6−メルカプトヘキサノールのSH基を電極表面に結合させることにより固定を行う。
図3に示すように、複数種のプローブを単一の電極に固定して用いる方法は、本発明の特徴というべき方法であって、標的遺伝子の異なる複数のプローブのそれぞれについて、電気的応答の互いに異なる酸化還元性ユニットを用いることによって為し得るものである。
たとえば、標的遺伝子が互いに異なるプローブ1及びプローブ2に対して、それぞれアントラキノン及びフェロセンからなる酸化還元性ユニットを用いた場合、ディファレンシャルパルスボルタモグラフィーにおけるヘアピン状態での電流値のピークは、プローブ1では−0.5V付近、プローブ2では+0.3V付近に見られる。従って、これらプローブが同一電極上に固定されていても、測定条件を個々に変えることなく、それぞれのプローブに対応するピーク電流値を読み取ることにより、標的遺伝子1あるいは標的遺伝子2を相互に識別して検出することが可能である。
このような単一電極型・多元解析用DNAチップは、チップの構造を単純なものとすることができ、チップの作成コストや測定にかかるコストを低くできるものと期待される。
本発明の電気化学的遺伝子検出用法に用いられる電極の材料としては、グラファイト、グラシーカーボン等の炭素電極、白金、金、パラジウム、ロジウム等の貴金属電極、酸化チタン、酸化スズ、酸化マンガン、酸化鉛等の酸化物電極、Si、Ge、ZnO、CdS等の半導体電極、チタンなどの電子伝導体を挙げることができるが、金もしくはグラシーカーボンを用いることが特に好ましい。これらの電子伝導体は、導電性高分子によって被覆されていても、単分子膜によって被覆されていてもよい。
電極を配置する担体としては、疎水性または低親水性の電気絶縁性の材料を用いることが好ましく、このような材料としては、ガラス、セメント、陶磁器等のセラミックスもしくはニューセラミックス、ポリエチレンテレフタレート、酢酸セルロース、ビスフェノールAのポリカーボネート、ポリスチレン、ポリメチルメタクリレート等のポリマー、シリコン、活性炭、多孔質ガラス、多孔質セラミックス、多孔質シリコン、多孔質活性炭、織編物、不織布、濾紙、短繊維、メンブレンフィルタ等の多孔質物質などを挙げることができるが、各種ポリマー、ガラスもしくはシリコンであることが特に好ましい。これは、表面処理の容易さや電気化学的方法による解析の容易さによるものである。電気絶縁性の担体または基板の厚さは、特に限定されない。
電極を担体または基板に複数配置する場合、各電極は、互いに接しないように、かつ規則的に該担体または基板の上に配置されていることが好ましい。電極を設ける前に、該担体または基板上に、電荷を有する親水性の高分子物質からなる層や架橋剤からなる層を設けてもよい。このような層を設けることによって該担体または基板の凹凸を軽減することができる。また、担体または基板の種類によっては、その物質中に電荷を有する親水性の高分子物質を含ませることも可能であり、このような処理を施した担体または基板も好ましく用いることができる。
電極表面へのプローブの固定法としては、種々の方法が利用可能であるが、共有結合を介したものが好ましい。このような固定法として、プローブの末端をチオール基を含む化合物、例えば6−メルカプトヘキサノールで修飾しておき、活性化した金電極の表面にチオール結合により固定する方法が挙げられる。このような結合の際、プローブ分子と電極表面の活性基との間に適当な大きさのスペーサー分子を介在させることも可能である。
プローブ分子の固定は、プローブ分子が溶解あるいは分散されてなる水性液を電極表面上に点着して行うことが好ましい。プローブ分子を含む水性液中には、その水性液の粘性を高める添加剤を含有させてもよい。このような添加剤としては、ショ糖、ポリエチレングリコール、グリセロール等を挙げることができる。点着後、所定の温度でそのまま数時間放置するとプローブ分子が固定される。点着は、マニュアル操作によっても行うことができるが、汎用されているDNAチップ作製装置に装備されたスポッタを用いて行うこともできる。点着後は、インキュベーションを行ってもよい。インキュベート後、未固定のプローブ分子を洗浄して除去することが好ましい。
上記のようにして作成されたDNAチップは、検査対象となる核酸に対して直ちに使用することができる。
本発明においては、遺伝子検出用プローブにおける標的遺伝子の認識配列を変えることにより種々の遺伝子の検出を行なうことができる。食品分野では、食品中に含まれる微生物の全体もしくはその一部の塩基配列に相補的な配列を認識配列とする遺伝子検出用プローブを用いた場合には、食品中に含まれる微生物の直接検出を行なうことができ、食品衛生検査が可能になる。このような食品中に含まれる微生物としては、例えば、病原性の大腸菌、ブドウ球菌、サルモネラ菌を挙げることができる。
農林水産業分野では、作物、畜産動物、魚類の病原性微生物もしくはウイルスの検出や、農産物、畜産物の産地や銘柄の検定等に利用可能である。また、遺伝子組換え作物や畜産物の検出にも利用可能である。植物ウイルスもしくはウイロイドの一部の塩基配列に相補的な配列を認識配列としたプローブを用いた場合には、植物に感染した植物ウイルスもしくはウイロイドの検出を行なうことができ、農業分野における感染症診断が可能になる。このような植物ウイルスもしくはウイロイドとしては、例えば、タバコモザイクウイルス、カリフラワーモザイクウイルスを挙げることができる。畜産動物や魚類に感染する病原性微生物もしくはウイルスの全体あるいはその一部の塩基配列に相補的な配列を認識配列とするプローブを用いた場合には、魚類に感染する病原性微生物もしくはウイルスの検出を行なうことができ、畜産分野や水産分野における感染症診断が可能になる。このような病原性ウイルスや微生物としては、例えば、口蹄疫ウイルスや病原性ビブリオを挙げることができる。
医療分野では、人体に感染し、感染症等を引き起こす病原性微生物もしくはウイルス、遺伝病の原因遺伝子、活性化プロトオンコジーン等の検出が可能である。核酸プローブとして人体に感染し、感染症等を引き起こす病原性微生物もしくはウイルスの全体あるいはその一部の塩基配列に相補的な配列を認識配列とするプローブを用いた場合には、感染症診断が可能になる。このような人体に感染して感染症等を引き起こす病原性微生物としては、例えば、病原性微生物であるストレプトコッカス、マイコプラズマ、クロストリジウム、クラミジア、サルモネラ、単純ヘルペス、サイトメガロウイルスを挙げることができる。
遺伝病の原因遺伝子の全体もしくはその一部の塩基配列に相補的な配列を認識配列とするプローブを用いた場合には、遺伝病の直接検定が可能になる。このような遺伝病の原因遺伝子としては、例えば、アデノシンデアミナーゼ欠損症、鎌形赤血球貧血の原因遺伝子を挙げることができる。
活性化プロトオンコジーンの全体もしくはその一部の塩基配列に相補的な配列を認識配列とするプローブを用いた場合には、癌診断が可能になる。このような活性化プロトオンコジーンとしては、例えば、癌遺伝子データブック(渋谷正史、秀潤社)に記載の癌遺伝子を挙げることができる。
遺伝病の原因遺伝子や、他の病気への罹りやすさ、薬の利きやすさ等については、遺伝子上の一塩基多型(SNP)によって決定される場合がある。このような遺伝子の検出においては、当該遺伝子そのものの存在や遺伝子の発現量について検出するのではなく、検体ごとにことなる遺伝子上のわずかな構造上の差異について識別することが必要である。本発明では、より厳密なハイブリダイゼーションの条件を用いることにより、検体におけるSNPの有無を検出することが可能である。
本発明の遺伝子検出方法では、まず、検査対象となる核酸を各種材料や生体組織からの抽出操作等により調製する。生体組織からDNAを調製する場合、試薬メーカー等が提供する各種のDNAキット、例えば、血液からの調製に適したGet pureDNA Kit−Blood(同仁化学社製)や、毛髪からの調製に適したISOHAIR(ニッポンジーン社製)等が利用可能である。調製された核酸は必要に応じて、例えばポリメラーゼ連鎖反応(PCR)などにより増幅したり、RNAの場合は逆転写反応により対応するDNAに変換して用いることができる。
次に、DNAチップを用いて上記操作で得た核酸と本発明の遺伝子検出用プローブとのハイブリダイゼーションを行う。本発明では、ハイブリダイゼーションの前に、核酸を標識する等の化学的な処理を必要としないが、核酸試料が二本鎖DNAの場合は、熱処理によって変性し、一本鎖としてハイブリダイゼーションに用いることが好ましい。ハイブリダイゼーションは、本発明の遺伝子検出用プローブに、核酸が溶解あるいは分散してなる試料溶液を接触させることによって実施する。ハイブリダイゼーションは、20〜40℃の温度範囲で、そして1〜24時間の範囲で実施することが好ましいが、電極に固定するプローブ分子の鎖長、試料核酸の種類などに応じて、ハイブリダイゼーションの最適条件を設定することが望ましい。ハイブリダイゼーション終了後は、洗浄を行い、未反応の試料核酸断片を除去することが好ましい。
本発明のDNAチップを用いた遺伝子検出法では、核酸試料とのハイブリダイゼーションの後、特別な操作を経ることなく直ちに、電流値の測定を行うことができる。電流量の測定は、電極と酸化還元性ユニットとの間を流れる電流量が測定できる方法であれば如何なる方法であってもよい。サイクリックボルタモグラフィ(CV)、デファレンシャルパルスボルタモグラフィ(DPV)、リニアスィープボルタモグラフィ、ポテンショスタット等を用いることが好ましい。カウンタ電極と遺伝子検出用プローブが固定された電極を電解質溶液に浸漬し、一対の電解系を形成させ、デファレンシャルパルスボルタモグラフィを測定することが特に好ましい。ファレンシャルパルスボルタモグラフィを測定することが特に好ましい。
DPVでは、プローブに用いた酸化還元性ユニットの酸化還元電位に従い、プローブに固有の電位でのピーク電流が得られる。このピーク電流は、プローブがヘアピン構造をとっている時に最大であり、プローブと標的遺伝子が二本鎖を形成している時に最小となる。標的遺伝子ごとに電気的応答の異なる酸化還元性ユニットを用いた、複数種の遺伝子検出用プローブを単一の電極に固定したDNAチップの場合は、個々のプローブごとにピーク電流を与える固有の電位が存在するため、DPVにおいてこれらの電位におけるピーク電流の変化をトレースすることにより、それぞれの標的遺伝子について検出を行うことができる。
なお、試料とプローブとの反応において未反応のプローブのヘアピン構造を維持し、標的配列と二本鎖を形成する反応系の溶媒、並びにプローブと標的配列との二本鎖形成の電流の変化に基づく検出における溶媒としては、1〜100mMのMgClを含む中性から弱塩基性の緩衝液を用いるのが望ましい。10mMトリス−塩酸、1mMEDTAからなる緩衝液(pH8.0)を用い、MgCl濃度を3〜10mMの範囲で用いるのが特に望ましい。
Hereinafter, the present invention will be described in detail.
The “target gene detection probe” in the present invention refers to a molecule for detecting the presence in a sample of a nucleic acid molecule having a sequence for specifying a target gene as a detection target based on a hybridization reaction. . The gene detection probe in the present invention is composed of a linear molecule containing a redox unit, and has a closed hairpin structure consisting of a double-stranded stem and a single-stranded loop alone, but has a target gene. Under the conditions, the target gene has a sequence characteristic such that an open structure is formed by forming a double strand with the target gene. Examples of the structure capable of forming such a hairpin structure include, for example, those that each include a reverse repeat sequence complementary to each other and a sequence capable of recognizing a target gene between the repeat sequences. it can.
“Linear molecules” include nucleic acids (DNA or RNA) such as oligonucleotides, nucleic acid analogues (modified nucleic acids) consisting of chemically modified nucleotide units, and so-called textures containing DNA and RNA. Rick nucleotides, peptide nucleic acids (PNA), and other artificial linear molecules that can behave like nucleic acid molecules in hybridization reactions are included. The linear nucleic acid can be synthesized by, for example, a DNA synthesizer, and the synthesized nucleic acid may be amplified by PCR if necessary. Molecules similar to linear nucleic acids can be prepared by methods known per se.
“Double-stranded stem” refers to the double strand formed in the molecule, and “single-stranded loop” refers to the single-stranded portion that has become a loop as the double-stranded stem is formed. Say. “Closed structure” refers to a hairpin-like structure composed of a double-stranded stem and a single-stranded loop, and “open structure” refers to a state where the double-stranded stem is dissociated. The “single-stranded loop” does not necessarily have a loop shape and can take a random structure, but does not contribute to stabilization of the “closed structure”.
“Complementary inverted repeat sequence” is any sequence that is capable of forming a stable duplex within a molecule by Watson-Crick base pairing and is not related to the target gene. The repeating unit is preferably 3 bases or more, and more preferably 5 to 8 bases, but longer repeating units are suitable for some applications. Further, it is preferable that the repeating unit is arranged at both ends of the gene detection probe molecule or in the vicinity of the ends.
The “recognition sequence capable of recognizing the target gene” or the recognition sequence of the target gene refers to a sequence complementary to a sequence to be detected (base sequence) that specifies a gene to be detected, and a preferable length range is 7 to 40 bases. It is. In the gene detection probe of the present invention, the target gene recognition sequence is sandwiched between the repeating units of the complementary inverted repeat sequence. Because of such sequence characteristics, the gene detection probe according to the present invention has complementary reverse repeat sequences in the absence of the target gene or when the conditions for hybridization with the target gene are not sufficient. Forms a closed molecular structure composed of a double-stranded stem structure formed by hybridizing and a single-stranded loop structure composed of a recognition sequence of the target gene.
Therefore, “including a reverse repeat sequence complementary to each other in the molecule, and a sequence capable of recognizing a target gene between the repeat sequences” means that “from a double-stranded stem and a single-stranded loop alone. It can be said to be a typical example of a “sequence feature that takes a closed structure, but becomes an open structure by forming a double strand with the target gene under conditions where the target gene is present”.
The sequence capable of recognizing the target gene is preferably located in a single-stranded loop structure, and a part or all of one or both of the above repetitive sequences (parts constituting the stem) of the sequence capable of recognizing the target gene It may be included in some.
In addition, the sequence to be detected that specifies the target gene is a sequence that is included in a molecule that is actually used in a hybridization reaction with a probe. This target sequence may be the target gene itself to be detected, or may be a complementary sequence of a portion specific to the target gene contained in the target gene. Such a partial sequence may be a fragment obtained directly from the isolated gene, or may be synthesized based on a partial sequence selected from the base sequence of the target gene.
Such a structure consisting of a double-stranded stem structure and a single-stranded loop is generally called a hairpin structure. However, when the probe molecule is DNA or RNA, the stability of the structure is complementary to the intramolecular double-stranded formation. In addition to the type and length of the repetitive sequence, it is influenced by the temperature and salt concentration of the buffer in which the probe is present. For example, in the case of an oligonucleotide molecule consisting of 27 bases, 5m-TTGAG-3 '/ 5'-CTCAA-3' complementary reverse repeat sequence of 5 bases, Tm value related to intramolecular duplex formation Is estimated to be about 54 ° C. in a buffer containing 50 mM NaCl based on the actual measurement. The Tm value in duplex formation between the probe molecule and the target gene is determined by the type and length of the recognition sequence of the target gene. When the sequence is 20 mer or less, the Tm value is approximated by the following equation according to Wallace's law: Given. Tm (° C.) = 2 × (number of A or T) + 4 × (number of G or C). In the case of a sequence larger than 20 mer, several calculation methods such as Nearest-neighbor method are applied.
When the presence of the target gene is detected by the gene detection probe of the present invention, the Tm value in the double strand formation between the probe molecule and the target gene is equal to or higher than the Tm value in the double strand formation in the probe molecule. It is preferable to set. The preferred length of the target gene recognition sequence is 15 to 18 mer, but shorter or longer ones can be used depending on the purpose.
In the target gene analysis method of the present invention, the hairpin structure is maintained by the probe alone, and the reaction between the sample and the probe is performed under the condition that the hairpin structure is eliminated when the molecule having the sequence to be detected and the probe are hybridized. .
The salt concentration of the buffer solution affects the hybridization when the probe molecule is DNA or RNA. Since the double strand is stabilized by the presence of the cation, the Tm value generally increases at high ionic strength. On the other hand, when the probe molecule is composed of peptide nucleic acid, the influence of ionic strength is reduced.
When designing a recognition sequence for a target gene in the gene detection probe of the present invention, sequence information such as the base sequence of the target gene itself or the consensus sequence of the gene family to which the target gene belongs is necessary. The operation of selecting a recognition sequence having an appropriate Tm value from the sequence information can be performed by visual observation, but a commercially available primer design program or an online program provided by a public institution such as Oligo Calculator (http) : /Mbcf.dfci.harvard.edu/docs/oligocalc.html) and the like.
On the other hand, the complementary inverted repeat sequence can be arbitrarily set regardless of the target gene. In general, it is a sequence that contributes to the formation of a stable hairpin structure, a sequence that is not complementary to the recognition sequence of the target gene, and the Tm value in intramolecular duplex formation is It is preferable that the sequence gives a value equal to or lower than the Tm value in the formation of this strand, but depending on the purpose, a part or all of one or both of the repetitive sequences may be a recognition sequence of the target gene. May be included in some.
Many of the various primer design programs can calculate the ease of formation of intramolecular duplexes, and can therefore be used as a guide for sequencing.
In the target gene detection probe of the present invention, the redox unit is bound to one strand constituting the double-stranded stem in a state where the double-stranded stem is formed. When the two strands constituting the double-stranded stem have an extended portion from the double-stranded stem on the opposite side of the single-stranded loop of the double-stranded stem, one of the extended portions has a redox unit. May be combined. For example, the redox unit is preferably included in any one of the following positions a) and b).
a) On formation of a closed structure consisting of a double-stranded stem and a single-stranded loop, on any one of the strands constituting the double-stranded stem.
b) Either end of a linear nucleic acid or similar molecule.
The gene detection probe of the present invention alone can take a closed structure consisting of a double-stranded stem and a single-stranded loop, but under the condition that the detected sequence for specifying the target gene exists, It is characterized by having an open structure by forming a double strand. The region that forms the double-stranded stem has the largest structural change before and after the recognition of the target gene. In the present invention, such a structural change is used as a change in an electrical signal. Therefore, the redox unit is preferably contained on one strand forming a double-stranded stem in the gene detection probe of the present invention. As such a method, reverse repeat sequences complementary to each other are used. It is preferable to arrange on one of the repeating units. In the probe for gene detection of the present invention, it is preferable to arrange inverted repeat sequences complementary to each other at both ends of the probe, so that either end of a linear nucleic acid constituting the probe or a molecule similar thereto It is more preferable to contain a redox unit. Here, the “terminal” does not need to be strictly a terminal, and a width of 3 to 5 nucleotides is allowed. That is, the case where the redox unit is bound to the fifth nucleotide from the end of the molecule is also considered to be included in the “terminal”. In addition, when a linker molecule or the like is bound to the end of a linear nucleic acid or a similar molecule depending on the purpose, a redox unit may be included in the linker.
A preferred form in which the redox unit is contained in the probe molecule is a case where it is covalently bound to a linear nucleic acid or a similar molecule (nucleic acid analogue) directly or via a linker molecule. Although it is mentioned, it is not limited to this.
The redox unit bound to the gene detection probe of the present invention is a substance having a redox potential of +1.0 to -1.0 V in a single measurement (measurement in a state where it is not bound to a probe or the like). It is preferable. More preferably, selected from quinone compounds such as quinone and derivatives thereof, flavin compounds such as flavin and derivatives thereof, porphyrin compounds such as porphyrin and derivatives thereof, organometallic complexes represented by metallocene compounds such as ferrocene, metals and metal compounds. Can be used. Examples of the quinone compound include anthraquinone and pyrroloquinoline quinone. If necessary, a plurality of redox units may be bound to one probe.
FIG. 1 shows a schematic structure and a general chemical formula of a typical gene detection probe of the present invention. In the chemical formula, N represents an arbitrary nucleotide, A represents an adenosine nucleotide, and U represents a uridine nucleotide. Redox represents a redox unit. In the figure, 1 indicates the probe molecule body, and 2 and 8 indicate complementary inverted repeat sequences. Reference numeral 3 denotes a target gene recognition sequence, which forms a hairpin structure and forms a single-stranded loop. While 10 is a molecule composed of an oligonucleotide, 9 represents a linker composed of 6-mercaptohexanol. The redox unit shown in 4 indicates that it is covalently bound to the uracil base of the uridine nucleotide.
When the probe molecule (portion not including the redox unit of the gene detection probe of the present invention) is composed of DNA or RNA, it can be synthesized by a commercially available DNA / RNA synthesizer. In many cases, nucleic acids containing various modified nucleotides similar to DNA or RNA nucleotides can be synthesized using a commercially available DNA / RNA synthesizer.
When a peptide nucleic acid is contained in the probe molecule, it can be synthesized by a liquid phase method or a solid phase method in the same manner as a peptide, and the synthesized one is also commercially available. Regarding the method for synthesizing peptide nucleic acids, the specification of JP-T-6-509063, the specification of US Pat. E. Nielsen et al. , Journal of American Chemical Society, 114, 1895-1987 (1992), p. E. Nielsen et al. , Journal of American Chemical Society, 114, 9679-9678 (1992).
FIG. 2 illustrates a typical electrochemical gene detection method of the present invention. The most preferable form of gene detection in the present invention is performed in a state where the gene detection probe of the present invention is fixed to the electrode surface, and more preferably, a plurality of types of gene detection probes are arranged on a carrier or a substrate. This is performed in the state of a DNA chip fixed to the electrode.
In FIG. 2, the probe molecule is bonded to the surface of 5 electrodes via 6 thiol groups located at the end of a linker consisting of 9 6-mercaptohexanol. Recognizing the target gene 7 opens the hairpin structure and a double strand consisting of 7 and 1 is formed. Along with such a structural change, the four redox units change the distance from the electrode surface, and the change in the distance is measured as a change in the current value.
The “target nucleic acid detection chip” of the present invention is a single type or a plurality of types of gene detection probes of the present invention immobilized on an appropriate carrier, for example, the surface of an electrode placed on the surface of a substrate or substrate of various shapes. When using multiple types of probes, these may be fixed to a single electrode, or arranged in an orderly manner so that the positional information of each probe can be traced. The method of fixing to can be used.
When multiple different probes are used, the detected sequence hybridizes to which probe based on the obtained electrical responsiveness by changing the electrical responsiveness of the redox unit for each of multiple different probes that recognize different target genes. The target gene can be identified based on the information on the target gene recognition sequence of the probe hybridized with the sequence to be detected. For example, in order to obtain a system capable of detecting the first and second target genes, the first probe having a sequence complementary to a nucleic acid molecule having a first detected sequence capable of specifying the first target gene A second probe having a sequence complementary to a nucleic acid molecule having a second detected sequence capable of specifying a second target gene and having a redox unit having a different electrical response from the first probe, A region is fixed to a single electrode or two independent electrodes, and reacted with a sample. When the nucleic acid molecule having the first detected sequence is present in the sample, the first target gene can be detected by the change in the electrical response of the redox unit of the first probe, and the second target is detected in the sample. When the nucleic acid molecule having the detected sequence is present, the second target gene can be detected by the change in the electrical response of the redox unit of the second probe. When both of these nucleic acid molecules having the first and second detected sequences are present in the sample, the electrical response of the redox unit of the first probe changes, and the second probe different from this has Based on the change in the electrical response of the redox unit, the first and second target genes can be detected.
In the DNA chip of the present invention, it is preferable that the gene detection probe of the present invention is fixed to the electrode surface by bonding between any one of the following parts c) and d) and the electrode surface.
c) When forming a closed structure composed of a double-stranded stem part and a single-stranded loop part, one of the two chains constituting the double-stranded stem that does not contain a redox unit.
d) Terminals that do not contain redox units of linear nucleic acids or similar molecules.
The gene detection probe of the present invention alone has a closed structure consisting of a double-stranded stem portion and a single-stranded loop portion, but the target gene and the double strand under the condition that a target sequence for identifying the target gene exists. It is characterized by having an open structure by forming a chain. The DNA chip of the present invention is characterized in that gene detection is performed by reading a change in the distance of the redox unit as an electric current value before and after the recognition of the target gene. Therefore, it is preferable to fix the probe so that the change of the distance becomes the largest. For this purpose, it is preferable that one of the two strands constituting the double-stranded stem does not contain a redox unit. It is preferable to fix the terminal of the linear nucleic acid constituting the probe or a molecule similar thereto to the electrode without the redox unit. Here, the term “terminal” does not need to be strictly a terminal, and a width of 3 to 5 nucleotide units is allowed. In addition, when a linker molecule or the like is bonded to the end of a linear nucleic acid or a similar molecule depending on the purpose, the linker can be fixed by bonding the linker to the electrode surface. In the case of the probe shown in FIG. 1, immobilization is performed by binding the SH group of 6-mercaptohexanol bound to the 3 ′ end of the nucleotide chain to the electrode surface.
As shown in FIG. 3, the method of using a plurality of types of probes immobilized on a single electrode is a method that should be a feature of the present invention, in which the electrical response of each of a plurality of probes having different target genes is measured. This can be achieved by using different redox units.
For example, when a redox unit consisting of anthraquinone and ferrocene is used for probe 1 and probe 2 having different target genes, the peak of the current value in the hairpin state in differential pulse voltammography is It can be seen near -0.5V and with probe 2 around + 0.3V. Therefore, even if these probes are fixed on the same electrode, the target gene 1 or the target gene 2 can be distinguished from each other by reading the peak current value corresponding to each probe without changing the measurement conditions individually. Can be detected.
Such a single electrode type / multiple analysis DNA chip can be simplified in structure of the chip, and is expected to reduce the cost of chip production and measurement.
Materials for electrodes used in the electrochemical gene detection method of the present invention include carbon electrodes such as graphite and glassy carbon, noble metal electrodes such as platinum, gold, palladium and rhodium, titanium oxide, tin oxide, manganese oxide, and oxidation. Examples thereof include oxide electrodes such as lead, semiconductor electrodes such as Si, Ge, ZnO, and CdS, and electronic conductors such as titanium, but it is particularly preferable to use gold or glassy carbon. These electronic conductors may be coated with a conductive polymer or a monomolecular film.
As the carrier on which the electrode is placed, it is preferable to use a hydrophobic or low hydrophilic electrically insulating material. Examples of such a material include glass, cement, ceramics such as ceramics or new ceramics, polyethylene terephthalate, and cellulose acetate. , Polymers such as polycarbonate of bisphenol A, polystyrene, polymethylmethacrylate, silicon, activated carbon, porous glass, porous ceramics, porous silicon, porous activated carbon, woven / knitted fabric, nonwoven fabric, filter paper, short fiber, membrane filter, etc. Among them, various polymers, glass or silicon are particularly preferable. This is due to the ease of surface treatment and the ease of analysis by electrochemical methods. The thickness of the electrically insulating carrier or substrate is not particularly limited.
When a plurality of electrodes are arranged on the carrier or the substrate, it is preferable that each electrode is arranged on the carrier or the substrate regularly so as not to contact each other. Before providing the electrode, a layer made of a hydrophilic polymer substance having a charge or a layer made of a crosslinking agent may be provided on the carrier or the substrate. By providing such a layer, unevenness of the carrier or the substrate can be reduced. Further, depending on the type of the carrier or the substrate, it is possible to include a hydrophilic polymer substance having a charge in the substance, and a carrier or substrate subjected to such treatment can also be preferably used.
Various methods can be used as the method for immobilizing the probe to the electrode surface, but a method via a covalent bond is preferred. As such an immobilization method, there is a method in which the end of the probe is modified with a compound containing a thiol group, for example, 6-mercaptohexanol, and immobilized on the surface of the activated gold electrode by a thiol bond. In such binding, a spacer molecule of an appropriate size may be interposed between the probe molecule and the active group on the electrode surface.
The probe molecules are preferably immobilized by spotting an aqueous liquid on which the probe molecules are dissolved or dispersed on the electrode surface. The aqueous liquid containing the probe molecule may contain an additive that increases the viscosity of the aqueous liquid. Examples of such additives include sucrose, polyethylene glycol, glycerol and the like. After spotting, the probe molecules are fixed when left for several hours at a predetermined temperature. Although spotting can be performed by manual operation, it can also be performed using a spotter provided in a widely used DNA chip manufacturing apparatus. Incubation may be performed after spotting. After incubation, it is preferable to remove unfixed probe molecules by washing.
The DNA chip produced as described above can be used immediately for the nucleic acid to be examined.
In the present invention, various genes can be detected by changing the recognition sequence of the target gene in the gene detection probe. In the food field, when a gene detection probe that uses a recognition sequence that is complementary to the base sequence of all or part of a microorganism contained in food, direct detection of the microorganism contained in the food is performed. Can be performed, and food hygiene inspection becomes possible. Examples of microorganisms contained in such foods include pathogenic E. coli, staphylococci, and Salmonella.
In the field of agriculture, forestry and fisheries, it can be used for detection of pathogenic microorganisms or viruses in crops, livestock animals and fish, and verification of production areas and brands of agricultural products and livestock products. It can also be used to detect genetically modified crops and livestock products. When a probe whose sequence is complementary to a part of the base sequence of a plant virus or viroid is used, it can detect a plant virus or viroid infected with a plant, and diagnoses infectious diseases in the agricultural field. Is possible. Examples of such plant viruses or viroids include tobacco mosaic virus and cauliflower mosaic virus. Detection of pathogenic microorganisms or viruses that infect fish when using a probe whose recognition sequence is complementary to the base sequence of all or part of the pathogenic microorganisms or viruses that infect livestock animals and fish Infectious diseases can be diagnosed in the livestock and fisheries fields. Examples of such pathogenic viruses and microorganisms include foot-and-mouth disease virus and pathogenic Vibrio.
In the medical field, it is possible to detect pathogenic microorganisms or viruses that infect the human body and cause infections, genes causing genetic diseases, activated proto-oncogenes, and the like. Infectious disease diagnosis is possible when using a probe that recognizes a complementary sequence to the base sequence of all or part of a pathogenic microorganism or virus that infects the human body and causes infections, etc. as a nucleic acid probe become. Examples of such pathogenic microorganisms that infect human bodies and cause infections include Streptococcus, Mycoplasma, Clostridium, Chlamydia, Salmonella, herpes simplex, and cytomegalovirus, which are pathogenic microorganisms.
When a probe having a recognition sequence that is complementary to the entire base sequence of a gene causing a genetic disease or a part thereof is used, a direct test for a genetic disease is possible. Examples of the causative gene for such genetic diseases include adenosine deaminase deficiency and sickle cell anemia causative gene.
When a probe having a recognition sequence that is a sequence complementary to the whole or a part of the base sequence of the activated proto-oncogene is used, cancer diagnosis becomes possible. Examples of such activated proto-oncogenes include oncogenes described in the oncogene data book (Masashi Shibuya, Shujunsha).
The causative gene of a genetic disease, the susceptibility to other diseases, the ease of use of drugs, and the like may be determined by a single nucleotide polymorphism (SNP) on the gene. In the detection of such a gene, it is necessary not to detect the presence of the gene itself or the expression level of the gene, but to identify slight structural differences on the gene that are different for each specimen. In the present invention, it is possible to detect the presence or absence of SNP in a sample by using more stringent hybridization conditions.
In the gene detection method of the present invention, first, a nucleic acid to be examined is prepared by an extraction operation from various materials and biological tissues. When preparing DNA from living tissue, various DNA kits provided by reagent manufacturers, such as Get pure DNA Kit-Blood (manufactured by Dojin Chemical Co., Ltd.) suitable for preparation from blood, and ISOHAIR suitable for preparation from hair (Nippon Gene Co., Ltd.) can be used. The prepared nucleic acid can be amplified as necessary by, for example, polymerase chain reaction (PCR) or the like, or in the case of RNA, converted to the corresponding DNA by reverse transcription reaction.
Next, hybridization of the nucleic acid obtained by the above operation with the probe for gene detection of the present invention is performed using a DNA chip. In the present invention, chemical treatment such as labeling of nucleic acid is not required before hybridization, but when the nucleic acid sample is double-stranded DNA, it is denatured by heat treatment and used as a single strand for hybridization. It is preferable. Hybridization is carried out by bringing a sample solution in which nucleic acid is dissolved or dispersed into contact with the gene detection probe of the present invention. Hybridization is preferably carried out in the temperature range of 20 to 40 ° C. and in the range of 1 to 24 hours. However, depending on the chain length of the probe molecule immobilized on the electrode, the type of sample nucleic acid, etc. It is desirable to set optimal conditions. After completion of hybridization, washing is preferably performed to remove unreacted sample nucleic acid fragments.
In the gene detection method using the DNA chip of the present invention, the current value can be measured immediately after the hybridization with the nucleic acid sample without any special operation. The current amount can be measured by any method as long as the amount of current flowing between the electrode and the redox unit can be measured. Cyclic voltammography (CV), differential pulse voltammography (DPV), linear sweep voltammography, potentiostat, etc. are preferably used. It is particularly preferable to measure differential pulse voltammography by immersing the electrode on which the counter electrode and the gene detection probe are fixed in an electrolyte solution to form a pair of electrolytic systems. It is particularly preferred to measure a differential pulse voltammography.
In DPV, a peak current at a potential unique to the probe is obtained according to the redox potential of the redox unit used for the probe. This peak current is maximum when the probe has a hairpin structure, and is minimum when the probe and the target gene form a double strand. In the case of a DNA chip using a redox unit with different electrical responses for each target gene and a plurality of gene detection probes fixed to a single electrode, a unique potential that gives a peak current for each probe Therefore, it is possible to detect each target gene by tracing the change of the peak current at these potentials in the DPV.
In the reaction between the sample and the probe, the hairpin structure of the unreacted probe is maintained, the solvent of the reaction system that forms a double strand with the target sequence, and the current in the double strand formation between the probe and the target sequence. As a solvent in the detection based on 1-100 mM MgCl 2 It is desirable to use a neutral to weakly basic buffer solution containing Using a buffer solution (pH 8.0) consisting of 10 mM Tris-HCl and 1 mM EDTA, MgCl 2 It is particularly desirable to use a concentration in the range of 3-10 mM.

(1)アントラキノン修飾型ウリジンヌクレオチドの合成
合成ルートを図4に示す。
2−アントラキノンカルボン酸(和光純薬社製)より塩化チオニル処理により酸塩化物(化合物2)を得た。化合物2とプロパルギルアミン(1、和光純薬社製)とを(重量比1対1)1−エチル−3−(3−ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド(1当量、和光純薬社製)存在下、N,N−ジメチルホルムアミド中で4時間室温で攪拌して反応させ、抽出後、カラムクロマトグラフィーで精製し、生成物3(21%)を得た。
5−ヨード−2’−デオキシウリジン(4、シグマ社製)と4,4’−ジメトキシトリチルクロリド(東京化成社製)(重量比1対1)をピリジン中で混合し、室温で16時間攪拌して反応させ、抽出後、カラムクロマトグラフィーで精製し、生成物5(65%)を得た。
生成物3と5(重量比1対1)を(テトラキストリフェニルホスフィン)パラジウム(0.15当量、和光純薬社製)及びトリエチルアミン(1当量、和光純薬社製)存在下、N,N−ジメチルホルムアミド中で室温で12時間攪拌して反応させ、抽出後、カラムクロマトグラフィーで精製し、生成物6(74%)を得た。更に、生成物6と2−シアノエチルテトライソプロピルホスホロジミアダイト(アルドリッチ社製)(重量比1対1)をテトラゾール(1当量、同仁化学社製)存在下、アセトニトリル中で室温で、1時間攪拌して反応させ、得られた生成物8をそのままDNA合成に使用した。
(2)プローブ及び検体用オリゴヌクレオチドの作成
プローブODN1は、配列表の配列番号1に示すヌクレオチド配列(TGAGTATCATCTTTGGTGTTTCTCAA)を持つ。本オリゴヌクレオチドをDNA合成機で合成し、5’末端には(1)で作成したアントラキノン修飾型ウリジンを付加した。合成物を精製した後、3’末端に6−メルカプトヘキサノールを付加させた。

Figure 2004035829
ODN2〜ODN4は配列表の配列番号2〜4に示す配列からなり、それぞれDNA合成機により合成した。
Figure 2004035829
(3)プローブで修飾された金電極の作成
表面積2mmの金電極を2M水酸化カリウム溶液中で3時間煮沸し、純水で洗浄した後、濃硝酸溶液に室温で3時間浸し、さらに純水で洗浄した。上記の処理をした金電極の表面に1μMのODN1溶液を1μL滴下し、ゴムキャップをかぶせて室温で3時間放置した。その後、電極を軽く純水で洗浄し、1mMのメルカプトヘキサノール1μLを滴下し、ゴムキャップをかぶせて室温で3時間放置した。
(4)ハイブリダイゼーション
ODN1を固定化した金電極上に50ナノモル相当のODN2〜4をそれぞれ含む、5mMリン酸ナトリウム、50mM塩化ナトリウム、pH7.0の溶液を滴下し、室温で1時間放置することによりハイブリダイゼーションさせた。その後、緩衝溶液で軽く洗浄を行った。
(5)電流値の測定
ディファレンシャルパルスボルタンメトリー(DPV)による測定は、ALS社製のモデル660A エレクトロケミカルアナライザーで行った。参照電極は飽和カロメア電極(SCE)、対極はプラチナ電極をそれぞれ用いた。測定は、5mMリン酸ナトリウム、50mM塩化ナトリウム、pH7.0の溶液中、室温で行い、pulse periodを200ms、scan rateを100mV/s、pulse amplitudeを50mV、pulse widthを50msとした。それぞれの検体用オリゴヌクレオチドについて、2回づつの測定を行い、値を平均化した。
プローブODN1における認識配列と完全にマッチする配列を含むODN2を検体として用いた場合のDPV結果を図5に示す。検体を加えない状態(ヘアピン)で認められたピーク電流値が、検体を加えた状態(WT)では顕著に減少していることがわかる。
一方、プローブODN1における認識配列とマッチしない配列からなるODN3、ODN4の場のDPV結果を夫々、図6、7に示す。いずれの場合も、検体を加えない状態(ヘアピン)及び検体を加えた状態(G178MUまたはF508)共に電流応答が見られるが、検体を加えた状態において、電流量、ピーク値共に減少している。これは、検体の添加によって、プローブのヘアピン構造が多少の影響を受けていることを示唆するものと思われるが、ハイブリダイゼーションの条件を調整することにより、電流値の変化は抑えられるものと思われる。
図8、9には各検体ごとに、添加の前後における電流量、ピーク電流の変化を相対的に示した。これらの図からもわかるように、プローブにおける認識配列と完全にマッチする場合は、その認識の前後において顕著な電流応答の変化が認められる。マッチしない配列からなる検体の場合は、その認識の前後において電流値の変化がほとんどないことが望ましいが、本実施例におけるハイブリダイゼーションの条件では、プローブと検体との間での相互作用を排除することができなかったため、電流値の差異を生じたものと思われる。しかしながら、図に示される電流値の差異があれば検出には支障はない。(1) Synthesis of anthraquinone-modified uridine nucleotides A synthetic route is shown in FIG.
Acid chloride (compound 2) was obtained from 2-anthraquinonecarboxylic acid (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) by thionyl chloride treatment. Compound 2 and propargylamine (1, Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) (weight ratio 1: 1) in the presence of 1-ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide (1 equivalent, Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) The mixture was reacted in N, N-dimethylformamide by stirring at room temperature for 4 hours, extracted, and purified by column chromatography to obtain the product 3 (21%).
5-Iodo-2′-deoxyuridine (4, manufactured by Sigma) and 4,4′-dimethoxytrityl chloride (manufactured by Tokyo Chemical Industry) (weight ratio of 1: 1) were mixed in pyridine and stirred at room temperature for 16 hours. After reaction, extraction and purification by column chromatography gave the product 5 (65%).
Products 3 and 5 (weight ratio 1 to 1) were added in the presence of (tetrakistriphenylphosphine) palladium (0.15 equivalent, manufactured by Wako Pure Chemical Industries) and triethylamine (1 equivalent, manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.). Reaction was carried out by stirring for 12 hours at room temperature in dimethylformamide, followed by extraction and purification by column chromatography to obtain the product 6 (74%). Further, the product 6 and 2-cyanoethyltetraisopropyl phosphorodiamidite (Aldrich) (weight ratio 1: 1) were stirred in acetonitrile at room temperature for 1 hour in the presence of tetrazole (1 equivalent, manufactured by Dojindo). The product 8 obtained was used for DNA synthesis as it was.
(2) Preparation of Probe and Sample Oligonucleotide Probe ODN1 has a nucleotide sequence (TGAGTATCATCTTTGGGTTTTCTCAA) shown in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing. This oligonucleotide was synthesized with a DNA synthesizer, and the anthraquinone modified uridine prepared in (1) was added to the 5 ′ end. After purification of the synthesized product, 6-mercaptohexanol was added to the 3 ′ end.
Figure 2004035829
ODN2 to ODN4 consisted of sequences shown in SEQ ID Nos. 2 to 4 in the sequence listing, and were synthesized by a DNA synthesizer.
Figure 2004035829
(3) Preparation of a gold electrode modified with a probe A gold electrode having a surface area of 2 mm was boiled in 2M potassium hydroxide solution for 3 hours, washed with pure water, then immersed in concentrated nitric acid solution at room temperature for 3 hours, and further purified water Washed with. 1 μL of a 1 μM ODN1 solution was dropped on the surface of the gold electrode subjected to the above treatment, and a rubber cap was put on the surface to stand at room temperature for 3 hours. Thereafter, the electrode was lightly washed with pure water, 1 μL of 1 mM mercaptohexanol was dropped, and the rubber cap was put on and left at room temperature for 3 hours.
(4) Hybridization A solution of 5 mM sodium phosphate, 50 mM sodium chloride, pH 7.0, each containing 50 nmoles of ODN2-4, is dropped on a gold electrode on which ODN1 is immobilized, and left at room temperature for 1 hour. Hybridization. Thereafter, it was gently washed with a buffer solution.
(5) Measurement of current value Measurement by differential pulse voltammetry (DPV) was performed with a model 660A electrochemical analyzer manufactured by ALS. The reference electrode was a saturated calomere electrode (SCE), and the counter electrode was a platinum electrode. The measurement was performed at room temperature in a solution of 5 mM sodium phosphate, 50 mM sodium chloride, pH 7.0, the pulse period was 200 ms, the scan rate was 100 mV / s, the pulse amplitude was 50 mV, and the pulse width was 50 ms. For each specimen oligonucleotide, two measurements were taken and the values were averaged.
FIG. 5 shows the DPV result when ODN2 containing a sequence that perfectly matches the recognition sequence in probe ODN1 is used as a specimen. It can be seen that the peak current value observed when no specimen is added (hairpin) is significantly reduced when the specimen is added (WT).
On the other hand, FIGS. 6 and 7 show the DPV results in the fields of ODN3 and ODN4, which are sequences that do not match the recognition sequence in the probe ODN1, respectively. In either case, a current response is observed in both the state where the sample is not added (hairpin) and the state where the sample is added (G178MU or F508), but both the amount of current and the peak value are decreased in the state where the sample is added. This seems to suggest that the hairpin structure of the probe is somewhat affected by the addition of the sample, but it seems that the change in the current value can be suppressed by adjusting the hybridization conditions. It is.
8 and 9 relatively show changes in the amount of current and the peak current before and after the addition for each specimen. As can be seen from these figures, a significant change in the current response is observed before and after the recognition when it completely matches the recognition sequence in the probe. In the case of a specimen consisting of a sequence that does not match, it is desirable that there is almost no change in the current value before and after the recognition, but the hybridization conditions in this example exclude the interaction between the probe and the specimen. It was thought that the difference of the current value was caused because it was not possible. However, if there is a difference between the current values shown in the figure, there is no problem in detection.

(1)フラビン類縁体修飾型プローブの作成
酸化還元性ユニットとしてフラビン類縁体を含むODN5を合成した。

Figure 2004035829
フラビン類縁体は、Ikedaら、Tetrahedron Letters 42、2529(2001)に示した方法で合成した。
自動DNA合成機により、3’端(サポートのヌクレオシド)より2番目にThiol modifier C6 S−S(Glen Research製)を導入し、5’端にAmino modifier C2 dT(Glen Research製)を導入する方法で配列番号5の配列(TAGCGAAATAAGTATTAGACAACCGCTA)を有するオリゴDNAを合成した。サポートからの切り出し、脱保護の後、20mMのN−ヒドロキシスクシンイミドで活性化されたフラビン類縁体を含む50mMリン酸ナトリウム緩衝液(pH8.7)で、12時間攪拌した。反応液をHPLCにより精製することで、5’端にフラビン類縁体が付加したオリゴDNAを得た。さらに、これを0.1MのDTT溶液中(50mM Na phosphate,pH8.4)で30分間撹拌してS−S結合の還元を行い、HPLC精製することで、3’端をヘキサンチオール化したオリゴDNA(ODN5)を得た(図10)。
(2)プローブで修飾された金電極の作成、ハイブリダイゼーション
実施例1に記載の方法で行った。
(3)DPVによる電流値の測定は実施例1に記載の方法で行った。
プローブODN5における認識配列と相補的なODN3(G178MU)を検体として用いた場合のDPV結果を図12に示す。検体を加えない状態(ヘアピン)で認められたピーク電流値が、検体を加えた状態(G178MU)では顕著に減少していることがわかる。
一方、プローブODN5における認識配列と相補的でないODN2(WT)、ODN4(F508)を検体とした場合のDPV結果を夫々、図11、13に示す。いずれの場合も、検体を加えない状態(ヘアピン)及と検体を加えた状態(WTまたはF508)で電流応答がほとんど変化していない。(1) Preparation of flavin analog-modified probe ODN5 containing a flavin analog was synthesized as a redox unit.
Figure 2004035829
Flavin analogs were synthesized by the method shown in Ikeda et al., Tetrahedron Letters 42, 2529 (2001).
Method of introducing Thiol modifier C6 SS (manufactured by Glen Research) second from the 3 ′ end (support nucleoside), and introducing amino modifier C2 dT (manufactured by Glen Research) to the 5 ′ end by an automatic DNA synthesizer Thus, an oligo DNA having the sequence of SEQ ID NO: 5 (TAGCGAAATAAGTATAGATACAACCGCTA) was synthesized. After cutting out from the support and deprotecting, the mixture was stirred for 12 hours with 50 mM sodium phosphate buffer (pH 8.7) containing a flavin analog activated with 20 mM N-hydroxysuccinimide. The reaction solution was purified by HPLC to obtain oligo DNA with a flavin analog added to the 5 ′ end. Furthermore, this was stirred for 30 minutes in a 0.1 M DTT solution (50 mM Na phosphate, pH 8.4) to reduce the S—S bond, and purified by HPLC to obtain an oligo-thiolated 3 ′ end oligo. DNA (ODN5) was obtained (FIG. 10).
(2) Preparation and hybridization of a gold electrode modified with a probe The method described in Example 1 was used.
(3) The measurement of the current value by DPV was performed by the method described in Example 1.
FIG. 12 shows the DPV result when ODN3 (G178MU) complementary to the recognition sequence in the probe ODN5 is used as a sample. It can be seen that the peak current value observed when no sample is added (hairpin) is significantly reduced when the sample is added (G178MU).
On the other hand, FIGS. 11 and 13 show the DPV results when ODN2 (WT) and ODN4 (F508) that are not complementary to the recognition sequence in the probe ODN5 are used as samples, respectively. In either case, the current response hardly changes between the state in which the specimen is not added (hairpin) and the state in which the specimen is added (WT or F508).

実施例1で用いたアントラキノン修飾型プローブと実施例2で用いたフラビン修飾型プローブについて、遺伝子検出におけるS/N比を算出し比較した。ここでは、S/N比をハイブリダイゼーション前の電流量(Apbefore)からハイブリダイゼーション後の電流量(Apafeter)を引いた値をハイブリダイゼーション前の電流量(Apbefore)で割った値として定義した。算定結果を表1及び図14に示した。

Figure 2004035829
プローブの配列が異なるため一概には比較できないが、アントラキノン修飾型プローブに比較し、フラビン修飾型プローブの場合は、相補的な配列に対してS/N比が高く、相補的でない配列に対してS/N比が低い理想的な結果となった。The S / N ratio in gene detection was calculated and compared for the anthraquinone modified probe used in Example 1 and the flavin modified probe used in Example 2. Here, defined as a value obtained by dividing the S / N of the current before hybridization ratio (Ap before) the amount of current after hybridization from (Ap afeter) value of current before hybridization minus (Ap before) did. The calculation results are shown in Table 1 and FIG.
Figure 2004035829
Since the probe sequences are different, it is not possible to compare them in general. However, compared to anthraquinone modified probes, the flavin modified probes have a higher S / N ratio for complementary sequences and non-complementary sequences. An ideal result was obtained with a low S / N ratio.

DNA修飾電極を繰り返し使用した時の電流値の変化
実施例2で作成したODN5修飾電極を用いてハイブリダイゼーション/変性を繰り返し行い、電流値の変化を調べた。ODN5修飾電極に対し、相補的なターゲットであるODN3(G178MU)、またはODN2(WT)、ODN4(F508)を加えハイブリダイゼーションを行い、DPVにより電流値を測定した。引き続き、電極を90%ホルムアミド/10%TE buffer溶液に1分間浸し2本鎖状態を解離させ、TE buffer中に1分間した後、DPVにより電流値を測定した。上記の操作を1サイクルとして、10サイクル繰り返した場合の電流値の結果を図15に示した。相補的なターゲットであるODN3(G178MU)を用いた場合は、ハイブリダイゼーションの前後において、ヘアピン状態と二本鎖状態を反映した電流値が示され、サイクルを重ねてもこれらの値はほぼ一定であった。一方、プローブに相補的でないODN2(WT)またはODN4(F508)を用いた場合は、サイクルの後半で若干の電流値の低下が見られたものの、ハイブリダイゼーション/変性を反映した電流値の周期的な変化は見られなかった。以上のような結果から、本発明の遺伝子検出用プローブが固定された電極を用いることで、遺伝子の検出が再現性良く繰り返し行えることが示された。
Change in current value when DNA modified electrode was used repeatedly Hybridization / denaturation was repeated using the ODN5 modified electrode prepared in Example 2 to examine the change in current value. ODN3 (G178MU), ODN2 (WT), and ODN4 (F508), which are complementary targets, were added to the ODN5-modified electrode for hybridization, and the current value was measured by DPV. Subsequently, the electrode was immersed in a 90% formamide / 10% TE buffer solution for 1 minute to dissociate the double-stranded state, and after 1 minute in the TE buffer, the current value was measured by DPV. FIG. 15 shows the results of current values when the above operation was repeated for 10 cycles. When the complementary target ODN3 (G178MU) is used, current values reflecting the hairpin state and the double-stranded state are shown before and after hybridization, and these values are almost constant even after repeated cycles. there were. On the other hand, when ODN2 (WT) or ODN4 (F508) that is not complementary to the probe was used, although a slight decrease in the current value was observed in the second half of the cycle, the current value periodically reflecting hybridization / denaturation was observed. No significant change was seen. From the above results, it was shown that gene detection can be repeated with good reproducibility by using an electrode on which the gene detection probe of the present invention is fixed.

本発明にかかる酸化還元ユニットを有するヘアピン型プローブ及びこれを利用した電気化学的遺伝子検出法を利用することにより、
1)目的塩基配列や一塩基多型の検出、
2)電気化学式標的遺伝子検出用チップ、
4)バイオセンサー
等を提供することができる。
By using a hairpin probe having a redox unit according to the present invention and an electrochemical gene detection method using the same,
1) Detection of target nucleotide sequence and single nucleotide polymorphism,
2) Chip for detecting electrochemical target gene,
4) A biosensor or the like can be provided.

【配列表】

Figure 2004035829
Figure 2004035829
[Sequence Listing]
Figure 2004035829
Figure 2004035829

Claims (11)

標的遺伝子を認識し得る認識配列を含み、かつ核酸及び核酸類似物の少なくとも一方からなる直鎖状分子と、酸化還元性ユニットと、を有する標的遺伝子検出用のプローブであって、
単独では、二本鎖ステムと一本鎖ループとからなり、該一本鎖ループが該二本鎖ステムにより閉じられたヘアピン構造を形成し、標的遺伝子の存在を示す被検出配列と前記認識配列とが二本鎖を形成することにより、該ヘアピン構造が開かれて、該プローブの一部に被検出配列との2本鎖部分が形成されるために必要な配列を有し、かつ
前記酸化還元性ユニットは、前記ヘアピン構造が形成された場合に前記一本鎖ループ以外で結合または近接する二本の鎖の一方に結合している
ことを特徴とする標的遺伝子検出用のプローブ。
A probe for detecting a target gene comprising a linear molecule comprising a recognition sequence capable of recognizing a target gene and comprising at least one of a nucleic acid and a nucleic acid analog, and a redox unit,
Independently, it comprises a double-stranded stem and a single-stranded loop, the single-stranded loop forms a hairpin structure closed by the double-stranded stem, and the detected sequence indicating the presence of the target gene and the recognition sequence Forming a double strand, the hairpin structure is opened, and a portion of the probe has a sequence necessary to form a double-stranded portion with a detected sequence, and the oxidation The reducing unit is a probe for detecting a target gene, wherein when the hairpin structure is formed, the reducing unit is bound to one of two strands that are bound or adjacent to each other except the single-stranded loop.
前記ヘアピン構造を形成し得る配列が、互いに相補的な2つの逆向き繰り返し配列と、これらの繰り返し配列の間に設けられた被検出配列に相補的な配列からなる標的遺伝子認識配列と、を有する請求項1に記載の標的遺伝子検出用のプローブ。The sequence capable of forming the hairpin structure has two inverted repeat sequences complementary to each other and a target gene recognition sequence consisting of a sequence complementary to the detected sequence provided between these repeat sequences. The probe for detecting a target gene according to claim 1. 前記一本鎖分子の少なくとも一部がDNAまたはRNAである請求項1または2に記載の標的遺伝子検出用のプローブ。The probe for detecting a target gene according to claim 1 or 2, wherein at least a part of the single-stranded molecule is DNA or RNA. 前記一本鎖分子の少なくとも一部がペプチド核酸である請求項1または2に記載の遺伝子検出用のプローブ。The probe for gene detection according to claim 1 or 2, wherein at least a part of the single-stranded molecule is a peptide nucleic acid. 前記酸化還元性ユニットが、次のa)及びb)のいずれかの位置に含まれる請求項1〜4のいずれかに記載の遺伝子検出用のプローブ。
a)前記二本鎖ステムを構成する2つの鎖のいずれか一方の鎖。
b)前記直鎖状の分子の一方の末端。
The probe for gene detection according to any one of claims 1 to 4, wherein the redox unit is contained at any one of the following positions a) and b).
a) One of the two strands constituting the double-stranded stem.
b) One end of the linear molecule.
酸化還元性ユニットが、キノン化合物、メタロセン化合物、フラビン化合物及びポルフィリン化合物、金属または金属化合物である請求項1〜5のいずれかに記載の遺伝子検出用のプローブ。The probe for gene detection according to any one of claims 1 to 5, wherein the redox unit is a quinone compound, a metallocene compound, a flavin compound, a porphyrin compound, a metal or a metal compound. 電極表面を有する担体と、該電極表面に結合した請求項1〜6のいずれかに記載の標的遺伝子検出用のプローブとを有する標的遺伝子検出用のチップであって、
前記ヘアピン構造が形成された場合に、前記一本鎖ループ以外で結合または近接する二本の鎖のうちの前記還元性ユニットが結合していない方の鎖の末端領域が前記電極と結合している
ことを特徴とする標的遺伝子検出用のチップ。
A target gene detection chip comprising a carrier having an electrode surface and the target gene detection probe according to any one of claims 1 to 6 bound to the electrode surface,
When the hairpin structure is formed, the end region of the strand that is not bound to the reducing unit of the two strands that are bound or adjacent to each other other than the single-stranded loop is bound to the electrode. A chip for detecting a target gene.
異なる複数の標的遺伝子のそれぞれを特定し得る異なる複数のプローブが、各プローブごとに前記電極表面に固定され、かつ、前記複数の標的遺伝子ごとに電気的応答の異なる酸化還元性ユニットが各プローブに結合している請求項7に記載の標的遺伝子検出用のチップ。Different probes capable of specifying each of a plurality of different target genes are immobilized on the electrode surface for each probe, and redox units having different electrical responses for each of the plurality of target genes are attached to each probe. The chip for detecting a target gene according to claim 7, which is bound. 標的遺伝子をプローブを用いて検出する方法において、
請求項7に記載の標的遺伝子検出用のチップの電極表面に、該電極表面に固定された該プローブが前記ヘアピン構造をし得る反応系を形成する工程と、
該反応系中で、試料と前記プローブとを、該試料中に被検出配列が含まれている場合に、該プローブと該被検出配列とのハイブリダイゼーションにより二本鎖を形成させて、該プローブのヘアピン構造が開かれて一本鎖に変換し得る条件下で反応させる工程と、
該反応を経たチップの電極に電位を与え、得られた電流値に基づいて該プローブと該被検出配列とのハイブリダイゼーションの状態を判定する工程と
を有することを特徴とする標的遺伝子の検出方法。
In a method for detecting a target gene using a probe,
Forming on the electrode surface of the target gene detection chip according to claim 7 a reaction system in which the probe fixed on the electrode surface can form the hairpin structure;
In the reaction system, when the sample and the probe contain a sequence to be detected, a double strand is formed by hybridization of the probe and the sequence to be detected. A step of reacting under the condition that the hairpin structure of can be opened and converted into a single strand;
A method of detecting a target gene, comprising: applying a potential to the electrode of the chip that has undergone the reaction, and determining a state of hybridization between the probe and the sequence to be detected based on the obtained current value .
異なる複数の標的遺伝子を認識する複数のプローブを、それぞれのプローブごとに異なる電極に固定したプローブを用いる請求項9に記載の標的遺伝子の検出方法。The method for detecting a target gene according to claim 9, wherein a plurality of probes that recognize a plurality of different target genes are immobilized on different electrodes for each probe. 標的遺伝子をプローブを用いて検出する方法において、
請求項8に記載の標的遺伝子検出用のチップの電極表面に、該電極表面に固定された該プローブが前記ヘアピン構造をし得る反応系を形成する工程と、
該反応系中で、試料と前記プローブとを、該試料中に異なる複数の標的遺伝子に対応する被検出配列の少なくとも1種が含まれている場合に、該プローブと該被検出配列とのハイブリダイゼーションによる二本鎖を形成させて、該プローブのヘアピン構造が開かれて二本鎖部分を持たない一本鎖に変換し得る条件下で反応させる工程と、
該反応を経たチップの電極に電位を与え、得られた電流値に基づいて該プローブと該被検出配列とのハイブリダイゼーションの状態を判定する工程と
を有することを特徴とする複数標的遺伝子の同時検出方法。
In a method for detecting a target gene using a probe,
Forming on the electrode surface of the target gene detection chip according to claim 8 a reaction system in which the probe fixed on the electrode surface can form the hairpin structure;
In the reaction system, when the sample and the probe contain at least one kind of detected sequences corresponding to a plurality of different target genes, the probe and the detected sequence are high. Forming a double strand by hybridization, and reacting under a condition in which the hairpin structure of the probe is opened and converted into a single strand having no double-stranded portion;
Applying the potential to the electrode of the chip that has undergone the reaction, and determining the state of hybridization between the probe and the sequence to be detected based on the obtained current value. Detection method.
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