【０００１】
【発明の属する技術分野】
この発明は、植物培養細胞によるゴムの生産方法に関するものである。
【０００２】
【発明の背景】
現代工業社会においてゴム製品は至るところに使用されており、ゴム製品なくして社会が成り立たないといっても過言ではない。ゴムはそのように重要な素材であるが、２０００年のゴム素材の日本での消費実績は、天然ゴムで約７５０千トン、代表的な合成ゴムのＳＢＲで約１，１４０千トンである。言うまでもなくＳＢＲは石油由来のものであり、鉱物資源の使用、地球環境保全（炭酸ガスの排出）の観点からはＳＢＲの消費を減少、節減することが望ましい。したがって、ＳＢＲの消費分を天然ゴムで代替すればよいが、天然ゴムは南方地域にその資源的偏りがあり、必ずしも代替がスムーズに行われない。
【０００３】
天然ゴムはゴムの木から採取される樹液を原料とするシス型のイソプレンゴムであるが、その他のゴム資源としては温暖域においても生育可能な杜仲も天然ゴムを産生することが知られている。石油系合成ゴムの発明以前には杜仲からもゴム物質が採取され、海底電線の被覆材、ゴルフボールの被覆材、また、歯科材料などに広く利用されていた。ところが、合成ゴムが安価に合成されるようになったため、これらはほとんど合成ゴムにとって替わられた。
【０００４】
そこで、植物系天然ゴムの生産を復活させることは、地球環境規模においてもきわめて意義あることである。植物系天然ゴムの生産には、言うまでもなく植物を育成することが必要である。これは、先に述べたように植生に地域性があり、特にシス型イソプレンゴム（所謂、天然ゴム）は、南米、東南アジアといったごく限られた地域でしか生産されないからである。したがって、世界中のどこでも植物系天然ゴムの生産が達成されれば、これはゴム生産産業に計り知れない利益をもたらすものである。そして、その技術は地球環境保全の観点から人類にとっても重要な意味を持ってくる。
【０００５】
本発明は、このような実状に鑑み、植物の木としての生育を経由せずに、その植物の培養細胞によって、直接植物系のゴムを提供することを企図したものである。したがって、本発明方法によれば、特殊な地域での植物の栽培、広大な育成面積を必要とせず、工場内でのゴム生産が可能である。
【０００６】
【従来の技術】
通常、植物系天然ゴムを得るには、植物を栽培し、その植物体内でゴム物質を生合成させ、それを採取している。しかし、植物体は必ずしも完全な木まで成長させずともカルスなどの植物培養体においても固有の成分（二次代謝物質）を生合成できることは知られている。
【０００７】
しかし、一般的にはカルス等の植物培養組織は植物体と比べて二次代謝物質の生産能力に劣り、従来、植物培養組織においてゴム物質を生合成（二次代謝）させることに関する報告はない。
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、植物の培養細胞によって植物系天然ゴムを生産する方法を提供することを課題とする。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
本発明は、植物培養組織体において、ゴム物質を生合成させタンク培養によってゴム物質を生産する方法を提供するものである。
【００１０】
すなわち本発明は、植物生長ホルモンおよび炭素源を含む植物組織培養用培地中で培養、育成した杜仲植物体の根組織よりゴムを得ることを特徴とする植物培養によるゴムの生産方法である。
【００１１】
好ましい植物組織培養用培地は、ＭＳ培地、ＬＳ培地、ガンボーグＢ５培地、Ｗｈｉｔｅ培地、Ｎｉｔｓｃｈ培地またはこれらを微改変した培地である。
【００１２】
好ましい炭素源は、シュークロース、グルコース、フルクトース、キシロース、キシルロース等の糖類である。
【００１３】
好ましい植物生長ホルモンは、オーキシン類およびサイトカイン類の少なくとも一方である。
【００１４】
好ましいオーキシン類は、インドール酢酸、ナフタレン酢酸、インドール酪酸、インドールプロピオン酸、２，４−Ｄもしくは２，４，５−Ｔまたはこれらの２種以上の組み合わせである。
【００１５】
好ましいサイトカイン類は、ゼアチン、カイネチネンもしくはベンジルアミノプリンまたはこれらの２種以上の組み合わせである。
【００１６】
好ましい実施形態では、杜仲幼植物体の根をＭＳ培地にα−ナフタレン酢酸を加えた培地中にて振とう培養する。
【００１７】
【発明の実施の形態】
つぎに、この発明を具体的に説明するために、この発明の実施例およびこれとの比較を示すための比較例をいくつか挙げる。
【００１８】
実施例１
愛媛県生名島の杜仲雌株より採集した種子を２重量％の蔗糖を含むゲルライト培地（ゲルライト濃度０．２４重量％）に無菌的に播種した。播種後４０〜６０日経過した幼植物体から根を２〜３ｃｍに切断し、根の切断片を採取した。採取した根切断片を、培地を５０ｍｌずつ分注したコニカルビーカーに３本ずつ入れ、無菌的に振とう培養を行った。
【００１９】
培養には、ＭＳ培地（Ｍｕｒａｓｈｉｇｅ ｅｔ ａ１．， １９６２）に、２，４−ジクロロフェノキシ酢酸（２，４−Ｄ）およびα−ナフタレン酢酸（ＮＡＡ）、３−インドール酪酸（ＩＢＡ）、３−インドール酢酸（ＩＡＡ）（以上オーキシン：植物性ホルモン）と６−ベンジルアミノプリン（ＢＡＰ）を種々の濃度で加え、それぞれに蔗糖（濃度２重量％）を加えた培地を用いた。
【００２０】
温度を２５℃に一定に保ち、光合成有効光量子束密度（ＰＰＦＤ）５０μ ｍｏ１（／ｍ２・ｓ）、明期１６時間／日の照明下で振とう培養し、振とう回数は１００〜１１０回／ｍｉｎとした。
【００２１】
根の培養に適したホルモン濃度を決定するために、まず、表１から分かるようにＮＡＡとＢＡＰを種々の濃度で組み合わせた。この結果、ＢＡＰの濃度が高くなると根が膨張する傾向にあった。そして、ＮＡＡが０．１μＭ、１μＭで、ＢＡＰが０μＭ、０．１μＭ、１μＭである組み合わせの培地（Ｎｏ．２、Ｎｏ．３、Ｎｏ．６、Ｎｏ．７、Ｎｏ．１０、Ｎｏ．１１）では根の伸長が見られた。そこで、これらの培地で伸長した根の本数および長さの合計を調べたところ、Ｎｏ．３（ＮＡＡ：１μＭ、ＢＡＰ：０μＭ）の培地で最も大きな値が得られた。その次に大きな値が得られたのはＮｏ．７（ＮＡＡ：１μＭ、ＢＡＰ：１μＭ）の培地であるが、この培地では培養後４週間目にカルスが形成される傾向があった。
【００２２】
根の伸長の状況は次の通りである。根は培養開始後１０日から２週間目で伸長し始め、Ｎｏ．２（ＮＡＡ：０．１μＭ、ＢＡＰ：０μＭ）の培地では培養後４週間目に、Ｎｏ．３（ＮＡＡ：１μＭ、ＢＡＰ：０μＭ）の培地では培養後６週間目に、それぞれ著しい根の伸張が見られた。また、Ｎｏ．６、Ｎｏ．７、Ｎｏ．１０、Ｎｏ．１１の培地でも根の伸長が見られたが、これらの培地では培養後４週間目にカルスが形成されたり根が膨脹する傾向があり、培養の初期段階において効率のよい根の伸張が見られるのはＮｏ．２とＮｏ．３であった。
【００２３】
培養開始後４週間目におけるＮｏ．２（ＮＡＡ：０．１μＭ，ＢＡＰ：０μＭ）の培地の伸長した根の重量は、０．０５〜０．１５ｇ増加した。
【００２４】
以上の結果から、根の振とう培養ではＢＡＰを加えると根が膨張し、根を効率よく伸長させることが出来ないこと、および、低濃度のＮＡＡのみであればカルスを形成しないことが分かる。したがって、根の増殖の初期段階にはオーキシンＮＡＡが最も有効で有り、その濃度は０．１μＭ〜１μＭ（試験Ｎｏ．２とＮｏ．３）が最も有効である。
【００２５】
比較例１
実施例１で見たように、根の培養にはＢＡＰは必ずしも必要ではなく、オーキシンのみでもよいと考えられたため、他のオーキシンを用いて根の生育状況を試験した。その結果、２，４−Ｄ（表２、試験Ｎｏ．１７〜２２）、ＩＢＡ（表３、試験Ｎｏ．２３〜２２）、ＩＡＡ（表４、試験Ｎｏ．２７〜３０）では、全ての試験培地で著しい根の伸長が見られたものは無かった。
【００２６】
【表１】
【００２７】
【表２】
【００２８】
【表３】
【００２９】
【表４】
【００３０】
実施例２
増殖した根の培養細胞を凍結破砕し、トルエンソックスレー抽出により破砕細胞からゴム成分の抽出を行った。
【００３１】
得られたトルエンソックスレー抽出物をＮＭＲ分析に供し、ゴム成分の存在の有無を調べた。その結果、図２に示すようにトランスポリイソプレンに由来するシグナルが認められ、ゴムの存在が確認された。
【００３２】
また、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）により、ゴムの分子量分布を調べた。その結果、図３に示すように、数平均分子量１１０００、重量平均分子量７６０００、多分散度６．９の分子量分布を有するゴムが生産したことが確認された。
【００３３】
比較例２
実施例１で述べた試験Ｎｏ．４の条件で得られた杜仲のカルスについて、同様にトルエンソックスレー抽出によりゴムの抽出を試みＮＭＲ分析を行った。しかし、図２で認められるようなゴムに由来するシグナルは観測されず、ゴムの存在は磯認できなかった。
【００３４】
比較例３
培養に、ＭＳ培地（Ｍｕｒａｓｈｉｇｅ ｅｔ ａ１．， １９６２）に、α−ナフタレン酢酸（ＮＡＡ）または２，４−ジクロロフェノキシ酢酸（２，４−Ｄ）と６−ベンジルアミノプリン（ＢＡＰ）を種々の濃度で加え、それぞれに蔗糖（濃度２重量％）を加えた培地（表５，表６）を用いた以外、実施例１と同様の操作を行った。
【００３５】
培養の結果、元の茎に根の形成等の変化は全く見られなかった。
【００３６】
【表５】
【００３７】
【表６】
【００３８】
【００３９】
【発明の効果】
この発明によれば、従来難しいとされてきた組織培養系でのゴム生産が初めて可能になった。これにより、タンク培養によるゴム生産が可能である。さらに、遺伝子改変が容易な本培養細胞において、高いゴム生産能を有する形質転換体を作成し、効率的で安定したゴム生産が可能である。
【図面の簡単な説明】
【図１】培養開始後６週間目の杜仲根培養物を示す写真である。
【図２】杜仲根培養物トルエンソックスレー抽出物１Ｈ−ＮＭＲスペクトルである。杜仲ゴム（トランスポリイソプレン）由来のシグナルを矢印で示す。
【図３】杜仲根培養物トルエンソックスレー抽出物ＳＥＣ分析結果を示すグラフである。[0001]
TECHNICAL FIELD OF THE INVENTION
The present invention relates to a method for producing rubber using cultured plant cells.
[0002]
BACKGROUND OF THE INVENTION
In modern industrial society, rubber products are used everywhere, and it is no exaggeration to say that society cannot be established without rubber products. Rubber is such an important material, but the consumption of rubber materials in Japan in 2000 was about 750,000 tons for natural rubber and about 1,140,000 tons for typical synthetic rubber SBR. Needless to say, SBR is derived from petroleum, and it is desirable to reduce and save the consumption of SBR from the viewpoint of using mineral resources and protecting the global environment (emission of carbon dioxide gas). Therefore, the consumption of SBR may be replaced with natural rubber, but natural rubber is not always smoothly replaced due to its resource bias in the southern region.
[0003]
Natural rubber is a cis-type isoprene rubber made from sap collected from a rubber tree, but other rubber resources are known to produce natural rubber, such as Tonaka, which can grow even in warm regions. . Prior to the invention of petroleum-based synthetic rubber, rubber materials were also collected from Tochu, and were widely used as covering materials for submarine electric wires, covering materials for golf balls, and dental materials. However, since synthetic rubbers have been synthesized at low cost, these have almost been replaced by synthetic rubbers.
[0004]
Therefore, reviving the production of plant-based natural rubber is extremely significant on a global environmental scale. Of course, the production of plant-based natural rubber requires growing plants. This is because vegetation has regional characteristics as described above, and cis-isoprene rubber (so-called natural rubber) is produced only in a very limited area such as South America and Southeast Asia. Thus, if the production of plant-based natural rubber is achieved anywhere in the world, this will have immense benefits to the rubber manufacturing industry. And that technology has important significance for human beings from the viewpoint of global environmental protection.
[0005]
The present invention has been made in view of the above circumstances, and aims to provide plant-based rubber directly by cultured cells of the plant without growing the plant as a tree. Therefore, according to the method of the present invention, it is possible to produce rubber in a factory without requiring plant cultivation in a special area and a large growing area.
[0006]
[Prior art]
Usually, in order to obtain a plant-based natural rubber, a plant is cultivated, a rubber substance is biosynthesized in the plant body, and collected. However, it is known that a plant can biosynthesize a unique component (secondary metabolite) even in a plant culture such as callus without necessarily growing to a complete tree.
[0007]
However, in general, plant cultures such as callus are inferior in the ability to produce secondary metabolites compared to plants, and there is no report on biosynthesis (secondary metabolism) of rubber substances in plant cultures. .
[0008]
[Problems to be solved by the invention]
An object of the present invention is to provide a method for producing plant-based natural rubber using cultured cells of a plant.
[0009]
[Means for Solving the Problems]
The present invention provides a method for biosynthesizing a rubber substance in a cultured plant tissue and producing the rubber substance by tank culture.
[0010]
That is, the present invention is a method for producing rubber by plant culture, which comprises obtaining rubber from the root tissue of a Tochu plant grown and grown in a plant tissue culture medium containing a plant growth hormone and a carbon source.
[0011]
Preferred medium for plant tissue culture is MS medium, LS medium, Gamborg B5 medium, White medium, Nitsch medium or a medium obtained by slightly modifying these.
[0012]
Preferred carbon sources are sugars such as sucrose, glucose, fructose, xylose, xylulose and the like.
[0013]
Preferred plant growth hormones are at least one of auxins and cytokines.
[0014]
Preferred auxins are indoleacetic acid, naphthaleneacetic acid, indolebutyric acid, indolepropionic acid, 2,4-D or 2,4,5-T or a combination of two or more thereof.
[0015]
Preferred cytokines are zeatin, kinetinene or benzylaminopurine or a combination of two or more of these.
[0016]
In a preferred embodiment, the roots of the Tochu juvenile plants are cultured with shaking in a medium obtained by adding α-naphthaleneacetic acid to an MS medium.
[0017]
BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION
Next, in order to specifically describe the present invention, some examples of the present invention and comparative examples for comparison with the examples will be given.
[0018]
Example 1
Seeds collected from the Tonaka female strain of Ikunajima, Ehime Prefecture were aseptically seeded on a gellite medium containing 2% by weight of sucrose (gellite concentration: 0.24% by weight). Roots were cut into 2-3 cm from the seedlings 40 to 60 days after sowing, and cut pieces of the roots were collected. Each of the collected root cut pieces was placed in a conical beaker into which 50 ml of the medium was dispensed, and the culture was shaken aseptically.
[0019]
For the culture, 2,4-dichlorophenoxyacetic acid (2,4-D) and α-naphthaleneacetic acid (NAA), 3-indolebutyric acid (IBA), and 3-indole were added to an MS medium (Murashige et al., 1962). Acetic acid (IAA) (above: phytohormone) and 6-benzylaminopurine (BAP) were added at various concentrations, and a medium containing sucrose (2% by weight) in each was used.
[0020]
The temperature is kept constant at 25 ° C, and the photosynthetic effective photon flux density (PPFD) is 50 µmol (/ m 2 · s) under shaking culture under the light of 16 hours / day, and the number of times of shaking is 100 to 110 times. / Min.
[0021]
To determine the appropriate hormone concentration for root culture, NAA and BAP were first combined at various concentrations as seen in Table 1. As a result, when the concentration of BAP was increased, the roots tended to expand. Then, a combination of culture media in which NAA is 0.1 μM, 1 μM, and BAP is 0 μM, 0.1 μM, 1 μM (No. 2, No. 3, No. 6, No. 7, No. 10, No. 11). Showed root elongation. Therefore, when the total number and length of roots elongated in these media were examined, No. 3 (NAA: 1 μM, BAP: 0 μM) gave the highest values. The next largest value was obtained for No. 2. 7 (NAA: 1 μM, BAP: 1 μM). In this medium, calli tended to form 4 weeks after culture.
[0022]
The situation of root elongation is as follows. Roots began to grow 10 days after the start of culture and 2 weeks later. In the medium of No. 2 (NAA: 0.1 μM, BAP: 0 μM), No. 2 was cultured 4 weeks after the culture. In the medium of No. 3 (NAA: 1 μM, BAP: 0 μM), significant root elongation was observed 6 weeks after the culture. No. 6, no. 7, no. 10, no. Although root elongation was observed even in the 11th medium, calli formation and root swelling tended to occur 4 weeks after cultivation in these mediums, and efficient root elongation was observed in the initial stage of culture. No. 2 and No. It was 3.
[0023]
No. 4 weeks after the start of culture. 2 (NAA: 0.1 μM, BAP: 0 μM) increased the weight of the elongated roots by 0.05-0.15 g.
[0024]
From the above results, it can be seen that in the root shaking culture, when BAP is added, the root swells and the root cannot be efficiently elongated, and it does not form callus if only a low concentration of NAA is used. Thus, auxin NAA is most effective in the early stages of root growth, with concentrations of 0.1 μM to 1 μM (test Nos. 2 and 3) being most effective.
[0025]
Comparative Example 1
As seen in Example 1, it was thought that BAP was not necessarily required for culturing roots, and that auxin alone was sufficient. Therefore, root growth was tested using other auxins. As a result, in 2,4-D (Table 2, Test Nos. 17 to 22), IBA (Table 3, Test Nos. 23 to 22), and IAA (Table 4, Test Nos. 27 to 30), all tests were performed. None of the media showed significant root elongation.
[0026]
[Table 1]
[0027]
[Table 2]
[0028]
[Table 3]
[0029]
[Table 4]
[0030]
Example 2
The cultured cells of the grown root were freeze-crushed, and a rubber component was extracted from the crushed cells by toluene soxhlet extraction.
[0031]
The obtained toluene Soxhlet extract was subjected to NMR analysis to examine the presence or absence of a rubber component. As a result, as shown in FIG. 2, a signal derived from trans polyisoprene was recognized, and the presence of rubber was confirmed.
[0032]
The molecular weight distribution of the rubber was examined by size exclusion chromatography (SEC). As a result, as shown in FIG. 3, it was confirmed that a rubber having a molecular weight distribution of a number average molecular weight of 11,000, a weight average molecular weight of 76,000, and a polydispersity of 6.9 was produced.
[0033]
Comparative Example 2
The test No. described in the first embodiment. With respect to the callus of Tonaka obtained under the conditions of No. 4, rubber extraction was similarly attempted by toluene soxhlet extraction, and NMR analysis was performed. However, no signal derived from rubber as observed in FIG. 2 was observed, and the presence of rubber could not be recognized.
[0034]
Comparative Example 3
For culture, α-naphthaleneacetic acid (NAA) or 2,4-dichlorophenoxyacetic acid (2,4-D) and 6-benzylaminopurine (BAP) were added to MS medium (Murashige et al., 1962) at various concentrations. And the same operation as in Example 1 was performed except that a medium (Table 5 and Table 6) to which sucrose (concentration: 2% by weight) was added respectively was used.
[0035]
As a result of the culture, no change such as root formation was observed in the original stem.
[0036]
[Table 5]
[0037]
[Table 6]
[0038]
[0039]
【The invention's effect】
According to the present invention, it has become possible for the first time to produce rubber in a tissue culture system, which has been considered difficult. Thereby, rubber production by tank culture is possible. Furthermore, a transformant having a high rubber-producing ability is prepared in a main cultured cell in which gene modification is easy, and efficient and stable rubber production is possible.
[Brief description of the drawings]
BRIEF DESCRIPTION OF DRAWINGS FIG. 1 is a photograph showing a culture of Tonaka roots 6 weeks after the start of culture.
FIG. 2 is a 1 H-NMR spectrum of a Tochu root culture solubilized by Soxhlet extract. Arrows indicate signals derived from Du Zhong rubber (trans polyisoprene).
FIG. 3 is a graph showing the results of SEC analysis of a Tonaka root culture in toluene soxhlet extract.
