JP2004350637A

JP2004350637A - Inspection method for mugwort

Info

Publication number: JP2004350637A
Application number: JP2003154629A
Authority: JP
Inventors: Hiroto Yamakawa; 宏人山川; Eriko Suzuki; 江里子鈴木
Original assignee: Nisshin Seifun Group Inc
Current assignee: Nisshin Seifun Group Inc
Priority date: 2003-05-30
Filing date: 2003-05-30
Publication date: 2004-12-16
Anticipated expiration: 2023-05-30
Also published as: JP4215568B2

Abstract

<P>PROBLEM TO BE SOLVED: To provide an inspection method for mugwort (Artemisia princeps) that can specifically and exactly measure the mugwort included in specimens, for example, food products. <P>SOLUTION: A primer that is designed on the basis of the genetic information of mugwort and can specifically detect mugwort is used to carry out PCR (Polymerase Chain Reaction) and the mugwort in the specimens is determined quantitatively or measured qualitatively. <P>COPYRIGHT: (C)2005,JPO&NCIPI

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ヨモギの検査方法に関する。詳細には、食品等の被検試料中のヨモギを定性的または定量的に測定しうるヨモギの検査方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
ヨモギはキク科の多年草（キク科ヨモギ属、和名「ヨモギ」、学名「Ａｒｔｅｍｉｓｉａｐｒｉｃｅｐｓ」）で、東アジア一帯（例えば、中国、韓国等）、日本ではほぼ全土に自生している。この他に、ヨモギ属には大型で山地に生育する「オオヨモギ（ヤマヨモギ）」、河口泥地に群生する「フクド（ハマヨモギ）」や、河原に多く見られる「カワラヨモギ」等の他、一部地域にだけ見られる種類に、「サマニヨモギ」、「ミヤマオトコヨモギ」、「シロヨモギ」等があり、これら全てのヨモギ属植物は次にように薬や食品として活用される。
【０００３】
例えば、ヨモギは草餅や草だんご、パン、茶の他、麺類等に添加されており、よく知られ、多用される食品原料のひとつである。また、漢方薬「がいよう」として婦人科でよく用いられる他、乾燥させた葉の裏の白い繊毛を集めたものが灸の材料モグサとして利用されている。
【０００４】
原料としてヨモギを取り扱う食品工場等においては、製造過程におけるコンタミネーション等が原因で、ヨモギ無添加食品への意図せざるヨモギの混入が生じる可能性がある。ヨモギが加工食品に混入すると、流通過程や接触時に変色や異臭等の問題が生じることがあり、結果としてその商品の回収・廃棄等経済的に大きな不利益を被るばかりか、製造・犯罪基として消費者の信頼の失墜に繋がる。このため、ヨモギを取り扱う食品工場等では加工食品や製品の品質管理として、ヨモギの混入を検査することが求められている。
【０００５】
一方、食品中に微量に含まれる食品原料や素材を検出する方法として、その食品原料由来の特定タンパク質を検出する免疫化学的手法（例えば、ウェスタンブロッティング法、ＥＬＩＳＡ法等）が実施されているが、これらの方法はその特定のタンパク質が変成している可能性がある加工素材・食品においては必ずしも有効ではない。
【０００６】
また、食品からＤＮＡを抽出し、特定のＤＮＡ配列を標的としてＰＣＲを行って特定の食品原料を検出する方法が提案されている（特許文献１参照。）。しかし、該方法では特定の食品原料以外との交叉反応がある。このような交叉反応は、検査で偽陽性、偽陰性の可能性があり、不要な加工食品の廃棄や混入製品の流通といった問題が生じる可能性がある。
【０００７】
さらに、上述の方法のうちヨモギを対象とする検査方法は知られておらず、このため食品中に混入するヨモギについては、商品の流通過程での変色や異臭について検査を行うか、製造過程におけるコンタミネーションの防止を図る等の対策が採られているにすぎなかった。
【０００８】
【特許文献１】特開２００１−３０９７８６号公報
【０００９】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の課題は、食品等の被検試料中に微量に存在するヨモギを簡便に、かつ正確に測定しうる方法を提供することである。
【００１０】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記課題の解決を目的として鋭意検討した結果、ヨモギ特異的な特定のプライマーを構築し、これを用いてＰＣＲを行うことにより、原材料や加工食品中のヨモギを高精度に検出することができることを見出した。
すなわち、本発明は、以下の（１）〜（７）に関する。
【００１１】
（１）ヨモギの遺伝情報に基づき設計され、ヨモギを特異的に検出しうるプライマーを用いてＰＣＲ（ＰｏｌｙｍｅｒａｓｅＣｈａｉｎｒｅａｃｔｉｏｎ）を行うことを特徴とする、被検試料中のヨモギを定性的または定量的に測定する方法。
なお、本発明において被検試料は、食品原料、その加工中間原料、加工食品が含まれる。また、食品素材または食品はヒトの食品のみならず、ペットフードや飼料を含む。
【００１２】
（２）遺伝情報が、ヨモギ（Ａｒｔｅｍｉｓｉａｖｕｌｇａｒｉｓ）の補因子−非依存性ホスホグリセリン酸ムターゼをコードする遺伝子（ＡｃｃｅｓｓｉｏｎＮｏ．Ａ６０４４３）の塩基配列である前記（１）に記載の方法。
【００１３】
（３）前記プライマーが、（ａ）配列番号１に示される塩基配列、（ｂ）その相補的塩基配列、または（ｃ）前記（ａ）もしくは（ｂ）とハイブリダイズするＤＮＡの塩基配列の少なくとも５〜３５個の連続した塩基配列を有する上記（１）または（２）に記載の方法。
【００１４】
（４）前記プライマーが、配列番号１８に示されるプライマーＡｒｔ１７、配列番号１９に示されるプライマーＡｒｔ１８、またはこれらのプライマーと実質的に同一の塩基配列を有する、即ち少なくとも８０％の塩基配列が一致するプライマーである上記（１）〜（３）のいずれかに記載の方法。
【００１５】
（５）ヨモギを特異的に検出し、ライムギ、オオムギ、コメ、トウモロコシ、ダイズ、アワ、ナタネ、オーツムギ、コムギ、ソバ、ノギク、タンポポ、ブタクサ、アザミおよびヒメジョンとは交叉反応しない、上記（１）〜（４）のいずれかに記載の方法。
【００１６】
（６）上記（１）〜（５）のいずれかに記載の方法に用いる、ヨモギの遺伝情報に基づき設計され、ヨモギを特異的に検出しうるＰＣＲ用プライマー。
（７）上記（６）に記載のプライマーを含有する、試料中のヨモギを定性的または定量的に測定するためのキット。
【００１７】
【発明の実施の形態】
以下に、本発明を詳細に説明する。
本発明は、ヨモギの遺伝情報に基づきＰＣＲ用プライマーを設計してＰＣＲを行い、食品中のヨモギの有無を測定する方法（以下、「本発明の方法」という場合がある。）である。
【００１８】
被検試料として検査される食品は、原材料であっても、加工段階のいずれであっても、加工後の食品であってもよい。本発明の方法は、食品中の例えば、全食品に対するヨモギの質量比、またはＤＮＡレベルでのヨモギ由来ＤＮＡの質量もしくは体積比で、１％以下、好ましくは１００ｐｐｍ以下、さらには５０ｐｐｍ以下、特に１０ｐｐｍ程度の微量のヨモギの存在の有無を検出することができる。このため、意図しないヨモギの混入、調味料や添加物の一部として微量存在しても検出することができる。さらに核酸（ＤＮＡ）は、タンパク質等の他の生体物質に比べて、加熱等の食品加工に対して比較的安定であり、加熱、調理等、加工された食品中の微量の存在を検出できる。
【００１９】
また、本発明の方法は、食品へのヨモギ混入等の正確な情報を与え、検査における偽陰性、偽陽性の心配がない、食品等の被検試料中のヨモギを特異的にかつ正確に検出または測定できることが必要とされる。すなわち、本発明の方法に用いるＰＣＲ用プライマーは、ヨモギを特異的に検出し、ヨモギ以外の植物や食品原料、例えば、ライムギ、オオムギ、コメ、トウモロコシ、ダイズ、アワ、ナタネ、オーツムギ、コムギ、ソバ、ノギク、タンポポ、ブタクサ、アザミおよびヒメジョン等とは交叉反応しないように設計される必要がある。そのようなプライマーはヨモギの遺伝情報に基づいて設計される。
【００２０】
ヨモギの遺伝情報は、ヨモギ属植物から抽出したＤＮＡもしくはそのＤＮＡライブラリーから常法により塩基配列を決定することにより得てもよいが、今日では多くの既知の遺伝情報を用いることができる。例えば、国立遺伝学研究所（ＤＤＢＪ）等のデーターベースからヨモギのＤＮＡ配列情報を得て、該配列の一部から本発明のＰＣＲに適したプライマーを設計して、ヨモギの検出に用いることができる。また、ヨモギの遺伝情報としては、日本産ヨモギ（例えば、Ａｒｔｅｍｉｓｉａｐｒｉｃｅｐｓ等）に限らず、外国産の近種のヨモギ（例えば、Ａｒｔｅｍｉｓｉａｖｕｌｇａｒｉｓ等）の遺伝情報を用いてもよい。本発明においては、ヨモギ（Ａｒｔｅｍｉｓｉａｖｕｌｇａｒｉｓ）由来の補因子−非依存性ホスホグリセリン酸ムターゼをコードする遺伝子（ＡｃｃｅｓｓｉｏｎＮｏ．Ａ６０４４３、配列番号１）の塩基配列を遺伝情報として用いている。
【００２１】
プライマーの設計は、本発明の方法を考慮して以下の条件等に留意する。
条件として、（ｉ）プライマーのＧＣ含量が４０〜６０％、（ｉｉ）プライマーのＴｍ値が５５〜７０℃、（ｉｉｉ）センス、アンチセンスプライマーのＴｍ値が近い、（ｉｖ）プライマーの３′末端側で相補的配列を有していない、（ｖ）プライマーが高次構造を形成しない、（ｖｉ）プライマーの全長は５〜５０ｍｅｒ、好ましくは１５〜３５ｍｅｒ、（ｖｉｉ）プライマーの３′末端側のＧＣ含量を低くする、（ｖｉｉｉ）プライマー内で同一ヌクレオチドが多数連続する配列は回避する、（ｉｘ）プライマーは増幅すべき鋳型ＤＮＡの片側１本鎖の配列と完全に一致している必要はないが、３′末端側の相補性を高くする、（ｘ）使用する鋳型ＤＮＡにおいて、プライマー部位の他に同様の配列がない等である。
【００２２】
本発明の方法は、生の原材料だけでなく、加工段階の食品や加熱、調理等の加工食品にも使用可能であることが必要とされる。このため、使用されるヨモギの鋳型ＤＮＡがインタクトだけではなく、細かく切断されたＤＮＡ断片である場合があり、（ｘｉ）ＰＣＲにより増幅されるＤＮＡ領域は、比較的短いことが好ましい。
本発明の方法に用いるプライマーは、該ＤＮＡ領域において（ｉ）〜（ｘｉ）の全ての条件を満たすプライマーとして設計する。しかし、これらの条件を全て満たすプライマーを設計することは難しく、条件を満たすプライマーを設計できたとしてもＰＣＲを行う上での必要条件でしかなく、所望のＰＣＲの結果が得られるかどうかは、実際にＰＣＲを行ってみないと判らない。それ故、プライマーの設計は、ＰＣＲを行う上で非常に困難な問題となっている。
【００２３】
本発明におけるプライマーは、配列番号１に示されるＤＮＡ配列より選択される少なくとも５〜３５個の連続した塩基配列を有するプライマーである。そのようなプライマーの例には、配列番号２〜配列番号２０に示される各オリゴヌクレオチドプライマーが挙げられる。また、プライマーのセットとしては、例えば、Ａｒｔ０１（配列番号２）／０２（配列番号３）、Ａｒｔ０３（配列番号４）／０４（配列番号５）、Ａｒｔ０５（配列番号６）／０６（配列番号７）、Ａｒｔ０７（配列番号８）／０８（配列番号９）、Ａｒｔ０９（配列番号１０）／１０（配列番号１１）、Ａｒｔ１１（配列番号１２）／１２（配列番号１３）、Ａｒｔ１３（配列番号１４）／１４（配列番号１５）、Ａｒｔ１５（配列番号１６）／１６（配列番号１７）、Ａｒｔ１７（配列番号１８）／１８（配列番号１９）、Ａｒｔ１７（配列番号１８）／２０（配列番号２０）、好ましくは、Ａｒｔ０７（配列番号８）／０８（配列番号９）、Ａｒｔ１７（配列番号１８）／１８（配列番号１９）が挙げられる。
【００２４】
一般的に、ＰＣＲにより増幅すべき領域（鋳型ＤＮＡ領域）がほぼ同一であれば、プライマーの配列が５′側および／または３′側に１〜１０数塩基ずれても同様のＰＣＲ結果（ＰＣＲ産物）が得られる可能性があることが知られている。したがって、本発明のプライマーは、特定の配列および長さのプライマーに限定されず、該プライマーと実質的に同一の機能を有するプライマーもまた包含する。故に、本発明のプライマーは、あるプライマーおよび該プライマーと同じ鋳型ＤＮＡの領域にハイブリダイズするプライマーを包含する。具体的には、例えば、各プライマーの１または数塩基を欠失、置換、付加および／または挿入したプライマー、対応する鋳型ＤＮＡに対し５′側および／または３′側に１または数塩基ないしは１０数塩基ずれているプライマー、もとのプライマーと少なくとも８０％、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上の配列が一致するプライマーである。
【００２５】
本発明において、ＰＣＲ法は特に限定されず、公知である種々の改良方法を含むが、１例を挙げれば、プライマーのセット、鋳型（被検）ＤＮＡの他にＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ＫＣｌ、ＭｇＣｌ_２、各ｄＮＴＰ、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ等の試薬類を混合してＰＣＲ反応液とする。ＰＣＲの１サイクルは、熱変性、アニーリング、ＤＮＡポリメラーゼによるＤＮＡ合成反応の３つのステップからなる。各ステップはそれぞれ異なる、場合により同一の反応温度と反応時間を必要とし、これらは増幅すべきＤＮＡ領域の塩基配列、長さに等により適宜決定される。このような操作のためのｔｈｅｒｍａｌｃｙｃｌｅｒが市販されている。
【００２６】
本発明の方法においては、ＤＮＡポリメラーゼ、ＭｇＣｌ_２の濃度や反応サイクル数等好適なＰＣＲ条件の検討、またはｎｅｓｔｅｄＰＣＲを用いれば、さらに検出感度が向上する可能性がある。
【００２７】
ＰＣＲの結果（ＰＣＲ産物）は、特定のＤＮＡ断片を同定しうる任意の方法、例えば、電気泳動、キャピラリー電気泳動、ハイブリダイゼーション、免疫学的方法等を用いて同定することができる。一般的には、ＰＣＲ産物を電気泳動し、その泳動パターンにより確認する。この場合、所望のサイズの明瞭なバンドが認められれば、被検試料中にヨモギの存在を検出することできる。また、種々の量の鋳型ＤＮＡを用いることにより、ヨモギのみを定量的に測定することができる。
【００２８】
本発明は、上記ＰＣＲ用プライマーを含む本発明の方法を実施するためのキットを包含する。該キットは、上記ＰＣＲ用プライマーの他に、ＰＣＲに広く用いられる公知の試薬を含有していても、電気泳動装置等の他の装置が付属していてもよい。
試薬としては、例えば、ｄＮＴＰ、ＭｇＣｌ_２、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ等のポリメラーゼ、緩衝液（例えばＴｒｉｓ−ＨＣｌ）、グリセロール、ＤＭＳＯ、ポジティブコントロール用ＤＮＡ、ネガティブコントロール用ＤＮＡ、蒸留水等が挙げられる。これらの試薬はキットの中で、それぞれ独立に梱包されて提供されてもよいし、２種以上の試薬が混合された形で提供されてもよい。キット中のそれぞれの試薬の濃度に特に制限はなく、本発明のＰＣＲを実施するについて可能な範囲であればよい。また、キットには、好適なＰＣＲ条件等の情報がさらに添付されていてもよいし、プライマー試薬のみであってもよい。
【００２９】
【実施例】
以下に本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
（１）ヨモギ検出のためのプライマーの構築
ヨモギ由来ＤＮＡを検出するためのプライマーを構築するにあたって、国立遺伝学研究所（ＤＤＢＪ）のデータベースにアクセスし、ヨモギの既知遺伝子配列の検索を行った。
しかし、日本産ヨモギ（Ａｒｔｅｍｉｓｉａｐｒｉｃｅｐｓ等）のＤＮＡ情報はなく、本発明では外国産ヨモギ（ＡｒｔｅｍｉｓｉａＶｕｌｇａｒｉｓ）由来の補因子−非依存性ホスホグリセリン酸ムターゼをコードする遺伝子（ＡｃｃｅｓｓｉｏｎＮｏ．Ａ６０４４３、配列番号１）の塩基配列情報をもとにプライマーを設計した。
【００３０】
本発明者は、プライマーを設計するために、上記遺伝子配列についてソフトウェア「ＧＥＮＥＴＹＸＭＡＣ」を使用して、プライマーの候補となる配列の検索を行った。「ＧＥＮＥＴＹＸＭＡＣ」は、プライマー設計の上記条件のうち、手計算では解析困難な条件（ｉ）ＧＣ含量、（ｉｉ）Ｔ_ｍ値の範囲設定を行えることから使用した。その結果、候補として１５０以上のプライマーのセット（センスプライマーおよびアンチセンスプライマー）の中から特に８７セットをピックアップした。ついで、これらの中で上記（ｉ）〜（ｘｉ）のプライマー設計のための条件を全て満たすプライマーとして、本発明者が独自に検索することにより、１０セットのＰＣＲ用プライマーをＱＩＡＧＥＮにて作製した。作製したプライマーを第１表に示す。
【００３１】
【表１】

【００３２】
（２）ＤＮＡの抽出
ヨモギおよびその他のキク科植物の葉は、表面を純水で洗浄した後よく乾燥させた。穀物については表面を１％ＴｒｉｔｏｎＸ（和光純薬（株）製）により洗浄した後蒸留水ですすぎ、よく乾燥させた。その後マルチビーズショッカー（安井機械（株）製）により微粉砕した。粉末ヨモギについてはそのままＤＮＡ抽出に供した。
得られた各粉砕サンプル１ｇおよび粉末ヨモギのＤＮＡを、厚生労働省医薬局食品保健部長通知食発第１１０６００１号（平成１４年１１月６日付け）「アレルギー物質を含む食品の検査方法について」（以下、単に「通知法」という。）に記載されたプロトコールに従って、ＤｎｅａｓｙＰｌａｎｔＭａｘｉｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いて抽出した。加工食品については２４時間フリーズドライ処理後２ｇを、上記通知法のＧｅｎｏｍｉｃＴｉｐ２０／Ｇ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いた方法に従ってＤＮＡを抽出した。抽出された各ＤＮＡは吸光度の測定により濃度を求めた後、純水を用いて２０ｎｇ／μＬに希釈し、これをＰＣＲの鋳型（被検）ＤＮＡ試料液として用いた。
【００３３】
（３）ＰＣＲと電気泳動像によるヨモギの検出
ＰＣＲ反応液は以下のようにして調製した。
すなわち、ＰＣＲ緩衝液（ＰＣＲｂｕｆｆｅｒＩＩ、アプライドバイオシステムズ社）、２００μｍｏｌ／ＬｄＮＴＰ、１．５ｍｍｏｌ／ＬＭｇＣｌ_２、０．５μｍｏｌ／Ｌ各プライマーおよび０．６２５単位ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（ＡｍｐｌｉＴａｑＧｏｌｄ、アプライトバイオシステムズ社）を含む液に、２０ｎｇ／μＬに調整したＤＮＡ試料液２．５μＬを加え、全量を２５μＬとした。
【００３４】
ＰＣＲ増幅装置にはＧｅｎｅＡｍｐＰＣＲＳｙｓｔｅｍ９６００（アプライドバイオシステムズ社）を用い、反応条件は次のように設定した。
まず９５℃に１０分間保ち反応を開始させ、次に９５℃で３０秒間、６０℃で３０秒間、７２℃で３０秒間を１サイクルとして、４０サイクルのＰＣＲの増幅を行った。最後に終了反応として７２℃に７分間保った後４℃で保存し、得られた反応液をＰＣＲ増幅反応液とした。
ＰＣＲ増幅反応液はエチジウムブロミドを含む２％アガロースゲル（２％Ｅ−Ｇｅｌ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）による電気泳動に供し、陰性コントロール（鋳型ＤＮＡを含まれいＰＣＲ反応液：ＮＴＣ）および陽性コントロール（ヨモギより抽出したＤＮＡ）のバントの有無およびサイズによってＰＣＲの妥当性を判断すると共に、各プライマーによるＰＣＲ産物のバンドとそのサイズを確認することによって試料中のヨモギの混入の有無を判定した。
【００３５】
また同時に、下記の植物ＤＮＡ検出プライマー：
ＣＰ０３−５’：５’−ＣＧＧＡＣＧＡＧＡＡＴＡＡＡＧＡＴＡＧＡＧＴ−３’ （配列番号２１）
ＣＰ０３−３’：５’−ＴＴＴＴＧＧＧＧＡＴＡＧＡＧＧＧＡＣＴＴＧＡ−３’ （配列番号２２）
を用いてＰＣＲ反応を行い、ＤＮＡ試料液にＰＣＲ反応に至適なＤＮＡが確実に含まれていることを確認した。
【００３６】
実験例１：ヨモギ検出プライマーの選抜（１）
粉末ヨモギ由来のＤＮＡを鋳型として、第１表に示すプライマー１０セットについてＰＣＲを行った。その結果、Ａｒｔ１７（配列番号１８）／２０（配列番号２０）ではＰＣＲ増幅産物が認められず、Ａｒｔ０３（配列番号４）／０４（配列番号５）、Ａｒｔ０９（配列番号１０）／１０（配列番号１１）、Ａｒｔ１１（配列番号１２）／１２（配列番号１３）、Ａｒｔ１３（配列番号１４）／１４（配列番号１５）およびＡｒｔ１５（配列番号１６）／１６（配列番号１７）ではＰＣＲ増幅産物は認められるが、予想される増幅サイズとは異なっていた。これに対して、Ａｒｔ０１（配列番号２）／０２（配列番号３）、Ａｒｔ０５（配列番号６）／０６（配列番号７）、Ａｒｔ０７（配列番号８）／０８（配列番号９）およびＡｒｔ１７（配列番号１８）／１８（配列番号１９）では予想されるＰＣＲ増幅産物のバンドのみが検出された。これらの結果を第２表に示す。
【００３７】
【表２】

【００３８】
実験例２：ヨモギ検出プライマーの選抜（２）
実験例１において、所望のＰＣＲ増幅産物が得られたプライマーＡｒｔ０１／０２、Ａｒｔ０５／０６、Ａｒｔ０７／０８およびＡｒｔ１７／１８のセットについて再度ＰＣＲを行った。ＤＮＡ試料として、粉末ヨモギのＤＮＡの他に、採取場所の異なる生のヨモギ葉から抽出したＤＮＡを用いて実験例１と同様にＰＣＲを行い、ＰＣＲ増幅産物を電気泳動にて確認した（図１）。
その結果、所望のＰＣＲ増幅産物のバンドが明瞭なプライマーのセットとして、Ａｒｔ０７／０８およびＡｒｔ１７／１８を選択した。
なお、図１の電気泳動像において、レーン１および２はヨモギ葉ＤＮＡ（生ヨモギ）、レーン３は粉末ＤＮＡ（粉末ヨモギ）、ＭはＤＮＡサイズマーカーを示す。
【００３９】
実験例３：ヨモギ検出プライマーの選抜（３）
ライムギ２種（１；ドイツ産、２；カナダ産）、オオムギ、コメ、トウモロコシ、ダイズ、アワ、ナタネ、オーツムギ、ソバ、コムギおよびヨモギ由来のそれぞれのＤＮＡを試料として、実験例２で選択したプライマーのセット（Ａｒｔ０７／０８およびＡｒｔ１７／１８）によるＰＣＲを行い、プライマーのヨモギ特異性を検証した。これらの結果を第３表に示す。
【００４０】
【表３】

【００４１】
その結果、Ａｒｔ１７／１８ではヨモギにのみ強いシングルバンドが検出された。Ａｒｔ０７／０８ではライムギに予想サイズと異なるバンドが検出され、さらに、ダイズ、アワ、ナタネおよびコムギとの交叉反応が認められた。
なお、各資料ＤＮＡについて、植物ＤＮＡ検出プライマーＣＰ０３−５’／３’による増幅が認められたため、ＤＮＡ試料はＰＣＲに適当であったことが示されている。
【００４２】
実験例４：プライマーのヨモギ特異性の評価
実験例３にて選択したプライマーＡｒｔ１７／１８を用いて、ヨモギ以外のキク科植物として、ノギク２種（ノギク黄花、ノギク白花）、セイヨウタンポポ、ブタクサ、アザミおよびヒメジョンの葉由来のＤＮＡ、他の穀物としてライムギ、オオムギ、コメ、トウモロコシ、ダイズ、アワ、ナタネ、オーツムギ、ソバ、コムギ由来のＤＮＡおよびヨモギＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行い、さらにプライマーのヨモギ特異性を確認した。これらの結果を第４表および図２に示す。
【００４３】
【表４】

【００４４】
その結果、ヨモギのみに強いシングルバンドが検出され、ヨモギ以外の植物との交叉反応は認められず、プライマーＡｒｔ１７／１８のセットがヨモギに対して高い特異性を有することが示された。
なお、図２の電気泳動像において、レーン１はライムギ、レーン２はオオムギ、レーン３はコメ、レーン４はトウモロコシ、レーン５はダイズ、レーン６はアワ、レーン７はナタネ、レーン８はオーツムギ、レーン９はソバ、レーン１０はコムギ、レーン１１はノギク（黄花）、レーン１２はノギク（白花）、レーン１３はセイヨウタンポポ、レーン１４はブタクサ、レーン１５はアザミ、レーン１６はヒメジョン、レーン１７はヨモギ、レーン１８はＮＴＣ、ＭはＤＮＡサイズマーカーを示す。
【００４５】
実験例５：検出限界の評価
擬似混入ＤＮＡサンプルを鋳型テンプレートとして、プライマーＡｒｔ１７／１８によるＰＣＲを行い、ヨモギＤＮＡの検出限界を確認した。
ＤＮＡレベルの擬似混入ＤＮＡサンプルは、ヨモギＤＮＡを２０ｎｇ／μＬに希釈し、それをサケ精子ＤＮＡ中のヨモギＤＮＡの混入率が０、１０、５０、１００、１０００ｐｐｍとなるように混合して作製した。結果を第５表に示す。
【００４６】
【表５】

【００４７】
その結果、プライマーＡｒｔ１７／１８のセットを用いたＰＣＲの検出限界は１０ｐｐｍ以下であり、本発明の検査方法がヨモギの混入を検知するための充分な感度を有していることが示された。
【００４８】
実験例６：加工食品中のヨモギの検出
プライマーＡｒｔ１７／１８を用いて、加工食品中のヨモギの有無についての検査を行った。ここで、加工食品として、ヨモギ入り茹でうどん、ヨモギ餅、ヨモギを含まない茹でうどん（通常品）、ポジティブコントロールとして粉末ヨモギ、生ヨモギを用いた。これらの加工食品からＤＮＡを抽出し、これを鋳型としてＰＣＲを行った。また、加工食品から抽出されたＤＮＡがＰＣＲに適するかを植物ＤＮＡ検出プライマーＣＰ０３−５’／３’により確認した。
その結果、ヨモギ含有食品のみ陽性でありヨモギを含まない加工食品では陰性であったため、本発明の方法が実際に加工食品の検査に用いることができることが示された。結果を第６表に示す。
【００４９】
【表６】

【００５０】
【発明の効果】
本発明によれば、ヨモギに対して特異性が高く、精度および感度が高いヨモギの検査方法が提供される。本発明の方法はＤＮＡレベルで１０ｐｐｍ以下のヨモギを検出可能であり、これはタンパク質量として数ｐｐｍに相当する。このため、本発明のヨモギの検出方法は、食品、特に加工食品におけるヨモギの検査方法として極めて有用である。
【００５１】
【配列表】

【図面の簡単な説明】
【図１】図１ａは、プライマーＡｒｔ０１／０２およびＡｒｔ０５／０６、図１ｂは、プライマーペアーＡｒｔ０７／０８およびＡｒｔ１７／１８によるヨモギＤＮＡの検出結果を示す電気泳動図である。
【図２】図２は、プライマーＡｒｔ１７／１８を用いたヨモギ特異性の結果を示す電気泳動図である。[0001]
TECHNICAL FIELD OF THE INVENTION
The present invention relates to a mugwort inspection method. More specifically, the present invention relates to a mugwort inspection method capable of qualitatively or quantitatively measuring mugwort in a test sample such as food.
[0002]
[Prior art]
Artemisia is a perennial plant of the family Asteraceae (Asteraceae, Artemisia pricipes), which grows throughout East Asia (eg, China, Korea, etc.) and almost all over Japan. In addition, the Artemisia species are large, growing in mountainous areas, such as "Greenwort", "Fukud", which grows in estuarine mudlands, and "Kawarayomugi", which is often found in riverbanks. There are "Samani mugwort", "Miyamoku mugi mugwort", "White mugwort", etc., all of which are used only as medicines and foods as follows.
[0003]
For example, mugwort is added to mochi, grass dumpling, bread, tea, noodles and the like, and is one of well-known and frequently used food ingredients. In addition, it is often used in gynecology as a Chinese herbal medicine "Gaiyo", and a collection of dried cilia on the back of dried leaves is used as a moxa for moxibustion.
[0004]
In a food factory or the like that handles mugwort as a raw material, unintended mugwort may be mixed into mugwort-free food due to contamination in the manufacturing process. When mugwort is mixed into processed foods, problems such as discoloration and unpleasant odor may occur during the distribution process or contact, resulting in significant economic disadvantages such as collection and disposal of the product, as well as production and crime. This will lead to a loss of consumer confidence. For this reason, food factories handling mugwort are required to inspect for contamination of mugwort as quality control of processed foods and products.
[0005]
On the other hand, as a method of detecting a trace amount of a food material or material contained in a food, an immunochemical method (for example, a Western blotting method, an ELISA method, etc.) for detecting a specific protein derived from the food material has been implemented. However, these methods are not always effective for processed materials and foods in which the specific protein may be denatured.
[0006]
Also, a method has been proposed in which DNA is extracted from food and a specific DNA sequence is targeted to perform PCR to detect a specific food material (see Patent Document 1). However, in this method, there is a cross-reaction with a substance other than a specific food material. Such a cross-reaction may result in false positives or false negatives in the test, and may cause problems such as disposal of unnecessary processed foods and distribution of mixed products.
[0007]
Furthermore, among the above-mentioned methods, inspection methods for mugwort are not known, and for mugwort mixed in foods, therefore, inspect for discoloration and unusual odor in the distribution process of the product, or in the manufacturing process. Only measures such as prevention of contamination were taken.
[0008]
[Patent Document 1] Japanese Patent Application Laid-Open No. 2001-309786
[Problems to be solved by the invention]
An object of the present invention is to provide a method capable of easily and accurately measuring a mugwort present in a trace amount in a test sample such as food.
[0010]
[Means for Solving the Problems]
The present inventors have conducted intensive studies for the purpose of solving the above problems, and as a result, constructed mugwort-specific specific primers, and performed PCR using the primers, so that mugworts in raw materials and processed foods can be obtained with high accuracy. It has been found that it can be detected.
That is, the present invention relates to the following (1) to (7).
[0011]
(1) Qualitative or quantitative analysis of mugwort in a test sample, wherein PCR (Polymerase Chain reaction) is performed using primers designed based on genetic information of mugwort and capable of specifically detecting mugwort. How to measure.
In the present invention, the test sample includes a food raw material, a processed intermediate raw material, and a processed food. The food material or food includes not only human food but also pet food and feed.
[0012]
(2) The method according to the above (1), wherein the genetic information is a nucleotide sequence of a gene (Accession No. A60443) encoding a cofactor-independent phosphoglycerate mutase of Artemisia vulgaris.
[0013]
(3) The primer comprises at least (a) the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1, (b) its complementary nucleotide sequence, or (c) the nucleotide sequence of a DNA that hybridizes with (a) or (b). The method according to the above (1) or (2), having 5 to 35 consecutive nucleotide sequences.
[0014]
(4) the primer has the same nucleotide sequence as the primer Art17 shown in SEQ ID NO: 18, the primer Art18 shown in SEQ ID NO: 19, or these primers, that is, at least 80% of the nucleotide sequences match The method according to any one of the above (1) to (3), which is a primer.
[0015]
(5) The mugwort is specifically detected, and does not cross-react with rye, barley, rice, corn, soybean, millet, rape, oats, wheat, buckwheat, nogi, dandelion, ragweed, thistle, and Himejon. The method according to any one of (1) to (4).
[0016]
(6) A primer for PCR used in the method according to any one of the above (1) to (5), which is designed based on genetic information of mugwort and is capable of specifically detecting mugwort.
(7) A kit for qualitatively or quantitatively measuring mugwort in a sample, comprising the primer according to (6).
[0017]
BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION
Hereinafter, the present invention will be described in detail.
The present invention is a method of designing PCR primers based on genetic information of mugwort, performing PCR, and measuring the presence or absence of mugwort in food (hereinafter, may be referred to as “the method of the present invention”).
[0018]
The food to be inspected as the test sample may be a raw material, at any stage of processing, or a processed food. The method of the present invention can be used, for example, in a food in a mass ratio of mugwort to all foods, or a mass or volume ratio of mugwort-derived DNA at a DNA level, 1% or less, preferably 100 ppm or less, further 50 ppm or less, particularly 10 ppm or less The presence or absence of a very small amount of mugwort can be detected. For this reason, unintended mixing of mugwort, and the presence of traces as a part of seasonings or additives can be detected. Furthermore, nucleic acid (DNA) is relatively stable to food processing such as heating, and can detect the presence of a trace amount in processed food such as heating and cooking, as compared with other biological substances such as proteins.
[0019]
In addition, the method of the present invention provides accurate information such as mugwort contamination in food, and there is no fear of false negatives and false positives in tests, and specifically and accurately detects mugwort in test samples such as food. Or it needs to be measurable. That is, the primer for PCR used in the method of the present invention specifically detects mugwort, and plants and food materials other than mugwort, for example, rye, barley, rice, corn, soybean, millet, rapeseed, oats, wheat, buckwheat. , Daisies, dandelions, ragweed, thistles and shimmers must be designed so as not to cross-react. Such primers are designed based on mugwort genetic information.
[0020]
The genetic information of mugwort may be obtained by determining the nucleotide sequence of DNA extracted from a plant of the genus Artemisia or a DNA library thereof by a conventional method, but many known genetic information can be used today. For example, it is possible to obtain DNA sequence information of mugwort from a database such as the National Institute of Genetics (DDBJ), design primers suitable for the PCR of the present invention from a part of the sequence, and use it for detection of mugwort. it can. In addition, the genetic information of mugwort is not limited to Japanese mugwort (eg, Artemisia prices), but may be genetic information of a foreign mugwort (eg, Artemisia vulgaris). In the present invention, the nucleotide sequence of a gene (Accession No. A60443, SEQ ID NO: 1) encoding a cofactor-independent phosphoglycerate mutase derived from Artemisia vulgaris is used as genetic information.
[0021]
In designing the primer, the following conditions are considered in consideration of the method of the present invention.
The conditions are (i) the GC content of the primer is 40 to 60%, (ii) the Tm value of the primer is 55 to 70 ° C., (iii) the Tm values of the sense and antisense primers are close, and (iv) the 3 ′ of the primer. (V) the primer does not form a higher-order structure, (vi) the total length of the primer is 5 to 50 mer, preferably 15 to 35 mer, and (vii) the 3 'end of the primer. (Viii) avoid sequences that have a large number of identical nucleotides in the primers, (ix) the primers need to be completely identical to the sequence of one strand of the template DNA to be amplified. However, the complementarity at the 3 'end is increased, and (x) the template DNA used has no similar sequence other than the primer site.
[0022]
It is necessary that the method of the present invention can be used not only for raw raw materials but also for foods in the processing stage and processed foods such as heating and cooking. For this reason, the mugwort template DNA used may be not only intact but also a finely cut DNA fragment, and the (xi) PCR-amplified DNA region is preferably relatively short.
The primer used in the method of the present invention is designed as a primer satisfying all the conditions (i) to (xi) in the DNA region. However, it is difficult to design a primer that satisfies all of these conditions, and even if a primer that satisfies the conditions can be designed, it is only a necessary condition for performing PCR, and whether or not a desired PCR result can be obtained. You can't understand unless you actually perform PCR. Therefore, designing primers is a very difficult problem in performing PCR.
[0023]
The primer in the present invention is a primer having at least 5 to 35 consecutive base sequences selected from the DNA sequence shown in SEQ ID NO: 1. Examples of such primers include the oligonucleotide primers shown in SEQ ID NO: 2 to SEQ ID NO: 20. As a set of primers, for example, Art01 (SEQ ID NO: 2) / 02 (SEQ ID NO: 3), Art03 (SEQ ID NO: 4) / 04 (SEQ ID NO: 5), Art05 (SEQ ID NO: 6) / 06 (SEQ ID NO: 7) ), Art07 (SEQ ID NO: 8) / 08 (SEQ ID NO: 9), Art09 (SEQ ID NO: 10) / 10 (SEQ ID NO: 11), Art11 (SEQ ID NO: 12) / 12 (SEQ ID NO: 13), Art13 (SEQ ID NO: 14) / 14 (SEQ ID NO: 15), Art15 (SEQ ID NO: 16) / 16 (SEQ ID NO: 17), Art17 (SEQ ID NO: 18) / 18 (SEQ ID NO: 19), Art17 (SEQ ID NO: 18) / 20 (SEQ ID NO: 20), Preferably, Art07 (SEQ ID NO: 8) / 08 (SEQ ID NO: 9) and Art17 (SEQ ID NO: 18) / 18 (SEQ ID NO: 19) are exemplified.
[0024]
In general, if the region to be amplified by PCR (template DNA region) is almost the same, the same PCR result (PCR) can be obtained even if the primer sequence is shifted by 1 to 10 bases to the 5 'side and / or 3' side. Product) is known to be obtained. Therefore, the primer of the present invention is not limited to a primer having a specific sequence and length, but also includes a primer having substantially the same function as the primer. Therefore, the primer of the present invention includes a primer and a primer that hybridizes to the same region of the template DNA as the primer. Specifically, for example, a primer in which one or several bases of each primer have been deleted, substituted, added and / or inserted, or one or several bases or 10 to 5 'and / or 3' to the corresponding template DNA It is a primer having a base shifted by several nucleotides, and a primer whose sequence matches at least 80%, more preferably 90% or more, even more preferably 95% or more with the original primer.
[0025]
In the present invention, the PCR method is not particularly limited and includes various known improvement methods. For example, in addition to a primer set and a template (test) DNA, Tris-HCl, KCl, MgCl ₂ Then, reagents such as dNTPs and Taq DNA polymerase are mixed to prepare a PCR reaction solution. One cycle of PCR consists of three steps: heat denaturation, annealing, and DNA synthesis reaction by DNA polymerase. Each step requires a different and possibly the same reaction temperature and reaction time, and these are appropriately determined depending on the base sequence and length of the DNA region to be amplified. Thermal cyclers for such operations are commercially available.
[0026]
In the method of the present invention, the detection sensitivity may be further improved by examining suitable PCR conditions such as the concentration of DNA polymerase and MgCl ₂ and the number of reaction cycles, or by using nested PCR.
[0027]
The PCR result (PCR product) can be identified using any method capable of identifying a specific DNA fragment, for example, electrophoresis, capillary electrophoresis, hybridization, an immunological method, and the like. Generally, a PCR product is electrophoresed and confirmed by its migration pattern. In this case, if a clear band of a desired size is recognized, the presence of mugwort in the test sample can be detected. In addition, by using various amounts of template DNA, only mugwort can be quantitatively measured.
[0028]
The present invention includes a kit for carrying out the method of the present invention, which comprises the above primer for PCR. The kit may contain a well-known reagent widely used for PCR in addition to the above primers for PCR, or may be provided with another device such as an electrophoresis device.
Examples of the reagent include polymerases such as dNTP, MgCl ₂ , and Taq DNA polymerase, buffers (eg, Tris-HCl), glycerol, DMSO, positive control DNA, negative control DNA, and distilled water. These reagents may be provided individually in a kit in a package, or may be provided in the form of a mixture of two or more reagents. The concentration of each reagent in the kit is not particularly limited, and may be any range as long as it is possible to carry out the PCR of the present invention. In addition, information such as suitable PCR conditions may be further attached to the kit, or only the primer reagent may be used.
[0029]
【Example】
Hereinafter, the present invention will be described specifically, but the present invention is not limited thereto.
(1) Construction of Primers for Mugwort Detection In constructing primers for detecting mugwort-derived DNA, a database of the National Institute of Genetics (DDBJ) was accessed to search for known gene sequences of mugwort.
However, there is no DNA information of Japanese mugwort (Artemisia prices and the like), and in the present invention, a gene encoding a cofactor-independent phosphoglycerate mutase derived from a foreign mugwort (Artemisia vulgaris) (Accession No. A60443, SEQ ID NO: 2). Primers were designed based on the nucleotide sequence information of 1).
[0030]
In order to design a primer, the present inventor searched for a candidate primer sequence using the software “GENETYX MAC” for the above gene sequence. “GENETYX MAC” was used because, among the above-mentioned conditions for primer design, it was difficult to analyze by manual calculation, and (i) GC content and (ii) _Tm value range could be set. As a result, 87 sets were picked up from among 150 or more primer sets (sense primers and antisense primers) as candidates. Next, among the above, the present inventors independently searched for primers satisfying all of the above conditions (i) to (xi) for designing primers, thereby producing 10 sets of PCR primers by QIAGEN. . The prepared primers are shown in Table 1.
[0031]
[Table 1]

[0032]
(2) Extraction of DNA The leaves of mugwort and other Asteraceae plants were thoroughly dried after their surfaces were washed with pure water. The surface of the grain was washed with 1% Triton X (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.), rinsed with distilled water, and thoroughly dried. Then, it was pulverized with a multi-beads shocker (manufactured by Yasui Machine Co., Ltd.). The mugwort powder was directly subjected to DNA extraction.
1 g of each ground sample obtained and the DNA of mugwort powder were transferred from the Ministry of Health, Labor and Welfare's Pharmaceutical Affairs Bureau, Ministry of Health and Welfare, Food and Beverage No. 1106001 (November 6, 2002) , Simply referred to as “notification method”) using the Dneasy Plant Maxi kit (QIAGEN). As for the processed food, 2 g of the freeze-dried product was extracted for 24 hours, and DNA was extracted according to the above-mentioned notification method using Genomic Tip 20 / G (QIAGEN). The concentration of each extracted DNA was determined by measuring absorbance, and then diluted with pure water to 20 ng / μL, and this was used as a PCR template (test) DNA sample solution.
[0033]
(3) Detection of mugwort by PCR and electrophoresis image A PCR reaction solution was prepared as follows.
That is, PCR buffer (PCR buffer II, Applied Biosystems), 200 μmol / L dNTP, 1.5 mmol / L MgCl ₂ , 0.5 μmol / L each primer and 0.625 units Taq DNA polymerase (AmpliTaq Gold, Apprite Biosystems) ) Was added to 2.5 μL of a DNA sample solution adjusted to 20 ng / μL to make a total volume of 25 μL.
[0034]
GeneAmp PCR System 9600 (Applied Biosystems) was used as a PCR amplification apparatus, and reaction conditions were set as follows.
First, the reaction was started at 95 ° C. for 10 minutes to start the reaction, and then 40 cycles of PCR amplification were carried out at 95 ° C. for 30 seconds, 60 ° C. for 30 seconds, and 72 ° C. for 30 seconds. Finally, the reaction was kept at 72 ° C. for 7 minutes as a termination reaction and then stored at 4 ° C., and the obtained reaction solution was used as a PCR amplification reaction solution.
The PCR amplification reaction solution was subjected to electrophoresis using 2% agarose gel (2% E-Gel, Invitrogen) containing ethidium bromide, and a negative control (PCR reaction solution containing template DNA: NTC) and a positive control (extracted from Artemisia mugwort) The validity of PCR was determined based on the presence and size of the DNA) band, and the presence or absence of mugwort in the sample was determined by confirming the PCR product band and the size of each primer.
[0035]
At the same time, the following plant DNA detection primers:
CP03-5 ': 5'-CGG ACG AGA ATA AAG ATA GAG T-3' (SEQ ID NO: 21)
CP03-3 ': 5'-TTT TGG GGA TAG AGG GAC TTG A-3' (SEQ ID NO: 22)
Was used to perform a PCR reaction, and it was confirmed that the DNA sample solution contained DNA optimal for the PCR reaction.
[0036]
Experimental example 1: Selection of mugwort detection primer (1)
Using DNA derived from powdered mugwort as a template, PCR was performed on 10 sets of primers shown in Table 1. As a result, no PCR amplification product was observed for Art17 (SEQ ID NO: 18) / 20 (SEQ ID NO: 20), and Art03 (SEQ ID NO: 4) / 04 (SEQ ID NO: 5) and Art09 (SEQ ID NO: 10) / 10 (SEQ ID NO: 10) 11), Art11 (SEQ ID NO: 12) / 12 (SEQ ID NO: 13), Art13 (SEQ ID NO: 14) / 14 (SEQ ID NO: 15) and Art15 (SEQ ID NO: 16) / 16 (SEQ ID NO: 17) show PCR amplification products But different from the expected amplification size. In contrast, Art01 (SEQ ID NO: 2) / 02 (SEQ ID NO: 3), Art05 (SEQ ID NO: 6) / 06 (SEQ ID NO: 7), Art07 (SEQ ID NO: 8) / 08 (SEQ ID NO: 9) and Art17 (SEQ ID NO: 9) No. 18) / 18 (SEQ ID NO: 19), only the band of the expected PCR amplification product was detected. Table 2 shows the results.
[0037]
[Table 2]

[0038]
Experimental Example 2: Selection of mugwort detection primer (2)
In Experimental Example 1, PCR was performed again on a set of primers Art01 / 02, Art05 / 06, Art07 / 08 and Art17 / 18 from which a desired PCR amplification product was obtained. As a DNA sample, in addition to DNA of powdered mugwort, PCR was performed in the same manner as in Experimental Example 1 using DNA extracted from raw mugwort leaves at different collection locations, and the PCR amplification product was confirmed by electrophoresis (FIG. 1). ).
As a result, Art07 / 08 and Art17 / 18 were selected as a set of primers in which the band of the desired PCR amplification product was clear.
In the electrophoresis image of FIG. 1,

lanes

1 and 2 show mugwort leaf DNA (raw mugwort), lane 3 shows powdered DNA (powdered mugwort), and M shows a DNA size marker.
[0039]
Experimental Example 3: Selection of mugwort detection primer (3)
Primers selected in Experimental Example 2 using DNAs from two kinds of rye (1; from Germany, 2; from Canada), barley, rice, corn, soybean, millet, rape, oats, buckwheat, wheat and mugwort as samples PCR (Art07 / 08 and Art17 / 18) was performed to verify the mugwort specificity of the primers. Table 3 shows the results.
[0040]
[Table 3]

[0041]
As a result, in Art17 / 18, a single band strong only to mugwort was detected. In Art07 / 08, a band different from the expected size was detected in rye, and a cross-reaction with soybean, millet, rapeseed and wheat was observed.
It should be noted that amplification of each sample DNA by the plant DNA detection primer CP03-5 '/ 3' was confirmed, indicating that the DNA sample was suitable for PCR.
[0042]
Experimental Example 4: Evaluation of primer mugwort specificity Using the primers Art17 / 18 selected in Experimental Example 3, as asteraceae plants other than mugwort, two kinds of daisies, daisies, yellow dandelion, ragweed, and thistle PCR using the DNA and mugwort DNAs derived from rye, barley, rice, corn, soybean, millet, rapeseed, oats, buckwheat and wheat as other cereals as templates, and further, the mugwort specificity of the primers It was confirmed. The results are shown in Table 4 and FIG.
[0043]
[Table 4]

[0044]
As a result, a strong single band was detected only in mugwort, and no cross-reaction with plants other than mugwort was observed, indicating that the set of primers Art17 / 18 has high specificity for mugwort.
In the electrophoresis image of FIG. 2, lane 1 is rye, lane 2 is barley, lane 3 is rice, lane 4 is maize, lane 5 is soybean, lane 6 is millet, lane 7 is rape, lane 8 is oats, Lane 9 is buckwheat, lane 10 is wheat, lane 11 is rhododendron (yellow), lane 12 is rhododendron (white blossom), lane 13 is dandelion, lane 14 is ragweed, lane 15 is thistle, lane 16 is himejon, and lane 17 is mugwort. , Lane 18 indicates NTC, and M indicates a DNA size marker.
[0045]
Experimental Example 5: Evaluation of detection limit Using a pseudo-contaminated DNA sample as a template, PCR was performed with primers Art17 / 18 to confirm the detection limit of mugwort DNA.
DNA-level pseudo-contaminated DNA samples were prepared by diluting mugwort DNA to 20 ng / μL and mixing them so that the mixing ratio of mugwort DNA in salmon sperm DNA was 0, 10, 50, 100, and 1000 ppm. . The results are shown in Table 5.
[0046]
[Table 5]

[0047]
As a result, the detection limit of PCR using the set of primers Art17 / 18 was 10 ppm or less, indicating that the test method of the present invention had sufficient sensitivity to detect mugwort contamination.
[0048]
Experimental Example 6: Detection of Artemisia in Processed Food Using a primer Art17 / 18, an inspection was performed on the presence or absence of artemisia in processed food. Here, boiled udon with mugwort, mugwort mochi, boiled udon without mugwort (normal product) were used as processed foods, and mugwort powder and raw mugwort were used as positive controls. DNA was extracted from these processed foods, and PCR was performed using this as a template. In addition, whether the DNA extracted from the processed food was suitable for PCR was confirmed using a plant DNA detection primer CP03-5 ′ / 3 ′.
As a result, only the food containing mugwort was positive and the processed food not containing mugwort was negative, indicating that the method of the present invention can be actually used for inspection of processed food. The results are shown in Table 6.
[0049]
[Table 6]

[0050]
【The invention's effect】
ADVANTAGE OF THE INVENTION According to this invention, the specificity with respect to mugwort is provided, and the test method of mugwort with high precision and sensitivity is provided. The method of the present invention can detect mugwort of 10 ppm or less at the DNA level, which corresponds to several ppm in protein amount. Therefore, the method for detecting mugwort of the present invention is extremely useful as a method for detecting mugwort in foods, particularly processed foods.
[0051]
[Sequence list]

[Brief description of the drawings]
FIG. 1a is an electrophoretogram showing the results of mugwort DNA detection using the primers Art01 / 02 and Art05 / 06, and FIG. 1b is the result using the primer pairs Art07 / 08 and Art17 / 18.
FIG. 2 is an electrophoretogram showing the results of mugwort specificity using primers Art17 / 18.

Claims

A qualitative or quantitative measurement of mugwort in a test sample, characterized by performing PCR (Polymerase Chain reaction) using primers designed based on genetic information of mugwort and capable of specifically detecting mugwort. Method.

The primer comprises (a) a nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1; (b) a complementary nucleotide sequence thereof; 2. The method according to claim 1, wherein the method has a continuous base sequence.

The method according to claim 1 or 2, wherein the primer is a primer Art17 shown in SEQ ID NO: 18, a primer Art18 shown in SEQ ID NO: 19, or a primer whose base sequence matches at least 80% of these primers.

A primer for PCR used in the method according to any one of claims 1 to 3, which is designed based on genetic information of mugwort and is capable of specifically detecting mugwort.

A kit for qualitatively or quantitatively measuring mugwort in a sample, comprising the primer according to claim 4.