JP2004283138A

JP2004283138A - Gene transfer

Info

Publication number: JP2004283138A
Application number: JP2003082236A
Authority: JP
Inventors: Shohei Kasugai; 昇平春日井; Shinji Kuroda; 真司黒田
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2003-03-25
Filing date: 2003-03-25
Publication date: 2004-10-14

Abstract

<P>PROBLEM TO BE SOLVED: To provide a method for increasing the efficiency of gene transfer into cells in vivo. <P>SOLUTION: This inventor pays attention to the calcium phosphate (CaP) technique that is used for transferring gene into cultured cells. In this case, the negatively charged DNA has a high affinity to the CaP microscopically fine particles and forms a complex with the CaP microscopically fine particles, then the complex is taken into cells by the endocytosis, further the DNA shifts into the nucleus whereby the transfer is completed. Thus, the inventor has got an idea that the combination of a matrix substance with the CaP technique would have high possibility of increasing the efficiency of the gene transfer in vivo and has completed this invention. <P>COPYRIGHT: (C)2005,JPO&NCIPI

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は改良された生体内での細胞内への効率的な遺伝子導入法に関し、より詳しくは、リン酸カルシウム法による遺伝子導入法の改良に関する。
【０００２】
【従来の技術】
遺伝子導入法は、外来の遺伝子（ＤＮＡ）を細胞に入れ、その遺伝子にコードされたタンパクを細胞に発現させる方法である。遺伝子導入法を疾患の治療に用いる遺伝子治療は、従来の治療法にない治療効果が期待できるため注目されている。ウイルスベクターは遺伝子導入効率が良いことから頻用されているが、遺伝子治療に使用する場合の安全性が問題となっている。ウイルスベクターに比較してプラスミドベクターは安全性が高いが、プラスミド単体では導入効率が低いため遺伝子導入効率を上げるための種々の手法が考案されている。
【０００３】
１９９６年に米国のＢｏｎａｄｉｏ等は、骨誘導因子であるＢＭＰ４（ＢｏｎｅＭｏｒｐｈｏｇｅｎｅｔｉｃＰｒｏｔｅｉｎ４）あるいは骨増加作用を示すＰＴＨ（副甲状腺ホルモン）をコードするプラスミドベクターをコラーゲンと混合したものを、ラット大腿骨の完全離断した骨欠損部に埋入することにより、骨離断部に骨が新生し治癒することを報告した（非特許文献１）。さらに１９９９年にビーグル犬の同様の骨欠損モデルにおいて、ＰＴＨをコードするプラスミドベクターとコラーゲンを混合したものを埋入することにより、離断部に新生骨が形成され治癒することを報告した（非特許文献２）。彼等は、遺伝子を含むポリマー（この場合コラーゲン）をＧｅｎｅＡｃｔｉｖａｔｅｄＭａｔｒｉｘ（ＧＡＭ）と呼称している。ＧＡＭを骨欠損部に埋入すると、周囲組織から由来した主に線維芽細胞がプラスミドベクターを取り込み、コードしてあるタンパク（上記の場合、ＢＭＰ４、ＰＴＨ）を発現して、産生されたタンパクが周囲の細胞に作用することにより、組織再生を促進すると考えられている。
【０００４】
上記のラットの実験において、大腿骨の骨離断距離は５ｍｍで、そこに０．５−１ｍｇのプラスミドＤＮＡを含むＧＡＭを埋入している。また、イヌの実験において骨離断距離は１、１．６、２ｃｍと様々であり、プラスミドＤＮＡの量も変えて実験をおこなっているが、１００ｍｇのプラスミドＤＮＡを埋入した場合に離断部が癒合する。これらの実験において多量のプラスミドＤＮＡを含有するＧＡＭが用いられていることは、遺伝子導入効率が非常に低いことを示している。
【０００５】
【先行文献】
【非特許文献１】
ＦａｎｇＪｅｔａｌ．
Ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎｏｆｎｅｗｂｏｎｅｆｏｒｍａｔｉｏｎｂｙｄｉｒｅｃｔｔｒａｎｓｆｅｒｏｆｏｓｔｅｏｇｅｎｉｃｐｌａｓｍｉｄｇｅｎｅｓ．
ＰｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓｏｆｔｈｅＮａｔｉｏｎａｌＡｃａｄｅｍｙｏｆＳｃｉｅｎｃｅｓｏｆｔｈｅＵｎｉｔｅｄＳｔａｔｅｓｏｆＡｍｅｒｉｃａ．９３（１２）：５７５３−５７５８，１９９６
【非特許文献２】
ＢｏｎａｄｉｏＪｅｔａｌ．
Ｌｏｃａｌｉｚｅｄ，ｄｉｒｅｃｔｐｌａｓｍｉｄｇｅｎｅｄｅｌｉｖｅｒｙｉｎｖｉｖｏ：ｐｒｏｌｏｎｇｅｄｔｈｅｒａｐｙｒｅｓｕｌｔｓｉｎｒｅｐｒｏｄｕｃｉｂｌｅｔｉｓｓｕｅｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ．
ＮａｔｕｒｅＭｅｄｉｃｉｎｅ．５（７）：７５３−７５９，１９９９
【０００６】
【発明の課題】
本発明は、生体内での細胞への遺伝子導入効率をあげることを課題とする。
【０００７】
【発明の課題解決手段】。
本発明者は、培養細胞への遺伝子導入法として用いられているリン酸カルシウム（ＣａＰ）法に注目した。この方法においては、負電荷のＤＮＡはＣａＰ微小顆粒への親和性が高いのでＣａＰ微小顆粒と複合体を形成し、これがエンドサイトーシスによって細胞内に取り込まれ、ＤＮＡが細胞の核へ移行することにより遺伝子導入が起きる。本発明者は、ＧＡＭとＣａＰ法を組み合わせることにより、生体内での遺伝子導入効率を増加できる可能性は高いと考え、種々の検討をおこない本発明を完成した。
【０００８】
すなわち本発明は、
１．生体内での細胞内への遺伝子を直接導入するに際して使用するリン酸カルシウム（ＣａＰ）法において、遺伝子導入用ベクターをマトリックス物質（ＧＡＭ）との共存において、使用することを特徴とする遺伝子導入法。
２．マトリックス物質が、コラーゲンである請求項１の導入法。
３．生体内での細胞内への遺伝子を直接導入するに際して使用するリン酸カルシウム法において、遺伝子導入用ベクターの保持剤としてのマトリックス物質の用途。
４．生体内での細胞内への遺伝子を直接導入するに際して使用するリン酸カルシウム法においての用途である、遺伝子導入用ベクターとマトリックス物質の共存組成物。
５．生体内での細胞内への遺伝子を直接導入するに際して使用するリン酸カルシウム法用試薬とマトリックス物質を含む試薬キット。
からなる。
【０００９】
【発明の実施の態様】
本発明において「リン酸カルシウム法」とは、遺伝子とリン酸カルシウムを共沈殿させ、細胞膜の透過性を変化させて細胞内への遺伝子導入をおこす１９７３年頃より行われている古典的な方法である。この方法は、これまで特殊な装置を必要としない利点がある一方、導入効率が低いことが欠点とされていた。リン酸カルシウム法は培養細胞への遺伝子導入法として用いられてきたが、生体内での細胞への遺伝子導入法としては用いられていなかった。
【００１０】
本発明で使用される遺伝子導入用ベクターとは、ＢＡＣ、ＹＡＣ、組換えウイルス、トランスポゾン等、通常の組み換え実験によって挿入ＤＮＡ断片を導入することが可能な全ての組換えベクターに適用することができる。ベクターは、当然に自体公知の組合せが好適であるプロモーター、エンハンサーと共に構築することができる。例えば、通常宿主に適したプロモーターが挿入されている市販あるいは特別に作成された蛋白質発現ベクターを用いることができる。
具体的には、ＺＡＰＥｘｐｒｅｓｓ（ストラタジーン社製）、ｐＳＶＫ３（アマシャムファルマシアバイオテク社製）、ｐＥＧＦＰ−Ｃ１（クロンテック社製）等が挙げられる。
ベクターへのポリヌクレオチドの挿入は、該ポリヌクレオチドまたはこれを含むＤＮＡ断片をベクター中のプロモーターの下流にプロモーターの制御下におかれるように連結して行う。また、プロモーターと遺伝子との間にコザック配列（Ｋｏｚａｋ，Ｍ．，Ｇｅｎｅ，２３４，１８７，（１９９９））を挿入したり、遺伝子の下流にタグとなるポリペプチドをコードするＤＮＡを挿入した構造を有するベクターも好ましく用いられる。タグとなるポリペプチドとしては特に制限はないが、例えば、ＦＬＡＧタグ（ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，７，５８０，（１９８９））等が挙げられる
環状構造をとるプラスミドＤＮＡ以外に、一本鎖あるいは２本鎖のＤＮＡあるいはＲＮＡの断片を同様の手法で細胞内に導入することが可能である。
【００１１】
本発明で使用されるマトリックス物質としては、コラーゲン、特にＩ型コラーゲン等が好適に例示される。コラーゲン以外のマトリックスとしては、ヒアルロン酸、コンドロチイチン硫酸、キト酸等の多糖類、ＰＬＡ／ＰＬＧＡに代表される生体分解性合成ポリマーの使用が可能である。
マトリックス物質とベクターは、共存しておれば十分でこれらの混合物であっても十分である。配合比は、ベクターの１００重量部に対してコラーゲン等のマトリックス物質を１００〜１００００重量部で混合する。配合量は、適宜用法に応じて変化可能である。
コラーゲンの種類は、特に制限はないが、生体内に多量に存在するＩ型、ＩＩ型、ＩＩＩ型等が望ましい。
【００１２】
なお、ベクターへの遺伝子の組み込み方法は、自体公知の方法を適用できる。例えば、適当な制限酵素を選択、処理してＤＮＡを特定部位で切断し、次いで同様に処理したベクターとして用いるＤＮＡと混合し、リガーゼによって再結合する方法が用いられる。
【００１３】
本発明での遺伝子の細胞への導入は、リン酸カルシウム（ＣａＰ）法である。調製はベクターをリン酸カルシウム法用の溶液に添加することでベクターをリン酸カルシウムの微粒子に吸着させ、これにコラーゲンを加え混合することで調製される。調製後、生体内に注入あるは埋入し、所望の対象細胞と接触させることで、遺伝子の導入が達成可能である。
【００１４】
本発明では、このようなリン酸カルシウム法用試薬とコラーゲンのようなマトリックス物質をキット化し、試薬キットとして調製すれば手技上便宜である。
【００１５】
【実施例】
以下本発明を実施例により具体的に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【００１６】
【実施例１】
ＣａＰ法とＧＡＭの組み合わせが生体での遺伝子導入に及ぼす影響（凍結乾燥ペレットの使用）
哺乳類細胞用のＥＧＦＰ発現プラスミドベクター（ｐＥＧＦＰ，Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）を用いた。ｐＥＧＦＰをＰＢＳに０．５μｇ／ｍｌ（５０ μｇ／１００μｌ）の濃度に溶解し、その溶液２００μｌと、２％の牛アテロコラーゲン溶液（ＫＯＫＥＮ社製）２００μｌを混合した（Ａ）。１００μｇのｐＥＧＦＰをＣａＰ法用溶液に加え（註１）、その溶液２００μｌに２００μｌの２％の牛アテロコラーゲン溶液を加え混合した（Ｂ）。ｐＥＧＦＰをＰＢＳに０．５μｇ／μｌ（５０ μｇ／１００μｌ）の濃度に溶解し、その溶液２００μｌにＰＢＳ２００μｌを加え混合した（Ｃ）。Ｂと同様に１００μｇのｐＥＧＦＰをＣａＰ法用溶液に加え、その溶液２００μｌにＰＢＳを２００μｌ加え混合した（Ｄ）。Ａ，Ｂ，Ｃ，Ｄそれぞれの溶液５０μｌ（１２．５ μｇのｐＥＧＦＰを含む）を０．５ｍｌのプラスチック遠沈管に入れ凍結乾燥した。
ネンブタール麻酔下で６週齢の雄性ＳＤ系ラットの頭部を切開剥離し、皮下に凍結乾燥したそれぞれのペレットを置き、切開部を縫合した。術後１週後と２週後にクロロホルム麻酔下で屠殺し、ペレット埋入部の頭部皮下組織を分離し、７０％エタノール溶液中に浸漬保存した。ペレット埋入部の皮下組織の蛍光を共焦点レーザー顕微鏡（ＣＬＳＭ，Ｚｅｉｓｓ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて観測した。また、２週後のペレット埋入部の組織を５０ｍＭＮａＨ_２ＰＯ_４，１０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ，２００ｍＭＮａＣｌ，ｐＨ８．０の溶液中でホモジナイズした後に、超音波粉砕し、蛍光測光機を用いて蛍光強度を測定した。
結果を以下の表に示す。
【００１７】
【表１】

【００１８】
Ａ，Ｂ群は１週後と２週後それぞれｎ＝５。Ｃ，Ｄ群は１週後と２週後それぞれｎ＝３。この結果は、ＣａＰ法とＧＡＭの組み合わせは、ＧＡＭ単独に比べて遺伝子導入効率が向上することを示している。
【００１９】
註１：プラスミド１００ μｇを６９ μｌのＨ_２Ｏに溶解し、２．５ＭＣａＣｌ_２溶液３１ μｌを加える。次に、２ｘＨＢＳ（４２ｍＭＨｅｐｅｓ，２９０ｍＭＮａＣｌ，１．４ｍＭＮａ_２ＨＰＯ_４，ｐＨ７．２）を１００μｌ加え、丁寧に混合する。
【００２０】
【実施例２】
ＣａＰ法とＧＡＭの組み合わせが生体での遺伝子導入に及ぼす影響（ゲルを使用）
ｐＥＧＦＰを１μｇ／μｌの濃度で含む１％の牛アテロコラーゲンを調整した（Ａゲル）。ｐＥＧＦＰをＣａＰ法溶液に２μｇ／μｌの濃度になるように調整し、同用量の２％の牛アテロコラーゲンを混合した（Ｂゲル）。それぞれのゲルの４０μｌ（２０μｇのｐＥＧＦＰを含む）を、１９Ｇの注射針を用い、ラットの脛骨の近心端より骨髄内に注入した。注入して１週後と、２週後にラットを屠殺し、脛骨を７０％エタノール溶液中に浸漬保存した。共焦点顕微鏡を用いて脛骨の骨髄内を観察した。
結果を以下の表に示す。
【００２１】
【表２】

【００２２】
２週後の組織標本は図１及び２に示した。図１は、「ＧＡＭ，ｐＥＧＦＰ」群、図２は、「ＧＡＭ，ＣａＰ，ｐＥＧＦＰ」群である。
【００２３】
ＧＡＭとして凍結乾燥したコラーゲンではなく、ゲル状のコラーゲンを用いることで、切開をすることなく注射によって遺伝子導入が可能となる。上記の結果は、ＣａＰ法とＧＡＭの組み合わせは、ＧＡＭ単独に比べて遺伝子導入効率が向上することを示している。
【００２４】
【実施例３】
ＣａＰ法とＧＡＭを組み合わせた場合のＤＮＡ保持作用
実施例１と同様にＡとＢの２種類の溶液１ｍｌを調整し、その溶液２００μｌ（５０μｇのｐＥＧＦＰを含む）を凍結乾燥しペレットを作成した。それぞれのペレットを１．５ｍｌのプラスチックチューブに入れ、１ｍｌのＰＢＳを加え、室温で２４時間振盪後、遠心分離し、上清を回収して溶液中のＤＮＡ量を分光光度計により測定した。
結果を以下の表に示す。
【００２５】
【表３】

【００２６】
この結果は、ＣａＰ法とＧＡＭの組み合わせは、ＧＡＭ単独に比べてｐｌａｓｍｉｄＤＮＡの保持力が高いこと示している。
【００２７】
【実施例４】
ＣａＰ法を用いた場合のＤＮＡａｓｅに対する抵抗性
２０μｇのｐＥＧＦＰを５０μｌのＨ_２Ｏに溶解し、ＤＮａｓｅを含む１ＭＴｒｉｓ−ＨＣｌＢｕｆｆｅｒ（註２）５０μｌを加え、３７℃で１時間インキュベートし、その溶液をポリアクリルアミドゲル電気泳動で解析した。一方、ｐＥＧＦＰ１００ μｇを６９ μｌのＨ_２Ｏに溶解し、２．５ＭＣａＣｌ_２溶液３１μｌを加えた。次に、２ｘＨＢＳ（４２ｍＭＨｅｐｅｓ，２９０ｍＭＮａＣｌ，１．４ｍＭＮａ_２ＨＰＯ_４，ｐＨ７．２）を１００μｌ加え、丁寧に混合した。この溶液４０μｌ（２０μｇのｐＥＧＦＰを含む）に１０μｌのＨ_２Ｏを加え、ＤＮａｓｅを含む１ＭＴｒｉｓ−ＨＣｌＢｕｆｆｅｒ（註２）５０μｌを加え、３７℃で１時間インキュベートした。さらに０．２５ＭＥＤＴＡ（ｐＨ８．１）で一晩処理し、微量透析装置を用いて脱塩透析後、凍結乾燥し、ポリアクリルアミドゲル電気泳動で解析した。結果は図３に示した。この結果は、ＣａＰとｐｌａｓｍｉｄＤＮＡを組み合わせることにより、ＤＮＡａｓｅに対する抵抗性が示すことを示している。
【００２８】

【００２９】
【実施例５】
ＣａＰ法とＧＡＭを組み合わせたＢＭＰ２遺伝子導入による骨組織の誘導（ゲルを使用）
哺乳類細胞用のＥＧＦＰ発現プラスミドベクター（ｐＥＧＦＰ，Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）のＥＧＦＰコード部分を、骨誘導作用を示すＢＭＰ２のｃＤＮＡに置き換えた。実験１と同様に、このプラスミドを０．２５μｇ／μｌの濃度で含む１％の牛アテロコラーゲンを調整した（Ａゲル：ＢＭＰ２）。実験１と同様に、このプラスミドをＣａＰ法溶液に加え、同用量の２％の牛アテロコラーゲンを混合した（Ｂゲル：ＢＭＰ２）。それぞれのゲルの８０μｌ（プラスミド２０μｇ）を、ラットの頭部皮下に注入した。注入して４週後にラットを屠殺し、注入部の組織を摘出し、通法に従い固定しパラフィン包埋後、組織学的に検討した。
結果を以下の表に示す。実験に用いた動物の数と、骨様組織形成のあった動物の数を示した。
【００３０】
【表４】

【００３１】
組織標本を図４及び５に示した。
この結果は、ＧＡＭとしてゲル状のアテロコラーゲンを用い、それにＣａＰ法を組み合わせることにより、注射により骨様の組織を皮下に誘導できることを示している。
【００３２】
【実施例６】
ＣａＰ法とＧＡＭを組み合わせたＢＭＰ２遺伝子導入による骨組織の誘導（凍結乾燥ペレットを使用）
哺乳類細胞用のＥＧＦＰ発現プラスミドベクター（ｐＥＧＦＰ，Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）のＥＧＦＰコード部分を、骨誘導作用を示すＢＭＰ２のｃＤＮＡに置き換えたプラスミドを使用した。このプラスミドをＰＢＳに０．５μｇ／μｌ（５０μｇ／１００μｌ）の濃度に溶解しその溶液２００μｌと、２％の牛アテロコラーゲン溶液（ＫＯＫＥＮ社製）２００μｌを混合した（ＧＡＭ−ＢＭＰ２ｐｌａｓｍｉｄ）。１００μｇのプラスミドをＣａＰ法用溶液に加え（註３）、その溶液２００μｌに２００μｌの２％の牛アテロコラーゲン溶液を加え混合した（ＧＡＭ−ＣａＰ−ＢＭＰ２ｐｌａｓｍｉｄ）。それぞれの溶液５０μｌ（１２．５ｍｇのプラスミドを含む）を０．５ｍｌのプラスチック遠沈管に入れ凍結乾燥した。
８週齢のＳＤ系雄性ラットの脛骨を、横に離断して、５ｍｍの骨欠損を作成し、両端の骨を固定装置を用いて固定した。６週後にラットを屠殺し、処置部位を軟Ｘ線装置を用いて撮影した。
結果を以下の表に示す。実験に用いた動物の数と、離断部の接合があった動物の数を示した。
【００３３】
【表５】

【００３４】
軟Ｘ線写真を図６に示した。
【００３５】
註３：プラスミド１００μｇを６９μｌのＨ_２Ｏに溶解し、２．５ＭＣａＣｌ_２溶液３１μｌを加える。次に、２ｘＨＢＳ（４２ｍＭＨｅｐｅｓ，２９０ｍＭＮａＣｌ，１．４ｍＭＮａ_２ＨＰＯ_４，ｐＨ７．２）を１００μｌ加え、丁寧に混合する。
【００３６】
【発明の効果】
以上説明したように、本発明の方法により、遺伝子の細胞内導入が格段の上昇を達成した。
【図面の簡単な説明】
【図１】「ＧＡＭ，ｐＥＧＦＰ」群の２週後の組織標本である。
【図２】「ＧＡＭ，ＣａＰ，ｐＥＧＦＰ」群の２週後の組織標本である。
【図３】ポリアクリルアミドゲル電気泳動図。左より、Ａ：ｐｌａｓｍｉｄＤＮＡ（ＤＮＡａｓｅ未処理）、Ｂ：ｐｌａｓｍｉｄＤＮＡをＤＮＡａｓｅ処理、Ｃ：ＣａＰとｐｌａｓｍｉｄＤＮＡを組み合わせＤＮＡａｓｅ処理。
【図４】組織標本図である。「ＧＡＭ，ｐＥＧＦＰ」群では骨様組織は観察されない。
【図５】組織標本図である。「ＧＡＭ，ＣａＰ，ｐＥＧＦＰ」群では骨様組織の形成が見られた。
【図６】軟Ｘ線写真図である。左は「ＧＡＭ，ＣａＰ，ｐＥＧＦＰ」群、右は「ＧＡＭ，ｐＥＧＦＰ」群である。[0001]
TECHNICAL FIELD OF THE INVENTION
The present invention relates to an improved method for gene transfer into cells in vivo in an improved manner, and more particularly, to an improved method for gene transfer by the calcium phosphate method.
[0002]
[Prior art]
The gene transfer method is a method in which a foreign gene (DNA) is introduced into a cell, and the protein encoded by the gene is expressed in the cell. Gene therapy, which uses gene transfer for the treatment of disease, has attracted attention because it can be expected to have a therapeutic effect not found in conventional treatments. Viral vectors are frequently used because of their high gene transfer efficiency, but their safety when used in gene therapy is a problem. Although plasmid vectors have higher safety than virus vectors, the introduction efficiency of the plasmid alone is low, so various methods have been devised to increase the gene introduction efficiency.
[0003]
In 1996, Bonadio et al. Of the United States reported that a plasmid vector encoding BMP4 (Bone Morphogenetic Protein 4), which is an osteoinductive factor, or PTH (parathyroid hormone) exhibiting a bone-increasing action, was mixed with collagen to obtain a complete rat femur. It has been reported that a bone is newly formed and healed at a bone transection site when the bone is implanted into a transected bone defect (Non-patent Document 1). Furthermore, in 1999, in a similar bone defect model of a beagle dog, it was reported that by implanting a mixture of a plasmid vector encoding PTH and collagen, new bone was formed at the transection site and healed. Patent Document 2). They refer to the gene-containing polymer (in this case, collagen) as Gene Activated Matrix (GAM). When GAM is implanted in a bone defect, mainly fibroblasts derived from surrounding tissues take in the plasmid vector, express the encoded proteins (BMP4, PTH in the above case), and produce the produced protein. It is thought that it acts on surrounding cells to promote tissue regeneration.
[0004]
In the above-described rat experiment, the femur had a bone transection distance of 5 mm, and GAM containing 0.5-1 mg of plasmid DNA was implanted therein. In dog experiments, bone dissection distances varied from 1, 1.6, and 2 cm, and experiments were performed with varying amounts of plasmid DNA. The parts unite. The use of GAMs containing large amounts of plasmid DNA in these experiments indicates that gene transfer efficiency is very low.
[0005]
[Prior literature]
[Non-patent document 1]
Fang J et al.
Stimulation of new bone formation by direct transfer of osteogeneic plasmid genes.
Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93 (12): 5753-5758, 1996.
[Non-patent document 2]
Bonadio J et al.
Localized, direct plasmid gene delivery in vivo: controlled therapies results inreproducible tissue regeneration.
Nature Medicine. 5 (7): 753-759, 1999
[0006]
[Problems of the Invention]
An object of the present invention is to increase the efficiency of gene transfer into cells in a living body.
[0007]
[MEANS FOR SOLVING PROBLEMS]
The present inventors have paid attention to the calcium phosphate (CaP) method used as a method for introducing genes into cultured cells. In this method, negatively charged DNA forms a complex with CaP microgranules because of its high affinity for CaP microgranules, which are taken up into cells by endocytosis, and DNA is translocated to the nucleus of cells. Causes gene transfer. The present inventor considered that it is highly possible to increase the gene transfer efficiency in a living body by combining GAM and the CaP method, and made various studies to complete the present invention.
[0008]
That is, the present invention
1. A gene transfer method comprising using a gene transfer vector in the presence of a matrix substance (GAM) in the calcium phosphate (CaP) method used for directly transferring a gene into cells in a living body.
2. 2. The method according to claim 1, wherein the matrix material is collagen.
3. Use of a matrix substance as a carrier for a gene transfer vector in a calcium phosphate method used for direct transfer of a gene into cells in a living body.
4. A coexisting composition of a gene transfer vector and a matrix substance, which is a use in the calcium phosphate method used for direct transfer of a gene into cells in a living body.
5. A reagent kit comprising a reagent for a calcium phosphate method and a matrix substance used for directly introducing a gene into cells in a living body.
Consists of
[0009]
DESCRIPTION OF THE PREFERRED EMBODIMENTS
In the present invention, the “calcium phosphate method” is a classical method which has been practiced since about 1973, in which a gene and calcium phosphate are co-precipitated, and the permeability of a cell membrane is changed to introduce the gene into cells. While this method has the advantage that no special equipment is required, it is disadvantageous in that the introduction efficiency is low. The calcium phosphate method has been used as a method for introducing genes into cultured cells, but has not been used as a method for introducing genes into cells in vivo.
[0010]
The gene transfer vector used in the present invention can be applied to all recombinant vectors, such as BAC, YAC, recombinant virus, transposon, etc., into which an inserted DNA fragment can be introduced by ordinary recombination experiments. . The vector can be constructed together with a promoter and an enhancer, of which a combination known per se is suitable. For example, a commercially available or specially prepared protein expression vector into which a promoter suitable for a host is usually inserted can be used.
Specific examples include ZAP Express (manufactured by Stratagene), pSVK3 (manufactured by Amersham Pharmacia Biotech), and pEGFP-C1 (manufactured by Clontech).
Insertion of a polynucleotide into a vector is performed by ligating the polynucleotide or a DNA fragment containing the polynucleotide downstream of the promoter in the vector so as to be under the control of the promoter. In addition, a structure in which a Kozak sequence (Kozak, M., Gene, 234, 187, (1999)) is inserted between a promoter and a gene, or a structure in which a DNA encoding a polypeptide serving as a tag is inserted downstream of the gene. A vector having the same is also preferably used. The polypeptide serving as a tag is not particularly limited. For example, in addition to plasmid DNA having a cyclic structure such as a FLAG tag (BioTechniques, 7, 580, (1989)), single-stranded or double-stranded DNA Alternatively, RNA fragments can be introduced into cells by a similar technique.
[0011]
Preferable examples of the matrix material used in the present invention include collagen, particularly type I collagen. As a matrix other than collagen, it is possible to use polysaccharides such as hyaluronic acid, chondroitin sulfate and chito acid, and biodegradable synthetic polymers represented by PLA / PLGA.
It is sufficient that the matrix material and the vector coexist, and even a mixture thereof is sufficient. The mixing ratio is such that 100 to 10,000 parts by weight of a matrix material such as collagen is mixed with 100 parts by weight of the vector. The compounding amount can be appropriately changed depending on the usage.
The type of collagen is not particularly limited, but is preferably type I, type II, type III, or the like, which is present in a large amount in a living body.
[0012]
In addition, a method known per se can be applied as a method for integrating a gene into a vector. For example, a method is used in which a DNA is cleaved at a specific site by selecting and treating an appropriate restriction enzyme, then mixed with a DNA used as a vector similarly treated, and religated with ligase.
[0013]
The introduction of the gene into the cells in the present invention is a calcium phosphate (CaP) method. The preparation is performed by adding the vector to a solution for the calcium phosphate method to adsorb the vector to calcium phosphate microparticles, adding collagen thereto, and mixing. After the preparation, gene transfer can be achieved by injecting or embedding in a living body and bringing it into contact with desired target cells.
[0014]
In the present invention, it is convenient for the technique if such a reagent for calcium phosphate method and a matrix material such as collagen are prepared as a kit and prepared as a reagent kit.
[0015]
【Example】
Hereinafter, the present invention will be described specifically with reference to Examples, but the present invention is not limited to the following Examples.
[0016]
Embodiment 1
Effect of combination of CaP method and GAM on gene transfer in living body (use of freeze-dried pellet)
An EGFP expression plasmid vector for mammalian cells (pEGFP, manufactured by Clontech) was used. pEGFP was dissolved in PBS to a concentration of 0.5 μg / ml (50 μg / 100 μl), and 200 μl of the solution was mixed with 200 μl of a 2% bovine atelocollagen solution (KOKEN) (A). 100 μg of pEGFP was added to the solution for CaP method (Note 1), and 200 μl of 2% bovine atelocollagen solution was added to 200 μl of the solution and mixed (B). pEGFP was dissolved in PBS to a concentration of 0.5 μg / μl (50 μg / 100 μl), and 200 μl of the solution was added with 200 μl of PBS and mixed (C). As in B, 100 μg of pEGFP was added to the solution for the CaP method, and 200 μl of PBS was added to 200 μl of the solution and mixed (D). 50 μl of each of the solutions A, B, C and D (containing 12.5 μg of pEGFP) was placed in a 0.5 ml plastic centrifuge tube and freeze-dried.
Under anesthesia with Nembutal, the head of a 6-week-old male SD rat was incised and peeled, and each lyophilized pellet was placed under the skin, and the incision was sutured. One and two weeks after the operation, the mice were sacrificed under chloroform anesthesia, and the subcutaneous tissue of the head at the site where the pellet was embedded was separated and immersed and stored in a 70% ethanol solution. The fluorescence of the subcutaneous tissue at the portion where the pellet was embedded was observed using a confocal laser microscope (CLSM, Zeiss, Germany). After 2 weeks, the tissue in the pellet-implanted portion was homogenized in a solution of 50 mM NaH ₂ PO ₄ , 10 mM Tris-HCl, 200 mM NaCl, pH 8.0, and then ultrasonically ground, and the fluorescence intensity was measured using a fluorescence photometer. Was measured.
The results are shown in the table below.
[0017]
[Table 1]

[0018]
In groups A and B, n = 5 after 1 week and 2 weeks respectively. In groups C and D, n = 3 after 1 week and 2 weeks respectively. This result indicates that the combination of the CaP method and GAM improves the gene transfer efficiency as compared to GAM alone.
[0019]
Note 1: Dissolve 100 μg of plasmid in 69 μl of H ₂ O and add 31 μl of 2.5 M CaCl ₂ solution. Next, 100 μl of ₂ × HBS (42 mM Hepes, 290 mM NaCl, 1.4 mM Na ₂ HPO ₄ , pH 7.2) is added and mixed carefully.
[0020]
Embodiment 2
Effect of combination of CaP method and GAM on gene transfer in living body (using gel)
1% bovine atelocollagen containing pEGFP at a concentration of 1 μg / μl was prepared (A gel). pEGFP was adjusted to a concentration of 2 μg / μl in the CaP method solution, and the same dose of 2% bovine atelocollagen was mixed (B gel). Forty μl of each gel (containing 20 μg of pEGFP) was injected into the bone marrow from the mesial end of the rat tibia using a 19G needle. One and two weeks after the injection, the rats were sacrificed, and the tibia was immersed and stored in a 70% ethanol solution. The tibia was observed inside the bone marrow using a confocal microscope.
The results are shown in the table below.
[0021]
[Table 2]

[0022]
Tissue specimens after two weeks are shown in FIGS. FIG. 1 shows a “GAM, pEGFP” group, and FIG. 2 shows a “GAM, CaP, pEGFP” group.
[0023]
By using gel-like collagen instead of freeze-dried collagen as GAM, gene transfer can be performed by injection without incision. The above results indicate that the combination of the CaP method and GAM improves the gene transfer efficiency as compared to GAM alone.
[0024]
Embodiment 3
DNA retention effect when CaP method and GAM were combined In the same manner as in Example 1, 1 ml of two kinds of solutions A and B were prepared, and 200 μl of the solution (containing 50 μg of pEGFP) was freeze-dried to prepare pellets. Each pellet was placed in a 1.5 ml plastic tube, 1 ml of PBS was added, the mixture was shaken at room temperature for 24 hours, centrifuged, the supernatant was recovered, and the amount of DNA in the solution was measured by a spectrophotometer.
The results are shown in the table below.
[0025]
[Table 3]

[0026]
This result indicates that the combination of the CaP method and GAM has a higher retention of plasmid DNA than GAM alone.
[0027]
Embodiment 4
Resistance to DNAase using CaP method 20 μg of pEGFP was dissolved in 50 μl of H ₂ O, 50 μl of 1 M Tris-HCl Buffer (Note 2) containing DNase was added, and the mixture was incubated at 37 ° C. for 1 hour. Was analyzed by polyacrylamide gel electrophoresis. On the other hand, 100 μg of pEGFP was dissolved in 69 μl of H ₂ O, and 31 μl of a 2.5 M CaCl ₂ solution was added. Next, 100 μl of ₂ × HBS (42 mM Hepes, 290 mM NaCl, 1.4 mM Na ₂ HPO ₄ , pH 7.2) was added and mixed carefully. 10 μl of H ₂ O was added to 40 μl of this solution (containing 20 μg of pEGFP), 50 μl of 1 M Tris-HCl Buffer (Note 2) containing DNase was added, and the mixture was incubated at 37 ° C. for 1 hour. The cells were further treated with 0.25 M EDTA (pH 8.1) overnight, subjected to desalting dialysis using a microdialysis device, freeze-dried, and analyzed by polyacrylamide gel electrophoresis. The results are shown in FIG. This result indicates that the combination of CaP and plasmid DNA exhibits resistance to DNAase.
[0028]

[0029]
Embodiment 5
Induction of bone tissue by BMP2 gene transfer combining CaP method and GAM (using gel)
The EGFP coding portion of an EGFP expression plasmid vector for mammalian cells (pEGFP, manufactured by Clontech) was replaced with BMP2 cDNA having osteoinductive activity. As in

Experiment

1, 1% bovine atelocollagen containing this plasmid at a concentration of 0.25 μg / μl was prepared (A gel: BMP2). As in Experiment 1, this plasmid was added to the CaP method solution, and the same dose of 2% bovine atelocollagen was mixed (B gel: BMP2). 80 μl (20 μg of plasmid) of each gel was injected subcutaneously in the rat head. Four weeks after the injection, the rat was sacrificed, the tissue at the injection site was excised, fixed according to the usual method, embedded in paraffin, and then histologically examined.
The results are shown in the table below. The number of animals used in the experiment and the number of animals with bone-like tissue formation are shown.
[0030]
[Table 4]

[0031]
Tissue specimens are shown in FIGS.
This result indicates that bone-like tissue can be induced subcutaneously by injection by using gel-like atelocollagen as GAM and combining it with the CaP method.
[0032]
Embodiment 6
Induction of bone tissue by BMP2 gene transfer combining CaP method and GAM (using lyophilized pellet)
A plasmid in which the EGFP coding portion of an EGFP expression plasmid vector for mammalian cells (pEGFP, manufactured by Clontech) was replaced with BMP2 cDNA having osteoinductive activity was used. This plasmid was dissolved in PBS at a concentration of 0.5 μg / μl (50 μg / 100 μl), and 200 μl of the solution was mixed with 200 μl of a 2% bovine atelocollagen solution (KOKEN) (GAM-BMP2 plasmid). 100 μg of the plasmid was added to the solution for the CaP method (Note 3), and 200 μl of the solution was mixed with 200 μl of a 2% bovine atelocollagen solution (GAM-CaP-BMP2 plasmid). 50 μl of each solution (containing 12.5 mg of plasmid) was placed in a 0.5 ml plastic centrifuge tube and freeze-dried.
The tibia of an 8-week-old male SD rat was transected laterally to create a 5 mm bone defect, and the bones at both ends were fixed using a fixing device. Six weeks later, the rats were sacrificed and the treatment sites were photographed using a soft X-ray machine.
The results are shown in the table below. The number of animals used in the experiment and the number of animals having transections were shown.
[0033]
[Table 5]

[0034]
A soft X-ray photograph is shown in FIG.
[0035]
Note 3: Dissolve 100 μg of plasmid in 69 μl of H ₂ O and add 31 μl of 2.5 M CaCl ₂ solution. Next, 100 μl of ₂ × HBS (42 mM Hepes, 290 mM NaCl, 1.4 mM Na ₂ HPO ₄ , pH 7.2) is added and mixed carefully.
[0036]
【The invention's effect】
As described above, by the method of the present invention, the introduction of the gene into cells has been significantly increased.
[Brief description of the drawings]
BRIEF DESCRIPTION OF DRAWINGS FIG. 1 is a tissue sample of a “GAM, pEGFP” group two weeks later.
FIG. 2 is a tissue sample of the “GAM, CaP, pEGFP” group two weeks later.
FIG. 3 is a polyacrylamide gel electrophoresis diagram. From the left, A: Plasmid DNA (untreated with DNAase), B: Plasmid DNA with DNAase treatment, C: Combination of CaP and plasmid DNA with DNAase treatment.
FIG. 4 is a tissue specimen diagram. No bone-like tissue is observed in the “GAM, pEGFP” group.
FIG. 5 is a tissue specimen diagram. In the “GAM, CaP, pEGFP” group, formation of bone-like tissue was observed.
FIG. 6 is a soft X-ray photograph. The left is the “GAM, CaP, pEGFP” group, and the right is the “GAM, pEGFP” group.

Claims

A gene transfer method comprising using a gene transfer vector in the coexistence of a matrix substance in the calcium phosphate method used for directly transferring a gene into cells in a living body.

2. The method according to claim 1, wherein the matrix material is collagen.

Use of a matrix substance as a carrier for a gene transfer vector in a calcium phosphate method used for direct transfer of a gene into cells in a living body.

A co-existing composition of a gene transfer vector and a matrix material, which is a use in the calcium phosphate method used for direct transfer of a gene into cells in a living body.

A reagent kit containing a calcium phosphate method reagent and a matrix substance used when directly introducing a gene into cells in a living body.