【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、生理活性物質を固定化するための磁性複合粒子およびその製造方法に関し、さらに詳しくは、診断薬担体、細菌分離担体、核酸分離精製担体、タンパク質精製担体、固定化酵素担体、抗体固定化担体などに使用するうえで有用な磁性複合粒子およびその製造方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
従来から、生理活性物質を基材上に共有結合により固定化する方法として、シッフ塩基法が知られている。この方法は、たとえば、生理活性物質や基材に対して親和性のある官能基を有するカップリング剤を使用することにより、基材上に生理活性物質を固定化するという方法である。
【０００３】
生理活性物質を固定化する材料として、特開平５−３４４８８５号公報に開示のように、シラノール誘導体からなるものが公知である。生理活性物質を固定化するには、この固定化材料をシランカップリング剤により基材に導入したのち、活性化し、生理活性物質を接触させて固定化する。この固定化材料は、鎖長を変えることで任意の生理活性物質を基材に固定化できるが、分解されやすい結合を有しており、固定化材料自身の安定性が悪いという問題がある。
【０００４】
また、生理活性物質として、酵素、抗体、補酵素などの機能を持つタンパク質、糖タンパク質、糖類などが挙げられるが、その中でも、酵素を固定化するための担体が知られている。たとえば、特開平５−２１９９５２号公報には、酵素に対して親和性のある官能基と疎水性の官能基を有するカップリング剤を結合した酵素固定化用無機質または有機質担体が開示されている。
また、特開平９−２５７号公報には、特殊な官能基を持つシランカップリング剤で処理した無機担体が開示されており、これに酵素を固定化し、洗浄、乾燥したのち、脂肪酸を含浸させて固定化酵素担体を得ている。
【０００５】
さらに、生理活性物質を固定化するための担体として、基材に磁性粒子を用いたものも公知である（特許文献１参照）。このものは、平均粒径１〜１０μｍの樹脂粒子に平均粒径０．３〜１μｍの磁性粒子を固定し、これにシランカップリング剤により生理活性物質を固定化するものである。
しかしながら、この担体では、磁性粒子表面の一部は樹脂粒子との結合点となるため、シランカップリング剤と結合できる点は限定される。したがって、この担体に多量の生理活性物質を固定化するのは困難となる。
【０００６】
【特許文献１】
特開平７−６３７６１号公報（第２〜３頁）
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、このような事情に照らして、生理活性物質を高収率で固定化できる材料を提供することを目的とする。また、生理活性物質を固定化するのに安定な構造を有する材料を提供することを別の目的とする。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記の目的を達成するために、鋭意検討した結果、基材として強磁性酸化鉄粒子を使用しこれにシリカおよびシランカップリング剤を結合させた複合磁性粒子によると、生理活性物質を高収率で固定化でき、しかも安定性の高い固定化材料となることを知り、本発明をなすに至った。
本発明の磁性複合粒子は、強磁性酸化鉄粒子を基材としてその上にシリカ層を形成し、さらにこのシリカ層にシランカップリング剤を結合させたものである。このシランカップリング剤に含まれる官能基を介して、直接または他の官能基を結合させたのちに、各種の生理活性物質を結合させることができる。
【０００９】
シランカップリング剤は、生理活性物質に対して親和性のある官能基として、アミノ基、エポキシ基、メルカプト基、カルボキシル基、ヒドロキシル基、ビニル基、アクリル基またはメタクリル基を有しているのが好ましい。
これらのシランカップリング剤により、表面にシリカ層を形成した強磁性酸化鉄粒子を処理すると、シリカとシランカップリング剤のシラノール基と磁性粒子表面のシリカとの間に化学結合が形成され、上記官能基をこの官能基が磁性粒子の外側に向くように導入させることができる。
シランカップリング剤の量は、強磁性酸化鉄粒子に対して、０．０１〜２０重量％の範囲とするのが好ましい。シランカップリング剤の量が、この範囲より少ないと、固定化できる生理活性物質の量が減少する傾向にある。一方、上記範囲より多いと、シランカップリング剤が粒子表面に均一に結合しにくくなるため、生理活性物質の固定化効率が逆に劣る傾向にある。
【００１０】
本発明者らは、生理活性物質を固定化するための磁性担体の構造について、広範囲に検討してきた。シランカップリング剤は、無機物質となんらかの形で相互作用をなすため、強磁性酸化鉄粒子に直接シランカップリング剤を結合させることも可能である。しかしながら、磁性粒子に直接結合させた場合には、その結合量が少ないか、または結合力が弱いという問題がある。
【００１１】
本発明者らは、シランカップリング剤は無機材料の中でも、とくにシリカと強い結合を形成することに注目し、シリカ層を介してシランカップリング剤を結合させることを着想した。このように強磁性酸化鉄粒子にシリカ層を形成し、このシリカ層にシランカップリング剤を結合させた磁性複合粒子が、生理活性物質を固定化するための材料として最適であることを見い出した。
すなわち、強磁性酸化鉄粒子を基材としその上にシリカ層を形成することで、多量のシランカップリング剤を結合させることができ、これにより生理活性物質に対して親和性のある官能基を多量に導入できることがわかった。また、シリカとシランカップリング剤は強固に結合するため、本発明の磁性粒子は安定性の高い生理活性物質固定化用材料となりうるものである。
【００１２】
シランカップリング剤を結合させるためのシリカの量は、強磁性酸化鉄粒子に対して、０．５〜５０重量％の範囲とするのが好ましい。シリカの量が上記より少ないと、シランカップリング剤の結合量が減少し、固定化できる生理活性物質の量も減少する傾向にある。また、上記より多いと、シリカが粒子表面以外の部分に析出しやすくなるため、シランカップリング剤を粒子表面に均一に結合させるのが難しく、生理活性物質の固定化量向上の効果が少なくなる。
【００１３】
また、本発明の磁性複合粒子は、強磁性酸化鉄粒子から構成されているため、この磁性粒子に生理活性物質を固定化したのちに、磁石などを用いて容易に捕集することができるという特徴を有している。
強磁性酸化鉄粒子としては、マグネタイト（Ｆｅ３ Ｏ４ ）粒子、マグヘマイト（γ−Ｆｅ２ Ｏ３ ）粒子、マグネタイト−マグヘマイト中間酸化鉄、マンガン亜鉛フェライト（ＭｎＺｎＦｅ２ Ｏ４ ）粒子が、好ましく用いられる。これらの中でも、マグネタイト粒子は、飽和磁化量が大きいため、磁石などで捕集する際の磁界感度が良好なため、最適である。これら強磁性酸化鉄粒子の粒子サイズは、とくに限定されるものではないが、０．０１〜０．５μｍの範囲にあるものは、溶液中での分散性が良好であり、好適である。
【００１４】
シリカとシランカップリング剤を結合したのちの磁性複合粒子の粒子サイズとしては、平均粒子サイズが０．０１〜１０μｍであるが最適であり、平均粒子サイズが０．０２〜８μｍであるのがとくに好ましい。
平均粒子サイズが上記範囲より小さいと、比表面積が大きくなるため、生理活性物質の固定化量は向上するが、磁界による捕集性が低くなる傾向にある。また、平均粒子サイズが上記範囲より大きくなると、粒子の比表面積が小さくなるため、生理活性物質の固定化効率が低くなる傾向にある。
【００１５】
生理活性物質を固定化した磁性粒子は、磁石などにより捕集されるが、この捕集性は磁性粒子の飽和磁化量に依存し、飽和磁化量が大きいほど捕集性は向上する。シリカの量が強磁性酸化鉄粒子に対して０．５〜５０重量％の範囲であり、またシランカップリング剤の量が強磁性酸化鉄粒子に対して０．０１〜２０重量％の範囲であれば、飽和磁化量が低下しても、実質的に磁石による捕集性に対してはほとんど影響がないことがわかった。
シリカの量やシランカップリング剤の量が、上記範囲より少ないと、生理活性物質の固定化効率が低くなり、上記範囲より多いと、磁性粒子の飽和磁化量が小さくなるため、磁石による捕集性が低下する傾向にある。
【００１６】
つぎに、磁性複合粒子の保磁力であるが、一般に保磁力が大きくなると磁性粒子間の凝集力が大きくなり、分散性が低下する。その結果、生理活性物質と結合すべき活性点が減少し、生理活性物質の固定化効率が低下する傾向にある。
本発明の磁性複合粒子においては、個々の強磁性酸化鉄粒子に対してシリカおよびシランカップリング剤が被着形成されているため、磁性粒子の保磁力としては、強磁性酸化鉄粒子の保磁力によりほぼ決まる。
【００１７】
本発明者らは、生理活性物質の固定化特性に影響を与えない最適の保磁力の範囲について検討した結果、０．８０〜１５．９２ｋＡ／ｍ（１０〜２００エルステッド）の範囲であれば、実用上問題がないことを見い出した。
保磁力が１５．９２ｋＡ／ｍより大きいと、磁性複合粒子の分散性が低下するが、１５．９２ｋＡ／ｍ以下の保磁力であれば、実用上問題ないことがわかった。保磁力が低い分にはとくに問題とならないが、０．８０ｋＡ／ｍより低くするには、強磁性酸化鉄粒子の粒子サイズを大きくするなど、強磁性酸化鉄粒子を本発明の目的に適さない形状や構造にする必要があり、好ましくない。
【００１８】
つぎに、磁性複合粒子の飽和磁化は、強磁性酸化鉄粒子の飽和磁化と被着形成するシリカおよびシランカップリング剤の量により決まり、２０〜８０Ａ・ｍ２ ／ｋｇ（２０〜８０ｅｍｕ／ｇ）の範囲が最適である。
飽和磁化が２０Ａ・ｍ２ ／ｋｇより小さいと、磁石による捕集性が低下する傾向にある。また、８０Ａ・ｍ２ ／ｋｇより大きくするためには、シリカおよびシランカップリング剤の量を少なくする必要があり、生理活性物質の固定化効率が低下する傾向にある。
【００１９】
強磁性酸化鉄粒子は、針状、板状、球状、粒状、楕円状、立方形状などの各種の形状のものを使用できるが、粒子形状は、生理活性物質の固定化量を左右し、球状ないし粒状のものが分散性が最も良好であり、好ましい。
ここで、「球状」とは、アスペクト比（あらゆる方向で測定した場合の最大長さと最小長さとの比）が１．０〜１．２の範囲内である形状を指し、「楕円状」とは、アスペクト比が１．２〜１．５の範囲内である形状を指している。また、「粒状」とは、球状のように粒子の長さが全方向で揃っているものや、楕円状のように一方向の長さのみ大きいもの以外に、方向による長さの差異はあるが、全体として形状にとくに異方性がない粒子を指している。
【００２０】
【発明の実施の形態】
本発明の磁性複合粒子は、既述のとおり、強磁性酸化鉄粒子とシリカおよびシランカップリング剤とから構成されている。とくに強磁性酸化鉄粒子の表面近傍にシリカ層を被着形成し、これにシランカップリング剤を結合することにより、生理活性物質を効率よく固定化することが可能となる。
【００２１】
磁性複合粒子の形状としては、球状ないし粒状が好ましく、平均粒子サイズは０．０１〜１０μｍの範囲が好ましい。また、保磁力は０．８０〜１５．９２ｋＡ／ｍ（１０〜２００エルステッド）の範囲、飽和磁化は２０〜８０Ａ・ｍ２ ／ｋｇ（２０〜８０ｅｍｕ／ｇ）の範囲が好ましい。
【００２２】
強磁性酸化鉄粒子としては、とくに限定されるものではないが、マグネタイト（Ｆｅ３ Ｏ４ ）粒子、マグヘマイト（γ−Ｆｅ２ Ｏ３ ）粒子、マグネタイト−マグヘマイト中間酸化鉄、マンガン亜鉛フェライト（ＭｎＺｎＦｅ２ Ｏ４ ）粒子が好ましい。これらの中でも、マグネタイト粒子は飽和磁化量が大きいため、磁石などで捕集する際の磁界感度が良好なため、とくに好ましい。
【００２３】
つぎに、強磁性酸化鉄粒子としてマグネタイト粒子を用い、この粒子近傍にシリカ層を設け、このシリカ層にシランカップリング剤を結合した磁性複合粒子を例にとり、本発明の磁性複合粒子の製造方法を説明する。
【００２４】
＜マグネタイト粒子の合成＞
マグネタイト粒子は、鉄塩の水溶液中の酸化反応を用いた、以下の方法により合成することができる。
まず、硫酸第一鉄（ＦｅＳＯ４ ・６Ｈ２ Ｏ）を溶解した２価のＦｅイオン水溶液にＮａＯＨ水溶液を滴下し、水酸化第一鉄〔Ｆｅ（ＯＨ）２ 〕を析出させる。この水酸化第一鉄の懸濁液のｐＨを９〜１０に調整したのち、空気を吹き込んで酸化することにより、マグネタイト粒子を成長させる。ｐＨが上記範囲よりも小さいと、マグネタイトの析出が遅くなる。上記範囲よりも大きいと、ゲーサイト（α−ＦｅＯＯＨ）が生成しやすくなる。
【００２５】
空気吹き込み速度と、懸濁液の保持温度は、マグネタイト粒子の粒子サイズに大きく影響する。空気吹き込み速度は１００〜４００リットル／時間に、懸濁液の保持温度は５０〜９０℃に調整するのがよい。空気吹き込み速度が大きいと、マグネタイトの結晶成長が速くなり、粒子サイズは小さくなる。また、空気吹き込み速度が小さすぎるか、あるいは大きすぎると、マグネタイト以外の物質が混在析出しやすくなる。さらに、保持温度が高くなるほど、マグネタイトが結晶成長しやすくなり、粒子サイズが大きくなる。一方、保持温度が低すぎると、ゲーサイト（α−ＦｅＯＯＨ）粒子が生成しやすくなる。
このような方法により、平均粒子サイズが０．０１〜０．５μｍのマグネタイト粒子を合成することができる。平均粒子サイズは、走査型電子顕微鏡写真上で３００個の粒子のサイズを測定し、その平均値から求められる。
【００２６】
＜シリカの被着処理＞
つぎに、シリカの被着処理方法について、説明する。
上記の方法で合成したマグネタイト粒子を純水で十分水洗したのち、乾燥させることなく、水に対するマグネタイト粒子の量が１〜１０重量％になるように、マグネタイト粒子を水に分散させて懸濁液を得る。
水に対するマグネタイト粒子の量は、シリカを個々のマグネタイト粒子の表面近傍に被着形成するときの均一性に影響し、上記範囲内のときに最も均一にシリカが被着形成される。水に対するマグネタイト粒子の量が１重量％未満となると、濃度が希薄すぎて、シリカがマグネタイト粒子の表面以外の場所で析出しやすくなる。また、水に対するマグネタイト粒子の量が１０重量％を超えると、濃度が高すぎて、マグネタイト粒子が凝集しやすくなり、個々のマグネタイト粒子の表面近傍に均一にシリカを被着形成することが困難になる。
【００２７】
つぎに、この懸濁液に、ＳｉＯ２ に換算して、強磁性酸化鉄粒子に対し、０．５〜５０重量％になるように、ケイ酸ナトリウム（水ガラス）を添加する。この添加量が０．５重量％より少ないと、マグネタイト粒子の表面近傍に被着形成されるシリカの量が不十分になるため、シランカップリング剤の結合量が少なくなり、磁性粒子表面の生理活性物質と結合すべき活性点が少なくなって、生理活性物質の固定化効率が低下する。また、上記の添加量が５０重量％より多いと、シリカが個々のマグネタイト粒子の表面以外の部分に析出しやすくなるため、シランカップリング剤を粒子表面に均一に結合させることが困難となり、また磁性担体としての飽和磁化量が減少し、磁界による捕集性が低下する。
【００２８】
このようにケイ酸ナトリウムを添加した懸濁液に、撹拌しながら、希塩酸などの酸を添加して中性付近まで中和処理することにより、マグネタイト粒子の表面近傍にシリカを被着形成する。その際、珪酸ナトリウムは、水に対し、ＳｉＯ２ に換算して、０．５〜２重量％となるように調整されているのが好ましい。これは、珪酸ナトリウム水溶液から上記中和反応によりシリカを析出させると、液の粘度が高くなってくるためである。この液の粘度が高すぎると、個々のマグネタイト粒子の表面近傍にシリカを均一に被着形成するのが困難になり、一方、液の粘度が低すぎると、シリカが析出しにくくなる。
【００２９】
したがって、マグネタイト粒子に対し、ＳｉＯ２ に換算して、０．５〜５０重量％になるように珪酸ナトリウムを加えるが、このときの水に対する珪酸ナトリウムの量が、ＳｉＯ２ に換算して、０．５〜２重量％になるように調整し、かつ水に対するマグネタイト粒子の量が１〜１０重量％になるように、マグネタイト粒子、珪酸ナトリウムおよび水の量を調整するのが好ましい。
このようにして合成される粒子は、純水で十分水洗したのち、ろ過し、空気中で、たとえば６０℃で４時間程度乾燥させる。
【００３０】
＜シランカップリング剤の結合＞
つぎに、シランカップリング剤の結合によるマグネタイト粒子表面への官能基の導入の方法について、説明する。
上記の方法でシリカ被着処理したマグネタイト粒子を、水に対して１〜４０重量％になるように水中に分散し、この分散液にシランカップリング剤溶液を加える。このシランカップリング剤溶液は、そのままでもよいし、水やアルコール、メチルエチルケトン、トルエン、ベンゼン、ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシドまたはこれらの混合溶媒などで希釈して使用してもよい。
【００３１】
シランカップリング剤としては、生理活性物質に対して親和性のある官能基として、アミノ基、エポキシ基、メルカプト基、カルボキシル基、ヒドロキシル基、ビニル基、アクリル基、メタクリル基を有するものを使用できる。
これらの官能基を有するシランカップリング剤には、Ｎ−２（アミノエチル）３−アミノプロピルトリメトキシシラン、Ｎ−２（アミノエチル）３−アミノプロピルトリエトキシシラン、３−グリシドキシプロピルトリメトキシシラン、３−グリシドキシプロピルメチルジメトキシシラン、３−メルカプトプロピルトリメトキシシラン、ビニルトリエトキシシランなどが挙げられる。
【００３２】
シランカップリング剤の量は、強磁性酸化鉄粒子に対し、０．０１〜２０重量％の範囲とするのが好ましい。この量が上記範囲より少ないと、固定化できる生理活性物質の量が減少し、多すぎると、シランカップリング剤が粒子表面に均一に結合しにくくなり、生理活性物質の固定化効率が逆に劣る傾向にある。
シランカップリング剤の処理時間は、１〜４時間程度が好ましい。処理時間が短すぎると、シランカップリング剤のシリカへの結合が不十分になる。処理時間が長すぎると、反応時に生成するアルコールなどが悪影響を及ぼすためか、シリカ表面のシランカップリング剤に未反応のアルコキシ基が残存するため、好ましくない。この反応混合物を水洗して、ろ過、乾燥する。
上記の方法により、マグネタイト粒子の表面に形成したシリカ層にシランカップリング剤を結合させることができ、これによりシランカップリング剤の官能基をマグネタイト粒子の表面に導入することができる。
【００３３】
このような方法により、保磁力と飽和磁化がそれぞれ０．８０〜１５．９２ｋＡ／ｍ（１０〜２００エルステッド）と２０〜８０Ａ・ｍ２ ／ｋｇ（２０〜８０ｅｍｕ／ｇ）の範囲にある、個々のマグネタイト粒子の表面近傍にマグネタイト粒子に対し０．５〜５０重量％のシリカと０．０１〜２０重量％のシランカップリング剤が被着形成された、平均粒子サイズが０．０１〜１０μｍの球状ないし粒状である、生理活性物質を高収率で固定化できる磁性複合粒子が得られる。
【００３４】
なお、保磁力および飽和磁化は、振動試料型磁力計（東英工業社製）を用いて測定される値である。飽和磁化は、７９７ｋＡ／ｍ（１０キロエルステッド）の磁界を印加したときの磁化量から求められる。保磁力は、７９７ｋＡ／ｍの磁界を印加して磁化したのち、磁界をゼロに戻し、さらに磁界を逆方向に徐々に増加させて行ったときの、磁化量がゼロになる印加磁界の値から求められる。
【００３５】
本発明の磁性複合粒子およびその製造方法について、その特徴を箇条書きにすると、下記（１）〜（６）のとおりである。
（１）強磁性酸化鉄粒子とシリカおよびシランカップリング剤とから構成されている磁性複合粒子であって、
（２）この磁性複合粒子に含まれるシリカとシランカップリング剤の量は、強磁性酸化鉄粒子に対し、それぞれ０．５〜５０重量％と０．０１〜２０重量％の範囲にあるのが好ましく、
（３）強磁性酸化鉄粒子は、マグネタイト粒子であるのが好ましく、
（４）この磁性複合粒子は、球状ないし粒状の形状を有し、平均粒子サイズが０．０１〜１０μｍの範囲にあるのが好ましく、
（５）この磁性複合粒子の保磁力と飽和磁化が、それぞれ、０．８０〜１５．９２ｋＡ／ｍ（１０〜２００エルステッド）と２０〜８０Ａ・ｍ２ ／ｋｇ（２０〜８０ｅｍｕ／ｇ）の範囲にあるのが好ましい。
（６）また、この磁性複合粒子の製造方法として、強磁性酸化鉄粒子を分散させた水懸濁液中に所定量の珪酸ナトリウムを加えて溶解したのち、酸を加えて中和することにより、個々の強磁性酸化鉄粒子の表面近傍にシリカを被着形成し、このシリカ層にさらにシランカップリング剤を結合させて、粒子表面に官能基を導入するのが好ましい。
【００３６】
【実施例】
以下に、本発明の実施例を記載して、より具体的に説明する。ただし、本発明はこれらの実施例にのみ限定されるものではない。
【００３７】
実施例１
＜マグネタイト粒子の合成＞
１００ｇの硫酸第一鉄（ＦｅＳＯ４ ・７Ｈ２ Ｏ）を１，０００ｃｃの純水に溶解した。この硫酸第一鉄と等倍モルになるように、２８．８ｇの水酸化ナトリウムを５００ｃｃの純水に溶解した。つぎに、硫酸第一鉄水溶液を攪拌しながら、１時間かけて水酸化ナトリウム水溶液を滴下し、水酸化第一鉄の沈殿物を生成させた。滴下終了後、攪拌しながら、水酸化第一鉄の沈殿物を含む懸濁液の温度を７５℃まで昇温した。懸濁液の温度が７５℃に達したのち、２５０リットル／時間の速度で、エアーポンプを使用して空気を吹き込みながら、８時間酸化して、マグネタイト粒子を生成させた。このマグネタイト粒子はほぼ球形であり、平均粒子サイズは約０．２３μｍであった。
なお、マグネタイト粒子の粒子サイズは、透過型電子顕微鏡写真上、約３００個の粒子サイズを測定し、その平均粒子サイズから求めた。
【００３８】
＜シリカの被着処理＞
上記のマグネタイト粒子の分散液を、純水を用いて十分に水洗したのち、乾燥させることなく、マグネタイトと純水の重量がそれぞれ１０ｇと２００ｇになるように調整した。水洗後の分散液中のマグネタイトの含有量は、一部採取して乾燥させて求めた。この分散液に２ｇの珪酸ナトリウムを溶解した。
上記の珪酸ナトリウムは、溶解状態ではアルカリ性であるが、中和して中性付近になるとシリカとして析出する。そこで、この珪酸ナトリウム溶解マグネタイト粒子分散液に、攪拌しながら、約１時間かけて、希塩酸を滴下して中性付近まで中和した。滴下終了後、さらに１時間、攪拌を継続した。これにより、個々のマグネタイト粒子の表面近傍にシリカが被着形成された。
なお、この反応において、水に対する珪酸ナトリウムの量とマグネタイト粒子の量は重要であり、珪酸ナトリウムの量が、水に対してＳｉＯ２ に換算して０．５〜２重量％の範囲であるのが、珪酸ナトリウム水溶液から中和反応によりシリカを析出させるときの液の粘度が最適になり、個々のマグネタイト粒子の表面近傍にシリカを均一に被着形成することでできる。また、水に対するマグネタイト粒子の量が１〜１０重量％の範囲とするのが、マグネタイト粒子の表面近傍に優先的にシリカを被着形成する上で最適である。
つぎに、攪拌を停止して、自然沈降させた。上澄み液を除去し、水洗したのち、ろ過し、６０℃で４時間乾燥した。
【００３９】
＜シランカップリング剤の結合処理＞
つぎに、上記のシリカを被着したマグネタイト粒子１０ｇを、純水２５ｇ中に分散した。この分散液を撹拌しながら、末端にアミノ基を有するＮ−２（アミノエチル）３−アミノプロピルトリメトキシシラン０．２ｇを添加した。添加後、さらに３時間撹拌した。水洗したのち、ろ過し、１１０℃で４時間乾燥することにより、磁性複合粒子を製造した。
【００４０】
このようにして得られた磁性複合粒子は、平均粒子サイズが０．３０μｍの球状ないし粒状であり、保磁力が４．７８ｋＡ／ｍ（６０エルステッド）で、飽和磁化が６７．９Ａ・ｍ２ ／ｋｇ（６７．９ｅｍｕ／ｇ）であった。また、シリカの量は、マグネタイトに粒子に対して２２．２重量％で、シランカップリング剤の量は、マグネタイト粒子に対して１．８８重量％であった。
【００４１】
実施例２
シリカの被着処理工程において、珪酸ナトリウムの添加量を２ｇから４ｇに変更した以外は、実施例１と同様にシリカを被着形成し、その後のシランカップリング剤の結合処理も、実施例１と同様に行い、マグネタイト粒子の表面近傍にシリカおよびシランカップリング剤を被着形成した磁性複合粒子を製造した。
この磁性複合粒子は、平均粒子サイズが０．３３μｍの球状ないし粒状であり、保磁力が５．９７ｋＡ／ｍ（７５エルステッド）で、飽和磁化が５９．３Ａ・ｍ２ ／ｋｇ（５９．３ｅｍｕ／ｇ）であった。また、シリカの量は、マグネタイト粒子に対して３８．９重量％で、シランカップリング剤の量は、マグネタイト粒子に対して１．９１重量％であった。
【００４２】
実施例３
シランカップリング剤の結合処理工程において、末端にアミノ基を有するＮ−２（アミノエチル）３−アミノプロピルトリメトキシシランに代えて、末端にエポキシ基を有する３−グリシドキシプロピルトリメトキシシランを使用した以外は、実施例１と同様に結合処理を行い、マグネタイト粒子の表面近傍にシリカおよびシランカップリング剤を被着形成した磁性複合粒子を製造した。
この磁性複合粒子は、平均粒子サイズが０．３１μｍの球状ないし粒状であり、保磁力が５．１８ｋＡ／ｍ（６５エルステッド）で、飽和磁化が６８．３Ａ・ｍ２ ／ｋｇ（６８．３ｅｍｕ／ｇ）であった。また、シリカの量は、マグネタイトに粒子に対して２０．８重量％で、シランカップリング剤の量は、マグネタイト粒子に対して１．７６重量％であった。
【００４３】
比較例１
シリカの被着処理を行わず、マグネタイト粒子に直接シランカップリング剤の結合処理を施した以外は、実施例１と同様に行い、マグネタイト粒子にシランカップリング剤を結合させた磁性複合粒子を製造した。
この磁性複合粒子は、平均粒子サイズが０．２８μｍの球状ないし粒状であり、保磁力が５．７４ｋＡ／ｍ（７２エルステッド）で、飽和磁化が７９．５Ａ・ｍ２ ／ｋｇ（７９．５ｅｍｕ／ｇ）であった。また、シランカップリング剤の量は、マグネタイト粒子に対して０．４２重量％であった。
【００４４】
上記の実施例１〜３および比較例１で得た各磁性複合粒子について、平均粒子サイズ、マグネタイト粒子に対するシリカの割合（ＳｉＯ２ ／Ｆｅ３ Ｏ４ ）、マグネタイト粒子に対するシランカップリング剤の結合割合（シランカップリング剤／Ｆｅ３ Ｏ４ ）、保磁力および飽和磁化を、表１にまとめて示した。
【００４５】
表１
【００４６】
上記表１の結果から、マグネタイト粒子にシリカ層を形成したのち、シランカップリング剤の結合処理を施した実施例１〜３の磁性複合粒子は、マグネタイト粒子に直接シランカップリング剤の結合処理を施した比較例１の磁性複合粒子に比べて、シランカップリング剤の結合量が向上しており、生理活性物質に対して親和性のある官能基を多量に導入できることがわかる。これは、シリカとシランカップリング剤との間の強い相互作用によるものと考えられる。
【００４７】
つぎに、これらの磁性複合粒子を用いて、酵素の固定化試験を行った。
まず、磁性複合粒子の一定量を水に分散し、この分散液に酵素として一定量のペルオキシダーゼを添加、撹拌し、磁性複合粒子にペルオキシダーゼを固定化した。固定化した酵素の量および活性を測定する方法として、ＴＯＯＳ−４−ＡＡ系の発色反応を使用した。この発色反応は、ペルオキシダーゼにより触媒される過酸化水素の還元によって生成した酸素と、ＴＯＯＳ〔Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３−メチルアニリン〕および４−ＡＡ（４−アミノアンチピリン）の反応により、波長５４６ｎｍに吸収を有する色素が生成することを利用したものであり、当業者間で公知の方法である。
【００４８】
すなわち、まず、０．９重量％の過酸化水素を含有する水溶液０．１ｍｌに、反応液〔５０ｍＭ・トリス塩酸バッファー（ｐＨ７．５）、０．６ｍＭ・ＴＯＯＳ、０．５ｍＭ・４−ＡＡ〕を３ｍｌ添加して攪拌し、測定液を調製した。つぎに、この測定液にペルオキシダーゼ固定化磁性粒子を１００ｍｇ添加し、３７℃で加温した。この溶液について、吸光度計により磁性粒子の添加直後から５分間の吸光度（ＯＤ：５４６ｎｍ）を３０秒間隔で測定して、上記試料中の過酸化水素の改質により生成した色素を定量した。その結果、実施例１〜３の磁性複合粒子は、比較例１の磁性複合粒子に比べて、多量の酵素が固定化されており、またこの固定化された酵素は高い活性を示すものであることがわかった。
【００４９】
【発明の効果】
以上のように、本発明は、強磁性酸化鉄粒子を基材とし、これにシリカ層とシランカップリング剤を結合させた磁性複合粒子を提供するものであり、とくに、強磁性酸化鉄粒子に対し、シリカを０．５〜５０重量％の範囲に、シランカップリング剤を０．０１〜２０重量％の範囲に、それぞれ設定し、また平均粒子サイズを０．０１〜１０μｍの範囲に、さらに保磁力と飽和磁化をそれぞれ０．８０〜１５．９２ｋＡ／ｍ（１０〜２００エルステッド）と２０〜８０Ａ・ｍ２ ／ｋｇ（２０〜８０ｅｍｕ／ｇ）の範囲に設定することにより、生理活性物質を効率良く固定化できるという格別の効果が奏される。また、このように固定化した酵素は高い活性を示すという効果も奏されるものである。[0001]
TECHNICAL FIELD OF THE INVENTION
The present invention relates to a magnetic composite particle for immobilizing a physiologically active substance and a method for producing the same, and more particularly, a diagnostic agent carrier, a bacterial separation carrier, a nucleic acid separation and purification carrier, a protein purification carrier, an immobilized enzyme carrier, and an antibody immobilization. TECHNICAL FIELD The present invention relates to a magnetic composite particle useful for use as an immobilized carrier and a method for producing the same.
[0002]
[Prior art]
Conventionally, the Schiff base method has been known as a method for immobilizing a physiologically active substance on a substrate by covalent bonding. In this method, for example, a physiologically active substance is immobilized on a substrate by using a coupling agent having a functional group having an affinity for the substrate or the physiologically active substance.
[0003]
As a material for immobilizing a physiologically active substance, a material comprising a silanol derivative is known as disclosed in JP-A-5-344885. In order to immobilize a physiologically active substance, the immobilization material is introduced into a substrate with a silane coupling agent, activated, and then immobilized by contacting the physiologically active substance. This immobilization material can immobilize any physiologically active substance on the substrate by changing the chain length, but has a problem that the immobilization material itself has poor stability because it has a bond that is easily decomposed.
[0004]
Examples of the physiologically active substance include proteins, glycoproteins, and saccharides having functions such as enzymes, antibodies, and coenzymes. Among them, carriers for immobilizing enzymes are known. For example, JP-A-5-219952 discloses an inorganic or organic carrier for immobilizing an enzyme, in which a coupling agent having a functional group having an affinity for an enzyme and a coupling agent having a hydrophobic functional group are bonded.
JP-A-9-257 discloses an inorganic carrier treated with a silane coupling agent having a special functional group. The enzyme is immobilized on the inorganic carrier, washed, dried, and then impregnated with a fatty acid. To obtain an immobilized enzyme carrier.
[0005]
Further, as a carrier for immobilizing a physiologically active substance, a carrier using magnetic particles as a base material is also known (see Patent Document 1). In this method, magnetic particles having an average particle size of 0.3 to 1 μm are fixed to resin particles having an average particle size of 1 to 10 μm, and a physiologically active substance is immobilized on the magnetic particles by a silane coupling agent.
However, in this carrier, since a part of the surface of the magnetic particles becomes a bonding point with the resin particles, the point that can be bonded to the silane coupling agent is limited. Therefore, it is difficult to immobilize a large amount of a physiologically active substance on this carrier.
[0006]
[Patent Document 1]
JP-A-7-63761 (pages 2-3)
[0007]
[Problems to be solved by the invention]
An object of the present invention is to provide a material capable of immobilizing a physiologically active substance in a high yield in view of such circumstances. Another object is to provide a material having a stable structure for immobilizing a physiologically active substance.
[0008]
[Means for Solving the Problems]
The present inventors have conducted intensive studies to achieve the above object, and as a result, according to the composite magnetic particles using ferromagnetic iron oxide particles as a base material and binding silica and a silane coupling agent thereto, The present inventors have found that an active substance can be immobilized in a high yield and that the immobilization material has high stability.
The magnetic composite particles of the present invention are obtained by forming a silica layer on a ferromagnetic iron oxide particle as a base material and further bonding a silane coupling agent to the silica layer. Various physiologically active substances can be bound directly or after binding another functional group via the functional group contained in the silane coupling agent.
[0009]
The silane coupling agent has an amino group, an epoxy group, a mercapto group, a carboxyl group, a hydroxyl group, a vinyl group, an acrylic group or a methacryl group as a functional group having an affinity for a physiologically active substance. preferable.
When the ferromagnetic iron oxide particles having a silica layer formed on the surface thereof are treated with these silane coupling agents, a chemical bond is formed between the silica, the silanol group of the silane coupling agent, and the silica on the surface of the magnetic particles. A functional group can be introduced such that the functional group points outside the magnetic particles.
The amount of the silane coupling agent is preferably in the range of 0.01 to 20% by weight based on the ferromagnetic iron oxide particles. If the amount of the silane coupling agent is less than this range, the amount of the immobilizable physiologically active substance tends to decrease. On the other hand, when the amount is larger than the above range, the silane coupling agent is difficult to be uniformly bonded to the particle surface, so that the efficiency of immobilizing the physiologically active substance tends to be inferior.
[0010]
The present inventors have extensively studied the structure of a magnetic carrier for immobilizing a physiologically active substance. Since the silane coupling agent interacts with the inorganic substance in some way, the silane coupling agent can be directly bonded to the ferromagnetic iron oxide particles. However, when directly bonded to the magnetic particles, there is a problem that the amount of the bonding is small or the bonding force is weak.
[0011]
The present inventors have noticed that a silane coupling agent forms a strong bond with silica, particularly among inorganic materials, and have conceived of binding the silane coupling agent via a silica layer. As described above, it has been found that magnetic composite particles in which a silica layer is formed on ferromagnetic iron oxide particles and a silane coupling agent is bonded to the silica layer are optimal as a material for immobilizing a physiologically active substance. .
That is, by forming a silica layer on a ferromagnetic iron oxide particle as a base material, a large amount of a silane coupling agent can be bound, thereby forming a functional group having an affinity for a physiologically active substance. It was found that a large amount could be introduced. In addition, since the silica and the silane coupling agent are strongly bonded, the magnetic particles of the present invention can be a highly stable material for immobilizing a physiologically active substance.
[0012]
The amount of silica for binding the silane coupling agent is preferably in the range of 0.5 to 50% by weight based on the ferromagnetic iron oxide particles. If the amount of silica is smaller than the above, the amount of the silane coupling agent bound decreases, and the amount of the immobilizable physiologically active substance tends to decrease. In addition, when the amount is larger than the above, silica is easily precipitated on a portion other than the particle surface, so that it is difficult to uniformly bond the silane coupling agent to the particle surface, and the effect of improving the amount of immobilized physiologically active substance is reduced. .
[0013]
In addition, since the magnetic composite particles of the present invention are composed of ferromagnetic iron oxide particles, they can be easily collected using a magnet or the like after immobilizing a physiologically active substance on the magnetic particles. Has features.
As the ferromagnetic iron oxide particles, magnetite (Fe 3 O 4 ) Particles, maghemite (γ-Fe 2 O 3 ) Particles, magnetite-maghemite intermediate iron oxide, manganese zinc ferrite (MnZnFe) 2 O 4 ) Particles are preferably used. Among these, magnetite particles are optimal because of their large saturation magnetization and good magnetic field sensitivity when collected by a magnet or the like. Although the particle size of these ferromagnetic iron oxide particles is not particularly limited, those having a particle size in the range of 0.01 to 0.5 μm are preferable because of good dispersibility in a solution.
[0014]
As the particle size of the magnetic composite particles after bonding the silica and the silane coupling agent, the average particle size is preferably from 0.01 to 10 μm, and most preferably, the average particle size is from 0.02 to 8 μm. preferable.
When the average particle size is smaller than the above range, the specific surface area increases, so that the amount of the immobilized physiologically active substance is improved, but the trapping property by the magnetic field tends to be low. On the other hand, when the average particle size is larger than the above range, the specific surface area of the particles becomes small, and the efficiency of immobilizing the physiologically active substance tends to be low.
[0015]
The magnetic particles on which the physiologically active substance is immobilized are collected by a magnet or the like, and the collecting property depends on the saturation magnetization of the magnetic particles. The larger the saturation magnetization, the higher the collecting property. When the amount of silica is in the range of 0.5 to 50% by weight based on the ferromagnetic iron oxide particles, and the amount of the silane coupling agent is in the range of 0.01 to 20% by weight based on the ferromagnetic iron oxide particles. If so, it was found that even if the saturation magnetization was reduced, there was substantially no effect on the trapping ability by the magnet.
When the amount of silica or the amount of the silane coupling agent is less than the above range, the immobilization efficiency of the physiologically active substance is reduced, and when the amount is more than the above range, the saturation magnetization of the magnetic particles becomes small, so that the collection by the magnet is performed. Properties tend to decrease.
[0016]
Next, regarding the coercive force of the magnetic composite particles, generally, as the coercive force increases, the cohesive force between the magnetic particles increases, and the dispersibility decreases. As a result, the number of active sites to be bound to the physiologically active substance decreases, and the efficiency of immobilizing the physiologically active substance tends to decrease.
In the magnetic composite particles of the present invention, since the silica and the silane coupling agent are applied to the individual ferromagnetic iron oxide particles, the coercive force of the ferromagnetic iron oxide particles is Is almost determined by
[0017]
The present inventors have studied the optimum coercive force range that does not affect the immobilization characteristics of the physiologically active substance. As a result, if the range is 0.80 to 15.92 kA / m (10 to 200 Oersted), We found that there was no problem in practical use.
When the coercive force is larger than 15.92 kA / m, the dispersibility of the magnetic composite particles is reduced, but it is found that there is no practical problem if the coercive force is 15.92 kA / m or less. Although there is no particular problem for the low coercive force, ferromagnetic iron oxide particles are not suitable for the purpose of the present invention, such as increasing the particle size of the ferromagnetic iron oxide particles below 0.80 kA / m. It is necessary to have a shape and a structure, which is not preferable.
[0018]
Next, the saturation magnetization of the magnetic composite particles is determined by the saturation magnetization of the ferromagnetic iron oxide particles and the amounts of the silica and the silane coupling agent to be formed. 2 / Kg (20-80 emu / g) is optimal.
Saturation magnetization is 20 Am 2 If it is smaller than / kg, the trapping property by the magnet tends to decrease. Also, 80 Am 2 In order to make it larger than / kg, it is necessary to reduce the amount of the silica and the silane coupling agent, and the efficiency of immobilizing the physiologically active substance tends to decrease.
[0019]
As the ferromagnetic iron oxide particles, various shapes such as needles, plates, spheres, granules, ellipses, and cubes can be used, but the shape of the particles determines the amount of the physiologically active substance immobilized and is spherical. Granular materials are preferred because they have the best dispersibility.
Here, the term “spherical” refers to a shape having an aspect ratio (ratio of the maximum length to the minimum length when measured in all directions) in the range of 1.0 to 1.2, and “oval”. Indicates a shape having an aspect ratio in the range of 1.2 to 1.5. In addition, the term “granular” refers to a particle having a uniform length in all directions, such as a spherical shape, or a particle having a length in only one direction, such as an elliptical shape, and a difference in length depending on the direction. However, it refers to particles having no particular anisotropy in shape as a whole.
[0020]
BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION
As described above, the magnetic composite particles of the present invention are composed of ferromagnetic iron oxide particles, silica and a silane coupling agent. In particular, by forming a silica layer in the vicinity of the surface of the ferromagnetic iron oxide particles and bonding a silane coupling agent to the silica layer, it becomes possible to immobilize the physiologically active substance efficiently.
[0021]
The shape of the magnetic composite particles is preferably spherical or granular, and the average particle size is preferably in the range of 0.01 to 10 μm. The coercive force is in the range of 0.80 to 15.92 kA / m (10 to 200 Oe), and the saturation magnetization is 20 to 80 A · m. 2 / Kg (20-80 emu / g) is preferred.
[0022]
The ferromagnetic iron oxide particles include, but are not limited to, magnetite (Fe 3 O 4 ) Particles, maghemite (γ-Fe 2 O 3 ) Particles, magnetite-maghemite intermediate iron oxide, manganese zinc ferrite (MnZnFe) 2 O 4 ) Particles are preferred. Among these, magnetite particles are particularly preferable because of their large saturation magnetization and good magnetic field sensitivity when collected by a magnet or the like.
[0023]
Next, magnetite particles are used as ferromagnetic iron oxide particles, a silica layer is provided in the vicinity of the particles, and a magnetic composite particle in which a silane coupling agent is bonded to the silica layer is taken as an example. Will be described.
[0024]
<Synthesis of magnetite particles>
The magnetite particles can be synthesized by the following method using an oxidation reaction of an iron salt in an aqueous solution.
First, ferrous sulfate (FeSO 4 ・ 6H 2 O) was added dropwise to a divalent aqueous Fe ion solution in which O) was dissolved, and ferrous hydroxide [Fe (OH) 2 ] Is precipitated. After adjusting the pH of the suspension of ferrous hydroxide to 9 to 10, air is blown to oxidize the magnetite particles to grow them. If the pH is lower than the above range, the precipitation of magnetite will be slow. When it is larger than the above range, goethite (α-FeOOH) is easily generated.
[0025]
The air blowing speed and the suspension holding temperature greatly affect the particle size of the magnetite particles. The air blowing speed is preferably adjusted to 100 to 400 liters / hour, and the suspension holding temperature is preferably adjusted to 50 to 90 ° C. If the air blowing speed is high, the crystal growth of magnetite becomes faster and the particle size becomes smaller. On the other hand, if the air blowing speed is too low or too high, substances other than magnetite are likely to coexist. Furthermore, the higher the holding temperature, the easier the magnetite crystal grows and the larger the particle size. On the other hand, when the holding temperature is too low, it becomes easy to generate goethite (α-FeOOH) particles.
According to such a method, magnetite particles having an average particle size of 0.01 to 0.5 μm can be synthesized. The average particle size is determined by measuring the size of 300 particles on a scanning electron micrograph and obtaining the average value.
[0026]
<Silica deposition>
Next, a method of applying silica will be described.
After the magnetite particles synthesized by the above method are sufficiently washed with pure water, the magnetite particles are dispersed in water so that the amount of the magnetite particles is 1 to 10% by weight with respect to water without drying. Get.
The amount of magnetite particles relative to water affects the uniformity of the silica when it is deposited near the surface of each magnetite particle, and silica is most uniformly deposited when it is within the above range. If the amount of the magnetite particles with respect to water is less than 1% by weight, the concentration is too low, and the silica tends to precipitate at a place other than the surface of the magnetite particles. On the other hand, when the amount of the magnetite particles with respect to water exceeds 10% by weight, the concentration is too high, and the magnetite particles are likely to aggregate, making it difficult to uniformly apply silica to the vicinity of the surface of each magnetite particle. Become.
[0027]
Next, SiO 2 was added to this suspension. 2 Sodium silicate (water glass) is added so as to be 0.5 to 50% by weight based on the ferromagnetic iron oxide particles. If the addition amount is less than 0.5% by weight, the amount of silica deposited near the surface of the magnetite particles becomes insufficient, so that the amount of the silane coupling agent bonded becomes small, and the surface of the magnetic particles is physiologically affected. The number of active sites to be bound to the active substance decreases, and the efficiency of immobilizing the physiologically active substance decreases. On the other hand, if the amount is more than 50% by weight, silica tends to precipitate on portions other than the surfaces of the individual magnetite particles, making it difficult to uniformly bond the silane coupling agent to the particle surfaces. The amount of saturation magnetization as a magnetic carrier decreases, and the trapping property by a magnetic field decreases.
[0028]
An acid such as dilute hydrochloric acid is added to the suspension to which sodium silicate is added while stirring to neutralize the suspension to near neutrality, thereby forming silica on the surface of the magnetite particles. At this time, the sodium silicate is converted into SiO 2 with respect to water. 2 It is preferably adjusted to be 0.5 to 2% by weight in terms of This is because when silica is precipitated from the aqueous sodium silicate solution by the above neutralization reaction, the viscosity of the liquid increases. If the viscosity of the liquid is too high, it is difficult to uniformly apply silica to the vicinity of the surface of each magnetite particle, and if the viscosity of the liquid is too low, it becomes difficult to deposit silica.
[0029]
Therefore, for magnetite particles, SiO 2 2 Sodium silicate is added so as to be 0.5 to 50% by weight, and the amount of sodium silicate with respect to water at this time is SiO 2 And the amounts of magnetite particles, sodium silicate and water are adjusted so that the amount of magnetite particles with respect to water is 1 to 10% by weight. Is preferred.
The particles synthesized in this manner are sufficiently washed with pure water, filtered, and dried in air at, for example, 60 ° C. for about 4 hours.
[0030]
<Binding of silane coupling agent>
Next, a method for introducing a functional group to the surface of magnetite particles by bonding a silane coupling agent will be described.
The magnetite particles coated with silica by the above method are dispersed in water so as to be 1 to 40% by weight based on the water, and a silane coupling agent solution is added to the dispersion. This silane coupling agent solution may be used as it is, or may be used after being diluted with water, alcohol, methyl ethyl ketone, toluene, benzene, dimethylformamide, dimethyl sulfoxide or a mixed solvent thereof.
[0031]
As the silane coupling agent, those having an amino group, an epoxy group, a mercapto group, a carboxyl group, a hydroxyl group, a vinyl group, an acrylic group, or a methacryl group as a functional group having an affinity for a physiologically active substance can be used. .
The silane coupling agents having these functional groups include N-2 (aminoethyl) 3-aminopropyltrimethoxysilane, N-2 (aminoethyl) 3-aminopropyltriethoxysilane, and 3-glycidoxypropyltrisilane. Examples include methoxysilane, 3-glycidoxypropylmethyldimethoxysilane, 3-mercaptopropyltrimethoxysilane, vinyltriethoxysilane, and the like.
[0032]
The amount of the silane coupling agent is preferably in the range of 0.01 to 20% by weight based on the ferromagnetic iron oxide particles. When the amount is less than the above range, the amount of the physiologically active substance that can be immobilized decreases, and when the amount is too large, the silane coupling agent is hardly uniformly bonded to the particle surface, and the immobilization efficiency of the physiologically active substance is adversely affected. It tends to be inferior.
The treatment time of the silane coupling agent is preferably about 1 to 4 hours. If the treatment time is too short, the binding of the silane coupling agent to the silica will be insufficient. If the treatment time is too long, unreacted alkoxy groups remain in the silane coupling agent on the silica surface, possibly due to an adverse effect of alcohol or the like generated during the reaction, which is not preferable. The reaction mixture is washed with water, filtered and dried.
By the above method, the silane coupling agent can be bonded to the silica layer formed on the surface of the magnetite particles, whereby the functional group of the silane coupling agent can be introduced to the surface of the magnetite particles.
[0033]
By such a method, the coercive force and the saturation magnetization are 0.80 to 15.92 kA / m (10 to 200 Oe) and 20 to 80 A · m, respectively. 2 / Kg (20 to 80 emu / g), the surface of each magnetite particle is coated with 0.5 to 50% by weight of silica and 0.01 to 20% by weight of a silane coupling agent with respect to the magnetite particle. Magnetic composite particles which are formed and have a spherical or granular average particle size of 0.01 to 10 μm and which can immobilize a physiologically active substance in a high yield can be obtained.
[0034]
The coercive force and the saturation magnetization are values measured using a vibrating sample magnetometer (manufactured by Toei Kogyo Co., Ltd.). The saturation magnetization is obtained from the magnetization amount when a magnetic field of 797 kA / m (10 kOe) is applied. The coercive force is determined by applying a magnetic field of 797 kA / m, magnetizing the magnetic field, returning the magnetic field to zero, and gradually increasing the magnetic field in the opposite direction. Desired.
[0035]
The features of the magnetic composite particles of the present invention and the method for producing the same are summarized in the following items (1) to (6).
(1) Magnetic composite particles composed of ferromagnetic iron oxide particles, silica and a silane coupling agent,
(2) The amounts of silica and silane coupling agent contained in the magnetic composite particles are in the range of 0.5 to 50% by weight and 0.01 to 20% by weight, respectively, based on the ferromagnetic iron oxide particles. Preferably,
(3) The ferromagnetic iron oxide particles are preferably magnetite particles,
(4) The magnetic composite particles have a spherical or granular shape, and preferably have an average particle size in the range of 0.01 to 10 μm,
(5) The coercive force and saturation magnetization of the magnetic composite particles are 0.80 to 15.92 kA / m (10 to 200 Oe) and 20 to 80 Amm, respectively. 2 / Kg (20-80 emu / g).
(6) As a method for producing the magnetic composite particles, a predetermined amount of sodium silicate is added to and dissolved in an aqueous suspension in which ferromagnetic iron oxide particles are dispersed, and then neutralized by adding an acid. It is preferable that silica is deposited on the surface of each ferromagnetic iron oxide particle in the vicinity of the surface, and a silane coupling agent is further bonded to the silica layer to introduce a functional group onto the particle surface.
[0036]
【Example】
Hereinafter, examples of the present invention will be described in more detail. However, the present invention is not limited only to these examples.
[0037]
Example 1
<Synthesis of magnetite particles>
100 g of ferrous sulfate (FeSO 4 ・ 7H 2 O) was dissolved in 1,000 cc of pure water. 28.8 g of sodium hydroxide was dissolved in 500 cc of pure water so as to be equimolar to the ferrous sulfate. Next, an aqueous solution of sodium hydroxide was added dropwise over 1 hour while stirring the aqueous solution of ferrous sulfate to produce a precipitate of ferrous hydroxide. After the completion of the dropwise addition, the temperature of the suspension containing the precipitate of ferrous hydroxide was increased to 75 ° C. while stirring. After the temperature of the suspension reached 75 ° C., it was oxidized for 8 hours while blowing air using an air pump at a rate of 250 liters / hour to produce magnetite particles. The magnetite particles were substantially spherical and had an average particle size of about 0.23 μm.
The particle size of the magnetite particles was determined from the average particle size by measuring about 300 particle sizes on a transmission electron micrograph.
[0038]
<Silica deposition>
The dispersion of the magnetite particles was sufficiently washed with pure water, and then adjusted without drying so that the weights of the magnetite and pure water were 10 g and 200 g, respectively. The content of magnetite in the dispersion after washing with water was determined by partially collecting and drying. 2 g of sodium silicate was dissolved in this dispersion.
The above sodium silicate is alkaline in a dissolved state, but precipitates as silica when neutralized to near neutrality. Then, dilute hydrochloric acid was added dropwise to the sodium silicate-dissolved magnetite particle dispersion over a period of about 1 hour with stirring to neutralize the dispersion to near neutrality. After the completion of the dropwise addition, stirring was continued for another hour. As a result, silica was deposited near the surface of each magnetite particle.
In this reaction, the amount of sodium silicate and the amount of magnetite particles relative to water are important, and the amount of sodium silicate is 2 In the range of 0.5 to 2% by weight, the viscosity of the liquid when the silica is precipitated by the neutralization reaction from the aqueous solution of sodium silicate is optimized, and the silica is deposited near the surface of each magnetite particle. It can be formed by uniform deposition. It is most preferable that the amount of the magnetite particles with respect to water is in the range of 1 to 10% by weight in order to preferentially deposit silica on the vicinity of the surface of the magnetite particles.
Next, the stirring was stopped and the mixture was allowed to settle naturally. The supernatant was removed, washed with water, filtered, and dried at 60 ° C. for 4 hours.
[0039]
<Binding treatment of silane coupling agent>
Next, 10 g of the magnetite particles coated with the above silica were dispersed in 25 g of pure water. While stirring the dispersion, 0.2 g of N-2 (aminoethyl) 3-aminopropyltrimethoxysilane having an amino group at a terminal was added. After the addition, the mixture was further stirred for 3 hours. After washing with water, the mixture was filtered and dried at 110 ° C. for 4 hours to produce magnetic composite particles.
[0040]
The magnetic composite particles thus obtained are spherical or granular with an average particle size of 0.30 μm, have a coercive force of 4.78 kA / m (60 Oersteds), and have a saturation magnetization of 67.9 A · m. 2 / Kg (67.9 emu / g). The amount of silica was 22.2% by weight based on the magnetite particles, and the amount of the silane coupling agent was 1.88% by weight based on the magnetite particles.
[0041]
Example 2
In the silica coating process, silica was formed in the same manner as in Example 1 except that the amount of sodium silicate added was changed from 2 g to 4 g, and the subsequent bonding process of the silane coupling agent was performed in Example 1. In the same manner as described above, magnetic composite particles in which silica and a silane coupling agent were adhered and formed near the surface of the magnetite particles were produced.
The magnetic composite particles are spherical or granular with an average particle size of 0.33 μm, have a coercive force of 5.97 kA / m (75 Oersted), and have a saturation magnetization of 59.3 A · m. 2 / Kg (59.3 emu / g). The amount of silica was 38.9% by weight based on the magnetite particles, and the amount of the silane coupling agent was 1.91% by weight based on the magnetite particles.
[0042]
Example 3
In the binding treatment step of the silane coupling agent, 3-glycidoxypropyltrimethoxysilane having an epoxy group at the end is replaced with N-2 (aminoethyl) 3-aminopropyltrimethoxysilane having an amino group at the end. Except for using the same, a binding treatment was performed in the same manner as in Example 1 to produce magnetic composite particles in which silica and a silane coupling agent were formed in the vicinity of the surface of the magnetite particles.
The magnetic composite particles are spherical or granular with an average particle size of 0.31 μm, have a coercive force of 5.18 kA / m (65 Oersteds), and have a saturation magnetization of 68.3 A · m. 2 / Kg (68.3 emu / g). The amount of silica was 20.8% by weight based on the magnetite particles, and the amount of the silane coupling agent was 1.76% by weight based on the magnetite particles.
[0043]
Comparative Example 1
Manufacture of magnetic composite particles in which the silane coupling agent was bonded to the magnetite particles was performed in the same manner as in Example 1 except that the magnetite particles were directly bonded to the magnetite particles without performing the silica deposition process. did.
The magnetic composite particles are spherical or granular with an average particle size of 0.28 μm, have a coercive force of 5.74 kA / m (72 Oersteds), and have a saturation magnetization of 79.5 A · m. 2 / Kg (79.5 emu / g). The amount of the silane coupling agent was 0.42% by weight based on the magnetite particles.
[0044]
For each of the magnetic composite particles obtained in Examples 1 to 3 and Comparative Example 1, the average particle size and the ratio of silica to magnetite particles (SiO 2 2 / Fe 3 O 4 ), Binding ratio of silane coupling agent to magnetite particles (silane coupling agent / Fe 3 O 4 ), Coercive force and saturation magnetization are summarized in Table 1.
[0045]
Table 1
[0046]
From the results in Table 1 above, the magnetic composite particles of Examples 1 to 3 in which the silica layer was formed on the magnetite particles and then subjected to the binding treatment of the silane coupling agent were subjected to the binding treatment of the silane coupling agent directly to the magnetite particles. Compared with the magnetic composite particles of Comparative Example 1, the amount of binding of the silane coupling agent was improved, indicating that a large amount of a functional group having an affinity for a physiologically active substance could be introduced. This is believed to be due to the strong interaction between the silica and the silane coupling agent.
[0047]
Next, an enzyme immobilization test was performed using these magnetic composite particles.
First, a fixed amount of the magnetic composite particles was dispersed in water, a certain amount of peroxidase was added as an enzyme to the dispersion, and the mixture was stirred to immobilize peroxidase on the magnetic composite particles. As a method for measuring the amount and activity of the immobilized enzyme, a TOOS-4-AA color reaction was used. This color-forming reaction is carried out by using oxygen generated by peroxidase-catalyzed reduction of hydrogen peroxide, TOOS [N-ethyl-N- (2-hydroxy-3-sulfopropyl) -3-methylaniline] and 4-AA ( This is a method known to those skilled in the art, utilizing the generation of a dye having an absorption at a wavelength of 546 nm by the reaction of 4-aminoantipyrine).
[0048]
That is, first, a reaction solution [50 mM Tris-HCl buffer (pH 7.5), 0.6 mM TOOS, 0.5 mM 4-AA] is added to 0.1 ml of an aqueous solution containing 0.9% by weight of hydrogen peroxide. Was added and stirred to prepare a measurement solution. Next, 100 mg of peroxidase-immobilized magnetic particles were added to this measurement solution, and heated at 37 ° C. With respect to this solution, the absorbance (OD: 546 nm) for 5 minutes immediately after the addition of the magnetic particles was measured at an interval of 30 seconds using an absorbance meter, and the dye formed by reforming the hydrogen peroxide in the sample was quantified. As a result, in the magnetic composite particles of Examples 1 to 3, a larger amount of the enzyme was immobilized than in the magnetic composite particle of Comparative Example 1, and the immobilized enzyme exhibited high activity. I understand.
[0049]
【The invention's effect】
As described above, the present invention provides a magnetic composite particle in which a ferromagnetic iron oxide particle is used as a base material, and a silica layer and a silane coupling agent are bonded to the ferromagnetic iron oxide particle. On the other hand, the silica is set in the range of 0.5 to 50% by weight, the silane coupling agent is set in the range of 0.01 to 20% by weight, and the average particle size is set in the range of 0.01 to 10 μm. The coercive force and the saturation magnetization are respectively 0.80 to 15.92 kA / m (10 to 200 Oe) and 20 to 80 Am 2 / Kg (20-80 emu / g), a special effect that the bioactive substance can be immobilized efficiently can be obtained. In addition, the enzyme immobilized in such a manner has an effect of exhibiting high activity.
