JP2004294105A

JP2004294105A - Two-dimensional time resolution spectral substance detection method and apparatus

Info

Publication number: JP2004294105A
Application number: JP2003083453A
Authority: JP
Inventors: Noriaki Kimura; 憲明木村; Kyoji Doi; 恭二土井; Takayoshi Yumii; 孝佳弓井; Takuji Yoshida; 卓史吉田
Original assignee: Mitsui Engineering and Shipbuilding Co Ltd
Current assignee: Mitsui Engineering and Shipbuilding Co Ltd
Priority date: 2003-03-25
Filing date: 2003-03-25
Publication date: 2004-10-21
Anticipated expiration: 2023-03-25
Also published as: JP3950075B2

Abstract

<P>PROBLEM TO BE SOLVED: To detect substances in a sample easily. <P>SOLUTION: Ultraviolet rays 16 radiated by a pulse ultraviolet light source 12 are subjected to wavelength dispersion by a diffraction grating 14, and are made to be linear excitation light 28 along the direction, where a wavelength is dispersed, for irradiating a sample 28. Fluorescence 34 radiated from a sample 30 is reflected to the side of a reflection lattice 36 by a dichroic filter 24. The diffraction grating 36 allows incident light to be subjected to wavelength dispersion in a direction for orthogonally crossing the wavelength dispersion direction of the diffraction grating 14. The fluorescence 34 reflected by the diffraction grating 36 is converted to an electric signal by a light reception section 40. A spectrum computing section 48 of a spectrum detection section 44 obtains the biaxial spectral spectrum of an excitation wavelength and a radiation fluorescent wavelength, based on signals outputted by the light reception section 40 for outputting to a substance identification section 50. A relaxation time computing section 52 obtains the relationship among the excitation wavelength, radiation fluorescent wavelength, and the relaxation time of fluorescence. A substance judgment section specifies the fluorescent substance from a relationship obtained by the relaxation time computing section 52. <P>COPYRIGHT: (C)2005,JPO&NCIPI

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、光を利用して試料中に含まれる物質を検出する方法に係り、特に励起光を照射された試料からの放射光を検出して試料中に含まれる物質を検出するのに好適な二次元時間分解分光物質検出方法および装置に関する。
【０００２】
【従来の技術】
生化学や医療などのライフサイエンスまたは環境分野において、しばしば試料（検体）中に含まれる特定のＤＮＡやタンパク質、細胞を検出して分析することが行なわれる。このような試料中のＤＮＡやタンパク質、細胞などの物質の検出は、一般に次のようにして行なう。すなわち、まず、蛍光物質を添加したトレーサを試料に加え、検出対象物質とトレーサとを結合させる。その後、試料に紫外線などの励起光を照射し、試料から放射される蛍光の有無により検出対象物質を検出する。
【０００３】
タンパク質は、２０種のアミノ酸から構成されている。これらのアミノ酸のうち、芳香族側鎖を持つチロシン、フェニルアラニン、トリプトファンの３種類のアミノ酸が強い蛍光を放射する。これら３種類のアミノ酸は、タンパク質の種類ごとに存在比が異なっている。このため、タンパク質の検出、分析を行なう場合、試料に紫外線を照射して３種類のアミノ酸が放射する蛍光を検出し、蛍光の強さからチロシン、フェニルアラニン、トリプトファンの存在比を求めてタンパク質を特定するようにしている。
【０００４】
図９は、従来の物質検出装置の一例を示す模式図である。図９において、物質検出装置２００は、キセノンフラッシュランプなどからなる光源２０２を有する。光源２０２が放射した広帯域の光２０３は、フィルタ２０５によって所定波長の紫外線からなる励起光２０４にされる。この励起光２０４は、半透鏡（ハーフミラー）などからなるミラーユニット２０６によって反射され、対物レンズ２０８に入射する。対物レンズ２０８は、励起光２０４を集光し、マイクロプレートなどに配置してある試料２１０に照射する。試料２１０中の蛍光物質（図示せず）は、励起光２０４によって励起され、所定波長の蛍光を放射する。
【０００５】
この試料２１０から放射された蛍光（放射光）と、試料２１０によって反射された励起光２０４とからなる検出光２１２は、対物レンズ２０８、ミラーユニット２０６を透過してフィルタ２１４に入射する。フィルタ２１４に入射した検出光２１２は、蛍光２１６のみがフィルタ２１４を透過してＣＣＤカメラ２１８に入射し、電気信号に変換される。ＣＣＤカメラ２１８が出力した電気信号は、コンピュータなどの信号処理装置２２０によって所定の処理が行なわれ、表示装置２２２に表示される。
【０００６】
一方、特許文献１には、ＤＮＡから放射される蛍光を時間分解して検出できる装置が開示されている。この特許文献１に記載の時間分解蛍光検出装置は、一定間隔でパルス状レーザを検査対象（ＤＮＡ）に照射するとともに、レーザの照射後、所定時間を経過したときに検査対象から放射される蛍光をＣＣＤカメラによって撮像するようになっている。
【０００７】
【特許文献１】
特開２００２−２８６６３９号公報
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】
ところで、蛍光物質は、物質ごとに吸収スペクトル（励起波長）と放射蛍光スペクトル（放射光波長）と放射蛍光の緩和時間とが異なっている。このため、上記した従来の物質検出装置２００においては、試料２１０に含まれている物質を検出する場合、その物質に吸収されて物質を励起可能な波長の光を照射しなければならないとともに、その物質に特有の蛍光２１６を検出する必要がある。そこで、従来は、試料２１０に含まれる未知の物質や種々の物質を検出する場合、励起光２０４を生成するフィルタ２０５と、検出すべき放射蛍光２１６を透過させるフィルタ２１４とのそれぞれを複数種類用意し、これらを種々に組み合わせて使用する必要があった。このため、物質の検出に多くの手間と時間とを必要とする。
【０００９】
また、上記の物質検出装置２００は、試料２１０が蛍光２１６を放射するか否かによって物質の有無を検出するようになっているため、誤った測定結果を生じやすい。すなわち、フィルタ２１４を透過する蛍光２１６は、目的物質が放射したものばかりでなく、試料中に含まれる他の物質からの弱い蛍光などの外乱を含んでいる。このため、検出した蛍光２１６に対して閾値を設定し、一定の強度を有する蛍光の存在から物質を検出する場合、閾値の設定が困難なことが少なくなく、誤った結果を生ずることがある。しかも、物質によっては、他の物質の吸収スペクトルと放射光スペクトルに近似したものが存在し、正確な測定を困難にする。
【００１０】
さらに、従来の蛍光の時間分解検出は、特許文献１に記載されているように、ＣＣＤカメラによって撮像するようになっている。このため、応答が遅く、ナノ秒以下の時間分解が困難である。
【００１１】
本発明は、前記従来技術の欠点を解消するためになされたもので、試料中の物質を容易に検出できるようにすることを目的としている。
また、本発明は、試料中の物質を誤りなく特定できるようにすることを目的としている。
さらに、本発明は、時間分解能を向上することを目的としている。
【００１２】
【課題を解決するための手段】
吸収スペクトルと放射光スペクトルとの関係は、各物質に特有のものである。従って、吸収スペクトルと放射光スペクトルとを求めることによって、物質を正確、容易に特定することができる。また、吸収スペクトルと放射光スペクトルとの関係が近似している複数の物質があったとしても、各物質から放射される放射光は、各物質に特有の緩和時間を有する。従って、吸収スペクトルと放射光スペクトルおよび放射光の緩和時間とを検出することにより、物質を特定することができる。
【００１３】
本発明は、このような知見に基づいてなされたもので、本発明に係る二次元時間分解分光物質検出方法は、光源が放射した光を波長分散させて光の分散される方向に沿って線状の励起光を試料に照射し、前記試料からの光を前記線状励起光の長手方向と交差する方向に波長分散し、前記試料の吸収スペクトルと放射光スペクトルとを求めて前記試料中の物質を検出する、ことを特徴としている。
【００１４】
このようになっている本発明は、波長分散した線状励起光を試料に照射し、その試料からの光を線状励起光に交差させて波長分散しているため、一辺が励起光の波長方向を軸とし、他の辺が試料の放射光の波長方向を軸とする平面が得られる。従って、励起光に対する放射光、すなわち吸収スペクトルと放射光スペクトルとの関係を容易に求めることができ、試料中の検出対象となる物質の有無を容易、確実に検出することができる。
【００１５】
試料が放射した放射光の緩和時間を求めるようにするとよい。吸収スペクトルと放射光スペクトルとが相互に近似している複数の物質が存在していたとしても、放射光の緩和時間を検出することにより、物質を確実に特定することができ、検出物質を他の物質と取り違えるような測定ミスを避けることができる。
【００１６】
そして、上記の物質検出方法を実施する二次元時間分解分光物質検出装置は、光源が放射した光を波長分散する第１分光部と、この第１分光部から放射された光を波長分散する方向に沿った線状の励起光にして試料に照射する照射部と、前記試料からの光を前記線状励起光と交差させて波長分散する第２分光部と、この第２分光部からの光が入射し、電気信号を出力する受光部と、この受光部と前記試料との間の光路に配置され、前記試料の放射光を透過させるフィルタ部と、前記受光部の出力信号に基づいて、前記試料の吸収スペクトルと放射光スペクトルとを求めるスペクトル検出部と、を有することを特徴としている。これにより、吸収スペクトルと放射光スペクトルとの関係を求めることができ、試料中の物質を容易、確実に検出することができる。
【００１７】
受光部は、光の入射によって電子を放出する光電変換部と、この光電変換部の放出した前記電子を増幅する複数の電子増幅部からなる増幅モジュールと、前記各増幅部のそれぞれに対応して設けられ、直交変調パターンに基づいて動作する電子検出部と、を有するように形成することができる。受光部をこのように形成すると、検出信号を効率よく迅速に処理することが可能で、ナノ秒以下の高い時間分解能を実現することができる。
【００１８】
また、スペクトル検出部の出力側に設けられ、スペクトル検出部が求めた前記吸収スペクトルと前記放射光スペクトルとに基づいて、前記試料中の物質を検出する物質を設け、この物質識別部によって放射光の緩和時間を求めて物質を同定するようにできる。これにより、吸収スペクトルと放射光スペクトルとが相互に近似する物質が存在する場合であっても、放射光を放射した物質を容易、確実に同定（特定）することができる。
【００１９】
【発明の実施の形態】
本発明に係る二次元時間分解分光物質検出方法および装置の好ましい実施の形態を、添付図面に従って詳細に説明する。
図１は、本発明に係る二次元時間分解分光物質検出装置を模式的に示した説明図である。物質検出装置１０は、パルス状の紫外線を放射可能なパルス紫外線光源１２を有する。パルス紫外線光源（以下、単に紫外線光源という）１２の前方（下方）には、第１分光部である透過型の回折格子１４が配設してある。回折格子１４は、多数のスリット１４ａが平行して設けてあって、紫外線光源１２の放射した紫外線１６がスリット１４ａを透過することにより波長分散される。回折格子１４により波長分散された分散光１８は、コリメートレンズ２０によって平行光２２にされ、ダイクロイックフィルタ２４に入射する。なお、回折格子１４は、反射型であってもよい。
【００２０】
このダイクロイックフィルタ２４は、所定の波長以下の光を透過し、それより波長の長い光を反射するようになっていて、後述する試料から放射された蛍光を反射できるようになっている。ダイクロイックフィルタ２４を透過した平行光２２は、照射部を構成しているレンズユニット２６に入射する。レンズユニット２６は、平行光２２を波長が分散された方向に沿った線状の励起光（線状励起光）２８を生成し、下方に配置した試料３０（３０ａ〜３０ｎ）に照射する。試料３０は、多数が図示しないマイクロプレートにマトリックス状に配置してあって、矢印３２に示したように、図の左右方向にステップ状に移動可能となっているとともに、矢印３２と直交した方向にもステップ状に移動できるようにしてある。
【００２１】
線状励起光２８が照射された試料３０は、含まれている蛍光物質（図示せず）が励起されて放射光である蛍光３４を放射する。この蛍光３４は、試料３０によって反射された励起光２８とともに、レンズユニット２６を介してダイクロイックフィルタ２４に入射する。ダイクロイックフィルタ２４は、波長の短い励起光２８を透過し、波長の長い蛍光３４を第２分光部である反射型の回折格子３６の方向に反射する。この回折格子３６は、もちろん透過型であってもよい。回折格子３６は、蛍光３４を波長分散させる溝３６ａが透過型回折格子１４のスリット１４ａと交差する方向（実施形態においては、直交する方向）に配置してある。そして、回折格子３６において波長分散され、反射された蛍光３４は、レンズ３８を介して詳細を後述する受光部４０に入射する。この受光部４０は、駆動制御部４２によって動作が制御されるようになっており、蛍光３４が入射すると電気信号をスペクトル検出部４４に出力する。駆動制御部４２は、紫外線光源１２に紫外線放射パルスを与えるとともに、受光部４０に駆動パルスを与え、スペクトル検出部４４にサンプリングパルスを与える。
【００２２】
スペクトル検出部４４は、受光部４０の出力信号が入力するＡ／Ｄ変換器４６と、このＡ／Ｄ変換器４６の出力側に設けたスペクトル演算部４８とを有する。スペクトル演算部４８は、詳細を後述するように、Ａ／Ｄ変換器４６の出力信号に基づいて、励起波長（吸収スペクトル）と放射光波長（蛍光スペクトル）との波長分布を求める。そして、スペクトル演算部４８は、求めた波長分布（スペクトル）をスペクトル検出部４４の出力側に設けた物質識別部５０に出力するとともに、図示しない表示装置やプリンタ、ハードディスクなどの外部記憶装置に出力する。
【００２３】
物質識別部５０は、緩和時間演算部５２と物質判定部５４とを有している。緩和時間演算部５２は、スペクトル演算部４８が求めたスペクトルの時間的変化から蛍光３４の緩和時間を算出し、この緩和時間と励起波長と放射蛍光波長との関係を求めて物質判定部５４に入力する。そして、物質判定部５４は、緩和時間演算部５２の出力信号に基づいて、試料３０中の蛍光３４を放射した蛍光物質を同定（特定）し、表示装置やプリンタ、記憶装置などに出力する。
【００２４】
受光部４０は、図２に示したようになっていて、試料台６０に配置した試料３０の放射した蛍光３４が入射する検出窓であるガラス板６２を有する。また、受光部４０は、図２におけるガラス板６２の光電変換部６４、増幅モジュールとなるマイクロチャンネルプレート６６、検出モジュール６８、読出し回路７０を備えている。そして、光電変換部６４は、蛍光３４（光子７２）が入射すると、電子（光電子）７４を放出する。光電変換部６４が放出した電子７４は、マイクロチャンネルプレート６６において詳細を後述するように数が１０^４〜１０^７倍程度に増幅され、増幅電子７６となって検出モジュール６８に入射し、検出モジュール６８によって検出される。読出し回路７０は、検出モジュール６８の出力する電流信号を電圧パルス７８に変換し、増幅してスペクトル検出部４４に入力する。
【００２５】
マイクロチャンネルプレート６６は、複数のマイクロキャピラリー８０をマトリックス状に配設した構造を有している。マイクロキャピラリー８０は、電子増幅部となっていて二次電子倍増管から構成してあり、図３に示したようになっている。すなわち、マイクロキャピラリー８０は、直径が６μｍ、長さが１ｍｍ程度の加速管８２と、この加速管８２の両端に設けたカソード８４、アノード８６からなっている。そして、マイクロキャピラリー８０は、カソード８４とアノード８６とが直流電源８８に接続され、１０００〜１００００Ｖの直流高電圧がカソード８４とアノード８６との間に印加される。このため、カソード８４側から加速管８２内に入射した電子７４は、カソード８４とアノード８６との間に印加してある高電圧によって加速され、加速管８２の内壁に衝突するたびに二次電子を生じて雪崩的に数が増幅され、増幅電子７６としてアノード８６側から出射される。
【００２６】
検出モジュール６８は、各マイクロキャピラリー８０に対応して配置した電子検出部を有する。この電子検出部は、実施形態の場合、ＭＯＳトランジスタからなっている。そして、検出モジュール６８は、図４に示したように、マトリックス状に配置した検出トランジスタ（電子検出部）９０と、ＭＯＳトランジスタからなる複数の読出しトランジスタ９２とを備えている。読出しトランジスタ９２は、検出トランジスタ９０の各列に対応して設けてある。そして、検出トランジスタ９０は、各列ごとにゲートがゲート制御線９４に接続され、これらのゲート制御線９４が駆動制御部４２を構成しているゲート制御回路９６に接続してある。また、検出トランジスタ９０は、ドレインが各行ごとにデータ線９８を介して読出しトランジスタ９２のソースに接続してある。さらに、検出トランジスタ９０のソースには、マイクロキャピラリー８０の出力側に対面して設けた検出電極１０２が接続してある。
【００２７】
各読出しトランジスタ９２は、ドレインが読出し回路７０に接続してある。読出しトランジスタ９２のそれぞれのゲートは、対応する読出し線１００に接続してある。この読出し線１００は、駆動制御部４２を構成している読出しマスク制御回路１０４に接続してある。駆動制御部４２は、ゲート制御回路９６、読出しマスク制御回路１０４に切替制御信号を出力するマスクパターン制御部１０６を有する。このマスクパターン制御部１０６は、詳細を後述するように、２値直交変調パターン（直交変調パターン）に基づいて切替制御信号を生成し、この切替制御信号をゲート制御回路９６と読出しマスク制御回路１０４とに与え、各検出トランジスタ９０と読出しトランジスタ９２とを直交変調パターンに基づいて切替動作させるようになっている。
【００２８】
このように構成した実施形態に係る物質検出装置１０の作用は、次のとおりである。まず、複数の試料３０を図示しないマイクロプレートにセットする。そして、マイクロプレートを物質検出装置１０のレンズユニット２６の下方に配置する。その後、物質検出装置１０を起動すると、駆動制御部４２が紫外線光源１２に紫外線放射パルスを出力する。これにより、紫外線光源１２から所定波長の紫外線１６が放射される。この紫外線１６は、透過型回折格子１４のスリット１４ａを通過して波長分散された分散光１８となる。分散光１８は、コリメートレンズ２０によって平行光２２とされたのち、ダイクロイックフィルタ２４を透過してレンズユニット２６に入射する。レンズユニット２６は、平行光２２を波長が分散方向された方向に沿った線状励起光２８にして試料３０に照射する。
【００２９】
試料３０に含まれている蛍光物質（図示せず）は、線状励起光２８に励起されて所定波長の蛍光（放射光）３４を放射する。この蛍光３４は、試料３０において反射された励起光２８とともにレンズユニット２６を透過し、ダイクロイックフィルタ２４に入射する。ダイクロイックフィルタ２４は、所定の波長より短い励起光２８を透過し、それより波長の長い蛍光３４を反射型回折格子３６の方向に反射する。回折格子３６は、溝３６ａが透過型回折格子１４のスリット１４ａと直交するように配設してある。このため、回折格子３６は、入射した光を回折格子１４が波長分散させた方向に直交して波長分散する。この結果、回折格子３６によって反射された光は、図５に示したように、回折格子３６が波長分散した試料３０から放射された放射光（蛍光３４）の波長方向と、回折格子１４が波長分散した励起光の波長方向とを２軸とする正方形または矩形の光となる。
【００３０】
すなわち、回折格子３６によって波長分散することにより、図５に示されているように、蛍光（放射光）３４のスペクトル（放射光波長）と試料３０の吸収スペクトル（励起波長）との関係が得られる。従って、吸収スペクトルと放射光スペクトルとの関係から、試料３０中に含まれている蛍光物質を特定することができる。このため、既知の蛍光物質を添加したトレーサと結合した試料３０中のＤＮＡやタンパク質、細胞などが含まれていれば、これらを容易、確実に検出することができる。
【００３１】
なお、図５において、より色の濃い部分は、蛍光３４の輝度がより大きいことを示している。そして、図５のように、複数の蛍光３４が存在する場合、各蛍光３４の強さを求めることにより、これらの蛍光を放射する物質の存在比（構成比）を求めることができる。このため、タンパク質などの複数の蛍光物質が含まれている場合であっても、タンパク質の種類を容易、正確に同定することができる。
【００３２】
回折格子３６によって波長分散された光は、レンズ３８によって集光させられ、受光部４０に入射する。受光部４０は、前記したように、光電変換部６４が入射した蛍光３４を電子７４に変換し、マイクロチャンネルプレート６６が電子７４を増幅（増倍）して増幅電子７６を出力する。この増幅電子７６は、検出モジュール６８を構成している検出トランジスタ９０の検出電極１０２に入射する。この検出モジュール６８は、各検出トランジスタ９０が駆動制御部４２によって所定のパターンに従って切替駆動される。すなわち、駆動制御部４２は、紫外線光源１２に紫外線放射パルス信号を出力すると、これに同期してマスクパターン制御部１０６がゲート制御回路９６と読出しマスク制御回路１０４とに、２値直交変調パターンに従った切替制御信号を出力する。ゲート制御回路９６と読出しマスク制御回路１０４とは、マスクパターン制御回路１０６の出力する切替制御信号に従って、受光部４０の検出モジュール６８を構成している検出トランジスタ９０をオン、オフさせる。また、駆動制御部４２は、検出モジュール６８への切替制御信号に同期してスペクトル検出部４４にサンプリング信号を出力する。
【００３３】
マスクパターン制御部１０６の出力する切替制御信号は、２値直交変調パターンであるアダマール行列の各行に対応した変調パターンを構成している。アダマール行列は、要素が「＋１」と「−１」とからなっていて、対角線に沿って対象位置にある要素が同じである対称行列となっている。例えば、一次のアダマール行列Ｈ^（１）を具体的に書くと、
【数１】

のようになる。また、二次、三次のアダマール行列Ｈ^（２）、Ｈ^（３）は、数式２、数式３のように書くことができる。
【数２】

【数３】

【００３４】
すなわち、アダマール行列は、一般的に次の漸化式によって定義することができる。
【数４】

ただし、数式４において、ｋは次数を示す。
【００３５】
そこで、実施形態においては、検出トランジスタ９０または読出しトランジスタ９２をオンにする場合をアダマール行列の「＋１」、これらをオフにする場合を「−１」に対応させている。例えば、検出モジュール６８が８×８個の検出トランジスタ９０で構成されている場合、検出トランジスタ９０と読出しトランジスタ９２とに与える切替制御信号は、図６の符号１１０、１１２のようになる。この図８においては、斜線を施した部分が動作電圧を与えられてオンとなる「＋１」に相当し、白抜きの部分がオフである「−１」に相当している。
【００３６】
この変調パターンによる検出モジュール６８の動作は、検出モジュール６８が図６のように８×８個の検出トランジスタ９０によって形成してある場合、次のようになる。例えば、ゲート制御回路９６が同図に示されているように、６次の変調パターンでゲート制御線９４をオン、すなわち第１列目と第２列目および第７列目と第８列目をオンし、第３列目〜第６列目までをオフにしたとする。このとき、マスクパターン制御部１０６は、読出しマスク制御回路１０４を介して、各読出しトランジスタ９２を０次〜７次までの変調パターンに従って順次切り替えてオン、オフさせる。そして、マスクパターン制御部１０６は、読出しトランジスタ９２を０次〜７次までの切り替え終わると、ゲート制御回路９６に次の変調パターンを与え、読出しトランジスタ９２を０次〜７次まで変調パターンに従って切り替える。そして、検出電極１０２に電子が入射すると、即座に読出し回路７０に検出トランジスタ９０の出力信号が入力し、読出し回路７０から電圧パルス７８に変換されて出力される。したがって、蛍光３４の入射に対するタイムラグをほとんど生ずることなく検出信号が得られる。このため、アダマール行列に基づいたマスクパターン（切替パターン）によって検出トランジスタ９０と読出しトランジスタ９２とを切替動作させることにより、ナノ秒以下の高速サンプリングが可能となり、高速時間分解をすることができる。
【００３７】
オンされた検出トランジスタ９０の検出電極１０２に増幅電子７６が入射し、読出しトランジスタ９２がオンされると、データ線９８に電流パルスが流れる。この電流パルスは、読出し回路７０によって増幅され、図４に示した電圧パルス７８に変換される。この電圧パルス７８は、スペクトル検出部４４のＡ／Ｄ変換器４６に入力する。Ａ／Ｄ変換器４６は、入力したアナログ信号をディジタル信号に変換してスペクトル演算部４８に送出する。スペクトル演算部４８は、駆動制御部４２からサンプリング信号が入力する。このサンプリング信号は、受光部４０の検出モジュール６８に与える切替制御信号に同期している。そして、スペクトル演算部４８は、サンプリング信号に同期してＡ／Ｄ変換器４６の出力信号を読み込み、図示しないメモリにサンプリングデータを書き込む。
【００３８】
駆動制御部４２は、検出モジュール６８に対してすべての切替パターンについて切り替えを終了すると、スペクトル演算部４８に対してスペクトル演算命令を与える。スペクトル演算部４８は、メモリに記憶しているサンプリングデータを読み出し、これらのデータに対してアダマール逆変換を行なう。これにより、図５に示した２軸分光スペクトルが得られる。スペクトル演算部４８は、求めた分光スペクトルを図示しない映像表示装置に出力し、２軸分光画像として表示する。
【００３９】
駆動制御部４２は、紫外線光源１２に１つの放射パルスを与えると、検出モジュール６８のトランジスタに対する上記した１群の切替駆動と、スペクトル演算部４８へのスペクトル演算命令とを複数回出力する。そして、スペクトル演算部４８は、その都度分光スペクトルを求めて映像表示装置に出力する。これにより、蛍光３４が減衰する時間的変化、すなわち蛍光３４の緩和過程が求められる。従って、図７に示したように、励起波長と放射蛍光波長および時間軸を３軸とする３次元画像を得ることができる。なお、図７に示した縦軸のｔ_１〜ｔ_４は、紫外線光源１２の紫外線放射タイミングを示す。
【００４０】
スペクトル演算部４８は、演算結果を映像表示装置に出力するとともに、物質識別部５０の緩和時間演算部５２に出力する。緩和時間演算部５２は、スペクトル演算部４８が時々刻々出力する分光スペクトルから、各蛍光３４の緩和時間を求める。そして、緩和時間演算部５２は、図８に模式的に示したように、励起（吸収）波長と放射蛍光波長および緩和時間τとを３軸とする空間分布強度を求める。この空間分布強度は、物質判定部５４に出力されるとともに、映像表示装置に表示される。物質判定部５４は、複数の蛍光物質に対する励起波長と放射蛍光波長と蛍光の緩和時間との関係が予め図示しない記憶部に与えられている。そして、物質判定部５４は、緩和時間演算部５２が求めた励起波長、放射蛍光波長、蛍光緩和時間から記憶部を検索し、対応する蛍光物質を同定して映像表示装置などの出力装置に出力する。
【００４１】
このように、実施の形態においては、励起波長と放射蛍光波長との関係ばかりでなく、放射蛍光の緩和時間をも求めるようにしているため、励起波長と放射蛍光波長との関係が近似している物質が存在したとしても、緩和時間を求めることにより、蛍光物質を容易、確実に特定することができる。従って、検出の誤りをなくすことができ、分析精度の向上などを図ることができる。また、検出すべき物質が複数の蛍光物質を構成要素として含んでいる場合であっても、対応した複数の放射蛍光の強度を求めることにより、各蛍光物質の存在比（構成比）を求めることが可能となり、その物質を特定することができる。
【００４２】
例えばタンパク質の場合、タンパク質を構成するチロシン、フェニルアラニン、トリプトファンの３種のアミノ酸が紫外線の励起により強い蛍光を放射する。これらのアミノ酸は、励起波長がそれぞれ異なっており、また放射する蛍光の波長も、蛍光の緩和時間のそれぞれ異なる。従って、図８から各アミノ酸の存在比を得ることができ、タンパク質を容易、確実に同定することができる。
【００４３】
なお、前記実施形態においては、線状励起光２８の入射方向に放射される蛍光３４を検出する場合について説明したが、線状励起光２８の試料３０を透過方向に放射される蛍光３４を検出するようにしてもよい。
【００４４】
【発明の効果】
以上に述べたように、本発明によれば、光の波長分散された方向に沿った線状の励起光を試料に照射し、その試料からの光を線状励起光に交差させて波長分散しているため、一辺が励起光の波長方向を軸とし、他の辺が試料の放射光の波長方向を軸とする平面が得られ、励起光の波長に対する放射光の波長、すなわち吸収スペクトルと放射光スペクトルとの関係を容易に求めることができ、試料中の物質を容易、確実に検出することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は本発明の実施の形態に係る二次元時間分解分光物質検出装置を模式的に示した説明図である。
【図２】実施の形態に係る受光部の詳細を示す分解斜視図である。
【図３】実施の形態に係るマイクロキャピラリーの詳細説明図である。
【図４】実施の形態に係る検出モジュールの詳細説明図である。
【図５】実施の形態に係る物質検出装置により得られる２軸分光スペクトルの一例を示す図である。
【図６】アダマール行列に基づくトランジスタの切替制御を説明する図である。
【図７】実施の形態により求められる励起波長と放射蛍光波長と蛍光の緩和過程との関係を示す図である。
【図８】実施の形態により求められる励起波長と放射蛍光波長と蛍光緩和時間との関係を示す図である。
【図９】従来の物質検出装置の説明図である。
【符号の説明】
１０………物質検出装置、１２………パルス紫外線光源、１４………第１分光部（回折格子）、１６………光（紫外線）、２４………フィルタ部（ダイクロイックフィルタ）、２６………照射部（レンズユニット）、２８………線状励起光、３０ａ〜３０ｎ………試料、３４………光（蛍光）、３６………第２分光部（回折格子）、４０………受光部、４２………駆動制御部、４４………スペクトル検出部、４８………スペクトル演算部、５０………物質識別部、５２………緩和時間演算部、５４………物質判定部、６４………光電変換部、６６………増幅モジュール（マイクロチャンネルプレート）、６８………検出モジュール、８０………電子増幅部（マイクロキャピラリー）、９０………電子検出部（検出トランジスタ）、９２………読出しトランジスタ。[0001]
TECHNICAL FIELD OF THE INVENTION
The present invention relates to a method for detecting a substance contained in a sample using light, and is particularly suitable for detecting a substance contained in a sample by detecting emitted light from a sample irradiated with excitation light. And a method and an apparatus for detecting two-dimensional time-resolved spectral substances.
[0002]
[Prior art]
In the field of life science or environment such as biochemistry and medicine, detection and analysis of a specific DNA, protein, or cell contained in a sample (sample) is often performed. The detection of substances such as DNA, protein and cells in such a sample is generally performed as follows. That is, first, the tracer to which the fluorescent substance is added is added to the sample, and the detection target substance and the tracer are bound. Thereafter, the sample is irradiated with excitation light such as ultraviolet light, and the target substance is detected based on the presence or absence of fluorescence emitted from the sample.
[0003]
Proteins are composed of 20 amino acids. Among these amino acids, three types of amino acids having an aromatic side chain, tyrosine, phenylalanine, and tryptophan, emit strong fluorescence. These three amino acids have different abundance ratios for each type of protein. Therefore, when performing protein detection and analysis, the sample is irradiated with ultraviolet light to detect the fluorescence emitted by the three types of amino acids, and the protein is identified by calculating the abundance ratio of tyrosine, phenylalanine, and tryptophan based on the intensity of the fluorescence. I am trying to do it.
[0004]
FIG. 9 is a schematic diagram illustrating an example of a conventional substance detection device. In FIG. 9, the substance detection device 200 has a light source 202 such as a xenon flash lamp. The broadband light 203 emitted from the light source 202 is converted into excitation light 204 made of ultraviolet light of a predetermined wavelength by a filter 205. The excitation light 204 is reflected by a mirror unit 206 composed of a semi-transparent mirror (half mirror) or the like, and enters an objective lens 208. The objective lens 208 condenses the excitation light 204 and irradiates the sample 210 disposed on a microplate or the like. A fluorescent substance (not shown) in the sample 210 is excited by the excitation light 204 and emits fluorescence of a predetermined wavelength.
[0005]
Detection light 212 composed of fluorescence (emitted light) emitted from the sample 210 and excitation light 204 reflected by the sample 210 passes through the objective lens 208 and the mirror unit 206 and enters the filter 214. Only the fluorescence 216 of the detection light 212 that has entered the filter 214 passes through the filter 214 and enters the CCD camera 218, where it is converted into an electric signal. The electric signal output from the CCD camera 218 is subjected to predetermined processing by a signal processing device 220 such as a computer, and is displayed on a display device 222.
[0006]
On the other hand, Patent Literature 1 discloses an apparatus capable of detecting fluorescence emitted from DNA in a time-resolved manner. The time-resolved fluorescence detection device described in Patent Document 1 irradiates a pulsed laser to a test object (DNA) at regular intervals, and emits fluorescence emitted from the test object when a predetermined time has elapsed after the laser irradiation. Is captured by a CCD camera.
[0007]
[Patent Document 1]
JP 2002-286639 A
[0008]
[Problems to be solved by the invention]
By the way, each fluorescent substance has a different absorption spectrum (excitation wavelength), emission fluorescence spectrum (emission light wavelength), and relaxation time of emission fluorescence. Therefore, in the above-described conventional substance detection device 200, when detecting a substance contained in the sample 210, it is necessary to irradiate light having a wavelength capable of being excited by the substance by being absorbed by the substance, It is necessary to detect the fluorescence 216 specific to the substance. Therefore, conventionally, when an unknown substance or various substances contained in the sample 210 are detected, a plurality of types of filters 205 for generating the excitation light 204 and a filter 214 for transmitting the emitted fluorescent light 216 to be detected are prepared. However, they need to be used in various combinations. For this reason, detection of a substance requires much labor and time.
[0009]
Further, since the substance detection device 200 detects the presence or absence of a substance based on whether or not the sample 210 emits the fluorescent light 216, an erroneous measurement result is likely to occur. That is, the fluorescence 216 transmitted through the filter 214 includes not only the emission of the target substance but also disturbance such as weak fluorescence from other substances contained in the sample. For this reason, when a threshold is set for the detected fluorescence 216 and a substance is detected from the presence of fluorescence having a certain intensity, it is not difficult to set the threshold, and an erroneous result may be generated. In addition, some substances approximate the absorption spectrum and the emission light spectrum of other substances, making accurate measurement difficult.
[0010]
Further, in conventional time-resolved detection of fluorescence, as described in Patent Document 1, an image is taken by a CCD camera. Therefore, the response is slow, and it is difficult to resolve the time in nanoseconds or less.
[0011]
The present invention has been made to solve the above-mentioned drawbacks of the related art, and has as its object to make it possible to easily detect a substance in a sample.
Another object of the present invention is to enable a substance in a sample to be specified without error.
Another object of the present invention is to improve the time resolution.
[0012]
[Means for Solving the Problems]
The relationship between the absorption spectrum and the emission spectrum is unique to each substance. Therefore, a substance can be specified accurately and easily by obtaining the absorption spectrum and the emission light spectrum. Further, even when there are a plurality of substances having a similar relationship between the absorption spectrum and the emitted light spectrum, the emitted light emitted from each substance has a relaxation time unique to each substance. Therefore, the substance can be specified by detecting the absorption spectrum, the emission light spectrum, and the relaxation time of the emission light.
[0013]
The present invention has been made based on such knowledge, and the two-dimensional time-resolved spectral material detection method according to the present invention disperses the light emitted by the light source in a wavelength-wise manner along a line along the direction in which the light is dispersed. Irradiate the sample with the excitation light in the form of, the light from the sample is wavelength-dispersed in a direction intersecting with the longitudinal direction of the linear excitation light, the absorption spectrum and the emission light spectrum of the sample are obtained, Detecting a substance.
[0014]
In the present invention having such a configuration, the sample is irradiated with the wavelength-dispersed linear excitation light, and the wavelength from the sample is crossed with the linear excitation light to disperse the wavelength. A plane having the direction as the axis and the other side as the axis of the wavelength direction of the emitted light of the sample is obtained. Therefore, the relationship between the emission light with respect to the excitation light, that is, the relationship between the absorption spectrum and the emission light spectrum can be easily obtained, and the presence or absence of the substance to be detected in the sample can be easily and reliably detected.
[0015]
The relaxation time of the radiation emitted by the sample may be determined. Even if there are a plurality of substances whose absorption spectrum and emission spectrum are close to each other, the substance can be specified reliably by detecting the relaxation time of the emission light, and other Measurement errors that can be mistaken for the substance can be avoided.
[0016]
The two-dimensional time-resolved spectral substance detecting device that implements the above-described substance detecting method includes a first spectral unit that wavelength-disperses the light emitted from the light source, and a direction that wavelength-disperses the light emitted from the first spectral unit. An irradiation unit that irradiates the sample with linear excitation light along the line, a second beam splitting unit that intersects the light from the sample with the linear excitation light and wavelength-disperses the light, and light from the second beam splitting unit Is incident, a light receiving unit that outputs an electric signal, and is disposed in an optical path between the light receiving unit and the sample, and a filter unit that transmits emitted light of the sample, based on an output signal of the light receiving unit, A spectrum detector for obtaining an absorption spectrum and a radiation spectrum of the sample. Thereby, the relationship between the absorption spectrum and the emitted light spectrum can be obtained, and the substance in the sample can be easily and reliably detected.
[0017]
The light receiving unit corresponds to each of the photoelectric conversion unit that emits electrons by incidence of light, an amplification module including a plurality of electron amplification units that amplify the electrons emitted by the photoelectric conversion unit, and the amplification units. And an electron detector that operates based on the quadrature modulation pattern. When the light receiving section is formed in this manner, the detection signal can be efficiently and quickly processed, and a high time resolution of nanoseconds or less can be realized.
[0018]
Further, a substance is provided on the output side of the spectrum detection unit, and based on the absorption spectrum and the emission spectrum obtained by the spectrum detection unit, a substance for detecting a substance in the sample is provided. The substance can be identified by determining the relaxation time of the substance. This makes it possible to easily and reliably identify (specify) the substance that has emitted the emitted light even when there is a substance whose absorption spectrum and the emitted light spectrum are close to each other.
[0019]
BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION
Preferred embodiments of the two-dimensional time-resolved spectral material detection method and device according to the present invention will be described in detail with reference to the accompanying drawings.
FIG. 1 is an explanatory diagram schematically showing a two-dimensional time-resolved spectral material detection device according to the present invention. The substance detection device 10 has a pulsed ultraviolet light source 12 that can emit pulsed ultraviolet light. In front (below) of a pulsed ultraviolet light source (hereinafter simply referred to as an ultraviolet light source) 12, a transmission type diffraction grating 14 as a first beam splitting unit is provided. The diffraction grating 14 has a large number of slits 14a provided in parallel, and the ultraviolet light 16 emitted from the ultraviolet light source 12 passes through the slits 14a to be wavelength-dispersed. The dispersed light 18 wavelength-dispersed by the diffraction grating 14 is converted into parallel light 22 by a collimator lens 20 and enters a dichroic filter 24. Note that the diffraction grating 14 may be a reflection type.
[0020]
The dichroic filter 24 transmits light having a wavelength equal to or shorter than a predetermined wavelength and reflects light having a longer wavelength than that, and can reflect fluorescence emitted from a sample described later. The parallel light 22 transmitted through the dichroic filter 24 is incident on a lens unit 26 constituting an irradiation unit. The lens unit 26 generates the linear excitation light (linear excitation light) 28 along the direction in which the parallel light 22 is dispersed, and irradiates the sample 30 (30a to 30n) disposed below. A large number of the samples 30 are arranged in a matrix on a microplate (not shown), and are movable stepwise in the left-right direction of the figure as shown by an arrow 32 and in a direction orthogonal to the arrow 32. Can be moved in steps.
[0021]
The sample 30 irradiated with the linear excitation light 28 excites a fluorescent substance (not shown) contained therein and emits a fluorescent light 34 as emitted light. The fluorescent light 34 enters the dichroic filter 24 via the lens unit 26 together with the excitation light 28 reflected by the sample 30. The dichroic filter 24 transmits the excitation light 28 having a short wavelength and reflects the fluorescence 34 having a long wavelength in the direction of a reflection type diffraction grating 36 which is a second beam splitting unit. This diffraction grating 36 may of course be a transmission type. The diffraction grating 36 is arranged in a direction in which the groove 36 a for dispersing the wavelength of the fluorescent light 34 intersects the slit 14 a of the transmission type diffraction grating 14 (in the embodiment, a direction orthogonal to the slit 14 a). Then, the fluorescent light 34 that has been wavelength-dispersed and reflected in the diffraction grating 36 is incident on a light receiving unit 40, which will be described in detail later, via a lens 38. The operation of the light receiving unit 40 is controlled by the drive control unit 42, and outputs an electric signal to the spectrum detecting unit 44 when the fluorescent light 34 enters. The drive control unit 42 supplies an ultraviolet radiation pulse to the ultraviolet light source 12, a drive pulse to the light receiving unit 40, and a sampling pulse to the spectrum detection unit 44.
[0022]
The spectrum detection unit 44 includes an A / D converter 46 to which an output signal of the light receiving unit 40 is input, and a spectrum calculation unit 48 provided on the output side of the A / D converter 46. The spectrum calculator 48 calculates the wavelength distribution between the excitation wavelength (absorption spectrum) and the emission wavelength (fluorescence spectrum) based on the output signal of the A / D converter 46, as will be described in detail later. Then, the spectrum calculation unit 48 outputs the obtained wavelength distribution (spectrum) to the material identification unit 50 provided on the output side of the spectrum detection unit 44, and also outputs it to an external storage device such as a display device, a printer, or a hard disk (not shown). I do.
[0023]
The substance identification section 50 has a relaxation time calculation section 52 and a substance determination section 54. The relaxation time calculation unit 52 calculates the relaxation time of the fluorescence 34 from the temporal change of the spectrum obtained by the spectrum calculation unit 48, obtains the relationship between the relaxation time, the excitation wavelength, and the emission fluorescence wavelength, and sends the relationship to the material determination unit 54. input. Then, based on the output signal of the relaxation time calculation unit 52, the substance determination unit 54 identifies (specifies) the fluorescent substance that has emitted the fluorescence 34 in the sample 30, and outputs the fluorescent substance to a display device, a printer, a storage device, or the like.
[0024]
The light receiving section 40 is configured as shown in FIG. 2 and has a glass plate 62 serving as a detection window through which the fluorescent light 34 emitted from the sample 30 disposed on the sample stage 60 enters. The light receiving unit 40 includes a photoelectric conversion unit 64 of the glass plate 62 in FIG. 2, a microchannel plate 66 serving as an amplification module, a detection module 68, and a readout circuit 70. The photoelectric conversion unit 64 emits electrons (photoelectrons) 74 when the fluorescent light 34 (photons 72) is incident. The number of electrons 74 emitted from the photoelectric conversion unit 64 is 10 in the microchannel plate 66 as described later in detail. ⁴ -10 ⁷ It is amplified about twice, becomes amplified electrons 76, enters the detection module 68, and is detected by the detection module 68. The readout circuit 70 converts the current signal output from the detection module 68 into a voltage pulse 78, amplifies the voltage pulse 78, and inputs the amplified voltage pulse to the spectrum detection unit 44.
[0025]
The micro channel plate 66 has a structure in which a plurality of micro capillaries 80 are arranged in a matrix. The microcapillary 80 serves as an electron amplification unit, and is constituted by a secondary electron multiplier, as shown in FIG. That is, the microcapillary 80 includes an acceleration tube 82 having a diameter of 6 μm and a length of about 1 mm, and a cathode 84 and an anode 86 provided at both ends of the acceleration tube 82. In the microcapillary 80, the cathode 84 and the anode 86 are connected to a DC power supply 88, and a high DC voltage of 1000 to 10000 V is applied between the cathode 84 and the anode 86. For this reason, the electrons 74 that have entered the acceleration tube 82 from the cathode 84 side are accelerated by the high voltage applied between the cathode 84 and the anode 86, and each time the electrons 74 collide with the inner wall of the acceleration tube 82, the secondary electrons Is generated and the number is amplified like an avalanche, and is emitted from the anode 86 side as amplified electrons 76.
[0026]
The detection module 68 has an electron detection unit arranged corresponding to each microcapillary 80. This electron detection unit is formed of a MOS transistor in the case of the embodiment. The detection module 68 includes, as shown in FIG. 4, detection transistors (electron detection units) 90 arranged in a matrix and a plurality of read transistors 92 formed of MOS transistors. The read transistor 92 is provided corresponding to each column of the detection transistor 90. The gate of the detection transistor 90 is connected to a gate control line 94 for each column, and these gate control lines 94 are connected to a gate control circuit 96 constituting the drive control unit 42. The drain of the detection transistor 90 is connected to the source of the read transistor 92 via the data line 98 for each row. Further, a detection electrode 102 provided facing the output side of the microcapillary 80 is connected to the source of the detection transistor 90.
[0027]
Each read transistor 92 has a drain connected to the read circuit 70. Each gate of read transistor 92 is connected to a corresponding read line 100. The read line 100 is connected to a read mask control circuit 104 constituting the drive control unit 42. The drive control unit 42 includes a mask pattern control unit 106 that outputs a switching control signal to the gate control circuit 96 and the read mask control circuit 104. The mask pattern control unit 106 generates a switching control signal based on a binary quadrature modulation pattern (orthogonal modulation pattern), as will be described in detail later, and outputs the switching control signal to the gate control circuit 96 and the read mask control circuit 104. And the switching operation of each detection transistor 90 and readout transistor 92 is performed based on the orthogonal modulation pattern.
[0028]
The operation of the substance detection device 10 according to the embodiment configured as described above is as follows. First, a plurality of samples 30 are set on a microplate (not shown). Then, the microplate is arranged below the lens unit 26 of the substance detection device 10. Thereafter, when the substance detection device 10 is activated, the drive control unit 42 outputs an ultraviolet radiation pulse to the ultraviolet light source 12. Thus, the ultraviolet light source 12 emits ultraviolet light 16 having a predetermined wavelength. The ultraviolet light 16 passes through the slit 14 a of the transmission diffraction grating 14 and becomes a dispersed light 18 wavelength-dispersed. The dispersed light 18 is converted into parallel light 22 by a collimating lens 20, and then passes through a dichroic filter 24 and enters a lens unit 26. The lens unit 26 irradiates the sample 30 with the parallel light 22 as linear excitation light 28 along the direction in which the wavelength is dispersed.
[0029]
The fluorescent substance (not shown) contained in the sample 30 is excited by the linear excitation light 28 and emits fluorescence (emission light) 34 of a predetermined wavelength. The fluorescent light 34 passes through the lens unit 26 together with the excitation light 28 reflected on the sample 30 and enters the dichroic filter 24. The dichroic filter 24 transmits the excitation light 28 shorter than a predetermined wavelength and reflects the fluorescent light 34 having a longer wavelength in the direction of the reflective diffraction grating 36. The diffraction grating 36 is disposed such that the groove 36 a is orthogonal to the slit 14 a of the transmission diffraction grating 14. Therefore, the diffraction grating 36 wavelength-disperses the incident light orthogonal to the direction in which the wavelength is dispersed by the diffraction grating 14. As a result, as shown in FIG. 5, the light reflected by the diffraction grating 36 has the wavelength direction of the radiated light (fluorescence 34) emitted from the sample 30 in which the wavelength is dispersed by the diffraction grating 36 and the wavelength The light becomes a square or rectangular light whose two axes are the wavelength direction of the dispersed excitation light.
[0030]
That is, by performing wavelength dispersion by the diffraction grating 36, as shown in FIG. 5, the relationship between the spectrum of the fluorescence (radiation light) 34 and the absorption spectrum (excitation wavelength) of the sample 30 is obtained. Can be Therefore, the fluorescent substance contained in the sample 30 can be specified from the relationship between the absorption spectrum and the emission light spectrum. Therefore, if DNA, protein, cells, and the like in the sample 30 combined with the tracer to which a known fluorescent substance is added are included, these can be easily and reliably detected.
[0031]
In FIG. 5, the darker portion indicates that the luminance of the fluorescent light 34 is higher. Then, as shown in FIG. 5, when there are a plurality of fluorescent lights 34, by determining the intensity of each fluorescent light 34, the abundance ratio (composition ratio) of these fluorescent light emitting substances can be obtained. Therefore, even when a plurality of fluorescent substances such as proteins are contained, the type of protein can be easily and accurately identified.
[0032]
The light wavelength-dispersed by the diffraction grating 36 is condensed by the lens 38 and enters the light receiving unit 40. As described above, the light receiving unit 40 converts the fluorescent light 34 incident on the photoelectric conversion unit 64 into electrons 74, and the micro channel plate 66 amplifies (multiplies) the electrons 74 and outputs amplified electrons 76. The amplified electrons 76 enter the detection electrode 102 of the detection transistor 90 included in the detection module 68. In the detection module 68, each detection transistor 90 is switched and driven by the drive control unit 42 according to a predetermined pattern. That is, when the drive control unit 42 outputs an ultraviolet radiation pulse signal to the ultraviolet light source 12, in synchronization with this, the mask pattern control unit 106 causes the gate control circuit 96 and the read mask control circuit 104 to output a binary orthogonal modulation pattern. The switching control signal is output in accordance with the switching control signal. The gate control circuit 96 and the read mask control circuit 104 turn on and off the detection transistor 90 constituting the detection module 68 of the light receiving unit 40 according to the switching control signal output from the mask pattern control circuit 106. Further, the drive control unit 42 outputs a sampling signal to the spectrum detection unit 44 in synchronization with the switching control signal to the detection module 68.
[0033]
The switching control signal output from the mask pattern control unit 106 forms a modulation pattern corresponding to each row of a Hadamard matrix that is a binary orthogonal modulation pattern. The Hadamard matrix is a symmetric matrix in which elements are “+1” and “−1”, and elements at target positions along the diagonal are the same. For example, a first-order Hadamard matrix H ⁽¹⁾ Is written specifically,
(Equation 1)

become that way. Also, a second-order or third-order Hadamard matrix H ⁽²⁾ , H ⁽³⁾ Can be written as

Equations

2 and 3.
(Equation 2)

[Equation 3]

[0034]
That is, the Hadamard matrix can be generally defined by the following recurrence formula.
(Equation 4)

However, in Equation 4, k indicates the order.
[0035]
Therefore, in the embodiment, the case where the detection transistor 90 or the read transistor 92 is turned on corresponds to “+1” of the Hadamard matrix, and the case where these are turned off corresponds to “−1”. For example, when the detection module 68 includes 8 × 8 detection transistors 90, the switching control signals given to the detection transistor 90 and the read transistor 92 are as shown by

reference numerals

110 and 112 in FIG. In FIG. 8, a hatched portion corresponds to "+1" which is turned on when an operating voltage is applied, and a white portion corresponds to "-1" which is turned off.
[0036]
The operation of the detection module 68 based on this modulation pattern is as follows when the detection module 68 is formed by 8 × 8 detection transistors 90 as shown in FIG. For example, as shown in the figure, the gate control circuit 96 turns on the gate control line 94 with a sixth-order modulation pattern, that is, the first and second columns and the seventh and eighth columns. Is turned on, and the third to sixth columns are turned off. At this time, the mask pattern control unit 106 sequentially turns on and off the read transistors 92 via the read mask control circuit 104 according to the 0th to 7th modulation patterns. When the switching of the read transistor 92 from the 0th to the 7th order is completed, the mask pattern control unit 106 gives the next modulation pattern to the gate control circuit 96, and switches the readout transistor 92 from the 0th to the 7th order according to the modulation pattern. . When an electron enters the detection electrode 102, the output signal of the detection transistor 90 is immediately input to the readout circuit 70, and is converted from the readout circuit 70 into a voltage pulse 78 and output. Therefore, a detection signal can be obtained with almost no time lag for the incidence of the fluorescent light 34. Therefore, by performing the switching operation of the detection transistor 90 and the read transistor 92 by a mask pattern (switching pattern) based on the Hadamard matrix, high-speed sampling of nanoseconds or less can be performed, and high-speed time resolution can be performed.
[0037]
When the amplified electrons 76 enter the detection electrode 102 of the turned on detection transistor 90 and the read transistor 92 is turned on, a current pulse flows through the data line 98. This current pulse is amplified by the read circuit 70 and converted into the voltage pulse 78 shown in FIG. This voltage pulse 78 is input to the A / D converter 46 of the spectrum detector 44. The A / D converter 46 converts the input analog signal into a digital signal and sends the digital signal to the spectrum calculator 48. The spectrum calculator 48 receives a sampling signal from the drive controller 42. This sampling signal is synchronized with the switching control signal given to the detection module 68 of the light receiving unit 40. Then, the spectrum calculator 48 reads the output signal of the A / D converter 46 in synchronization with the sampling signal, and writes the sampling data into a memory (not shown).
[0038]
When the drive control unit 42 completes the switching for all the switching patterns to the detection module 68, the drive control unit 42 gives a spectrum calculation instruction to the spectrum calculation unit 48. The spectrum calculator 48 reads out the sampling data stored in the memory, and performs an inverse Hadamard transform on these data. As a result, the biaxial spectral spectrum shown in FIG. 5 is obtained. The spectrum calculator 48 outputs the obtained spectral spectrum to an image display device (not shown) and displays it as a biaxial spectral image.
[0039]
When one radiation pulse is given to the ultraviolet light source 12, the drive control unit 42 outputs the above-described group of switching drive for the transistors of the detection module 68 and a spectrum calculation command to the spectrum calculation unit 48 a plurality of times. Then, the spectrum calculation unit 48 obtains a spectrum each time and outputs the spectrum to the image display device. Accordingly, a temporal change in which the fluorescence 34 attenuates, that is, a relaxation process of the fluorescence 34 is required. Therefore, as shown in FIG. 7, it is possible to obtain a three-dimensional image having three axes of the excitation wavelength, the emission fluorescence wavelength, and the time axis. Note that t on the vertical axis shown in FIG. ₁ ~ T ₄ Indicates the ultraviolet radiation timing of the ultraviolet light source 12.
[0040]
The spectrum calculation unit 48 outputs the calculation result to the video display device and outputs the calculation result to the relaxation time calculation unit 52 of the substance identification unit 50. The relaxation time calculation unit 52 obtains the relaxation time of each fluorescent light 34 from the spectral spectrum output from time to time by the spectrum calculation unit 48. Then, as schematically shown in FIG. 8, the relaxation time calculation unit 52 calculates the spatial distribution intensity with the excitation (absorption) wavelength, the emission fluorescence wavelength, and the relaxation time τ as three axes. This spatial distribution intensity is output to the substance determination unit 54 and displayed on the video display device. The relationship between the excitation wavelength, the emission fluorescence wavelength, and the fluorescence relaxation time for a plurality of fluorescent materials is given to the storage unit (not shown) in the material determination unit 54 in advance. Then, the substance determination unit 54 searches the storage unit from the excitation wavelength, emission fluorescence wavelength, and fluorescence relaxation time obtained by the relaxation time calculation unit 52, identifies the corresponding fluorescent substance, and outputs it to an output device such as a video display device. I do.
[0041]
As described above, in the embodiment, not only the relationship between the excitation wavelength and the emission fluorescence wavelength, but also the relaxation time of the emission fluorescence is determined, so that the relationship between the excitation wavelength and the emission fluorescence wavelength is approximated. Even if a substance exists, the fluorescent substance can be easily and reliably specified by obtaining the relaxation time. Accordingly, detection errors can be eliminated, and analysis accuracy can be improved. In addition, even when the substance to be detected includes a plurality of fluorescent substances as constituent elements, the abundance ratio (composition ratio) of each fluorescent substance can be obtained by obtaining the intensity of the corresponding plurality of emitted fluorescent light. And the substance can be specified.
[0042]
For example, in the case of a protein, three kinds of amino acids, tyrosine, phenylalanine, and tryptophan, which constitute the protein, emit strong fluorescence when excited by ultraviolet light. These amino acids have different excitation wavelengths, and the wavelengths of emitted fluorescence also have different fluorescence relaxation times. Therefore, the abundance ratio of each amino acid can be obtained from FIG. 8, and the protein can be easily and reliably identified.
[0043]
In the above embodiment, the case where the fluorescence 34 emitted in the incident direction of the linear excitation light 28 is detected, but the fluorescence 34 emitted in the transmission direction of the sample 30 of the linear excitation light 28 is detected. You may make it.
[0044]
【The invention's effect】
As described above, according to the present invention, the sample is irradiated with the linear excitation light along the direction in which the wavelength of the light is dispersed, and the light from the sample is crossed with the linear excitation light to perform the wavelength dispersion. As a result, a plane is obtained in which one side is the axis of the wavelength of the excitation light and the other side is the axis of the wavelength of the emission light of the sample, and the wavelength of the emission light relative to the wavelength of the excitation light, that is, the absorption spectrum is obtained. The relationship with the emitted light spectrum can be easily obtained, and the substance in the sample can be easily and reliably detected.
[Brief description of the drawings]
FIG. 1 is an explanatory diagram schematically showing a two-dimensional time-resolved spectral substance detection device according to an embodiment of the present invention.
FIG. 2 is an exploded perspective view illustrating details of a light receiving unit according to the embodiment.
FIG. 3 is a detailed explanatory diagram of the microcapillary according to the embodiment.
FIG. 4 is a detailed explanatory diagram of a detection module according to the embodiment.
FIG. 5 is a diagram showing an example of a biaxial spectral spectrum obtained by the substance detection device according to the embodiment.
FIG. 6 is a diagram illustrating switching control of a transistor based on a Hadamard matrix.
FIG. 7 is a diagram showing a relationship among an excitation wavelength, an emission fluorescence wavelength, and a fluorescence relaxation process determined by the embodiment.
FIG. 8 is a diagram showing a relationship among an excitation wavelength, an emission fluorescence wavelength, and a fluorescence relaxation time obtained according to the embodiment.
FIG. 9 is an explanatory diagram of a conventional substance detection device.
[Explanation of symbols]
Reference numeral 10: Substance detection device, 12: Pulsed ultraviolet light source, 14: First spectral part (diffraction grating), 16: Light (ultraviolet light), 24: Filter part (dichroic filter), 26 ... Irradiation unit (lens unit), 28 linear excitation light, 30a to 30n sample, 34 light (fluorescence), 36 second spectral unit (diffraction grating), 40 ... Light receiving section, 42 drive control section, 44 spectrum detection section, 48 spectrum calculation section, 50 substance identification section, 52 relaxation time calculation section, 54 ... Material determination section, 64 ... Photoelectric conversion section, 66 ... Amplification module (micro channel plate), 68 ... Detection module, 80 ... Electron amplification section (microcapillary), 90 ... Electron detection (Detection transistor), 92 ... Out transistor.

Claims

Irradiating the sample with linear excitation light along the direction in which the light emitted from the light source is wavelength-dispersed and the light is wavelength-dispersed;
Wavelength-dispersing light from the sample in a direction crossing the linear excitation light,
Detecting a substance in the sample by determining an absorption spectrum and an emission spectrum of the sample,
A two-dimensional time-resolved spectroscopic substance detection method, characterized in that:

The two-dimensional time-resolved spectral material detection method according to claim 1,
A two-dimensional time-domain spectroscopic substance detection method, wherein a relaxation time of emission light emitted from the sample is obtained.

A first beam splitting unit that wavelength-disperses the light emitted by the light source;
An irradiation unit configured to irradiate the sample with light emitted from the first beam splitting unit as linear excitation light along a direction in which the wavelength is dispersed;
A second spectroscopic unit that disperses the wavelength of the light from the sample by crossing the linear excitation light,
A light receiving unit that receives light from the second beam splitting unit and outputs an electric signal;
A filter unit that is disposed in an optical path between the light receiving unit and the sample and that transmits emitted light of the sample;
Based on the output signal of the light receiving unit, a spectrum detection unit that determines the absorption spectrum and the emission light spectrum of the sample,
A two-dimensional time-resolved spectroscopic substance detection device, comprising:

The two-dimensional time-resolved spectral material detection device according to claim 3,
The light receiving unit corresponds to each of the photoelectric conversion unit that emits electrons by incidence of light, an amplification module including a plurality of electron amplification units that amplify the electrons emitted by the photoelectric conversion unit, and each of the amplification units. A two-dimensional time-resolved spectral substance detection device, comprising: an electron detection unit provided based on the orthogonal modulation pattern and operating based on the orthogonal modulation pattern.

The two-dimensional time-resolved spectral substance detection device according to claim 3 or 4,
Provided on the output side of the spectrum detection unit, based on the absorption spectrum and the emitted light spectrum determined by the spectrum detection unit, a substance identification unit that detects a substance in the sample,
The substance identification unit identifies the substance by determining a relaxation time of the radiation,
A two-dimensional time-resolved spectral substance detection device, characterized in that: