JP2004279113A

JP2004279113A - Method of manufacturing extract of antigen or antibody

Info

Publication number: JP2004279113A
Application number: JP2003068471A
Authority: JP
Inventors: Koichiro Hirata; 広一郎平田; Fumio Ukaji; 文緒宇梶; Naohiro Haniyu; 尚広羽生
Original assignee: Tokuyama Dental Corp; Tokuyama Corp
Current assignee: Tokuyama Dental Corp; Tokuyama Corp
Priority date: 2003-03-13
Filing date: 2003-03-13
Publication date: 2004-10-07
Anticipated expiration: 2023-03-13
Also published as: JP4157400B2

Abstract

<P>PROBLEM TO BE SOLVED: To provide a method for rapidly and easily manufacturing an extract containing antigens or antibodies with a high concentration. <P>SOLUTION: A chamber for supplying liquid to be filtered communicates with a filtrate outlet via a filtration film, a humor liquid to be inspected is filtered by a filter equipped with a negative pressure means at the upstream of the chamber for supplying the liquid to be filtered, the retained object of an antigen or an antibody is captured on a permeation film, then the inside of the filter is set to be under a negative pressure by the negative pressure means, thus absorbing solution for extraction from the filtrate exhausting port for flowing backward in the filter and manufacturing the extract of an antigen or an antibody. <P>COPYRIGHT: (C)2005,JPO&NCIPI

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、抗原または抗体の抽出液の製造方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
臨床検査、食品分析、環境分析等において、例えば微生物等の抗原又は抗体の保持物を含有する被検体液から、該抗原又は抗体の保持物を抽出し、分析試料とすることが行われている。この被検体液からの抗原又は抗体の保持物の抽出は、濾過法、即ち、被濾過液供給室と濾過液排出口とが濾過膜を介して連通する濾過装置を用い、その被濾過液供給室に被検体液を供給して濾過して、該抗原又は抗体の保持物を濾過膜上に捕捉し、液成分を濾過液排出口から排出させる方法が汎用されている。かかる濾過法は、遠心分離法等と比較して特別な装置を必要とせず、迅速且つ簡便に抗原又は抗体の保持物を捕捉・濃縮できるため大変効率的である。
【０００３】
このようにして捕捉された抗原又は抗体の保持物は、そのまま分析試料として用いても良いが、分析の感度や特異性を向上させるためには、このものに抽出用液を作用させ、抗原または抗体のみを分離・回収して用いるのが有効である。その場合、この抽出操作は、前記濾過法により、抗原又は抗体の保持物が捕捉された濾過膜に、抗原又は抗体の抽出用液を被濾過液供給室側から流し、濾過液排出口から排出される抽出液を回収する方法が一般的に採用されてきた（例えば特許文献１、特許文献２参照）。
【０００４】
【特許文献１】
特表平０８−５０２４１３号公報
【特許文献２】
特表２００２−５１９６４９号公報
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
しかし、上記方法は、抽出用液と抗原又は抗体の保持物の接触時間が限られる。さらには、濾過膜状に、多量の抗原又は抗体の保持物が保持されていたり、該抗原又は抗体の保持物が粘着質のものであったり、さらには、これら抗原又は抗体の保持物の他に粘着質等の共雑物が含有されている場合には、捕捉されている該抗原又は抗体の保持物の内部まで抽出用液が十分に作用し難くなり、満足できる抽出効率が得られない問題があった。このため、上記抽出方法では、抗原又は抗体の抽出用液を流す操作を加圧下に行い、その流通性を向上させることが行われているが、根本的な解決に至っていないのが実状である。
【０００６】
しかして、この問題は、特に、ムチン等の粘着性多糖を含有する唾液や、不溶性、粘着性多糖を含有する微生物を含有する試料が被検体液の場合には、特に顕著に発生しており、そのさらなる改善が望まれていた。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記課題に鑑み鋭意研究を続けてきた。その結果、
▲１▼抽出用液を、濾過膜に対して被検体液の濾過方向とは逆方向に通過させることで、該保持物に保持された抗原または抗体の抽出効率が向上すること、▲２▼このような抽出用液の濾過装置内への導入は、被濾過液供給室の上流に陰圧手段を備えれば簡単に実現できることを見出し、本発明を完成させるに至った。
【０００８】
すなわち、本発明は、被濾過液供給室と濾過液排出口とが濾過膜を介して連通しており、被濾過液供給室の上流に陰圧手段を備えた濾過装置により、抗原又は抗体の保持物を含有する被検体液を濾過して、該抗原又は抗体の保持物を濾過膜上に捕捉し、次いで、上記陰圧手段により濾過装置内を陰圧にして、濾過液排出口より抽出用液を吸液して該濾過装置内を逆流させ、被濾過液供給室に抗原又は抗体の抽出液を貯留することを特徴とする抗原又は抗体の抽出液の製造方法である。
【０００９】
【発明の実施の形態】
本発明の抗原又は抗体抽出液の製造方法は、被濾過液供給室と濾過液排出口とが濾過膜を介して連通しており、被濾過液供給室の上流に陰圧手段を備えた濾過装置を用いて実施する。該濾過装置に関して、以下で図面を使用し説明する。図１は、本発明で使用する濾過装置の代表的態様を示した斜視図である。
【００１０】
この濾過装置は、被濾過液供給主室１と濾過液排出口２とを備えている。また、濾過膜３は、濾過膜収納部４内に収納されており、前記被濾過液供給主室１は、接続部５により該濾過膜収納部４に接続されている。したがって、被濾過液供給主室１と濾過液排出口２とは、該濾過膜３を介して互いに連通した構造をしている。この装置は、上記濾過液排出口２と後述する被濾過液供給主室１の上流に設けられる陰圧手段への接続口以外には他に開口部はなく密閉系である。
【００１１】
本発明において、被濾過液供給室は、濾過膜より上流に設けられた、被濾過液の一定量が貯留される空隙の全てをいう。したがって、濾過膜収納部４内において、濾過膜３の上部には、該濾過膜収納部に流入した被検体液を一時的に貯留する小空間６が設けられているが、この小空間６も、本発明における被濾過液供給室の一部をなす。
【００１２】
一方、本発明において濾過液排出口２は、濾過液等の排出及び後述する抽出溶液の吸液の操作性から、管状等の凸部として形成されているのが好ましい。
【００１３】
被濾過液供給主室１の上流には、シリンジ外筒７とプランジャー８で構成されたシリンジ９からなる陰圧手段が設けられている。陰圧手段は、装置内を陰圧にする機能を有するものであれば良いが、このシリンジ９のように加圧機能を備えたものであるのが、被検体液が濾過性の悪い液である場合において、加圧濾過により効率的な濾過を可能にできるため好ましい。
【００１４】
本発明の抗原又は抗体抽出液の製造方法では、上記構造の濾過装置を用い、まず、その被濾過液供給主室１に、抗原又は抗体の保持物を含有する被検体液を供給する。この供給操作は、シリンジ９との接続部を濾過液供給主室１から外した後、ピペット等の器具を使用して、濾過液供給主室１に供給すること等により適宜に行えばよい。
【００１５】
次いで、この被検体液を、濾過膜３まで下方に流し、自然濾過又はシリンジ９において、プランジャー８を押して装置内を加圧することにより加圧濾過する。
この濾過により、被検体液に含まれる抗原又は抗体の保持物は、濾過膜３の上面や内部の細孔に捕捉される。他方、濾過膜３を通過し、抗原又は抗体の保持物から分離された濾過液は、濾過液排出口２から装置外へ排出される。なお、濾過膜３上に捕捉された抗原又は抗体の保持物は、必要に応じて適当な洗浄用溶液（例えば純水、緩衝液、酸溶液、アルカリ溶液、界面活性剤溶液等を例示できる）で洗浄することもできる。洗浄は、洗浄用溶液を、自然濾過又は加圧濾過することにより行っても良いし、濾過液排出口２より吸液して、濾過装置内を逆流させた後に排出することにより行っても良い。
【００１６】
そして、本発明では、シリンジ９において、プランジャー８を引いて濾過装置内を陰圧にして、濾過液排出口２より、抗原又は抗体の保持物から該抗原又は抗体を抽出する作用を有する抽出用液を吸液して、該濾過装置内を逆流させる。それにより、濾過膜３に捕捉される抗原又は抗体の保持物に、該抽出用液が接触し抗原又は抗体が抽出される他、この抽出用液の濾過装置内を逆流する流れに随伴して、該濾過膜３に捕捉されていた抗原又は抗体の保持物の多くが、再度、小空間６を経て被濾過液供給主室１に吸い上げられる。この逆流する流れの過程や、被濾過液供給主室１内に貯留された状態で一定時間、好適には１時間以内、より好適には１０秒〜２０分放置することにより、抗原又は抗体の保持物に対して抽出用液を十分に作用させることができる。したがって、かかる本発明の方法によれば、抗原又は抗体の抽出効率を大きく向上させることができる。
【００１７】
抽出効率をより高めるためには、被濾過液供給主室１内に抽出用液を貯留した後、被濾過液供給主室１を一定時間振動等して、抽出用液に液流を生じさせても良い。
【００１８】
本発明では、この被濾過液供給主室１内に貯留され、抗原又は抗体の十分な抽出が終了した抗原又は抗体抽出液を、該被濾過液供給主室１より採取して分析試料として用いても良い。この採取操作は、接続部５を濾過膜収納部４から外して抽出液を排出させたり、シリンジ９との接続部を濾過液供給主室１から外した後、ピペット等の器具を使用して採取すること等により適宜に行えばよい。
【００１９】
一方向のみから、１回の吸引操作により抽出用溶液を濾過膜に通過させる方法では、被検体液に含有されていた抗原又は抗体の保持物が粘着質のものであったり、さらには、これら抗原又は抗体の保持物の他に粘着質等の共雑物が含有されている場合等においては、これらが濾過膜３内部の細孔を閉塞し、その奥に詰まった抗原又は抗体の保持物にまで上記抽出用溶液が十分に作用しないことがある。したがって、このような場合には、被濾過液供給主室１及び小空間６に貯留された抗原又は抗体の抽出液を、貯留後すぐにまたは一定時間保持後、自然濾過又は加圧濾過し、反対方向からの液流を作用させ、濾過液排出口２から排出される抽出液を分析試料として用いるのが好ましい。なお、このように濾過液排出口２から排出される抽出液を分析試料として用いれば、抗原又は抗体が抽出された後のこれらの保持物の残渣や共雑物が濾過により取り除かれるため、これらが分析時の抗原抗体反応に悪影響を及ぼすおそれがある場合には有意義である。
【００２０】
さらに、上記操作でも、満足できるだけの抽出が行えない場合には、上記により濾過液排出口２から排出された抽出液を再度、濾過液排出口より吸液して濾過装置内を逆流させ、被濾過液供給室１に貯留すればよく、本発明では、所望の抽出効率が達成されるまで、該抽出液の濾過、吸液操作を必要回数、通常は濾過を１〜１０回、吸液を０〜１０回繰り返して行えばよい。
【００２１】
さらに、他の方法としては、前記被濾過液供給主室１及び小空間６に貯留された抗原又は抗体の抽出液を、自然濾過又は加圧濾過して、抗原又は抗体の保持物を再度、濾過膜３上に捕捉した後、一定時間放置し、膜に残存する抽出液により十分な抽出を遂行することもできる。この場合、抗原又は抗体の保持物は、抽出液と混ざり合った状態で、濾過膜３上の内部細孔に捕捉されていくので、微細部分に捕捉されたものまで抗原又は抗体の保持物は抽出液に良く浸っており、抗原又は抗体の抽出は、効果的に進行する。濾過膜３に含まれる抗原または抗体の抽出液は、▲１▼使用した抽出用液と同じ組成液等の回収用液を、被濾過液供給主室１に供給して自然濾過、加圧濾過したり、濾過液排出口２か吸液して逆流させることにより回収するか、▲２▼濾過膜収納部４を解体して濾過膜３を取り出し、抽出液を回収する等の方法により採取すればよい。このような方法によれば、抽出液量を必要最小限にできる、または、回収溶液を適宜選択することで抽出液の組成を適宜に調整することができる。上記方法では、好適には１時間以内、より好適には１０秒〜２０分放置することにより、抗原又は抗体の保持物に対して抽出用液を十分に作用させることができる。
【００２２】
図２は、本発明で使用する濾過装置の別の態様を示した側面図である。この濾過装置は、濾過膜収納部４内において、濾過膜３の上下に空間がほとんど形成されておらず、この濾過膜収納部４の上面に直接、陰圧手段であるシリンジ９の先端部が脱着可能に接続されたものであり、被濾過液供給室はシリンジ外筒７の内空部に形成される。このような装置は、構造が簡単である他、吸液された抗原又は抗体の抽出液のほぼ全てが、該シリンジ外筒７の内空部に貯留されるため、これを分析試料として用いる場合には、操作上効率的である。
【００２３】
勿論、濾過装置の形状は図１、図２に限定されない。
【００２４】
以上のような構造の、本発明で用いる濾過装置において、濾過膜３は、材質、孔径、形状等は特に限定されず、従来公知の濾過膜を使用することができる。被検体液中の抗原又は抗体の保持物に対し実用上十分な捕捉能が得られるように、孔径や材質の異なる複数の膜を組合わせて使用することも可能である。抗原又は抗体の保持物が微生物である場合には、孔径は０．１μｍ〜５μｍであるのが好ましい。尚、本発明における孔径とは、濾過膜３が多孔質膜である場合は、バブルポイント法（ＪＩＳＫ３８３２に記載の方法）により測定される孔径を、また、濾過膜３が濾紙等である場合は、硫酸バリウム等を自然濾過した際の漏洩粒子経を求める方法（ＪＩＳＰ３８０１に記載の方法）により測定される保留粒子径を指す。
【００２５】
濾過膜３の材質としては、被検体液や抽出用溶液に対する耐薬品性等を考慮し、ガラス繊維；ポリビニリデンフルオライド（ＰＶＤＦ）、ポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）、ポリサルフォン、ポリカーボネート、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリアミド等のプラスチック類；セルロース、ニトロセルロース、アセチルセルロース等のセルロース類等を使用することができる。また、ガラス繊維濾紙の細片や活性炭等の集合体も使用することができる。
【００２６】
濾過膜収納部４の形状は特に限定されず、濾過膜３の形状に応じて適宜選択すればよい。濾過膜収納部４の材質は特に限定されず、量産の容易さや耐薬品性等を考慮し、ポリプロピレンやポリエチレン等のプラスチック材料を使用することができる。吸液や濾過時の濾過膜３の変形や破損を防止する目的で、濾過膜３の上面又は下面には、放射状、格子状、点状等の各種パターン構造を有す板状構造体；ナイロンネット等の網目状材料；多孔性材料；ガラス繊維やポリプロピレン不織布等の繊維材料等を介在させても良い。また、濾過膜３の上面には、濾過を容易にする目的で活性炭や濾紙粉末等の濾過助剤を添加することもできるし、或いはガラスフィルター、ポリプロピレン不織布等のプレフィルターを設置することもできる。
【００２７】
陰圧手段としては、濾過装置内部を装置外部に対して陰圧状態とすることができる手段であれば、従来公知の陰圧手段を使用することができる。このような陰圧手段としては、シリンジ、スポイト、ゴム球等の各種手動器具や、真空ポンプ、アスピレーター等の各種装置を使用することができる。このうちシリンジ、スポイト等は、前記した図２の濾過装置のように、被濾過液供給室の機能を兼ねることができるため特に有用である。被検体の濾過を加圧下に行う場合において、加圧を陰圧手段とは別の独立した手段で行うことも適宜に可能である。こうした加圧手段としては、ボンベ、加圧用ポンプ等が挙げられる。
【００２８】
次に、本発明において被検体液は、抗原または抗体の保持物を懸濁状態で含む液体であれば特に限定されず、従来公知の懸濁液を使用できる。このような懸濁液としては、微生物（酵母、カビ、キノコ、細菌、放線菌、単細胞藻類、ウイルス、原生動物、動物または植物の分化してない細胞及び組織培養物等を例示できる）の培養液；飲食物；咽頭ぬぐい液、唾液、血漿、血清、尿等の体液；河川水、下水、工業用水等の環境水；或いは微生物、飲食物、糞便、歯垢等の固形物を水性液体（純水、生理食塩水等の塩溶液、リン酸緩衝液等の緩衝溶液等を例示できる）に適宜懸濁した懸濁液等が挙げられる。
【００２９】
上記抗原または抗体は、公知のものが制限無く対象になる。例えば、抗原としては、細胞膜タンパク質、細胞壁タンパク質、リポ多糖等のタンパク質や糖タンパク質或いは脂質タンパク質；グリコシルトランスフェラーゼ等の酵素タンパク質；莢膜多糖や血清型多糖等の各種糖類；核酸；レセプター等が例示される。また、抗体としてはＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ等の免疫グロブリンが例示される。
【００３０】
特に好適な被検体液としては、唾液や歯垢等の口腔内試料を含む被検体液を例示できる。該口腔内試料を含む被検体液には、口腔内細菌等の微生物、及び唾液ムチンや口腔内細菌の産生する不溶性・粘着性グルカン等の粘着性物質が含まれるため、濾過時に濾過膜が閉塞し易い。このような被検体液を抽出処理する場合には、本発明の製造方法を使用することで特に迅速且つ簡便に高濃度の抗原抽出液を製造することができる。
【００３１】
近年、歯牙の齲蝕のリスクを診断するために、口腔内より採取した唾液や歯垢を含む中に存在する齲蝕関連菌の濃度を測定することが試みられている。このような齲蝕関連菌を例示すれば、ミュータンスレンサ球菌に属する細菌（ストレプトコッカス・ミュータンスやストレプトコッカス・ソブリヌスを例示できる）、ラクトバチルス属に属する細菌、アクチノミセス属に属する細菌を例示できる。
これらの齲蝕関連菌の多くは、糖鎖抗原（血清型多糖抗原）を有する微生物であるが、唾液や歯垢中に１０^４〜１０^７個／ｍｌ程度に微量にしか含まれておらず、さらに通常は、不溶性グルカンに覆われた凝集状態で存在しているため、該齲蝕関連菌を直接分析する方法は限定される。このような状況にあって、本発明の方法は、かかる唾液や歯垢中に存在する齲蝕関連菌を高精度で分析するに際して、糖鎖抗原を抽出する方法として適用できる。
【００３２】
抗原または抗体の保持物に対して使用する抽出用液は、中島暉躬等編（１９８８年）：抽出・精製・分析Ｉ：１４−３８．新基礎生化学実験法２．丸善株式会社、小川智也等編（１９９２）：糖鎖工学：２８２−３２１．株式会社産業調査会等に記載されている従来公知の可溶化法や溶媒抽出法において使用される抽出用液や、その他、化学的或いは生物学的切断・分解方法において使用される抽出用液が制限なく使用できる。具体的には、可溶化法や溶媒抽出法に使用する、塩化マグネシウム水溶液、チオシアン酸ナトリウム水溶液、グアニジン塩酸水溶液等の塩溶液；塩酸等の酸溶液；水酸化ナトリウム水溶液等のアルカリ溶液；デオキシコール酸ナトリウム水溶液、オクチルグルコシド水溶液、セチルトリメチルアンモニウムブロミド水溶液、３−［（３−コラミドプロピル）ジメチルアンモニオ］−１−プロパンスルホン酸水溶液等の界面活性剤溶液；ｎ−ブタノール等の有機溶媒；グリシン塩酸緩衝液等の緩衝溶液等が、また、化学的或いは生物学的切断・分解方法に使用する、亜硝酸水溶液；塩酸等の酸溶液；水酸化ナトリウム水溶液等のアルカリ溶液、プロテアーゼ、ホスホリパーゼ等の酵素を含む溶液等が例示できる。
【００３３】
前記した唾液や歯垢等の口腔内試料を含む被検体液から齲蝕関連菌の糖鎖抗原を抽出する場合においては、いわゆる亜硝酸抽出法で使用される抽出用液が使用される。亜硝酸抽出法は、短時間に且つ高い効率で、微生物から血清型多糖抗原等の特異性の高い糖鎖抗原を抽出できる（武井勉．阪大医学雑誌．３５：９３−１０９，１９９０．）。しかしながら、微生物を捕捉した濾過膜上に亜硝酸溶液を添加し流下させる方法では、亜硝酸溶液を濾過膜の細部に浸透させることが困難であるため、十分な抽出効率が達成されない場合があり、本発明の方法を適用するのに特に適している。
【００３４】
上記亜硝酸抽出法を実施する場合において抽出用液となる亜硝酸溶液は、一般的には亜硝酸塩溶液と酸溶液とを適宜混合することで調製できる。亜硝酸塩溶液としては、亜硝酸ナトリウムや亜硝酸カリウム等の水溶液が使用でき、酸溶液としては酢酸、プロピオン酸、クエン酸等の有機酸水溶液や硝酸、塩酸等の無機酸水溶液が使用できる。亜硝酸塩溶液と酸溶液との混合時において、亜硝酸塩の濃度は、０．１〜８Ｍになる濃度であり、酸の濃度は０．１〜１６Ｍになる量であるのが好ましい。
【００３５】
上記亜硝酸溶液の液温は、通常、１０〜６０℃が好ましい。また、抽出操作全体を通じて、かかる亜硝酸溶液と抗原または抗体の保持物が接触している時間は、少なくとも０．５分以上、好適には０．５〜１０分であるのが好ましい。
【００３６】
亜硝酸抽出法により得られた抽出液は、残留する酸により酸性を呈しているため、該抽出液を免疫学的測定方法等に適用する場合は、塩基性溶液により中和して分析試料として使用することが好ましい。該塩基性溶液としては、水酸化ナトリウム水溶液やトリス水溶液等の各種塩基を含む水溶液、或いはトリス−塩酸緩衝液等の各種緩衝液を使用することができる。これら中和用液は、被濾過液供給室に直接的に供給して抽出液に混合したり、濾過装置外に取り出した抽出液に加えて混合しても良いが、濾過液排出口２より吸液して混合するのが好ましい。なお、前記したように、抗原又は抗体の保持物を濾過膜３上に捕捉した後、膜に残存する抽出液により十分な抽出を遂行する場合は、この中和用液を、該抽出液の回収用液として利用すればよい。
【００３７】
以上により得られた抗原又は抗体の抽出液から該抗原量または抗体量を測定する方法は、抗原又は抗体の化学的、物理的、生物学的、或いは免疫学的性質を利用した公知の測定方法が適宜に採用される。具体的には、抗原または抗体を構成する元素を分析する方法としては、放射化学分析法、有機元素分析法、原子スペクトル分析法、蛍光Ｘ線分析法等が例示できる。官能基や分子の化学的性質を利用する方法としては、ｐＨ測定法、イオン電極法、電気化学分析法、固定化酵素法、化学修飾による各種官能基の分析法が例示できる。またマススペクトロメトリー法やＮＭＲ法が例示できる。また、固定相と移動相との交換反応を利用した各種クロマトグラフィー法が例示できる。また、分子量や荷電状態といった性質を利用する電気泳動法が例示できる。
【００３８】
生化学的性質を利用する方法としては、各種酵素活性測定法やＰＣＲ（ポリメラーゼ鎖反応）法等が例示できる。免疫学的性質を利用する方法としては、ラテックス法等の凝集法、放射免疫測定法、酵素免疫測定法、標識抗体法、ウエスタンブロット法等の各種イムノブロット法、イムノクロマトグラフィー法等が例示できる。（中島暉躬等編（１９８８年）：抽出・精製・分析Ｉ．新基礎生化学実験法２．丸善株式会社、中島暉躬等編（１９８８年）：抽出・精製・分析ＩＩ．新基礎生化学実験法２．丸善株式会社、大沢利昭等編（１９９２年）：分子免疫学ＩＩＩ．新生化学実験講座１２．株式会社東京化学同人）。
【００３９】
【実施例】
以下、実施例により本発明を具体的に説明するが、本発明は以下の実施例により限定されるものではない。
【００４０】
製造例１
〔ストレプトコッカス・ミュータンスに対する精製ポリクローナル抗体の作製〕
（１）［菌体試料懸濁液の調製］
ブレインハートインフュージョン（以下「ＢＨＩ」と略すこともある）（ＤＩＦＣＯ社）３．７ｇを１００ｍｌの純水に溶解後、オートクレーブ処理し、ＢＨＩ液体培地を調製した。ＢＨＩ液体培地２ｍｌ中でＩｎｇｂｒｉｔｔ（ストレプトコッカス・ミュータンス、血清型ｃ）を３７℃、５時間、嫌気条件下（Ｎ_２：Ｈ_２：ＣＯ_２＝８０：１０：１０）で培養した後、培養液を４０００ｇ、５分遠心処理し、上清の培地成分を除去し菌体沈殿を回収した。
【００４１】
次いで、沈殿物を５ｍｌのリン酸生理食塩緩衝液（ｐＨ７．４）（以下ＰＢＳと略すこともある）に懸濁し、同様の遠心分離をする操作を３回行い、沈殿物を洗浄した。その後得られた菌体沈殿をＰＢＳに懸濁し、Ａ_６００＝１．０に調整しＩｎｇｂｒｉｔｔ菌体試料懸濁液とした。なお、該菌体試料懸濁液を超音波処理後、適宜希釈した後にＢＨＩ培地プレート上に添加し、生じたコロニー数を計数し菌体試料懸濁液の希釈倍率を乗じることで該菌体試料懸濁液の菌体濃度を求めたところ、約１×１０^９個／ｍｌであった。
【００４２】
（２）〔ストレプトコッカス・ミュータンスに対する抗血清の作製〕
免疫は以下のように実施した。
【００４３】
第１週は０．５ｍｌのＩｎｇｂｒｉｔｔ菌体試料懸濁液を、５日連続で５回ウサギに対し耳介静脈注射した。第２週は１．０ｍｌの該菌体試料懸濁液を、５日連続で５回ウサギに対し耳介静脈注射した。第３週は２．０ｍｌの該菌体試料懸濁液を、５日連続で５回ウサギに対し耳介静脈注射した。第４週は第３週と同様に免疫した。力価の上昇をスライドグラスを利用した菌体の凝集反応の程度により確認後、最終免疫より１週間後に、定法に従い採血しストレプトコッカス・ミュータンスに対する抗血清を得た。
【００４４】
（３）〔ストレプトコッカス・ミュータンスに対するポリクローナル抗体の精製〕
オートクレーブ処理したＢＨＩ液体培地１Ｌ中でＩｎｇｂｒｉｔｔを３７℃、１２時間、嫌気条件下で培養した。培養液を４０００ｇ、５分遠心処理し、上清の培地成分を除去し菌体沈殿を回収した。次いで、沈殿物を１００ｍｌのＰＢＳに懸濁させて、同様の遠心分離をする操作を３回行い、沈殿物を洗浄した。
【００４５】
Ｉｎｇｂｒｉｔｔ菌体を洗浄した後、０．１Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）に懸濁しＡ_６００＝１５に調整した。ここにプロナーゼ（和光純薬社）を５ｍｇ／ｍｌとなるように添加し、３７℃で１時間保温した。反応終了後、遠心分離し菌体沈殿を回収した。次いで、沈殿物を２０ｍｌのＰＢＳに懸濁して、同様の遠心分離をする操作を３回行い、沈殿物を洗浄した。次いで２０ｍｌの０．１Ｍグリシン塩酸緩衝液（ｐＨ２．０）で３回洗浄し、更に２０ｍｌのＰＢＳで３回洗浄し、プロテアーゼ処理菌体懸濁液（Ａ_６００＝１２．５）を調製した。
【００４６】
次いで、該プロテアーゼ処理菌体懸濁液と（２）で調製した抗血清０．５ｍｌとを混合し、４℃、６０分反応させた。混合液を４０００ｇ、５分遠心分離し、菌体を回収した。この菌体を１０ｍｌのＰＢＳに懸濁し、同様の遠心分離をする操作を３回行い洗浄した。
【００４７】
次いで、０．５ｍｌの０．１Ｍグリシン塩酸緩衝液（ｐＨ２．０）に菌体を懸濁し、吸着した抗体を溶出し、遠心分離により上清を回収し、１Ｍトリス−塩酸（ｐＨ９．０）を添加しｐＨ７．４に調整した。同様の溶出操作を４回行い、各画分のタンパク質量を２８０ｎｍの吸光度により測定した。
【００４８】
次いで、あらかじめＰＢＳで平衡化した１ｍｌのプロテインＡ−セファロース（アマシャムファルマシアバイオテク社）を充填したカラムに上記溶出液を添加し、５ｍｌ洗浄後、５ｍｌの０．１Ｍグリシン−塩酸緩衝液（ｐＨ３．０）にて溶出し、直ちに１Ｍトリス−塩酸（ｐＨ９．０）を添加しｐＨ７．４に調整した。ＩｇＧの溶出画分は、Ａ_２８０を測定することで確認した。
【００４９】
以上により、抗血清（０．５ｍｌ）をプロテアーゼ処理菌体により精製したポリクローナル抗体を１ｍｇ得た。
【００５０】
製造例２
〔ストレプトコッカス・ミュータンス測定用免疫クロマトグラフィー法テストストリップの作製〕
（１）〔金コロイド標識されたストレプトコッカス・ミュータンスに対する精製ポリクローナル抗体の調製〕
コロイド粒径が４０ｎｍの市販金コロイド溶液（ＢｒｉｔｉｓｈＢｉｏＣｅｌｌＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ社）１０ｍｌに１００ｍＭＫ_２ＣＯ_３を２μｌ添加し、ｐＨを９．０に調製後、０．２２μｍフィルター処理した。金コロイド溶液の５２０ｎｍの吸光度を測定したところ、Ａ_５２０＝１．０であった。
【００５１】
次いで、１ｍｇ／ｍｌに調整した製造例１（３）で調製したポリクローナル抗体の２ｍＭホウ酸緩衝溶液（ｐＨ９．０）６４μｌを、上記金コロイド溶液に撹拌しながら添加し、室温下５分放置した。次いで、１０％スキムミルク−２ｍＭホウ酸緩衝液（ｐＨ９．０）を１．１ｍｌ撹拌しながら添加し（スキムミルク終濃度１％）、室温下３０分放置した。次いで、反応溶液を１０℃、１００００ｇ、３０分遠心処理し、上清を除去後、２ｍｌの２ｍＭＰＢＳ（ｐＨ７．４）を添加し、下層の金コロイド画分を再懸濁した。該再懸濁した画分の５２０ｎｍの吸光度を測定したところ、Ａ_５２０＝４．９であった。得られた金コロイド画分（以下、「金コロイド標識抗体」と表記することもある）は、４℃にて保存した。
【００５２】
（２）〔免疫クロマトグラフィー法テストストリップの作製〕
以下の方法に従い、図３、図４に示す免疫クロマトグラフィー法テストストリップを作製した。
【００５３】
ニトロセルロースメンブレン１１（ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ社、Ｈｉ−ＦｌｏｗＰｌｕｓＭｅｍｂｒａｎｅ、ＨＦ１８０、２５ｍｍ×６ｍｍ）上の検出部位１５及びコントロール判定部位１６上に、それぞれ１ｍｇ／ｍｌの製造例１（３）で調製した精製ポリクローナル抗体及び抗ウサギＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）ポリクローナル抗体（ＩＣＮファーマシューティカルズ社）１μｌをスポットし、インキュベーター内で３７℃、６０分乾燥し抗体を固定化した。該抗体固定化メンブレン１１を１％スキムミルク−０．０１％ＴｒｉｔｏｎＸ１００水溶液中で室温下、５分振とうした。次いで、該メンブレン１１を１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）中で室温下、１０分振とう後取り出し、真空ポンプで吸引しながら６０分間デシケーター中で乾燥した。
【００５４】
また、コンジュゲートパッド１２（ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ社、７．５ｍｍ×６ｍｍ）を０．５％ＰＶＡ−０．５％ショ糖水溶液中で１分間振とう後取り出し、真空ポンプで吸引しながら６０分間デシケーター中で乾燥した。該コンジュゲートパッド１２にＡ_５２０＝１．０に調整した製造例２（１）で調製した金コロイド標識抗体を２５μｌ添加し、真空ポンプで吸引しながら６０分間デシケーター中で乾燥した。更に、サンプルパッド１３（ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ社、１７ｍｍ×６ｍｍ）を１％Ｔｗｅｅｎ２０−ＰＢＳ水溶液中で１分間振とう後取り出し、真空ポンプで吸引しながら６０分間デシケーター中で乾燥した。尚、展開終了後の被検液を保持するための吸収パッド１４（ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ社、２０ｍｍ×６ｍｍ）は未処理のまま用いた。
【００５５】
このように調製した、図３に示すような免疫クロマトグラフィーテストストリップの各構成部分をプラスチックの支持台上に配置し、図４に示すような免疫クロマトグラフィーテストストリップを組み立てた。
【００５６】
実施例１
〔ストレプトコッカス・ミュータンスの糖鎖抗原抽出液の調製と免疫クロマトグラフィー法テストストリップを使用したストレプトコッカス・ミュータンスの検出（１）〕
（１）〔唾液の採取と培養法による唾液中のストレプトコッカス・ミュータンス濃度の測定〕
異なる１７人の被験者にパラフィンペレットを５分間噛ませ、分泌された唾液を滅菌容器に吐き出させることで回収した。
【００５７】
得られた唾液を４０Ｗ、１０秒間超音波処理した後、適宜希釈して、１００μｌをミチス・サリバリウス・バシトラシン（以下、「ＭＳＢ」と表記することもある。）固体培地上に添加し、３７℃、嫌気条件下、４８時間培養した。ＭＳＢ固体培地上に生じるコロニー数を計数し、唾液の希釈率から、ストレプトコッカス・ミュータンス濃度を個／ｍｌとして算出した。ＭＳＢ固体培地上には主としてストレプトコッカス・ミュータンスとストレプトコッカス・ソブリヌスが、また、一部の口腔内細菌が生育する。
【００５８】
コロニーの形態学的分類、及び形態学的に識別不可能なコロニーに関しては、該コロニーを純粋培養後、ミュータンスレンサ球菌の血清型特異的な抗体を利用した免疫学的測定方法及び、糖発酵試験等の生化学的方法により、ストレプトコッカス・ミュータンスをストレプトコッカス・ソブリヌス及び他の口腔内細菌と識別し、ストレプトコッカス・ミュータンス濃度を測定した。
【００５９】
（２）〔濾過装置を使用した抗原抽出液の調製〕
シリンジフィルター１０（ワットマン社、１３ｍｍシリンジフィルタ、ガラス繊維濾紙ＧＦ／Ｃ、粒子保持能１．２μｍ）にシリンジ９（テルモ社、２．５ｍｌ）をセットし、図２の構造の濾過装置を作製した。
【００６０】
プランジャー８を濾過装置より引き抜き、実施例１（１）で採取した唾液０．５ｍｌをシリンジ外筒７内に添加し、プランジャー８を装着後、該プランジャー８を押し下げ加圧することで唾液を濾過した。濾過液排出口２から排出された濾過液は廃棄した。
【００６１】
０．５ｍｌの０．１ＭＮａＯＨ水溶液を、シリンジフィルター１０の濾過液排出口２より、プランジャー８を引き上げ陰圧とすることで吸液しシリンジ外筒７内まで流入させ、直ちにプランジャー８を押し下げ加圧することで濾過し、濾過液を廃棄した。次いで、０．１２ｍｌの１Ｍ亜硝酸ナトリウム−０．５Ｍ酢酸水溶液を吸液し、シリンジ外筒７内まで流入した上記液をそのまま室温下、２及び５分間保持した。次いで、０．３８ｍｌの０．５Ｍトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ９．０）を、同様に濾過液排出口２より吸液し、シリンジ外筒７内に抽出液（約０．５ｍｌ）を回収し十分に混合した。
【００６２】
（３）〔免疫クロマトグラフィー法テストストリップによるストレプトコッカス・ミュータンスの測定〕
上記（２）で使用したシリンジ９からシリンジフィルター１０を外した。製造例２（２）で作製した免疫クロマトグラフィー法テストストリップのサンプルパッド１３に、該シリンジ９内の抽出液を０．１５ｍｌ添加し、１０分後の検出部位１５及びコントロール判定部位１６の発色の有無と強度を判定した。判定は、検出部位１５の発色強度を４段階（＋＋＋：発色強度が強い、＋＋：発色強度が中程度、＋：発色強度が弱い、−：発色しない）に目視で識別した。尚、コントロール判定部位１６が発色しない場合は、金コロイド標識抗体の展開が不良であることを示すので、再度分析した。
【００６３】
免疫クロマトグラフィー法テストストリップの判定結果と、実施例１（１）の培養法により得られた唾液中のストレプトコッカス・ミュータンス濃度とを比較した。結果を表１に示す。
【００６４】
【表１】

【００６５】
表１に示したように、培養法により得られたストレプトコッカス・ミュータンスの濃度と相関する判定結果が得られた。本発明の抽出液の製造方法を使用することで、糖鎖抗原を含む抽出液を迅速（抽出処理に要する時間は５分以内）、且つ簡便に調製できた。
【００６６】
比較例１
〔抽出用溶液を逆流させない方法によるストレプトコッカス・ミュータンスの糖鎖抗原抽出液の調製と免疫クロマトグラフィー法テストストリップによる検出（１）〕
（１）〔唾液の採取と培養法による唾液中のストレプトコッカス・ミュータンス濃度の測定〕
実施例１（１）の方法に従った。
【００６７】
（２）〔濾過装置を使用した抗原抽出液の調製〕
実施例１（２）と同様の濾過装置を作製した。
【００６８】
実施例１（２）と同様にして、実施例１（１）で採取した唾液０．５ｍｌを濾過し、次いで０．５ｍｌの０．１ＭＮａＯＨ水溶液を吸液・濾過した。プランジャー８を引き抜き、０．１２ｍｌの１Ｍ亜硝酸ナトリウム−０．５Ｍ酢酸水溶液をシリンジ外筒７内に添加した。プランジャー８を装着後、該プランジャー８を軽く押し下げ液体が滴下しない程度に加圧することで、濾紙に上記亜硝酸水溶液を含ませ、室温下、２及び５分間反応させた。次いで、０．３８ｍｌの０．５Ｍトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ９．０）を濾過液排出口２より吸液し、シリンジ外筒７内に抽出液（約０．５ｍｌ）を回収し十分に混合した。
【００６９】
（３）〔免疫クロマトグラフィー法テストストリップによるストレプトコッカス・ミュータンスの測定〕
上記（２）で使用したシリンジ９からシリンジフィルター１０を外した。製造例２（２）で作製した免疫クロマトグラフィー法テストストリップのサンプルパッド１３に、該シリンジ９中の抽出液を０．１５ｍｌ添加し、１０分後の検出部位１５及びコントロール判定部位１６の発色の有無と強度を実施例１（３）と同様に判定した。
【００７０】
免疫クロマトグラフィー法テストストリップの判定結果と、実施例１（１）の培養法により得られた唾液中のストレプトコッカス・ミュータンス濃度とを比較した。結果を表２に示す。
【００７１】
【表２】

【００７２】
表２に示したように、被検体液（唾液）を濾過した方向と同一方向に抽出用溶液（亜硝酸水溶液）を通過させる方法で濾過膜に添加した場合は、実施例１と比較して、２分間の抽出では感度及び発色強度が不十分な検体が４検体もあった。また、抽出試薬の添加が煩雑であった。
【００７３】
実施例２
〔ストレプトコッカス・ミュータンスの糖鎖抗原抽出液の調製と免疫クロマトグラフィー法テストストリップを使用したストレプトコッカス・ミュータンスの検出（２）〕
（１）〔唾液の採取と培養法による唾液中のストレプトコッカス・ミュータンス濃度の測定〕
実施例１（１）の方法に従った。
【００７４】
（２）〔濾過装置を使用した抗原抽出液の調製〕
実施例１（２）と同様の濾過装置を作製した。
【００７５】
実施例１（２）と同様にして、実施例１（１）で採取した唾液０．５ｍｌを濾過し、次いで０．５ｍｌの０．１ＭＮａＯＨ水溶液を吸液し、すぐに濾過した。次いで、０．１２ｍｌの１Ｍ亜硝酸ナトリウム−０．５Ｍ酢酸水溶液を吸液し、そのまま室温下、２及び５分間保持した。次いで、シリンジ９内の溶液を全量濾過することによりサンプリングチューブに回収した。排出された液量は約０．１２ｍｌであった。次いで、０．３８ｍｌの０．５Ｍトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ９．０）を添加し、抽出液（約０．５ｍｌ）を十分に混合した。
【００７６】
（３）〔免疫クロマトグラフィー法テストストリップによるストレプトコッカス・ミュータンスの測定〕
製造例２（２）で作製した免疫クロマトグラフィー法テストストリップのサンプルパッド１３に、上記（２）で調製した抽出液０．１５ｍｌを添加し、１０分後の検出部位１５及びコントロール判定部位１６の発色の有無と強度を実施例１（３）と同様に判定した。
【００７７】
免疫クロマトグラフィー法テストストリップの判定結果と、実施例１（１）の培養法により得られた唾液中のストレプトコッカス・ミュータンス濃度とを比較した。結果を表３に示す。
【００７８】
【表３】

【００７９】
表３に示したように、抽出液を濾過して回収した場合は、実施例１と比較して発色強度が向上した検体が２検体あった。抽出液中の不溶物の影響が除去できる為、免疫クロマト法における金コロイド標識抗体の展開性が向上した為と考えられた。
【００８０】
実施例３
〔ストレプトコッカス・ミュータンスの糖鎖抗原抽出液の調製と免疫クロマトグラフィー法テストストリップを使用したストレプトコッカス・ミュータンスの検出（３）〕
（１）〔唾液の採取と培養法による唾液中のストレプトコッカス・ミュータンス濃度の測定〕
実施例１（１）の方法に従った。
【００８１】
（２）〔濾過装置を使用した抗原抽出液の調製〕
実施例１（２）と同様の濾過装置を作製した。
【００８２】
実施例１（２）と同様にして、実施例１（１）で採取した唾液０．５ｍｌを濾過し、次いで０．５ｍｌの０．１ＭＮａＯＨ水溶液を吸液・濾過した。次いで、０．１２ｍｌの１Ｍ亜硝酸ナトリウム−０．５Ｍ酢酸水溶液を吸液し、すぐに濾過した。直ちに、該濾液を再度吸液し、そのまま室温下、２及び５分間保持した。次いで、０．３８ｍｌの０．５Ｍトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ９．０）を濾過液排出口２より吸液し、シリンジ外筒７内に抽出液（約０．５ｍｌ）を回収し十分に混合した。
【００８３】
（３）〔免疫クロマトグラフィー法テストストリップによるストレプトコッカス・ミュータンスの測定〕
上記（２）で使用したシリンジ９からシリンジフィルター１０を外した。製造例２（２）で作製した免疫クロマトグラフィー法テストストリップのサンプルパッド１３に、該シリンジ９内の抽出液を０．１５ｍｌ添加し、１０分後の検出部位１５及びコントロール判定部位１６の発色の有無と強度を実施例１（３）と同様に判定した。
【００８４】
免疫クロマトグラフィー法テストストリップの判定結果と、実施例１（１）の培養法により得られた唾液中のストレプトコッカス・ミュータンス濃度とを比較した。結果を表４に示す。
【００８５】
【表４】

【００８６】
表４に示したように、抽出液を吸液・濾過する操作を繰り返した場合は、実施例１と比較して感度及び発色強度が向上した検体が４検体あった。抽出効率が向上したためと考えられた。
【００８７】
実施例４
〔ストレプトコッカス・ミュータンスの糖鎖抗原抽出液の調製と免疫クロマトグラフィー法テストストリップを使用したストレプトコッカス・ミュータンスの検出（４）〕
（１）〔唾液の採取と培養法による唾液中のストレプトコッカス・ミュータンス濃度の測定〕
実施例１（１）の方法に従った。
【００８８】
（２）〔濾過装置を使用した抗原抽出液の調製〕
実施例１（２）と同様の濾過装置を作製した。
【００８９】
実施例１（２）と同様にして、実施例１（１）で採取した唾液０．５ｍｌを濾過し、次いで０．５ｍｌの０．１ＭＮａＯＨ水溶液を吸液・濾過した。次いで、０．１２ｍｌの１Ｍ亜硝酸ナトリウム−０．５Ｍ酢酸水溶液を吸液し、すぐに濾過し、そのまま室温下、２及び５分間保持して、ガラス繊維濾紙に残留する上記水溶液による抗原の抽出を遂行した。ガラス繊維濾紙に残留した亜硝酸溶液は約０．０４５ｍｌであった。次いで、０．１５ｍｌの０．５Ｍトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ９．０）を濾過液排出口２より吸液し、シリンジ外筒７内に抽出液（約０．１５ｍｌ）を回収し十分に混合した。
【００９０】
（３）〔免疫クロマトグラフィー法テストストリップによるストレプトコッカス・ミュータンスの測定〕
上記（２）で使用したシリンジ９からシリンジフィルター１０を外した。製造例２（２）で作製した免疫クロマトグラフィー法テストストリップのサンプルパッド１３に、該シリンジ９中の抽出液の全量（約０．１５ｍｌ）をシリンジ９にて添加し、１０分後の検出部位１５及びコントロール判定部位１６の発色の有無と強度を実施例１（３）と同様に判定した。
【００９１】
免疫クロマトグラフィー法テストストリップの判定結果と、実施例１（１）の培養法により得られた唾液中のストレプトコッカス・ミュータンス濃度とを比較した。結果を表５に示す。
【００９２】
【表５】

【００９３】
表５に示したように、吸液・濾過後に濾過膜に残存する抽出用溶液（亜硝酸水溶液）にて抽出した場合は、実施例１と比較して発色強度が向上した検体が２検体あった。抽出液中の抗原濃度を約３．３倍に濃縮可能であった為と考えられた。
【００９４】
比較例２
〔抽出用溶液を逆流させない方法によるストレプトコッカス・ミュータンスの糖鎖抗原抽出液の調製と免疫クロマトグラフィー法テストストリップによる検出（２）〕
（１）〔唾液の採取と培養法による唾液中のストレプトコッカス・ミュータンス濃度の測定〕
実施例１（１）の方法に従った。
【００９５】
（２）〔濾過装置を使用した抗原抽出液の調製〕
実施例１（２）と同様の濾過装置を作製した。
【００９６】
実施例１（２）と同様にして、実施例１（１）で採取した唾液０．５ｍｌを濾過し、次いで０．５ｍｌの０．１ＭＮａＯＨ水溶液を吸液・濾過した。プランジャー８を引き抜き、０．１２ｍｌの１Ｍ亜硝酸ナトリウム−０．５Ｍ酢酸水溶液をシリンジ外筒７内に添加した。プランジャー８を装着後、該プランジャー８を押し下げ加圧することで濾過し、室温下、２及び５分間保持した。次いで、０．１５ｍｌの０．５Ｍトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ９．０）を濾過液排出口２より吸液し、シリンジ外筒７内に抽出液（約０．１５ｍｌ）を回収し十分に混合した。
【００９７】
（３）〔免疫クロマトグラフィー法テストストリップによるストレプトコッカス・ミュータンスの測定〕
上記（２）で使用したシリンジ９からシリンジフィルター１０を外した。製造例２（２）で作製した免疫クロマトグラフィー法テストストリップのサンプルパッド１３に、該シリンジ９中の抽出液の全量（約０．１５ｍｌ）をシリンジ９にて添加し、１０分後の検出部位１５及びコントロール判定部位１６の発色の有無と強度を実施例１（３）と同様に判定した。
【００９８】
免疫クロマトグラフィー法テストストリップの判定結果と、実施例１（１）の培養法により得られた唾液中のストレプトコッカス・ミュータンス濃度とを比較した。結果を表６に示す。
【００９９】
【表６】

【０１００】
表６に示したように、被検体液（唾液）を濾過した方向と同一方向に抽出用液（亜硝酸水溶液）を通過させる方法で濾過膜に添加し、濾過膜に残存する抽出用溶液にて抽出した場合は、実施例１と比較して、抽出液中の抗原濃度を約３．３倍に濃縮可能であるにも関わらず、２分間の抽出では感度および発色強度が不十分な検体が３検体あった。また、抽出試薬の添加が煩雑であった。
【０１０１】
【発明の効果】
本発明の抗原または抗体の製造方法により、被検体液中の抗原または抗体の保持物を濾過、抽出処理することで、該抗原または抗体の抽出液を迅速、且つ簡便に製造することができる。該抽出液を各種分析に適用することで、被検体液中の抗原または抗体を高感度に分析できる。特に、齲蝕のリスク診断等が歯科医院等における繁忙な日常現場で実施されることを考慮すれば、本発明で達成される操作の簡便化、抽出時間の短時間化の効果は計り知れない程大きい。
【図面の簡単な説明】
【図１】本図は、本発明に使用する濾過装置の代表的態様を示す斜視図である。
【図２】本図は、本発明に使用する濾過装置の別の態様を示す側面図である。
【図３】本図は、実施例で使用した免疫クロマトグラフィー法テストリップの各部材の概略図である。
【図４】本図は、実施例で使用した免疫クロマトグラフィー法テストリップの側面図である。
【符号の説明】
１・・・被濾過液供給主室
２・・・濾過液排出口
３・・・濾過膜
４・・・濾過膜収納部
５・・・接続部
６・・・小空間
７・・・シリンジ外筒
８・・・プランジャー
９・・・シリンジ
１０・・・シリンジフィルター
１１・・・ニトロセルロースメンブレン
１２・・・コンジュゲートパッド
１３・・・サンプルパッド
１４・・・吸収パッド
１５・・・検出部位
１６・・・コントロール判定部位[0001]
TECHNICAL FIELD OF THE INVENTION
The present invention relates to a method for producing an antigen or antibody extract.
[0002]
[Prior art]
In clinical tests, food analysis, environmental analysis, and the like, for example, extraction of a retentate of an antigen or an antibody from a test solution containing a retentate of an antigen or an antibody such as a microorganism is performed as an analysis sample. . The extraction of the antigen or antibody retentate from the sample liquid is performed by a filtration method, that is, by using a filtration device in which a filtrate supply chamber and a filtrate discharge port communicate with each other through a filtration membrane. A method is commonly used in which a test solution is supplied to a chamber, filtered, the retentate of the antigen or antibody is captured on a filtration membrane, and a liquid component is discharged from a filtrate outlet. Such a filtration method is very efficient because it does not require a special device as compared with a centrifugation method or the like, and can quickly and easily capture and concentrate the antigen or antibody retentate.
[0003]
The antigen or antibody retentate thus captured may be used as it is as an analysis sample.However, in order to improve the sensitivity and specificity of the analysis, an extract or extract is allowed to act on the antigen or antibody. It is effective to separate and collect only the antibody before use. In this case, in this extraction operation, the antigen or antibody extraction solution is caused to flow from the filtrate supply chamber side to the filtration membrane on which the antigen or antibody retention material has been captured by the filtration method, and discharged from the filtrate outlet. A method of recovering the extracted extract has been generally adopted (for example, see Patent Documents 1 and 2).
[0004]
[Patent Document 1]
Japanese Unexamined Patent Publication No. 08-502413
[Patent Document 2]
JP-T-2002-519649
[0005]
[Problems to be solved by the invention]
However, in the above method, the contact time between the extraction solution and the retentate of the antigen or antibody is limited. Further, a large amount of a substance holding an antigen or an antibody is retained in the form of a filtration membrane, the substance holding the antigen or the antibody is sticky, In the case where contaminants such as adhesiveness are contained, the extraction liquid does not sufficiently act even inside the retained substance of the antigen or antibody being captured, and a satisfactory extraction efficiency cannot be obtained. There was a problem. For this reason, in the above-mentioned extraction method, an operation of flowing an antigen or antibody extraction solution is performed under pressure to improve its flowability, but the actual situation has not reached a fundamental solution. .
[0006]
However, this problem is particularly noticeable when saliva containing an adhesive polysaccharide such as mucin or a sample containing a microorganism containing an insoluble or adhesive polysaccharide is a sample liquid. Further improvement was desired.
[0007]
[Means for Solving the Problems]
The present inventors have continued intensive research in view of the above problems. as a result,
{Circle around (1)} The extraction efficiency of the antigen or antibody held by the holding substance is improved by passing the extraction liquid through the filtration membrane in a direction opposite to the filtration direction of the sample liquid; It has been found that such an extraction liquid can be easily introduced into the filtration device by providing a negative pressure means upstream of the filtrate supply chamber, and the present invention has been completed.
[0008]
That is, according to the present invention, the filtrate supply chamber and the filtrate discharge port communicate with each other through a filtration membrane, and the filtration device provided with a negative pressure means upstream of the filtrate supply chamber allows the filtration of the antigen or antibody. The analyte liquid containing the retentate is filtered, the retentate of the antigen or antibody is captured on the filtration membrane, and then the inside of the filtration device is set to a negative pressure by the negative pressure means, and extracted from the filtrate outlet. A method for producing an extract of an antigen or an antibody, characterized in that a liquid for use in an antigen or an antibody is stored in a filtration solution supply chamber by sucking a liquid for use and flowing backward in the filtration device.
[0009]
BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION
In the method for producing an antigen or antibody extract of the present invention, the filtration liquid supply chamber and the filtration liquid discharge port communicate with each other through a filtration membrane, and the filtration method includes a negative pressure means upstream of the filtration liquid supply chamber. This is performed using an apparatus. The filtering device will be described below with reference to the drawings. FIG. 1 is a perspective view showing a typical embodiment of a filtration device used in the present invention.
[0010]
The filtration device includes a main liquid supply main chamber 1 and a filtrate discharge port 2. Further, the filtration membrane 3 is accommodated in a filtration membrane accommodation part 4, and the filtrate supply main chamber 1 is connected to the filtration membrane accommodation part 4 by a connection part 5. Therefore, the filtrate supply main chamber 1 and the filtrate discharge port 2 have a structure communicating with each other via the filtration membrane 3. This device is a closed system with no other openings except for the filtrate discharge port 2 and a connection port to a negative pressure means provided upstream of the filtrate supply main chamber 1 described later.
[0011]
In the present invention, the filtrate supply chamber refers to all voids provided upstream of the filtration membrane and storing a fixed amount of the filtrate. Therefore, a small space 6 for temporarily storing the analyte liquid flowing into the filtration membrane storage section is provided above the filtration membrane 3 in the filtration membrane storage section 4, and this small space 6 is also provided. And a part of the filtrate supply chamber in the present invention.
[0012]
On the other hand, in the present invention, the filtrate discharge port 2 is preferably formed as a convex portion such as a tube from the viewpoint of discharging the filtrate and the like and operability of absorbing the extraction solution described later.
[0013]
A negative pressure means including a syringe 9 composed of a syringe outer cylinder 7 and a plunger 8 is provided upstream of the filtrate supply main chamber 1. The negative pressure means may have a function of reducing the pressure inside the apparatus, but a device having a pressurizing function like the syringe 9 is a liquid in which the subject liquid has poor filtration properties. In some cases, pressure filtration is preferable because efficient filtration can be achieved.
[0014]
In the method for producing an antigen or antibody extract of the present invention, a sample liquid containing an antigen or antibody retentate is first supplied to the filtrate supply main chamber 1 using the filtration device having the above structure. This supply operation may be appropriately performed by removing the connection part with the syringe 9 from the filtrate supply main chamber 1 and then supplying the filtrate to the filtrate supply main chamber 1 using an instrument such as a pipette.
[0015]
Next, the subject liquid is allowed to flow downward to the filtration membrane 3 and filtered under pressure by pressing the plunger 8 to pressurize the inside of the apparatus with the natural filtration or the syringe 9.
As a result of the filtration, the antigen or antibody retentate contained in the sample liquid is captured by the upper surface of the filtration membrane 3 or the internal pores. On the other hand, the filtrate that has passed through the filtration membrane 3 and has been separated from the antigen or antibody retentate is discharged from the filtrate discharge port 2 to the outside of the apparatus. In addition, the retentate of the antigen or the antibody captured on the filtration membrane 3 may be a suitable washing solution (for example, pure water, a buffer solution, an acid solution, an alkali solution, a surfactant solution, etc.) as necessary. Can also be washed. The washing may be carried out by filtering the washing solution by natural filtration or pressure filtration, or may be carried out by sucking the solution through the filtrate outlet 2 and flowing it back through the filtration device. .
[0016]
In the present invention, in the syringe 9, the plunger 8 is pulled to make the inside of the filtration device a negative pressure, and the extraction having the function of extracting the antigen or antibody from the antigen or antibody holding substance through the filtrate outlet 2. The liquid for use is sucked, and is caused to flow backward in the filtration device. Thereby, the antigen or antibody is extracted by contacting the antigen or antibody holding substance captured by the filtration membrane 3 and the antigen or antibody is extracted. In addition to the flow of the extraction liquid flowing backward in the filtration device, Most of the antigen or antibody retained by the filtration membrane 3 is again sucked into the filtrate supply main chamber 1 through the small space 6. In the course of this backward flow, or by leaving the liquid to be retained in the filtrate supply main chamber 1 for a certain period of time, preferably within one hour, more preferably 10 seconds to 20 minutes, the antigen or antibody The extraction liquid can sufficiently act on the retentate. Therefore, according to the method of the present invention, the extraction efficiency of the antigen or the antibody can be greatly improved.
[0017]
In order to further improve the extraction efficiency, after the extraction liquid is stored in the filtrate-supplying main chamber 1, the filtrate-supplying main chamber 1 is vibrated for a certain period of time to generate a liquid flow in the extraction liquid. May be.
[0018]
In the present invention, the antigen or antibody extract, which is stored in the filtrate-supplying main chamber 1 and from which the antigen or antibody has been sufficiently extracted, is collected from the filtrate-supplying main chamber 1 and used as an analysis sample. May be. This collection operation is performed by removing the connection portion 5 from the filtration membrane housing portion 4 to discharge the extract, or removing the connection portion with the syringe 9 from the filtrate supply main chamber 1 and then using an instrument such as a pipette. What is necessary is just to collect | recover and perform suitably.
[0019]
In the method in which the extraction solution is passed through the filtration membrane by one suction operation from only one direction, the antigen or antibody holding substance contained in the test liquid is sticky, In the case where contaminants such as adhesiveness are contained in addition to the antigen or antibody retentate, these may block the pores inside the filter membrane 3 and block the antigen or antibody retentate inside. In some cases, the extraction solution does not work sufficiently. Therefore, in such a case, the antigen or antibody extract stored in the filtrate-supplying main chamber 1 and the small space 6 is subjected to natural filtration or pressure filtration immediately after storage or after holding for a certain period of time, It is preferable to apply a liquid flow from the opposite direction and use the extract discharged from the filtrate discharge port 2 as an analysis sample. If the extract discharged from the filtrate discharge port 2 is used as an analysis sample, residues and contaminants of these retentates after the antigen or antibody is extracted are removed by filtration. Is significant if it may adversely affect the antigen-antibody reaction during analysis.
[0020]
Further, if the above operation does not allow the extraction to be performed to a satisfactory extent, the extract discharged from the filtrate outlet 2 is sucked again from the filtrate outlet through the above, and then is returned through the filtration device, thereby causing It may be stored in the filtrate supply chamber 1, and in the present invention, until the desired extraction efficiency is achieved, the extraction and filtration operations of the extract are necessary, usually 1 to 10 times, and the filtration is performed. It may be repeated 0 to 10 times.
[0021]
Further, as another method, the extract of the antigen or antibody stored in the filtrate-supplying main chamber 1 and the small space 6 is subjected to natural filtration or pressure filtration, and the antigen or antibody retentate is again filtered. After being captured on the filtration membrane 3, it can be left for a certain period of time, and sufficient extraction can be performed with the extract remaining on the membrane. In this case, the retained substance of the antigen or the antibody is trapped in the internal pores on the filtration membrane 3 in a state of being mixed with the extract, so that the retained substance of the antigen or the antibody is trapped in the minute part. It is well immersed in the extract, and the extraction of the antigen or antibody proceeds effectively. The antigen or antibody extract contained in the filtration membrane 3 is as follows: (1) A recovery liquid such as the same composition as the extraction liquid used is supplied to the filtrate-supplying main chamber 1, and natural filtration and pressure filtration are performed. Or by collecting the filtrate by sucking it through the filtrate discharge port 2 and causing it to flow backward, or (2) disassembling the filter membrane housing part 4, taking out the filter membrane 3, and collecting the extract. Just fine. According to such a method, the amount of the extract can be minimized, or the composition of the extract can be appropriately adjusted by appropriately selecting the recovery solution. In the above method, the extraction liquid can sufficiently act on the antigen- or antibody-retained material by leaving it for preferably 1 hour or less, more preferably 10 seconds to 20 minutes.
[0022]
FIG. 2 is a side view showing another embodiment of the filtration device used in the present invention. In this filtration device, little space is formed above and below the filtration membrane 3 in the filtration membrane storage unit 4, and the distal end of the syringe 9 serving as a negative pressure means is directly provided on the upper surface of the filtration membrane storage unit 4. The filtrate supply chamber is detachably connected, and the filtrate supply chamber is formed inside the syringe outer cylinder 7. Such an apparatus has a simple structure, and almost all of the absorbed antigen or antibody extract is stored in the inner space of the syringe outer cylinder 7, so that it is used as an analysis sample. Is operationally efficient.
[0023]
Of course, the shape of the filtration device is not limited to FIGS.
[0024]
In the filtration device having the above-described structure and used in the present invention, the filtration membrane 3 is not particularly limited in material, pore diameter, shape, and the like, and a conventionally known filtration membrane can be used. It is also possible to use a combination of a plurality of membranes having different pore diameters and materials so that a practically sufficient capturing ability can be obtained for the antigen- or antibody-retained substance in the sample liquid. When the antigen or antibody carrier is a microorganism, the pore size is preferably 0.1 μm to 5 μm. When the filtration membrane 3 is a porous membrane, the pore diameter in the present invention refers to a pore diameter measured by a bubble point method (method described in JIS K 3832), and the filtration membrane 3 is a filter paper or the like. In this case, it refers to the retained particle diameter measured by a method of obtaining a leakage particle diameter when barium sulfate or the like is naturally filtered (method described in JIS P 3801).
[0025]
The material of the filtration membrane 3 is glass fiber; polyvinylidene fluoride (PVDF), polytetrafluoroethylene (PTFE), polysulfone, polycarbonate, polyethylene, polypropylene in consideration of chemical resistance to a test solution and an extraction solution. And plastics such as polyamide; celluloses such as cellulose, nitrocellulose and acetylcellulose. Also, aggregates such as glass fiber filter paper strips and activated carbon can be used.
[0026]
The shape of the filtration membrane housing part 4 is not particularly limited, and may be appropriately selected according to the shape of the filtration membrane 3. The material of the filtration membrane housing part 4 is not particularly limited, and a plastic material such as polypropylene or polyethylene can be used in consideration of easiness of mass production and chemical resistance. For the purpose of preventing deformation or breakage of the filtration membrane 3 during liquid absorption or filtration, a plate-like structure having various pattern structures such as radial, lattice, and dot; A mesh material such as a net; a porous material; a fiber material such as a glass fiber or a polypropylene nonwoven fabric may be interposed. In addition, a filter aid such as activated carbon or filter paper powder can be added to the upper surface of the filtration membrane 3 for the purpose of facilitating filtration, or a prefilter such as a glass filter or a polypropylene nonwoven fabric can be provided. .
[0027]
As the negative pressure means, any conventionally known negative pressure means can be used as long as the inside of the filtration device can be brought into a negative pressure state with respect to the outside of the device. As such a negative pressure means, various manual devices such as a syringe, a dropper and a rubber ball, and various devices such as a vacuum pump and an aspirator can be used. Among them, a syringe, a dropper, and the like are particularly useful because they can also function as a filtrate supply chamber as in the filtration device of FIG. In the case where the filtration of the subject is performed under pressure, the pressurization can be appropriately performed by means independent of the negative pressure means. Examples of such pressurizing means include a cylinder and a pressurizing pump.
[0028]
Next, in the present invention, the test liquid is not particularly limited as long as it is a liquid containing the antigen or antibody holding substance in a suspended state, and a conventionally known suspension can be used. Examples of such a suspension include culture of microorganisms (e.g., yeasts, molds, mushrooms, bacteria, actinomycetes, unicellular algae, viruses, protozoa, non-differentiated cells and tissue cultures of animals or plants). Fluids; foods and drinks; body fluids such as throat swabs, saliva, plasma, serum, and urine; environmental waters such as river water, sewage, and industrial water; or solid substances such as microorganisms, foods and drinks, feces, and plaque as aqueous liquids ( A suspension such as a salt solution such as pure water or physiological saline, or a buffer solution such as a phosphate buffer.
[0029]
Known antigens and antibodies can be used without limitation. For example, examples of antigens include proteins such as cell membrane proteins, cell wall proteins, and lipopolysaccharides, glycoproteins and lipid proteins; enzyme proteins such as glycosyltransferase; various saccharides such as capsular polysaccharides and serotype polysaccharides; nucleic acids; You. Examples of the antibody include immunoglobulins such as IgG, IgA, and IgM.
[0030]
Particularly suitable test liquids include test liquids containing oral samples such as saliva and plaque. The test liquid containing the oral sample contains microorganisms such as oral bacteria, and adhesive substances such as salivary mucin and insoluble / adhesive glucan produced by oral bacteria. Easy to do. In the case of subjecting such a sample liquid to an extraction treatment, a high-concentration antigen extract can be produced particularly quickly and easily by using the production method of the present invention.
[0031]
In recent years, in order to diagnose the risk of dental caries, attempts have been made to measure the concentration of caries-related bacteria present in saliva and plaque collected from the oral cavity. Examples of such caries-related bacteria include bacteria belonging to the mutans streptococci (for example, Streptococcus mutans and Streptococcus sobrinus), bacteria belonging to the genus Lactobacillus, and bacteria belonging to the genus Actinomyces.
Many of these caries-related bacteria are microorganisms having carbohydrate antigens (serotype polysaccharide antigens), but are found in saliva and dental plaque. ⁴ -10 ⁷ Since it is contained only in a very small amount of about individual / ml, and usually exists in an aggregated state covered with insoluble glucan, a method for directly analyzing the cariogenic bacteria is limited. In such a situation, the method of the present invention can be applied as a method for extracting a carbohydrate antigen when analyzing caries-related bacteria present in saliva and plaque with high accuracy.
[0032]
The extraction solution used for the antigen or antibody retentate is described in, for example, Terumi Nakajima et al. (1988): Extraction / Purification / Analysis I: 14-38. New basic biochemical experiment method2. Edited by Maruzen Co., Ltd., Tomoya Ogawa et al. (1992): Glycotechnology: 282-321. Extraction liquids used in conventionally known solubilization methods and solvent extraction methods described in the Industrial Research Institute Co., Ltd., and other extraction liquids used in chemical or biological cleavage / decomposition methods Can be used without restrictions. Specifically, a salt solution such as an aqueous solution of magnesium chloride, an aqueous solution of sodium thiocyanate, or an aqueous solution of guanidine hydrochloride; an acid solution such as an aqueous solution of hydrochloric acid; an alkaline solution such as an aqueous solution of sodium hydroxide; Aqueous solution of sodium acid, aqueous solution of octylglucoside, aqueous solution of cetyltrimethylammonium bromide, aqueous solution of surfactant such as aqueous solution of 3-[(3-cholamidopropyl) dimethylammonio] -1-propanesulfonic acid; organic solvent such as n-butanol; A buffer solution such as glycine hydrochloride buffer or the like is also used for chemical or biological cleavage / decomposition methods. An aqueous solution of nitrite; an acid solution such as hydrochloric acid; an alkaline solution such as an aqueous solution of sodium hydroxide, protease, phospholipase, etc. And the like.
[0033]
In the case of extracting the carbohydrate antigens of caries-related bacteria from a test solution containing an intraoral sample such as saliva or dental plaque, an extraction solution used in a so-called nitrite extraction method is used. The nitrous acid extraction method can extract highly specific sugar chain antigens such as serotype polysaccharide antigens from microorganisms in a short time and with high efficiency (Tsudo Takei. Osaka University Medical Journal. 35: 93-109, 1990.). . However, in the method of adding and flowing down a nitrite solution onto a filtration membrane capturing microorganisms, it is difficult to make the nitrite solution penetrate into the details of the filtration membrane, so that sufficient extraction efficiency may not be achieved, It is particularly suitable for applying the method of the invention.
[0034]
In the case of performing the above-mentioned nitrite extraction method, the nitrite solution serving as the extraction solution can be generally prepared by appropriately mixing a nitrite solution and an acid solution. As the nitrite solution, an aqueous solution such as sodium nitrite or potassium nitrite can be used, and as the acid solution, an aqueous solution of an organic acid such as acetic acid, propionic acid, or citric acid, or an aqueous solution of an inorganic acid such as nitric acid or hydrochloric acid can be used. When the nitrite solution and the acid solution are mixed, the concentration of the nitrite is preferably 0.1 to 8 M, and the concentration of the acid is preferably 0.1 to 16 M.
[0035]
Usually, the liquid temperature of the nitrous acid solution is preferably 10 to 60 ° C. In addition, during the entire extraction operation, the time during which the nitrite solution is in contact with the antigen or antibody holding material is preferably at least 0.5 minutes or more, and more preferably 0.5 to 10 minutes.
[0036]
Since the extract obtained by the nitrous acid extraction method is acidic due to the residual acid, when applying the extract to an immunological measurement method or the like, the extract is neutralized with a basic solution and used as an analysis sample. It is preferred to use. As the basic solution, an aqueous solution containing various bases such as an aqueous sodium hydroxide solution and a tris aqueous solution, or various buffers such as a tris-hydrochloric acid buffer can be used. These neutralizing liquids may be supplied directly to the filtrate supply chamber and mixed with the extract, or may be added to the extract taken out of the filtration device and mixed therewith. It is preferable to mix by absorbing the liquid. In addition, as described above, after the retentate of the antigen or the antibody is captured on the filtration membrane 3 and sufficient extraction is performed with the extract remaining on the membrane, this neutralizing solution is used as the extract. It may be used as a liquid for recovery.
[0037]
A method for measuring the amount of the antigen or antibody from the antigen or antibody extract obtained as described above is a known measuring method utilizing the chemical, physical, biological, or immunological properties of the antigen or antibody. Is appropriately adopted. Specifically, examples of a method for analyzing an element constituting an antigen or an antibody include a radiochemical analysis method, an organic element analysis method, an atomic spectrum analysis method, and a fluorescent X-ray analysis method. Examples of the method utilizing the chemical properties of functional groups and molecules include a pH measurement method, an ion electrode method, an electrochemical analysis method, an immobilized enzyme method, and a method of analyzing various functional groups by chemical modification. In addition, a mass spectrometry method and an NMR method can be exemplified. Further, various chromatography methods utilizing an exchange reaction between a stationary phase and a mobile phase can be exemplified. Further, an electrophoresis method utilizing properties such as molecular weight and charge state can be exemplified.
[0038]
Examples of the method utilizing biochemical properties include various enzyme activity measuring methods and PCR (polymerase chain reaction) methods. Examples of the method utilizing the immunological properties include an agglutination method such as a latex method, a radioimmunoassay method, an enzyme immunoassay method, a labeled antibody method, various immunoblot methods such as a Western blot method, and an immunochromatography method. (Takemi Nakajima et al. (1988): Extraction, Purification and Analysis I. New Basic Biochemistry Experiment Method 2. Maruzen Co., Ltd., Takimi Nakajima et al. (1988): Extraction, Purification and Analysis II. New Basic Biochemistry Experiment Method 2. Maruzen Co., Ltd., Toshiaki Osawa et al. (1992): Molecular Immunology III.
[0039]
【Example】
Hereinafter, the present invention will be specifically described with reference to examples, but the present invention is not limited to the following examples.
[0040]
Production Example 1
(Preparation of purified polyclonal antibody against Streptococcus mutans)
(1) [Preparation of cell sample suspension]
3.7 g of Brain Heart Infusion (hereinafter sometimes abbreviated as “BHI”) (DIFCO) was dissolved in 100 ml of pure water and autoclaved to prepare a BHI liquid medium. Ingbrit (Streptococcus mutans, serotype c) in 2 ml of BHI liquid medium at 37 ° C. for 5 hours under anaerobic conditions (N ₂ : H ₂ : CO ₂ = 80: 10: 10), and the culture was centrifuged at 4000 g for 5 minutes to remove the medium component of the supernatant and collect the bacterial cell precipitate.
[0041]
Next, the precipitate was suspended in 5 ml of a phosphate buffered saline (pH 7.4) (hereinafter sometimes abbreviated as PBS), and the same centrifugation was performed three times to wash the precipitate. Thereafter, the obtained cell precipitate was suspended in PBS, and A ₆₀₀ = 1.0 to obtain an Ingbrit cell suspension. After the sonication of the cell sample suspension, the mixture was appropriately diluted and added to a BHI medium plate. The number of colonies produced was counted, and the resulting cells were multiplied by the dilution ratio of the cell sample suspension. When the cell concentration of the sample suspension was determined, about 1 × 10 ⁹ Pcs / ml.
[0042]
(2) [Preparation of antiserum against Streptococcus mutans]
Immunization was performed as follows.
[0043]
In the first week, rabbits were injected with 0.5 ml of the Ingbritt cell sample suspension five times for five consecutive days on the auricular vein. In the second week, rabbits were injected with auricular vein (1.0 ml) five times for 5 consecutive days. In the third week, rabbits were injected with auricular vein five times for 5 consecutive days with 2.0 ml of the cell sample suspension. The fourth week was immunized as in the third week. After the increase in titer was confirmed by the degree of agglutination of the cells using a slide glass, one week after the final immunization, blood was collected according to a standard method to obtain an antiserum against Streptococcus mutans.
[0044]
(3) [Purification of polyclonal antibody against Streptococcus mutans]
Ingbrit was cultured in 1 L of an autoclaved BHI liquid medium under anaerobic conditions at 37 ° C. for 12 hours. The culture solution was centrifuged at 4000 g for 5 minutes to remove the medium component of the supernatant and collect the bacterial cell precipitate. Subsequently, the precipitate was suspended in 100 ml of PBS, and the same centrifugation was performed three times to wash the precipitate.
[0045]
After washing the Ingbritt cells, the cells were suspended in 0.1 M Tris-HCl buffer (pH 8.0) and ₆₀₀ = 15. Pronase (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) was added thereto at a concentration of 5 mg / ml, and the mixture was kept at 37 ° C. for 1 hour. After completion of the reaction, centrifugation was performed to collect the cell precipitate. Subsequently, the precipitate was suspended in 20 ml of PBS, and the same centrifugation operation was performed three times to wash the precipitate. Then, the plate was washed three times with 20 ml of 0.1 M glycine hydrochloride buffer (pH 2.0) and further three times with 20 ml of PBS, and the protease-treated cell suspension (A ₆₀₀ = 12.5) was prepared.
[0046]
Next, the protease-treated cell suspension and 0.5 ml of the antiserum prepared in (2) were mixed and reacted at 4 ° C. for 60 minutes. The mixture was centrifuged at 4000 g for 5 minutes to collect the cells. The cells were suspended in 10 ml of PBS, and the same centrifugation was performed three times to wash the cells.
[0047]
Next, the cells were suspended in 0.5 ml of 0.1 M glycine hydrochloride buffer (pH 2.0), the adsorbed antibody was eluted, the supernatant was recovered by centrifugation, and 1 M Tris-hydrochloric acid (pH 9.0) was used. Was added to adjust the pH to 7.4. The same elution operation was performed four times, and the protein amount of each fraction was measured by absorbance at 280 nm.
[0048]
Next, the above eluate was added to a column packed with 1 ml of Protein A-Sepharose (Amersham Pharmacia Biotech) pre-equilibrated with PBS, washed 5 ml, and then 5 ml of 0.1 M glycine-HCl buffer (pH 3.0). ) And immediately adjusted to pH 7.4 by adding 1M Tris-hydrochloric acid (pH 9.0). The elution fraction of IgG was A ₂₈₀ Was confirmed by measurement.
[0049]
As described above, 1 mg of a polyclonal antibody obtained by purifying antiserum (0.5 ml) with protease-treated cells was obtained.
[0050]
Production Example 2
[Preparation of immunochromatographic test strip for measuring Streptococcus mutans]
(1) [Preparation of purified polyclonal antibody against Streptococcus mutans labeled with colloidal gold]
100 mM K in 10 ml of a commercially available colloidal gold solution (British BioCell International) having a colloid particle size of 40 nm. ₂ CO ₃ Was added to adjust the pH to 9.0, followed by 0.22 μm filter treatment. When the absorbance at 520 nm of the gold colloid solution was measured, A ₅₂₀ = 1.0.
[0051]
Next, 64 μl of a 2 mM borate buffer solution (pH 9.0) of the polyclonal antibody prepared in Production Example 1 (3) adjusted to 1 mg / ml was added to the gold colloid solution with stirring, and the mixture was allowed to stand at room temperature for 5 minutes. . Next, 1.1 ml of 10% skim milk-2 mM borate buffer (pH 9.0) was added with stirring (final concentration of skim milk 1%), and the mixture was allowed to stand at room temperature for 30 minutes. Next, the reaction solution was centrifuged at 10000 g for 30 minutes at 10 ° C., and after removing the supernatant, 2 ml of 2 mM PBS (pH 7.4) was added, and the gold colloid fraction in the lower layer was resuspended. When the absorbance at 520 nm of the resuspended fraction was measured, ₅₂₀ = 4.9. The obtained colloidal gold fraction (hereinafter sometimes referred to as “colloidal gold-labeled antibody”) was stored at 4 ° C.
[0052]
(2) [Preparation of immunochromatographic test strip]
According to the following method, immunochromatographic test strips shown in FIGS. 3 and 4 were prepared.
[0053]
1 mg / ml of the purified polyclonal antibody prepared in Production Example 1 (3) on the detection site 15 and the control judgment site 16 on the nitrocellulose membrane 11 (MILLIPORE, Hi-Flow Plus Membrane, HF180, 25 mm × 6 mm). Further, 1 μl of an anti-rabbit IgG (H + L) polyclonal antibody (ICN Pharmaceuticals, Inc.) was spotted and dried in an incubator at 37 ° C. for 60 minutes to immobilize the antibody. The antibody-immobilized membrane 11 was shaken in a 1% skim milk-0.01% Triton X100 aqueous solution at room temperature for 5 minutes. Next, the membrane 11 was shaken in a 10 mM phosphate buffer (pH 7.4) at room temperature for 10 minutes, taken out, and dried in a desiccator for 60 minutes while suctioning with a vacuum pump.
[0054]
Further, the conjugate pad 12 (MILLIPORE, 7.5 mm × 6 mm) was shaken in a 0.5% PVA-0.5% sucrose aqueous solution for 1 minute, taken out, and sucked by a vacuum pump in a desiccator for 60 minutes. Dried. The conjugate pad 12 has A ₅₂₀ 25 μl of the colloidal gold-labeled antibody prepared in Production Example 2 (1) adjusted to = 1.0 was added, and dried in a desiccator for 60 minutes while suctioning with a vacuum pump. Further, the sample pad 13 (MILLIPORE, 17 mm × 6 mm) was shaken in a 1% Tween 20-PBS aqueous solution for 1 minute, taken out, and dried in a desiccator for 60 minutes while sucking with a vacuum pump. In addition, the absorption pad 14 (MILLIPORE, 20 mm × 6 mm) for holding the test solution after the development was used without any treatment.
[0055]
Each component of the immunochromatography test strip thus prepared as shown in FIG. 3 was placed on a plastic support, and an immunochromatography test strip as shown in FIG. 4 was assembled.
[0056]
Example 1
[Preparation of sugar chain antigen extract of Streptococcus mutans and detection of Streptococcus mutans using immunochromatography test strip (1)]
(1) [Measurement of Streptococcus mutans concentration in saliva by saliva collection and culture method]
Seventeen different subjects chewed the paraffin pellets for 5 minutes and collected the secreted saliva by exhaling it into a sterile container.
[0057]
The obtained saliva was subjected to ultrasonic treatment at 40 W for 10 seconds, diluted appropriately, and 100 μl was added to a solid medium of Mitis salivarius bacitracin (hereinafter sometimes referred to as “MSB”) at 37 ° C. The cells were cultured under anaerobic conditions for 48 hours. The number of colonies formed on the MSB solid medium was counted, and the concentration of Streptococcus mutans was calculated as the number of cells / ml from the dilution rate of saliva. On the MSB solid medium, Streptococcus mutans and Streptococcus sobrinus grow, and some oral bacteria grow.
[0058]
Morphological classification of colonies and morphologically indistinguishable colonies, after culturing the colonies in pure culture, immunoassay using serotype-specific antibodies of mutans streptococci, and sugar fermentation Streptococcus mutans was distinguished from Streptococcus sobrinus and other oral bacteria by a biochemical method such as a test, and the concentration of Streptococcus mutans was measured.
[0059]
(2) [Preparation of antigen extract using filtration device]
A syringe 9 (Termo, 2.5 ml) was set on a syringe filter 10 (Whatman, 13 mm syringe filter, glass fiber filter GF / C, particle holding capacity 1.2 μm), and a filtration device having a structure shown in FIG. 2 was prepared. .
[0060]
The plunger 8 is pulled out from the filtration device, 0.5 ml of saliva collected in Example 1 (1) is added into the syringe outer cylinder 7, and after the plunger 8 is attached, the plunger 8 is pushed down and pressurized to cause saliva. Was filtered. The filtrate discharged from the filtrate outlet 2 was discarded.
[0061]
0.5 ml of a 0.1 M NaOH aqueous solution is pulled up from the filtrate outlet 2 of the syringe filter 10 by pulling up the plunger 8 to make it negative pressure, and the liquid is absorbed into the syringe outer cylinder 7 and immediately flows into the syringe outer cylinder 7. Filtration was performed by pressing down and pressing, and the filtrate was discarded. Next, 0.12 ml of a 1 M sodium nitrite-0.5 M acetic acid aqueous solution was absorbed, and the above-mentioned liquid that had flowed into the syringe outer cylinder 7 was kept at room temperature for 2 and 5 minutes. Next, 0.38 ml of 0.5 M Tris-HCl buffer (pH 9.0) was similarly sucked from the filtrate outlet 2, and the extract (about 0.5 ml) was collected in the syringe barrel 7. Mix well.
[0062]
(3) [Measurement of Streptococcus mutans using immunochromatography test strip]
The syringe filter 10 was removed from the syringe 9 used in the above (2). 0.15 ml of the extract in the syringe 9 was added to the sample pad 13 of the immunochromatography test strip prepared in Production Example 2 (2), and the coloration of the detection site 15 and the control determination site 16 after 10 minutes was added. Presence and strength were determined. In the determination, the coloring intensity of the detection site 15 was visually identified in four stages (++: strong coloring intensity, ++: medium coloring intensity, +: weak coloring intensity,-: no coloring). If the control determination site 16 does not develop color, it indicates that the development of the colloidal gold-labeled antibody is defective, and the analysis was performed again.
[0063]
The determination result of the immunochromatographic test strip was compared with the concentration of Streptococcus mutans in saliva obtained by the culture method of Example 1 (1). Table 1 shows the results.
[0064]
[Table 1]

[0065]
As shown in Table 1, a determination result correlated with the concentration of Streptococcus mutans obtained by the culture method was obtained. By using the method for producing an extract of the present invention, an extract containing a sugar chain antigen could be prepared quickly (the time required for the extraction treatment was within 5 minutes) and simply.
[0066]
Comparative Example 1
[Preparation of sugar chain antigen extract of Streptococcus mutans by a method that does not reverse the extraction solution and detection by immunochromatography test strip (1)]
(1) [Measurement of Streptococcus mutans concentration in saliva by saliva collection and culture method]
The method of Example 1 (1) was followed.
[0067]
(2) [Preparation of antigen extract using filtration device]
A filtration device similar to that of Example 1 (2) was produced.
[0068]
In the same manner as in Example 1 (2), 0.5 ml of the saliva collected in Example 1 (1) was filtered, and then 0.5 ml of a 0.1 M NaOH aqueous solution was absorbed and filtered. The plunger 8 was pulled out, and 0.12 ml of a 1 M sodium nitrite-0.5 M acetic acid aqueous solution was added into the syringe barrel 7. After the plunger 8 was attached, the plunger 8 was lightly pushed down and pressurized to such an extent that the liquid did not drip, so that the nitrite aqueous solution was contained in the filter paper and reacted at room temperature for 2 and 5 minutes. Next, 0.38 ml of 0.5 M Tris-HCl buffer (pH 9.0) was sucked from the filtrate outlet 2, and the extract (about 0.5 ml) was collected in the syringe barrel 7 and mixed well. did.
[0069]
(3) [Measurement of Streptococcus mutans using immunochromatography test strip]
The syringe filter 10 was removed from the syringe 9 used in the above (2). 0.15 ml of the extract in the syringe 9 was added to the sample pad 13 of the immunochromatography test strip prepared in Production Example 2 (2), and the coloration of the detection site 15 and the control determination site 16 after 10 minutes was added. Presence / absence and strength were determined in the same manner as in Example 1 (3).
[0070]
The determination result of the immunochromatographic test strip was compared with the concentration of Streptococcus mutans in saliva obtained by the culture method of Example 1 (1). Table 2 shows the results.
[0071]
[Table 2]

[0072]
As shown in Table 2, when the test solution (saliva) was added to the filtration membrane by a method of passing the extraction solution (aqueous nitrite solution) in the same direction as the direction of filtration, compared with Example 1, In 2 minutes of extraction, there were 4 samples with insufficient sensitivity and color intensity. Further, addition of the extraction reagent was complicated.
[0073]
Example 2
[Preparation of Streptococcus mutans sugar chain antigen extract and detection of Streptococcus mutans using immunochromatographic test strip (2)]
(1) [Measurement of Streptococcus mutans concentration in saliva by saliva collection and culture method]
The method of Example 1 (1) was followed.
[0074]
(2) [Preparation of antigen extract using filtration device]
A filtration device similar to that of Example 1 (2) was produced.
[0075]
In the same manner as in Example 1 (2), 0.5 ml of the saliva collected in Example 1 (1) was filtered, and then 0.5 ml of a 0.1 M NaOH aqueous solution was absorbed, and immediately filtered. Subsequently, 0.12 ml of a 1M sodium nitrite-0.5M acetic acid aqueous solution was absorbed, and the mixture was kept at room temperature for 2 and 5 minutes. Next, the entire solution in the syringe 9 was filtered and collected in a sampling tube. The discharged liquid amount was about 0.12 ml. Then, 0.38 ml of 0.5 M Tris-HCl buffer (pH 9.0) was added, and the extract (about 0.5 ml) was mixed well.
[0076]
(3) [Measurement of Streptococcus mutans using immunochromatography test strip]
0.15 ml of the extract prepared in the above (2) was added to the sample pad 13 of the immunochromatography test strip prepared in Production Example 2 (2), and the detection site 15 and the control judgment site 16 were detected 10 minutes later. The presence or absence and intensity of color development were determined in the same manner as in Example 1 (3).
[0077]
The determination result of the immunochromatographic test strip was compared with the concentration of Streptococcus mutans in saliva obtained by the culture method of Example 1 (1). Table 3 shows the results.
[0078]
[Table 3]

[0079]
As shown in Table 3, when the extract was collected by filtration, there were two samples whose coloring intensity was improved as compared with Example 1. It is considered that the influence of the insoluble matter in the extract could be removed, so that the expandability of the colloidal gold-labeled antibody in the immunochromatography was improved.
[0080]
Example 3
[Preparation of Streptococcus mutans sugar chain antigen extract and detection of Streptococcus mutans using immunochromatographic test strip (3)]
(1) [Measurement of Streptococcus mutans concentration in saliva by saliva collection and culture method]
The method of Example 1 (1) was followed.
[0081]
(2) [Preparation of antigen extract using filtration device]
A filtration device similar to that of Example 1 (2) was produced.
[0082]
In the same manner as in Example 1 (2), 0.5 ml of the saliva collected in Example 1 (1) was filtered, and then 0.5 ml of a 0.1 M NaOH aqueous solution was absorbed and filtered. Next, 0.12 ml of a 1 M sodium nitrite-0.5 M acetic acid aqueous solution was absorbed, and the mixture was immediately filtered. Immediately, the filtrate was sucked again and kept at room temperature for 2 and 5 minutes. Next, 0.38 ml of 0.5 M Tris-HCl buffer (pH 9.0) was sucked from the filtrate outlet 2, and the extract (about 0.5 ml) was collected in the syringe barrel 7 and mixed well. did.
[0083]
(3) [Measurement of Streptococcus mutans using immunochromatography test strip]
The syringe filter 10 was removed from the syringe 9 used in the above (2). 0.15 ml of the extract in the syringe 9 was added to the sample pad 13 of the immunochromatography test strip prepared in Production Example 2 (2), and the coloration of the detection site 15 and the control determination site 16 after 10 minutes was added. Presence / absence and strength were determined in the same manner as in Example 1 (3).
[0084]
The determination result of the immunochromatographic test strip was compared with the concentration of Streptococcus mutans in saliva obtained by the culture method of Example 1 (1). Table 4 shows the results.
[0085]
[Table 4]

[0086]
As shown in Table 4, when the operation of absorbing and filtering the extract was repeated, there were four samples whose sensitivity and color intensity were improved as compared with Example 1. It is considered that the extraction efficiency was improved.
[0087]
Example 4
[Preparation of Streptococcus mutans sugar chain antigen extract and detection of Streptococcus mutans using immunochromatographic test strip (4)]
(1) [Measurement of Streptococcus mutans concentration in saliva by saliva collection and culture method]
The method of Example 1 (1) was followed.
[0088]
(2) [Preparation of antigen extract using filtration device]
A filtration device similar to that of Example 1 (2) was produced.
[0089]
In the same manner as in Example 1 (2), 0.5 ml of the saliva collected in Example 1 (1) was filtered, and then 0.5 ml of a 0.1 M NaOH aqueous solution was absorbed and filtered. Then, 0.12 ml of a 1 M sodium nitrite-0.5 M acetic acid aqueous solution was absorbed, filtered immediately, and kept at room temperature for 2 and 5 minutes to extract the antigen with the aqueous solution remaining on the glass fiber filter paper. Was carried out. About 0.045 ml of the nitrous acid solution remained on the glass fiber filter paper. Next, 0.15 ml of 0.5 M Tris-HCl buffer (pH 9.0) is sucked from the filtrate outlet 2, and the extract (about 0.15 ml) is collected in the syringe barrel 7 and mixed well. did.
[0090]
(3) [Measurement of Streptococcus mutans using immunochromatography test strip]
The syringe filter 10 was removed from the syringe 9 used in the above (2). The entire amount (about 0.15 ml) of the extract in the syringe 9 was added to the sample pad 13 of the immunochromatography test strip prepared in Production Example 2 (2) using the syringe 9, and the detection site 10 minutes later was added. The presence and intensity of color development at 15 and the control determination site 16 were determined in the same manner as in Example 1 (3).
[0091]
The determination result of the immunochromatographic test strip was compared with the concentration of Streptococcus mutans in saliva obtained by the culture method of Example 1 (1). Table 5 shows the results.
[0092]
[Table 5]

[0093]
As shown in Table 5, when extracted with an extraction solution (aqueous nitrite solution) remaining on the filtration membrane after liquid absorption and filtration, two samples with improved color intensity compared to Example 1 were obtained. Was. It is considered that the antigen concentration in the extract could be concentrated about 3.3 times.
[0094]
Comparative Example 2
[Preparation of sugar chain antigen extract of Streptococcus mutans by a method that does not reverse the extraction solution and detection by immunochromatography test strip (2)]
(1) [Measurement of Streptococcus mutans concentration in saliva by saliva collection and culture method]
The method of Example 1 (1) was followed.
[0095]
(2) [Preparation of antigen extract using filtration device]
A filtration device similar to that of Example 1 (2) was produced.
[0096]
In the same manner as in Example 1 (2), 0.5 ml of the saliva collected in Example 1 (1) was filtered, and then 0.5 ml of a 0.1 M NaOH aqueous solution was absorbed and filtered. The plunger 8 was pulled out, and 0.12 ml of a 1 M sodium nitrite-0.5 M acetic acid aqueous solution was added into the syringe barrel 7. After attaching the plunger 8, the plunger 8 was filtered by pressing down and pressurizing, and kept at room temperature for 2 and 5 minutes. Next, 0.15 ml of 0.5 M Tris-HCl buffer (pH 9.0) is sucked from the filtrate outlet 2, and the extract (about 0.15 ml) is collected in the syringe barrel 7 and mixed well. did.
[0097]
(3) [Measurement of Streptococcus mutans using immunochromatography test strip]
The syringe filter 10 was removed from the syringe 9 used in the above (2). The entire amount (about 0.15 ml) of the extract in the syringe 9 was added to the sample pad 13 of the immunochromatography test strip prepared in Production Example 2 (2) using the syringe 9, and the detection site 10 minutes later was added. The presence and intensity of color development at 15 and the control determination site 16 were determined in the same manner as in Example 1 (3).
[0098]
The determination result of the immunochromatographic test strip was compared with the concentration of Streptococcus mutans in saliva obtained by the culture method of Example 1 (1). Table 6 shows the results.
[0099]
[Table 6]

[0100]
As shown in Table 6, the test solution (saliva) was added to the filtration membrane by passing the extraction solution (aqueous nitrite solution) in the same direction as the filtration direction, and added to the extraction solution remaining on the filtration membrane. In the case where the extraction was performed by extraction, the sensitivity and the color intensity were insufficient when the extraction was performed for 2 minutes although the antigen concentration in the extract could be concentrated about 3.3 times as compared with Example 1. There were three samples. Further, addition of the extraction reagent was complicated.
[0101]
【The invention's effect】
According to the method for producing an antigen or antibody of the present invention, an antigen or antibody extract can be rapidly and easily produced by filtering and extracting the antigen or antibody retentate in a test solution. By applying the extract to various analyses, the antigen or antibody in the sample liquid can be analyzed with high sensitivity. In particular, considering that caries risk diagnosis and the like are performed in a busy daily practice at a dental clinic or the like, the effects of the simplification of the operation and the shortening of the extraction time achieved by the present invention are incalculable. large.
[Brief description of the drawings]
FIG. 1 is a perspective view showing a typical embodiment of a filtration device used in the present invention.
FIG. 2 is a side view showing another embodiment of the filtration device used in the present invention.
FIG. 3 is a schematic view of each member of an immunochromatography test strip used in Examples.
FIG. 4 is a side view of an immunochromatography test strip used in Examples.
[Explanation of symbols]
1 ・・・ Main chamber for supplying liquid to be filtered
2 ... filtrate outlet
3 ... Filtration membrane
4 ... Filtration membrane storage unit
5 ... connection part
6 ... small space
7 ・・・ Syringe outer cylinder
8 ・・・ Plunger
9 ... Syringe
10 ... Syringe filter
11 ・・・ Nitrocellulose membrane
12 ... conjugate pad
13 ... Sample pad
14 ・・・ Absorption pad
15 ... Detection site
16 ... Control judgment part

Claims

The filtrate supply chamber and the filtrate outlet are in communication with each other through a filtration membrane, and the filtration device having negative pressure means upstream of the filtrate supply chamber is provided with a substance containing the antigen or antibody holding substance by a filtration device. The sample solution is filtered, the retentate of the antigen or antibody is captured on the filtration membrane, and then the inside of the filtration device is set to a negative pressure by the negative pressure means, and the extraction liquid is sucked from the filtrate outlet. And recovering the extract of the antigen or antibody in the filtrate supply chamber by storing the extract of the antigen or antibody.

After carrying out the method of claim 1, the extract of the antigen or antibody stored in the filtrate supply chamber is filtered, and the discharged extract is sucked from the filtrate outlet to flow backward in the filtration device. A method for producing an antigen or antibody extract, comprising repeating the operation of storing the extract in the liquid supply chamber at least once.

The method for producing an antigen or antibody extract according to claim 1 or 2, wherein the filtration device further comprises a negative pressure means and a pressurizing means upstream of the filtrate supply chamber, and the filtration is performed under pressure. .

The method for producing an antigen or antibody extract according to any one of claims 1 to 3, wherein the antigen carrier is a microorganism having a sugar chain antigen, and the antigen extraction solution is a nitrite extraction reagent.

The test solution containing the antigen-retaining substance is a solution containing an oral sample, and the antigen is an antigen of a caries-related bacterium, and the antigen or antibody extract according to any one of claims 1 to 4. Manufacturing method.