JP6655246B2 - Double and single anchor type isomaltomegalo sugars, production method thereof and use thereof - Google Patents
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Description
本発明は、ダブルアンカー型イソマルトメガロ糖（以下、ＤＩＭＳと称する）、その製造方法及びその利用に関する。さらに本発明は、イソマルトメガロ糖鎖の非還元末端にアンカー糖鎖を有するシングルアンカー型イソマルトメガロ糖（以下、Ｎ−ＳＩＭＳと称する）、その製造方法及びその利用に関する。 The present invention relates to a double anchor type isomaltomegalosaccharide (hereinafter, referred to as DIMS), a method for producing the same, and use thereof. Furthermore, the present invention relates to a single anchor type isomaltomegalosaccharide having an anchor sugar chain at a non-reducing end of the isomaltomegalosaccharide (hereinafter, referred to as N-SIMS), a method for producing the same, and use thereof.
低分子マルトオリゴ糖には難水溶性化合物の水への可溶化能はなく、また、鎖長の比較的長いマルトオリゴ糖には可溶化作用はあるが、非常に弱い。難水溶性化合物の可溶化に関する従来の技術として、「シクロデキストリン（環状オリゴ糖；マルトオリゴ糖が環状化した糖質でグルコース・サイズが６〜８が代表例）」がある。但し、シクロデキストリン自体が難溶性で、また包接作用がサイズに依存するため、適用できるＢＣＳクラス２化合物は限定され、さらに鎖長の異なるα、β、γ−シクロデキストリンを使い分ける必要性がある。 Low molecular weight oligosaccharides do not have the ability to solubilize poorly water-soluble compounds in water, and maltooligosaccharides having a relatively long chain length have a solubilizing effect, but are very weak. As a conventional technique relating to solubilization of a poorly water-soluble compound, there is "cyclodextrin (cyclic oligosaccharide; a sugar obtained by cyclizing a maltooligosaccharide, typically having a glucose size of 6 to 8)". However, since cyclodextrin itself is hardly soluble and the inclusion action depends on the size, applicable BCS class 2 compounds are limited, and it is necessary to use α, β, γ-cyclodextrin having different chain lengths properly. .
直鎖のマルトオリゴ糖には、フラボノイドやイブプロフェンに対する可溶化能はほとんどない。また、環状マルトオリゴ糖の一種であるシクロデキストリンには、これら化合物に対する可溶化能はあるが、次に示す２つの課題がある。 Linear maltooligosaccharides have little solubilizing capacity for flavonoids and ibuprofen. Cyclodextrin, a kind of cyclic maltooligosaccharide, has a solubilizing ability for these compounds, but has the following two problems.
（１）水難溶性化合物の分子サイズが限定的である。シクロデキストリンはその環状構造で水難溶性化合物を捉える（包接）。一方、環サイズは決まっているため、分子サイズが合致しない水難溶性化合物とは複合体を形成できない。（分子量が過大や過小な化合物とは複合体形成しない。） (1) The molecular size of the poorly water-soluble compound is limited. Cyclodextrin captures poorly water-soluble compounds by its cyclic structure (inclusion). On the other hand, since the ring size is fixed, a complex cannot be formed with a poorly water-soluble compound whose molecular size does not match. (Does not form a complex with a compound having an excessively high or low molecular weight.)
（２）複合体の解離が困難である。難溶性化合物を包接した複合体は安定で、また消化酵素であるα-アミラーゼによる加水分解を受けにくい。そのため、腸内では対象化合物（フラボノイドなどのBCSクラス２化合物）は放出されにくく、生体利用性がかえって悪くなる場合がある。 (2) Dissociation of the complex is difficult. The complex containing the hardly soluble compound is stable and is not easily hydrolyzed by α-amylase, which is a digestive enzyme. Therefore, the target compound (BCS class 2 compound such as flavonoid) is hardly released in the intestine, and the bioavailability may be worsened.
シングルアンカーイソマルトメガロ糖を用いた可溶化技術が知られている（非特許文献１及び２）。鎖長の比較的長いマルトオリゴ糖には可溶化作用がある。しかし、非常に弱いものである。 A solubilization technique using a single anchor isomalt megalosaccharide is known (Non-Patent Documents 1 and 2). Maltooligosaccharides having a relatively long chain length have a solubilizing effect. But it is very weak.
鎖長の比較的長いイソマルトオリゴ糖には共存する物質を水に対して可溶化する作用があり、非特許文献１及び２に記載されているようにイソマルトメガロ糖鎖の非還元末端にアンカー糖鎖を付加したシングルアンカーイソマルトメガロ糖（Ｒ−ＳＩＭＳ）を用いた可溶化の提案がなされている。しかし、このシングルアンカーイソマルトメガロ糖は、いくつかの難水溶性化合物については可溶化能を示さず、その可溶化能は総じて非常に弱いものである。 Isomaltooligosaccharides having a relatively long chain length have the effect of solubilizing coexisting substances in water, and as described in Non-Patent Documents 1 and 2, anchor the non-reducing end of the isomaltomegalo sugar chain. Proposals have been made for solubilization using a single anchor isomalt megalosaccharide (R-SIMS) to which a sugar chain has been added. However, this single anchor isomalt megalosaccharide does not show solubilizing ability for some poorly water-soluble compounds, and its solubilizing ability is generally very weak.
本発明は、シクロデキストリンのように、水難溶性化合物の分子サイズに対する制限がなく、かつ水難溶性化合物と形成された複合体からの水難溶性化合物の解離が容易である、新たな可溶化能力を有する材料を提供することを目的とする。さらに、本発明は、この可溶化能力を有する材料を用いた、水難溶性化合物の溶解促進剤及び水難溶性化合物の水溶液の調製方法、及び可溶化能力を有する材料を用いた、水難溶性化合物を含む水溶液含有組成物を提供することも目的とする。 The present invention has a new solubilizing ability, such as cyclodextrin, which has no limitation on the molecular size of a poorly water-soluble compound and easily dissociates the poorly water-soluble compound from a complex formed with the poorly water-soluble compound. The purpose is to provide the material. Further, the present invention includes a method for preparing a dissolution promoter for a poorly water-soluble compound and an aqueous solution of a poorly water-soluble compound using the material having the solubilizing ability, and a poorly water-soluble compound using the material having the solubilizing ability. It is also an object to provide an aqueous solution containing composition.
本発明は以下のとおりである。
［１］
イソマルトメガロ糖鎖の両末端にアンカー糖鎖をそれぞれ有するダブルアンカー型イソマルトメガロ糖（以下、ＤＩＭＳと称する）であって、
前記イソマルトメガロ糖鎖は、α１−６結合で連結したグルコピラノースからなり、かつグルコピラノースの重合度が１０〜１００の範囲であり、
前記イソマルトメガロ糖鎖の還元末端側の前記アンカー糖鎖は、α１−４結合で連結したグルコピラノースからなり、かつグルコピラノースの重合度が２〜２０の範囲であり、
前記イソマルトメガロ糖鎖の非還元末端側の前記アンカー糖鎖は、α１−４結合で連結したグルコピラノースであり、かつグルコピラノースの重合度が１〜５０の範囲である、ＤＩＭＳ。
［２］
前記イソマルトメガロ糖鎖及び２つのアンカー糖鎖のグルコピラノースの重合度の合計は、１３〜１７０の範囲である［１］に記載のＤＩＭＳ。
［３］
［１］〜［２］のいずれか１項に記載の少なくとも２種のＤＩＭＳの混合物であって、平均重合度が１３〜１７０の範囲である、前記混合物。
［４］
イソマルトメガロ糖鎖の非還元末端にアンカー糖鎖を有するシングルアンカー型イソマルトメガロ糖（以下、Ｎ−ＳＩＭＳと称する）であって、
前記イソマルトメガロ糖鎖は、α１−６結合で連結したグルコピラノースからなり、かつグルコピラノースの重合度が１０〜１００の範囲であり、かつ
前記アンカー糖鎖は、α１−４結合で連結したグルコピラノースであり、かつグルコピラノースの重合度が１〜１００の範囲である、Ｎ−ＳＩＭＳ。
［５］
前記イソマルトメガロ糖鎖及びアンカー糖鎖のグルコピラノースの重合度の合計は、１１〜２００の範囲である［４］に記載のＮ−ＳＩＭＳ。
［６］
［４］〜［５］のいずれか１項に記載の少なくとも２種のＮ−ＳＩＭＳの混合物であって、平均重合度が１１〜２００の範囲である、前記混合物。
［７］
［１］〜［２］のいずれか１項に記載の少なくとも１種のＤＩＭＳ及び［４］〜［５］のいずれか１項に記載の少なくとも１種のＮ−ＳＩＭＳの混合物であって、平均重合度が１１〜２００の範囲である、前記混合物。
［８］
［１］〜［３］のいずれか１項に記載のＤＩＭＳ又はその混合物の製造方法であって、
イソマルトメガロ糖鎖の還元末端にアンカー糖鎖を有するシングルアンカー型イソマルトメガロ糖（以下、Ｒ−ＳＩＭＳと称する）と、糖供与体基質とを、糖質の転移活性を示す酵素による糖転移反応に供して、ＤＩＭＳ又はその混合物を得る、
但し、前記Ｒ−ＳＩＭＳのイソマルトメガロ糖鎖は、α１−６結合で連結したグルコピラノースからなり、かつグルコピラノースの重合度が１０〜１００の範囲であり、
前記Ｒ−ＳＩＭＳの前記アンカー糖鎖は、α１−４結合で連結したグルコピラノースからなり、かつグルコピラノースの重合度が２〜２０の範囲である、
ことを含む方法。
［９］
［４］〜［６］のいずれか１項に記載のＮ−ＳＩＭＳ又はその混合物の製造方法であって、
イソマルトメガロ糖（以下、ＩＭＳと称する）と糖供与体基質とを、糖質の転移活性を示す酵素による糖転移反応に供して、Ｎ−ＳＩＭＳ又はその混合物を得る、
但し、前記ＩＭＳのイソマルトメガロ糖鎖は、α１−６結合で連結したグルコピラノースからなり、かつグルコピラノースの重合度が１０〜１００の範囲である、
ことを含む方法。
［１０］
［１］〜［３］のいずれか１項に記載の少なくとも１種のＤＩＭＳ及び［４］〜［６］のいずれか１項に記載の少なくとも１種のＮ−ＳＩＭＳの混合物の製造方法であって、Ｒ−ＳＩＭＳ及びＩＭＳと、糖供与体基質とを、糖質の転移活性を示す酵素による糖転移反応に供して、ＤＩＭＳ及びＮ−ＳＩＭＳの混合物を得る、
但し、前記Ｒ−ＳＩＭＳのイソマルトメガロ糖鎖は、α１−６結合で連結したグルコピラノースからなり、かつグルコピラノースの重合度が１０〜１００の範囲であり、
前記Ｒ−ＳＩＭＳの前記アンカー糖鎖は、α１−４結合で連結したグルコピラノースからなり、かつグルコピラノースの重合度が２〜２０の範囲であり、
前記ＩＭＳのイソマルトメガロ糖鎖は、α１−６結合で連結したグルコピラノースからなり、かつグルコピラノースの重合度が１０〜１００の範囲である、
ことを含む方法。
［１１］
前記糖供与体基質がシクロデキストリンであり、かつ前記糖質の転移活性を示す酵素が、シクロマルトデキストリングルカノトランスフェラーゼ（CGTaseと略称）である［８］〜［１０］のいずれか１項に記載の方法。
［１２］
前記シクロデキストリンが、α−シクロデキストリン、β−シクロデキストリン、及びγ−シクロデキストリンから成る群から選ばれる１種または２種以上である、［１１］に記載の製造方法。
［１３］
前記供与体基質がオリゴ糖及び多糖から成る群から選ばれる少なくとも1種であり、
かつ前記糖質の転移活性を示す酵素が、α−グルコシダーゼ、Ｄ−酵素（不均一化酵素）、アミラーゼ及びアミロスクラーゼから成る群から選ばれる少なくとも1種の酵素及びCGTaseである［８］〜［１０］のいずれか１項に記載の方法。
［１４］
水難溶性化合物の水溶液を製造する方法であって、
水難溶性化合物と（ｉ）［１］〜［３］のいずれか一項に記載のＤＩＭＳ若しくはその混合物、（ｉｉ）［４］〜［６］のいずれか一項に記載のＮ−ＳＩＭＳ若しくはその混合物、又は（ｉｉｉ）［１］〜［３］のいずれか一項に記載の少なくとも１種のＤＩＭＳ及び［４］〜［６］のいずれか一項に記載の少なくとも１種のＮ−ＳＩＭＳの混合物とを水又は水を含有する溶媒中で混合することを含む、前記方法。
［１５］
前記水を含有する溶媒は、水及び少なくとも1種の有機溶媒から成る溶媒であり、前記有機溶媒は可食性有機溶媒である、［１４］に記載の製造方法。
［１６］
水難溶性化合物を、この化合物の融点以上に加熱すること、及び加熱溶解した水難溶性化合物を、（ｉ）ＤＩＭＳ若しくはその混合物、（ｉｉ）Ｎ−ＳＩＭＳ若しくはその混合物、又は（ｉｉｉ）少なくとも１種のＤＩＭＳ及び少なくとも１種のＮ−ＳＩＭＳの混合物を含有する溶媒と混合すること、を含む［１４］又は［１５］に記載の製造方法。
［１７］
水難溶性化合物が、ＢＣＳクラス２に分類される化合物である、［１４］〜［１６］のいずれか一項に記載の製造方法。
［１８］
水難溶性化合物、及び（ｉ）［１］〜［３］のいずれか一項に記載のＤＩＭＳ若しくはその混合物、（ｉｉ）［４］〜［６］のいずれか一項に記載のＮ−ＳＩＭＳ若しくはその混合物、又は（ｉｉｉ）［１］〜［３］のいずれか一項に記載の少なくとも１種のＤＩＭＳ及び［４］〜［６］のいずれか一項に記載の少なくとも１種のＮ−ＳＩＭＳの混合物を含む組成物。
［１９］
可食性有機溶媒をさらに含む［１８］に記載の組成物。
［２０］
水難溶性化合物が薬効成分であり、前記組成物は有効量の前記水難溶性化合物を含有する医薬用組成物である［１８］又は［１９］に記載の組成物。
［２１］
水難溶性化合物が飲食品用成分であり、前記組成物は飲食品用組成物又は飲食品用原料組成物である［１８］又は［１９］に記載の組成物。
［２２］
［１］〜［３］のいずれか一項に記載のＤＩＭＳ若しくはその混合物、又は［４］〜［６］のいずれか一項に記載のＮ−ＳＩＭＳ若しくはその混合物、［１］〜［３］のいずれか一項に記載の少なくとも１種のＤＩＭＳ及び［４］〜［６］のいずれか一項に記載の少なくとも１種のＮ−ＳＩＭＳの混合物を含有する、水難溶性化合物を水溶液化するための溶解促進剤。
［２３］
水難溶性化合物が、ＢＣＳクラス２に分類される化合物である、［２２］に記載の溶解促進剤。
The present invention is as follows.
[1]
A double-anchored isomaltomegalosaccharide (hereinafter, referred to as DIMS) having anchor sugar chains at both ends of the isomaltmegalo sugar chain,
The isomalt megalo sugar chain is composed of glucopyranose linked by α1-6 bond, and the degree of polymerization of glucopyranose is in a range of 10 to 100,
The anchor sugar chain on the reducing end side of the isomalt megalo sugar chain is composed of glucopyranose linked by an α1-4 bond, and the degree of polymerization of glucopyranose is in the range of 2 to 20,
A DIMS, wherein the anchor sugar chain on the non-reducing terminal side of the isomalt megalo sugar chain is glucopyranose linked by an α1-4 bond, and the degree of polymerization of glucopyranose is in the range of 1 to 50.
[2]
The DIMS according to [1], wherein the total degree of polymerization of glucopyranose of the isomalt megalo sugar chain and the two anchor sugar chains is in the range of 13 to 170.
[3]
A mixture of at least two types of DIMS according to any one of [1] to [2], wherein the average degree of polymerization is in a range of 13 to 170.
[4]
A single anchor type isomalt megalosaccharide having an anchor sugar chain at a non-reducing end of the isomalt megalo sugar chain (hereinafter, referred to as N-SIMS),
The isomalt megalo sugar chain is composed of glucopyranose linked by an α1-6 bond, the degree of polymerization of glucopyranose is in the range of 10 to 100, and the anchor sugar chain is a glucopyranose linked by an α1-4 bond. N-SIMS which is pyranose and has a degree of polymerization of glucopyranose in the range of 1 to 100.
[5]
The N-SIMS according to [4], wherein the total polymerization degree of glucopyranose of the isomalt megalo sugar chain and the anchor sugar chain is in a range of 11 to 200.
[6]
A mixture of at least two types of N-SIMSs according to any one of [4] to [5], wherein the average degree of polymerization is in a range of 11 to 200.
[7]
A mixture of at least one type of DIMS according to any one of [1] to [2] and at least one type of N-SIMS according to any one of [4] to [5], wherein The above-mentioned mixture, wherein the degree of polymerization is in the range of 11 to 200.
[8]
A method for producing DIMS or a mixture thereof according to any one of [1] to [3],
Glycosyl transfer between a single anchor type isomalt megalosaccharide having an anchor sugar chain at the reducing end of the isomaltmegalo sugar chain (hereinafter, referred to as R-SIMS) and a sugar donor substrate by an enzyme having carbohydrate transfer activity Subjecting the reaction to DIMS or a mixture thereof,
However, the isomaltomegalo sugar chain of the R-SIMS is composed of glucopyranose linked by an α1-6 bond, and the degree of polymerization of glucopyranose is in the range of 10 to 100,
The anchor sugar chain of the R-SIMS is composed of glucopyranose linked by an α1-4 bond, and the degree of polymerization of glucopyranose is in the range of 2 to 20,
A method that includes:
[9]
A method for producing an N-SIMS or a mixture thereof according to any one of [4] to [6],
Isomaltomegalosaccharide (hereinafter, referred to as IMS) and a sugar donor substrate are subjected to a glycosyltransfer reaction with an enzyme exhibiting carbohydrate transfer activity to obtain N-SIMS or a mixture thereof.
However, the isomalt megalo sugar chain of the IMS is composed of glucopyranose linked by an α1-6 bond, and the degree of polymerization of glucopyranose is in a range of 10 to 100.
A method that includes:
[10]
A method for producing a mixture of at least one kind of DIMS according to any one of [1] to [3] and at least one kind of N-SIMS according to any one of [4] to [6]. Subjecting the R-SIMS and IMS and the sugar donor substrate to a glycosyltransfer reaction with an enzyme exhibiting carbohydrate transfer activity to obtain a mixture of DIMS and N-SIMS.
However, the isomaltomegalo sugar chain of the R-SIMS is composed of glucopyranose linked by an α1-6 bond, and the degree of polymerization of glucopyranose is in the range of 10 to 100,
The anchor sugar chain of the R-SIMS is composed of glucopyranose linked by an α1-4 bond, and the degree of polymerization of glucopyranose is in a range of 2 to 20,
The IMS isomalt megalo sugar chain is composed of glucopyranose linked by an α1-6 bond, and the degree of polymerization of glucopyranose is in the range of 10 to 100.
A method that includes:
[11]
The enzyme according to any one of [8] to [10], wherein the sugar donor substrate is cyclodextrin, and the enzyme exhibiting carbohydrate transfer activity is cyclomaltodextrin glucanotransferase (abbreviated as CGTase). the method of.
[12]
The method according to [11], wherein the cyclodextrin is at least one member selected from the group consisting of α-cyclodextrin, β-cyclodextrin, and γ-cyclodextrin.
[13]
The donor substrate is at least one selected from the group consisting of oligosaccharides and polysaccharides,
In addition, the enzyme exhibiting the carbohydrate transfer activity is at least one enzyme selected from the group consisting of α-glucosidase, D-enzyme (heterogeneous enzyme), amylase, and amylosucrase, and CGTase [8] to [ [10] The method according to any one of [1] to [10].
[14]
A method for producing an aqueous solution of a poorly water-soluble compound,
Poorly water-soluble compound and (i) DIMS or a mixture thereof according to any one of [1] to [3], (ii) N-SIMS or a mixture thereof according to any one of [4] to [6] A mixture or (iii) of at least one kind of DIMS according to any one of [1] to [3] and at least one kind of N-SIMS according to any one of [4] to [6]. Mixing said mixture with water or a solvent containing water.
[15]
The production method according to [14], wherein the solvent containing water is a solvent composed of water and at least one organic solvent, and the organic solvent is an edible organic solvent.
[16]
Heating the poorly water-soluble compound to a temperature equal to or higher than the melting point of the compound; and heating and dissolving the poorly-soluble water-soluble compound in (i) DIMS or a mixture thereof, (ii) N-SIMS or a mixture thereof, or (iii) at least one of The production method according to [14] or [15], comprising mixing with a solvent containing a mixture of DIMS and at least one N-SIMS.
[17]
The production method according to any one of [14] to [16], wherein the poorly water-soluble compound is a compound classified into BCS class 2.
[18]
A poorly water-soluble compound, and (i) DIMS or a mixture thereof according to any one of [1] to [3], (ii) N-SIMS according to any one of [4] to [6] or A mixture thereof, or (iii) at least one DIMS according to any one of [1] to [3] and at least one N-SIMS according to any one of [4] to [6]. A composition comprising a mixture of
[19]
The composition according to [18], further comprising an edible organic solvent.
[20]
The composition according to [18] or [19], wherein the poorly water-soluble compound is a medicinal ingredient, and the composition is a pharmaceutical composition containing an effective amount of the poorly water-soluble compound.
[21]
The composition according to [18] or [19], wherein the poorly water-soluble compound is a component for food and drink, and the composition is a composition for food and drink or a raw material composition for food and drink.
[22]
DIMS or a mixture thereof according to any one of [1] to [3], or N-SIMS or a mixture thereof according to any one of [4] to [6], [1] to [3] For making a poorly water-soluble compound into an aqueous solution, comprising a mixture of at least one DIMS according to any one of the above and at least one N-SIMS according to any one of the above [4] to [6]. Dissolution promoter.
[23]
The dissolution accelerator according to [22], wherein the poorly water-soluble compound is a compound classified into BCS class 2.
本発明によれば、ダブルアンカー型イソマルトメガロ糖（ＤＩＭＳ）による難溶性化合物の可溶化技術を提供することができる。この可溶化技術は、包接作用によるものではなく、α-1,6鎖による比較的緩い相互作用によるものである（若干のα-1,4鎖の寄与もある）と考えられる。また複合体形成を安定化しているアンカー構造は、比較的容易にα-アミラーゼにより分解・短鎖長化され、腸内で対象物質をより放出しやすくする性質を持っている。さらに本発明は、イソマルトメガロ糖鎖の還元末端にアンカー糖鎖を有するシングルアンカー型イソマルトメガロ糖（Ｒ−ＳＩＭＳ）による難溶性化合物の可溶化技術も提供することができる。 ADVANTAGE OF THE INVENTION According to this invention, the solubilization technique of the hardly soluble compound by the double anchor type | mold isomaltomegalo sugar (DIMS) can be provided. It is believed that this solubilization technique is not due to inclusion, but rather due to the relatively loose interaction of the α-1,6 chains (with some α-1,4 chain contribution). The anchor structure that stabilizes complex formation is relatively easily decomposed and shortened by α-amylase, and has the property of releasing the target substance more easily in the intestine. Further, the present invention can also provide a technique for solubilizing a hardly soluble compound using a single anchor type isomaltomegalosaccharide (R-SIMS) having an anchor sugar chain at the reducing end of the isomaltomegalosaccharide.
＜ダブルアンカー型イソマルトメガロ糖（ＤＩＭＳ）＞
本発明は、イソマルトメガロ糖鎖の両末端にアンカー糖鎖をそれぞれ有するＤＩＭＳに関する。このＤＩＭＳにおける前記イソマルトメガロ糖鎖は、α１−６結合で連結したグルコピラノースからなり、かつグルコピラノースの重合度が１０〜１００の範囲である。このグルコピラノースの重合度の下限は、例えば、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５又は５０であることができる。このグルコピラノースの重合度の上限は、例えば、１００、９５、９０、８５、８０、７５、７０、６５、６０又は５５であることができる。
<Double anchor type isomaltomegalo sugar (DIMS)>
The present invention relates to DIMS having an anchor sugar chain at each end of an isomalt megalo sugar chain. The isomaltomegalo sugar chain in this DIMS is composed of glucopyranose linked by an α1-6 bond, and the degree of polymerization of glucopyranose is in the range of 10 to 100. The lower limit of the degree of polymerization of glucopyranose can be, for example, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 or 50. The upper limit of the degree of polymerization of glucopyranose can be, for example, 100, 95, 90, 85, 80, 75, 70, 65, 60 or 55.
ＤＩＭＳにおける前記イソマルトメガロ糖鎖の還元末端側の前記アンカー糖鎖は、α１−４結合で連結したグルコピラノースからなり、かつグルコピラノースの重合度が２〜２０の範囲である。このグルコピラノースの重合度の下限は、例えば、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０であることができる。このグルコピラノースの重合度の上限は、例えば、２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２又は１１であることができる。 The anchor sugar chain on the reducing end side of the isomalt megalo sugar chain in DIMS is composed of glucopyranose linked by an α1-4 bond, and the degree of polymerization of glucopyranose is in the range of 2 to 20. The lower limit of the degree of polymerization of glucopyranose can be, for example, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 or 10. The upper limit of the degree of polymerization of glucopyranose can be, for example, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, or 11.
ＤＩＭＳにおける前記イソマルトメガロ糖鎖の非還元末端側の前記アンカー糖鎖は、α１−４結合で連結したグルコピラノースであり、かつグルコピラノースの重合度が１〜５０の範囲である。このグルコピラノースの重合度の下限は、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０又は２５であることができる。このグルコピラノースの重合度の上限は、例えば、５０、４９、４８、４７、４６、４５、４４、４３、４２、４１、４０、３５、又は３０であることができる。 The anchor sugar chain on the non-reducing end side of the isomalt megalo sugar chain in DIMS is glucopyranose linked by an α1-4 bond, and the degree of polymerization of glucopyranose is in the range of 1 to 50. The lower limit of the degree of polymerization of glucopyranose can be, for example, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, or 25. The upper limit of the degree of polymerization of glucopyranose can be, for example, 50, 49, 48, 47, 46, 45, 44, 43, 42, 41, 40, 35, or 30.
本発明のＤＩＭＳにおけるイソマルトメガロ糖鎖及び２つのアンカー糖鎖のグルコピラノースの重合度の合計は、１３〜１７０の範囲であることができる。この重合度の合計の下限は、例えば、１３、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、又は７０であることができる。この重合度の合計の上限は、例えば、１７０、１６５、１６０、１５５、１５０、１４５、１４０、１３５、１３０、１２５、１２０、１１５、１１０、１０５、１００、９５、９０、８５、８０、又は７５であることができる。 The sum of the degree of polymerization of glucopyranose of the isomalt megalo sugar chain and the two anchor sugar chains in the DIMS of the present invention can be in the range of 13 to 170. The lower limit of the total degree of polymerization can be, for example, 13, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, or 70. The upper limit of the total degree of polymerization is, for example, 170, 165, 160, 155, 150, 145, 140, 135, 130, 125, 120, 115, 110, 105, 100, 95, 90, 85, 80, or 75.
本発明のＤＩＭＳは、１種類の化合物であることもできるが、２種以上のＤＩＭＳの混合物であることもできる。混合物に含まれるＤＩＭＳは、イソマルトメガロ糖鎖及び２つのアンカー糖鎖のいずれか１つ又は２つが共通で，残りの糖鎖が異なる場合と、イソマルトメガロ糖鎖及び２つのアンカー糖鎖の全てが異なる場合があり得る。 The DIMS of the present invention can be a single compound or a mixture of two or more DIMSs. The DIMS contained in the mixture is different between the case where one or two of the isomalt-megalo sugar chains and the two anchor sugar chains are common and the remaining sugar chains are different, and between the case where the isomaltomegalo sugar chains and the two anchor sugar chains are different. Everything can be different.
ＤＩＭＳが２種以上のＤＩＭＳの混合物である場合、混合物の平均重合度は、例えば、１３〜１７０の範囲であることができる。
この混合物の平均重合度の下限は、例えば、１３、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５又は７０であることができる。この混合物の平均重合度の上限は、例えば、１７０、１６５、１６０、１５５、１５０、１４５、１４０、１３５、１３０、１２５、１２０、１１５、１１０、１０５、１００、９５、９０、８５、８０、又は７５であることができる。
When the DIMS is a mixture of two or more DIMSs, the average degree of polymerization of the mixture can range, for example, from 13 to 170.
The lower limit of the average degree of polymerization of this mixture can be, for example, 13, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65 or 70. The upper limit of the average polymerization degree of this mixture is, for example, 170, 165, 160, 155, 150, 145, 140, 135, 130, 125, 120, 115, 110, 105, 100, 95, 90, 85, 80, Or 75.
＜シングルアンカー型イソマルトメガロ糖（Ｎ−ＳＩＭＳ）＞
本発明は、イソマルトメガロ糖鎖の非還元末端にアンカー糖鎖を有するＮ−ＳＩＭＳも包含する。Ｎ−ＳＩＭＳの前記イソマルトメガロ糖鎖は、α１−６結合で連結したグルコピラノースからなり、かつグルコピラノースの重合度が１０〜１００の範囲である。このα１−６結合で連結したグルコピラノースの重合度は、ＤＩＭＳの場合と同様であることができる。前記アンカー糖鎖は、α１−４結合で連結したグルコピラノースであり、かつグルコピラノースの重合度が１〜１００の範囲である。α１−４結合で連結したグルコピラノースの重合度下限は、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０又は２５であることができる。このグルコピラノースの重合度の上限は、例えば、１００、９５、９０、８５、８０、７５、７０、６５、６０、５５、５０、４５、４０、３５、又は３０であることができる。Ｎ−ＳＩＭＳの前記イソマルトメガロ糖鎖及びアンカー糖鎖のグルコピラノースの重合度の合計は、例えば、１１〜２００の範囲であることができる。
<Single anchor type isomaltomegalo sugar (N-SIMS)>
The present invention also includes an N-SIMS having an anchor sugar chain at a non-reducing end of an isomalt megalo sugar chain. The isomalt megalo sugar chain of N-SIMS is composed of glucopyranose linked by an α1-6 bond, and the degree of polymerization of glucopyranose is in the range of 10 to 100. The degree of polymerization of glucopyranose linked by this α1-6 bond can be the same as in DIMS. The anchor sugar chain is glucopyranose linked by an α1-4 bond, and the degree of polymerization of glucopyranose is in the range of 1 to 100. The lower limit of the degree of polymerization of glucopyranose linked by an α1-4 bond can be, for example, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, or 25. The upper limit of the degree of polymerization of glucopyranose can be, for example, 100, 95, 90, 85, 80, 75, 70, 65, 60, 55, 50, 45, 40, 35, or 30. The total degree of polymerization of glucopyranose of the isomalt megalo sugar chain and the anchor sugar chain in N-SIMS can be, for example, in the range of 11 to 200.
本発明のＮ−ＳＩＭＳは、１種類の化合物であることもできるが、２種以上のＮ−ＳＩＭＳの混合物であることもできる。混合物に含まれるＮ−ＳＩＭＳイソマルトメガロ糖鎖及びアンカー糖鎖のいずれか一方の糖鎖が異なる場合と、イソマルトメガロ糖鎖及びアンカー糖鎖の両方が異なる場合があり得る。
Ｎ−ＳＩＭＳが２種以上のＮ−ＳＩＭＳの混合物である場合、Ｎ−ＳＩＭＳの混合物の平均重合度は、例えば、１１〜２００の範囲であることができる。
The N-SIMS of the present invention can be a single compound or a mixture of two or more N-SIMS. It is possible that the N-SIMS isomalt megalo sugar chain and the anchor sugar chain contained in the mixture are different from each other, and that both the isomaltomegalo sugar chain and the anchor sugar chain are different.
When the N-SIMS is a mixture of two or more N-SIMSs, the average degree of polymerization of the N-SIMS mixture can be, for example, in the range of 11 to 200.
＜ＤＩＭＳとＮ−ＳＩＭＳの混合物＞
本発明は、ＤＩＭＳとＮ−ＳＩＭＳの混合物も包含する。ＤＩＭＳ及びＮ−ＳＩＭＳは、それぞれ単独の化合物であっても、それぞれ混合物であっても良い。ＤＩＭＳとＮ−ＳＩＭＳの混合物の平均重合度は、例えば、１１〜２００の範囲であることができる。
<A mixture of DIMS and N-SIMS>
The present invention also includes a mixture of DIMS and N-SIMS. DIMS and N-SIMS may each be a single compound or a mixture thereof. The average degree of polymerization of the mixture of DIMS and N-SIMS can be, for example, in the range of 11 to 200.
＜製造方法＞
本発明は、上記本発明のＤＩＭＳ又はその混合物の製造方法を包含する。この製造方法は、イソマルトメガロ糖鎖の還元末端にアンカー糖鎖を有するＲ−ＳＩＭＳと、糖供与体基質とを、糖質の転移活性を示す酵素（糖質転移酵素）による糖転移反応に供して、Ｒ−ＳＩＭＳの非還元末端にアンカー糖鎖を付加したＤＩＭＳ又はその混合物を得る、ことを含む。
<Production method>
The present invention includes a method for producing the DIMS of the present invention or a mixture thereof. In this production method, an R-SIMS having an anchor sugar chain at a reducing end of an isomalt-megalo sugar chain and a sugar donor substrate are subjected to a sugar transfer reaction by an enzyme having carbohydrate transfer activity (sugar transferase). To obtain DIMS in which an anchor sugar chain is added to the non-reducing end of R-SIMS or a mixture thereof.
さらに本発明は、上記本発明のＮ−ＳＩＭＳ又はその混合物の製造方法を包含する。この製造方法は、イソマルトメガロ糖（ＩＭＳ）と糖供与体基質とを、糖質転移酵素による糖転移反応に供して、ＩＭＳの非還元末端にアンカー糖鎖を付加したＮ−ＳＩＭＳ又はその混合物を得る、ことを含む。 The present invention further includes a method for producing the N-SIMS of the present invention or a mixture thereof. This production method comprises the steps of subjecting an isomalt megalosaccharide (IMS) and a sugar donor substrate to a glycosyltransferase reaction using a glycosyltransferase to add an anchor sugar chain to the non-reducing end of the IMS or a mixture thereof. , Including.
さらに本発明は、上記本発明のＤＩＭＳ及びＮ−ＳＩＭＳの混合物の製造方法であって、Ｒ−ＳＩＭＳ及びＩＭＳと、糖供与体基質とを、糖質の転移活性を示す酵素による糖転移反応に供して、ＤＩＭＳ及びＮ−ＳＩＭＳの混合物を得る、ことを含む。 Further, the present invention relates to a method for producing a mixture of DIMS and N-SIMS according to the present invention, wherein R-SIMS and IMS and a sugar donor substrate are subjected to a glycosyltransfer reaction by an enzyme having carbohydrate transfer activity. To obtain a mixture of DIMS and N-SIMS.
以下にＤＩＭＳ及びＮ−ＳＩＭＳの製造方法を例に、反応スキームで示す。 The reaction scheme is shown below, taking the production method of DIMS and N-SIMS as an example.
黒丸はα１-６結合で連結するグルコピラノース残基を示す。
白丸はα１-４結合で連結するグルコピラノース残基を示す。
斜線を付した白丸及び黒丸は還元末端のグルコピラノース残基を示す。
生産はCGTaseなどの糖転移活性を有する酵素によってなされる。
Black circles indicate glucopyranose residues linked by α1-6 bonds.
Open circles indicate glucopyranose residues linked by α1-4 bonds.
Open circles and black circles with hatching indicate glucopyranose residues at the reducing end.
Production is performed by an enzyme having glycosyltransferase activity such as CGTase.
ＤＩＭＳ又はその混合物の製造方法における一方の原料は、Ｒ−ＳＩＭＳである。前記のＲ−ＳＩＭＳを構成するイソマルトメガロ糖鎖は、α１−６結合で連結したグルコピラノースからなり、かつグルコピラノースの重合度が１０〜１００の範囲である。Ｒ−ＳＩＭＳを構成するイソマルトメガロ糖鎖の還元末端側のアンカー糖鎖は、α１−４結合で連結したグルコピラノースからなり、かつグルコピラノースの重合度が２〜２０の範囲である。これらイソマルトメガロ糖鎖及びアンカー糖鎖は、ＤＩＭＳにおいて説明したものと同義である。原料として用いるＲ−ＳＩＭＳは、例えば、非特許文献１及び２に記載の化合物であることができる。 One raw material in the method for producing DIMS or a mixture thereof is R-SIMS. The isomaltomegalo sugar chains constituting the R-SIMS are composed of glucopyranose linked by α1-6 bond, and the degree of polymerization of glucopyranose is in the range of 10 to 100. The anchor sugar chain on the reducing end side of the isomaltomegalo sugar chain constituting R-SIMS is composed of glucopyranose linked by an α1-4 bond, and the degree of polymerization of glucopyranose is in the range of 2 to 20. These isomalt megalo sugar chains and anchor sugar chains have the same meanings as those described in DIMS. R-SIMS used as a raw material can be, for example, the compounds described in Non-Patent Documents 1 and 2.
Ｎ−ＳＩＭＳ又はその混合物の製造方法における一方の原料はＩＭＳであり、ＩＭＳのイソマルトメガロ糖鎖は、α１−６結合で連結したグルコピラノースからなり、かつグルコピラノースの重合度が１０〜１００の範囲である。ＩＭＳのイソマルトメガロ糖鎖は、Ｎ−ＳＩＭＳにおいてＮ−ＳＩＭＳのイソマルトメガロ糖鎖として説明したものと同義である。 One raw material in the method for producing N-SIMS or a mixture thereof is IMS, and the isomaltmegalo sugar chain of IMS is composed of glucopyranose linked by α1-6 bond, and has a polymerization degree of glucopyranose of 10 to 100. Range. The IMS isomalt megalo sugar chain has the same meaning as that described in N-SIMS as the N-SIMS isomalt megalo sugar chain.
ＤＩＭＳ及びＮ−ＳＩＭＳの混合物の製造方法における一方の原料は、Ｒ−ＳＩＭＳ及びＩＭＳであり、いずれも、上記ＤＩＭＳの製造方法、及びＮ−ＳＩＭＳの製造方法で説明したものと同様である。 One raw material in the method for producing a mixture of DIMS and N-SIMS is R-SIMS and IMS, both of which are the same as those described in the method for producing DIMS and the method for producing N-SIMS.
他方の原料は、糖供与体基質である。糖供与体基質は、例えば、シクロデキストリンである。シクロデキストリンは、α−シクロデキストリン、β−シクロデキストリン、及びγ−シクロデキストリンから成る群から選ばれる１種のシクロデキストリン、または２種以上のシクロデキストリンの混合物であることができる。シクロデキストリンは、いずれかのシクロデキストリンを単独で使用することもできるが、２種以上のシクロデキストリンの混合物を用いることもできる。使用するシクロデキストリンの種類を選択することで、非還元末端に付加されるアンカー糖鎖の重合度を制御することができる。また、２種以上のシクロデキストリンの混合物を用いる場合も同様であり、混合物中のシクロデキストリンの種類や混合割合などで非還元末端に付加されるアンカー糖鎖の重合度を制御することができる。 The other source is a sugar donor substrate. The sugar donor substrate is, for example, cyclodextrin. The cyclodextrin may be one kind of cyclodextrin selected from the group consisting of α-cyclodextrin, β-cyclodextrin, and γ-cyclodextrin, or a mixture of two or more cyclodextrins. As the cyclodextrin, any cyclodextrin can be used alone, or a mixture of two or more cyclodextrins can be used. By selecting the type of cyclodextrin to be used, the degree of polymerization of the anchor sugar chain added to the non-reducing terminal can be controlled. The same applies to the case where a mixture of two or more cyclodextrins is used, and the degree of polymerization of the anchor sugar chain added to the non-reducing terminal can be controlled by the type and the mixing ratio of the cyclodextrin in the mixture.
糖質転移酵素は、糖供与体基質がシクロデキストリンの場合、例えば、シクロマルトデキストリングルカノトランスフェラーゼ（CGTase）であることができる。CGTaseは、シクロデキストリンを基質として、Ｒ−ＳＩＭＳ又はＩＭＳの非還元末端に、シクロデキストリンが開環した糖鎖をアンカー糖鎖として付加することができ、ＤＩＭＳ又はその混合物、Ｎ−ＳＩＭＡ又はその混合物をそれぞれ生成させることができる。シクロデキストリンが開環した糖鎖は、少なくとも１つ付加することで、ＤＩＭＳ又はその混合物、Ｎ−ＳＩＭＡ又はその混合物を生成させることができる。シクロデキストリンが開環した糖鎖は、既に非還元末端にアンカー糖鎖が付加した、ＤＩＭＳ又はＮ−ＳＩＭＡの非還元末端に、さらに付加することもできる。シクロデキストリンが開環した糖鎖の多重の付加の程度により、非還元末端のアンカー糖鎖の重合度は、変化する。また、原料として使用するシクロデキストリンの種類によっても、非還元末端のアンカー糖鎖の重合度は、変化する。シクロデキストリンが複数のシクロデキストリンの混合物である場合には、シクロデキストリンの種類により決まる重合度とシクロデキストリンが開環した糖鎖の多重の付加の程度により決まる重合度の２つの重合度により決まる。 The glycosyltransferase can be, for example, cyclomaltodextrin glucanotransferase (CGTase) when the sugar donor substrate is cyclodextrin. CGTase can add a cyclodextrin-opened sugar chain as an anchor sugar chain to the non-reducing end of R-SIMS or IMS using cyclodextrin as a substrate, DIMS or a mixture thereof, N-SIMA or a mixture thereof. Can be respectively generated. By adding at least one sugar chain in which the cyclodextrin has been opened, DIMS or a mixture thereof, N-SIMA or a mixture thereof can be produced. The sugar chain opened by cyclodextrin can be further added to the non-reducing terminal of DIMS or N-SIMA in which the anchor sugar chain has already been added to the non-reducing terminal. The degree of polymerization of the non-reducing terminal anchor sugar chain changes depending on the degree of multiple addition of the sugar chain opened by cyclodextrin. The degree of polymerization of the anchor sugar chain at the non-reducing end also changes depending on the type of cyclodextrin used as a raw material. When the cyclodextrin is a mixture of a plurality of cyclodextrins, the degree of polymerization is determined by two degrees of polymerization: a degree of polymerization determined by the type of cyclodextrin, and a degree of polymerization determined by the degree of multiple addition of a sugar chain opened by cyclodextrin.
CGTaseを用いる場合は、CGTaseの至適ｐＨ及び至適温度を考慮して、例えば、ｐＨ５〜６を含む安定域の範囲、温度３０〜６０℃の範囲、好ましくは４０〜６０℃で、Ｒ−ＳＩＭＳに対するシクロデキストリンのモル比を例えば１〜１０倍（例として、Ｒ−ＳＩＭＳを０．０１〜０．１ｍｏｌ／Ｌ）を含有する水溶液中で１〜１２時間、好ましくは１〜６時間反応させることで実施できる。
Ｒ−ＳＩＭＳに対してモル比で１〜１０倍のシクロデキストリン（例えば、Ｒ−ＳＩＭＳを０．０１〜０．１ｍｏｌ／Ｌ）を含有する水溶液中で１〜１２時間、好ましくは１〜６時間経過させることで実施できる。
When using CGTase, considering the optimal pH and optimal temperature of CGTase, for example, a range of a stable range including pH 5 to 6, a temperature of 30 to 60 ° C., preferably 40 to 60 ° C. The reaction is performed for 1 to 12 hours, preferably 1 to 6 hours in an aqueous solution containing a molar ratio of cyclodextrin to SIMS of, for example, 1 to 10 times (for example, 0.01 to 0.1 mol / L of R-SIMS). Can be implemented.
1 to 12 hours, preferably 1 to 6 hours in an aqueous solution containing 1 to 10 times the molar ratio of cyclodextrin to R-SIMS (for example, 0.01 to 0.1 mol / L of R-SIMS). It can be implemented by passing.
シクロデキストリン以外の糖供与体基質の例としては、オリゴ糖（例えば、スクロース又はマルトオリゴ糖）又は多糖（例えば、澱粉）などを用いることができる。糖供与体基質として、オリゴ糖（例えば、スクロース又はマルトオリゴ糖）又は多糖（例えば、澱粉）などを用いる場合には、糖質転移酵素としては、α−グルコシダーゼ、Ｄ−酵素（不均一化酵素）、アミラーゼ及びアミロスクラーゼから成る群から選ばれる少なくとも1種の酵素及びCGTaseを用いることができる。これらの場合の反応も、用いる糖供与体基質の種類と、糖質転移酵素の種類を考慮して適宜決定することができる。 Examples of sugar donor substrates other than cyclodextrin include oligosaccharides (eg, sucrose or maltooligosaccharides) and polysaccharides (eg, starch). When an oligosaccharide (eg, sucrose or maltooligosaccharide) or a polysaccharide (eg, starch) is used as the sugar donor substrate, α-glucosidase, D-enzyme (heterogeneous enzyme) may be used as the saccharyltransferase. , Amylase and amylosucrase, and at least one enzyme selected from the group consisting of CGTase and CGTase can be used. The reaction in these cases can also be appropriately determined in consideration of the type of the sugar donor substrate to be used and the type of the glycosyltransferase.
＜水難溶性化合物の水溶液製造方法＞
本発明は、水難溶性化合物の水溶液を製造する方法を包含する。この方法は、水難溶性化合物と本発明の（ｉ）ＤＩＭＳ若しくはその混合物、（ｉｉ）Ｎ−ＳＩＭＳ若しくはその混合物、又は（ｉｉｉ）少なくとも１種のＤＩＭＳ及び少なくとも１種のＮ−ＳＩＭＳの混合物、とを水又は水を含有する溶媒中で混合することを含む。上記（ｉ）〜（ｉｉｉ）のアンカー型イソマルトメガロ糖類を以下Ａ−ＩＭＳ類と称する。
<Method for producing aqueous solution of poorly water-soluble compound>
The present invention includes a method for producing an aqueous solution of a poorly water-soluble compound. The method comprises the steps of: providing a poorly water-soluble compound and (i) DIMS or a mixture thereof, (ii) N-SIMS or a mixture thereof, or (iii) a mixture of at least one DIMS and at least one N-SIMS of the present invention. In water or a solvent containing water. The anchor-type isomalt megalosaccharides (i) to (iii) above are hereinafter referred to as A-IMSs.
水難溶性化合物は、水や水を含有する溶媒（例えば、緩衝液や細胞培養液等）に対する溶解性が低い化合物であれば制限はない。水難溶性化合物は、例えば、ＢＣＳクラス２に分類される化合物であることができる。ＢＣＳとは、Biopharmaceutics Classification Systemの略語であり、医薬品の有効成分と成り得る化合物の溶解性と膜透過性のそれぞれの高低に応じてクラス分けを行い、各クラスに対応した化合物の生体吸収特性を整理する方法である。ＢＣＳクラス２は、低い溶解性と高い膜透過性を有する化合物が分類されるクラスである。化合物の溶解性に関しては、DMSO析出法及びShake flask法による評価が知られている。化合物の膜透過性に関しては、人工膜を用いた方法や培養細胞を用いた透過性評価が知られている。本発明において、溶解の対象とする水難溶性化合物がＢＣＳクラス２に属するか否かを判断するための評価方法は、特に制限はない。また、ＢＣＳクラス２に分類されない化合物であっても、水に対する溶解性の低い化合物は、本発明においては、水難溶性化合物として本発明のＡ−ＩＭＳ類を用いる水溶液の製造に用いることができる。 The poorly water-soluble compound is not limited as long as it has low solubility in water or a solvent containing water (for example, a buffer solution or a cell culture solution). The poorly water-soluble compound can be, for example, a compound classified into BCS class 2. BCS is an abbreviation of Biopharmaceutics Classification System, which classifies compounds that can be active ingredients of pharmaceuticals according to their solubility and membrane permeability to determine the bioabsorption characteristics of the compounds corresponding to each class. How to organize. BCS class 2 is a class in which compounds having low solubility and high membrane permeability are classified. With respect to the solubility of the compound, evaluation by a DMSO precipitation method and a shake flask method is known. As for the membrane permeability of a compound, a method using an artificial membrane and a permeability evaluation using cultured cells are known. In the present invention, there is no particular limitation on an evaluation method for determining whether or not a poorly water-soluble compound to be dissolved belongs to BCS class 2. In addition, in the present invention, compounds that are not classified into BCS class 2 and have low solubility in water can be used in the production of an aqueous solution using the A-IMS of the present invention as a poorly water-soluble compound.
使用する本発明のＡ−ＩＭＳ類は、水難溶性化合物の種類に応じて適宜決定することができる。使用するＡ−ＩＭＳ類を決定するに当たっては、事前に、水溶液化したい水難溶性化合物に対する、本発明のＡ−ＩＭＳ類の可溶化能力を試験することもできる。例えば、ＤＩＭＳの水難溶性化合物に対する可溶化能力は、イソマルトメガロ糖鎖の重合度、２つのアンカー糖鎖のそれぞれの重合度により変化する。また、ＤＩＭＳの混合物を用いる場合には、混合物に含まれるＤＩＭＳの種類（イソマルトメガロ糖鎖の重合度、２つのアンカー糖鎖のそれぞれの重合度により変化）及び含まれるＤＩＭＳの組成比により、水難溶性化合物に対する可溶化能力は変化し得る。Ｎ−ＳＩＭＳの水難溶性化合物に対する可溶化能力は、イソマルトメガロ糖鎖の重合度、アンカー糖鎖の重合度により変化する。また、Ｎ−ＳＩＭＳの混合物を用いる場合には、混合物に含まれるＮ−ＳＩＭＳの種類（イソマルトメガロ糖鎖の重合度、アンカー糖鎖の重合度により変化）及び含まれるＮ−ＳＩＭＳの組成比により、水難溶性化合物に対する可溶化能力は変化し得る。ＤＩＭＳ及びＮ−ＳＩＭＳの混合物については、ＤＩＭＳ及びＮ−ＳＩＭＳの種類や組成比等により水難溶性化合物に対する可溶化能力は変化し得る。 The A-IMS of the present invention to be used can be appropriately determined depending on the type of the poorly water-soluble compound. In determining the A-IMS to be used, the ability of the A-IMS of the present invention to solubilize a poorly water-soluble compound to be made into an aqueous solution can be tested in advance. For example, the ability of DIMS to solubilize poorly water-soluble compounds varies depending on the degree of polymerization of the isomaltomegalo sugar chain and the degree of polymerization of each of the two anchor sugar chains. When a mixture of DIMS is used, the type of DIMS contained in the mixture (changes depending on the degree of polymerization of the isomaltomegalo sugar chain and the degree of polymerization of each of the two anchor sugar chains) and the composition ratio of the contained DIMS are as follows: The solubilizing capacity for poorly water-soluble compounds can vary. The ability of N-SIMS to solubilize poorly water-soluble compounds varies depending on the degree of polymerization of the isomaltomegalo sugar chain and the degree of polymerization of the anchor sugar chain. When a mixture of N-SIMS is used, the type of N-SIMS contained in the mixture (changes depending on the degree of polymerization of isomalt-megalo sugar chains and the degree of polymerization of anchor sugar chains) and the composition ratio of N-SIMS contained therein Thus, the solubilizing ability for a poorly water-soluble compound may change. For a mixture of DIMS and N-SIMS, the solubilizing ability for a poorly water-soluble compound may vary depending on the type, composition ratio, and the like of DIMS and N-SIMS.
例えば、水難溶性化合物であるケルセチン配糖体と、ＤＩＭＳの還元末端及び非還元末端のアンカー糖鎖の重合度の違いによる溶解性の変化を以下の表に示す。具体的な実験方法及び条件は実施例４に示す。下記の表は、還元末端のアンカー糖鎖の重合度を一定で、非還元末端のアンカー糖鎖の重合度を変化させると、非還元末端のアンカー糖鎖の重合度が大きくなることで、ケルセチン配糖体（表ではQ3G）の溶解性が増すことが分かる。 For example, the following table shows the change in solubility due to the difference in the degree of polymerization between quercetin glycoside, which is a poorly water-soluble compound, and the anchor sugar chains at the reducing end and the non-reducing end of DIMS. Specific experimental methods and conditions are shown in Example 4. The following table shows that when the degree of polymerization of the anchor sugar chain at the reducing end is constant and the degree of polymerization of the anchor sugar chain at the non-reducing end is changed, the degree of polymerization of the anchor sugar chain at the non-reducing end increases. It can be seen that the solubility of the glycoside (Q3G in the table) increases.
水を含有する溶媒は、水及び少なくとも1種の物質を含有する溶媒であり、前記物質の種類や濃度等には特に制限はない。例えば、無機塩、有機酸塩、あるいは緩衝剤、さらには有機溶媒から成る溶媒等も挙げることができる。また、前記有機溶媒は可食性有機溶媒であることができる。可食性有機溶媒は、例えば、エタノール、酢酸、乳酸等であることができる。 The solvent containing water is a solvent containing water and at least one substance, and there is no particular limitation on the type and concentration of the substance. For example, an inorganic salt, an organic acid salt, a buffer, and a solvent composed of an organic solvent can be used. In addition, the organic solvent may be an edible organic solvent. The edible organic solvent can be, for example, ethanol, acetic acid, lactic acid, and the like.
本発明の方法は、水難溶性化合物を、この化合物の融点以上に加熱すること、及び加熱溶解した水難溶性化合物を、Ａ−ＩＭＳ類を含有する溶媒と混合すること、を含むことができる。加熱溶解した水難溶性化合物を、Ａ−ＩＭＳ類を含有する溶媒と混合することで、水難溶性化合物の溶解を促進することができる。但し、加熱溶解した水難溶性化合物を用いるか否かは化合物の種類に応じて適宜選択できる。全ての操作を常温で実施することもできる。 The method of the present invention can include heating the poorly water-soluble compound to a temperature equal to or higher than the melting point of the compound, and mixing the heat-dissolved poorly water-soluble compound with a solvent containing A-IMS. The dissolution of the poorly water-soluble compound can be promoted by mixing the heat-dissolved poorly water-soluble compound with a solvent containing A-IMSs. However, whether or not to use the hardly water-soluble compound dissolved by heating can be appropriately selected depending on the type of the compound. All operations can be performed at room temperature.
＜溶解促進剤＞
本発明は、前記本発明のＡ−ＩＭＳ類を含有する、水難溶性化合物を水溶液化するための溶解促進剤を包含する。Ａ−ＩＭＳ類は前述のとおりである。水難溶性化合物は、例えば、ＢＣＳクラス２に分類される化合物であるが、それに限定される意図ではない。本発明の溶解促進剤は、例えば、上記本発明の水難溶性化合物の水溶液の製造方法で説明した方法で使用できる。
<Dissolution accelerator>
The present invention includes a dissolution promoter for converting the poorly water-soluble compound into an aqueous solution, containing the A-IMS of the present invention. A-IMSs are as described above. The poorly water-soluble compound is, for example, a compound classified into BCS class 2, but is not intended to be limited thereto. The dissolution promoter of the present invention can be used, for example, by the method described in the method for producing an aqueous solution of a poorly water-soluble compound of the present invention.
＜組成物＞
本発明は、水難溶性化合物、及び本発明のＡ−ＩＭＳ類を含む組成物を包含する。水難溶性化合物は、上記製造方法での説明と同義であり、本発明のＡ−ＩＭＳ類は、前述の本発明のＡ−ＩＭＳ類の説明と同義である。
<Composition>
The present invention includes a composition comprising the poorly water-soluble compound and the A-IMS of the present invention. The poorly water-soluble compound has the same meaning as described in the above production method, and the A-IMS of the present invention has the same meaning as that of the above-described A-IMS of the present invention.
本発明の組成物は、溶媒をさらに含むことができる。溶媒は、例えば、水又は水及び少なくとも1種の物質を含有する溶媒であることができ、前記本発明の水難溶性化合物の水溶液の製造方法で説明した、水及び少なくとも1種の物質を含有する溶媒と同義である。溶媒の種類及び使用量は、本発明の組成物の使用目的に応じて適宜選択することができる。 The composition of the present invention may further include a solvent. The solvent can be, for example, water or a solvent containing water and at least one substance, and contains water and at least one substance as described in the method for producing an aqueous solution of a poorly water-soluble compound of the present invention. Synonymous with solvent. The type and amount of the solvent can be appropriately selected according to the purpose of use of the composition of the present invention.
本発明の組成物は、水難溶性化合物が薬効成分であり、前記組成物は有効量の前記水難溶性化合物を含有する医薬用組成物であることができる。 In the composition of the present invention, the poorly water-soluble compound is a medicinal ingredient, and the composition may be a pharmaceutical composition containing an effective amount of the poorly water-soluble compound.
本発明の組成物は、水難溶性化合物が飲食品用成分であり、前記組成物は飲食品用組成物又は飲食品用原料組成物であることができる。 In the composition of the present invention, the poorly water-soluble compound is a component for food and drink, and the composition may be a composition for food and drink or a raw material composition for food and drink.
本発明の組成物における、本発明のＡ−ＩＭＳ類の種類及び濃度、水難溶性化合物の種類及び濃度は、本発明の組成物の使用目的に応じて適宜選択することができる。 In the composition of the present invention, the type and concentration of the A-IMS of the present invention and the type and concentration of the poorly water-soluble compound can be appropriately selected according to the intended use of the composition of the present invention.
以下、本発明を実施例に基づいて更に詳細に説明する。但し、実施例は本発明の例示であって、本発明は実施例に限定される意図ではない。 Hereinafter, the present invention will be described in more detail based on examples. However, the embodiments are merely examples of the present invention, and the present invention is not intended to be limited to the embodiments.
実施例１
ダブルアンカー型イソマルトメガロ糖（ＤＩＭＳ）の合成
最初にシングルアンカー体を調製し、それにα-1,4グルコース鎖を付加させることでダブルアンカー体を作製した。まず、シングルアンカー体の調製について述べるが、その生産をGluconobacter oxydans ATCC 11894が産するデキストリンデキストラナーゼ（DDaseと略称; EC 2.4.1.2）を用いて行った。
Example 1
Synthesis of Double Anchor Isomaltomegalosugar (DIMS) First, a single anchor was prepared, and an α-1,4 glucose chain was added thereto to prepare a double anchor. First, the preparation of a single anchor is described. Production was performed using dextrin dextranase (abbreviated as DDase; EC 2.4.1.2) produced by Gluconobacter oxydans ATCC 11894.
（１）菌体からのDDase：
本菌を5%フラクトースと0.5%酵母エキスからなる培地（pH 5.95；合計1 L）中で30℃、2日間震盪培養した（600 nmの吸収から求めた濁度は約2）。菌体を遠心分離（11,300 xg、4℃、20分間）で回収し、50 mLの25 mM酢酸ナトリウム緩衝液（pH 4.2）で洗浄した。菌体に結合したDDaseの遊離を1% マルトトリオース（日本食品化工（株）、東京）による処理で行い [50 mLの25 mM 酢酸ナトリウム緩衝液（pH 4.2)；30℃；3時間で200 rpmの撹拌]、遠心分離（11,300 xg、4℃、20分間）でDDaseを回収した。
(1) DDase from cells:
This bacterium was cultured with shaking at 30 ° C. for 2 days in a medium (pH 5.95; total 1 L) containing 5% fructose and 0.5% yeast extract (turbidity determined from absorption at 600 nm was about 2). The cells were collected by centrifugation (11,300 × g, 4 ° C., 20 minutes) and washed with 50 mL of 25 mM sodium acetate buffer (pH 4.2). Release of DDase bound to the cells was performed by treatment with 1% maltotriose (Nippon Shokuhin Kako Co., Ltd., Tokyo) [50 mL of 25 mM sodium acetate buffer (pH 4.2); rpmase] and centrifugation (11,300 xg, 4 ° C, 20 minutes) to collect DDase.
（２）還元末端のアンカー部分が長いシングルアンカー体：
次にアンカー部分が長いシングルアンカー体（Single-と表記）の調製方法を説明する。前項で得られた酵素液 [50 mL；25 mM 酢酸ナトリウム緩衝液（pH 4.2)] を当該シングルアンカー体の調製に用いた。反応液の組成は、200 mM マルトヘキサオースとマルトへプタオースからなる糖質 [G6/G7と略称；日本食品化工（株）、東京]、25 mM酢酸ナトリウム緩衝液（pH 4.2）およびDDase（1.5 U/mL；酵素単位Uの定義は下記の＊を参照）であり、45℃で4〜5日間の撹拌反応（100 rpm）で行った。100℃で20分間の加熱処理で反応を停止させ、加熱変性した酵素蛋白を遠心分離（5,800 xg、4℃、20分間）で除いた。 Next, a method of preparing a single anchor body having a long anchor portion (described as Single-) will be described. The enzyme solution obtained in the previous section [50 mL; 25 mM sodium acetate buffer (pH 4.2)] was used for preparing the single anchor. The composition of the reaction solution was a saccharide consisting of 200 mM maltohexaose and maltoheptaose [abbreviated as G6 / G7; Nippon Shokuhin Kako Co., Ltd., Tokyo], 25 mM sodium acetate buffer (pH 4.2) and DDase (1.5 U / mL; the definition of the enzyme unit U is shown in * below), and the reaction was carried out at 45 ° C. by a stirring reaction (100 rpm) for 4 to 5 days. The reaction was stopped by heat treatment at 100 ° C. for 20 minutes, and the heat-denatured enzyme protein was removed by centrifugation (5,800 × g, 4 ° C., 20 minutes).
＊酵素活性（1 U）は、DDaseが15 mMマルトテトラオースに作用し [25 mM酢酸ナトリウム緩衝液（pH 4.2）；35℃；80μLの反応液]、その不均一化反応で1分間に1μmol のマルトトリオースを遊離させる酵素量とした。 * Enzyme activity (1 U) is determined by DDase acting on 15 mM maltotetraose [25 mM sodium acetate buffer (pH 4.2); 35 ° C; 80 µL reaction solution], and 1 µmol / min in the heterogeneous reaction. The amount of the enzyme to release maltotriose was determined.
反応液にメタノールを加え終濃度40%とし、副生成する多糖のデキストランを4℃で30分間の静置と遠心分離（13,000 xg、4℃、10分間）で除いた。上清にメタノールの追加で終濃度を90%とし、シングルアンカー体を沈殿回収した。すなわち、4℃で30分間の静置沈殿の後に遠心分離（13,000 xg、4℃、10分間）を行った。得られた沈殿に対し「少量の水による可溶化／90%メタノール添加／静置沈殿／遠心分離」を３回以上繰り返した。その後、さらに4℃に冷却した90%メタノールで沈殿を１回洗浄した。（90%メタノール分画の目的は、オリゴ糖や単糖の除去である）以上のアルコール分画で単離したアンカー部分が長いシングルアンカー体を濃縮し、イオン交換樹脂（Amberlite MB-4；オルガノ（株）、東京）に供することで塩を除き、凍結乾燥した（粉末標品の調製）。 Methanol was added to the reaction solution to a final concentration of 40%, and the by-product polysaccharide dextran was removed by standing at 4 ° C for 30 minutes and centrifuging (13,000 xg, 4 ° C, 10 minutes). The final concentration was 90% by adding methanol to the supernatant, and the single anchor was recovered by precipitation. That is, centrifugation (13,000 × g, 4 ° C., 10 minutes) was performed after standing sedimentation at 4 ° C. for 30 minutes. To the obtained precipitate, "solubilization with a small amount of water / 90% methanol addition / static precipitation / centrifugation" was repeated three times or more. Thereafter, the precipitate was washed once with 90% methanol cooled to 4 ° C. (The purpose of 90% methanol fractionation is to remove oligosaccharides and monosaccharides.) Concentrate a single anchor with a long anchor part isolated by the above alcohol fractionation and ion-exchange resin (Amberlite MB-4; organo Co., Ltd., Tokyo) to remove the salt and freeze-dry (preparation of powder preparation).
得られたアンカー部分が長いシングルアンカー体（Single-）の構造式は前記の通りである。アノメリック プロトンのNMRシグナルを図１に示す。図中、H1(→4)、H1(→6)、H1αおよびH1βは、α１−4およびα１−６結合したグルコース残基と還元末端グルコースのα-アノマーとβ-アノマーのアノメリック プロトンをそれぞれ示す。試料は、α１−６結合部分の平均重合度が11の長鎖シングルアンカー体である。 The structural formula of the obtained single anchor body having a long anchor portion (Single-) is as described above. The NMR signal of the anomeric proton is shown in FIG. In the figure, H1 (→ 4), H1 (→ 6), H1α and H1β indicate the anomeric protons of α-anomer and β-anomer of α1-4 and α1-6-linked glucose residues and reducing terminal glucose, respectively. . The sample is a long-chain single anchor having an average degree of polymerization of the α1-6 binding moiety of 11.
（３）還元末端のアンカー部分が短いシングルアンカー体：
次に、アンカー部分が短いシングルアンカー体（Single+と表記）の調製を述べる。製法は「アンカー部分が長いシングルアンカー体にα-アミラーゼを作用させ、アンカー部分の切断」により作製した。反応液の組成は、25%アンカー部分が長いシングルアンカー体、50 mM マレイン酸ナトリウム緩衝液（pH 6.9)、0.5%ブタ膵臓α-アミラーゼ（タイプI-A；Sigma-Aldrich Chemie Gmbh., Steinheim, Germany）、0.01% CaCl2であり、37℃で一晩の反応を行った。α-アミラーゼは100℃で10分間の加熱処理で失活させ、遠心分離（5,800 xg、4℃、20分間）で除いた。目的のアンカー部分が短いシングルアンカー体の精製（切断したアンカー部分との分離）は、前項で述べた90%メタノール分画の手法で行った。本糖の粉末標品は、凍結乾燥により調製した。 Next, preparation of a single anchor body having a short anchor portion (denoted as Single +) will be described. The production method was prepared by “cutting the anchor portion by applying α-amylase to a single anchor having a long anchor portion”. The composition of the reaction solution was a single anchor having a long 25% anchor portion, 50 mM sodium maleate buffer (pH 6.9), 0.5% porcine pancreatic α-amylase (type IA; Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Steinheim, Germany). , 0.01% CaCl 2 and reacted at 37 ° C. overnight. α-Amylase was inactivated by heating at 100 ° C. for 10 minutes, and removed by centrifugation (5,800 × g, 4 ° C., 20 minutes). Purification of the single anchor having a short anchor portion (separation from the cut anchor portion) was carried out by the 90% methanol fractionation technique described in the preceding section. A powder preparation of the present sugar was prepared by freeze-drying.
得られたアンカー部分が短いシングルアンカー体（Single+）の構造式は前記の通りである。アノメリック プロトンのNMRシグナルを図２に示す。H1(→4)、H1(→6)、H1αおよびH1βは、α１−4およびα１−６結合したグルコース残基と還元末端グルコースのα-アノマーとβ-アノマーのアノメリック プロトンをそれぞれ示す。 試料は、α１−６結合部分の平均重合度が11の短鎖シングルアンカー体である。 The structural formula of the obtained single anchor body having a short anchor portion (Single +) is as described above. The NMR signal of the anomeric proton is shown in FIG. H1 (→ 4), H1 (→ 6), H1α and H1β indicate the anomeric protons of α1- and α1-6-linked glucose residues and α-anomers and β-anomers of reducing terminal glucose, respectively. The sample is a short-chain single anchor having an average degree of polymerization of the α1-6 binding moiety of 11.
（４）ダブルアンカー体：
ダブルアンカー体は、アンカー部分が短鎖あるいは長鎖のシングルアンカー体にCGTase（天野エンザイム、名古屋）が触媒する糖転移反応を用いて作製した。
(4) Double anchor body:
The double anchor was prepared by using a single anchor having a short or long anchor moiety by a sugar transfer reaction catalyzed by CGTase (Amano Enzyme, Nagoya).
黒丸はα１-６結合で連結するグルコピラノース残基を示す。
白丸はα１-４結合で連結するグルコピラノース残基を示す。
斜線を付した白丸は還元末端のグルコピラノース残基を示す。
Black circles indicate glucopyranose residues linked by α1-6 bonds.
Open circles indicate glucopyranose residues linked by α1-4 bonds.
Open circles with diagonal lines indicate glucopyranose residues at the reducing end.
反応液の組成は、200 mM α-シクロデキストリン（αCDと略称；和光純薬工業（株）、大阪）、40 mMアンカー部分が短鎖あるいは長鎖のシングルアンカー体、50 mM酢酸ナトリウム緩衝液（pH 5.5）および1.74 U/mLのCGTaseであり、55℃で1時間あるいは4時間の反応を行った。100℃で20分間の加熱で反応停止させた。未反応のシングルアンカー体はデキストラングルコシダーゼ [α-1,6グルコシド結合のみを切断するエキソ型酵素；0.5 U/mL；50 mM酢酸ナトリウム緩衝液（pH 5.3）；37℃；一晩]の処理で分解させ、上記と同様の加熱処理で反応を停止した。αCD・オリゴ糖・単糖の除去をゲル濾過法および分画分子量サイズ8,000のセルロース膜（Spectrum Laboratories, Inc., Rancho Dominguez, CA, USA）を用いた透析（純水に対し）により行った。凍結乾燥により粉末標品を得た。なお、CGTaseの1時間反応でゲル濾過法分離のダブルアンカー体（合計平均重合度２６）はフラボノイド可溶化実験に用い、CGTase 4時間反応でセルロース膜分画のダブルアンカー体（合計平均重合度６２）はイブプロフェン可溶化実験に使用した。 The composition of the reaction solution was 200 mM α-cyclodextrin (abbreviated as αCD; Wako Pure Chemical Industries, Ltd., Osaka), a single anchor having a short or long chain of 40 mM anchor, a 50 mM sodium acetate buffer ( pH 5.5) and 1.74 U / mL CGTase, and reacted at 55 ° C for 1 hour or 4 hours. The reaction was stopped by heating at 100 ° C. for 20 minutes. The unreacted single anchor is treated with dextran glucosidase [an exo-type enzyme that cleaves only α-1,6 glucosidic bond; 0.5 U / mL; 50 mM sodium acetate buffer (pH 5.3); 37 ° C .; overnight]. It was decomposed and the reaction was stopped by the same heat treatment as above. The αCD / oligosaccharide / monosaccharide was removed by gel filtration and dialysis (based on pure water) using a cellulose membrane having a molecular weight cut off of 8,000 (Spectrum Laboratories, Inc., Rancho Dominguez, CA, USA). A powder preparation was obtained by freeze-drying. In addition, the double anchored body (total average degree of polymerization of 26) obtained by the gel filtration method in the reaction with CGTase for 1 hour was used for the flavonoid solubilization experiment, and the double anchored body of the cellulose membrane fraction (total average degree of polymerization of 62) was reacted with CGTase for 4 hours. ) Was used for the ibuprofen solubilization experiment.
得られたダブルアンカー体（合計平均重合度２６：フラボノイド可溶化実験に使用）の構造式は以下の通りである。アノメリック プロトンのNMRシグナルを図３に示す。H1(→4)、H1(→6)、H1αおよびH1βは、α１−4およびα１−６ 結合したグルコース残基と還元末端グルコースのα-アノマーとβ-アノマーのアノメリック プロトンをそれぞれ示す。 The structural formula of the obtained double anchor body (total average degree of polymerization 26: used in the flavonoid solubilization experiment) is as follows. The NMR signal of the anomeric proton is shown in FIG. H1 (→ 4), H1 (→ 6), H1α and H1β indicate the anomeric protons of α1- and α1-6-linked glucose residues and α-anomers and β-anomers of reducing terminal glucose, respectively.
得られたダブルアンカー体（合計平均重合度６２：イブプロフェン可溶化実験に使用）の構造式は以下の通りである。アノメリック プロトンのNMRシグナルを図４に示す。H1(→4)、H1(→6)、H1αおよびH1βは、α１−4およびα１−６ 結合したグルコース残基と還元末端グルコースのα-アノマーとβ-アノマーのアノメリック プロトンをそれぞれ示す。 The structural formula of the obtained double anchor body (total average degree of polymerization 62: used for ibuprofen solubilization experiment) is as follows. FIG. 4 shows the NMR signal of the anomeric proton. H1 (→ 4), H1 (→ 6), H1α and H1β indicate the anomeric protons of α1- and α1-6-linked glucose residues and α-anomers and β-anomers of reducing terminal glucose, respectively.
実施例２
（１）非還元末端シングルアンカー型イソマルトメガロ糖（N-SIMS）の製造方法
(1) Method for producing non-reducing terminal single anchor type isomaltomegalosaccharide (N-SIMS)
白丸はα１-４結合で連結するグルコピラノース残基を、
斜線を付した黒丸は還元末端のグルコピラノース残基を示す。(以下同様)
Open circles represent glucopyranose residues linked by α1-4 bonds,
Shaded black circles indicate glucopyranose residues at the reducing end. (The same applies hereinafter)
反応液の組成は、100 mM α-シクロデキストリン（αCD; 和光純薬工業（株）、大阪）、20 mMイソマルトメガロ糖（平均重合度7、19および32（Pharmacosmos, Holbaek, Denmark）あるいは平均重合度53（Amersham Biosciences AB, Uppsala, Sweden））、50 mM酢酸ナトリウム緩衝液（pH 6.0）および1.74 U/mLのCGTaseであり、20℃で３時間の反応を行った。100℃で20分間の加熱で反応停止させた。未反応のイソマルトメガロ糖はデキストラングルコシダーゼ（α-1,6グルコシド結合のみを切断するエキソ型酵素; 6.25 U/mL; 50 mM酢酸ナトリウム緩衝液（pH 5.3）; 37℃; 一晩）の処理で分解させ、100℃で10分間の加熱処理で反応を停止した。熱変性した酵素蛋白質を遠心分離（12,000 x g, 4℃で20分）で除いた。N-SIMSからのαCD・オリゴ糖・単糖の分離を90%エタノール分画（２回）および透析（分画分子量サイズ2,000のセルロース膜（Spectrum Laboratories, Inc., Rancho Dominguez, CA, USA））により行った。イオン交換樹脂処理（MB4; オルガノ、東京）で塩を除き、凍結乾燥により粉末標品を得た。 The composition of the reaction solution was 100 mM α-cyclodextrin (αCD; Wako Pure Chemical Industries, Ltd., Osaka), 20 mM isomaltomegalosaccharide (average degree of polymerization 7, 19 and 32 (Pharmacosmos, Holbaek, Denmark) or average). The polymerization degree was 53 (Amersham Biosciences AB, Uppsala, Sweden)), 50 mM sodium acetate buffer (pH 6.0) and 1.74 U / mL CGTase, and the reaction was performed at 20 ° C. for 3 hours. The reaction was stopped by heating at 100 ° C. for 20 minutes. Unreacted isomaltomegalosaccharide is treated with dextran glucosidase (an exo-type enzyme that cleaves only α-1,6 glucoside bond; 6.25 U / mL; 50 mM sodium acetate buffer (pH 5.3); 37 ° C .; overnight) And the reaction was stopped by heat treatment at 100 ° C. for 10 minutes. The heat-denatured enzyme protein was removed by centrifugation (12,000 × g, 20 minutes at 4 ° C.). Separation of αCD / oligosaccharide / monosaccharide from N-SIMS by 90% ethanol fractionation (twice) and dialysis (cellulose membrane with a cut-off molecular weight of 2,000 (Spectrum Laboratories, Inc., Rancho Dominguez, CA, USA)) Was performed. The salt was removed by ion exchange resin treatment (MB4; Organo, Tokyo) and freeze-dried to obtain a powder sample.
（２）構造解析
CGTaseの受容体基質に使用した４種類のイソマルトメガロ糖（平均重合度7、19、32および53）をNMR分析に供すると、α１−６結合のみが存在した。一方、N-SIMSには２２〜２５残基のα１−４グルコシド糖鎖が見出され、β-アミラーゼの消化実験も本糖鎖が非還元末端に位置することを支持した。得られた４種類のN-SIMSのNMRシグナルを示す（図５-１〜図５-４）。なお、平均重合度7、19、32および53のイソマルトメガロ糖から得られたN-SIMSの非還元末端アンカー重合度（平均値）はそれぞれ25、24、24および22であった。各々をN-SIMS(25-7)、N-SIMS(24-19)、N-SIMS(24-32)およびN-SIMS(22-53)と称する。
(2) Structural analysis
NMR analysis of the four isomaltomegalosaccharides (average degrees of polymerization 7, 19, 32 and 53) used as CGTase acceptor substrates revealed that only α1-6 linkages were present. On the other hand, an α1-4 glucoside sugar chain of 22 to 25 residues was found in N-SIMS, and the digestion experiment of β-amylase also supported that the present sugar chain was located at the non-reducing end. The NMR signals of the obtained four types of N-SIMS are shown (FIGS. 5-1 to 5-4). The non-reducing terminal anchor polymerization degrees (average values) of N-SIMS obtained from the isomaltomegalosaccharide having an average polymerization degree of 7, 19, 32 and 53 were 25, 24, 24 and 22, respectively. These are referred to as N-SIMS (25-7), N-SIMS (24-19), N-SIMS (24-32), and N-SIMS (22-53).
図５-１中、H1(→4)、H1(→6)、H1αおよびH1βは、α１−4およびα１−６結合したグルコース残基と還元末端グルコースのα-アノマーとβ-アノマーのアノメリック プロトンをそれぞれ示す。 試料は、α１−６結合部分の平均重合度７および非還元末端α１−４結合部分の平均重合度25のシングルアンカー体である。 In FIG. 5A, H1 (→ 4), H1 (→ 6), H1α and H1β are anomeric protons of α-anomer of α1-4 and α1-6 linked glucose residues and α-anomer of reducing terminal glucose and β-anomer. Are respectively shown. The sample is a single anchor having an average degree of polymerization of the α1-6 binding moiety of 7 and an average degree of polymerization of the non-reducing terminal α1-4 binding moiety of 25.
図５-２中、H1(→4)、H1(→6)、H1αおよびH1βは、α１−4およびα１−６結合したグルコース残基と還元末端グルコースのα-アノマーとβ-アノマーのアノメリック プロトンをそれぞれ示す。試料は、α１−６結合部分の平均重合度19および非還元末端α１−４結合部分の平均重合度24のシングルアンカー体である。
In FIG. 5B, H1 (→ 4), H1 (→ 6), H1α and H1β are anomeric protons of α-anomers of α1-4 and α1-6-linked glucose residues and α-anomers of reducing terminal glucose and β-anomers. Are respectively shown. The sample is a single anchor having an average degree of polymerization of the α1-6 binding portion of 19 and an average degree of polymerization of the non-reducing terminal α1-4 binding portion of 24.
図５-３中、H1(→4)、H1(→6)、H1αおよびH1βは、α１−4およびα１−６結合したグルコース残基と還元末端グルコースのα-アノマーとβ-アノマーのアノメリック プロトンをそれぞれ示す。 試料は、α１−６結合部分の平均重合度32および非還元末端α１−４結合部分の平均重合度24のシングルアンカー体である。
In FIG. 5-3, H1 (→ 4), H1 (→ 6), H1α and H1β are anomeric protons of α-anomer of α1-4 and α1-6-linked glucose residues, α-anomer of reducing terminal glucose and β-anomer. Are respectively shown. The sample is a single anchor having an average degree of polymerization of the α1-6 binding moiety of 32 and an average degree of polymerization of the non-reducing terminal α1-4 binding moiety of 24.
図５-４中、H1(→4)、H1(→6)、H1αおよびH1βは、α１−4およびα１−６結合したグルコース残基と還元末端グルコースのα-アノマーとβ-アノマーのアノメリック プロトンをそれぞれ示す。試料は、α１−６結合部分の平均重合度53および非還元末端α１−４結合部分の平均重合度22のシングルアンカー体である。 In FIG. 5-4, H1 (→ 4), H1 (→ 6), H1α and H1β are the anomeric protons of the α-anomer of the glucose residue linked to α1-4 and α1-6 and the reducing terminal glucose and the β-anomer. Are respectively shown. The sample is a single anchor having an average degree of polymerization of the α1-6 binding portion of 53 and an average degree of polymerization of the non-reducing terminal α1-4 binding portion of 22.
実施例３
フラボノイド可溶化試験法
(1) 終濃度0, 5, 10, 20 mMのアンカー型メガロ糖（実施例１で調製）を100μLずつ分注
(2) フラボノイドは終濃度が1, 5, 10 mMとなるよう、MQ水を添加、
超音波洗浄機で5 min、超音波破砕で30 sec処理して懸濁
(3) メガロ糖100μLが入ったチューブに添加
(4) 37℃ 30 min incubation
(5) 遠心分離(20℃, 5 min, 9300 g), 上清回収
(6) 50％ MeOHで希釈し、LC-MSで測定
Example 3
Flavonoid solubilization test method
(1) Dispense 100 μL each of anchor-type megalosaccharide (prepared in Example 1) with final concentration of 0, 5, 10, 20 mM
(2) Add MQ water so that the final concentration of flavonoids becomes 1, 5, 10 mM,
Suspended by treating with ultrasonic cleaner for 5 min and sonication for 30 sec.
(3) Add to the tube containing 100 μL of megalosaccharide
(4) 37 ° C 30 min incubation
(5) Centrifugation (20 ° C, 5 min, 9300 g), supernatant collection
(6) Dilute with 50% MeOH and measure by LC-MS
ダブルアンカー型メガロ糖（実施例１で調製）
DP=12 (非還元側のα-1,4結合); DP=11 (α-1,6結合); DP=3 (還元側のα-1,4結合)。ゲル濾過法による単離、CGTase反応時間は1 hr。
シングルアンカー型メガロ糖(Sngle+)：DP=11 (α-1,6結合); DP=3 (還元側のα-1,4結合)。
Double anchor type megalo sugar (prepared in Example 1)
DP = 12 (α-1,4 bond on non-reducing side); DP = 11 (α-1,6 bond); DP = 3 (α-1,4 bond on reducing side). Isolation by gel filtration method, CGTase reaction time is 1 hr.
Single anchor megalosaccharide (Sngle +): DP = 11 (α-1,6 bond); DP = 3 (α-1,4 bond on reducing side).
可溶化を検討したフラボノイド 15種類
イソフラボン： Genistein-7-glucoside (Genistin)
Daidzein-7-glucoside (Daidzin)
Genistein*
Daidzein*
フラボン： Apigenin-7-glucoside
Luteolin-7-glucoside
フラボノール： Quercetin*
Quercetin-3-glucoside (Isoquercitrin)
Quercetin-4'-glucoside
Kaempferol-3-glucoside
Myricetin 3-rhamnoside (Myricitrin)
フラバノン： Naringenin-7-rhamnoglucoside (Naringin)
Hesperetin*
Hesperetin-7-rhamnoglucoside (Hesperidin)
スチルベン： Resveratrol*
* aglycone
Solubilized flavonoids 15 kinds of isoflavones: Genistein-7-glucoside (Genistin)
Daidzein-7-glucoside (Daidzin)
Genistein *
Daidzein *
Flavone: Apigenin-7-glucoside
Luteolin-7-glucoside
Flavonol: Quercetin *
Quercetin-3-glucoside (Isoquercitrin)
Quercetin-4'-glucoside
Kaempferol-3-glucoside
Myricetin 3-rhamnoside (Myricitrin)
Flavanone: Naringenin-7-rhamnoglucoside (Naringin)
Hesperetin *
Hesperetin-7-rhamnoglucoside (Hesperidin)
Stilbene: Resveratrol *
* aglycone
ダブルアンカー型直鎖イソマルトメガロ糖によるフラボノイド可溶化結果を図６−１〜６−６、並びに図７−１及び７−２に示す。図６−１〜６−６は、ダブルアンカー型直鎖イソマルトメガロ糖により、シングルアンカー型直鎖イソマルトメガロ糖に比べて、より強く可溶化されるフラボノイド類の例である。図７−１及び７−２は、ダブルアンカー型のみで可溶化されるフラボノイド類の例を示す。 The results of flavonoid solubilization by the double-anchor-type linear isomalt megalosaccharide are shown in FIGS. 6-1 to 6-6 and FIGS. 7-1 and 7-2. FIGS. 6-1 to 6-6 are examples of flavonoids that are more strongly solubilized by the double anchor type linear isomalt megalosaccharide than by the single anchor type linear isomalt megalosaccharide. FIGS. 7-1 and 7-2 show examples of flavonoids solubilized only by the double anchor type.
実施例４
イブプロフェン可溶化実験
(1) シングルアンカー体R-SIMA及びダブルアンカー体DIMS
シングルアンカー体R-SIMA（5.0 mM）やダブルアンカー体DIMS（5.0 mM）を含む水溶液を100℃で10分間予備加熱し、0.1 mLを過剰量の粉末イブプロフェン（1 mg；ナトリウム塩；融点は77℃；ナカライテスク（株）、京都）に加えた。その後、80℃で1時間保持し、4℃に冷却した。12,000 xg（4℃、10分間）の遠心分離を行い、難溶性のイブプロフェンを沈殿除去した。上清を回収し、イブプロフェンの溶解量を264 nmの吸収から求めた（吸光度測定における希釈は50 mM炭酸ナトリウム緩衝液 (pH 11)を用いて行った）。
Example 4
Ibuprofen solubilization experiment
(1) Single anchor R-SIMA and double anchor DIMS
An aqueous solution containing a single anchor R-SIMA (5.0 mM) or a double anchor DIMS (5.0 mM) is preheated at 100 ° C for 10 minutes, and 0.1 mL of an excess amount of powdered ibuprofen (1 mg; sodium salt; melting point is 77) ° C; Nacalai Tesque, Inc., Kyoto). Thereafter, the temperature was maintained at 80 ° C. for 1 hour and cooled to 4 ° C. Centrifugation at 12,000 × g (4 ° C., 10 minutes) was performed to remove the hardly soluble ibuprofen by precipitation. The supernatant was recovered, and the amount of ibuprofen dissolved was determined from the absorbance at 264 nm (the dilution in the absorbance measurement was performed using a 50 mM sodium carbonate buffer (pH 11)).
ダブルアンカー体： DP=42 (非還元側のα-1,4結合); DP=17 (α-1,6結合); DP=3 (還元側のα-1,4結合)。膜分離（分子量分画8,000）による単離、CGTase反応時間は4 hr。
シングルアンカー型メガロ糖(Sngle+)：DP=17 (α-1,6結合); DP=3 (還元側のα-1,4結合)。
Double anchor: DP = 42 (α-1,4 bond on non-reducing side); DP = 17 (α-1,6 bond); DP = 3 (α-1,4 bond on reducing side). Isolation by membrane separation (molecular weight fractionation 8,000), CGTase reaction time is 4 hr.
Single-anchor megalosaccharide (Sngle +): DP = 17 (α-1,6 bond); DP = 3 (α-1,4 bond on reducing side).
イブプロフェンの相溶解度の測定法を以下のスキームに示す。
各種メガロ糖（5.0 mM）によるイブプロフェンの相対溶解度を図８に示す。水のみに対するイブプロフェンの溶解度は0.82 mMである（コントロール値で、縦軸の1.0に相当）
A method for measuring the phase solubility of ibuprofen is shown in the following scheme.
FIG. 8 shows the relative solubility of ibuprofen with various megalosaccharides (5.0 mM). The solubility of ibuprofen in water only is 0.82 mM (control value, equivalent to 1.0 on the vertical axis)
(2) シングルアンカー体N-SIMA
イブプロフェン可溶化実験の方法は、(1)と同じである。但し、４種類のN-SIMS をそれぞれ１〜１０mMの範囲の濃度とした。可溶化結果を図９に示す。N-SIMS(32-24)が最も高い水溶化能を示し、その他はほぼ同じ値であった。
(2) Single anchor N-SIMA
The method of the ibuprofen solubilization experiment is the same as in (1). However, the concentrations of the four types of N-SIMS were each in the range of 1 to 10 mM. FIG. 9 shows the results of solubilization. N-SIMS (32-24) showed the highest water-solubilizing ability, and the other values were almost the same.
イブプロフェン可溶化実験(1)及び(2)の結果（イブプロフェン相対溶解度、メガロ糖:5.0 mM）のまとめを以下の表に示す。
イブプロフェン相対溶解度はDIMSが最も高く、次にN-SIMSであった。その相対溶解度はR-SIMS（表中Single-及びSingle+）を上回り、N-SIMSで3〜3.5倍及びDIMSで6〜7倍であった。 DIMS had the highest relative solubility of ibuprofen, followed by N-SIMS. The relative solubility exceeded that of R-SIMS (Single- and Single + in the table), and was 3-3.5 times for N-SIMS and 6-7 times for DIMS.
実施例６
実施例３と同様に、25mMアンカー型イソマルトメガロ糖(下記)と終濃度が10mM相当になるケルセチン配糖体を用いて、HPLC(UV吸収)で遠心上清中のケルセチン配糖体濃度を測定することでケルセチン配糖体の水可溶化を試験した。結果を以下の表に示す。
Example 6
In the same manner as in Example 3, the concentration of quercetin glycoside in the centrifugal supernatant was determined by HPLC (UV absorption) using 25 mM anchor-type isomaltomegalosaccharide (described below) and quercetin glycoside having a final concentration of 10 mM. The water solubilization of the quercetin glycoside was tested by measuring. The results are shown in the table below.
水難溶性化合物であるケルセチン配糖体と、ＤＩＭＳの還元末端及び非還元末端のアンカー糖鎖の重合度の違いによる溶解性の変化の結果を以下の表に示す。下記の表から、還元末端のアンカー糖鎖の重合度を一定で、非還元末端のアンカー糖鎖の重合度が大きくなることで、ケルセチン配糖体の溶解性が増すことが分かる。 The following table shows the results of changes in solubility of quercetin glycoside, which is a poorly water-soluble compound, and the degree of polymerization of anchor sugar chains at the reducing end and the non-reducing end of DIMS. From the following table, it can be seen that the solubility of the quercetin glycoside is increased by keeping the polymerization degree of the anchor sugar chain at the reducing end constant and increasing the polymerization degree of the anchor sugar chain at the non-reducing end.
本発明は、飲食品用成分や医薬品等の難溶解性化合物の溶解促進を必要とする分野に有用である。 INDUSTRIAL APPLICABILITY The present invention is useful in the field where it is necessary to promote the dissolution of poorly soluble compounds such as food and drink components and pharmaceuticals.
Claims (23)
前記イソマルトメガロ糖鎖は、α１−６結合で連結したグルコピラノースからなり、かつグルコピラノースの重合度が１０〜１００の範囲であり、
前記イソマルトメガロ糖鎖の還元末端側の前記アンカー糖鎖は、α１−４結合で連結したグルコピラノースからなり、かつグルコピラノースの重合度が２〜２０の範囲であり、
前記イソマルトメガロ糖鎖の非還元末端側の前記アンカー糖鎖は、α１−４結合で連結したグルコピラノースであり、かつグルコピラノースの重合度が１〜５０の範囲である、ＤＩＭＳ。 A double-anchored isomaltomegalosaccharide (hereinafter, referred to as DIMS) having anchor sugar chains at both ends of the isomaltmegalo sugar chain,
The isomalt megalo sugar chain is composed of glucopyranose linked by α1-6 bond, and the degree of polymerization of glucopyranose is in a range of 10 to 100,
The anchor sugar chain on the reducing end side of the isomalt megalo sugar chain is composed of glucopyranose linked by an α1-4 bond, and the degree of polymerization of glucopyranose is in the range of 2 to 20,
A DIMS, wherein the anchor sugar chain on the non-reducing terminal side of the isomalt megalo sugar chain is glucopyranose linked by an α1-4 bond, and the degree of polymerization of glucopyranose is in the range of 1 to 50.
前記イソマルトメガロ糖鎖は、α１−６結合で連結したグルコピラノースからなり、かつグルコピラノースの重合度が１０〜１００の範囲であり、かつ
前記アンカー糖鎖は、α１−４結合で連結したグルコピラノースであり、かつグルコピラノースの重合度が１〜１００の範囲である、Ｎ−ＳＩＭＳ。 A single anchor type isomalt megalosaccharide having an anchor sugar chain at a non-reducing end of the isomalt megalo sugar chain (hereinafter, referred to as N-SIMS),
The isomalt megalo sugar chain is composed of glucopyranose linked by an α1-6 bond, the degree of polymerization of glucopyranose is in the range of 10 to 100, and the anchor sugar chain is a glucopyranose linked by an α1-4 bond. N-SIMS which is pyranose and has a degree of polymerization of glucopyranose in the range of 1 to 100.
イソマルトメガロ糖鎖の還元末端にアンカー糖鎖を有するシングルアンカー型イソマルトメガロ糖（以下、Ｒ−ＳＩＭＳと称する）と、糖供与体基質とを、糖質の転移活性を示す酵素による糖転移反応に供して、ＤＩＭＳ又はその混合物を得る、
但し、前記Ｒ−ＳＩＭＳのイソマルトメガロ糖鎖は、α１−６結合で連結したグルコピラノースからなり、かつグルコピラノースの重合度が１０〜１００の範囲であり、
前記Ｒ−ＳＩＭＳの前記アンカー糖鎖は、α１−４結合で連結したグルコピラノースからなり、かつグルコピラノースの重合度が２〜２０の範囲である、
ことを含む方法。 A method for producing DIMS or a mixture thereof according to any one of claims 1 to 3,
Glycosyl transfer between a single anchor type isomalt megalosaccharide having an anchor sugar chain at the reducing end of the isomaltmegalo sugar chain (hereinafter, referred to as R-SIMS) and a sugar donor substrate by an enzyme having carbohydrate transfer activity Subjecting the reaction to DIMS or a mixture thereof,
However, the isomaltomegalo sugar chain of the R-SIMS is composed of glucopyranose linked by an α1-6 bond, and the degree of polymerization of glucopyranose is in the range of 10 to 100,
The anchor sugar chain of the R-SIMS is composed of glucopyranose linked by an α1-4 bond, and the degree of polymerization of glucopyranose is in the range of 2 to 20,
A method that includes:
イソマルトメガロ糖（以下、ＩＭＳと称する）と糖供与体基質とを、糖質の転移活性を示す酵素による糖転移反応に供して、Ｎ−ＳＩＭＳ又はその混合物を得る、
但し、前記ＩＭＳのイソマルトメガロ糖鎖は、α１−６結合で連結したグルコピラノースからなり、かつグルコピラノースの重合度が１０〜１００の範囲である、
ことを含む方法。 A method for producing N-SIMS or a mixture thereof according to any one of claims 4 to 6,
Isomaltomegalosaccharide (hereinafter, referred to as IMS) and a sugar donor substrate are subjected to a glycosyltransfer reaction with an enzyme exhibiting carbohydrate transfer activity to obtain N-SIMS or a mixture thereof.
However, the isomalt megalo sugar chain of the IMS is composed of glucopyranose linked by an α1-6 bond, and the degree of polymerization of glucopyranose is in a range of 10 to 100.
A method that includes:
但し、前記Ｒ−ＳＩＭＳのイソマルトメガロ糖鎖は、α１−６結合で連結したグルコピラノースからなり、かつグルコピラノースの重合度が１０〜１００の範囲であり、
前記Ｒ−ＳＩＭＳの前記アンカー糖鎖は、α１−４結合で連結したグルコピラノースからなり、かつグルコピラノースの重合度が２〜２０の範囲であり、
前記ＩＭＳのイソマルトメガロ糖鎖は、α１−６結合で連結したグルコピラノースからなり、かつグルコピラノースの重合度が１０〜１００の範囲である、
ことを含む方法。 A process for producing a mixture of at least one DIMS according to any one of claims 1 to 3 and at least one N-SIMS according to any one of claims 4 to 6, SIMS and IMS and a sugar donor substrate are subjected to a glycosyltransfer reaction with an enzyme exhibiting carbohydrate transfer activity to obtain a mixture of DIMS and N-SIMS.
However, the isomaltomegalo sugar chain of the R-SIMS is composed of glucopyranose linked by an α1-6 bond, and the degree of polymerization of glucopyranose is in the range of 10 to 100,
The anchor sugar chain of the R-SIMS is composed of glucopyranose linked by an α1-4 bond, and the degree of polymerization of glucopyranose is in a range of 2 to 20,
The IMS isomalt megalo sugar chain is composed of glucopyranose linked by an α1-6 bond, and the degree of polymerization of glucopyranose is in the range of 10 to 100.
A method that includes:
かつ前記糖質の転移活性を示す酵素が、α−グルコシダーゼ、Ｄ−酵素（不均一化酵素）、アミラーゼ及びアミロスクラーゼから成る群から選ばれる少なくとも1種の酵素及びCGTaseである請求項８〜１０のいずれか１項に記載の方法。 The donor substrate is at least one selected from the group consisting of oligosaccharides and polysaccharides,
The enzyme exhibiting the carbohydrate transfer activity is CGTase and at least one enzyme selected from the group consisting of α-glucosidase, D-enzyme (heterogeneous enzyme), amylase and amylosucrase. The method according to any one of claims 1 to 4.
水難溶性化合物と（ｉ）請求項１〜３のいずれか一項に記載のＤＩＭＳ若しくはその混合物、（ｉｉ）請求項４〜６のいずれか一項に記載のＮ−ＳＩＭＳ若しくはその混合物、又は（ｉｉｉ）請求項１〜３のいずれか一項に記載の少なくとも１種のＤＩＭＳ及び請求項４〜６のいずれか一項に記載の少なくとも１種のＮ−ＳＩＭＳの混合物とを水又は水を含有する溶媒中で混合することを含む、前記方法。 A method for producing an aqueous solution of a poorly water-soluble compound,
The poorly water-soluble compound and (i) DIMS or a mixture thereof according to any one of claims 1 to 3, (ii) N-SIMS or a mixture thereof according to any one of claims 4 to 6, or ( iii) water or water comprising a mixture of at least one DIMS according to any one of claims 1 to 3 and at least one N-SIMS according to any one of claims 4 to 6; Said method comprising mixing in a solvent.
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