【０００１】
【発明が属する技術分野】
本発明は遺伝子解析若しくは遺伝子診断に用いられる塩基配列のＤＮＡ標識に関し、カーボンナノチューブの長さによるＡ（アデニン）、Ｃ（シトシン）、Ｇ（グアニン）、Ｕ（ウラシル）、もしくはＴ（チミン）の標識。
【０００２】
【従来の技術】
【０００３】
近年、遺伝情報解析技術の進歩は目覚しく、遺伝子解析の発展により遺伝子診断技術や遺伝子治療技術などの発展が期待されているが遺伝子解析は細胞等の生体試料のＤＮＡを採取し、精製するＤＮＡ抽出工程と目的のＤＮＡを大量に増やすＤＮＡ増幅工程やＤＮＡ成分を分離して検出する抽出工程など複雑な作業と時間を要す。
【０００４】
遺伝子配列をＭａｘａｍおよびＧｉｌｂｅｒｔ配列決定法としてＵＳＡ ７４：５６０−５６４，１９７７によるとＤＮＡは放射標識され、４つのサンプルへと分割され、そしてＤＮＡの特定のヌクレオチド塩基を選択的に破壊し、そして破壊の部位で分子を切断する化学物質で処理する。
【０００５】
ゲル電気泳動を行った後、ゲルをエックス線フィルムに露出し、得られたフラグメントを異なるバンドに分離することによってもとのＤＮＡ分子の配列がフィルムから読まれ、特定の複雑なＤＮＡ分子の配列が決定される。
【０００６】
また、Ｓａｎｇｅｒ配列決定法と称される配列決定のための技術も使用され、ＤＮＡポリメラーゼのＤＮＡ合成活性を使用する。
【０００７】
これは、反応を終結させるジデオキシヌクレオシド三リン酸および短いプライマーの混合物と組み合わせたとき４つのジデオキシ塩基の一つで特異的に終結する新たに合成された、一連のＤＮＡフラグメントを生じる。
【０００８】
これらのフラグメントは、ゲル電気泳動で分離され、配列は、上記のＭａｘａｍおよびＧｉｌｂｅｒｔ配列決定について記載されるように決定される。
【０００９】
４つの別個の反応（各々ｄｄＮＴＰについて一つ）を行うことによって、さらにかなり複雑なＤＮＡ分子の配列が迅速に決定され得る。
【００１０】
上記のような配列決定法が使用されてきたが、Ｍａｘａｍ／ＧｉｌｂｅｒｔおよびＳａｎｇｅｒの配列決定法は、時間がかかり、高価であり、そして配列決定に誤差が生じやすい。
【００１１】
最近になって、核酸分子のヌクレオチド配列の決定は、自動化されたＰＣＲ方法論において使用される比較的高温で活性を保持するＤＮＡポリメラーゼのような、特に熱安定性酵素を用いたポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）の使用に依存する。
【００１２】
核酸配列決定、特にジデオキシ配列決定（例えば、サイクル配列決定）の自動化方法の増幅ベースの方法は、標準的なＳａｎｇｅｒ配列決定において生成される単一のオリゴヌクレオチドとは対照的に、各々のテンプレートから多数のジデオキシ終結したオリゴヌクレオチドの合成を生じる単一プライマーおよびｄｄＮＴＰと組み合わせたＰＣＲ適用における熱安定性ポリメラーゼおよび温度サイクルを利用する。
【００１３】
【発明が解決しようとする課題】
塩基配列決定方法や遺伝子診断において行われている複雑な工程を簡略化する為に、従来法より遺伝子を簡易に処理可能とし、ＤＮＡを構成する一本鎖の塩基配列のＡ（アデニン），Ｃ（シトシン），Ｇ（グアニン）、もしくはＵ（ウラシル）もしくはＴ（チミン）の四塩基それぞれのコード配列を従来法と異なり短時間で連続的に読み取ることを可能とし、かつ正確な解析への応用が可能なＤＮＡ標識方法。
【００１４】
【課題を解決するための手段】
複数の長さが４種類以上のカーボンナノチューブで構成され、先端面は化学修飾する化学官能基の糖とリン酸からなるバインダーでＤＮＡのＡ（アデニン）、Ｃ（シトシン）、Ｇ（グアニン）、Ｕ（ウラシル）、もしくはＴ（チミン）の単体塩基が結合され同一長さのカーボンナノチューブと前記記載の各々１種類の単体塩基の構成により４種類の標識とし、カーボンナノチューブの中空形状の外壁は鉛、鉄、サマリウム、ニッケル、アルミ、銅、ステンレス、チタン、タングステン、コバルト、金、銀、白金、パラジウム、ルテニウム、シリコンなどの金属や貴金属、又は合金、半導体などをスパッタリング、真空蒸着、化学メッキなどのコーティングを施し単体塩基の直径を超えない厚みを備え、鉄、ニッケル成分は外部磁束による吸引効果の作用で単体塩基又は塩基配列の移動、固定、操作に用いる事を特長とする。
【００１５】
請求項１記載のカーボンナノチューブの円筒内空隙に鉛、鉄、サマリウム、ニッケル、アルミ、銅、ステンレス、チタン、タングステン、コバルト、金、銀、白金、パラジウム、ルテニウム、シリコンなどの金属や貴金属、又は合金、半導体など１種または２種以上の異物質が内包されたことを特長とする。
【００１６】
請求項１及び請求項２．記載によるＤＮＡ標識は、別の種と光学的に区別しうる一定のコーディングを有し、紫外、エックス腺、蛍光、可視領域で信号を発する群を支持するかまたは信号を発する群と結合しうる、数多くの分析物特異性の検出少なくともコーディングおよび１つの種の個々の微粒子上の信号を発する群の量、存在または不在を支持体上で光学的に検出可能としたことを備えたことを特長とする。
【００１７】
請求項１及び請求項２記載によるＤＮＡ標識は、電子、磁気、金属成分、金属固有の特性を別の種と区別し、信号を発する群を支持するかまたは信号を発する群と結合しうる、数多くの分析物特異性の検出少なくとも１つの種の個々の微粒子上の信号を発する成分、量、及び存在または不在を検出可能としたことを備えたことを特長とする。
【発明の実施の形態】
【００１８】
炭素原子からなる新しい材料として期待されているカーボンナノチューブは１つまたは複数のグラファイト構造を基本とした面が同心円筒状に配置しており、円筒内部には空洞が形成されている。
【００１９】
カーボンナノチューブは厚さ数原子層のグラファイト状炭素原子面を丸めた円筒が、複数個入れ子になったものであり、ｎｍオーダーの外径の極めて微小な物質である。
【００２０】
特許公開平６−１５７０１６カーボンナノチューブの製造方法などによるとカーボンナノチューブの長さ、直径を制御する発明が開示されている。
【００２１】
前記の製造方法によりカーボンナノチューブの長さを約１μｍとして０．７５μｍ、０．５μｍ、０．３μｍ前後、又は区分可能な４種の長さの異なるカーボンナノチューブを得る。
【００２２】
カーボンナノチューブの外壁側又は円筒内空隙に鉛、鉄、サマリウム、錫、銅、ニッケル、チタン、タングステン、コバルト、金、銀、白金、パラジウム、ルテニウム、シリコンなど１種または２種以上の異物質をコーティング又は内包する。
【００２３】
特開平９−１４２８１９号には、直径１０ｎｍ〜１μｍ、長さ１〜１００μｍのカーボンチューブ内に異物質を内包したカーボンチューブが記載されている。
【００２４】
異物内包カーボンチューブは、略直線状の細孔を有する無機物質を型枠として用い、その細孔内壁に被覆させた有機物質を加熱により炭化することにより、、カーボンチューブを一旦製造した後に異物質を溶液状態又は溶融状態で接触させて、カーボンチューブの中空部分へ異物質を挿入する製造方法。
【００２５】
更に、特開２０００−２０４４７１には、略直線状の細孔を有する無機物質の細孔内壁に筒状のカーボンを形成する第１工程、該筒状カーボンの内部に金属を析出させる第２工程からなる製造法により製造される記載がある。
【００２６】
カーボンナノチューブの先端面は化学修飾する化学官能基の糖とリン酸のバインダーでＤＮＡのＡ（アデニン）、Ｃ（シトシン）、Ｇ（グアニン）、Ｕ（ウラシル）、もしくはＴ（チミン）の各々１種類の単体塩基と結合して構成されており、塩基は相補性があり、任意の１塩基に対しては特定の一塩基のみが水素結合による引力を発生し、結合する。
【００２７】
従ってカーボンナノチューブの長さが異なった先端にはＤＮＡのＡ（アデニン）、Ｃ（シトシン）、Ｇ（グアニン）、Ｕ（ウラシル）、もしくはＴ（チミン）の内１種類を結合して各々４種類の長さのカーボンナノチューブに４種類のＤＮＡが結合されることになる。
【００２８】
試料混合物中の核酸又は核酸断片と、これのヌクレオチド配列に相補的な関係のヌレオチド配列を有するＤＮＡ標識をハイブリッド化させるに適した条件下で接触させる。
【００２９】
試料ＤＮＡ断片をハイブリダイゼーション用の溶液に混合させて固相基板上に添加する。
【００３０】
ハイブリダイゼーションは、公知の手法により標識された試料ＤＮＡ断片を調製し、適量を添加することで行われる。
【００３１】
ハイブリダイゼーションは、室温から７０℃の温度範囲で６時間から２４時間行うことが好ましい。
【００３２】
この時点で、固定されたＤＮＡの分子と相補的な塩基配列をもつ標識されたＤＮＡ中に含まれている分子は、選択的に結合する。
【００３３】
ＤＮＡのＡ（アデニン）、Ｃ（シトシン）、Ｇ（グアニン）、Ｕ（ウラシル）、もしくはＴ（チミン）の内１種類と相補的な関係の単塩基が結合し、核酸の配列長さに応じたＤＮＡ標識が結合される。理論的には塩基配列に対し必要量のＤＮＡ標識が確保されていれば全塩基に対し結合する事になる。
【００３４】
従って核酸の塩基配列と相補的な関係のＤＮＡのＡ（アデニン）、Ｃ（シトシン）、Ｇ（グアニン）、Ｕ（ウラシル）、もしくはＴ（チミン）に標識として結合されている標識は４種類の長さによるカーボンナノチューブで構成、区分する事が可能になる。
【００３５】
このカーボンチューブの一部又は複数に鉄やニッケル成分などを外部にコーティング又は円筒内空隙に充填しておきハイブリッド化後に外部より電磁石の磁力で吸引し、取り出し他の容器に移して磁気を遮断して超純水など不純物を取り除いた洗浄水で不要成分を取り除き、分析可能な環境にする事が可能である。
【００３６】
しかし、分析過程ではある程度の長さに切断しなければ分析操作上困難を伴うので１回当りの分析量としては５００キロ〜１０００キロ塩基長前後を１単位として１回当たりの分析対象とし、以後の分析方法にもよるが１０分〜１時間程度での分析が可能になる。
【００３７】
従来では蛍光標識された塩基配列を蛍光分析で行う方法が主であまり分析手法の選択余地がなかったが、本発明のＤＮＡ標識によると分析方法として超微量エックス線光源照射等によるカーボンナノチューブにコーティングされた鉛などを透過させ不透過部を影として捕らえ画像化し、長さを分析、数値化を可能とする方法や、ＤＮＡ標識の金属部位をレーザー光の反射波を利用した解析方法、紫外光や可視光領域における光学的に可視化、磁気的検出、金属特有の性質の応用により様々な金属が利用可能であり検出方式や分析手法が可能なＤＮＡ標識。
【００３８】
又、本ＤＮＡ標識は塩基配列の１塩基毎に対して標識を行い全塩基配列に対し標識をすることになり、塩基配列の読み込みや遺伝子診断以外にプライマーとして数塩基程度の配列として目的遺伝子の前後と結合させコーティングされた金属特性の利用により切断し、修復酵素による組み換え操作による目的遺伝子だけの組み替えも可能とする事が予想される。
【００３９】
【発明の効果】
本発明によれば単塩基毎のＤＮＡ標識が可能となる為に全塩基配列読み取り、遺伝子診断、遺伝子関連のドラツグディスカバリー、遺伝子スクリ‐ニングなどに応用可能であり、従来方法に比較して遺伝子情報を持つＲＮＡ中の全塩基配列が読み取れると、その相補性を利用してもとのＤＮＡの全塩基配列を決定することが容易となると共に、分析時間の短縮、分析精度の向上などが得られ又、ＤＮＡの全塩基配列が既知であれば、さらにそのＤＮＡの存在位置を染色体まで戻ることが可能となる。本発明を利用することで、染色体中の特定ＤＮＡ配列中で一塩基の配列の違いで発生する生体上の外形もしくは機能についての優位差など、遺伝子の配列に起因する多型解析および機能解析に応用することができる。[0001]
TECHNICAL FIELD OF THE INVENTION
The present invention relates to DNA labeling of a base sequence used for gene analysis or gene diagnosis, and relates to the labeling of A (adenine), C (cytosine), G (guanine), U (uracil), or T (thymine) depending on the length of carbon nanotube. Signs.
[0002]
[Prior art]
[0003]
In recent years, the progress of genetic information analysis technology has been remarkable, and the development of gene diagnosis technology and gene therapy technology is expected due to the development of gene analysis. However, genetic analysis involves DNA extraction, which collects and purifies DNA from biological samples such as cells. A complicated operation and time are required, such as a DNA amplification step for increasing the number of steps and target DNA in a large amount, and an extraction step for separating and detecting DNA components.
[0004]
According to USA 74: 560-564, 1977, the gene sequence is labeled as Maxam and Gilbert sequencing DNA is radiolabeled, split into four samples, and selectively destroys and destroys specific nucleotide bases of DNA. Treat with chemicals that cut the molecule at the site.
[0005]
After performing the gel electrophoresis, the gel is exposed to X-ray film, and the resulting fragments are separated into different bands, whereby the sequence of the original DNA molecule is read from the film, and the sequence of a specific complex DNA molecule is determined. It is determined.
[0006]
A technique for sequencing called Sanger sequencing is also used, which uses the DNA synthesis activity of DNA polymerase.
[0007]
This results in a series of newly synthesized DNA fragments that specifically terminate at one of the four dideoxy bases when combined with a mixture of dideoxynucleoside triphosphates and short primers that terminate the reaction.
[0008]
These fragments are separated by gel electrophoresis and the sequence is determined as described for Maxam and Gilbert sequencing above.
[0009]
By performing four separate reactions, one for each ddNTP, the sequence of a much more complex DNA molecule can be rapidly determined.
[0010]
Although sequencing methods such as those described above have been used, the Maxam / Gilbert and Sanger sequencing methods are time consuming, expensive, and prone to errors in sequencing.
[0011]
More recently, the determination of the nucleotide sequence of a nucleic acid molecule has been performed by polymerase chain reaction (PCR), particularly using thermostable enzymes, such as DNA polymerases that retain activity at relatively high temperatures used in automated PCR methodology. ) Depends on the use.
[0012]
The amplification-based methods of automated methods of nucleic acid sequencing, particularly dideoxy sequencing (eg, cycle sequencing), require that each template be contrasted with a single oligonucleotide generated in standard Sanger sequencing. It utilizes a thermostable polymerase and temperature cycling in PCR applications in combination with a single primer and ddNTPs resulting in the synthesis of multiple dideoxy terminated oligonucleotides.
[0013]
[Problems to be solved by the invention]
In order to simplify the complicated steps performed in the base sequence determination method and the gene diagnosis, the gene can be processed more easily than the conventional method, and the single-stranded base sequences A (adenine), C Unlike conventional methods, it enables continuous reading of the coding sequence of each of the four bases (cytosine), G (guanine), U (uracil) or T (thymine) in a short time, and is applied to accurate analysis. DNA labeling method capable of
[0014]
[Means for Solving the Problems]
A plurality of carbon nanotubes each having a length of four or more are formed, and the tip surface is a binder composed of a sugar and a phosphate of a chemical functional group to be chemically modified, and DNA A (adenine), C (cytosine), G (guanine), A single base of U (uracil) or T (thymine) is bonded to the carbon nanotube of the same length, and each of the single bases described above constitutes four kinds of labels. The hollow outer wall of the carbon nanotube is made of lead. Sputtering, vacuum evaporation, chemical plating, etc. of metals such as iron, samarium, nickel, aluminum, copper, stainless steel, titanium, tungsten, cobalt, gold, silver, platinum, palladium, ruthenium, silicon, and precious metals, alloys, and semiconductors With a thickness not exceeding the diameter of a single base, iron and nickel components are attracted by external magnetic flux Movement of a single nucleotide or base sequence by the action of fruit, stationary, that feature be used in the operation.
[0015]
Metals and noble metals such as lead, iron, samarium, nickel, aluminum, copper, stainless steel, titanium, tungsten, cobalt, gold, silver, platinum, palladium, ruthenium, silicon, etc. It is characterized in that one or two or more different substances such as alloys and semiconductors are included.
[0016]
Claims 1 and 2. The DNA label according to the description has a coding that is optically distinguishable from another species and can support or bind to groups that emit signals in the ultraviolet, X-ray, fluorescence, visible region. Detection of a large number of analyte specificities, characterized in that at least coding and the amount, presence or absence of a signal-generating group on individual microparticles of one species can be detected optically on the support And
[0017]
The DNA label according to claim 1 and claim 2 distinguishes electron, magnetism, metal components, metal-specific properties from another species, and can support or combine with the signaling group. Detection of a number of analyte specificities is characterized by the fact that at least one species capable of detecting a signal-emitting component, amount and presence or absence on individual microparticles is detectable.
BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION
[0018]
Carbon nanotubes, which are expected to be a new material composed of carbon atoms, have one or more surfaces based on a graphite structure arranged in a concentric cylinder shape, and a cavity is formed inside the cylinder.
[0019]
A carbon nanotube is a very small substance having an outer diameter on the order of nanometers in which a plurality of cylinders each having a rounded graphite-like carbon atom surface having a thickness of several atomic layers are nested.
[0020]
According to Japanese Patent Application Laid-Open No. 6-157016, a method for producing carbon nanotubes, an invention for controlling the length and diameter of carbon nanotubes is disclosed.
[0021]
According to the above manufacturing method, carbon nanotubes having different lengths of about 0.75 μm, 0.5 μm, 0.3 μm, or four kinds of different lengths can be obtained by setting the length of the carbon nanotubes to about 1 μm.
[0022]
One or two or more foreign substances such as lead, iron, samarium, tin, copper, nickel, titanium, tungsten, cobalt, gold, silver, platinum, palladium, ruthenium, and silicon are placed on the outer wall side of the carbon nanotube or in the cavity in the cylinder. Coating or enclosing.
[0023]
Japanese Patent Application Laid-Open No. 9-142819 describes a carbon tube in which a foreign substance is included in a carbon tube having a diameter of 10 nm to 1 μm and a length of 1 to 100 μm.
[0024]
The foreign substance-encapsulated carbon tube is made of an inorganic substance having substantially linear pores as a mold, and carbonized by heating the organic substance coated on the inner walls of the pores. In which a foreign substance is inserted into a hollow portion of a carbon tube by contacting the substance in a solution state or a molten state.
[0025]
Further, Japanese Patent Application Laid-Open No. 2000-204471 discloses a first step of forming a tubular carbon on the inner wall of a pore of an inorganic substance having substantially linear pores, and a second step of depositing a metal inside the tubular carbon. There is a description produced by a production method consisting of
[0026]
The tip surface of the carbon nanotube is a binder of a sugar and a phosphoric acid of a chemical functional group to be chemically modified, and each of DNA A (adenine), C (cytosine), G (guanine), U (uracil) or T (thymine) is used. The bases are complementary to each other, and the bases are complementary. Only one specific base generates an attractive force due to hydrogen bonding to any one base, and thus bonds.
[0027]
Therefore, one end of A (adenine), C (cytosine), G (guanine), U (uracil), or T (thymine) of DNA is bonded to the tips having different lengths of carbon nanotubes, and each of the four types is combined. The four types of DNA are bound to the carbon nanotube having the length.
[0028]
The nucleic acid or nucleic acid fragment in the sample mixture is contacted with a DNA label having a nucleotide sequence in a complementary relationship to its nucleotide sequence under conditions suitable for hybridizing.
[0029]
A sample DNA fragment is mixed with a solution for hybridization and added to a solid phase substrate.
[0030]
Hybridization is performed by preparing a labeled sample DNA fragment by a known method and adding an appropriate amount.
[0031]
Hybridization is preferably performed in a temperature range from room temperature to 70 ° C. for 6 hours to 24 hours.
[0032]
At this point, the molecules contained in the labeled DNA having a base sequence complementary to the molecules of the immobilized DNA selectively bind.
[0033]
A single base having a complementary relationship to one of A (adenine), C (cytosine), G (guanine), U (uracil), or T (thymine) of DNA binds, depending on the sequence length of the nucleic acid. DNA label is attached. Theoretically, if a required amount of DNA label is secured for the base sequence, it will bind to all bases.
[0034]
Therefore, there are four types of labels that are bound to A (adenine), C (cytosine), G (guanine), U (uracil), or T (thymine) of DNA complementary to the base sequence of the nucleic acid. It is possible to compose and classify carbon nanotubes according to their length.
[0035]
Part or more of this carbon tube is coated with iron or nickel components, etc. on the outside or filled in the cavity inside the cylinder, and after hybridization, it is sucked from the outside by the magnetic force of an electromagnet, taken out, transferred to another container and cut off magnetism. It is possible to remove unnecessary components with cleaning water from which impurities such as ultrapure water have been removed, thereby creating an environment where analysis is possible.
[0036]
However, in the analysis process, unless it is cut to a certain length, it is difficult to perform an analysis operation. Although it depends on the analysis method, analysis can be performed in about 10 minutes to 1 hour.
[0037]
Conventionally, the method of performing a fluorescently-labeled base sequence by fluorescence analysis has been mainly used, and there was not much choice in an analysis method. A method that allows the penetration of lead, etc., and captures an image of the opaque part as a shadow, and analyzes and digitizes the length.A method of analyzing the metal part of the DNA label using a reflected wave of laser light, A DNA label that can be used for various metals due to its optical visualization in the visible light region, magnetic detection, and the application of properties specific to metals, and can be used for detection and analysis.
[0038]
In addition, the present DNA label is used to label each base in the base sequence and label the entire base sequence. In addition to reading the base sequence and performing gene diagnosis, the sequence of about several bases is used as a primer as a sequence of several bases. It is anticipated that it will be possible to cut the target gene by recombination using a repair enzyme, by using the properties of the coated metal that has been bonded before and after.
[0039]
【The invention's effect】
According to the present invention, since DNA labeling can be performed for each single base, it can be applied to all base sequence reading, gene diagnosis, gene-related drug discovery, gene screening, and the like. If the entire base sequence in RNA with information can be read, it will be easy to determine the entire base sequence of the original DNA using its complementarity, and it will also shorten the analysis time and improve the analysis accuracy. In addition, if the entire base sequence of the DNA is known, it is possible to further return the location of the DNA to the chromosome. By utilizing the present invention, polymorphism analysis and functional analysis due to the sequence of a gene, such as a difference in the outer shape or function in a living body caused by a single base sequence difference in a specific DNA sequence in a chromosome, can be performed. Can be applied.