JP4925941B2 - Wheat detection method using PCR method and primer pair and nucleic acid probe used therefor - Google Patents
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Description
本発明は、ＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ）法を利用した小麦の特異的な検出方法及びこれに使用するプライマー対、核酸プローブに関する。
さらに詳しくは、食品原材料や加工食品など各種被検試料中に含まれる小麦を高感度で定性的及び／又は定量的に測定することが可能な検出方法及びこれに使用するプライマー対、核酸プローブに関する。
The present invention relates to a wheat specific detection method using a PCR (Polymerase chain reaction) method, a primer pair used in the method, and a nucleic acid probe.
More specifically, the present invention relates to a detection method capable of qualitatively and / or quantitatively measuring wheat contained in various test samples such as food raw materials and processed foods, and a primer pair and a nucleic acid probe used therefor .
小麦は、アレルギー症状を引き起こす食品原材料の一つであることが広く知られており、食品衛生法により卵、牛乳、蕎麦、落花生と共にアレルギー物質を含む特定原材料としてその含有量に関わらず当該原材料を含む旨を表示する義務がある品目の一つとして指定されている。
これら特定原材料は、極めて微量の混入であってもアレルギーを引き起こす可能性があることが示唆されている。
特に、蕎麦や落花生においては、それらの微量な混入により重大なアレルギー疾患が引き起こされることはよく知られている。
小麦においては、特定原材料の検査方法としてＥＬＩＳＡ法による一次検査とＰＣＲ法による二次検査が指定されている。
しかしながら、それらの検査方法は感度並びに特異性の問題で必ずしも十分ではなかった。
それ故、アレルギー患者の食生活を十分にサポートできるような、検出感度並びに特異性のより高い特定原材料の検出方法が求められている。
Wheat is widely known to be one of the food ingredients that cause allergic symptoms. According to the Food Sanitation Law, wheat, eggs, milk, buckwheat, and peanuts are used as specific ingredients including allergens regardless of their content. Designated as one of the items that are obligated to indicate inclusion.
It has been suggested that these specific raw materials can cause allergies even with very small amounts of contamination.
In particular, it is well known that, in buckwheat and peanuts, serious allergic diseases are caused by a minute amount of such contamination.
In wheat, primary inspection by ELISA method and secondary inspection by PCR method are designated as inspection methods for specific raw materials.
However, these inspection methods are not always sufficient in terms of sensitivity and specificity.
Therefore, there is a need for a method for detecting a specific raw material with higher detection sensitivity and specificity that can sufficiently support the diet of allergic patients.
これまでに様々な技術を駆使して小麦を特異的に且つ高感度に検出するための手法が考案されてきた。
それらの手法は、基本的に被検試料中に含まれる小麦由来のタンパク質ないしはＤＮＡを検出の対象としている手法に分類される。
タンパク質を検出する手法としては、電気泳動法、ウエスタンブロット法、免疫化学的方法、あるいはそれらを組み合わせた方法などが挙げられる。
自動化機器の開発が顕著である免疫化学的方法の一つであるＥＬＩＳＡ法が特に広く市場に受け入れられている。
しかしながら、本法は小麦に由来する標的タンパク質を特異的に検出することが可能である反面、その検出感度が十分ではないために極微量に存在する小麦を検出することが困難である。
また、食品原料や加工度の低い加工品においてはタンパク質が変性されていないのでＥＬＩＳＡによる標的タンパク質の検出は容易であるが、高度に加工された加工品においてはタンパク質が熱や物理的作用等により変性ないしは分解されているために必ずしも検出に適しているわけではない。
他方で、遺伝子増幅技術の一つであるＰＣＲ法を用いて小麦を特異的に検出するための技術も幾つか考案されてきた。
しかしながら、小麦のＤＮＡや遺伝子の解析が必ずしも十分ではないために、最適な検査方法の開発には困難をきたしている。
So far, various techniques have been devised to detect wheat specifically and with high sensitivity.
These methods are basically classified into methods in which wheat-derived protein or DNA contained in the test sample is the target of detection.
Examples of the method for detecting the protein include electrophoresis, western blotting, immunochemical methods, or a combination thereof.
The ELISA method, one of the immunochemical methods for which the development of automated equipment is remarkable, is particularly widely accepted in the market.
However, this method can specifically detect a target protein derived from wheat, but its detection sensitivity is not sufficient, so that it is difficult to detect a very small amount of wheat.
In addition, protein is not denatured in food materials and processed products with a low degree of processing, so it is easy to detect the target protein by ELISA. However, in highly processed products, the protein is heated or affected by physical action. Since it is denatured or decomposed, it is not necessarily suitable for detection.
On the other hand, several techniques for specifically detecting wheat using the PCR method, which is one of gene amplification techniques, have been devised.
However, since analysis of wheat DNA and genes is not always sufficient, it has been difficult to develop an optimal testing method.
非特許文献１では、Ｗｘ-Ｄ１遺伝子を標的として、ＰＣＲを利用した定性用及び定量用検査法が報告された。
しかしながら、普通小麦においては感度良く検出されたのに対し、デュラム小麦を検出することはできなかった。
これは、標的遺伝子が小麦のＤゲノムにコードされているためであり、ゲノム構成が六倍体のＡＡＢＢＤＤである普通小麦は検出対象となり得るが、四倍体のＡＡＢＢであるデュラム小麦及び二倍体のＡＡ又はＢＢである原種あるいは原種に近い食用小麦は検出対象にはなりえないことによる。
特許文献１で開示された小麦主要アレルゲンであるＴｒｉｔｉｃｉｎ、ｇｒａｎｕｌｅ−ｂｏｕｎｄ Ｓｔａｒｃｈ Ｓｙｎｔｈａｓｅ Ｉ並びにＧｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ Ｓ−ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ遺伝子検査用プライマー対は、小麦ゲノムにおける標的遺伝子のコピー数の品種間での安定性が不明である。
そのため、定性検査に利用できる可能性は高いが、定量検査に利用することは困難である。
また、それらプライマー対の検出感度は１００ｐｐｍ（１００ｐｇ/μＬ）であり、これは必ずしも高感度な検出に適用できるとは言えない。
特許文献２では、ＩＴＳ１-ＩＴＳ２領域を標的とした植物検出用プライマー対が利用されているが、小麦属だけでなく小麦連の近縁種も検出対象となるため、小麦を特異的に検出するためには更なる高度な解析作業が必要とされている。
また、この領域の塩基配列はゲノム中にマルチコピーで存在しているため、高感度で半定性的に小麦を検出することが可能である半面、コピー数が植物種間あるいは品種間で安定していないために定量検査には適さない。
このように、小麦を定性的及び／又は定量的に検査するための適切な手法は未だ存在せず、その検出方法の開発が望まれている。
Non-Patent Document 1 reported a qualitative and quantitative test method using PCR targeting the Wx-D1 gene.
However, while it was detected with high sensitivity in normal wheat, it was not possible to detect durum wheat.
This is because the target gene is encoded by the wheat D genome, and normal wheat having a hexaploid AABBDD can be detected, but tetraploid AABB durum wheat and diploid This is because edible wheat that is AA or BB of the body or edible wheat close to the original species cannot be a detection target.
The primary wheat allergens disclosed in Patent Literature 1, Triticin, granule-bound Starch Synthase I, and Glutathione S-transferase gene testing primer pairs are not stable among varieties of the copy number of the target gene in the wheat genome. is there.
Therefore, it is highly possible to use for qualitative inspection, but it is difficult to use for quantitative inspection.
Moreover, the detection sensitivity of these primer pairs is 100 ppm (100 pg / μL), and this cannot necessarily be applied to highly sensitive detection.
In Patent Document 2, a plant detection primer pair targeting the ITS1-ITS2 region is used, but not only wheat genus but also related species of wheat bran are detected, so wheat is specifically detected. For this purpose, further advanced analysis work is required.
In addition, since the base sequence of this region exists in multiple copies in the genome, wheat can be detected with high sensitivity and semi-qualitatively. On the other hand, the copy number is stable between plant species or cultivars. Not suitable for quantitative inspection.
Thus, an appropriate method for qualitatively and / or quantitatively inspecting wheat does not yet exist, and development of a detection method thereof is desired.
本発明は、小麦の混入を意図しない食品への小麦の混入検査を目的として、小麦特異的なＤＮＡ塩基配列を小麦のゲノムＤＮＡから選定し、ＰＣＲを利用した食品原材料や加工食品など各種被検試料中に含まれる小麦を高感度で定性的及び／又は定量的に測定することが可能な検出方法を提供することを目的とする。 The present invention selects wheat-specific DNA base sequences from wheat genomic DNA for the purpose of examining wheat contamination in foods that are not intended to be mixed with wheat, and is used for various tests such as food raw materials and processed foods using PCR. An object of the present invention is to provide a detection method capable of qualitatively and / or quantitatively measuring wheat contained in a sample with high sensitivity.
本発明者らは、上記の目的を達成するために鋭意研究を重ねた結果、小麦特異的なＤＮＡ塩基配列を見出し、この塩基配列を基盤として特定のプライマー対を設計し、これを用いてＰＣＲを実施することにより被試験試料中に含まれる小麦を特異的且つ高感度で検出できることを見出した。
一般的に小麦のゲノムＤＮＡはＡ、Ｂ、Ｄと称される３種類のゲノムから構成されており、各々７本の染色体を有している。
普通小麦はＡＡＢＢＤＤの六倍体からなっており、合計４２本の染色体から構成されているので極めて大きなゲノムサイズであることが知られている。
これまでに数多くの小麦遺伝子が同定されており、それら遺伝子の配座に関する情報も蓄積されている。
本発明では、これら小麦のゲノム情報を基に、既に遺伝子が同定されており且つゲノム中での配座が決定されているＤＮＡ塩基配列に着目し、その中でも特にＡ、Ｂ、Ｄの各ゲノムにおける配座が決定されている小麦スターチシンターゼＩＩ（ｗｈｅａｔ Ｓｔａｒｃｈ Ｓｙｎｔｈａｓｅ ＩＩ：略称ＳＳＩＩ−Ａ、ＳＳＩＩ−Ｂ、ＳＳＩＩ−Ｄ）に着目した。
これらＳＳＩＩ（ｗｈｅａｔ Ｓｔａｒｃｈ Ｓｙｎｔｈａｓｅ ＩＩ）は小麦Ａ、Ｂ、Ｄゲノム各々の７番染色体の短腕にコードされていることが報告されている（非特許文献２）。
また、各ゲノムにコードされているＳＳＩＩの塩基配列は微妙に異なっており、プライマー対の設計次第ではＳＳＩＩ−Ａ、ＳＳＩＩ−Ｂ、ＳＳＩＩ−Ｄの各々を特異的に見分けることも可能であることを見出した。
小麦群のゲノム構成は多様性に富んでおり、普通小麦等のようにＡＡＢＢＤＤの六倍体で構成されるものをはじめとして、ＡＡＢＢで構成される四倍体のデュラム小麦等、ＡＡ、ＢＢ又はＤＤで構成される二倍体の原種又は原種に近い食用小麦が存在する。
これら情報を総括し、ＳＳＩＩ−Ａ、ＳＳＩＩ−Ｂ、ＳＳＩＩ−Ｄの微妙に異なる特徴的な塩基配列あるいは小麦ＳＳＩＩのみに特異的な共通塩基配列を見出すことによって、すべてのゲノム構成の小麦群を検出することが可能であることを見出した。
すなわち、小麦ＳＳＩＩ−Ａ、ＳＳＩＩ−Ｂ、ＳＳＩＩ−Ｄにおいて特徴的な及び／又は共通な塩基配列であり、且つ他の植物に交叉しない塩基配列を選抜し、該塩基配列に相補的にハイブリダイズするプライマー対及び核酸プローブを設計し、それらを用いたＰＣＲを実施し、ＰＣＲ増幅産物の有無を指標にして被検試料中に含まれる小麦を定性的及び／又は定量的に検出できることを見出し、本発明を完成するに至った。
As a result of intensive studies to achieve the above-mentioned object, the present inventors have found a wheat-specific DNA base sequence, designed a specific primer pair based on this base sequence, and used this to perform PCR. It was found that the wheat contained in the sample to be tested can be detected specifically and with high sensitivity.
In general, wheat genomic DNA is composed of three types of genomes called A, B, and D, each having seven chromosomes.
Ordinary wheat consists of hexaploid AABBDD and is composed of a total of 42 chromosomes, and is known to have an extremely large genome size.
Many wheat genes have been identified so far, and information on the conformation of these genes has been accumulated.
In the present invention, attention is paid to DNA base sequences whose genes have already been identified and conformations in the genome have been determined based on the genome information of these wheat. Attention was paid to wheat starch synthase II (abbreviated as SSII-A, SSII-B, SSII-D).
It has been reported that these SSIIs (heat Star Synthase II) are encoded by the short arm of chromosome 7 of each of the wheat A, B, and D genomes (Non-patent Document 2).
In addition, the base sequence of SSII encoded in each genome is slightly different, and depending on the design of the primer pair, each of SSII-A, SSII-B and SSII-D can be specifically identified. I found.
The genome composition of the wheat group is rich in diversity, including those composed of hexaploid AAABBDD such as ordinary wheat, tetraploid durum wheat composed of AABB, etc., such as AA, BB or There are diploid primaries that are made up of DD or edible wheat that is close to the ancestor.
By summarizing these information and finding a slightly different characteristic base sequence of SSII-A, SSII-B, SSII-D or a common base sequence specific only to wheat SSII, all genome-structured wheat groups can be identified. It was found that it was possible to detect.
That is, a base sequence that is characteristic and / or common in wheat SSII-A, SSII-B, SSII-D and that does not cross other plants is selected and hybridized to the base sequence in a complementary manner. A primer pair and a nucleic acid probe to be designed, PCR using them is carried out, and it is found that wheat contained in a test sample can be detected qualitatively and / or quantitatively using the presence or absence of a PCR amplification product as an index, The present invention has been completed.
従って、本発明は、
（１）小麦のゲノムＤＮＡにコードされている遺伝子であるスターチシンターゼＩＩ（Ｓｔａｒｃｈ Ｓｙｎｔｈａｓｅ ＩＩ）の塩基配列に基づいて設計された該塩基配列と相補的にハイブリダイズする下記（Ａ）又は（Ｂ）のプライマー対を用いてＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ）を行い、該塩基配列のプライマー対に挟まれた領域のＰＣＲ増幅産物の存在を指標として小麦の存在を定性的及び／又は定量的に検出する小麦の検出方法である。
（Ａ）配列番号３に示す塩基配列で構成されるプライマーと配列番号４に示す塩基配列で構成されるプライマーからなるプライマー対。
（Ｂ）配列番号５に示す塩基配列で構成されるプライマーと配列番号６に示す塩基配列で構成されるプライマーからなるプライマー対。
（２）前記プライマー対に挟まれた領域の塩基配列に相補的な核酸プローブを用いてＰＣＲを行い、ＰＣＲ中にＤＮＡ塩基配列の増幅の指標となるシグナルをモニターし、予め作成された検量線を用いて反応開始時の分子数に換算して小麦の存在を定量的に検出する前記（１）に記載の小麦の存在を定量的に検出する小麦の検出方法である。
（３）ＤＮＡ塩基配列の増幅の指標となるシグナルが蛍光であって、前記蛍光が蛍光標識核酸プローブに由来し、前記蛍光がＰＣＲによるＤＮＡ塩基配列の増幅に伴う前記核酸プローブの分解に起因して変化する前記（２）に記載の小麦の存在を定量的に検出する小麦の検出方法である。
（４）核酸プローブが、下記（Ａ）のプライマー対の場合は、配列番号１７に示す塩基配列で構成される核酸プローブ、下記（Ｂ）のプライマー対の場合は、配列番号１８に示す塩基配列で構成される核酸プローブである前記（２）又は前記（３）に記載の小麦の検出方法である。
（Ａ）配列番号３に示す塩基配列で構成されるプライマーと配列番号４に示す塩基配列で構成されるプライマーからなるプライマー対。
（Ｂ）配列番号５に示す塩基配列で構成されるプライマーと配列番号６に示す塩基配列で構成されるプライマーからなるプライマー対。
（５）核酸プローブが、その５’末端及び３’末端が蛍光化合物又は蛍光化合物とクエンチング効果を有する化合物で標識される前記（２）乃至前記（４）のいずれかに記載の小麦の検出方法である。
（６）プライマー対を用いてＰＣＲを行い、電気泳動によってＰＣＲ増幅産物の明瞭なバンドを検出する前記（１）乃至前記（３）のいずれかに記載の小麦の検出方法である。
（７）普通小麦、デュラム小麦、その他食用に用いられる小麦からなる群から選択される少なくとも１種以上の小麦を含む食品原材料や加工食品など各種被検試料においてＰＣＲ増幅産物が認められ、且ついずれの前記小麦も含まない各種被検試料においてＰＣＲ増幅産物が認められない前記（１）乃至前記（６）のいずれかに記載の小麦の検出方法である。
（８）前記（１）に記載のプライマー対及び／又は前記（４）に記載の核酸プローブから構成される各種被検試料中の小麦の有無を定性的及び／又は定量的に判別するためのキットである。
Therefore, the present invention
(1) The following (A) or (B) which hybridizes complementarily with the base sequence designed based on the base sequence of Starch Synthase II, which is a gene encoded in the genomic DNA of wheat wheat of using primer pairs perform PCR (Polymerase chain reaction), for detecting the presence of wheat qualitatively and / or quantitatively the presence of a PCR amplification product of the region sandwiched between the pair of primers of the base sequence as an index This is a detection method.
( A) A primer pair comprising a primer composed of the base sequence shown in SEQ ID NO: 3 and a primer composed of the base sequence shown in SEQ ID NO: 4.
(B) A primer pair consisting of a primer composed of the base sequence shown in SEQ ID NO: 5 and a primer composed of the base sequence shown in SEQ ID NO: 6.
(2) A calibration curve prepared in advance by performing PCR using a nucleic acid probe complementary to the base sequence in the region sandwiched between the primer pairs, and monitoring a signal that serves as an indicator of DNA base sequence amplification during PCR. The method for detecting wheat according to (1) , wherein the presence of wheat is quantitatively detected by converting to the number of molecules at the start of the reaction using.
(3) The signal serving as an indicator for amplification of the DNA base sequence is fluorescence, the fluorescence is derived from a fluorescently labeled nucleic acid probe, and the fluorescence is caused by degradation of the nucleic acid probe accompanying amplification of the DNA base sequence by PCR. The method for detecting wheat according to (2) , wherein the presence of wheat is quantitatively detected.
(4) When the nucleic acid probe is a primer pair of the following (A), the nucleic acid probe composed of the base sequence shown in SEQ ID NO: 17, and when the nucleic acid probe is the primer pair of (B) below , the base sequence shown in SEQ ID NO: 18 The method for detecting wheat according to (2) or (3) above, which is a nucleic acid probe comprising:
( A) A primer pair comprising a primer composed of the base sequence shown in SEQ ID NO: 3 and a primer composed of the base sequence shown in SEQ ID NO: 4.
(B) A primer pair consisting of a primer composed of the base sequence shown in SEQ ID NO: 5 and a primer composed of the base sequence shown in SEQ ID NO: 6.
(5) The detection of wheat according to any one of (2) to (4) above, wherein the 5 ′ end and 3 ′ end of the nucleic acid probe are labeled with a fluorescent compound or a compound having a quenching effect with the fluorescent compound. Is the method.
(6) The wheat detection method according to any one of (1) to (3) , wherein PCR is performed using a primer pair, and a clear band of a PCR amplification product is detected by electrophoresis.
(7) PCR amplification products are observed in various test samples such as food raw materials and processed foods containing at least one wheat selected from the group consisting of normal wheat, durum wheat and other wheat used for food; The wheat detection method according to any one of (1) to (6) , wherein PCR amplification products are not observed in various test samples that do not contain the wheat.
(8 ) For qualitatively and / or quantitatively determining the presence or absence of wheat in various test samples composed of the primer pair described in (1) and / or the nucleic acid probe described in (4) It is a kit.
小麦の内在性遺伝子に相補的にハイブリダイズするプライマー対あるいは核酸プローブを用いてＰＣＲを実施することにより、小麦を特異的に、精度良く、且つ感度良く検出することができる。
本発明の方法によれば、小麦に起因する加工食品中のアレルゲンの分析手段としても有効である。
By performing PCR using a primer pair or a nucleic acid probe that hybridizes complementarily to an endogenous gene of wheat, it is possible to detect wheat specifically, accurately and with high sensitivity.
According to the method of the present invention, it is also effective as a means for analyzing allergens in processed foods caused by wheat.
本発明は、小麦ＤＮＡの塩基配列の一部より得られる情報に基づいて、小麦ゲノムＤＮＡに相補的にハイブリダイズするプライマー対並びに該プライマー対にはさまれた領域に相補的にハイブリダイズする核酸プローブを設計し、該プライマー対及び／又は該核酸プローブを用いたＰＣＲを実施することにより被検試料中に含まれる小麦の有無を定性的及び／又は定量的に検出する方法である。 The present invention relates to a primer pair that hybridizes complementary to wheat genomic DNA based on information obtained from a part of the base sequence of wheat DNA, and a nucleic acid that hybridizes complementary to a region sandwiched between the primer pairs. This is a method for qualitatively and / or quantitatively detecting the presence or absence of wheat contained in a test sample by designing a probe and performing PCR using the primer pair and / or the nucleic acid probe.
本発明に使用する被検試料、試料ＤＮＡ、検出対象塩基配列、プライマー対、核酸プローブ、ＰＣＲ反応条件及び定量ＰＣＲについて以下に詳細に説明する。
本発明に使用する被検試料は、被検試料由来のゲノムＤＮＡ又はその断片等の核酸を抽出できるものであれば特に制限されるものではなく、植物体、原材料、加工段階にある材料、加工食品等を用いることができる。
例えば、生ないしは乾燥種子、薄力粉等の粉末、グリッツなどの中間加工品、菓子類や麺類等の加熱調理済みの食品などが挙げられる。
また、これらの試料は、必要に応じて粉砕するなどして、核酸の抽出に適した形状に加工して用いることができる。
The test sample, sample DNA, detection target base sequence, primer pair, nucleic acid probe, PCR reaction conditions, and quantitative PCR used in the present invention are described in detail below.
The test sample used in the present invention is not particularly limited as long as nucleic acid such as genomic DNA derived from the test sample or a fragment thereof can be extracted. Plants, raw materials, materials in processing stage, processing Food or the like can be used.
Examples thereof include raw or dry seeds, powders such as soft flour, intermediate processed products such as grits, and cooked foods such as confectionery and noodles.
In addition, these samples can be used after being processed into a shape suitable for nucleic acid extraction, for example, by pulverizing as necessary.
被検試料に含まれる小麦の含有量は特に指定するものではないが、本発明では、被検試料から抽出した核酸溶液中に微量の小麦由来核酸が５０ｐｐｍ、好適には１０ｐｐｍ含有していれば、被検試料中に存在する小麦の有無を判定することができると共に、小麦の含有量を測定することができる。
また、生物由来の代謝産物や資化産物あるいはタンパク質等と比較して、核酸は加熱や加圧などの物理的加工に対して比較的安定であり、そのような加工に供された加工品の中に微量でも存在していれば十分に検出することが可能である。
これらのことは、生産者が意図しない各種食品への小麦の混入を検出するための基礎データを得ることが可能であることを意味する。
The content of wheat contained in the test sample is not particularly specified. In the present invention, a small amount of wheat-derived nucleic acid is contained in the nucleic acid solution extracted from the test sample in an amount of 50 ppm, preferably 10 ppm. The presence or absence of wheat present in the test sample can be determined, and the wheat content can be measured.
In addition, nucleic acids are relatively stable to physical processing such as heating and pressurization compared to biological metabolites, assimilation products, proteins, etc., and processed products subjected to such processing If even a small amount is present, it can be sufficiently detected.
These means that it is possible to obtain basic data for detecting the mixing of wheat into various foods that are not intended by the producer.
また、小麦は、ゲノム構成がＡＡＢＢＤＤの六倍体である普通系小麦、ＡＡＢＢの四倍体である二粒系小麦、ＡＡの二倍体である一粒系小麦に分類される。
その他、特殊なゲノム構成を擁するチモフェービ系小麦や原種に極めて近い食用小麦等も存在する。
一般的に汎用されている普通小麦やクラブ小麦、スペルト小麦等は普通系小麦に分類され、デュラム小麦やエンマー小麦等は二粒系小麦に分類される。
本発明で検出できる「小麦」は、Ａ、Ｂ、Ｄの何れかのゲノムを少なくとも１つ以上を有する小麦であれば特に限定されない。
本発明では、これらの小麦を高い再現性で検出することができる。
In addition, wheat is classified into normal wheat that is a hexaploid of AABBDD, double wheat that is a tetraploid of AABB, and single wheat that is a diploid of AA.
In addition, there are thymophobiic wheat with a special genome structure and edible wheat that is very close to the original varieties.
Commonly used ordinary wheat, club wheat, spelled wheat and the like are classified as ordinary wheat, and durum wheat and emmer wheat are classified as two-grain wheat.
The “wheat” that can be detected in the present invention is not particularly limited as long as it has at least one genome of any of A, B, and D.
In the present invention, these wheat grains can be detected with high reproducibility.
被検試料由来の核酸は、被検試料に含まれる植物体のゲノムＤＮＡであることが好ましい。
被検試料からの核酸の抽出方法は特に限定されず、ＰＣＲに供すに足る品質が保証される方法であればどのような方法又はキットでも使用することができる。
例えば、ＣＴＡＢ法やＱＩＡＧＥＮ Ｐｌａｎｔ ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）等の市販キットを用いることができる。
また、必要に応じてこれらの方法を改変することもできる。
これらの方法により抽出した核酸は、ＰＣＲの鋳型として用いるのに適した状態で保持することが望ましく、例えば適切な緩衝液に溶解させた状態しておくことが好ましい。
得られた核酸の濃度と純度は、分光光度計を用いて２３０，２６０，２８０，３２０ｎｍの吸光度を測定することにより検定することができる。
ＰＣＲを行う上で、２６０／２３０ｎｍの吸光度比が２以上、２６０／２８０ｎｍの吸光度比が１．８〜２．０と評価された核酸溶液を用いることが好ましい。
この際、２６０／２８０ｎｍの比が２．０に近づくに従ってＲＮＡの混入が疑われるので、ＤＮＡ濃度を検定する際には注意する必要がある。
さらに、抽出したＤＮＡを評価するために、アガロースゲル電気泳動及び被検試料を構成する植物体の内在性遺伝子に相補的なプライマー対を用いてＰＣＲ反応が進行することを確認してもよい。
The nucleic acid derived from the test sample is preferably a plant genomic DNA contained in the test sample.
The method for extracting a nucleic acid from a test sample is not particularly limited, and any method or kit can be used as long as the quality sufficient for PCR is guaranteed.
For example, commercially available kits such as CTAB method and QIAGEN Plant mini Kit (manufactured by QIAGEN) can be used.
In addition, these methods can be modified as necessary.
The nucleic acid extracted by these methods is desirably retained in a state suitable for use as a PCR template. For example, the nucleic acid is preferably dissolved in an appropriate buffer.
The concentration and purity of the obtained nucleic acid can be assayed by measuring the absorbance at 230, 260, 280, and 320 nm using a spectrophotometer.
When performing PCR, it is preferable to use a nucleic acid solution in which the absorbance ratio at 260/230 nm is 2 or more and the absorbance ratio at 260/280 nm is evaluated as 1.8 to 2.0.
At this time, RNA contamination is suspected as the 260/280 nm ratio approaches 2.0, so care must be taken when assaying the DNA concentration.
Furthermore, in order to evaluate the extracted DNA, it may be confirmed that the PCR reaction proceeds using agarose gel electrophoresis and a primer pair complementary to the endogenous gene of the plant constituting the test sample.
ＤＮＡ塩基配列決定方法の改良と共に数多くの遺伝子が同定され、今日に至ってはＮＣＢＩ（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｏｆ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ；Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ）やＤＤＢＪ（ＤＮＡ Ｄａｔａ Ｂａｎｋ ｏｆ Ｊａｐａｎ；国立遺伝学研究所）などの機関により膨大な塩基配列のデータベースが一般に公開されている。
検出対象とする小麦ＤＮＡ塩基配列は、それらのデータベースを活用してもよいし、自ら実験的に解析・取得した塩基配列を用いてもよい。
一般的に、小麦を含む植物体のＤＮＡは、ゲノムＤＮＡ、葉緑体ＤＮＡ、ミトコンドリアＤＮＡで構成されている。
細胞内のゲノムＤＮＡは核に１組のみ存在するが、それに対して葉緑体ＤＮＡとミトコンドリアＤＮＡの数は細胞内に存在する各オルガネラの数量に依存するので組織や細胞によって異なる。
以上のことから、本発明の目的を勘案し、小麦ゲノムＤＮＡに特異的であり、小麦ゲノムＤＮＡにおいてコピー数が安定しており、且つ小麦の多様なゲノム構成に対応したＤＮＡ塩基配列を検出対象として選抜する必要がある。
選抜した塩基配列を元情報として、ＰＣＲを基盤とした検出方法に適したプライマー対並びに核酸プローブを設計することができる。
本発明の検出方法を勘案すると、プライマー対の設計には様々な条件が課せられる。
すなわち、プライマー対は、増幅対象となるＤＮＡ塩基配列を特異的に増幅できる限りどのようなものであってもかまわないが、被検試料が加工食品である場合には加工工程において被検試料中のゲノムＤＮＡ等が断片化されることがあるので、ＰＣＲ増幅産物が８０〜５００ｂｐより好ましくは８０〜１５０ｂｐ程度になるように設計されることが望ましい。
更に、プライマーのＧＣ含量が４０〜６０％であること、プライマーが単独あるいは複数で高次構造を形成しないこと、プライマー対の各プライマー同士が３’端末側で相補的な配列でないこと、プライマー対のプライマー同士が連続した３塩基以上の塩基対を形成しないこと、プライマー対でＴｍが近似していること、などの条件を考慮しなければならない。
Numerous genes have been identified along with improvements in DNA sequencing methods. To date, NCBI (National Center of Biotechnology Information; National Institutes of Health) and DDBJ (DNA Data Bank of Japan; National Institute of Genetics) An extensive database of base sequences is open to the public.
As the wheat DNA base sequence to be detected, those databases may be used, or base sequences that are experimentally analyzed and obtained by themselves may be used.
Generally, plant DNA including wheat is composed of genomic DNA, chloroplast DNA, and mitochondrial DNA.
Only one set of genomic DNA in the cell exists in the nucleus, whereas the number of chloroplast DNA and mitochondrial DNA depends on the number of organelles present in the cell, and thus differs depending on the tissue and cell.
In view of the above, in consideration of the object of the present invention, a DNA base sequence that is specific to wheat genomic DNA, has a stable copy number in wheat genomic DNA, and corresponds to various genomic structures of wheat is detected. Need to be selected as.
Primer pairs and nucleic acid probes suitable for PCR-based detection methods can be designed using the selected base sequences as original information.
Considering the detection method of the present invention, various conditions are imposed on the design of primer pairs.
That is, the primer pair may be any as long as it can specifically amplify the DNA base sequence to be amplified, but if the test sample is processed food, Therefore, it is desirable to design the PCR amplification product to be about 80 to 500 bp, more preferably about 80 to 150 bp.
Furthermore, the GC content of the primer is 40 to 60%, the primer is single or plural and does not form a higher order structure, each primer of the primer pair is not a complementary sequence on the 3 ′ end side, the primer pair It is necessary to consider conditions such as that the primers do not form a continuous base pair of 3 or more bases, and that the Tm is close to the primer pair.
また、定量的ＰＣＲを実施する際のプライマー対設計においては、核酸プローブの設計に対する条件も勘案する必要がある。
定量的ＰＣＲとは、一般的にＰＣＲ増幅反応開始時点における反応液中の鋳型ＤＮＡ量を定量するための一連の反応を指す。
既に幾つかの定量的ＰＣＲ法が開発されており、それらの多くはＰＣＲ増幅反応によって生じた増幅産物の分子数に対応したシグナル変化をもたらすプローブを利用する。
例えば、プライマー対に挟まれた領域の塩基配列に相補的な核酸プローブを利用するＴａｑＭａｎプローブ法やＦＲＥＴプローブ法、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｅａｃｏｎ法、あるいはＤＮＡ二重螺旋構造にインターカレートする化合物をプローブとして利用したＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ法などが挙げられる。
核酸プローブを利用した手法は、その設計に様々な条件を解決する必要があるが、標的塩基配列がプライマー対と核酸プローブによって認識されるため、特異性の高い正確な定量的検出に効果を発揮する。
一方、インターカレーターを利用した手法は、簡便に実施できる利点があるが、非特異的なＰＣＲ増幅産物やプライマーダイマーに由来するシグナルも得られるために特異性の高い正確な定量値を得ることが難しい。
一般的に核酸プローブは蛍光化合物とクエンチング効果を持つ化合物とによって標識されており、ＰＣＲ増幅反応に依存して核酸プローブが分解されて蛍光物質を遊離し、その結果ＰＣＲ反応溶液中の蛍光量を増加させ、尚且つその蛍光量の増加が増幅の程度を反映する指標となることが好ましい。
これにより、ＰＣＲにおける増幅の様子をリアルタイムで簡便に検出することができる。
このような核酸プローブは、対応するプライマー対のＴｍ値よりも１０℃程度高く、且つクエンチング効果を維持するために１８〜２５塩基程度の長さになるように設計され、より好ましくは核酸プローブ末端がＧにならないように配慮されることが望ましい。
本発明の実施態様の一つとして、小麦ゲノムＤＮＡの内在性塩基配列を検出対象とする内部標準法に準拠し、且つ核酸プローブを利用した定量的ＰＣＲ法が使用される。
In addition, in designing primer pairs when performing quantitative PCR, it is necessary to consider the conditions for designing nucleic acid probes.
Quantitative PCR generally refers to a series of reactions for quantifying the amount of template DNA in a reaction solution at the start of a PCR amplification reaction.
Several quantitative PCR methods have already been developed, and many of them utilize probes that cause a signal change corresponding to the number of molecules of amplification products generated by the PCR amplification reaction.
For example, TaqMan probe method, FRET probe method, Molecular Beacon method using a nucleic acid probe complementary to the base sequence in the region sandwiched between primer pairs, or a compound intercalating into a DNA double helix structure was used as a probe. Examples thereof include the SYBR Green method.
The method using a nucleic acid probe needs to solve various conditions for its design, but because the target base sequence is recognized by the primer pair and the nucleic acid probe, it is effective for accurate quantitative detection with high specificity. To do.
On the other hand, the method using an intercalator has the advantage that it can be carried out easily, but it can also obtain signals derived from non-specific PCR amplification products and primer dimers, so that accurate quantitative values with high specificity can be obtained. difficult.
In general, a nucleic acid probe is labeled with a fluorescent compound and a compound having a quenching effect, and depending on the PCR amplification reaction, the nucleic acid probe is decomposed to release a fluorescent substance, resulting in the amount of fluorescence in the PCR reaction solution. It is preferable that an increase in the amount of fluorescence is an index reflecting the degree of amplification.
Thereby, the state of amplification in PCR can be easily detected in real time.
Such a nucleic acid probe is designed to be about 10 ° C. higher than the Tm value of the corresponding primer pair and to have a length of about 18 to 25 bases in order to maintain the quenching effect, and more preferably the nucleic acid probe It is desirable to take care that the end does not become G.
As one embodiment of the present invention, a quantitative PCR method based on an internal standard method that uses an endogenous base sequence of wheat genomic DNA as a detection target and using a nucleic acid probe is used.
以上のようにして設計されたプライマー対及び核酸プローブを用いて、被検試料から抽出した核酸を鋳型として定性的及び／又は定量的ＰＣＲを実施することができる。
ＰＣＲは、特に限定されるものではないが、公知である種々の改良法を用いることができる。
例えば、プライマー対、鋳型となる核酸、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌなどの適切な緩衝液、ｄＮＴＰ、塩化カリウム、塩化マグネシウム、耐熱性ＤＮＡ合成酵素等の試薬類をそれぞれ適切な量を混合してＰＣＲ反応液とすることができる。
ＰＣＲ反応は、鋳型ＤＮＡの熱変性、プライマー対と鋳型ＤＮＡとのアニーリング、耐熱性ＤＮＡ合成酵素によるＤＮＡの合成反応の３つのステップから構成される。
各ステップは、それぞれ異なった温度と時間を必要とするので、増幅しようとする領域の塩基配列とその長さを考慮して適切な範囲で設定する。
この工程は特に限定されるものではないが、例えば、９５℃で１０分間保持し、以後９５℃で３０秒、６０℃で３０秒、７２℃で１分を１サイクルとして３５サイクルの反復を行い、サイクル終了後に７２℃で７分保持し、その後４℃に保持することで行うことができる。
このような反応は、一般に市販されている装置を用いて行うことができ、その中には定量的ＰＣＲに対応する装置も含まれる。
定性的ＰＣＲによる増幅産物の検出は、特に限定されるものではないが、一般的に電気泳動法又は蛍光検出法により行われる。
例えば、必要に応じて陰性コントロールや陽性コントロール、マーカーと共に被検試料のＰＣＲ増幅産物をアガロース電気泳動に供し、泳動後エチジウムブロマイドなどのインターカレーターで染色し、紫外光照射下で検出される。
この際、ＰＣＲ増幅産物のバンドが観察されれば、被検試料中に小麦が存在する。
また、定量的ＰＣＲに対応する装置を用いて検出する場合には、ＰＣＲ増幅産物の増加に伴って発せられる核酸プローブ由来の蛍光の変化が検出されれば、被検試料中に小麦が存在する。
この際、蛍光の増加を指標として、予めあるいは同時に作成した検量線を用いた数学的演算により、被検試料中の小麦の含有量を定量的に算出することができる。
本発明の方法は、設計されたプライマー対及び核酸プローブを含む試薬キットとして用いることができる。
この試薬キットには、ＰＣＲを実施するための最適な各種試薬類並びに検出するための試薬類が付属されていてもよいし、プライマー対のみでもよい。
また、この試薬キットは微量の小麦を検出することができるので、被検試料中に小麦が含まれる旨の表示あるいはアレルギー情報として利用することができる。
その他、加工食品等の製造管理を適正に行うための指標としても利用することができる。
Using the primer pair and nucleic acid probe designed as described above, qualitative and / or quantitative PCR can be performed using a nucleic acid extracted from a test sample as a template.
PCR is not particularly limited, but various known improved methods can be used.
For example, an appropriate amount of a primer pair, a template nucleic acid, an appropriate buffer such as Tris-HCl, reagents such as dNTP, potassium chloride, magnesium chloride, and a heat-resistant DNA synthase are mixed with a PCR reaction solution. can do.
The PCR reaction is composed of three steps: thermal denaturation of the template DNA, annealing of the primer pair and the template DNA, and DNA synthesis reaction with a thermostable DNA synthase.
Each step requires a different temperature and time, and is set within an appropriate range in consideration of the base sequence of the region to be amplified and its length.
Although this process is not particularly limited, for example, it is held at 95 ° C. for 10 minutes, and thereafter 35 cycles are repeated with 95 ° C. for 30 seconds, 60 ° C. for 30 seconds, and 72 ° C. for 1 minute. After completion of the cycle, it can be carried out by holding at 72 ° C. for 7 minutes and then holding at 4 ° C.
Such a reaction can be performed using a commercially available apparatus, and includes an apparatus corresponding to quantitative PCR.
Although detection of the amplification product by qualitative PCR is not particularly limited, it is generally performed by electrophoresis or fluorescence detection.
For example, if necessary, a PCR amplification product of a test sample together with a negative control, a positive control, and a marker is subjected to agarose electrophoresis, stained with an intercalator such as ethidium bromide, and detected under ultraviolet light irradiation.
At this time, if a band of the PCR amplification product is observed, wheat is present in the test sample.
In addition, when detecting using a device that supports quantitative PCR, if a change in fluorescence derived from a nucleic acid probe that is emitted along with an increase in PCR amplification products is detected, wheat is present in the test sample. .
At this time, the wheat content in the test sample can be quantitatively calculated by mathematical calculation using a calibration curve prepared in advance or simultaneously with the increase in fluorescence as an index.
The method of the present invention can be used as a reagent kit containing a designed primer pair and a nucleic acid probe.
In this reagent kit, various optimal reagents for carrying out PCR and reagents for detection may be attached, or only a primer pair may be included.
Moreover, since this reagent kit can detect a trace amount of wheat, it can be used as an indication that wheat is contained in the test sample or as allergy information.
In addition, it can also be used as an index for properly managing the production of processed foods.
以下本発明を実施例により具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
［実施例１］小麦検出のためのプライマー対及び定量用核酸プローブの構築方法
＜標的遺伝子の選抜＞
一般的に小麦のゲノムＤＮＡは３種類のゲノムから構成されており、各々Ａ、Ｂ、Ｄゲノムと称されている。
普通小麦はＡＡＢＢＤＤゲノムを有する六倍体であり、デュラム小麦はＡＡＢＢゲノムを有する四倍体である。
本発明で標的遺伝子としたｗｈｅａｔ Ｓｔａｒｃｈ Ｓｙｎｔｈａｓｅ ＩＩは、小麦のＡ、Ｂ、Ｄゲノム各々の７番染色体の短腕にコードされており、これらの遺伝子は各々ＳＳＩＩ−Ａ、ＳＳＩＩ−Ｂ、ＳＳＩＩ−Ｄと略称される（非特許文献２）。
これらの遺伝子を標的遺伝子としてＰＣＲによる検出法を構築することができれば、本課題の目的を達成できると判断し、ＳＳＩＩ−Ａ（Ｔｒｉｔｉｃｕｍ ａｅｓｔｉｖｕｍ ｗＳＳＩＩ−Ａ ｇｅｎｅ ｆｏｒ ｓｔａｒｃｈ ｓｙｎｔｈａｓｅ ＩＩ−Ａ, ｃｏｍｐｌｅｔｅ ｃｄｓ.、Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ. ＡＢ２０１４４５、全長６８９８ｂｐ）（配列番号１３）、ＳＳＩＩ−Ｂ（Ｔｒｉｔｉｃｕｍ ａｅｓｔｉｖｕｍ ｗＳＳＩＩ−Ｂ ｇｅｎｅ ｆｏｒ ｓｔａｒｃｈ ｓｙｎｔｈａｓｅ ＩＩ−Ｂ, ｃｏｍｐｌｅｔｅ ｃｄｓ．、Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ． ＡＢ２０１４４６、全長６８１１ｂｐ）（配列番号１４）、ＳＳＩＩ−Ｄ（Ｔｒｉｔｉｃｕｍ ａｅｓｔｉｖｕｍ ｗＳＳＩＩ−Ｄ ｇｅｎｅ ｆｏｒ ｓｔａｒｃｈ ｓｙｎｔｈａｓｅ ＩＩ−Ｄ， ｃｏｍｐｌｅｔｅ ｃｄｓ．、Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＡＢ２０１４４７、全長７０１０ｂｐ）（配列番号１５）を検出標的遺伝子とて選択した。
また、小麦の原種であるタルホコムギ（Ａｅｇｉｌｏｐｓ ｔａｕｓｃｈｉｉ）のゲノムはＤＤゲノムを有する二倍体であり、そのＳＳＩＩ（Ａｅｇｉｌｏｐｓ ｔａｕｓｃｈｉｉ ｓｔａｒｃｈ ｓｙｎｔｈａｓｅ ＩＩ ｇｅｎｅ，ｃｏｍｐｌｅｔｅ ｃｄｓ．、Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＡＹ１３３２４８、全長９０２４ｂｐ）（配列番号１６）も併せて標的遺伝子として選択した。
EXAMPLES The present invention will be specifically described below with reference to examples, but the present invention is not limited to these examples.
[Example 1] Primer pair for wheat detection and method for constructing nucleic acid probe for quantification <Selection of target gene>
Generally, genomic DNA of wheat is composed of three types of genomes, which are referred to as A, B, and D genomes, respectively.
Ordinary wheat is hexaploid with the AABBDD genome, and durum wheat is tetraploid with the AABB genome.
Wheat Starch Synthase II, which is a target gene in the present invention, is encoded by the short arm of chromosome 7 of each of the wheat A, B, and D genomes, and these genes are SSII-A, SSII-B, and SSII-, respectively. Abbreviated as D (Non-patent Document 2).
If it is possible to construct a detection method by PCR using these genes as target genes, it is judged that the object of the present subject can be achieved, and SSII-A (Triticum aestivum wSSII-A gene for start synthase II-A, complete cds. Accession No. AB201445, full length 6898bp) (SEQ ID NO: 13), SSII-B (Triticum aestivum wSSII-B gene for start synthase II-B, complete cds., Accession No. AB20144), full length AB14146) -D (Triticum aestivum wSSII-D gene for start synthase II-D complete cds., Accession No.AB201447, full length 7010Bp) selected detection target gene with a (SEQ ID NO: 15).
In addition, the genome of the wheat seed, Aegilops tauschii, is a diploid having a DD genome, and its SSII (Aegilops tauschii start synthase II gene, complete cds., Accession No. A901348, full-length sequence No. A2413). 16) was also selected as a target gene.
＜ＳＳＩＩの相同性確認＞
ＮＣＢＩ又はＤＤＢＪのＢＬＡＳＴ検索によって、選択した小麦のＳＳＩＩ遺伝子と類似する塩基配列を有する遺伝子が小麦及び小麦以外の食品原材料となりうる生物体に存在するか否か確認した。
配列番号１３（小麦ＳＳＩＩ−Ａ）に対する相同性を表１に、配列番号１４（小麦ＳＳＩＩ−Ｂ）に対する相同性を表２に、配列番号１５（小麦ＳＳＩＩ−Ｄ）に対する相同性を表３に示す。
小麦のＳＳＩＩ−Ａ、ＳＳＩＩ−Ｂ、ＳＳＩＩ−Ｄ、小麦原種タルホコムギのＳＳＩＩ及びオオムギ（Ｈｏｒｄｅｕｍ ｖｕｌｇａｒ）のＳＳＩＩにおける一部の塩基配列と高い相同性を示したが、それ以外の遺伝子との相同性は極めて低かった。
特に、小麦ＳＳＩＩ−ＤとタルホコムギのＳＳＩＩの相同性は高く、小麦Ｄゲノムがタルホコムギに由来することを強く支持した。
<SSII homology confirmation>
By BLAST search of NCBI or DDBJ, it was confirmed whether or not a gene having a base sequence similar to the SSII gene of the selected wheat exists in an organism that can be a food raw material other than wheat and wheat.
Table 1 shows the homology to SEQ ID NO: 13 (wheat SSII-A), Table 2 shows the homology to SEQ ID NO: 14 (wheat SSII-B), and Table 3 shows the homology to SEQ ID NO: 15 (wheat SSII-D). Show.
It showed high homology with some of the nucleotide sequences in SSII-A, SSII-B, SSII-D in wheat, SSII in wheat seed varieties and SSII in barley (Hordeum vulgar), but homology with other genes Was extremely low.
In particular, the homology between SSII-D of wheat and SSII of tarho wheat was high, and strongly supported that the wheat D genome was derived from tarho wheat.
＜ＳＳＩＩに特異的なプライマー対の設計＞
ＳＳＩＩ遺伝子の各エキソン領域を対象として、遺伝子工学用ソフトウェアＯｌｉｇｏ（商品名：Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｉｎｓｉｇｈｔｓ社製）を用いてプライマーの候補となる塩基配列の検索を実施した。
最適なプライマーを設計するには、ＧＣ含量やＴｍ値、塩基配列長、ＰＣＲ産物長など各種条件を厳密に制御する必要がある。
これらを考慮した結果、複数のプライマーの候補塩基配列を選抜することができた。
選抜した塩基配列をＢＬＡＳＴ検索することにより、小麦ＳＳＩＩを特異的に認識する可能性が高いプライマーを絞り込み、最終的に６組のプライマー対を選抜した。
これら６組のプライマー対のＴｍ値は、塩基配列より最近接塩基対法及び／又はＧＣ法により算出し、ＰＣＲ反応における最適なアニール温度を設定するための指標とした。
<Design of SSII-specific primer pairs>
Using the genetic engineering software Oligo (trade name: manufactured by Molecular Biology Insights), a search for a base sequence that is a candidate for a primer was performed for each exon region of the SSII gene.
In order to design an optimal primer, it is necessary to strictly control various conditions such as the GC content, Tm value, base sequence length, and PCR product length.
As a result of these considerations, candidate base sequences of a plurality of primers could be selected.
By performing a BLAST search on the selected nucleotide sequences, primers having a high possibility of specifically recognizing wheat SSII were narrowed down, and finally 6 primer pairs were selected.
The Tm values of these six primer pairs were calculated from the base sequence by the closest base pair method and / or the GC method, and used as an index for setting the optimum annealing temperature in the PCR reaction.
＜ＳＳＩＩに特異的な定量的ＰＣＲ用核酸プローブの設計＞
定量的ＰＣＲの手法は既に幾通りか報告されている。
解析機器や反応試薬が充実していることから、ＴａｑＭａｎプローブ法が広く利用されている。
本手法の原理を以下に説明する。
プライマー対に挟まれた領域の塩基配列に相補的な核酸プローブを作成する。
この核酸プローブは、その５’末端ないしは３’末端を蛍光化合物で標識され、相対する末端をクエンチング効果を有する化合物で標識される。
ＰＣＲ反応において、熱変性され２本鎖から１本鎖となった標的鋳型ＤＮＡ分子にプライマー対及び核酸プローブが相補的にハイブリダイズし、耐熱性ＤＮＡ合成酵素によってプライマーを起点として５’末端側から３’末端側に向かってＤＮＡ鎖の伸張反応が起こる。
この伸張反応の過程において耐熱性ＤＮＡ合成酵素が核酸プローブの部位まで到達すると、同酵素が併せ持つＤＮＡ分解活性によって核酸プローブが分解される。
その分解に伴って核酸プローブの標識化合物が遊離されてクエンチング効果が解除されるので、蛍光物質の蛍光を検出することができるようになる。
この分解反応は標的鋳型ＤＮＡ、プライマー対及び核酸プローブが１:１:１の関係で起こるので、ＰＣＲ反応中の蛍光強度の変化を測定することにより反応試薬中に含まれる標的鋳型ＤＮＡの分子数を算出することができる。
換言すれば、ＰＣＲ反応におけるプライマー対に挟まれる領域の核酸分子の増幅の様子をリアルタイムで簡便にモニタリングすることができ、数学的演算により反応溶液中に含まれていたＰＣＲ反応開始時の標的鋳型ＤＮＡの分子数を求めることができる。
通常、このような核酸プローブは、対応するプライマー対のＴｍ値よりも１０℃程度高く、且つクエンチング効果を維持するために１８〜２５塩基程度の長さになるように設計され、より好ましくは核酸プローブ末端がＧにならないように配慮されることが望ましい。
本課題では、被検試料中に含まれる小麦の含有量を定量的に測定することが可能なシステムを構築するために、上記ＴａｑＭａｎプローブ法に則って核酸プローブを作成した。
各プライマー対に対応する核酸プローブは、Ｐｒｉｍｅｒ Ｅｘｐｒｅｓｓ ｖｅｒ．２．０．０（商品名：アプライドバイオシステムズ社製）を使用して設計した。
なお、核酸プローブの標識化合物には、蛍光化合物としてＦＡＭ（商品名：アプライドバイオシステムズ社製）を、クエンチング効果を有する化合物としてＴＡＭＲＡ（商品名：アプライドバイオシステムズ社製）を用いるが、特にこれらに限定されるものではなく、ＴａｑＭａｎプローブ法に適合する化合物であればいかなる化合物を用いてもよい。
<Design of nucleic acid probe for quantitative PCR specific to SSII>
Several quantitative PCR methods have already been reported.
The TaqMan probe method is widely used due to the richness of analytical instruments and reaction reagents.
The principle of this method will be described below.
A nucleic acid probe complementary to the base sequence in the region sandwiched between the primer pairs is prepared.
This nucleic acid probe is labeled with a fluorescent compound at its 5 ′ end or 3 ′ end and with a compound having a quenching effect at the opposite end.
In a PCR reaction, a primer pair and a nucleic acid probe are hybridized in a complementary manner to a target template DNA molecule that has been heat-denatured and converted from a double strand to a single strand, and the primer is used as a starting point by a thermostable DNA synthase from the 5 'end A DNA strand extension reaction takes place toward the 3 ′ end.
When the thermostable DNA synthetase reaches the site of the nucleic acid probe during the extension reaction, the nucleic acid probe is decomposed by the DNA decomposing activity of the enzyme.
Along with the decomposition, the labeled compound of the nucleic acid probe is released and the quenching effect is released, so that the fluorescence of the fluorescent substance can be detected.
Since this degradation reaction takes place in a 1: 1: 1 relationship between the target template DNA, the primer pair, and the nucleic acid probe, the number of molecules of the target template DNA contained in the reaction reagent is measured by measuring the change in fluorescence intensity during the PCR reaction. Can be calculated.
In other words, the state of amplification of the nucleic acid molecules in the region sandwiched between the primer pairs in the PCR reaction can be monitored easily in real time, and the target template at the start of the PCR reaction contained in the reaction solution by mathematical calculation The number of DNA molecules can be determined.
Usually, such a nucleic acid probe is designed to be about 10 ° C. higher than the Tm value of the corresponding primer pair and to have a length of about 18 to 25 bases in order to maintain the quenching effect, and more preferably It is desirable to take care that the nucleic acid probe ends are not G.
In this task, a nucleic acid probe was created in accordance with the TaqMan probe method in order to construct a system capable of quantitatively measuring the content of wheat contained in a test sample.
Nucleic acid probes corresponding to each primer pair are described in Primer Express ver. 2.0.0 (trade name: manufactured by Applied Biosystems) was used for designing.
As the labeling compound of the nucleic acid probe, FAM (trade name: manufactured by Applied Biosystems) is used as a fluorescent compound, and TAMRA (trade name: manufactured by Applied Biosystems) is used as a compound having a quenching effect. However, any compound may be used as long as the compound is compatible with the TaqMan probe method.
［実施例２］ＰＣＲに用いた鋳型ＤＮＡの抽出
小麦及びその他イネ科植物やマメ科植物等の種子は、その表面を界面活性化剤の一種であるＳＤＳの１．０％溶液で洗浄後、蒸留水で良く濯ぎ洗いをし、凍結乾燥した。
この種子をマルチビーズショッカー（商品名：安井機器社製）もしくは超遠心粉砕機（レッチェ社製）を用いて微粉砕した。
各粉砕試料からＤＮＡ Ｐｌａｎｔ Ｍｉｎｉ ｋｉｔ（商品名：ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いてゲノムＤＮＡを抽出した。
抽出操作については、ＤＮＡ Ｐｌａｎｔ Ｍｉｎｉ Ｈａｎｄｂｏｏｋを参照し、一部に改良を加えた方法にて実施した。
すなわち、粉砕試料をＡＰ１緩衝液とＲＮａｓｅ Ａ及びＰｒｏｔｅｉｎａｓｅ Ｋの混合液に懸濁し、これを６５℃に加温した反応層で１０分間保持した。
この後の操作については前出のＨａｎｄｂｏｏｋに従って実施した。
なお、Ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ Ｋについては、０．１ｇ粉砕試料あたり５μＬの２０ｍｇ／ｍＬ Ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ Ｋ溶液（タカラ社製）を添加した。
この添加量については、種子の種類や状態により適当量に変更することができる。
加工食品からＤＮＡを抽出する場合には、それらの物性に応じて抽出用試料を調製する。
固形の加工食品の場合には、前記で示したような粉砕機により微粉砕試料とする。
ゲル状加工食品の場合には、布製あるいは紙製等の吸湿剤で水分を良く除去した後、前記で示したような粉砕機により微粉砕試料とする。
ゾル状あるいは液状加工食品の場合には、そのまま試料として用いることができる。
それらの手法により調製した抽出用試料からのＤＮＡの抽出は、Ｇｅｎｏｍｉｃ−ｔｉｐ ２０／Ｇ（商品名：ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて行った。
抽出操作については、ＱＩＡＧＥＮ Ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ Ｈａｎｄｂｏｏｋを参照し、一部に改良を加えた方法にて実施した。
すなわち、抽出用試料をＧ２緩衝液とＲＮａｓｅ Ａ及びＰｒｏｔｅｉｎａｓｅ Ｋの混合液に懸濁し、これを５０℃に加温した反応層で３０分間保持した。
この後の操作については前出のＨａｎｄｂｏｏｋに従って実施した。
なお、ＲＮａｓｅ Ａ及びＰｒｏｔｅｉｎａｓｅ Ｋの添加量は、抽出用試料の状態により適量に変更することができる。
抽出したＤＮＡは、分光光度計により２３０，２６０，２８０，３２０ｎｍの吸光度を測定してその純度と濃度を求め、０．８％アガロースゲル電気泳動に供した。
その後、純水あるいはＴＥ緩衝液を添加して２０ｎｇ／μＬに希釈してＰＣＲの鋳型ＤＮＡ溶液とした。
[Example 2] Extraction of template DNA used in PCR After seeds such as wheat and other grasses and legumes were washed with a 1.0% solution of SDS, which is a kind of surfactant, Rinse thoroughly with distilled water and freeze-dry.
The seeds were finely pulverized using a multi-bead shocker (trade name: manufactured by Yasui Kikai Co., Ltd.) or an ultracentrifugal mill (manufactured by Lecce).
Genomic DNA was extracted from each crushed sample using DNA Plant Mini kit (trade name: QIAGEN).
About extraction operation, it implemented by the method which added DNA Plant Mini Handbook and improved partially.
That is, the pulverized sample was suspended in a mixed solution of AP1 buffer, RNase A, and Proteinase K, and this was held in a reaction layer heated to 65 ° C. for 10 minutes.
Subsequent operations were performed according to the above-mentioned Handbook.
For Proteinase K, 5 μL of 20 mg / mL Proteinase K solution (manufactured by Takara) was added per 0.1 g ground sample.
About this addition amount, it can change into a suitable amount with the kind and state of a seed.
When DNA is extracted from processed food, an extraction sample is prepared according to the physical properties thereof.
In the case of a solid processed food, a finely pulverized sample is obtained by a pulverizer as described above.
In the case of a gel-like processed food, moisture is well removed with a moisture absorbent such as cloth or paper, and then a finely pulverized sample is obtained by a pulverizer as described above.
In the case of a sol or liquid processed food, it can be used as it is as a sample.
Extraction of DNA from the sample for extraction prepared by these methods was performed using Genomic-tip 20 / G (trade name: manufactured by QIAGEN).
About extraction operation, it referred to QIAGEN Genomic DNA Handbook and implemented by the method which added the improvement partially.
That is, the sample for extraction was suspended in a mixed solution of G2 buffer, RNase A, and Proteinase K, and this was held in a reaction layer heated to 50 ° C. for 30 minutes.
Subsequent operations were performed according to the above-mentioned Handbook.
In addition, the addition amount of RNase A and Proteinase K can be changed to an appropriate amount depending on the state of the sample for extraction.
The extracted DNA was measured for absorbance at 230, 260, 280, and 320 nm with a spectrophotometer to determine its purity and concentration, and subjected to 0.8% agarose gel electrophoresis.
Thereafter, pure water or TE buffer was added to dilute to 20 ng / μL to obtain a template DNA solution for PCR.
［実施例３］ＰＣＲとＰＣＲ増幅産物の検出方法
ＰＣＲには、ＡｍｐｌｉＴａｑ Ｇｏｌｄ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（商品名：アプライドバイオシステムズ社製）とその付属試薬を用い、次のような組成でＰＣＲ反応液を調製した。
すなわち、２．５μＬのＰＣＲ ｂｕｆｆｅｒ ＩＩ、２．５μＬの２ｍＭ ｄＮＴＰ ｍｉｘ、１．５μＬの２５ｍＭ塩化マグネシウム、０．１２５μＬの５ｕｎｉｔｓ／μＬ ＡｍｐｌｉＴａｑ Ｇｏｌｄ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（商品名：アプライドバイオシステムズ社製）、２μＬの２．５μＭプライマー対及び１３．８７５μＬの滅菌水を十分に混合した溶液に２．５μＬの２０ｎｇ／μＬ鋳型ＤＮＡ溶液を添加して全量を２５μＬとした。
ＰＣＲ増幅装置には２７２０ Ｔｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒ（商品名：アプライドバイオシステムズ社製）を用い、反応条件は以下の表４に示す条件で実施した。
アニール温度は、前出の計算法で求めた個々のプライマーのＴｍ値を基準にして実験的に検証されるので、ＰＣＲに用いるプライマー対毎に最適な温度を設定して行った。
ＰＣＲ増幅産物の電気泳動に際して、ＰＣＲ反応液とローディング緩衝液とを適量混合し、３％アガロースゲルに供した。
電気泳動後、エチジウムブロマイド染色を行い、各プライマー対による至適サイズのＰＣＲ増幅産物を確認することによりサンプル中の小麦の有無を判定した。
この際、陽性コントロール及び陰性コントロールの増幅バンドの有無によりＰＣＲの妥当性を確認した。
[Example 3] PCR and PCR amplification product detection method For PCR, a PCR reaction solution was prepared with the following composition using AmpliTaq Gold DNA Polymerase (trade name: Applied Biosystems) and its associated reagents. .
That is, 2.5 μL of PCR buffer II, 2.5 μL of 2 mM dNTP mix, 1.5 μL of 25 mM magnesium chloride, 0.125 μL of 5 units / μL AmpliTaq Gold DNA Polymerase (trade name: manufactured by Applied Biosystems), 2 μL 2.5 μL of 20 ng / μL template DNA solution was added to a solution in which 2.5 μM primer pair and 13.875 μL of sterilized water were sufficiently mixed to make a total volume of 25 μL.
The PCR amplification apparatus was 2720 Thermal Cycler (trade name: manufactured by Applied Biosystems), and the reaction conditions were as shown in Table 4 below.
Since the annealing temperature is experimentally verified based on the Tm value of each primer obtained by the above calculation method, an optimum temperature was set for each primer pair used for PCR.
In electrophoresis of the PCR amplification product, an appropriate amount of a PCR reaction solution and a loading buffer was mixed and subjected to 3% agarose gel.
After electrophoresis, ethidium bromide staining was performed, and the presence or absence of wheat in the sample was determined by confirming the optimally sized PCR amplification product by each primer pair.
At this time, the validity of PCR was confirmed by the presence or absence of the positive control and negative control amplification bands.
［実施例４］ＰＣＲ産物の塩基配列解析
＜ＰＣＲ増幅産物の精製＞
ＰＣＲ増幅産物の精製は、ＱＩＡｑｕｉｃｋ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（商品名：ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて実施した。
ＰＣＲ増幅産物を前述した手法によりアガロースゲル電気泳動し、紫外光トランスイルミネーターで紫外光を照射してＰＣＲ増幅産物を視認しつつ、目的の増幅産物のバンドを洗浄済みカッターナイフで丁寧に切り取った。
このＰＣＲ増幅産物を含むゲル片から、同キット付属のＨａｎｄｂｏｏｋに従ってＰＣＲ増幅産物を精製した。
[Example 4] Base sequence analysis of PCR product <Purification of PCR amplification product>
Purification of the PCR amplification product was performed using a QIAquick Gel Extraction Kit (trade name: manufactured by QIAGEN).
The PCR amplification product was subjected to agarose gel electrophoresis according to the method described above, and the target amplification product band was carefully cut off with a washed cutter knife while observing the PCR amplification product by irradiating with ultraviolet light with an ultraviolet light transilluminator. .
The PCR amplification product was purified from the gel piece containing the PCR amplification product according to the Handbook attached to the kit.
＜シークエンス解析試料の調製＞
得られた上記精製ＰＣＲ増幅産物を用いたシークエンス反応は、ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ＢｉｇＤｙｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ ｖ３．１ ｃｙｃｌｅ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｋｉｔ（商品名：アプライドバイオシステムズ社製）を用いて実施した。
反応は同キット付属のプロトコールに従って実施し、サイクルシークエンス反応はＧｅｎｅＡｍｐ ＰＣＲ ｓｙｓｔｅｍ ９７００（商品名：アプライドバイオシステムズ社製）を用いて実施した。
得られたサイクルシークエンス反応物は、ＢｉｇＤｙｅ Ｘ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ精製キット（商品名：アプライドバイオシステムズ社製）を用いて付属のプロトコールに従って精製した。得られた精製溶液をシークエンス解析試料とした。
<Preparation of sequence analysis sample>
The sequencing reaction using the obtained purified PCR amplification product was carried out using ABI PRISM BigDye Terminator v3.1 cycle sequencing kit (trade name: manufactured by Applied Biosystems).
The reaction was performed according to the protocol attached to the kit, and the cycle sequence reaction was performed using GeneAmp PCR system 9700 (trade name: manufactured by Applied Biosystems).
The obtained cycle sequence reaction product was purified using a BigDye X Terminator purification kit (trade name: manufactured by Applied Biosystems) according to the attached protocol. The obtained purified solution was used as a sequence analysis sample.
＜塩基配列の解析＞
シークエンス解析試料を３１３０ｘｌ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ａｎａｌｙｚｅｒ（商品名：アプライドバイオシステムズ社製）により解析し、ＰＣＲ増幅産物の塩基配列情報を得た。
この塩基配列をＳＳＩＩの塩基配列（配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５）と比較し、ＰＣＲに用いたプライマー対で挟まれる領域の塩基配列と一致するか確認した。
さらに、この塩基配列をＮＣＢＩ又はＤＤＢＪのＢＬＡＳＴ解析することにより、小麦遺伝子及び小麦以外の植物由来遺伝子との相同性を確認した。
<Analysis of nucleotide sequence>
The sequence analysis sample was analyzed by 3130xl Genetic Analyzer (trade name: manufactured by Applied Biosystems) to obtain the base sequence information of the PCR amplification product.
This base sequence was compared with the base sequence of SSII (SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15), and it was confirmed whether or not it matched with the base sequence of the region sandwiched between the primer pairs used for PCR.
Furthermore, this base sequence was analyzed by BLAST analysis of NCBI or DDBJ to confirm homology with wheat genes and genes derived from plants other than wheat.
［実施例５］小麦を特異的に検出するためのプライマー対の選択
Ａ及びＢゲノムは、一般的に流通している小麦に普遍的に存在している。
それ故、これらのゲノムにコードされている遺伝子を特異的に検出することを目的としてＳＳＩＩ−Ａ（配列番号１３）を元配列としてプライマーを設計した。
前述の手法により小麦ＳＳＩＩ遺伝子のエキソン部分にプライマーを設計し、小麦ＳＳＩＩと相同性の高いオオムギＳＳＩＩにハイブリダイゼーションしないプライマー対を選択した。
選抜したプライマー対を表５のプライマー配列表１に、それらプライマーの小麦ＳＳＩＩにおけるプライマー配置を図１〜３に示す。
[Example 5] Selection of primer pairs for specifically detecting wheat A and B genomes are universally present in commonly distributed wheat.
Therefore, primers were designed with SSII-A (SEQ ID NO: 13) as the original sequence for the purpose of specifically detecting the genes encoded in these genomes.
Primers were designed in the exon part of the wheat SSII gene by the above-mentioned method, and a primer pair that did not hybridize to barley SSII having high homology with wheat SSII was selected.
The selected primer pairs are shown in the primer sequence table 1 of Table 5, and the primer arrangement of these primers in wheat SSII is shown in FIGS.
これらのプライマー対が小麦を特異的に認識することを確認するために、小麦及びその他の植物の種子から抽出したゲノムＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを実施した。
結果を表６に示す。
なお、ＰＣＲ反応におけるアニール温度は、ＳＳＩＩ−Ａ ｅｘ７−Ｕ／Ｌ、ＳＳＩＩ−Ａ ｅｘ８−Ｕ／Ｌ、ＳＳＩＩ−Ａ ｅｘ２−Ｕ／Ｌのプライマー対に対して各々５６℃、６７℃、５５℃に設定した。
ＳＳＩＩ−Ａ ｅｘ７−Ｕ／ＬとＳＳＩＩ−Ａ ｅｘ８−Ｕ／Ｌのプライマー対を用いたＰＣＲを実施したところ、普通小麦及びデュラム小麦では目的の長さのＰＣＲ増幅産物が得られたが、オオムギ、ライムギ、ソバ、ダイズ、トウモロコシ、コメの各植物種ではＰＣＲ増幅産物は得られなかった。
この結果は、ＳＳＩＩ−Ａ ｅｘ７−Ｕ／ＬとＳＳＩＩ−Ａ ｅｘ８−Ｕ／Ｌのプライマー対が小麦のゲノムＤＮＡを特異的認識していることを示した。
一方、ＳＳＩＩ−Ａ ｅｘ２−Ｕ／Ｌのプライマー対では、オオムギ並びにライムギにおいて長さの異なる非特異的なＰＣＲ増幅産物が得られた。
比較対象として特許文献１記載の方法に従ってＷｔｒ０１−５’／Ｗｔｒ１０−３’プライマー対を用いたＰＣＲを実施した。
なお、本プライマー対は、小麦の主要アレルゲンタンパク質であるＴｒｉｔｉｃｉｎをコードする遺伝子に相補的にハイブリダイズするように設計されているため、「アレルギー物質を含む食品の検査法について:食発１１０６００１号（平成１４年１１月６日）」において小麦の定性ＰＣＲ法に用いるプライマー対として指定されている。
鋳型ＤＮＡは上記と同一の植物種から抽出したものを用いた。
その結果、好適に普通小麦とデュラム小麦を検出することができたが、ダイズ及びラッカセイにおいてもＰＣＲ増幅産物が得られた。
これらのＰＣＲ増幅産物の長さは約１４０ｂｐ付近であり、小麦のそれと見分けるためにはシークエンス解析が必要であると考えられた。
In order to confirm that these primer pairs specifically recognize wheat, PCR was performed using genomic DNA extracted from the seeds of wheat and other plants as a template.
The results are shown in Table 6.
In addition, the annealing temperature in PCR reaction is 56 degreeC, 67 degreeC, and 55 degreeC with respect to the primer pairs of SSII-A ex7-U / L, SSII-A ex8-U / L, SSII-A ex2-U / L, respectively. Set to.
When PCR was carried out using the SSII-A ex7-U / L and SSII-A ex8-U / L primer pairs, PCR amplification products of the desired length were obtained in normal wheat and durum wheat. , Rye, buckwheat, soybean, corn, and rice plant species could not yield PCR amplification products.
This result showed that the SSII-A ex7-U / L and SSII-A ex8-U / L primer pairs specifically recognized the genomic DNA of wheat.
On the other hand, with the SSII-A ex2-U / L primer pair, non-specific PCR amplification products having different lengths were obtained in barley and rye.
As a comparison target, PCR was performed using the Wtr01-5 ′ / Wtr10-3 ′ primer pair according to the method described in Patent Document 1.
Since this primer pair is designed to hybridize complementarily to a gene encoding Triticin, which is a major wheat allergen protein, “Regarding a method for testing foods containing allergens: No. 1106001 ( "November 6, 2002)" is designated as a primer pair used in the qualitative PCR method for wheat.
Template DNA extracted from the same plant species as above was used.
As a result, normal wheat and durum wheat were preferably detected, but PCR amplification products were also obtained in soybean and peanut.
The length of these PCR amplification products was about 140 bp, and it was considered that sequence analysis was necessary to distinguish them from that of wheat.
［実施例６］小麦検出用プライマー対を用いたＰＣＲの増幅産物のシークエンス解析
実施例５で得られた普通小麦並びにデュラム小麦のゲノムＤＮＡを鋳型としたＰＣＲ増幅産物を実施例４で述べた方法により精製し、シークエンス解析によりそれらの塩基配列を検証した。
ＳＳＩＩ−Ａ ｅｘ７−Ｕ／Ｌプライマー対の標的領域は小麦ＳＳＩＩ−Ａ，Ｂ，Ｄにおいて共通の塩基配列をなしている。
ＳＳＩＩ−Ａ ｅｘ７−Ｕ／Ｌプライマー対でのＰＣＲ増幅産物の塩基配列を検証した結果、小麦ＳＳＩＩの塩基配列と一致した。
ＳＳＩＩ−Ａ ｅｘ２−Ｕ／Ｌプライマー対の標的領域の塩基配列は小麦ＳＳＩＩ−Ａ、Ｂ、Ｄにおいて僅かに異なっている。
ＳＳＩＩ−Ａ ｅｘ２−Ｕ／ＬでのＰＣＲ増幅産物の塩基配列を検証した結果を図４及び表７に示す。
本プライマー対を用いたＰＣＲ増幅産物の塩基配列は、図４に示したとおりであり、ＳＳＩＩ−Ａ，Ｂ，Ｄで塩基の異なる部位を矢印で示した。
これらの異なる塩基部位を表７に各ＳＳＩＩをＰＣＲ増幅産物の塩基と共に示す。
各塩基部位において、ＰＣＲ増幅産物の塩基配列は小麦ＳＳＩＩ−ＡとＳＳＩＩ−Ｂのヘテロ名配列であった。
これらのことから、本プライマー対が小麦ＳＳＩＩ−ＡとＳＳＩＩ−Ｂを認識していることが示された。
また、ＳＳＩＩ−Ａ ｅｘ８−Ｕ／Ｌプライマー対の標的領域の塩基配列は、小麦ＳＳＩＩ−Ａ、Ｄにおいて一致し、ＳＳＩＩ−Ｂにおいて僅かに異なる。
上記と同様の手順でＳＳＩＩ−Ａ ｅｘ８−Ｕ／ＬでのＰＣＲ増幅産物の塩基配列を検証した。
その結果、ＳＳＩＩ−Ａ ｅｘ８−Ｕ／Ｌプライマー対が認識すると想定される小麦ＳＳＩＩ−ＡとＳＳＩＩ−Ｄとの標的領域塩基配列と一致した。
一方、ＳＳＩＩ−Ａ ｅｘ２−Ｕ／Ｌのプライマー対を用いたＰＣＲでは、オオムギとライムギにおいて非特異的なＰＣＲ産物が得られた。
これらのシークエンス解析を実施した結果、オオムギで認められた１２０ｂｐ及び１８０ｂｐの非特異的ＰＣＲ増幅産物の塩基配列は、各々六条オオムギ及び二条オオムギのＳＳＩＩのエキソン２の部分配列と一致した。
また、ライムギで認められた２００ｂｐの非特異的ＰＣＲ増幅産物の塩基配列は、ＢＬＡＳＴ検索により一致する配列を見出すことができず、未登録のライムギのＤＮＡ塩基配列であることが推測された。
これらの結果は、ＳＳＩＩ−Ａ ｅｘ７−Ｕ／ＬとＳＳＩＩ−Ａ ｅｘ８−Ｕ／Ｌのプライマー対が小麦由来のＤＮＡを特異的に認識することを示唆した。
[Example 6] Sequence analysis of PCR amplification product using primer pair for wheat detection The PCR amplification product obtained by using genomic DNA of normal wheat and durum wheat obtained in Example 5 as a template was used in the method described in Example 4 And their nucleotide sequences were verified by sequence analysis.
The target region of the SSII-A ex7-U / L primer pair has a common base sequence in wheat SSII-A, B, D.
As a result of verifying the base sequence of the PCR amplification product with the SSII-A ex7-U / L primer pair, it was found to match the base sequence of wheat SSII.
The base sequence of the target region of SSII-A ex2-U / L primer pair is slightly different in wheat SSII-A, B, D.
FIG. 4 and Table 7 show the results of verifying the base sequence of the PCR amplification product with SSII-A ex2-U / L.
The base sequence of the PCR amplification product using this primer pair is as shown in FIG. 4, and the sites with different bases in SSII-A, B, D are indicated by arrows.
These different base sites are shown in Table 7 along with the bases of the PCR amplification products for each SSII.
At each base site, the base sequence of the PCR amplification product was a heterozygous sequence of wheat SSII-A and SSII-B.
From these, it was shown that this primer pair recognizes wheat SSII-A and SSII-B.
Moreover, the base sequence of the target region of SSII-A ex8-U / L primer pair is identical in wheat SSII-A, D, and slightly different in SSII-B.
The base sequence of the PCR amplification product with SSII-A ex8-U / L was verified by the same procedure as above.
As a result, the SSII-A ex8-U / L primer pair agreed with the target region base sequences of wheat SSII-A and SSII-D.
On the other hand, in PCR using the SSII-A ex2-U / L primer pair, non-specific PCR products were obtained in barley and rye.
As a result of conducting these sequence analyses, the base sequences of the 120 bp and 180 bp non-specific PCR amplification products observed in the barley were consistent with the partial sequences of exon 2 of SSII of the 6 barley barley and 2 barley barley, respectively.
Further, the base sequence of the 200 bp non-specific PCR amplification product observed in rye could not find a matching sequence by BLAST search, and it was presumed that it was an unregistered rye DNA base sequence.
These results suggested that SSII-A ex7-U / L and SSII-A ex8-U / L primer pairs specifically recognize wheat-derived DNA.
［実施例７］普通小麦に特異的な検出用プライマー対の選択
Ｄゲノムは、デュラム小麦を除く一般的な流通小麦に普遍的に存在している。
Ｄゲノムにコードされている遺伝子を特異的に検出することを目的としてＳＳＩＩ−Ｄ検出用のプライマー対を設計した。
前述の手法により小麦ＳＳＩＩ-Ｄ遺伝子には相同性が高く、オオムギＳＳＩＩには相同性が低いプライマーを選択した。
選抜したプライマー対を表８のプライマー配列表２に示す。
[Example 7] Selection of detection primer pair specific to ordinary wheat D-genome is universally present in general circulating wheat except durum wheat.
A primer pair for SSII-D detection was designed for the purpose of specifically detecting the gene encoded in the D genome.
Primers having high homology to the wheat SSII-D gene and low homology to barley SSII were selected by the above-described method.
The selected primer pairs are shown in the primer sequence table 2 of Table 8.
これらのプライマー対が普通小麦を特異的に認識することを確認するために、小麦及びその他の植物の種子から抽出したゲノムＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを実施した。
結果を表９に示す。
なお、ＰＣＲ反応におけるアニール温度は、ＳＳＩＩ−Ｄ ｅｘ１−Ｌ／Ｒ、ＳＳＩＩ−Ｄ ｅｘ８−Ｌ／Ｒ、ＳＳＩＩ−Ｄ ｅｘ９−Ｌ／Ｒのプライマー対に対してすべて５５℃に設定した。
ＳＳＩＩ−Ｄ ｅｘ１−Ｌ／Ｒのプライマー対を用いたＰＣＲを実施したところ、普通小麦のＤＮＡを鋳型としたＰＣＲで１４４ｂｐのＰＣＲ増幅産物が得られ、オオムギ、ライムギ、ソバ、ダイズ、トウモロコシの各植物種ではＰＣＲ増幅産物は得られなかった。
ＳＳＩＩ−Ｄ ｅｘ８−Ｌ／Ｒのプライマー対では、普通小麦に加えてデュラム小麦、オオムギ、ライムギでも１１４ｂｐのＰＣＲ増幅産物が得られた。
又、ＳＳＩＩ−Ｄ ｅｘ９−Ｌ／Ｒでは普通小麦で１０３ｂｐのＰＣＲ増幅産物が得られ、トウモロコシでも非特異的な２５０ｂｐのＰＣＲ増幅産物が得られたが、これらは電気泳動的に見分けることができる。
これらの結果は、ＳＳＩＩ−Ｄ ｅｘ１−Ｌ／ＲとＳＳＩＩ−Ｄ ｅｘ９−Ｌ／Ｒのプライマー対が普通小麦を検出するために適用できることを示した。
比較対象として非特許文献１記載の方法に従ってＷｘ０１２−５’／Ｗｘ０１２−３’プライマー対を用いたＰＣＲを実施した。
なお、鋳型ＤＮＡは上記と同一の植物種から抽出したものを用いた。
その結果、好適に普通小麦を検出することができたが、デュラム小麦ではＰＣＲ増幅産物は得られなかった。
In order to confirm that these primer pairs specifically recognize normal wheat, PCR was performed using genomic DNA extracted from the seeds of wheat and other plants as a template.
The results are shown in Table 9.
The annealing temperature in the PCR reaction was set to 55 ° C. for all the primer pairs SSII-D ex1-L / R, SSII-D ex8-L / R, and SSII-D ex9-L / R.
When PCR using the SSII-D ex1-L / R primer pair was performed, a PCR amplification product of 144 bp was obtained by PCR using normal wheat DNA as a template, and each of barley, rye, buckwheat, soybean, corn No PCR amplification product was obtained for plant species.
With the SSII-D ex8-L / R primer pair, a 114 bp PCR amplification product was obtained for durum wheat, barley and rye in addition to normal wheat.
In SSII-D ex9-L / R, a 103 bp PCR amplification product was obtained in normal wheat, and a non-specific 250 bp PCR amplification product was also obtained in maize, which can be distinguished electrophoretically. .
These results indicated that SSII-D ex1-L / R and SSII-D ex9-L / R primer pairs could be applied to detect normal wheat.
As a comparison target, PCR using a Wx012-5 ′ / Wx012-3 ′ primer pair was performed according to the method described in Non-Patent Document 1.
The template DNA used was extracted from the same plant species as described above.
As a result, normal wheat was successfully detected, but no PCR amplification product was obtained with durum wheat.
［実施例８］定性的ＰＣＲによる小麦検出用プライマー対の特異性の確認
実施例５並びに実施例７で選抜した小麦特異的プライマー対の評価を実施した。
評価に際して、その対象として実施例５及び実施例７記載の試験試料と合わせて合計普通小麦２０種、デュラム小麦６種、オオムギ１４種、ライムギ１０種、オートムギ５種、ライ小麦２種、ムギ以外のイネ科植物１９種（トウモロコシ、イネ、ワイルドライス、キビ、ヒエ、アワ、ハトムギ）、タデ科植物２種（ソバ）、ヒユ科植物１種（アマランサス）、アマ科植物１種（アマニ）、マメ科植物１３種（アズキ、インゲン、ソラマメ、エンドウ、ラッカセイ、ルピナス、レンズマメ、ヒヨコマメ、ダイズ）の植物種子から抽出したゲノムＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを実施した。
結果を表１０に示す。
ＳＳＩＩ−Ａ ｅｘ７−Ｕ／Ｌ及びＳＳＩＩ−Ａ ｅｘ８−Ｕ／Ｌのプライマー対を用いたＰＣＲでは小麦、デュラム小麦並びにライ小麦において目的サイズのＰＣＲ増幅産物が得られた。
ＳＳＩＩ−Ｄ ｅｘ９−Ｌ／Ｒプライマー対に於はトウモロコシで目的のサイズとは異なる２５０ｂｐの非特異的な薄いバンドが確認された。
また、特許文献１記載のＷｔｒ０１−５’／Ｗｔｒ１０−３’プライマー対を用いたＰＣＲでは、ヒエ１種、ダイズ２種、ラッカセイ１種、飼料用エンドウマメ１種で至適サイズと同等サイズのＰＣＲ増幅産物が得られた。
小麦とライムギは極めて近縁であるため、自然条件下で交配して容易にライ小麦が作出される。
ライ小麦のゲノム構成は、交配相手の小麦のゲノム構成に強く依存し、ＡＡＢＢＤＤＲＲの８倍体とＡＡＢＢＲＲの６倍体が存在することが既に知られている。
本実施例で用いたライ小麦は、小麦Ｄゲノムに相補的なプライマー対で検出できなかったこと、並びに小麦Ａ，Ｂゲノムに相補的なプライマー対で検出できたことから、ゲノム構成ＡＡＢＢＲＲの６倍体ライ小麦であることが示唆された。
以上の結果より、普通小麦及びデュラム小麦を含む一般的な食用小麦を特異的に検出するためには、ＳＳＩＩ−Ａ ｅｘ７−Ｕ／Ｌ及びＳＳＩＩ−Ａ ｅｘ８−Ｕ／Ｌプライマー対を用いた定性的ＰＣＲ試験が好適であることが示された。
[Example 8] Confirmation of specificity of primer pair for wheat detection by qualitative PCR The wheat-specific primer pair selected in Example 5 and Example 7 was evaluated.
In the evaluation, in addition to the test samples described in Example 5 and Example 7 as a target, a total of 20 kinds of common wheat, 6 kinds of durum wheat, 14 kinds of barley, 10 kinds of rye, 5 kinds of oats, 2 kinds of rye wheat, other than wheat 19 kinds of gramineous plants (corn, rice, wild rice, millet, barnyard millet, millet, pearl barley), 2 species of teraceae (buckwheat), 1 species of cassaceae (amamaranthus), 1 species of flaxaceae (linseed), PCR was performed using as a template genomic DNA extracted from plant seeds of 13 species of leguminous plants (Azuki beans, kidney beans, broad beans, peas, groundnuts, lupines, lentils, chickpeas, and soybeans).
The results are shown in Table 10.
PCR using SSII-A ex7-U / L and SSII-A ex8-U / L primer pairs yielded PCR amplification products of the desired size in wheat, durum wheat and rye wheat.
In the SSII-D ex9-L / R primer pair, a nonspecific thin band of 250 bp different from the target size was confirmed in corn.
In addition, in the PCR using the Wtr01-5 ′ / Wtr10-3 ′ primer pair described in Patent Document 1, the size is equivalent to the optimum size for one kind of millet, two kinds of soybeans, one kind of peanut, and one kind of pea for feed. A PCR amplification product was obtained.
Wheat and rye are so closely related that they can easily be bred by mating under natural conditions.
The genome composition of rye wheat depends strongly on the genome composition of the mating wheat, and it is already known that AABBDDRR octaploid and AABBRRR hexaploid exist.
The rye wheat used in this example could not be detected with a primer pair complementary to the wheat D genome and could be detected with a primer pair complementary to the wheat A and B genomes. It was suggested that it is a polyploid rye wheat.
From the above results, qualitative analysis using SSII-A ex7-U / L and SSII-A ex8-U / L primer pairs is possible in order to specifically detect common edible wheat including normal wheat and durum wheat. PCR tests have been shown to be suitable.
［実施例９］検出限界の評価
好適に小麦を特異的に検出するＳＳＩＩ−Ａ ｅｘ７−Ｕ／Ｌ及びＳＳＩＩ−Ａ ｅｘ８−Ｕ／Ｌプライマー対を用いたＰＣＲにより小麦ＤＮＡの半定量的な検出限界を検討した。
サケ精子ＤＮＡ溶液を希釈母体として、農林６１号及びＮｏ．１ Ｃａｎａｄａ Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｒｅｄ Ｓｐｒｉｎｇ（以下１ＣＷと略す。）から抽出した小麦ゲノムＤＮＡを２０ｎｇ／μＬ，１０ｎｇ／μＬ，１ｎｇ／μＬ，０．１ｎｇ／μＬ，５０ｐｇ／μＬ，１０ｐｇ／μＬ，１ｐｇ／μＬになるように段階的に希釈した鋳型ＤＮＡ溶液を調製した。
実施例３で述べた手法に従って、この溶液２．５μＬを鋳型ＤＮＡ溶液としてＰＣＲを実施し、５．０μＬのＰＣＲ反応液を電気泳動に供した。
結果を図５−Ａ、図５−Ｂに示す。
図中、下部数字はＰＣＲの鋳型として用いた小麦ゲノムＤＮＡ濃度を、Ｍはマーカー（Ｈｉ−Ｌｏ ＤＮＡマーカー（商品名：コスモバイオ社製））を示す。
農林６１号の段階希釈ＤＮＡ溶液を鋳型とした場合の検出限界は、ＳＳＩＩ−Ａ ｅｘ７−Ｕ／Ｌ及びＳＳＩＩ−Ａ ｅｘ８−Ｕ／Ｌプライマー対において各々１０ｐｇ／μＬ及び５０ｐｇ／μＬであった（図５−Ａ）。
また、１ＣＷの段階希釈ＤＮＡ溶液を鋳型とした場合の検出限界も、ＳＳＩＩ−Ａ ｅｘ７−Ｕ／Ｌ及びＳＳＩＩ−Ａ ｅｘ８−Ｕ／Ｌプライマー対において各々１０ｐｇ／μＬ及び５０ｐｇ／μＬであった（図５−Ｂ）。
なお、特許文献１によると、開示された各プライマー対を用いた検出限界の検討から、安定した検出結果を得るためには小麦由来ゲノムＤＮＡの濃度が少なくとも１００ｐｐｍ（＝１００ｐｇ／μＬ）必要であることが報告された。
これらのことから、小麦の品種に関係なくゲノム構成がＡＡＢＢＤＤの普通小麦であれば、ＳＳＩＩ−Ａ ｅｘ７−Ｕ／ＬないしはＳＳＩＩ−Ａ ｅｘ８−Ｕ／Ｌプライマー対を用いたＰＣＲにより１０ｐｇ／μＬないしは５０ｐｇ／μＬの高感度で小麦ゲノムＤＮＡを検出することができることが明らかとなった。
[Example 9] Evaluation of detection limit Semi-quantitative detection of wheat DNA by PCR using SSII-A ex7-U / L and SSII-A ex8-U / L primer pairs that specifically detect wheat suitably. The limit was examined.
Using salmon sperm DNA solution as a dilution matrix, Norin 61 and No. Wheat genomic DNA extracted from 1 Canada Western Red Spring (hereinafter abbreviated as 1CW) becomes 20 ng / μL, 10 ng / μL, 1 ng / μL, 0.1 ng / μL, 50 pg / μL, 10 pg / μL, 1 pg / μL A template DNA solution diluted stepwise was prepared.
According to the procedure described in Example 3, PCR was performed using 2.5 μL of this solution as a template DNA solution, and 5.0 μL of the PCR reaction solution was subjected to electrophoresis.
The results are shown in FIGS. 5-A and 5-B.
In the figure, the lower numeral indicates the wheat genomic DNA concentration used as a PCR template, and M indicates a marker (Hi-Lo DNA marker (trade name: Cosmo Bio).
The detection limits when using a serially diluted DNA solution of Norin 61 as the template were 10 pg / μL and 50 pg / μL for the SSII-A ex7-U / L and SSII-A ex8-U / L primer pairs, respectively ( FIG. 5-A).
The detection limits when using a 1 CW serially diluted DNA solution as a template were 10 pg / μL and 50 pg / μL, respectively, for the SSII-A ex7-U / L and SSII-A ex8-U / L primer pairs ( FIG. 5-B).
According to Patent Document 1, the concentration of wheat-derived genomic DNA is required to be at least 100 ppm (= 100 pg / μL) in order to obtain a stable detection result from examination of the detection limit using each disclosed primer pair. It was reported.
From these facts, if the genome composition is AABBDD ordinary wheat regardless of the variety of wheat, 10 pg / μL or by PCR using SSII-A ex7-U / L or SSII-A ex8-U / L primer pair It was revealed that wheat genomic DNA can be detected with a high sensitivity of 50 pg / μL.
［実施例１０］定量的ＰＣＲによる特異性の確認
好適に小麦を特異的に検出するＳＳＩＩ−Ａ ｅｘ７−Ｕ／Ｌ及びＳＳＩＩ−Ａ ｅｘ８−Ｕ／Ｌプライマー対並びにそれらプライマー対に対応する核酸プローブが、定量的ＰＣＲにおいて目的とする塩基配列のみを特異的に検出することができるか確認した。
鋳型ＤＮＡとして、小麦（農林６１号と１ＣＷ）、デュラム小麦（Ａ．Ｃ．Ｎａｖｉｇａｔｏｒ）、オオムギ（ＡＣ Ｍｅｔｃａｌｆｅ）、オートムギ（オーストラリア産）、コメ（国産流通品）、ソバ（茨城産）の合計７種類の被検試料から抽出したＤＮＡを用いた。
この際、ブランクとして鋳型ＤＮＡを含まない滅菌水の増幅シグナルの有無により定量的ＰＣＲの妥当性を確認した。
定量的ＰＣＲには、ＴａｑＭａｎ Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（商品名：アプライドバイオシステムズ社製）を用い、次のような組成で定量用ＰＣＲ反応液を調製した。
すなわち、１２．５μＬのＴａｑＭａｎ Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（２Ｘ）、０．５μＬの２５μＭプライマー対、０．５μＬの１０μＭ核酸プローブ及び９μＬの滅菌水を十分に混合した溶液に２．５μＬの鋳型ＤＮＡ溶液を添加して全量を２５μＬとした。
小麦の鋳型ＤＮＡ溶液には、サケ精子ＤＮＡ溶液を希釈母体として小麦ゲノムＤＮＡを１０ｎｇ／μＬ，１ｎｇ／μＬ，１００ｐｇ／μＬ，５０ｐｇ／μＬ，１０ｐｇ／μＬ，１ｐｇ／μＬになるように段階的に希釈した小麦ＤＮＡ溶液を用いた。
デュラム小麦、オオムギ、ライムギ、オートムギ、コメ、ソバの場合には、サケ精子ＤＮＡ溶液で１０ｎｇ／μＬに希釈したＤＮＡ溶液を用いた。
定量的ＰＣＲに用いた核酸プローブを表１１に示す。
[Example 10] Confirmation of specificity by quantitative PCR Suitably detecting SSII-A ex7-U / L and SSII-A ex8-U / L primer pairs that specifically detect wheat, and nucleic acid probes corresponding to these primer pairs However, it was confirmed that only the target base sequence can be specifically detected in quantitative PCR.
As template DNA, wheat (Agriculture 61 and 1CW), durum wheat (AC Navigator), barley (AC Metcalfe), oats (Australia), rice (domestic distribution), buckwheat (Ibaraki) 7 DNA extracted from various types of test samples was used.
At this time, the validity of quantitative PCR was confirmed by the presence or absence of an amplification signal of sterile water containing no template DNA as a blank.
For quantitative PCR, TaqMan Universal PCR Master Mix (trade name: manufactured by Applied Biosystems) was used, and a PCR reaction solution for quantification was prepared with the following composition.
That is, 12.5 μL of TaqMan Universal PCR Master Mix (2X), 0.5 μL of 25 μM primer pair, 0.5 μL of 10 μM nucleic acid probe, and 9 μL of sterilized water were mixed thoroughly with 2.5 μL of template DNA solution. Add to a total volume of 25 μL.
The wheat template DNA solution is stepwise so that the salmon sperm DNA solution is diluted as a matrix and the wheat genomic DNA is 10 ng / μL, 1 ng / μL, 100 pg / μL, 50 pg / μL, 10 pg / μL, 1 pg / μL. A diluted wheat DNA solution was used.
In the case of durum wheat, barley, rye, oats, rice, and buckwheat, a DNA solution diluted to 10 ng / μL with a salmon sperm DNA solution was used.
Table 11 shows the nucleic acid probes used for quantitative PCR.
反応は、定量ＰＣＲ装置ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ７０００ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（商品名：アプライドバイオシステムズ社製）を用いて行った。
反応条件は、反応液を５０℃で２分間保持した後、９５℃で１０分間保持し、以後９５℃で３０秒、５５℃で１分を１サイクルとして４５サイクルの反復を行い、４５サイクル終了後は２５℃に保持した。
反応過程において各反応ウェル中の蛍光量が経時的に計測され続けるので、反応終了後に反応ウェルごとの蛍光量の経時的な変化を解析することで蛍光量の増加があったウェルを特定することができる。
標的塩基配列にハイブリダイズした核酸プローブがＤＮＡの伸張反応の過程で分解され、それに伴って蛍光標識された塩基が遊離するので、蛍光量はＰＣＲ増幅反応の進行と共に増加する。
従って、蛍光量の増加はＰＣＲ増幅反応が起こっていることを意味する。
農林６１号から抽出したＤＮＡを鋳型とした定量的ＰＣＲの結果を図６−Ａ、図６−Ｂ、図７−Ａ、図７−Ｂに示す。
ＳＳＩＩ−Ａ ｅｘ７−Ｕ／Ｌプライマー対とＳＳＩＩ−Ａ ｅｘ７−Ｔ８２プローブの組合せ（図６−Ａ）並びにＳＳＩＩ−Ａ ｅｘ８−Ｕ／Ｌプライマー対とＳＳＩＩ−Ａ ｅｘ８−Ｔ３４９プローブの組合せ（図７−Ａ）は好適に増幅シグナルが認められ、検出限界は両組合せともに１０ｐｇ／μＬであった。
それらの増幅シグナルがスレッシュホールドラインに達するサイクル数と鋳型ＤＮＡ濃度の対数とは直線関係にあり、好適な定量的ＰＣＲが進行していることを示した（図６−Ｂ、７−Ｂ）。
なお、１ＣＷから抽出したＤＮＡを鋳型とした定量的ＰＣＲでも同様の結果が得られた。
また、デュラム小麦、オオムギ、オートムギ、コメ、ソバの定量的ＰＣＲによる検出では、デュラム小麦のみで増幅シグナルが得られた（図６−Ｃ、図７−Ｃ）。
これらの結果は、前記２種の定量的ＰＣＲのプライマー対と核酸プローブの組合せが、高感度で好適に小麦を定量的に検出できることを示した。
The reaction was performed using a quantitative PCR apparatus ABI PRISM 7000 Sequence Detection System (trade name: manufactured by Applied Biosystems).
The reaction conditions were that the reaction solution was held at 50 ° C. for 2 minutes, then held at 95 ° C. for 10 minutes, and then 45 cycles were repeated for 30 seconds at 95 ° C. and 1 minute at 55 ° C., and 45 cycles were completed. Thereafter, the temperature was maintained at 25 ° C.
Since the amount of fluorescence in each reaction well continues to be measured over time during the reaction process, it is necessary to identify wells that have increased in fluorescence by analyzing changes over time in the amount of fluorescence for each reaction well after the reaction is completed. Can do.
Since the nucleic acid probe hybridized to the target base sequence is decomposed in the course of the DNA extension reaction, and the fluorescence-labeled base is released along with it, the amount of fluorescence increases with the progress of the PCR amplification reaction.
Therefore, an increase in the amount of fluorescence means that a PCR amplification reaction is occurring.
The results of quantitative PCR using DNA extracted from Norin 61 as a template are shown in FIGS. 6-A, 6-B, 7-A, and 7-B.
SSII-A ex7-U / L primer pair and SSII-A ex7-T82 probe combination (FIG. 6A) and SSII-A ex8-U / L primer pair and SSII-A ex8-T349 probe combination (FIG. 7) In -A), an amplification signal was suitably observed, and the detection limit was 10 pg / μL for both combinations.
The number of cycles at which these amplified signals reach the threshold line and the logarithm of the template DNA concentration are in a linear relationship, indicating that suitable quantitative PCR is proceeding (FIGS. 6-B, 7-B).
Similar results were obtained by quantitative PCR using DNA extracted from 1CW as a template.
In addition, in the detection of durum wheat, barley, oats, rice and buckwheat by quantitative PCR, an amplified signal was obtained only with durum wheat (FIGS. 6-C and 7-C).
These results showed that the combination of the two kinds of quantitative PCR primer pairs and the nucleic acid probe can detect wheat appropriately with high sensitivity.
［実施例１１］小麦の定性的又は定量的に検出するための試薬キット
本発明のプライマー対及び／又は核酸プローブを用いることにより、被検試料中に含まれる小麦を高感度且つ特異的に検出することが可能な試薬キットを作製することができる。
本試薬キットは、ＰＣＲを利用した検出方法であることから、プライマー対のみの混合液でもかまわないし、耐熱性ＤＮＡ合成酵素を適切に作用させるための試薬類を包含させることもできる。
そのような試薬類としては、本発明のプライマー対及び核酸プローブの他に、例えば、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌなどの緩衝液、塩化マグネシウム、塩化カリウム、デオキシヌクレオチド、耐熱性ＤＮＡ合成酵素、同酵素の安定化剤、ＰＣＲ阻害物質の捕捉剤等があげられる。
プライマー対のみを混合した小麦の定性的検出用試薬キットとして以下の（１）、（２）のキットを作製した。
（１）ＳＳＩＩ−Ａ ｅｘ７−Ｕプライマー及びＳＳＩＩ−Ａ ｅｘ７−Ｌプライマーが各々最終濃度１μＭになるようにＴＥ緩衝液に溶解させた試薬キット。
（２）ＳＳＩＩ−Ａ ｅｘ８−Ｕプライマー及びＳＳＩＩ−Ａ ｅｘ８−Ｌプライマーが各々最終濃度１μＭになるようにＴＥ緩衝液に溶解させた試薬キット。
プライマー対及び耐熱性ＤＮＡ合成酵素を適切に作用させるための試薬類を混合した小麦の定性的検出用試薬キットとして（３）、（４）の試薬キットを作製した。
（３）ＳＳＩＩ−Ａ ｅｘ７−Ｕプライマー、ＳＳＩＩ−Ａ ｅｘ７−Ｌプライマー、塩化マグネシウム、塩化カリウム、各デオキシヌクレオチド及びＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．３）が各々最終濃度０．４μＭ、０．４μＭ、３ｍＭ、１００ｍＭ、０．４ｍＭ及び２０ｍＭになるように滅菌蒸留水に溶解させた試薬キット。
（４）ＳＳＩＩ−Ａ ｅｘ８−Ｕプライマー、ＳＳＩＩ−Ａ ｅｘ８−Ｌプライマー、塩化マグネシウム、塩化カリウム、各デオキシヌクレオチド及びＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．３）が各々最終濃度０．４μＭ、０．４μＭ、３ｍＭ、１００ｍＭ、０．４ｍＭ及び２０ｍＭになるように滅菌蒸留水に溶解させた試薬キット。
プライマー対及び核酸プローブのみを混合した小麦の定量的検出用試薬キットとして（５）、（６）のキットを作製した。
（５）ＳＳＩＩ−Ａ ｅｘ７−Ｕプライマー、ＳＳＩＩ−Ａ ｅｘ７−Ｌプライマー及びＳＳＩＩ−Ａ ｅｘ７−Ｔ８２核酸プローブが各々最終濃度２．５μＭ、２．５μＭ及び１μＭになるようにＴＥ緩衝液に溶解させた試薬キット。
（６）ＳＳＩＩ−Ａ ｅｘ８−Ｕプライマー、ＳＳＩＩ−Ａ ｅｘ８−Ｌプライマー及びＳＳＩＩ−Ａ ｅｘ８−Ｔ３４９核酸プローブが各々最終濃度２．５μＭ、２．５μＭ及び１μＭになるようにＴＥ緩衝液に溶解させた試薬キット。
プライマー対、核酸プローブ及び耐熱性ＤＮＡ合成酵素を適切に作用させるための試薬類を混合した小麦の定量的検出用試薬キットとして（７）、（８）の試薬キットを作製した。
（７）ＳＳＩＩ-Ａ ｅｘ７-Ｕプライマー、ＳＳＩＩ-Ａ ｅｘ７−Ｌプライマー、ＳＳＩＩ−Ａ ｅｘ７−Ｔ８２核酸プローブ、塩化マグネシウム、塩化カリウム、各デオキシヌクレオチド及びＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．３）が各々最終濃度１μＭ、１μＭ、０．４μＭ、３ｍＭ、１００ｍＭ、０．４ｍＭ及び２０ｍＭになるように滅菌蒸留水に溶解させた試薬キット。
（８）ＳＳＩＩ−Ａ ｅｘ８−Ｕプライマー、ＳＳＩＩ−Ａ ｅｘ８−Ｌプライマー、ＳＳＩＩ−Ａ ｅｘ８−Ｔ３４９核酸プローブ、塩化マグネシウム、塩化カリウム、各デオキシヌクレオチド及びＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．３）が各々最終濃度１μＭ、１μＭ、０．４μＭ、３ｍＭ、１００ｍＭ、０．４ｍＭ及び２０ｍＭになるように滅菌蒸留水に溶解させた試薬キット。
前記試薬キットの使用例として、（１）、（２）、（５）、（６）においては、使用する耐熱性ＤＮＡ合成酵素の取り扱い説明書で推奨される反応液に１／５量の試薬キットを添加してＰＣＲ反応を実施することができる。
また、（３）、（４）、（７）、（８）については、これら試薬キット１２．５μＬに適当量の被検試料となる核酸溶液とＡｍｐｌｉＴａｑ Ｇｏｌｄ（商品名：アプライドバイオシステムズ社製）等の耐熱性ＤＮＡ合成酵素を適当量添加し、滅菌蒸留水で２５μＬにメスアップしてＰＣＲ反応を実施することができる。
[Example 11] Reagent kit for qualitative or quantitative detection of wheat By using the primer pair and / or nucleic acid probe of the present invention, wheat contained in a test sample is detected with high sensitivity and specificity. A reagent kit that can be used can be prepared.
Since this reagent kit is a detection method using PCR, it may be a mixed solution of only primer pairs, and may include reagents for causing a thermostable DNA synthase to act appropriately.
Examples of such reagents include, in addition to the primer pair and nucleic acid probe of the present invention, for example, a buffer solution such as Tris-HCl, magnesium chloride, potassium chloride, deoxynucleotide, thermostable DNA synthase, and stabilization of the enzyme. Agents, PCR-inhibiting substance capture agents, and the like.
The following kits (1) and (2) were prepared as reagent kits for qualitative detection of wheat mixed only with a primer pair.
(1) A reagent kit in which SSII-A ex7-U primer and SSII-A ex7-L primer are each dissolved in TE buffer so as to have a final concentration of 1 μM.
(2) A reagent kit in which SSII-A ex8-U primer and SSII-A ex8-L primer are each dissolved in TE buffer so as to have a final concentration of 1 μM.
Reagent kits (3) and (4) were prepared as a reagent kit for qualitative detection of wheat mixed with a primer pair and reagents for appropriately acting a thermostable DNA synthase.
(3) SSII-A ex7-U primer, SSII-A ex7-L primer, magnesium chloride, potassium chloride, each deoxynucleotide and Tris-HCl (pH 8.3) have final concentrations of 0.4 μM, 0.4 μM and 3 mM, respectively. A reagent kit dissolved in sterile distilled water to be 100 mM, 0.4 mM and 20 mM.
(4) SSII-A ex8-U primer, SSII-A ex8-L primer, magnesium chloride, potassium chloride, each deoxynucleotide and Tris-HCl (pH 8.3) have final concentrations of 0.4 μM, 0.4 μM and 3 mM, respectively. A reagent kit dissolved in sterile distilled water to be 100 mM, 0.4 mM and 20 mM.
Kits (5) and (6) were prepared as reagent kits for quantitative detection of wheat in which only a primer pair and a nucleic acid probe were mixed.
(5) SSII-A ex7-U primer, SSII-A ex7-L primer and SSII-A ex7-T82 nucleic acid probe are dissolved in TE buffer so as to have final concentrations of 2.5 μM, 2.5 μM and 1 μM, respectively. Reagent kit.
(6) SSII-A ex8-U primer, SSII-A ex8-L primer and SSII-A ex8-T349 nucleic acid probe are dissolved in TE buffer so as to have final concentrations of 2.5 μM, 2.5 μM and 1 μM, respectively. Reagent kit.
Reagent kits (7) and (8) were prepared as reagent kits for quantitative detection of wheat mixed with a primer pair, a nucleic acid probe, and reagents for appropriately acting a thermostable DNA synthase.
(7) SSII-A ex7-U primer, SSII-A ex7-L primer, SSII-A ex7-T82 nucleic acid probe, magnesium chloride, potassium chloride, each deoxynucleotide and Tris-HCl (pH 8.3) are final concentrations. A reagent kit dissolved in sterile distilled water to 1 μM, 1 μM, 0.4 μM, 3 mM, 100 mM, 0.4 mM, and 20 mM.
(8) SSII-A ex8-U primer, SSII-A ex8-L primer, SSII-A ex8-T349 nucleic acid probe, magnesium chloride, potassium chloride, each deoxynucleotide and Tris-HCl (pH 8.3) are final concentrations. A reagent kit dissolved in sterile distilled water to 1 μM, 1 μM, 0.4 μM, 3 mM, 100 mM, 0.4 mM, and 20 mM.
As an example of the use of the reagent kit, in (1), (2), (5), (6), 1/5 amount of reagent is added to the reaction solution recommended in the instruction manual for the thermostable DNA synthase used. A PCR reaction can be carried out by adding a kit.
For (3), (4), (7), and (8), an appropriate amount of nucleic acid solution and AmpliTaq Gold (trade name: manufactured by Applied Biosystems) are used in 12.5 μL of these reagent kits. A suitable amount of a thermostable DNA synthase such as the above can be added, and the volume of the solution can be made up to 25 μL with sterilized distilled water to perform the PCR reaction.
［実施例１２］加工食品からの小麦の定性的検出
小麦は、その使用量の大小に関わらず菓子類や麺類、レトルト食品など様々な加工食品の原材料として使用されている。
これらの加工品に含まれる小麦を検出することを目的として、実施例１１で作成した「小麦の定性的検出用試薬キット」の内から（３）及び（４）を用いてＰＣＲを実施した。
核酸抽出用試料には、表１２に示した加工方法の異なる各種加工食品を用いた。
これらから抽出したＤＮＡ溶液は、分光光度計により濃度を算定した後、２０ｎｇ/μＬになるようにＴＥ緩衝液で希釈し、２０ｎｇ/μＬ以下の場合にはそのまま鋳型ＤＮＡ溶液としてＰＣＲに供した。
レトルト処理した加工食品については、算定値が２０ ｎｇ／μＬ以下であったので、ＤＮＡ抽出原液をそのまま鋳型ＤＮＡ溶液としてＰＣＲに供した。
なお、陽性コントロールには１ＣＷから抽出したＤＮＡ溶液を、陰性コントロールには滅菌水を用いた。
試薬キット（３）及び試薬キット（４）を用いたＰＣＲの結果を各々図８−Ａ及び図８−Ｂ並びに表１２に示す。
カレー２（Ｌａｎｅ１２）を除く各種小麦を含有する加工食品（Ｌａｎｅ１〜Ｌａｎｅ１１）において明瞭なＰＣＲ増幅産物が得られ、それらの加工食品に小麦が含まれることが確認された。
カレー２では、電気泳動バンドの確認は困難であるが、極微量のＰＣＲ増幅産物が得られたことから小麦の含有が確認された。
これは、小麦の原材料比率が低く、更にレトルト処理が施されているために小麦ゲノムＤＮＡが細かく断片化されているために小麦の検出が困難になったことが予想される。
一方、小麦を含まない加工食品からは、ＰＣＲ増幅産物は得られなかった。
なお、特許文献１では、レトルト処理した小麦含有加工食品から小麦を検出することはできないと報告された。
これらの結果は、ＳＳＩＩ−Ａ ｅｘ７−Ｕ／Ｌ及びＳＳＩＩ-Ａ ｅｘ８−Ｕ／Ｌプライマー対を用いたＰＣＲが食品原材料のみならず各種加工食品に含まれる小麦の検出に好適であることを示したと共に、試験に用いた「小麦の定性的検出用試薬キット」が各種加工食品や食品原材料に小麦が含まれるか否かを検査するために好適であることを示した。
[Example 12] Qualitative detection of wheat from processed foods Wheat is used as a raw material for various processed foods such as confectionery, noodles, and retort foods regardless of the amount used.
For the purpose of detecting wheat contained in these processed products, PCR was performed using (3) and (4) from among the “reagent kit for qualitative detection of wheat” prepared in Example 11.
Various processed foods with different processing methods shown in Table 12 were used as samples for nucleic acid extraction.
The DNA solution extracted from these was calculated with a spectrophotometer and then diluted with TE buffer so as to be 20 ng / μL. When the concentration was 20 ng / μL or less, it was directly subjected to PCR as a template DNA solution.
Since the calculated value of the retorted processed food was 20 ng / μL or less, the DNA extraction stock solution was directly subjected to PCR as a template DNA solution.
A DNA solution extracted from 1 CW was used as a positive control, and sterilized water was used as a negative control.
The results of PCR using the reagent kit (3) and the reagent kit (4) are shown in FIGS. 8-A and 8-B and Table 12, respectively.
A clear PCR amplification product was obtained in processed foods (Lane 1 to Lane 11) containing various wheats except for curry 2 (Lane 12), and it was confirmed that these processed foods contained wheat.
In curry 2, it was difficult to confirm the electrophoresis band, but the presence of wheat was confirmed because a very small amount of PCR amplification product was obtained.
This is because the wheat raw material ratio is low and the wheat genome DNA is fragmented finely due to the retort treatment, making it difficult to detect wheat.
On the other hand, no PCR amplification product was obtained from the processed food containing no wheat.
In Patent Document 1, it was reported that wheat could not be detected from the processed food containing wheat that had been retorted.
These results indicate that PCR using SSII-A ex7-U / L and SSII-A ex8-U / L primer pairs is suitable for detecting wheat contained in various processed foods as well as food ingredients. In addition, it was shown that the “reagent kit for qualitative detection of wheat” used in the test is suitable for examining whether various processed foods and food ingredients contain wheat.
配列番号１ ： ＰＣＲ用プライマー
配列番号２ ： ＰＣＲ用プライマー
配列番号３ ： ＰＣＲ用プライマー
配列番号４ ： ＰＣＲ用プライマー
配列番号５ ： ＰＣＲ用プライマー
配列番号６ ： ＰＣＲ用プライマー
配列番号７ ： ＰＣＲ用プライマー
配列番号８ ： ＰＣＲ用プライマー
配列番号９ ： ＰＣＲ用プライマー
配列番号１０ ： ＰＣＲ用プライマー
配列番号１１ ： ＰＣＲ用プライマー
配列番号１２ ： ＰＣＲ用プライマー
配列番号１７ ： ＰＣＲ用核酸プローブ 修飾: １-FAM-a, 25-a-TAMRA
配列番号１８ ： ＰＣＲ用核酸プローブ 修飾: １-FAM-a, 23-a-TAMRA
配列番号１９ ： ＰＣＲ用プライマー
配列番号２０ ： ＰＣＲ用プライマー
配列番号２１ ： ＰＣＲ用プライマー
配列番号２２ ： ＰＣＲ用プライマー
SEQ ID NO: 1 PCR primer SEQ ID NO: 2 PCR primer SEQ ID NO: 3 PCR primer SEQ ID NO: 4 PCR primer SEQ ID NO: 5 PCR primer SEQ ID NO: 6 PCR primer SEQ ID NO: 7 PCR primer sequence Number 8: PCR primer sequence number 9: PCR primer sequence number 10: PCR primer sequence number 11: PCR primer sequence number 12: PCR primer sequence number 17: PCR nucleic acid probe Modification: 1-FAM-a, 25-a-TAMRA
SEQ ID NO: 18: PCR nucleic acid probe Modification: 1-FAM-a, 23-a-TAMRA
SEQ ID NO: 19: PCR primer SEQ ID NO: 20: PCR primer SEQ ID NO: 21: PCR primer SEQ ID NO: 22: PCR primer
Claims (8)
（Ａ）配列番号３に示す塩基配列で構成されるプライマーと配列番号４に示す塩基配列で構成されるプライマーからなるプライマー対。
（Ｂ）配列番号５に示す塩基配列で構成されるプライマーと配列番号６に示す塩基配列で構成されるプライマーからなるプライマー対。 The primer pair of the following (A) or (B) which hybridizes complementarily with the base sequence designed based on the base sequence of Starch Synthase II, which is a gene encoded in the genomic DNA of wheat For detecting wheat by qualitatively and / or quantitatively detecting the presence of wheat with the presence of a PCR amplification product in a region sandwiched between primer pairs of the base sequence as an index by performing PCR (polymerase chain reaction) using .
( A) A primer pair comprising a primer composed of the base sequence shown in SEQ ID NO: 3 and a primer composed of the base sequence shown in SEQ ID NO: 4.
(B) A primer pair consisting of a primer composed of the base sequence shown in SEQ ID NO: 5 and a primer composed of the base sequence shown in SEQ ID NO: 6.
（Ａ）配列番号３に示す塩基配列で構成されるプライマーと配列番号４に示す塩基配列で構成されるプライマーからなるプライマー対。
（Ｂ）配列番号５に示す塩基配列で構成されるプライマーと配列番号６に示す塩基配列で構成されるプライマーからなるプライマー対。 When the nucleic acid probe is a primer pair of the following (A), the nucleic acid probe is composed of the base sequence shown in SEQ ID NO: 17, and when the nucleic acid probe is the primer pair of (B) below, it is composed of the base sequence shown in SEQ ID NO: 18. The method for detecting wheat according to claim 2 or 3, wherein the method is a nucleic acid probe.
( A) A primer pair comprising a primer composed of the base sequence shown in SEQ ID NO: 3 and a primer composed of the base sequence shown in SEQ ID NO: 4.
(B) A primer pair consisting of a primer composed of the base sequence shown in SEQ ID NO: 5 and a primer composed of the base sequence shown in SEQ ID NO: 6.
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