JP2004354159A - 皮膚老化度の評価方法 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】被験者由来の皮膚線維芽細胞を包埋したコラーゲンゲルに刺激物質を添加し、当該細胞に発生する力の変化を測定することを特徴とする当該被験者の皮膚老化度の評価方法。
【選択図】 なし
Description
【発明の属する技術分野】
本発明は、皮膚の生物的な加齢変化に基づき皮膚老化度を評価する方法及び評価キットに関する。
【0002】
【従来の技術及び発明が解決しようとする課題】
皮膚の加齢変化は、しわ、たるみ等の見た目や、ハリ、弾力等の触れた場合の感触等により認知される。そのため、見た目の皮膚老化度、いわゆる肌年齢の推定は外見からの判断により比較的容易に行えるし、また、皮膚表面に接触することを前提とする機器測定を利用すればより数値的な客観的なデータから肌年齢の推定が可能である。実際、肌年齢を判定する方法としては、しわ及びたるみの外的容貌の程度により実年齢を推定する方法(例えば、特許文献1、特許文献2参照)、皮膚に振動体を接触させた時の振動変化で肌特性、肌年齢を判定する方法(例えば、特許文献3参照)、超音波皮膚画像の真皮輝度により年齢を推定する方法(例えば、特許文献4参照)が報告されている。
【0003】
しかし、皮膚の加齢変化はこれら外見や感触以前に、まず数多くの皮膚における生物的な加齢変化、例えば細胞の老化やマトリックスの老化等に始まっていると考えられる。従って、皮膚老化度は、そのような皮膚における生物的な加齢変化を指標として評価されるのが好ましいが、斯かる評価方法はほとんど知られていない。例えば、表皮の角質細胞の平均面積を指標とする年齢推定方法(例えば、特許文献5参照)が知られているが、これは最外層の角層を見るものであり、皮膚における生物的な加齢変化を追ったものとは言いがたいものであった。
【0004】
本発明は、皮膚の生物的な加齢変化に基づき皮膚の老化度を評価する方法を提供することを目的とする。
【0005】
【特許文献1】
特開2002−330943号公報
【特許文献2】
特開2002−360544号公報
【特許文献3】
特開2001−212087号公報
【特許文献4】
特開2000−83954号公報
【特許文献5】
特開平11−299792号公報
【0006】
【課題を解決するための手段】
本発明者は、非筋細胞の発生する力と加齢との関係について検討したところ、意外にも皮膚線維芽細胞の発生する力が加齢により低下することを見出し、皮膚線維芽細胞に刺激物質を添加した場合に当該細胞に発生する力の変化を測定することにより、皮膚老化度の評価が可能であることを見出した。
【0007】
すなわち本発明は、被験者由来の皮膚線維芽細胞を包埋したコラーゲンゲルに刺激物質を添加し、当該細胞に発生する力の変化を測定することを特徴とする当該被験者の皮膚老化度の評価方法を提供するものである。
【0008】
また本発明は、皮膚線維芽細胞を包埋したコラーゲンゲル、刺激物質及び細胞発生張力測定装置を備えてなる皮膚老化度の評価キットを提供するものである。
【0009】
【発明の実施の形態】
本発明評価方法においては、被験者から採取した皮膚線維芽細胞がサンプルとして用いられる。皮膚線維芽細胞は、パンチバイオプシー等により、採取することができる。採取部位は、顔面部、上腕内側部、上腕外側部、大腿内側部、大腿外側部、腹部、背部の皮膚等が挙げられ、また、評価結果の利用の方法にも依存することもあるが、非露光部でありかつ採取時の傷の目立たない腹部、上腕内側部、大腿内側部などが好ましい。
【0010】
採取された皮膚線維芽細胞は、コラーゲンゲル中に包埋され、細胞が発生する力の測定に供される。線維芽細胞のコラーゲンゲルへの包埋は公知の方法(Kolodney MS, Wysolmerski RB, Isometric contraction by fibroblasts and endothelial cells in tissue culture: a quantitative study. J Cell Biol., 117, 73−82(1992)、或いは Kolodney MS, Elson EL, Correlation of myosin light chain phosphorylation with isometric contraction of fobroblasts. J Biol Chem, 268, 23850−55(1993))により行えばよいが、例えば、以下のよう調製することができる。
【0011】
採取された皮膚線維芽細胞を、例えば5%牛胎児血清(FBS)含有ダルベッコ改変イーグル培地(DMEM)で培養し、培養線維芽細胞を定法により単離して得る。得られた細胞を300−400万cells/mLになるようにFBS含有DMEMを加え再度けん濁させる。一方、コラーゲンゲル調製溶液は、コラーゲン溶液(新田ゼラチン、typeI−A)を用いて、定法により作製する。このコラーゲンゲル調製溶液に先に調製した細胞けん濁溶液を最終濃度で細胞密度が3×105 cells/mLから5×105 cells/mLとなるよう加え、線維芽細胞包埋コラーゲンゲル調製溶液を作製することができる。
【0012】
他方、コラーゲンゲルを作製するための容器は、シリコンラバー、シリコンチューブ、布テープ、及び培養ディッシュなどを用いて作製した。シリコンラバーで作成された溝に上記の線維芽細胞包埋コラーゲンゲル調製溶液を流し込み、37℃でインキュベートしゲル化させ、24時間後さらに無血清培地中で1日から2日インキュベートして、線維芽細胞包埋コラーゲンゲルを調製することができる。
【0013】
ここで用いられるコラーゲンとしては、動物由来のコラーゲンであればよいが、特にヒト、マウス、ラット、ウサギ、モルモット、ウシ等のほ乳類由来のコラーゲンが好ましい。これらのコラーゲンは組織より公知の方法により採取して用いてもよく、又は市販品(例えば新田ゼラチン社製、typeI−A)を購入して用いてもよい。
【0014】
コラーゲンゲルに包埋された皮膚線維芽細胞に発生する力とは、アクチンーミオシンが重合して筋原線維ともいえるストレスファイバーが細胞内に形成され、それが収縮する際に発生する力であり、その測定は公知の方法(Kolodney MS, Wysolmerski RB,.J Cell Biol.,117, 73−82(1992)、Kolodney MS, Elson EL, J Biol Chem, 268, 23850−23855(1993))に従って行うことができる。
【0015】
例えば、上記で調製された線維芽細胞包埋コラーゲンゲルを、ビーカー中で37℃程度に保温した無血清培地中に片側を固定し、もう一方をアイソトニックトランスデュ−サー(例えばIsotonic Transducer、8gf、T−7−8−240、ORIENTEC, JAPAN、またはPAT−08、Physio Tech.JAPAN など)に吊るし、50−300mgに相当する負荷をかけた後、30分〜1時間程度安定化させ、その後、無血清DMEM培地で最終濃度の50倍程度の濃度に調製した刺激物質を1mL程度添加し、発生する力の変化をアイソトニックトランスデュ−サーで計測し、増幅(例えば、Physio Tech., Signal Conditioner MAC−2)後、記録(例えば、MP100A−CE、AcqKnowledge 3.5、ともに Biopack system Inc. Santabarbara)することによって行うことができる。
【0016】
刺激物質としては、線維芽細胞のアクチンーミオシン系を刺激して力(張力)を発生させる物質であればいずれのものでもよく、例えばトロンビン(Thrombin)、リソホスファチジン酸(LPA:Lysophosphatidic acid)等、が代表例として挙げられるが、牛胎児血清(FBS)、モノパルミトイルホスファチジン酸(MLPA:Monopalmitoyl phosphatidic acid)、リソホスファチジルコリンパルミトイル(LPCP:Lysophosphatidyl choline palmitoyl)、エンドセリン(ET−1: Endothelin−1)、血小板由来成長因子(PDGF:Platelet−derived growth factor)等を用いることもできる。
【0017】
ヒト腹部由来の皮膚線維芽細胞(継代数2−3)を用い、継代培養して継代数5−7の細胞と、継代数16−19(in vitro 老化線維芽細胞)を調製し、それぞれコラーゲンゲルに包埋して、トロンビン及びLPAで刺激した場合の当該線維芽細胞の発生する力を測定したところ、老化線維芽細胞ではそれぞれ4.8+/−3.3dyne、2.5+/−3.1dyne(平均値+/−SD)であり、若い線維芽細胞(それぞれ32.3+/−25.3dyne、11.3+/−6.8dyne)と比較して細胞の発生する力が有意に低下していた(実施例1)。また、62−79歳の老齢者由来の線維芽細胞と1−4歳乳幼児由来の線維芽細胞について、トロンビン刺激した場合の細胞発生する力を測定したところ、老齢者由来の細胞は13.3+/−9.0dyneであり、乳幼児由来の細胞(24.5+/−2.0dyne)と比較して有意に低下していた(実施例2)。すなわち、皮膚線維芽細胞の細胞の発生する力は、加齢と共に低下している。
従って、被験者から採取した皮膚線維芽細胞について、当該細胞の発生する力を測定することにより、被験者の細胞の老化度、皮膚の老化度を評価することができる。
【0018】
本発明の皮膚老化度の評価キットは、上記した被験者の皮膚老化度の評価方法を実施するためのキットであり、上述した皮膚線維芽細胞を包埋したコラーゲンゲル、刺激物質及び細胞発生張力測定装置(例えば、アイソトニックトランスデュ−サー等)を備えてなるものである。
【0019】
本発明の評価方法及び評価キットは、例えば手術における創傷治癒速度の推定における手術方針や、再生医療における移植皮膚の作製、選択の方針、また肌年齢に応じた化粧料の選択方法の指針等に利用し得るものである。
また、各年齢層における皮膚線維芽細胞の発生する力の値をバックグラウンドデータとして用意し、これと被験者から得られたデータを比較することにより、被験者の肌年齢の推定等が可能となる。
【0020】
【実施例】
実施例1 In vitro老化による線維芽細胞発生張力の低下
(1)細胞
ヒト皮膚線維芽細胞(age; 62, sex; male、腹部由来、継代数2−3、PDL(Population doubling time)=6−8程度)をCELL SYSTEMS社−大日本製薬より購入し、購入時の継代数を3として、5%FBS含有DMEMでコンフルエント到達時にスプリット比1:4で継代培養した。継代数5−7を若年層(Young)、継代数16−19にin vitro 老化させた老年層(Old)として比較した。
【0021】
(2)細胞発生する力の測定
コラーゲンゲル培養系で力の測定法はKolodenyらの方法に従って行った(Kolodney MS, Wysolmerski RB, Isometric contraction by fibroblasts and endothelial cells in tissue culture: a quantitative study. J Cell Biol.,117, 73−82(1992)、Kolodney MS, Elson EL, Correlation of myosin light chain phosphorylation with isometric contraction of fibroblasts. J Biol Chem, 268, 23850−23855(1993))。簡単には、線維芽細胞包埋コラーゲンゲル(1.5×106cells, 1.5mg/mL collagen,新田ゼラチンTypeI−A)を37℃に保温した無血清培地中に固定し、安定化させた後、無血清DMEMで最終濃度の50倍程度の濃度に調整した物質を1mL添加(最終濃度:トロンビン=0.2 U/mL、LPA(リソフォスファチジン酸)=10μM)し、発生する力の変化はIsotonic Transducer(8gf、T−7−8−240、ORIENTEC、JAPAN)で計測し、増幅(Physio Tech., Signal Conditioner MAC−2)後、記録(MP100A−CE、AcqKnowledge 3.5、ともにBiopack system Inc. Santabarbara)で記録した。
【0022】
図1に示したごとく、in vitro老化させた老化線維芽細胞では若い線維芽細胞と比較し、トロンビン、LPAの刺激により細胞の発生する力が有意に低下することが確認された。細胞数は同一であることから加齢により個々の細胞の発生する力が低下したと考えられる。
【0023】
実施例2 In vivo老化による線維芽細胞発生張力の低下
(1)細胞
In vivo 老化細胞細は、 DF014(age; 62, sex; male), DF151 (age; 79, sex; male), DF181 (age; 64, sex; unknown), DF146 (age; 67,sex; male), DF149 (age; 75, sex; male),以上62−79歳の老齢者由来の細胞(OLD,n=5)、及びDF374 (age; 1, sex; male), DF628 (age; 4, sex; male), DF775 (age; 3, sex; male), (age; 1, sex; male),DF287 (age; 1, sex; female), DF486(age; 2, sex; male),以上1−4歳乳幼児由来の細胞(YNG、n=5)を用いた。
【0024】
(2)細胞の発生する力の測定
実施例1と同じ方法にて行った。無血清DMEMで最終濃度の50倍程度の濃度に調整したトロンビン溶液を1mL添加(最終濃度0.2 U/mL)し、発生する力の変化をみた。
【0025】
図2に示したごとく、老齢者由来の細胞は4歳乳幼児由来の細胞と比較して、トロンビン刺激により細胞の発生する力が有意に低下することが確認された。細胞数は同一であることから加齢により個々の細胞の発生する力が低下したと考えられる。
【0026】
【発明の効果】
本発明によれば、皮膚の生物的な加齢変化に基づき被験者の皮膚老化度を評価することができる。
【図面の簡単な説明】
【図1】図1は、in vitro老化線維芽細胞のトロンビン及びLPA刺激による力の発生の低下を示した図である。
【図2】図2は、in vivo老化線維芽細胞のトロンビン刺激による力の発生の低下を示した図である。
Claims (3)
- 被験者由来の皮膚線維芽細胞を包埋したコラーゲンゲルに刺激物質を添加し、当該細胞に発生する力の変化を測定することを特徴とする当該被験者の皮膚老化度の評価方法。
- 刺激物質が、トロンビン及び/又はリソホスファチジン酸である請求項1記載の評価方法。
- 皮膚線維芽細胞を包埋したコラーゲンゲル、刺激物質及び細胞発生張力測定装置を備えてなる皮膚老化度の評価キット。
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