【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、植物あるいはその部分にアルカリ液と、サイクロデキストリン、シクロアミロース、デキストリン、可溶性澱粉あるいは澱粉を加え、アルカリ域で糖転移酵素を用いて糖転移反応させて、生成した糖転移化合物を分離精製することで、植物から直接可溶性のフラボノイド類を製造する方法に関する。
【０００２】
【従来技術および発明が解決しようとする課題】従来からビタミンＰとして知られているヘスペリジンおよびルチンなどのフラボノイド類は、血管透過性の増大を抑制するという薬理的作用を有することから、抗高血圧剤、出血性疾患予防剤等として利用されている。また、大部分のフラボノイド類は、紫外線の吸収作用を有すること、およびラジカルスカベンジャー作用を有することから、これらフラボノイド類は化粧品および食品等に機能性添加物として利用することが期待される。
【０００３】フラボノイド類は、現在、約３，０００種類が知られており、特に柑橘類中に多量に存在することから、原料を容易に、かつ安価に入手し得るにも係わらず、その利用が非常に限られてくる。それはフラボノイド類の大部分は水に僅かに溶解するかまたは全く溶解しないことによる。
【０００４】これらを解決する方法として、特開昭４８−４４２６０号、特開平３−７５９３号あるいは特開平１１−３４６７９２号に、フラボノイド類から糖転移酵素を用いて可溶性のフラボノイド配糖体を調製する方法が示してある。しかしこれらの方法では、植物からフラボノイド類を精製する必要があり、また精製フラボノイド類も上市されているが、これらは元から高額であるゆえに配糖体の製造コストも当然高くなる。
【０００５】またミカン搾汁粕からフラボノイド類であるヘスペリジンを製造する方法については日食工誌，３７，６３１−６３６（１９９０）および日食工誌，４０，８３３−８４０（１９９３）で報告されている。前者の方法は比較的単純でｐＨ調整、遠心分離、乾燥工程のみであるが、収率が２５％程度と低い。一方、後者では収率こそ７０％と向上しているが、加熱処理、酵素処理、ｐＨ調整、遠心分離、乾燥工程と複雑な処理を必要としている。次に配糖体を得るには、この難溶性のヘスペリジンを再度溶解する必要があり、その後、糖転移反応にて生成することとなり、二段階の複雑な工程で調製しなければならない。
【０００６】このように植物を原料にして直接フラボノイド配糖体を効率的に製造する方法はない。
【０００７】
【課題を解決するための手段】本発明の可溶性フラボノイド配糖体の製造方法は、植物から直接にフラボノイド配糖体を製造する方法であって、植物に含まれるフラボノイド類をｐＨ８以上のアルカリ液と、サイクロデキストリン、デキストリン、可溶性澱粉あるいは澱粉を加えて、可溶化する工程、およびアルカリ域にて糖転移酵素で糖転移させる工程を包含しており、そのことによって上記目的が達成される。
【０００８】フラボノイド類とは、二つのフェニル基がピラン環あるいは、それに近い構造の三つの炭素原子を介して結合している物質群の総称である。
【０００９】本発明で使用し得る植物はどのようなものでもよいが、特に果実類が好ましく、ミカン、オレンジ、レモン、グレープフルーツなどの柑橘類や、リンゴ、ブドウ、モモ、ナシ、パインアップル、バナナ、メロン、イチゴといった果物類などがよい。また、本発明で使用し得る植物、特に果実類においては、果実全体だけでなく、皮、すじ、種子、果汁、果肉、さのう、果汁の絞りカスなどの部分を使用してもよい。さらにこれらの乾燥品を使用してもよい。
【００１０】植物に含まれ、本発明で配糖体となるフラボノイド類には、特に限定されず、公知のフラボノイド類を用いることができる。例えば、フラバノン類、フラボン類、フラボノール類、フラバノノール類、フラバノール類、アントシアン類、イソフラボン類、及びカルコン類等を挙げることができる。
【００１１】フラバノン類としては、レモン等に含まれるエリオジクチオール（Ｅｒｉｏｄｉｃｔｙｏｌ）、エリオジクチン（Ｅｒｉｏｄｉｃｔｉｎ）、カンゾウ等に含まれるリキリチン（Ｌｉｑｕｉｒｉｔｉｎ）、リキリチゲニン（Ｌｉｑｕｉｒｉｔｉｇｅｎｉｎ）、モモ等に含まれるナリンゲニン（Ｎａｒｉｎｇｅｎｉｎ）、柑橘類全般等に含まれるナリンギン（Ｎａｒｉｎｇｉｎ）、ネオヘスペリジン（Ｎｅｏｈｅｓｐｅｒｉｄｉｎ）、ヘスペレチン（Ｈｅｓｐｅｒｅｔｉｎ）、ヘスペリジン（Ｈｅｓｐｅｒｉｄｉｎ）、及びサクランボ等に含まれるプルニン（Ｐｒｕｎｉｎ）等が挙げられる。
【００１２】フラボン類としては、ダリア等に含まれるアピゲニン（Ａｐｉｇｅｎｉｎ）、パセリ等に含まれるアピイン（ａｐｉｉｎ）、タツナミソウ等に含まれるバイカレイン（Ｂａｉｃａｌｅｉｎ）、スイカズラ等に含まれるシナロシド（Ｃｙｎａｒｏｓｉｄｅ）、レモン等に含まれるジオスメチン（Ｄｉｏｓｍｅｔｉｎ）、ジオスミン（Ｄｉｏｓｍｉｎ）、スギナ等に含まれるガルテオリン（Ｇａｌｕｔｅｏｌｉｎ）、植物種全般に含まれるルテオリン（Ｌｕｔｅｏｌｉｎ）、及びハッサク等に含まれるノビレチン（Ｎｏｂｉｌｅｔｉｎ）等が挙げられる。
【００１３】フラボノール類としては、チャ等に含まれるアストラガリン（Ａｓｔｒａｇａｌｉｎ）、サイカチ等に含まれるフィセチン（Ｆｉｓｅｔｉｎ）、アーモンド等に含まれるイソラムネチン（Ｉｓｏｒｈａｍｎｅｔｉｎ）、カラスウリ等に含まれるケンフェリトリン（Ｋａｅｍｐｆｅｒｉｔｒｉｎ）、柑橘類等に含まれるケンフェロール（Ｋａｅｍｐｆｅｒｏｌ）、クワ等に含まれるモリン（Ｍｏｒｉｎ）、ヤマモモ等に含まれるミリセチン（Ｍｙｒｉｃｅｔｉｎ）、ミリシトリン（Ｍｙｒｉｃｉｔｒｉｎ）、タマネギ等に含まれるケルシトリン（Ｑｕｅｒｃｉｔｒｉｎ）、ケルシメリトリン（Ｑｕｅｒｃｉｍｅｒｉｔｒｉｎ）、ケルセチン（Ｑｕｅｒｃｅｔｉｎ）、キストゥス等に含まれるラムナジン（Ｒｈａｍｎａｚｉｎ）、プロポリス等に含まれるラムネチン（Ｒｈａｍｎｅｔｉｎ）、及びソバ等に含まれるルチン（Ｒｕｔｉｎ）等が挙げられる。
【００１４】フラバノノール類としては、ブドウ等に含まれるアロマデンドリン（Ａｒｏｍａｄｅｎｄｒｉｎ）、マツ種等に含まれるピノバンクシン（Ｐｉｎｏｂａｎｋｓｉｎ）、及びタキシホリン（Ｔａｘｉｆｏｌｉｎ）等が挙げられる。
【００１５】フラバノール類としては、チャ等に含まれるエピカテキン（Ｅｐｉｃａｔｅｃｈｉｎ）、エピカテキンガレート（Ｅｐｉｃａｔｅｃｈｉｎ ｇａｌｌａｔｅ）、エピガロカテキン（Ｅｐｉｇａｌｌｏｃａｔｅｃｈｉｎ）、エピガロカテキンガレート（Ｅｐｉｇａｌｌｏｃａｔｅｃｈｉｎ ｇａｌｌａｔｅ）、カテキン（Ｃａｔｅｃｈｉｎ）、カテキンガレート（Ｃａｔｅｃｈｉｎ ｇａｌｌａｔｅ）、ガロカテキン（Ｇａｌｌｏｃａｔｅｃｈｉｎ）、及びガロカテキンガレート（Ｇａｌｌｏｃａｔｅｃｈｉｎ ｇａｌｌａｔｅ）等が挙げられる。
【００１６】アントシアン類としては、コーリャン等に含まれるアピゲニニジン（Ａｐｉｇｅｎｉｎｉｄｉｎ）、ブドウ等に含まれるシアニジン（Ｃｙａｎｉｄｉｎ）、ブルーベリー等に含まれるデルフィニジン（Ｄｅｌｐｈｉｎｉｄｉｎ）、デルフィニウム等に含まれるデルフィニン（Ｄｅｌｐｈｉｎｉｎ）、デルフィン（Ｄｅｌｐｈｉｎ）、ソルガム等に含まれるルテオリニジン（Ｌｕｔｅｏｌｉｎｉｄｉｎ）、ウスベニアオイ等に含まれるマルビン（Ｍａｌｖｉｎ）、赤シソ等に含まれるマロニルシソニン（Ｍａｌｏｎｙｌｓｈｉｓｏｎｉｎ）、シソニン（Ｓｈｉｓｏｎｉｎ）、ナス等に含まれるナスニン（Ｎａｓｕｎｉｎ）、紫ジャガイモ等に含まれるペラニン（Ｐｅｌａｎｉｎ）、ペタイン（Ｐｅｔａｎｉｎ）、及びオランダイチゴ等に含まれるペラルゴニジン（Ｐｅｌａｒｇｏｎｉｄｉｎ）等が挙げられる。
【００１７】イソフラボン類としては、ダイズ等に含まれるゲニスチン（Ｇｅｎｉｓｔｉｎ）、ゲニステイン（Ｇｅｎｉｓｔｅｉｎ）、ダイジン（Ｄａｉｄｚｉｎ）、及びダイゼイン（Ｄａｉｄｚｅｉｎ）等が挙げられる。
【００１８】カルコン類としては、ベニバナ等に含まれるカルタミン（Ｃａｒｔｈａｍｉｎ）、及びマメ等に含まれるイソリキリチゲニン（Ｉｓｏｌｉｑｕｉｒｉｔｉｇｅｎｉｎ）等が挙げられる。
【００１９】本発明では、フラボノイド類の溶解方法の第１段階として、フラボノイド類がアルカリ域で水に対する溶解性が向上すること、およびサイクロデキストリン（以下「ＣＤ」という）を添加した場合はその包接化合物を形成することによって可溶化し得る。
【００２０】第１段階で、アルカリ液およびＣＤを用いる溶解工程を使用する場合、先に、アルカリ液を、続いてＣＤを添加し得るが、各工程を同時に進行することもできる。
【００２１】植物中に含まれ、本発明で配糖体となるフラボノイド類は、水酸化ナトリウム、アンモニア、水酸化カリウムなどを用いた、アルカリ液で溶解され得る。この時のｐＨは８以上であればよい。ｐＨ８未満でもフラボノイド類が溶解されるが、溶解されるフラボノイド類の種類が限定され、フラボノイド類の高濃度溶解液を調製し難いので、ｐＨ８以上がよい。好ましくは、ｐＨ８〜１１の範囲であり、より好ましくはｐＨ９〜１０である。
【００２２】植物中のフラボノイド類の可溶化は、植物またはその部分にアルカリ液を加え、必要に応じて、攪拌機、圧搾機、ホモジナイザー、濾過分離機、遠心分離機などを組み合わせて用いて、抽出液を調製することで得られる。この時、温度は、室温から１００℃までを選択し得るが、好ましくは２０〜８０℃である。なお、調製中にｐＨが８以下に下がることがあるので、適宜アルカリ液を添加しｐＨを８以上に保持するのがよい。
【００２３】ＣＤは、フラボノイド類と包接化合物を形成することにより、フラボノイド類を可溶化することと、フラボノイド配糖体生成における糖の供与体となる。ＣＤは、市販のものを用い得るが、澱粉にサイクロデキストリン合成酵素（１，４−α−Ｄ−Ｇｌｕｃａｎ： ４−α−Ｄ−（１，４−ｇｌｕｃａｎｏ）−ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ（Ｅ．Ｃ． ２．４．１．１９） 、以下「ＣＧＴａｓｅ」という）を作用させることによっても形成され得る。ここで生成されるＣＤは、グルコースが６〜８個、α−１，４結合で環状に結合した物質で、グルコースが６，７，８個のものをそれぞれα−ＣＤ、β−ＣＤ、γ−ＣＤという。
【００２４】ＣＤの他に、特開平８−３１１１０３号公報、特開平８−１３４１０４号公報に記載されているシクロアミロース、またはクラスターデキストリンなどでも供与体になるので用いることができる。さらに、多様な種類が市販されているデキストリン、可溶性澱粉、澱粉等も供与体として用いることができる。
【００２５】ＣＤ、シクロアミロース、デキストリン、可溶性澱粉、澱粉は室温のアルカリ液に容易に溶けるものであれば、アルカリ液に粉末を直接加えてもよいが、加熱により糊化溶解する必要があるものは加熱後の溶解液をアルカリ液に添加するのがよい。
【００２６】供与体の濃度は、０．１〜３０重量％、好ましくは１〜２０重量％である。
【００２７】第２段階では、糖転移酵素を用いて、糖転移を行い、フラボノイド類を配糖化することによって、中和後も沈澱を生じることがない可溶化フラボノイド類の製造を行う。
【００２８】本発明における、フラボノイド類の配糖体は、糖転移酵素による転移反応を利用して生産される。
【００２９】本発明に用いる酵素は糖転移酵素であればいずれのものでも使用し得る。例えば、ＣＧＴａｓｅ、α−アミラーゼ（Ｅ．Ｃ．３．２．１．１）およびα−グルコシダーゼ（Ｅ．Ｃ．３．２．１．２０）等がある。しかし、本発明はアルカリ域での反応を有するのでアルカリ域で不安定なものを用いるとフラボノイド配糖体の収量が著しく減少する。従って、アルカリ耐性の酵素を用いる方が好ましい。特に好ましいのは特開平７−１０７９７２号公報における好アルカリ性バチルス属の菌体が生産する耐アルカリ性ＣＧＴａｓｅである。
【００３０】糖転移酵素による転移反応は、基質と酵素量、ｐＨ、反応温度などにより、適宜選択されるが、フラボノイド類に糖転移するときの条件は、アルカリ域で行うこと以外は常法によるものと変わらない。中性域や酸性域で転移反応を行なうと、可溶化していたフラボノイド類が不溶化する場合があり、効率的な配糖体生成ができなくなるので、アルカリ域で転移反応を行なうのが好ましい。反応温度は、２０〜７５℃であることが好ましい。
【００３１】特開平７−１０７９７２号公報における耐アルカリ性ＣＧＴａｓｅを用いる場合での酵素濃度は、０．１〜１００ユニット／ｍｌとなるようにすることが好ましい。反応時間は酵素活性が持続する限り長いほどよい。反応は１００℃で５分間加熱することにより停止する。
【００３２】生成されたフラボノイド配糖体は、溶解性が著しく向上しているので、中和あるいは／およびＣＤ除去後、または酸性域でも、沈澱を生ずることのない可溶性のフラボノイド類である。
【００３３】植物から糖転移酵素で得られたフラボノイド配糖体は複数のフラボノイド類からなる混成物であるので、必要に応じて、イオン交換、ゲル濾過などを単独または、組み合わせて用いて、単離精製してもよい。
【００３４】
【実施例】
【００３５】（実施例１）オレンジ外皮５０ｇを６０℃で一晩乾燥させ、これを粉砕機で粉末化した。このオレンジ外皮乾燥粉末３ｇに３３ｍＭリン酸一水素カリウム溶液２８５ｍＬを、次に１Ｎ水酸化ナトリウム１５ｍＬを加え、強アルカリ液（ｐＨ１１．８）としてこれを懸濁しながら、粉末をより膨潤化させるために８０℃水中で５分間一時的に加熱した。室温まで冷却後、これにβ−ＣＤ５ｇを加え、次に１Ｎ塩酸の添加によりｐＨ７．０、８．０、９．０、１０．０または１１．０に調整した。これらに特開平７−１０７９７２号公報における好アルカリ性バチルス属の菌体が生産する耐アルカリ性ＣＧＴａｓｅを１５００ユニット分加えて、ｐＨを微調整し、４０℃に設定しておいた恒温槽に入れ、反応を開始させた。１６時間の反応の後、８０℃、５分間の加熱によって反応を停止させた。
これらの各溶液をＨＰＬＣ（ＯＤＳ）で分析したところ、図１の通り各ｐＨでの反応前フラボノイド類（ここではヘスペリジン）の溶解量に差は無かった。またオレンジ外皮乾燥粉末から溶解したヘスペリジンの量を求めると、外皮乾燥粉末１ｇ当たりで１７〜１８ｍｇであった。オレンジ乾燥外皮１ｇ中のヘスペリジン量はＪ．Ａｇｒｉｃ．Ｆｏｏｄ．Ｃｈｅｍ．，４７，４３９１−４３９７（１９９９）によると１２〜３１ｍｇとされ、本実施例での方法は適正な量が溶解していることが明らかとなった。
さらに酵素反応により生成したヘスペリジン配糖体量は図１の通りｐＨ８のアルカリ域で多く、ｐＨを１１．８から８．０まで下げて酵素反応をさせると効率的に配糖体が生成することが判明した。また、ｐＨ８．０におけるヘスペリジンの溶解量は反応液１００ｍｌ中１８ｍｇ、生成した配糖体量は１５ｍｇで、収率は８０％を超えていた。これらのことは、本実施例によりオレンジ外皮中のヘスペリジンが効率よく配糖化されていることを示している。
【００３６】なお、前記ＨＰＬＣ（ＯＤＳ）の分析条件は、カラム ： ＯＤＳ溶出液 ： ＡｃＣＮ／水 ＝ ２０／８０流速 ： ０．５ ｍｌ／ｍｉｎカラム温度 ： ４０℃検出法 ： ＵＶ２８０によった。
【００３７】（実施例２）オレンジ外皮５０ｇを６０℃で一晩乾燥させ、これを粉砕機で粉末化した。この乾燥粉末２ｇを５ｇのβ−ＣＤを含む次の各緩衝液３００ｍＬに加えた。すなわち、０．５Ｍのリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）、０．５Ｍのトリス・アミノメタン−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）、０．５Ｍのトリス・アミノメタン−塩酸緩衝液（ｐＨ９．０）、０．５Ｍの炭酸ナトリウム−炭酸水素ナトリウム緩衝液（ｐＨ１０．０）、リン酸一水素カリウム−水酸化ナトリウム緩衝液（ｐＨ１１．０）に加えた。これらを懸濁しながら、８０℃水中で５分間加熱した。続いて４０℃に設定しておいた恒温槽に入れ、４０℃に達温後、各緩衝液のｐＨに微調整し、この液に好アルカリ性バチルス属の菌体が生産する耐アルカリ性ＣＧＴａｓｅを１５００ユニット分加えて反応を開始させた。１６時間の反応の後、８０℃、５分間の加熱によって反応を停止させた。
これらの各溶液をＨＰＬＣ（ＯＤＳ）で分析したところ、図２の通り各ｐＨでの反応前ヘスペリジンの溶解量はｐＨ８以上のアルカリ域で多かった。また酵素反応により生成したヘスペリジン配糖体量はｐＨ８から９までのアルカリ域で多く、特にｐＨ９が最も多かった。
【００３８】（実施例３）
オレンジ外皮乾燥粉末１ｇに０．５Ｍのトリス・アミノメタン−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）１５０ｍＬ、または０．５Ｍのトリス・アミノメタン−塩酸緩衝液（ｐＨ９．０）１５０ｍＬを加え、８０℃水中で５分間加熱した。これに懸濁しながらα−ＣＤ、β−ＣＤ、γ−ＣＤ、または可溶性澱粉３ｇを加え、溶解後室温まで冷却した。これらに好アルカリ性バチルス属の菌体が生産する耐アルカリ性ＣＧＴａｓｅを８００ユニット分加えて、４０℃に設定しておいた恒温槽に入れ、反応を開始させた。１６時間の反応の後、８０℃、５分間の加熱によって反応を停止させた。
これらの各溶液をＨＰＬＣ（ＯＤＳ）で分析したところ、図３（ｐＨ８）、図４（ｐＨ９）の通り、β−ＣＤまたはγ−ＣＤの添加によりヘスペリジン配糖体が特に高収率で生成した。
【００３９】
【図面の簡単な説明】
【図１】アルカリ液で溶解し、各ｐＨに調整後の反応前フラボノイド類（ここではヘスペリジン）の溶解量および反応により生成した配糖体量をＨＰＬＣ（ＯＤＳ）で分析した結果である。（実施例１）
【図２】各ｐＨの緩衝液で溶解後の反応前ヘスペリジンの溶解量および反応により生成した配糖体量をＨＰＬＣ（ＯＤＳ）で分析した結果である。（実施例２）
【図３】ｐＨ８でのα−ＣＤ、β−ＣＤ、γ−ＣＤ、または可溶性澱粉を加えたヘスペリジン配糖体の収率分析結果である。（実施例３）
【図４】ｐＨ９でのα−ＣＤ、β−ＣＤ、γ−ＣＤ、または可溶性澱粉を加えたヘスペリジン配糖体の収率分析結果である。（実施例３）[0001]
INDUSTRIAL APPLICABILITY The present invention comprises adding an alkaline liquid and cyclodextrin, cycloamylose, dextrin, soluble starch or starch to a plant or a part thereof, and subjecting it to a glycosyltransferase using a glycosyltransferase in an alkaline region, The present invention relates to a method for producing soluble flavonoids directly from plants by separating and purifying the produced glycosyl transfer compound.
[0002]
Prior art and problems to be solved by the invention Since flavonoids such as hesperidin and rutin, which are conventionally known as vitamin P, have a pharmacological action of suppressing an increase in vascular permeability, antihypertensive agents It is used as an agent for preventing bleeding disorders. Moreover, since most flavonoids have an ultraviolet-absorbing action and a radical scavenger action, these flavonoids are expected to be used as functional additives in cosmetics and foods.
Currently, about 3,000 kinds of flavonoids are known, and since they are present in a large amount in citrus fruits, their use is easy despite being readily available at low cost. Very limited. That is because most of the flavonoids are slightly soluble in water or not at all.
As a method for solving these problems, soluble flavonoid glycosides are prepared from flavonoids using glycosyltransferases in JP-A-48-44260, JP-A-3-7593 or JP-A-11-346792. It shows how to do it. However, in these methods, it is necessary to purify flavonoids from plants, and purified flavonoids are also on the market. However, since these are originally expensive, the production cost of glycosides is naturally high.
[0005] Methods for producing hesperidin, a flavonoid, from citrus juice lees are reported in Eclipse Journal, 37 , 631-636 (1990) and Eclipse Journal, 40 , 833-840 (1993). ing. The former method is relatively simple and includes only pH adjustment, centrifugation, and drying steps, but the yield is as low as about 25%. On the other hand, in the latter case, the yield is improved to 70%, but complicated treatment such as heat treatment, enzyme treatment, pH adjustment, centrifugation, and drying process is required. Next, in order to obtain a glycoside, it is necessary to redissolve this sparingly soluble hesperidin, and then it is produced by a transglycosylation reaction and must be prepared in a two-step complicated process.
As described above, there is no method for efficiently producing flavonoid glycosides directly from plants.
[0007]
The method for producing a soluble flavonoid glycoside according to the present invention is a method for producing a flavonoid glycoside directly from a plant, wherein the flavonoid contained in the plant is an alkaline solution having a pH of 8 or more. And a step of solubilizing cyclodextrin, dextrin, soluble starch or starch, and a step of glycosyltransferase with a glycosyltransferase in an alkaline region, whereby the above object is achieved.
Flavonoids are a general term for a group of substances in which two phenyl groups are bonded via a pyran ring or three carbon atoms having a structure close thereto.
Any plant may be used in the present invention, but fruits are particularly preferred, and citrus fruits such as mandarin oranges, oranges, lemons, grapefruits, apples, grapes, peaches, pears, pineapples, bananas, Fruits such as melon and strawberry are good. Moreover, in the plant which can be used by this invention, especially fruit, you may use parts, such as not only the whole fruit but a skin, a streak, a seed, fruit juice, fruit meat, a sardine, and a juice waste juice. Further, these dry products may be used.
The flavonoids contained in plants and used as glycosides in the present invention are not particularly limited, and known flavonoids can be used. Examples include flavanones, flavones, flavonols, flavonols, flavanols, anthocyans, isoflavones, and chalcones.
Flavanones include eriodictyol contained in lemon and the like, eriodictin, liquiritin contained in licorice and the like, naringenin contained in liquiritigenin and peach Examples include Naringin, Neohesperidin, Hesperetin, Hesperidin, Hesperidin contained in citrus, etc., and Prune contained in cherries.
Examples of flavones include apigenin contained in dahlia and the like, apiin contained in parsley and the like, baicalein contained in seaweed, etc., synaroside contained in honeysuckle, lemon and the like. Include diosmethin, diosmin, galteolin contained in horsetail, etc., luteolin contained in all plant species, and nobiletin contained in hassaku and the like.
Examples of flavonols include astragalin contained in tea and the like, fisetin contained in saikachi and the like, isorhamnetin contained in almond and the like, kaempferitrin contained in crow uri and the like Kaempferol contained in citrus, Morin contained in mulberry, Myricetin contained in bayberry etc., Myricitrin, Quercitrin contained in onions etc., Quercitriline (Quercitrin) Rhamnazin, a quaternine, quercetin, kisstus, etc. Rhamnetin contained in police, etc. (Rhamnetin), and rutin (rutin) and the like contained in buckwheat and the like.
Examples of the flavonols include aromadendrin contained in grapes and the like, pinobanksin contained in pine species, and taxifolin.
Flavanols include epicatechin, epicatechin gallate, epigallocatechin, epigallocatechin gallate, catechin, catechin, and catechin, which are contained in tea and the like. (Catechin gallate), gallocatechin (Gallocatechin), gallocatechin gallate, and the like.
Examples of the anthocyans include apigenindin contained in sorghum and the like, cyanidin contained in grapes and the like, delphinidin contained in blueberries and the like, delphinin contained in delphinium and delphin (Delphine), luteolinidin contained in sorghum and the like, luvininidin contained in the moss, malvin, malonylshisonin contained in red perilla, etc. ), Peranin contained in purple potatoes, etc., petanin, and Dutch Pelargonidin (pelargonidin) and the like contained in the like.
Examples of isoflavones include genistin, genistin, daidzin, daidzein and the like contained in soybeans and the like.
Examples of the chalcones include carthamine contained in safflower and the like, and isoliquiritigenin contained in beans and the like.
In the present invention, as a first step of the method for dissolving flavonoids, the flavonoids are improved in solubility in water in the alkaline region, and when cyclodextrin (hereinafter referred to as “CD”) is added, It can be solubilized by forming a contact compound.
In the first stage, when a dissolution process using an alkaline solution and CD is used, the alkaline solution and then CD can be added first, but each step can also proceed simultaneously.
The flavonoids contained in the plant and used as glycosides in the present invention can be dissolved in an alkaline solution using sodium hydroxide, ammonia, potassium hydroxide or the like. The pH at this time may be 8 or more. The flavonoids are dissolved even at a pH lower than 8, but the type of flavonoids to be dissolved is limited, and it is difficult to prepare a high-concentration solution of flavonoids. Preferably, it is the range of pH 8-11, More preferably, it is pH 9-10.
For solubilization of flavonoids in plants, an alkaline solution is added to the plant or a part thereof, and if necessary, extraction is carried out using a combination of a stirrer, squeezer, homogenizer, filter separator, centrifuge, etc. It is obtained by preparing a liquid. At this time, the temperature can be selected from room temperature to 100 ° C, but is preferably 20 to 80 ° C. In addition, since pH may fall to 8 or less during preparation, it is good to add alkaline liquid suitably and hold | maintain pH to 8 or more.
CD forms a clathrate with flavonoids to solubilize flavonoids and become a sugar donor in the production of flavonoid glycosides. A commercially available CD can be used, but cyclodextrin synthase (1,4-α-D-Glucan: 4-α-D- (1,4-glucano) -transferase (EC) is used for starch. 4.1.19), hereinafter referred to as “CGTase”). The CD produced here is a substance in which 6 to 8 glucoses are bound cyclically by α-1,4 bonds, and those having 6, 7, 8 glucoses are α-CD, β-CD, γ, respectively. -It is called CD.
In addition to CD, cycloamylose or cluster dextrin described in JP-A-8-311103 and JP-A-8-134104 can also be used as a donor. Furthermore, various types of dextrin, soluble starch, starch and the like that are commercially available can also be used as donors.
CD, cycloamylose, dextrin, soluble starch, starch can be added directly to the alkaline solution as long as it can be easily dissolved in an alkaline solution at room temperature, but it must be gelatinized and dissolved by heating. The solution after heating is preferably added to the alkaline solution.
The concentration of the donor is 0.1 to 30% by weight, preferably 1 to 20% by weight.
In the second step, glycosyltransferase is used to produce solubilized flavonoids that do not cause precipitation even after neutralization by glycosylating flavonoids.
The flavonoid glycoside according to the present invention is produced by utilizing a transfer reaction by glycosyltransferase.
The enzyme used in the present invention can be any glycosyltransferase. For example, CGTase, α-amylase (EC 3.2.2.1), α-glucosidase (EC 3.2.2.1.20), and the like. However, since the present invention has a reaction in the alkaline region, the yield of flavonoid glycosides is remarkably reduced when an unstable one is used in the alkaline region. Therefore, it is preferable to use an alkali-resistant enzyme. Particularly preferred is alkali-resistant CGTase produced by alkalophilic Bacillus genus cells in JP-A-7-107972.
The transfer reaction by glycosyltransferase is appropriately selected depending on the substrate and the amount of enzyme, pH, reaction temperature, etc. The conditions for the sugar transfer to flavonoids are the same as in the conventional method except that the transfer is carried out in an alkaline region. It ’s not different. When the transfer reaction is performed in a neutral region or an acidic region, the solubilized flavonoids may be insolubilized, and efficient glycoside formation cannot be performed. Therefore, the transfer reaction is preferably performed in an alkaline region. The reaction temperature is preferably 20 to 75 ° C.
In the case of using alkali-resistant CGTase in JP-A-7-107972, the enzyme concentration is preferably 0.1-100 units / ml. The longer the reaction time, the better the enzyme activity lasts. The reaction is stopped by heating at 100 ° C. for 5 minutes.
The produced flavonoid glycosides are soluble flavonoids which do not cause precipitation even after neutralization and / or CD removal or even in the acidic region because the solubility is remarkably improved.
Since the flavonoid glycoside obtained from a plant by glycosyltransferase is a hybrid composed of a plurality of flavonoids, ion exchange, gel filtration or the like can be used alone or in combination as required. It may be separated and purified.
[0034]
【Example】
Example 1 50 g of orange skin was dried at 60 ° C. overnight, and powdered with a pulverizer. To swell the powder while further suspending it as a strong alkaline solution (pH 11.8) by adding 285 mL of 33 mM potassium monohydrogen phosphate solution to 3 g of this orange peel dry powder and then 15 mL of 1N sodium hydroxide. Heated temporarily in 80 ° C. water for 5 minutes. After cooling to room temperature, 5 g of β-CD was added thereto, and then adjusted to pH 7.0, 8.0, 9.0, 10.0 or 11.0 by adding 1N hydrochloric acid. To these, 1500 units of alkali-resistant CGTase produced by alkaliphilic Bacillus genus cells in JP-A-7-107972 was added, the pH was finely adjusted, and the mixture was placed in a thermostatic bath set at 40 ° C. Was started. After the reaction for 16 hours, the reaction was stopped by heating at 80 ° C. for 5 minutes.
When each of these solutions was analyzed by HPLC (ODS), there was no difference in the amount of dissolved flavonoids before reaction (here, hesperidin) at each pH as shown in FIG. The amount of hesperidin dissolved from the orange skin dry powder was 17 to 18 mg per 1 g of skin dry powder. The amount of hesperidin in 1 g of orange dry skin is Agric. Food. Chem. 47 , 4391-4397 (1999), it was 12-31 mg, and it was revealed that the method in this example was dissolved in an appropriate amount.
Furthermore, the amount of hesperidin glycoside produced by the enzyme reaction is large in the alkaline region at pH 8, as shown in FIG. There was found. Moreover, the dissolution amount of hesperidin at pH 8.0 was 18 mg in 100 ml of the reaction solution, the amount of produced glycoside was 15 mg, and the yield exceeded 80%. These facts indicate that the hesperidin in the orange peel is efficiently glycosylated according to this example.
The analytical conditions of the HPLC (ODS) were as follows: column: ODS eluent: AcCN / water = 20/80 flow rate: 0.5 ml / min column temperature: 40 ° C. detection method: UV280.
Example 2 50 g of orange skin was dried overnight at 60 ° C. and pulverized with a pulverizer. 2 g of this dry powder was added to the next 300 mL of each buffer containing 5 g of β-CD. That is, 0.5 M potassium phosphate buffer (pH 7.0), 0.5 M Tris-aminomethane-hydrochloric acid buffer (pH 8.0), 0.5 M Tris-aminomethane-hydrochloric acid buffer (pH 9. 0), 0.5 M sodium carbonate-sodium bicarbonate buffer (pH 10.0), and potassium monohydrogen phosphate-sodium hydroxide buffer (pH 11.0). While suspended, they were heated in water at 80 ° C. for 5 minutes. Subsequently, the solution was placed in a thermostat set at 40 ° C., and after reaching 40 ° C., the pH of each buffer solution was finely adjusted. In this solution, alkali-resistant CGTase produced by alkalophilic Bacillus genus cells was added to 1500. The unit was added to start the reaction. After the reaction for 16 hours, the reaction was stopped by heating at 80 ° C. for 5 minutes.
When each of these solutions was analyzed by HPLC (ODS), the amount of hesperidin dissolved before the reaction at each pH as shown in FIG. 2 was large in the alkaline region at pH 8 or higher. In addition, the amount of hesperidin glycoside produced by the enzyme reaction was large in the alkaline region from pH 8 to 9, especially pH 9.
Example 3
Add 150 mL of 0.5 M Tris-aminomethane-hydrochloric acid buffer (pH 8.0) or 150 mL of 0.5 M Tris-aminomethane-hydrochloric acid buffer (pH 9.0) to 1 g of orange peel dry powder, For 5 minutes. While suspended in this, 3 g of α-CD, β-CD, γ-CD, or soluble starch was added, and after dissolution, it was cooled to room temperature. To these, 800 units of alkali-resistant CGTase produced by alkalophilic Bacillus cells were added and placed in a thermostat set at 40 ° C. to initiate the reaction. After the reaction for 16 hours, the reaction was stopped by heating at 80 ° C. for 5 minutes.
When each of these solutions was analyzed by HPLC (ODS), as shown in FIG. 3 (pH 8) and FIG. 4 (pH 9), the addition of β-CD or γ-CD produced hesperidin glycosides in a particularly high yield. .
[0039]
[Brief description of the drawings]
FIG. 1 shows the results of HPLC (ODS) analysis of the dissolved amount of flavonoids before reaction (here, hesperidin) dissolved in an alkaline solution and adjusted to each pH and the amount of glycoside produced by the reaction. (Example 1)
FIG. 2 shows the result of HPLC (ODS) analysis of the dissolved amount of hesperidin before the reaction after dissolving in a buffer solution at each pH and the amount of glycoside produced by the reaction. (Example 2)
FIG. 3 is a result of yield analysis of hesperidin glycoside added with α-CD, β-CD, γ-CD, or soluble starch at pH 8. (Example 3)
FIG. 4 is a result of yield analysis of hesperidin glycoside added with α-CD, β-CD, γ-CD, or soluble starch at pH 9. (Example 3)
