JP2004267118A

JP2004267118A - Oncogene and application thereof

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Publication number: JP2004267118A
Application number: JP2003063578A
Authority: JP
Inventors: Keisuke Fukuchi; 圭介福地; Toshinori Azuma; 利紀我妻; Takehiro Hirai; 岳大平井
Original assignee: Sankyo Co Ltd
Current assignee: Sankyo Co Ltd
Priority date: 2003-03-10
Filing date: 2003-03-10
Publication date: 2004-09-30

Abstract

<P>PROBLEM TO BE SOLVED: To discover a gene associating with the generation and/or proliferation of a prostatic cancer cell; and to provide a method for detecting the prostatic cancer by using the oncogene, a method for screening a compound having activities for treating and/or preventing the prostatic cancer, and to obtain a medicinal composition for treating and/or preventing the prostatic cancer. <P>SOLUTION: The method for detecting the prostatic cancer uses the expression level of TMPM4 (transient receptor potential cation channel, subfamily M member 4), PLA1A (phospholipase A1 member 1) and/or BUCS1 (butyryl coenzyme A synthase 1) as an index. The kit for detecting the prostatic cancer usable for the detection method, the method for screening the compound having activities for treating and/or preventing the prostatic cancer, and the medicinal composition for treating and/or preventing the prostatic cancer are also provided. <P>COPYRIGHT: (C)2004,JPO&NCIPI

Description

【０００１】
【発明が属する技術分野】
本発明は、前立腺癌で顕著に発現量が高い遺伝子を用いた前立腺癌の検出方法、前立腺癌の治療及び／または予防効果を有する化合物のスクリーニング方法、及び前立腺癌の治療及び／または予防用医薬組成物等に関する。
【０００２】
【従来の技術】
癌は、欧米や日本などの先進諸国において、依然として主たる死亡原因の一つである。臨床的には、外科的癌組織の切除、放射線治療及び化学療法を含む種々の医学的方法がとられてきているが、悪性形質転換及び癌細胞の増殖に関する十分正確な理解に基づくものとは言えず、多くの場合、その効果は部分的で多くの患者を満足させるものではない。そのような悪性形質転換及び癌細胞の増殖機構に関し、過去１０数年に渡り多くの研究施設において精力的な研究が進められてきた。現在では、正常細胞の増殖は、癌遺伝子（Ｏｎｃｏｇｅｎｅ）（増殖促進遺伝子）と癌抑制遺伝子（Ｔｕｍｏｒｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒｇｅｎｅ）（増殖阻害遺伝子）等様々な遺伝子の質的および量的な変化によって制御されていると考えられている（例えば、非特許文献１参照。）。
【０００３】
細胞内在性の癌遺伝子は、一般的にそれ自体は正常細胞を癌化させる効果は必ずしも強いものではないが、構造変異によりその調節機能が失われると、癌遺伝子となり異常増殖、癌化の直接的な原因となる。例えば、点突然変異で癌を引き起こすＲａｓや、染色体転座により酵素活性の異常亢進を引き起こすＡｂｌ遺伝子などがその一例である。また、変異を生じなくとも、癌遺伝子の発現亢進が、癌化の引き金となる場合も多い。増殖因子受容体ＨＥＲ２／ｎｅｕの遺伝子増幅などによる発現亢進が転移性乳癌で惹起され、その阻害剤が転移性乳癌の治療に用いられているのはその一例である。以上のような事実は、これら癌遺伝子が、癌治療の標的として、極めて妥当な標的分子を提供するという作業仮説を強く示唆している。
【０００４】
癌疾患の中でも前立腺癌は、特に米国で最も頻繁に診断される癌であり、かつ男性の癌死原因の第二番目である。年間およそ３００，０００人の男性が新規に前立腺癌と診断され、また４０，０００人以上の男性が本疾患で死亡している。前立腺癌による死亡は主に転移した疾患に起因しているにも関わらず、新しく診断された患者の６０％近くは前立腺に限局した一次腫瘍を有している。こうした限局癌の患者に対しては外科手術及び放射線治療がしばしば有効であるが、転移伝播した癌患者の場合は、ほとんどの場合治療不能である。現在まで精力的な研究が進められてきているものの、前立腺癌の発生及び進行を引き起こす生物学的な機構に関してはごく僅かしか知られていない。
【０００５】
これら（前立腺癌をはじめとする）癌の発生、進行に関連する遺伝子の発見は、その機構の解明及び治療薬開発の上で極めて有用である。特にその分子機能を阻害することによって、癌細胞の増殖抑制や細胞死を誘導しうるものは、新たな癌治療の標的分子として期待できる。
【０００６】
標的分子の機能阻害による効果を知る代替法として、何らかの方法により、その遺伝子の発現を低下させる手法が用いられる。標的遺伝子と相補的な配列を持つ一本鎖ＤＮＡであるアンチセンスオリゴヌクレオチドやＲＮＡ切断活性を持たせた一本鎖ＲＮＡであるリボザイムを用いた方法などがその例である。これらに加え、最近二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）を用いたＲＮＡｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ（ＲＮＡｉ）が利用できるようになって来た（例えば、非特許文献２参照。）。
【０００７】
ＲＮＡｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ（ＲＮＡｉ）は、ｄｓＲＮＡにより、細胞内に存在する相同なｍＲＮＡが特異的に分解される現象で１９９８年に初めて線虫で起こる現象として報告された（例えば、非特許文献３参照。）。哺乳動物では長鎖のｄｓＲＮＡがインターフェロン応答を引き起こしてしまうため（例えば、非特許文献４及び５参照。）、当初はＲＮＡｉ効果を特異的な遺伝子抑制手法として利用するのは困難であると考えられていたが、２００１年にＥｌｂａｓｈｉｒらによってＲＮＡｉの中間産物である２１−２３ｍｅｒの短いｄｓＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）を利用することによってインターフェロン応答を回避しつつＲＮＡｉ効果を誘導できることが報告され（例えば、非特許文献６参照。）、このｓｉＲＮＡによるＲＮＡｉは、これまでに無い簡便且つ強力な遺伝子発現抑制手法として注目を集めている。
【０００８】
Ｈｏｍｏｓａｐｉｅｎｓｔｒａｎｓｉｅｎｔｒｅｃｅｐｔｏｒｐｏｔｅｎｔｉａｌｃａｔｉｏｎｃｈａｎｎｅｌ，ｓｕｂｆａｍｉｌｙＭ，ｍｅｍｂｅｒ４（以下、「ＴＲＰＭ４」とする）は、Ｘｕらにより心臓、前立腺、大腸に発現するチャネル様分子として最初にクローニングされ、単鎖型（ＴＲＰＭ４ａ）と長鎖型（ＴＲＰＭ４ｂ）が存在することが報告されている（例えば、非特許文献７参照。）。また、Ｌａｕｂａｒｙらにより、ＴＲＰＭ４ｂがカルシウムではなく、ナトリウムやカリウムイオンを透過させること、そしてカルシウムイオンの動員による刺激でチャネルが開口することが報告されている（例えば、非特許文献８参照。）。ＴＲＰＭ４はＴＲＰ９とも呼ばれており、前立腺で発現していることが示されているが、正常な前立腺と前立腺癌との間で発現量には差がないと報告されており（例えば、特許文献１参照。）、その機能と癌との関連性については全く明らかになっていない。
【０００９】
ＨｏｍｏｓａｐｉｅｎｓｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐａｓｅＡ１ｍｅｍｂｅｒＡ（以下、「ＰＬＡ１Ａ」とする。）は、ラット血小板のトロンビン刺激培養上清からＳａｔｏらにより精製・同定された蛋白であり、ホスファチヂルセリンやリゾフォスファチヂルセリンなどのセリンリン脂質に特異的に作用し、脂肪酸を切り離すリパーゼとして働くことが知られる（例えば、非特許文献９参照。）。そのヒトオーソログ遺伝子は、Ｎａｇａｉらによってヒト肝よりクローニングされた（例えば、非特許文献１０参照。）。ラットでは、血小板に豊富に発現しているものの、ヒト血小板にはほとんど存在しておらず、様々な臓器で発現が認められる。
【００１０】
ホスファチディルセリンは、細胞内では、プロテインキナーゼＣ（例えば、非特許文献１１参照。）、ｃ−ｒａｆ−１（例えば、非特許文献１２参照。）、一酸化窒素合成酵素（例えば、非特許文献１３参照。）、Ｎａ＋／Ｋ＋−ＡＴＰ分解酵素（例えば、非特許文献１４参照。）、ＧＴＰ分解酵素（例えば、非特許文献１５参照。）、ジアシルグリセロールキナーゼ（例えば、非特許文献１６参照。）等を制御することが知られている。一方、細胞外では、血液凝固反応（例えば、非特許文献１７参照。）やマクロファージの貪食能（例えば、非特許文献１８参照。）を活性化することが知られており、その分解酵素であるＰＬＡ１Ａは、それらホスファチディルセリンの作用に対し抑制的に働くことが予想されている（例えば、非特許文献１９参照。）。リゾフォスファチディルセリンについては、ヒト卵巣癌株や乳癌株の細胞内カルシウム濃度を一過性に上昇させ（例えば、非特許文献２０参照。）、また、リンパ腫細胞株ＪｕｒｋａｔＴ細胞にも細胞内カルシウム濃度を上昇させるとの報告がある（例えば、非特許文献２１参照。）。また、ケラチノサイトでは、その細胞増殖を亢進させることも報告されている（例えば、非特許文献２２参照。）。癌との関連については、ＶａｎＧｒｏｎｉｎｇｅｎらが、転移性とその発現が逆相関する遺伝子として単離した遺伝子ｎｍｄ１（例えば、非特許文献２３参照。）と同一であったことが挙げられるが、これらを除いては、癌細胞との関連指摘した報告はなく、その機能と癌特に前立腺癌との関連性については明らかになっていない（例えば、特許文献２参照。）。
【００１１】
ＨｏｍｏｓａｐｉｅｎｓｂｕｔｙｒｙｌＣｏｅｎｚｙｍｅＡｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ１（以下、「ＢＵＣＳ１」という。）は、Ｆｉｊｉｎｏらにより、炭素鎖が４から１６の脂肪酸のうち、特に炭素鎖８のオクタノエート（ｏｃａｔａｎｏａｔｅ）の酸化に関与する酸化酵素として同定された（例えば、非特許文献２４参照。）。ＢＵＣＳ１遺伝子の発現は主に肝臓と腎臓で認められ、ミトコンドリア基質中に局在することが報告されており、アシル−ＣｏＡの生産に寄与していると考えられる。本酵素のＥｘｐｒｅｓｓｅｄＳｅｑｕｅｎｃｅＴａｇ（ＥＳＴ）が前立腺癌で高く発現していることは報告されているが（例えば、特許文献３参照。）、本酵素と前立腺癌との関係は明らかにはなっていない。
【００１２】
【特許文献１】
国際公開第０２／１０３８２号パンフレット
【特許文献２】
国際公開第００／２４９１１号パンフレット
【特許文献３】
国際公開第０１／６０８６０号パンフレット
【非特許文献１】
新津洋司郎、横田淳編、「臨床家のための癌遺伝子／癌抑制遺伝子」、南江堂、１９９９年１０月１６日、Ｐ．１−４６
【非特許文献２】
多比良和誠編、「遺伝子の機能阻害実験法」、羊土社、２００１年９月２０日、ｐ．１９０−２０３
【非特許文献３】
「ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）」、１９９８年２月１９日、第３９１巻、第６６６９号、ｐ．８０６−８１１
【非特許文献４】
「マイクロバイオロジー・アンド・モレキュラー・バイオロジー・レビューズ（ＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙａｎｄＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙＲｅｖｉｅｗｓ）」、１９９８年１２月、第６２巻、第４号、ｐ．１４１５−１４３４
【非特許文献５】
「ザ・インターナショナル・ジャーナル・オブ・バイオケミストリー・アンド・セル・バイオロジー（ＴｈｅＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌＪｏｕｒｎａｌｏｆＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙａｎｄＣｅｌｌＢｉｏｌｏｇｙ）」、１９９７年、７月、第２９巻、第７号、ｐ．９４５−９４９
【非特許文献６】
「ジーンズ・アンド・デヴェロップメンツ（ＧｅｎｅｓａｎｄＤｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｓ）」）、２００１年１月１５日、第１５巻、第２号、ｐ．１８８−２００
【非特許文献７】
「プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシィーズ・オブ・ザ・ユナイテッド・ステイツ・オブ・アメリカ（ＰｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓｏｆｔｈｅＮａｔｉｏｎａｌＡｃａｄｅｍｙｏｆＳｃｉｅｎｃｅｓｏｆｔｈｅＵｎｉｔｅｄＳｔａｔｅｓｏｆＡｍｅｒｉｃａ）」、２００１年９月１１日、第９８巻、第１９号、ｐ．１０６９２−１０６９７
【非特許文献８】
「セル（Ｃｅｌｌ）」、２００２年５月３日、第１０９巻、第３号、ｐ．３９７−４０７
【非特許文献９】
「ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（ＪｏｕｒｎａｌｏｆＢｉｏｌｏｇｉｃａｌＣｈｅｍｉｓｔｒｙ）」、１９９７年１月２４日、第２７２巻、第４号、ｐ．２１９２−２１９８
【非特許文献１０】
「ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（ＪｏｕｒｎａｌｏｆＢｉｏｌｏｇｉｃａｌＣｈｅｍｉｓｔｒｙ）」、１９９９年４月１６日、第２７４巻、第１６号、ｐ．１１０５３−１１９５９
【非特許文献１１】
「サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）」、１９９２年１０月２３日、第２５８巻、第５０８２号、ｐ．６０７−６１４）
【非特許文献１２】
「ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（ＪｏｕｒｎａｌｏｆＢｉｏｌｏｇｉｃａｌＣｈｅｍｉｓｔｒｙ）」、１９９４年４月１日、第２６９巻、第１３号、ｐ．１００００−１０００７
【非特許文献１３】
「ジャーナル・オブ・エクスペリメンタル・メディシン（ＪｏｕｒｎａｌｏｆＥｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌＭｅｄｉｃｉｎｅ）」、１９９４年９月１日、第１８０巻、第３号、ｐ．９４５−９５８
【非特許文献１４】
「アドバンセズ・イン・エクスペリメンタル・メディシン・アンド・バイオロジー（ＡｄｖａｎｃｅｓｉｎＥｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌＭｅｄｉｃｉｎｅａｎｄＢｉｏｌｏｇｙ）」、１９９２年８月１３日、第３１８巻、ｐ．３２５−３３０
【非特許文献１５】
「ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（ＪｏｕｒｎａｌｏｆＢｉｏｌｏｇｉｃａｌＣｈｅｍｉｓｔｒｙ）」、１９９３年８月１５日、第２６８巻、第２３号、ｐ．１７２４０−１７２４６
【非特許文献１６】
「ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（ＪｏｕｒｎａｌｏｆＢｉｏｌｏｇｉｃａｌＣｈｅｍｉｓｔｒｙ）」、１９９１年４月１５日、第２６６巻、第１１号、ｐ．７０９６−７１００
【非特許文献１７】
「アニュアル・レビュー・オブ・バイオケミストリー（ＡｎｎｕａｌＲｅｖｉｅｗｏｆＢｉｏｃｈｅｍｉｓｉｔｒｙ）」、１９８８年、第５７巻、ｐ．９１５−９５６
【非特許文献１８】
「ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（ＪｏｕｒｎａｌｏｆＢｉｏｌｏｇｉｃａｌＣｈｅｍｉｓｔｒｙ）」、１９９０年３月２５日、第２６５巻、第９号、ｐ．５２２６−５２３１
【非特許文献１９】
「蛋白質核酸酵素」、１９９９年５月２３日、第４４巻、第８巻、ｐ．１０３８−１０４２
【非特許文献２０】
「クリニカル・キャンサー・リサーチ（ＣｌｉｎｉｃａｌＣａｎｃｅｒＲｅｓｅａｒｃｈ）」、１９９５年１０月、第１巻、第１０号、ｐ．１２２３−１２３２
【非特許文献２１】
「ジャーナル・オブ・セル・フィジオロジー（ＪｏｕｒｎａｌｏｆＣｅｌｌＰｈｙｓｉｏｌｏｇｙ）」、１９９５年６月、第１６３巻、第３号、ｐ．４４１−４５０
【非特許文献２２】
「アメリカン・ジャーナル・オブ・フィジオロジー（ＡｍｅｒｉｃａｎＪｏｕｒｎａｌｏｆＰｈｙｓｉｏｌｏｇｙ）」、１９９８年４月、第２７４巻、第４号、第一部、ｐ．Ｃ１０６５−Ｃ１０７４
【非特許文献２３】
「キャンサー・リサーチ（ＣａｎｃｅｒＲｅｓｅａｒｃｈ）」、１９９５年１２月１５日、第５５巻、第２４号、ｐ．６２３７−６２４３
【非特許文献２４】
「ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（ＪｏｕｒｎａｌｏｆＢｉｏｌｏｇｉｃａｌＣｈｅｍｉｓｔｒｙ）」、２００１年９月２１日、第２７６巻、第３８号、ｐ．３５９６１−３５９６６
【００１３】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、前立腺癌細胞の発生及び／または増殖に関連する遺伝子を見出し、該癌遺伝子を用いた前立腺癌の検出方法、前立腺癌の治療及び／または予防効果を有する化合物のスクリーニング方法、及び前立腺癌の治療及び／または予防用医薬組成物を提供することを目的とする。
【００１４】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、他の組織に比べて前立腺で発現量が高い遺伝子のうち、更に前立腺癌で発現量が高い遺伝子として、ＴＭＰＭ４、ＰＬＡ１Ａ及びＢＵＣＳ１を見出し、該遺伝子の発現量を抑えると癌細胞の増殖を抑制できることを見出し、該遺伝子を用いた、前立腺癌の検出方法、新規前立腺癌治療及び／または予防効果を有する化合物のスクリーニング方法を開発し、更に、該遺伝子の発現を抑制させる物質を提供し本発明を完成させた。
すなわち、本発明は、
（１）下記の工程１）乃至４）を含む、前立腺癌の検出方法：
１）被験者より採取した検体より、全ＲＮＡ画分を抽出する工程；
２）正常人より採取した検体より、全ＲＮＡ画分を抽出する工程；
３）上記工程１）由来の全ＲＮＡ画分と上記工程２）由来の全ＲＮＡ画分における、下記の▲１▼乃至▲３▼のいずれか一つに記載のポリヌクレオチドまたはその部分ポリヌクレオチドの発現量を測定する工程；
▲１▼配列表の配列番号１に示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド、配列番号３に示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド及び配列番号５に示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドからなる群から選択される少なくともいずれか一つのポリヌクレオチド、
▲２▼配列表の配列番号７に示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド、
▲３▼配列表の配列番号９に示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド、
４）上記工程１）由来の全ＲＮＡ画分と上記工程２）由来の全ＲＮＡ画分との間における上記工程３）によって測定されたポリヌクレオチドの発現量の差を解析し、上記工程１）に記載の被験者の前立腺癌を検出する工程、
（２）下記の工程１）乃至３）を含む、前立腺癌の検出方法：
１）被験者より採取した検体における、下記の▲１▼乃至▲３▼のいずれか一つに記載の蛋白質またはその部分ポリペプチドの発現量を測定する工程；
▲１▼配列表の配列番号２に示されるアミノ酸配列からなる蛋白質、配列番号４に示されるアミノ酸配列からなる蛋白質及び配列番号６に示されるアミノ酸配列からなる蛋白質からなる群から選択される少なくともいずれか一つの蛋白質、
▲２▼配列表の配列番号８に示されるアミノ酸配列からなる蛋白質、
▲３▼配列表の配列番号１０に示されるアミノ酸配列からなる蛋白質、
２）正常人から採取した検体における、上記工程１）の▲１▼乃至▲３▼のいずれか一つに記載の蛋白質の発現量を測定する工程；
３）上記工程１）で検出された蛋白質の発現量と上記工程２）で検出された該蛋白質の発現量の差を解析し、被験者または被験動物の前立腺癌を検出する工程、
（３）下記の工程１）乃至４）を含むことからなる、前立腺癌に対する治療効果及び／または予防効果を有する物質のスクリーニング方法：
１）被験物質を添加した培地で培養した哺乳動物由来培養細胞より、全ＲＮＡ画分を抽出する工程；
２）被験物質を添加しないで培養した哺乳動物由来培養細胞より、全ＲＮＡ画分を抽出する工程：
３）上記工程１）由来の全ＲＮＡ画分と上記工程２）由来の全ＲＮＡ画分における、下記の▲１▼乃至▲３▼のいずれか一つに記載のポリヌクレオチドまたはその部分ポリヌクレオチドの発現量を測定する工程；
▲１▼配列表の配列番号１に示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド、配列番号３に示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド及び配列番号５に示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドからなる群から選択される少なくともいずれか一つのポリヌクレオチド、
▲２▼配列表の配列番号７に示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド、
▲３▼配列表の配列番号９に示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド、
４）上記工程１）由来の全ＲＮＡ画分と上記工程２）由来の全ＲＮＡ画分との間における上記工程３）によって測定されたポリヌクレオチドの発現量の差を解析し、被験物質の、前立腺癌に対する治療効果及び／または予防効果を判定する工程、
（４）下記の工程１）乃至４）を含むことからなる、前立腺癌の治療効果及び／または予防効果を有する物質のスクリーニング方法：
１）被験物質を投与した哺乳動物個体より採取した検体より、全ＲＮＡ画分を抽出する工程；
２）被験物質を投与しなかった哺乳動物個体より採取した検体より、全ＲＮＡ画分を抽出する工程；
３）上記工程１）由来の全ＲＮＡ画分と上記工程２）由来の全ＲＮＡ画分における、下記の▲１▼乃至▲３▼のいずれか一つに記載のポリヌクレオチドまたはその部分ポリヌクレオチドの発現量を測定する工程；
▲１▼配列表の配列番号１に示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド、配列番号３に示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド及び配列番号５に示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドからなる群から選択される少なくともいずれか一つのポリヌクレオチド、
▲２▼配列表の配列番号７に示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド、
▲３▼配列表の配列番号９に示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド、
４）上記工程１）由来の全ＲＮＡ画分と上記工程２）由来の全ＲＮＡ画分との間における上記工程３）よって測定されたポリヌクレオチドの発現量の差を解析し、被験物質の前立腺癌に対する治療効果及び／または予防効果を判定する工程、
（５）下記の工程１）乃至３）を含むことからなる、前立腺癌の治療効果及び／または予防効果を有する物質のスクリーニング方法：
１）被験物質を添加した培地で培養した哺乳動物由来培養細胞における、下記の▲１▼乃至▲３▼のいずれか一つに記載の蛋白質またはその部分ポリペプチドの発現量を測定する工程；
▲１▼配列表の配列番号２に示されるアミノ酸配列からなる蛋白質、配列番号４に示されるアミノ酸配列からなる蛋白質及び配列番号６に示されるアミノ酸配列からなる蛋白質からなる群から選択される少なくともいずれか一つの蛋白質、
▲２▼配列表の配列番号８に示されるアミノ酸配列からなる蛋白質、
▲３▼配列表の配列番号１０に示されるアミノ酸配列からなる蛋白質、
２）被験物質を添加しない培地で培養した哺乳動物由来培養細胞における、上記工程１）の▲１▼乃至▲３▼のいずれか一つに記載の蛋白質の発現量を該蛋白質に特異的に結合する抗体またはリガンドを用いて検出する工程；
３）上記工程１）で検出された蛋白質の発現量と、上記工程２）で検出された該蛋白質の発現量の差を解析し、被験物質の前立腺癌に対する治療効果及び／または予防効果を判定する工程、
（６）下記の工程１）乃至３）を含むことからなる、前立腺癌の治療効果及び／または予防効果を有する物質のスクリーニング方法：
１）被験物質を投与された哺乳動物個体より採取した検体における、下記の▲１▼乃至▲３▼のいずれか一つに記載の蛋白質またはその部分ポリペプチドの発現量を測定する工程；
▲１▼配列表の配列番号２に示されるアミノ酸配列からなる蛋白質、配列番号４に示されるアミノ酸配列からなる蛋白質及び配列番号６に示されるアミノ酸配列からなる蛋白質からなる群から選択される少なくともいずれか一つの蛋白質、
▲２▼配列表の配列番号８に示されるアミノ酸配列からなる蛋白質、
▲３▼配列表の配列番号１０に示されるアミノ酸配列からなる蛋白質、
２）被験物質を投与されなかった哺乳動物個体より採取した検体における、上記工程１）の▲１▼乃至▲３▼のいずれか一つに記載の蛋白質またはその部分ポリペプチドの発現量を測定する工程；
３）上記工程１）で検出された蛋白質の発現量と、上記工程２）で検出された該蛋白質の発現量の差を解析し、被験物質の前立腺癌に対する治療効果及び／または予防効果を判定する工程、
（７）トランジエント・レセプター・ポテンシャル・カチオン・チャンネル，サブファミリーＭ，メンバー４（ｔｒａｎｓｉｅｎｔｒｅｃｅｐｔｏｒｐｏｔｅｎｔｉａｌｃａｔｉｏｎｃｈａｎｎｅｌ，ｓｕｂｆａｍｉｌｙＭ，ｍｅｍｂｅｒ４：以下、「ＴＲＰＭ４」とする。）の陽イオン透過チャンネルを阻害する物質を同定することを特徴とし、以下の工程１）乃至３）を含むことからなる、前立腺癌に対する治療効果及び／または予防効果を有する物質の決定方法：
１）ＴＲＰＭ４を細胞表面に発現している細胞を供給する工程；
２）Ｃａ^２＋の存在下において１）に記載の細胞と被験物質を接触する工程；
３）細胞内への陽イオンの取り込みが減少するかどうかを決定する工程（ここで、細胞内への陽イオンの取り込みが減少することは被験物質がＴＲＰＭ４の陽イオン透過チャンネルを阻害していることを示す。）
（８）フォスフォリパーゼＡ１活性を阻害する物質を同定することを特徴とし、以下の工程１）及び２）を含むことからなる、前立腺癌に対する治療効果及び／または予防効果を有する物質の決定方法：
１）フォスフォリパーゼＡ１メンバーＡの基質とフォスフォリパーゼＡ１メンバーＡを被験物質と接触する工程；
２）被験物質の存在下で基質を加水分解する活性が減少するかどうかを決定する工程（ここで、基質を加水分解する活性が減少することは被験物質がフォスフォリパーゼＡ１活性を阻害することを示す。）、
（９）ブチリル・コエンザイムＡ・シンテターゼ１（ｂｕｔｙｒｙｌＣｏｅｎｚｙｍｅＡｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ１：以下，「ＢＵＣＳ１」という。）のアシル−ＣｏＡの合成活性を阻害する物質を同定することを特徴とし、以下の工程１）乃至２）を含むことからなる、前立腺癌に対する治療効果及び／または予防効果を有する物質の決定方法：
１）ＢＵＣＳ１の基質とＢＵＣＳ１を被験物質と接触する工程；
２）被験物質の存在下でアシル−ＣｏＡの合成量が減少するかどうかを決定する工程（ここで、アシル−ＣｏＡの合成量が減少することは被験物質がＢＵＣＳ１のアシル−ＣｏＡの合成活性を阻害することを示す。）、
（１０）ポリヌクレオチドの発現量を測定する方法が、ノーザンブロット法、ドットブロット法、スロットブロット法、ＲＴ−ＰＣＲ、リボヌクレアーゼ保護アッセイまたはランオン・アッセイであることを特徴とする、請求項１、３及び４のいずれか一つに記載の方法、
（１１）ポリヌクレオチドの発現量を測定する方法が動物組織または動物細胞由来の相補的ＤＮＡ群または該ＤＮＡ群の各ＤＮＡの部分配列からなるＤＮＡで作製された遺伝子チップまたはアレイを用いることを特徴とする請求項１、３及び４のいずれか一つに記載の方法、
（１２）蛋白質の発現量の測定方法が、該蛋白質に特異的に結合する抗体またはリガンドを用いることを特徴とする、（２）、（５）及び（６）のいずれか一つに記載の方法、
（１３）蛋白質の発現量の測定方法が、ウエスタンブロット法、ドットブロット法、スロットブロット法または固相酵素免疫定量法（ＥＬＩＳＡ法）であることを特徴とする、（２）、（５）及び（６）のいずれか一つに記載の方法、
（１４）下記の１）乃至３）からなる群から選択される少なくとも一つ以上を含む、被験物質の前立腺癌に対する治療効果及び／または予防効果判定用キット：
１）配列表の配列番号１に示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド、配列番号３に示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド、配列番号５に示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド、配列番号７に示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド及び配列番号９に示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドからなる群から選択される少なくともいずれか一つのポリヌクレオチドを特異的に増幅するための１５乃至３０塩基長の連続したオリゴヌクレオチドプライマー；
２）配列表の配列番号１に示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド、配列番号３に示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド、配列番号５に示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド、配列番号７に示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド及び配列番号９に示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドからなる群から選択される少なくともいずれか一つのポリヌクレオチドにストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、該ポリヌクレオチドを検出するための１５ヌクレオチド以上の連続したポリヌクレオチドプローブ；
３）配列表の配列番号１に示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド、配列番号３に示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド、配列番号５に示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド、配列番号７に示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド及び配列番号９に示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドからなる群から選択される少なくともいずれか一つのポリヌクレオチドが固定された固相化試料、
（１５）下記の１）及び２）の少なくとも一つを含む、被験物質の前立腺癌に対する治療効果及び／または予防効果判定用キット：
１）配列表の配列番号２に示されるアミノ酸配列からなる蛋白質、配列番号４に示されるアミノ酸配列からなる蛋白質、配列番号６に示されるアミノ酸配列からなる蛋白質、配列番号８に示されるアミノ酸配列からなる蛋白質及び配列番号１０に示されるアミノ酸配列からなる蛋白質からなる群から選択される少なくともいずれか一つの蛋白質に特異的に結合し、該蛋白質を検出するための抗体；
２）上記１）に記載の抗体に結合し得る二次抗体、
（１６）下記の１）乃至３）からなる群から選択される少なくとも一つ以上を含む、前立腺癌の検出用キット：
１）配列表の配列番号１に示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド、配列番号３に示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド、配列番号５に示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド、配列番号７に示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド及び配列番号９に示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドからなる群から選択される少なくともいずれか一つのポリヌクレオチドを特異的に増幅するための１５乃至３０塩基長の連続したオリゴヌクレオチドプライマー；
２）配列表の配列番号１に示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド、配列番号３に示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド、配列番号５に示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド、配列番号７に示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド及び配列番号９に示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドからなる群から選択される少なくともいずれか一つのポリヌクレオチドにストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、該ポリヌクレオチドを検出するための１５ヌクレオチド以上の連続したポリヌクレオチドプローブ；
３）配列表の配列番号１に示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド、配列番号３に示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド、配列番号５に示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド、配列番号７に示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド及び配列番号９に示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドからなる群から選択される少なくともいずれか一つのポリヌクレオチドが固定された固相化試料、
（１７）下記の１）及び２）の少なくとも一つを含む、前立腺癌の検出用キット：
１）配列表の配列番号２に示されるアミノ酸配列からなる蛋白質、配列番号４に示されるアミノ酸配列からなる蛋白質、配列番号６に示されるアミノ酸配列からなる蛋白質、配列番号８に示されるアミノ酸配列からなる蛋白質及び配列番号１０に示されるアミノ酸配列からなる蛋白質からなる群から選択される少なくともいずれか一つの蛋白質に特異的に結合し、該蛋白質を検出するための抗体；
２）上記１）に記載の抗体に結合し得る二次抗体、
（１８）下記の１）乃至５）からなる群から選択されるいずれか一つのヌクレオチド配列または該配列の部分配列に相補的なヌクレオチド配列を有するオリゴヌクレオオチドを含む前立腺癌の治療及び／または予防用医薬組成物：
１）配列表の配列番号１に示されるヌクレオチド配列；
２）配列表の配列番号３に示されるヌクレオチド配列；
３）配列表の配列番号５に示されるヌクレオチド配列；
４）配列表の配列番号７に示されるヌクレオチド配列；
５）配列表の配列番号９に示されるヌクレオチド配列、
（１９）配列表の配列番号２に示されるアミノ酸配列からなる蛋白質、配列番号４に示されるアミノ酸配列からなる蛋白質、配列番号６に示されるアミノ酸配列からなる蛋白質、配列番号８に示されるアミノ酸配列からなる蛋白質及び配列番号１０に示されるアミノ酸配列からなる蛋白質からなる群から選択される少なくともいずれか一つの蛋白質を特異的に認識する抗体を含有する前立腺癌の治療及び／または予防用医薬組成物、
からなる。
【００１５】
【発明の実施の形態】
本明細書中において、前立腺癌の治療及び／または予防効果を有する化合物とは、前立腺癌の増殖を抑制する活性、前立腺癌を縮小する活性、及び／または、前立腺癌の発生を予防する活性を有する化合物をいう。なお、本明細書中においては、「癌」と「腫瘍」は同じ意味に用いている。本明細書中において、「遺伝子」という語には、ＤＮＡのみならずそのｍＲＮＡ、ｃＤＮＡ及びそのｃＲＮＡも含まれるものとする。したがって、本発明におけるＴＲＰＭ４遺伝子、ＰＬＡ１Ａ遺伝子及びＢＵＣＳ１遺伝子には、ＴＲＰＭ４、ＰＬＡ１Ａ及びＢＵＣＳ１のＤＮＡ、ｍＲＮＡ、ｃＤＮＡ及びｃＲＮＡが含まれる。本明細書中において、「ポリヌクレオチド」という語は核酸と同じ意味で用いており、ＤＮＡ、ＲＮＡ、プローブ、オリゴヌクレオチド、及びプライマーも含まれている。本明細中においては、「ポリペプチド」と「蛋白質」は区別せずに用いている。また、本明細書中において、「ＲＮＡ画分」とは、ＲＮＡを含んでいる画分をいう。また、本明細書中において、「細胞」には、動物個体内の細胞、培養細胞も含んでいる。本明細書中において、「細胞の癌化」とは、細胞が接触阻止現象への感受性を喪失することや、足場非依存性増殖を示すこと等、細胞が異常な増殖を示すことをいい、このような異常な増殖を示す細胞を「癌細胞」という。本明細書において、ＴＲＰＭ４、ＰＬＡ１Ａ及びＢＵＣＳ１のそれぞれと「実質的に同一の蛋白質」とは、ＴＲＰＭ４、ＰＬＡ１Ａ及びＢＵＣＳ１のそれぞれが有する細胞の癌化活性等と同一の機能を有する蛋白質をいう。なお本発明における癌遺伝子（Ｏｎｃｏｇｅｎｅ）という語には癌遺伝子の他に癌原遺伝子、前癌遺伝子（Ｐｒｏｔｏ−Ｏｎｃｏｇｅｎｅ）も含む。
【００１６】
１．前立腺癌で発現量が高い遺伝子の検出
ＴＲＰＭ４、ＰＬＡ１Ａ及びＢＵＣＳ１遺伝子は、前立腺由来・正常組織サンプルと前立腺由来・腫瘍サンプルにおける発現量の解析から前立腺由来腫瘍において有意に発現量が高いことが本発明者によって明らかとなった。また、正常な各種臓器、組織間の比較ではＴＲＰＭ４、ＰＬＡ１Ａ及びＢＵＣＳ１遺伝子は他の組織では前立腺に比べ発現量が有意に低下していることが本発明者らによって見出された。ＴＲＰＭ４には長鎖型（ＴＲＰＭ４ｂ）と単鎖型（ＴＲＰＭ４ａ）があり、単鎖型にはさらにスプライシング・バリアント（Ｓｐｌｉｃｉｎｇｖａｒｉａｎｔ）も知られているが、本明細書において「ＴＲＰＭ４」という用語は特に限定していない限り、これらを特に区別することなく用いている。ＴＲＰＭ４ｂのｃＤＮＡのヌクレオチド配列は、配列表の配列番号１に示されており、そのオープン・リーディング・フレーム（ＯＲＦ）は配列番号１のヌクレオチド番号７３乃至３７１４に示され、アミノ酸配列は配列表の配列番号２に示されている。ＴＲＰＭ４ａのｃＤＮＡのヌクレオチド配列は、配列表の配列番号３に示されており、そのＯＲＦは配列番号３のヌクレオチド番号２２３乃至３３４２に示され、アミノ酸配列は配列表の配列番号４に示されている。ＴＲＰＭ４ａのスプライシング・バリアントのｃＤＮＡのヌクレオチド配列は、配列表の配列番号５に示されており、そのＯＲＦは配列番号５のヌクレオチド番号３２４乃至３３７１に示され、アミノ酸配列は配列表の配列番号６に示されている。ＰＬＡ１ＡのｃＤＮＡのヌクレオチド配列は、配列表の配列番号７に示されており、そのオープン・リーディング・フレーム（ＯＲＦ）は配列番号７のヌクレオチド番号３２乃至１３９９に示され、アミノ酸配列は配列表の配列番号８に示されている。ＢＵＣＳ１のｃＤＮＡのヌクレオチド配列は、配列表の配列番号９に示されており、そのオープン・リーディング・フレーム（ＯＲＦ）は配列番号９のヌクレオチド番号６９乃至１７９９に示され、アミノ酸配列は配列表の配列番号１０に示されている。また、ＴＲＰＭ４ｂの遺伝子はＧｅｎＢａｎｋにＨｏｍｏｓａｐｉｅｎｓｔｒａｎｓｉｅｎｔｒｅｃｅｐｔｏｒｐｏｔｅｎｔｉａｌｃａｔｉｏｎｃｈａｎｎｅｌ，ｓｕｂｆａｍｉｌｙＭ，ｍｅｍｂｅｒ４（ＴＲＰＭ４），ｍＲＮＡ（アクセッション番号：ＮＭ＿０１７６３６）として登録されている。ＴＲＰＭ４ａの遺伝子はＧｅｎＢａｎｋにＨｏｍｏｓａｐｉｅｎｓＴＲＰ−ｒｅｌａｔｅｄｃａｔｉｏｎｉｎｆｌｕｘｃｈａｎｎｅｌ（ＴＲＰＭ４）ｍＲＮＡ，ｃｏｍｐｌｅｔｅｃｄｓ．（アクセッション番号：ＡＹ０４６３９６）として登録されている。ＴＲＰＭ４ａのスプライシング・バリアントの遺伝子はＧｅｎＢａｎｋにＨｏｍｏｓａｐｉｅｎｓｃＤＮＡＦＬＪ２００４１ｆｉｓ，ｃｌｏｎｅＣＯＬ００４２３．（アクセッション番号：ＡＫ００００４８）として登録されている。ＰＬＡ１Ａ遺伝子は、ＧｅｎＢａｎｋにＨｏｍｏｓａｐｉｅｎｓｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐａｓｅＡ１ｍｅｍｂｅｒＡ（ＰＬＡ１Ａ），ｍＲＮＡ（アクセッション番号：ＮＭ＿０１５９００）として登録されている。ＢＵＣＳ１は、ＧｅｎＢａｎｋにＨｏｍｏｓａｐｉｅｎｓｂｕｔｙｒｙｌＣｏｅｎｚｙｍｅＡｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ１（ＢＵＣＳ１），ｍＲＮＡ（アクセッション番号：ＮＭ＿０５２９５６）として登録されている。
【００１７】
本明細書中において、「ＴＲＰＭ４遺伝子」とは、配列表の配列番号１に示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド、配列番号３に示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド及び配列番号５に示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドの少なくともいずれか一つ、または、該ヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドと相補的なヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドをいう。本明細書中において、「ＰＬＡ１Ａ遺伝子」とは、配列表の配列番号７に示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド、または、該ヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドと相補的なヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドをいう。本明細書中において、「ＢＵＣＳ１遺伝子」とは、配列表の配列番号９に示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド、または、該ヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドと相補的なヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドをいう。また、本明細書中において、「ＴＲＰＭ４」とは、配列表の配列番号２に示されるアミノ酸配列からなる蛋白質、配列表の配列番号４に示されるアミノ酸配列からなる蛋白質及び配列表の配列番号６に示されるアミノ酸配列からなる蛋白質の少なくともいずれか一つ、該蛋白質のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、カルシウムイオン存在下で陽イオン透過チャンネルとしての機能を有する蛋白質をいう。「ＰＬＡ１Ａ」とは、配列表の配列番号８に示されるアミノ酸配列からなる蛋白質、または、該蛋白質のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、フォスフォリパーゼＡ１活性を有する蛋白質をいう。「ＢＵＣＳ１」とは、配列表の配列番号１０に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質、または、該蛋白質のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、アシル−ＣｏＡ・シンテターゼ活性を有する蛋白質をいう。
【００１８】
２．前立腺癌の検出方法
ＴＲＰＭ４、ＰＬＡ１Ａ及びＢＵＣＳ１は前立腺、特に前立腺癌で高い発現が認められるので、前立腺の癌化及び／または癌細胞の増殖に関与していると考えられる。なお、「検体」とは、被験者や臨床検体等から得られた、血液、体液、前立腺、精巣、陰茎、膀胱、腎臓、口腔、咽頭、口唇、舌、歯肉、鼻咽頭、食道、胃、小腸、大腸、結腸、肝臓、胆嚢、膵臓、鼻、肺、骨、軟部組織、皮膚、乳房、子宮、卵巣、脳、甲状腺、リンパ節、筋肉、脂肪組織等の組織、組織の一部または排泄物等の試料を意味するが、本発明においては前立腺か前立腺の一部がより好ましい。
【００１９】
（１）ＴＲＰＭ４遺伝子、ＰＬＡ１Ａ遺伝子及びＢＵＣＳ１遺伝子から選択される少なくとも一つの遺伝子の発現量を利用した前立腺癌の検出方法
ＴＲＰＭ４遺伝子、ＰＬＡ１Ａ遺伝子及びＢＵＣＳ１遺伝子から選択される少なくとも一つの遺伝子の発現量を利用した前立腺癌の検出方法は、具体的には、以下の工程１）乃至４）を含む方法である。
１）被験者より採取した検体より、全ＲＮＡ画分を抽出する工程；
２）正常人より採取した検体より、全ＲＮＡ画分を抽出する工程；
３）上記工程１）に記載の全ＲＮＡ画分と上記工程２）に記載の全ＲＮＡ画分におけるＴＲＰＭ４遺伝子、ＰＬＡ１Ａ遺伝子及びＢＵＣＳ１遺伝子から選択される少なくとも一つの遺伝子の発現量を測定する工程；
４）上記工程１）由来の全ＲＮＡ画分と上記工程２）由来の全ＲＮＡ画分との間における上記工程３）によって測定された遺伝子の発現量の差を解析し、上記工程１）に記載の被験者の前立腺癌を検出する工程。
以下、各工程を具体的に説明する。
【００２０】
▲１▼ 工程１）被験者より採取した検体より、全ＲＮＡ画分を抽出する工程；
検体から全ＲＮＡ画分を抽出するに際しては、適切な実験の倫理基準に適した方法で入手したヒト由来組織をＲＮＡ抽出用の溶媒（例えばフェノール等、リボヌクレアーゼを不活性化する作用を有する成分を含むもの）で直接溶解するか又は、該組織の細胞を破壊しないように、スクレーパーで慎重に掻きとるか、もしくはトリプシン等の蛋白質分解酵素を用いて穏やかに組織から細胞を抽出するなどの方法により、細胞を回収した後、速やかにＲＮＡ抽出工程に移行する。
【００２１】
ＲＮＡの抽出方法としては、チオシアン酸グアニジン・塩化セシウム超遠心法、チオシアン酸グアニジン・ホットフェノール法、グアニジン塩酸法、酸性チオシアン酸グアニジン・フェノール・クロロホルム法（Ｃｈｏｍｃｚｙｎｓｋｉ，Ｐ．ａｎｄＳａｃｃｈｉ，Ｎ．，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．（１９８７），１６２，１５６−１５９）などを採用しうるが、酸性チオシアン酸グアニジン・フェノール・クロロホルム法が好適である。また、市販のＲＮＡ抽出用試薬（例えば、ＩＳＯＧＥＮ（ニッポンジーン（株）製）、ＴＲＩＺＯＬ試薬（ギブコ・ビーアールエル社製））等を試薬に添付のプロトコールに従って用いることもできる。
【００２２】
得られた全ＲＮＡ画分は、必要に応じてさらにｍＲＮＡのみに精製して用いるのが好ましい。精製方法は特に限定されないが、例えばビオチン化したオリゴ（ｄＴ）プローブにｍＲＮＡを吸着させ、さらにストレプトアビジンを固定化した常磁性粒子に、ビオチン／ストレプトアビジン間の結合を利用してｍＲＮＡを捕捉し洗浄操作の後、ｍＲＮＡを溶出することにより、ｍＲＮＡを精製することができる。また、オリゴ（ｄＴ）セルロースカラムにｍＲＮＡを吸着させて、次にこれを溶出して精製する方法も採用し得る。ただし、本発明の方法のためには、これらｍＲＮＡの精製工程は必須ではなく、検出対象のポリヌクレオチドの発現の検出が可能である限りにおいて、全ＲＮＡ画分をその後の工程に用いることもできる。
【００２３】
▲２▼ 工程２）正常人より採取した検体より、全ＲＮＡ画分を抽出する工程：
本発明において、正常人とは、癌を有さない人を意味する。正常人であるか否かは、ＴＲＰＭ４遺伝子、ＰＬＡ１Ａ遺伝子及びＢＵＣＳ１遺伝子から選択される少なくともいずれか一つの遺伝子の発現量を測定し、あらかじめ正常人の値として決められている数値範囲に入るか否かで判定することもできるし、ＴＲＰＭ４遺伝子、ＰＬＡ１Ａ遺伝子及びＢＵＣＳ１遺伝子の発現量と、前立腺癌の形成度の相関をあらかじめ調べておくことによって、正常な範囲にあるとして判断することもできる。正常人よりの全ＲＮＡ画分の調製は、上記工程１）と同様に行うことができる。
【００２４】
▲３▼ 工程３）上記工程１）に記載の全ＲＮＡ画分と上記工程２）に記載の全ＲＮＡ画分におけるＴＲＰＭ４遺伝子、ＰＬＡ１Ａ遺伝子及びＢＵＣＳ１遺伝子から選択される少なくとも一つの遺伝子の発現量を測定する工程：
ＴＲＰＭ４遺伝子、ＰＬＡ１Ａ遺伝子及びＢＵＣＳ１遺伝子から選択される少なくともいずれか一つの遺伝子の発現量の測定方法として、固相化試料を用いた測定方法と、その他のいくつかの測定方法について説明する。
【００２５】
（ａ）固相化試料を用いた測定方法
（ｉ）固相化試料
固相化試料としては、例えば以下のものが挙げられる。
【００２６】
（イ）遺伝子チップ：
データベース上のＥＳＴ（ｅｘｐｒｅｓｓｅｄｓｅｑｕｅｎｃｅｔａｇ）配列又はｍＲＮＡ配列をもとに合成したアンチセンスオリゴヌクレオチドが固相化された遺伝子チップを用いることができる。このような遺伝子チップとしてはアフィメトリックス（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ）社製の遺伝子チップ（Ｌｉｐｓｈｕｔｚ，Ｒ．Ｊ．ｅｔａｌ．，ＮａｔｕｒｅＧｅｎｅｔ．（１９９９）２１，ｓｕｐｐｌｉｍｅｎｔ，２０−２４）を用いることができるが、これに限定されず、公知の方法に基づき作製してもよい。ヒト細胞由来のｍＲＮＡを解析する場合には、ヒト由来のものが好ましく、例えば、アフィメトリックス社製ヒトＵ９５セット又はＵ１３３セットを用いることができる。しかしながら、それらに限定されず、例えば近縁種の動物由来のものも使用可能である。
【００２７】
（ロ）ヒト、全ＲＮＡあるいは特定の組織から得た全ＲＮＡより作製されたｃＤＮＡ又はＲＴ−ＰＣＲ産物が固相化された、アレイ又はメンブレンフィルター：
上記ｃＤＮＡ又はＲＴ−ＰＣＲ産物は、ヒトのＥＳＴデータベース等の配列情報を基に作製されたプライマーで逆転写酵素反応やＰＣＲを実施することによりクローン化されたものである。このｃＤＮＡやＲＴ−ＰＣＲ産物は、あらかじめ腫瘍を有するヒトと腫瘍を有さないヒトの間で発現量の異なる全ＲＮＡを、サブトラクション法（Ｄｉａｔｃｈｅｎｋｉ，Ｌ，ｅｔａｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，（１９９６）９３，６０２５−６０３０）、ディファレンシャルディスプレイ法（Ｌｉａｎｇ，Ｐ．，ｅｔａｌＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．，（１９９２）２３，３６８５−３６９０）などを利用して選択されたものであってもよい。また、アレイやフィルターは市販のもの（例えば、インテリジーン：タカラバイオ社製等）を使用してもよいし、上記ｃＤＮＡやＲＴ−ＰＣＲ産物を市販のスポッターで（例えば、ＧＭＳ４１７アレイヤー：タカラバイオ社製等）を用いて固相化することにより作製してもよい。
【００２８】
（ｉｉ）プローブの作製と解析
標識プローブは、特定のｍＲＮＡクローンではなく、発現している全てのｍＲＮＡを標識したものを用いる。プローブ作製のための出発材料としては精製していないｍＲＮＡを用いてもよいが、前述の方法で精製したポリ（Ａ）＋ＲＮＡを用いることが望ましい。以下に、各種固相化試料を用いた場合の、標識プローブの調製方法と検出、解析方法について説明する。
【００２９】
（イ）アフィメトリックス社製遺伝子チップ：
アフィメトリクス社製遺伝子チップに添付されたプロトコール（アフィメトリックス社発現解析技術マニュアル）に従ってビオチン標識したｃＲＮＡプローブを作製する。次いでアフィメトリックス社製遺伝子チップに添付のプロトコール（発現解析技術マニュアル）に従って、アフィメトリックス社製の解析装置（ＧｅｎｅＣｈｉｐＦｌｕｉｄｉｃｓＳｔａｔｉｏｎ４００）を用いてハイブリダイゼーション及び解析を行い、アビジンによる発光を検出、解析を行なう。
【００３０】
（ロ）アレイ：
逆転写酵素反応でポリ（Ａ）^＋ＲＮＡからｃＤＮＡを作製する際に、ｃＤＮＡの検出ができるようにｃＤＮＡを標識しておくことが必要であり、蛍光色素で標識する場合には、蛍光色素（例えばＣｙ３、Ｃｙ５など）で標識されたｄ−ＵＴＰなどを加えておくことによりｃＤＮＡを蛍光標識する。このとき、前立腺癌細胞由来のポリ（Ａ）^＋ＲＮＡと対照細胞由来のポリ（Ａ）^＋ＲＮＡをそれぞれ異なる色素で標識しておけば、後のハイブリダイゼーション時には両者を混合して用いることができる。アレイとして例えば、タカラバイオ（株）社の市販アレイを用いる場合、同社のプロトコールに従いハイブリダイゼーション及び洗浄を行って、蛍光シグナル検出機（例えばＧＭＳ４１８アレイスキャナー（タカラバイオ（株）社製）等）で蛍光シグナルを検出後、解析を行う。ただし、使用するアレイとしては市販のものに限定されず、自家製のもの、特別に作製したものでもよい。
【００３１】
（ハ）メンブレンフィルター：
逆転写酵素でポリ（Ａ）^＋ＲＮＡからｃＤＮＡを作製する際に、放射性同位元素（例えば、ｄ−ＣＴＰ等を加えることにより標識プローブを調製し、常法によりハイブリダイゼーションを行ない、例えば、市販のフィルター製マイクロアレーである、アトラスシステム（クロンテック社製）を用いてハイブリダイゼーション及び洗浄を行なった後、解析装置（例えば、アトラスイメージ：クロンテック社製等）を用いて検出、解析を行なう。
【００３２】
前記（イ）乃至（ハ）のいずれに記載の方法も、同一ロットの固相化試料にヒト各組織由来のプローブをハイブリダイズさせる。このとき、使用するプローブ以外のハイブリダイゼーション以外の条件は同じとする。蛍光標識プローブを用いる場合には、それぞれのプローブを異なる蛍光色素で標識しておけば一つの固相化試料に両プローブの混合物を一度にハイブリダイズさせて蛍光強度を読み取ることができる（Ｂｒｏｗｎ、Ｐ．Ｏ．ｅｔａｌ．ＮａｔｕｒｅＧｅｎｅｔ．，（１９９９）２１，ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ，ｐ．３３−３７）。
【００３３】
（ｂ）その他の測定方法
上記以外の測定方法としてサブトラクションクローニング法（実験医学別冊新遺伝子工学ハンドブック、羊土社刊（１９９６）ｐ．３２−３５参照）、ディファレンシャルディスプレー法（基礎生化学実験法４核酸・遺伝子実験ＩＩ．応用編、東京化学同人（２００１），ｐ１２５−１２８）、レポーター遺伝子を用いた方法（クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（例えば、ｐＣＡＴ３−Ｂａｓｉｃベクター：プロメガ社製を使用。）やβ−ガラクトシダーゼ（例えば、ｐβｇａｌ−Ｂａｓｉｃ：プロメガ社製を使用。）、分泌型アルカリホスファターゼ（例えば、ｐＳＥＡＰ２−Ｂａｓｉｃ：クロンテック社製を使用。）、緑色蛍光蛋白質（ｇｒｅｅｎ−ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔｐｒｏｔｅｉｎ）（例えば、ｐＥＧＦＰ−１：クロンテック社製を使用。））があるがこれらに限定されない。
【００３４】
▲４▼ 工程４）上記工程１）由来の全ＲＮＡ画分と上記工程２）由来の全ＲＮＡ画分との間における上記工程３）によって測定された遺伝子の発現量の差を解析し、上記工程１）に記載の被験者の前立腺癌を検出する工程。
【００３５】
正常人由来の検体と被験者由来の検体との間でＴＲＰＭ４、ＰＬＡ１Ａ及びＢＵＣＳ１から選択される少なくともいずれか一つの遺伝子の発現量の差を解析し、ＴＲＰＭ４遺伝子、ＰＬＡ１Ａ遺伝子及びＢＵＣＳ１遺伝子から選択される少なくともいずれか一つの遺伝子の発現量が有意に増加している検体では癌、特に前立腺癌が存在する可能性が高いと判定することができ、前立腺癌を検出することができる。発現量が有意に増加しているとは、例えば、アフィメトリックス社の遺伝子チップを用いて、アフィメトリックス社のＭｉｃｒｏａｒｒａｙＳｕｉｔｅＶｅｒ．３．０を用いて解析した場合、前立腺癌細胞由来の遺伝子の遺伝子発現量（Ａｖｅｒａｇｅｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ値）が正常な前立腺細胞に比べて有意に増加している場合をいう。なお、該検出は、ＴＲＰＭ４遺伝子、ＰＬＡ１Ａ遺伝子及びＢＵＣＳ１遺伝子から選択されるいずれか一つの遺伝子の発現量を個別に評価して行うことも可能であるし、ＴＲＰＭ４遺伝子、ＰＬＡ１Ａ遺伝子及びＢＵＣＳ１遺伝子の発現量を総合的に評価して行うこともできる。
【００３６】
また、ＴＲＰＭ４、ＰＬＡ１Ａ及びＢＵＣＳ１遺伝子の濃度を測定し、あらかじめ正常人の値として決められている数値範囲に入るか否かを解析し正常人の値として決められている範囲を超えている場合には前立腺癌を有すると判定することで前立腺癌を検出することもできるし、ＴＲＰＭ４、ＰＬＡ１Ａ及びＢＵＣＳ１遺伝子の発現量と、正常人の前立腺癌の形成度の相関をあらかじめ調べておくことによって、被験者から採取した検体におけるＴＲＰＭ４、ＰＬＡ１Ａ及びＢＵＣＳ１遺伝子の発現量を測定することによって被験者が、前立腺癌を有するか否を判定することもできる。
【００３７】
（２）ＴＲＰＭ４、ＰＬＡ１Ａ及びＢＵＣＳ１から選択される少なくともいずれか一つの蛋白質の発現量を利用した前立腺癌の検出方法
ＴＲＰＭ４、ＰＬＡ１Ａ及びＢＵＣＳ１から選択される少なくともいずれか一つの蛋白質の発現量を利用した前立腺癌の検出方法は、具体的には、以下の工程１）乃至３）を含む方法である。
１）被験者より採取した検体における、ＴＲＰＭ４、ＰＬＡ１Ａ及びＢＵＣＳ１の少なくともいずれか一つの蛋白質の発現量を測定する工程：
２）正常人より採取した検体における、上記１）に記載の蛋白質の発現量を測定する工程：
３）上記工程１）で測定された蛋白質の発現量と上記工程２）で測定された該蛋白質の発現量の差を解析し、被験者の前立腺癌を検出する工程。
以下、各工程を具体的に説明する。
【００３８】
▲１▼ 工程１）被験者より採取した検体における、ＴＲＰＭ４、ＰＬＡ１Ａ及びＢＵＣＳ１から選択される少なくともいずれか一つの蛋白質の発現量を測定する工程：
（ａ）検体より蛋白質測定用試料の調製
検体は、必要に応じて高速遠心を行うことにより、不溶性の物質を除去した後、以下のようにＥＬＩＳＡ／ＲＩＡ用試料やウエスタンブロット用試料として調製する。
【００３９】
ＥＬＩＳＡ／ＲＩＡ用試料としては、例えば回収した、前立腺をそのまま使用するか、緩衝液で適宜希釈したものを用いる。ウエスタンブロット用（電気泳動用）試料は、例えば、前立腺または前立腺の一部の抽出液をそのまま使用するか、緩衝液で適宜希釈して、ＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動用の２−メルカトルエタノールを含むサンプル緩衝液（シグマ（Ｓｉｇｍａ）社製等）と混合する。ドット／スロットブロットの場合は、例えば回収した前立腺または前立腺の一部の抽出液そのもの、または緩衝液で適宜希釈したものを、ブロッティング装置を使用するなどして、直接メンブレンへ吸着させる。
【００４０】
（ｂ）試料の固相化
上記のようにして得られた試料中の蛋白質を特異的に検出するためには、試料を免疫沈降法、リガンドの結合を利用した方法等によって、沈殿させ、固相化せずに検出することもできるし、そのまま検出する該試料を固相化することもできる。蛋白質を固相化する場合において、ウエスタンブロット法、ドットブロット法またはスロットブロット法に用いられるメンブレンとしては、ニトロセルロースメンブレン（例えば、バイオラッド社製等）、ナイロンメンブレン（例えば、ハイボンド−ＥＣＬ（アマシャム・ファルマシア社製）等）、コットンメンブレン（例えば、ブロットアブソーベントフィルター（バイオラッド社製）等）またはポリビニリデン・ジフルオリド（ＰＶＤＦ）メンブレン（例えば、バイオラッド社製等）等が挙げられる。
【００４１】
ＥＬＩＳＡ法／ＲＩＡ法で蛋白質の検出・定量を行うためには、専用の９６穴プレート（例えば、イムノプレート・マキシソープ（ヌンク社製）等）に試料またはその希釈液（例えば０．０５％アジ化ナトリウムを含むリン酸緩衝生理食塩水（以下「ＰＢＳ」という）で希釈したもの）を入れて４℃乃至室温で一晩、または３７℃で１乃至３時間静置することにより、ウエル内底面に蛋白質を吸着させて固相化する。
【００４２】
ＴＲＰＭ４、ＰＬＡ１Ａ及びＢＵＣＳ１に対する抗体は、常法を用いて（例えば、新生化学実験講座１、蛋白質１、ｐ．３８９−３９７、１９９２参照。）、ＴＲＰＭ４、ＰＬＡ１Ａ及びＢＵＣＳ１またはＴＲＰＭ４、ＰＬＡ１Ａ及びＢＵＣＳ１のアミノ酸配列から選択される任意のポリペプチドを動物に免疫し、生体内に産生される抗体を採取、精製することによって得ることができる。また、公知の方法（例えば、ＫｏｈｌｅｒａｎｄＭｉｌｓｔｅｉｎ，Ｎａｔｕｒｅ２５６，４９５−４９７，１９７５、Ｋｅｎｎｅｔ，Ｒ．ｅｄ．，ＭｏｎｏｃｌｏｎａｌＡｎｔｉｂｏｄｙｐ．３６５−３６７，１９８０，ＰｒｅｎｕｍＰｒｅｓｓ，Ｎ．Ｙ．）に従って、ＴＲＰＭ４、ＰＬＡ１Ａ及びＢＵＣＳ１から選択されるいずれかの蛋白質に対する抗体を産生する抗体産生細胞とミエローマ細胞とを融合させることによりハイブリドーマを樹立し、モノクローナル抗体を得ることもできる。
【００４３】
なお、抗原となるＴＲＰＭ４、ＰＬＡ１Ａ及びＢＵＣＳ１はＴＲＰＭ４遺伝子、ＰＬＡ１Ａ遺伝子及びＢＵＣＳ１遺伝子を遺伝子操作により宿主細胞に産生させることによって得ることができる。具体的には、ＴＲＰＭ４遺伝子、ＰＬＡ１Ａ遺伝子及びＢＵＣＳ１遺伝子を発現可能なベクターを作製し、これを宿主細胞に導入して該遺伝子を発現させ、発現したＴＲＰＭ４、ＰＬＡ１Ａ及びＢＵＣＳ１を精製すればよい。
【００４４】
（ｃ）ＴＲＰＭ４、ＰＬＡ１Ａ及びＢＵＣＳ１から選択される少なくともいずれか一つの蛋白質の発現量の測定
発現量の測定は、抗ＴＲＰＭ４抗体、抗ＰＬＡ１Ａ抗体及び抗ＢＵＣＳ１から選択されるいずれかの抗体を用いてウエスタンブロット法やドット／スロットブロット法等公知の方法を用いて測定することができる。
【００４５】
▲２▼ 工程２）正常人より採取した検体における、上記１）に記載の蛋白質の発現量を測定する工程：
正常人より採取した検体におけるＴＲＰＭ４、ＰＬＡ１Ａ及びＢＵＣＳ１から選択されるいずれかの蛋白質の発現量の測定は上記工程▲１▼と同様の方法で行うことができる。
【００４６】
▲３▼ 工程３）上記工程１）で測定された蛋白質の発現量と上記工程２）で測定された該蛋白質の発現量の差を解析し、被験者の前立腺癌を検出する工程。
【００４７】
正常人由来の検体と被験者由来の検体との間でＴＲＰＭ４、ＰＬＡ１Ａ及びＢＵＣＳ１から選択される少なくともいずれか一つの蛋白質の発現量の差を解析し、ＴＲＰＭ４、ＰＬＡ１Ａ及びＢＵＣＳ１の発現量が有意に増加している検体では癌、特に前立腺癌が存在する可能性が高いと判定することができ、前立腺癌を検出することができる。なお、該判定は、ＴＲＰＭ４、ＰＬＡ１Ａ及びＢＵＣＳ１から選択されるいずれか一つの蛋白質の発現量に基づいて個別に行うこともできるし、ＴＲＰＭ４、ＰＬＡ１Ａ及びＢＵＣＳ１の発現量を総合的に評価して行うこともできる。
【００４８】
また、ＴＲＰＭ４、ＰＬＡ１Ａ及びＢＵＣＳ１の濃度を測定し、あらかじめ正常人の値として決められている数値範囲に入るか否かを解析し正常人の値として決められている範囲を超えている場合には前立腺癌を有すると判定することで前立腺癌を検出することもできるし、ＴＲＰＭ４、ＰＬＡ１Ａ及びＢＵＣＳ１の発現量と、正常人の前立腺癌の形成度の相関をあらかじめ調べておくことによって、被験者から採取した検体におけるＴＲＰＭ４、ＰＬＡ１Ａ及びＢＵＣＳ１の発現量を測定することによって被験者が、前立腺癌を有するか否かを判定することもできる。
【００４９】
３．ＴＲＰＭ４遺伝子、ＰＬＡ１Ａ遺伝子及びＢＵＣＳ１遺伝子、ＴＲＰＭ４、ＰＬＡ１Ａ及びＢＵＣＳ１の検定
ＴＲＰＭ４遺伝子、ＰＬＡ１Ａ遺伝子及びＢＵＣＳ１遺伝子、ＴＲＰＭ４、ＰＬＡ１Ａ及びＢＵＣＳ１の発現量は、ヒトの正常組織の間では前立腺に比べ他の組織では有意に低下しており、更に、正常な前立腺に比べ、前立腺癌で発現量が有意に増加していることが本発明者らによって見出された。ＴＲＰＭ４、ＰＬＡ１Ａ及びＢＵＣＳ１の機能は以下の方法によって調べることができる。
【００５０】
（１）ＴＲＰＭ４、ＰＬＡ１Ａ及びＢＵＣＳ１の機能を調べる第１の方法としては、まず、ＴＲＰＭ４、ＰＬＡ１Ａ及びＢＵＣＳ１を発現している細胞由来のヒトｃＤＮＡライブラリーから、コロニーハイブリダイゼーション法等、公知の方法に従い、完全長ｃＤＮＡを取得する。この完全長ｃＤＮＡをマウス又はヒト細胞に導入して高発現させ、細胞に影響が生じるか否かを検討する。
【００５１】
ｃＤＮＡを動物個体内で発現させるためには、得られた完全長ｃＤＮＡをウイルスベクターに組み込み、動物に投与する方法が挙げられる。ウイルスベクターによる遺伝子導入方法としては例えば、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ関連ウイルス、ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルス、ポックスウイルス、ポリオウイルス等のＤＮＡウイルス、又はＲＮＡウイルスにｃＤＮＡを組み込んで導入する方法が挙げられる。なかでも、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ関連ウイルス、ワクシニアウイルスを用いた方法が好ましい。
【００５２】
非ウイルス性の遺伝子導入方法としては、発現プラスミドを直接筋肉内に投与する方法（ＤＮＡワクチン法）、リポソーム法、リポフェクション法、マイクロインジェクション法、リン酸カルシウム法、エレクトロポレーション法等が挙げられ、なかでも、ＤＮＡワクチン法、リポソーム法が好ましい。
【００５３】
また、培養細胞に対して、完全長ｃＤＮＡをヒト、マウス、ラット等由来の筋肉細胞、肝細胞、脂肪細胞、あるいは筋肉細胞、肝細胞、脂肪細胞、皮膚細胞、前立腺細胞等へ導入し、高発現させ、各標的細胞の有する機能、具体的には、糖や脂質の産生や取り込み、あるいはグリコーゲンの蓄積等の糖脂質代謝を調節する機能、あるいは細胞の形態にどの様な影響が現れるかを検討することができる。
【００５４】
完全長ｃＤＮＡを動物又は細胞に導入するにあたっては、適当なプロモーター及び形質発現に関わる配列を含むベクターに該ｃＤＮＡを組み込み、該ベクターで宿主細胞を形質転換させる。脊椎動物細胞の発現プロモーターとしては、通常発現しようとする遺伝子の上流に位置するプロモーター、ＲＮＡのスプライス部位、ポリアデニル化部位、及び転写終結配列等を有するものを使用でき、さらにこれは必要により複製起点を有してもよい。該発現ベクターの例としては、ＳＶ４０の初期プロモーターを有するｐＳＶ２ｄｈｆｒ（Ｓｕｂｒａｍａｎｉ，Ｓ．ｅｔａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，（１９８１）１，ｐ．８５４−８６４）、レトロウイルスベクターｐＬＮＣＸ、ｐＬＮＳＸ、ｐＬＸＩＮ、ｐＳＩＲ（クロンテック（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）社製）、コスミドベクターｐＡｘＣｗ（タカラバイオ社製）等が挙げられるが、これに限定されない。該発現ベクターは、ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）−デキストラン法（Ｌｕｔｈｍａｎ，Ｈ．ａｎｄＭａｇｎｕｓｓｏｎ，Ｇ．，ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．（１９８３）１１，ｐ．１２９５−１３０８）、リン酸カルシウム−ＤＮＡ共沈殿法（Ｇｒａｈａｍ，Ｆ．Ｌ．ａｎｄｖａｎｄｅｒＥｂ，Ａ．Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，（１９７３）５２，ｐ．４５６−４５７）、及び電気パルス穿孔法（Ｎｅｕｍａｎｎ，Ｅ．ｅｔａｌ．，ＥＭＢＯＪ．（１９８２）１，ｐ．８４１−８４５）などによりサルの細胞であるＣＯＳ細胞（Ｇｌｕｚｍａｎ，Ｙ．Ｃｅｌｌ（１９８１）２３，ｐ．１７５−１８２，ＡＴＣＣ：ＣＲＬ−１６５０）やチャイニーズ・ハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ細胞、ＡＴＣＣ：ＣＣＬ−６１）のジヒドロ葉酸還元酵素欠損株（Ｕｒｌａｕｂ，Ｇ．ａｎｄＣｈａｓｉｎ，Ｌ．Ａ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９８０）７７，ｐ．４１２６−４２２０）、ヒト胎児腎臓由来２９３細胞（ＡＴＣＣ：ＣＲＬ−１５７３）等に取り込ませることができるが、これらに限定されない。かくして所望の形質転換体を得ることができる。
【００５５】
また、遺伝子操作により、正常動物において、目的とする遺伝子が高発現するようにトランスジェニック動物を作製し、細胞の形態にどの様な影響が現れるかを検討することも可能である。逆に、前立腺癌を有する動物において、対象とする遺伝子を破壊したノックアウト動物を作製し細胞の状態を判定することができる。
【００５６】
（２）ＴＲＰＭ４、ＰＬＡ１Ａ及びＢＵＣＳ１の機能を調べる第２の方法としては、癌細胞株においてＴＲＰＭ４、ＰＬＡ１Ａ及びＢＵＣＳ１の少なくともいずれか一つの発現を抑制し、細胞の機能や増殖の形態にどの様な影響が出るかを調べることもできる。
【００５７】
試験する遺伝子の全ＲＮＡに対するアンチセンス核酸を、細胞に導入し、各標的細胞の機能や形態にどの様な影響が出るかを調べることもできる。
【００５８】
遺伝子の発現を抑制する他の方法としては二本鎖の単鎖ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）を用いる方法を挙げることもできる（「ジーンズ・アンド・デヴェロップメンツ（ＧｅｎｅｓａｎｄＤｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｓ）」）、２００１年１月１５日、第１５巻、第２号、ｐ．１８８−２００）。例えば、ヒト前立腺細胞株ＬＮＣａＰ（ＡｍｅｒｉｃａｎＴｉｓｓｕｅＣｕｌｔｕｒｅＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎＡＴＣＣＮｏ．：ＣＲＬ−１７４０）あるいはヒト前立腺癌細胞株ＰＣ−３（ＡｍｅｒｉｃａｎＴｉｓｓｕｅＣｕｌｔｕｒｅＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎＡＴＣＣＮｏ．：ＣＲＬ−１４３５）に対してＴＲＰＭ４遺伝子、ＰＬＡ１Ａ遺伝子及びＢＵＣＳ１遺伝子のいずれかの遺伝子に対するｓｉＲＮＡを文献記載の方法に従って導入し、ｓｉＲＮＡの対象となる遺伝子の発現量及び細胞の増殖率を調べると、ＴＲＰＭ４遺伝子、ＰＬＡ１Ａ遺伝子及びＢＵＣＳ１遺伝子のいずれの発現量を抑制した場合にも細胞の増殖の抑制が観察される。すなわち、ＴＲＰＭ４、ＰＬＡ１Ａ及びＢＵＣＳ１の発現量の増大が前立腺癌の増殖に関係していることが明らかとなる。
【００５９】
４．ＴＲＰＭ４遺伝子、ＰＬＡ１Ａ遺伝子及びＢＵＣＳ１遺伝子、ＴＲＰＭ４、ＰＬＡ１Ａ及びＢＵＣＳ１、及び／または、ＴＲＰＭ４、ＰＬＡ１Ａ及びＢＵＣＳ１検出用キット
ＴＲＰＭ４遺伝子、ＰＬＡ１Ａ遺伝子及びＢＵＣＳ１遺伝子、ＴＲＰＭ４、ＰＬＡ１Ａ及びＢＵＣＳ１、及び／または、ＴＲＰＭ４、ＰＬＡ１Ａ及びＢＵＣＳ１は、以下の１）乃至５）からなる群から選択される少なくとも一つ以上を含むキットを用いて検出することができる。
１）配列表の配列番号１に示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド、配列番号３に示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド、配列番号５に示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド、配列番号７に示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド及び配列番号９に示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドからなる群から選択される少なくともいずれか一つのポリヌクレオチドを特異的に増幅するための１５乃至３０塩基長の連続したオリゴヌクレオチドプライマー；
２）配列表の配列番号１に示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド、配列番号３に示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド、配列番号５に示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド、配列番号７に示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド及び配列番号９に示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドからなる群から選択される少なくともいずれか一つのポリヌクレオチドにストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、該ポリヌクレオチドを検出するための１５ヌクレオチド以上の連続したポリヌクレオチドプローブ；
３）配列表の配列番号１に示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド、配列番号３に示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド、配列番号５に示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド、配列番号７に示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド及び配列番号９に示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドからなる群から選択される少なくともいずれか一つのポリヌクレオチドが固定された固相化試料。
４）配列表の配列番号２に示されるアミノ酸配列からなる蛋白質、配列番号４に示されるアミノ酸配列からなる蛋白質、配列番号６に示されるアミノ酸配列からなる蛋白質、配列番号８に示されるアミノ酸配列からなる蛋白質及び配列番号１０に示されるアミノ酸配列からなる蛋白質からなる群から選択される少なくともいずれか一つの蛋白質に特異的に結合し、該蛋白質を検出するための抗体；
５）上記４）に記載の抗体に結合し得る二次抗体。
【００６０】
前記１）記載のプライマーは、ＴＲＰＭ４遺伝子、ＰＬＡ１Ａ遺伝子及びＢＵＣＳ１遺伝子のヌクレオチド配列に基づき市販のプライマー設計ソフト（たとえば、ＷｉｓｃｏｎｓｉｎＧＣＧｐａｃｋａｇｅＶｅｒｓｉｏｎ１０．２）を用いる等、常法により容易に設計し、増幅することができる。また、前記２）に記載のプローブは、ＴＲＰＭ４、ＰＬＡ１Ａ及びＢＵＣＳ１に特異的にハイブリダイズするポリヌクレオチドであって、１００乃至１５００塩基長、好ましくは３００乃至６００塩基長である。これらのプライマーやプローブは、適当な標識によりラベル（例えば、酵素標識、放射性標識、蛍光標識等）されていてもよく、また、リンカーを付加していてもよい。
【００６１】
上記３）に記載の固相化試料は、上記２）に記載のプローブをガラス板、ナイロンメンブレン等の固相に固定することにより作製される。このような固相化試料の作成方法については、既に「２．前立腺癌の検出方法」の項中、「（１）ＴＲＰＭ４遺伝子、ＰＬＡ１Ａ遺伝子及びＢＵＣＳ１遺伝子から選択される少なくとも一つの遺伝子の発現量を利用した前立腺癌の検出方法」の項で説明した通りであり、例えば、遺伝子チップ、ｃＤＮＡアレイ、オリゴアレイ、メンブレンフィルター等を挙げることができる。
【００６２】
本発明のキットには、更に耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ、ｄＮＴＰ（ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰの混合物）及び緩衝液を含めることもできる。耐熱性ＤＮＡポリメラーゼとしてはＴａｑＤＮＡポリメラーゼ、ＬＡＴａｑＤＮＡｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（宝酒造社製）、ＴｔｈＤＮＡポリメラーゼ、ＰｆｕＤＮＡポリメラーゼなどが例示できる。緩衝液は使用するＤＮＡポリメラーゼに応じて選ばれ、必要に応じてＭｇ^２＋などが添加されている。
【００６３】
前記、４）及び５）に記載の抗体は上記「２．前立腺癌の検出方法」の項中「（２）ＴＲＰＭ４、ＰＬＡ１Ａ及びＢＵＣＳ１から選択される少なくともいずれか一つの蛋白質の発現量を利用した前立腺癌の検出方法」や下記の「６．抗ＴＲＰＭ４、ＰＬＡ１Ａ及びＢＵＣＳ１抗体の製造」の項に記載した方法により作製することができる。該抗体は、適当な標識によりラベル（例えば、酵素標識、放射性標識、蛍光標識等）されていてもよい。
【００６４】
本発明のキットはＴＲＰＭ４遺伝子、ＰＬＡ１Ａ遺伝子及びＢＵＣＳ１遺伝子、ＴＲＰＭ４、ＰＬＡ１Ａ及びＢＵＣＳ１、及び／または、ＴＲＰＭ４、ＰＬＡ１Ａ及びＢＵＣＳ１の検出に用いることができ、前立腺癌の有無の判定や、前立腺癌の増殖を抑制する物質のスクリーニングにも用いることができる。
【００６５】
５．前立腺癌の治療効果及び／または予防効果を有する物質のスクリーニング方法
本発明の一つの態様として、ＴＲＰＭ４遺伝子、ＰＬＡ１Ａ遺伝子及びＢＵＣＳ１遺伝子、ＴＲＰＭ４、ＰＬＡ１Ａ及びＢＵＣＳ１、及び／または、ＴＲＰＭ４、ＰＬＡ１Ａ及びＢＵＣＳ１の少なくとも一つの発現量を測定することによって前立腺癌に対して治療及び／または予防効果を有する物質のスクリーニングをすることができる。
【００６６】
本発明の一つの態様として、ＴＲＰＭ４、ＰＬＡ１Ａ及びＢＵＣＳ１から選択されるいずれか一つの蛋白質の活性を阻害する物質を同定することによって、前立腺癌に対する治療効果及び／または予防効果を有する物質をスクリーニングすることができる。
【００６７】
なお、「被験物質」とは、本発明のスクリーニング方法で癌の増殖抑制活性を調べる対象となる物質をいう。被験物質としては、化合物、微生物の代謝産物、植物や動物組織の抽出物、それらの誘導体またはそれらの混合物等が挙げられる。また、ＴＲＰＭ４、ＰＬＡ１Ａ及びＢＵＣＳ１の少なくとも一つのの発現量を低下するように設計された核酸またはその誘導体（アンチセンスオリゴヌクレオチド、リボザイム、ｄｓＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ等を含む）を、被験物質として使用することも可能である。被験物質の投与量や濃度は適宜設定するか、または例えば希釈系列を作成するなどして複数種の投与量を設定してもよく、固体、液体等適当な状態で投与することができ、適当なバッファーに溶解したり、安定化剤等を加えてもよい。培養細胞を用いるスクリーニング方法の場合には、培地に添加して培養することができる。培地に添加する場合には培養開始時から添加してもよいし、培養途中で添加しても良く、また、添加の回数も１回に限らない。被験物質存在下で培養する期間も適宜設定してよいが、好ましくは３０分乃至２週間であり、より好ましくは、３０分乃至４８時間である。哺乳動物個体に被験物質を投与する場合は、被験物質の物性等により経口投与、静脈注射、腹腔内注射、経皮投与、皮下注射等の投与形態を使い分ける。また、前立腺癌に直接塗布または注射することもできる。なお被験物質の投与から、検体を得るまでの時間は適当に選択することができる。
【００６８】
本発明のスクリーニング方法において用いられる培養細胞は、ＴＲＰＭ４、ＰＬＡ１Ａ及びＢＵＣＳ１の少なくともいずれか一つを発現する哺乳動物細胞である限りにおいて、正常な細胞でも、癌細胞等の異常な増殖を示す細胞でもよく、例えば、マウス繊維芽細胞由来細胞株ＮＩＨ３Ｔ３細胞、ヒト前立腺癌細胞株ＬＮＣａＰ、ヒト前立腺癌細胞株ＰＣ−３、マウス、ラット及びヒト遊離脂肪細胞、マウス、ラット及びヒト初代肝細胞等を挙げることができるがこれらに限定されない。培養細胞の哺乳動物種としては、ヒト、マウスまたはハムスターが好ましく、ヒトまたはマウスがより好ましいが、これらに限定されない。なお、培養細胞としてはＴＲＰＭ４、ＰＬＡ１Ａ及びＢＵＣＳ１の少なくともいずれか一つを過剰発現している哺乳動物細胞を用いるのがより好ましく、例えばＴＲＰＭ４、ＰＬＡ１Ａ及びＢＵＣＳ１遺伝子をそのプロモーター領域とともに導入し、ＴＲＰＭ４、ＰＬＡ１Ａ及びＢＵＣＳ１を過剰発現するＮＩＨ３Ｔ３細胞などを挙げることができる。
【００６９】
腫瘍細胞では以下に示す、▲１▼フォーカス形成、▲２▼コロニー形成、▲３▼スフェロイド増殖等の正常な細胞とは異なる異常な増殖を示す場合が多い。従って、かかる増殖を低減する物質は癌の治療効果及び／または予防効果を有する物質である可能性が高い。これらの性質は具体的には以下の通りである。
【００７０】
▲１▼ フォーカス形成試験
ＮＩＨ３Ｔ３をはじめとする正常繊維芽細胞は、通常、増殖して密集状態になっても細胞が重なり合うことはなく、単層を形成したところで増殖は止まる。一方、形質転換した細胞、癌細胞では、接触阻止現象への感受性が喪失しており、重なり合いながら増殖を続けることが可能であり、何層にも重なった細胞集団を形成し、単層の細胞の広がりの中に高密度の細胞塊であるフォーカス（Ｆｏｃｕｓ）を作るという特性を持つ（横田淳、山本雅編、バイオマニュアルＵＰシリーズ癌研究プロトコール羊土社１６８−１７４（１９９５年１０月１５日刊行）。この現象は、例えば、培養細胞に癌ウイルスを感染させた場合に観察されることから、癌ウイルスの定量にも用いられる場合もあるのみならず（ＦｕｎｄａｍｅｎｔａｌＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓｉｎＶｉｒｏｌｏｇｙ，ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ（１９６９），ｐ１９８−２１１）、ウイルスや細胞由来の癌遺伝子を含むＤＮＡ断片を細胞にトランスフェクションすることによっても観察することができることから、癌遺伝子、癌抑制遺伝子のスクリーニングに用いられる。
【００７１】
ＴＲＰＭ４、ＰＬＡ１Ａ及びＢＵＣＳ１遺伝子を過剰発現させた細胞株と過剰発現させなかった細胞株を通常の方法で培養し、新鮮な培養液に置換した後にマルチウェルプレート（例えば９６穴プレート：コーニング−コスター社製３５９８）に分注し一定時間培養した後に各ウェルあたりのフォーカス数を測定する。各ウェルあたりのフォーカス数を集計した後統計処理を行ない、各ウェルあたりの平均フォーカス数及び標準偏差を算出する。ＴＲＰＭ４遺伝子、ＰＬＡ１Ａ遺伝子及びＢＵＣＳ１遺伝子の少なくともいずれか一つを過剰発現させたＮＩＨ３Ｔ３細胞ではＴＲＰＭ４、ＰＬＡ１Ａ及びＢＵＣＳ１遺伝子を過剰発現させなかった細胞に比べ、フォーカス数が顕著に増加していることが観察される。
【００７２】
▲２▼ コロニー形成試験
正常な細胞は、血液細胞を除き、接着する足場のない状態におくと増殖できないことが知られる。これに対して形質転換した細胞、癌細胞は、足場のない状態でも増殖しうる特性をもつ。この特性変化は、これは軟寒天培地中における増殖コロニーの形成で容易に調べることが可能である（横田淳、山本雅編、バイオマニュアルＵＰシリーズ癌研究プロトコール羊土社１６８−１７４（１９９５年１０月１５日刊行）。
【００７３】
ＴＲＰＭ４遺伝子、ＰＬＡ１Ａ遺伝子及びＢＵＣＳ１遺伝子の少なくともいずれか一つを過剰発現させた細胞株と過剰発現させなかった細胞株を通常の方法で培養し、新鮮な培養液に置換した後に軟寒天培地（例えば０．３３％Ｂａｃｔｏａｇａｒ（Ｄｉｆｃｏ社製）及び２０％ＦＣＳ含有ＲＰＭＩ１６４０）に懸濁し、寒天培地（例えば０．６６％Ｂａｃｔｏａｇａｒ及び２０％ＦＣＳ含有ＲＰＭＩ１６４０）の上に重層する。通常の条件（例えば３７℃、５％ＣＯ_２）で培養し、形成された軟寒天中の増殖コロニー数を測定する。マルチウェルプレート（例えば１２穴プレート：コーニング−コスター社製３５１２）を用いて培養した場合には、一定時間培養した後に各ウェルあたりのコロニー数を測定する。各ウェルあたりのコロニー数を集計した後統計処理を行ない、各ウェルあたりの平均コロニー数及び標準偏差を算出する。ＴＲＰＭ４遺伝子、ＰＬＡ１Ａ遺伝子及びＢＵＣＳ１遺伝子の少なくともいずれか一つを過剰発現させたＮＩＨ３Ｔ３細胞株ではＴＲＰＭ４、ＰＬＡ１Ａ及びＢＵＣＳ１遺伝子の少なくともいずれかひとつを過剰発現させなかった細胞に比べ、コロニー数が顕著に増加していることが観察される。
【００７４】
▲３▼ スフェロイド（Ｓｐｈｅｒｏｉｄ）増殖試験
形質転換した細胞、癌細胞の足場非依存的な増殖という特性は、スフェロイド（Ｓｐｈｅｒｏｉｄ）状態での培養によっても容易に評価することができる。スフェロイドは細胞が多数集合した凝集体のことであり、細胞接着を極めて低く抑えた培養プレートでの培養によって容易に形成しうる。スフェロイド状態での培養は、通常の単層培養とは異なり、「▲２▼コロニー形成試験」に示したのと同様に足場非依存的な状態での培養に類似し、生体内に近い条件下で機能を観察することができる（住友ベークライト社ＳＵＭＩＬＯＮ理化学機器総合カタログ）。ＴＲＰＭ４遺伝子、ＰＬＡ１Ａ遺伝子及びＢＵＣＳ１遺伝子の少なくともいずれか一つを過剰発現させた細胞株と該遺伝子を過剰発現させなかった細胞株を通常の方法で培養し、新鮮な培養液に置換し、細胞非付着性マルチウェルプレート（例えばスフェロイド９６Ｕ：住友ベークライト社製ＭＳ−００９６Ｓ）に分注する。通常の条件（例えば、３７℃、５％ＣＯ_２）で培養し、培養開始後一定時間経過後にプレート上に形成されるスフェロイドの大きさを測定する。スフェロイドの大きさは例えば顕微鏡下、接眼方眼ミクロメータ−（三啓社製：Ｓ−６）を用いて測定することができ、スフェロイドの大きさの指標としてスフェロイドの直径を用いることができる。ＴＲＰＭ４遺伝子、ＰＬＡ１Ａ遺伝子及びＢＵＣＳ１遺伝子の少なくともいずれか一つを過剰発現させたＮＩＨ３Ｔ３細胞株では該遺伝子を過剰発現させなかった細胞に比べ、スフェロイドの直径の顕著な増加が観察される。
【００７５】
本発明のスクリーニング方法には、培養細胞を用いず、哺乳動物個体に被験物質を投与して、その後該動物個体から摘出されたその臓器または組織細胞におけるＴＲＰＭ４遺伝子、ＰＬＡ１Ａ遺伝子及びＢＵＣＳ１遺伝子の少なくともいずれか一つの発現を検出する方法も含まれる。遺伝子発現の検出対象となる臓器または組織は、ＴＲＰＭ４、ＰＬＡ１Ａ及びＢＵＣＳ１を発現するものであればよいが、好ましくは癌が発生している組織であり、より好ましくは前立腺である。哺乳動物種としては非ヒト哺乳動物を用いることができ、マウス、ラットまたはハムスターが好ましく、マウスまたはラットがより好ましい。なお、ヒト、サル、マウスまたはラット由来の腫瘍を皮下、皮内あるいは腹腔等に移植した腫瘍モデル動物である、担癌動物（ヒト癌株を移植したヌードマウス、同種移植マウスなど）、あるいは、癌を自然発生する系統の動物（天然に同定された動物及び遺伝子改変動物を含む。例えば、ｐ５３ノックアウトマウス（Ｄｏｎｅｈｏｗｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ（１９９２）、３５６巻、ｐ．２１５−２２１）、Ｍｙｃトランスジェニックマウス（Ａｄａｍｓら、Ｎａｔｕｒｅ（１９８５）、３１８巻、ｐ．５３３−５３８）、ＴＲＡＭＰマウス（Ｆｏｓｔｅｒら、ＣａｎｃｅｒＲｅｓ．（１９９７）、５７巻、ｐ．３３２５−３３３０）などを用いることもできる。更に、ＴＲＰＭ４、ＰＬＡ１Ａ及びＢＵＣＳの少なくともいずれか一つを過剰発現させた動物を用いることもできる。また、癌誘発処置を行なった動物を用いることもできる。
【００７６】
本発明の方法において用いられる培養細胞は、被験物質を添加しない場合にＴＲＰＭ４、ＰＬＡ１Ａ及びＢＵＣＳ１の少なくともいずれか一つを発現可能な条件であれば、いかなる条件で培養してもよい。例えば、該培養細胞について公知の培養条件が知られており、該条件下において該細胞がＴＲＰＭ４、ＰＬＡ１Ａ及びＢＵＣＳ１の少なくともいずれか一つを発現する場合は、該条件で培養してもよい。また、哺乳動物個体から摘出した臓器または組織におけるＴＲＰＭ４、ＰＬＡ１Ａ及びＢＵＣＳ１の少なくともいずれか一つの発現を検出する場合における、該動物の飼育条件も、被験物質を添加しない場合にＴＲＰＭ４、ＰＬＡ１Ａ及びＢＵＣＳ１から選択される少なくともいずれか一つを発現可能な条件であればよい。
【００７７】
なお、被験物質の、ＴＲＰＭ４、ＰＬＡ１Ａ及びＢＵＣＳ１の少なくともいずれか一つの発現に対する影響を調べるためには、ＴＲＰＭ４遺伝子、ＰＬＡ１Ａ遺伝子及びＢＵＣＳ１遺伝子の少なくともいずれか一つの遺伝子の発現量を測定する方法と、ＴＲＰＭ４遺伝子、ＰＬＡ１Ａ遺伝子及びＢＵＣＳ１遺伝子の少なくともいずれか一つの翻訳産物である、ＴＲＰＭ４、ＰＬＡ１Ａ及びＢＵＣＳ１の少なくともいずれか一つの発現量を測定する方法がある。ＴＲＰＭ４遺伝子、ＰＬＡ１Ａ遺伝子及びＢＵＣＳ１遺伝子の少なくともいずれか一つの遺伝子、及び／または、ＴＲＰＭ４、ＰＬＡ１Ａ及びＢＵＣＳ１の少なくともいずれか一つの発現を抑える被験物質は癌、好適には前立腺癌に対する治療効果及び／または予防効果を有する物質であると考えられる。
【００７８】
培養細胞からの、全ＲＮＡの抽出、ＴＲＰＭ４遺伝子、ＰＬＡ１Ａ遺伝子及びＢＵＣＳ１遺伝子の少なくともいずれか一つの遺伝子の発現量の測定、ＴＲＰＭ４、ＰＬＡ１Ａ及びＢＵＣＳ１の少なくともいずれか一つの遺伝子の発現量の測定については、上記「２．前立腺癌の検出方法」の項に記載した方法に従って行うことができる。
【００７９】
（１）ＴＲＰＭ４遺伝子、ＰＬＡ１Ａ遺伝子及びＢＵＣＳ１遺伝子の少なくともいずれか一つを用いる方法
本発明のスクリーニング方法としては例えば、哺乳動物由来培養細胞を用いる方法、及び哺乳動物個体を用いる方法についてそれぞれ以下のようになる。
【００８０】
▲１▼ 哺乳動物由来培養細胞を用いる方法
（ｉ）以下の工程イ）乃至ハ）を含む：
イ）被験物質を添加した培地で培養した哺乳動物由来培養細胞より、全ＲＮＡを抽出する工程；
ロ）イ）由来の全ＲＮＡと被験物質を添加しないで培養した哺乳動物培養細胞由来全ＲＮＡの間における、ＴＲＰＭ４遺伝子、ＰＬＡ１Ａ遺伝子及びＢＵＣＳ１遺伝子の少なくともいずれか一つの発現量の差を検出する工程；
ハ）ロ）に記載の遺伝子の発現量の差を解析し、被験物質の、前立腺癌に対する治療、及び／または予防効果を判定する工程。
【００８１】
（ｉｉ）以下の工程イ）乃至ニ）を含む。
イ）被験物質を添加した培地で培養した哺乳動物由来培養細胞より、全ＲＮＡ画分を抽出する工程；
ロ）被験物質を添加しない培地で培養した哺乳動物由来培養細胞より、全ＲＮＡ画分を抽出する工程；
ハ）上記イ）由来の全ＲＮＡ画分とロ）由来の全ＲＮＡ画分における、ＴＲＰＭ４遺伝子、ＰＬＡ１Ａ遺伝子及びＢＵＣＳ１遺伝子の少なくともいずれか一つの遺伝子の発現量を測定する工程；
ニ）上記イ）由来の全ＲＮＡ画分とロ）由来の全ＲＮＡ画分との間における上記ハ）によって測定された遺伝子の発現量の差を解析し、被験物質の、前立腺癌に対する治療、及び／または治療効果を判定する工程。
【００８２】
▲２▼哺乳動物個体を用いる方法
（ｉ）以下の工程１）乃至３）を含む。
イ）被験物質を投与した哺乳動物個体より採取した検体より、全ＲＮＡを抽出する工程；
ロ）イ）由来の全ＲＮＡと被験物質を投与しなかった動物個体より採取した検体より得た全ＲＮＡの間における、ＴＲＰＭ４遺伝子、ＰＬＡ１Ａ遺伝子及びＢＵＣＳ１遺伝子の少なくともいずれか一つの遺伝子の発現量の差を検出する工程；
ハ）上記ロ）に記載の遺伝子の発現量の差を解析し、被験物質の前立腺癌に対する治療、及び／または予防効果を判定する工程。
【００８３】
（ｉｉ）以下の工程イ）乃至ニ）を含む。
イ）被験物質を投与した哺乳動物個体より採取した検体より、全ＲＮＡを抽出する工程；
ロ）被験物質を投与しなかった哺乳動物個体より採取した検体より、全ＲＮＡを抽出する工程；
ハ）上記工程イ）由来の全ＲＮＡと上記工程ロ）由来の全ＲＮＡにおける、ＴＲＰＭ４遺伝子、ＰＬＡ１Ａ遺伝子及びＢＵＣＳ１遺伝子の少なくともいずれか一つの遺伝子の発現量を測定する工程；
ニ）ハ）に記載の遺伝子の発現量の差を解析し、被験物質の前立腺癌に対する治療及び／または予防効果を判定する工程。
【００８４】
（２）ＴＲＰＭ４、ＰＬＡ１Ａ及びＢＵＣＳ１を用いる方法
ＴＲＰＭ４、ＰＬＡ１Ａ及びＢＵＣＳ１の少なくともいずれか一つの発現量を測定することを利用したスクリーニング方法については哺乳動物培養細胞を用いた方法と動物個体を用いた方法についてそれぞれ以下の工程を含む。
【００８５】
▲１▼ 哺乳動物由来培養細胞を用いる方法
（ｉ）以下の工程１）及び２）を含む：
イ）被験物質を添加した培地で培養した哺乳動物由来培養細胞における、ＴＲＰＭ４、ＰＬＡ１Ａ及びＢＵＣＳ１の少なくともいずれか一つの発現量を測定する工程；
ロ）イ）で測定された蛋白質の発現量と、被験物質を添加しない培地で培養した哺乳動物由来培養細胞における該蛋白質の発現量の差を解析し、被験物質の前立腺癌に対する治療効果及び／または予防効果を判定する工程。
【００８６】
（ｉｉ）以下の工程イ）乃至ハ）を含む：
イ）被験物質を添加した培地で培養した哺乳動物由来培養細胞における、ＴＲＰＭ４、ＰＬＡ１Ａ及びＢＵＣＳ１の少なくともいずれか一つの蛋白質の発現量を測定する工程；
ロ）被験物質を添加しない培地で培養した哺乳動物由来培養細胞における、上記イ）に記載の蛋白質の発現量を測定する工程；
ハ）上記イ）で測定された蛋白質の発現量と、上記ロ）で測定された該蛋白質の発現量の差を検出し、被験物質の前立腺癌に対する治療効果及び／または予防効果を判定する工程。
【００８７】
（ｉｉｉ）以下の工程イ）乃至ハ）を含む：
イ）被験物質を添加した培地で培養した哺乳動物由来培養細胞から得た全蛋白質を固相化する工程；
ロ）上記固相化蛋白質における、ＴＲＰＭ４、ＰＬＡ１Ａ及びＢＵＣＳ１の少なくともいずれか一つの蛋白質の発現量を測定する工程；
ハ）上記ロ）で検出されたＴＲＰＭ４、ＰＬＡ１Ａ及びＢＵＣＳ１の発現量と、被験物質を添加しない培地で培養した哺乳動物由来培養細胞から得た全蛋白質における該蛋白質の発現量の差を解析し、被験物質の前立腺癌に対する治療効果及び／または予防効果を判定する工程。
【００８８】
（ｉｖ）以下の工程イ）乃至ホ）を含む：
イ）被験物質を添加した培地で培養した哺乳動物由来培養細胞から得た全蛋白質を固相化する工程；
ロ）被験物質を添加しない培地で培養した哺乳動物由来培養細胞から得た全蛋白質を固相化する工程；
ハ）上記工程イ）に記載の固相化蛋白質におけるＴＲＰＭ４、ＰＬＡ１Ａ及びＢＵＣＳ１の少なくともいずれか一つの蛋白質の発現量を該蛋白質に特異的に結合する抗体またはリガンドを用いて測定する工程；
ニ）上記工程ロ）に記載の固相化蛋白質におけるＴＲＰＭ４、ＰＬＡ１Ａ及びＢＵＣＳ１の少なくともいずれか一つの発現量を該蛋白質に特異的に結合する抗体またはリガンドを用いて測定する工程；
ホ）上記工程ハ）で測定された蛋白質の発現量と、上記工程ニ）で測定された蛋白質の発現量の差を解析し、被験物質の、前立腺癌に対する治療効果及び／または予防効果を判定する工程。
【００８９】
▲２▼ 哺乳動物個体を用いる方法
（ｉ）以下の工程イ）及びロ）を含む：
イ）被験物質を投与された哺乳動物個体より採取した検体における、ＴＲＰＭ４、ＰＬＡ１Ａ及びＢＵＣＳ１の少なくともいずれか一つの蛋白質の発現量を測定する工程；
ロ）上記工程イ）で測定されたＴＲＰＭ４、ＰＬＡ１Ａ及びＢＵＣＳ１の少なくともいずれか一つの発現量と、被験物質を投与されなかった哺乳動物個体から採取した検体における該蛋白質の発現量の差を解析し、被験物質の前立腺癌に対する治療効果及び／または予防効果を判定する工程。
【００９０】
（ｉｉ）以下の工程イ）乃至ハ）を含む：
イ）被験物質を投与された哺乳動物個体より採取した検体における、ＴＲＰＭ４、ＰＬＡ１Ａ及びＢＵＣＳ１の少なくともいずれか一つの蛋白質の発現量を該蛋白質に特異的に結合する抗体またはリガンドを用いて測定する工程；
ロ）被験物質を投与されなかった哺乳動物個体より採取した検体における、該蛋白質の発現量を測定する工程；
ハ）イ）で測定されたＴＲＰＭ４、ＰＬＡ１Ａ及びＢＵＣＳ１の少なくともいずれか一つの蛋白質の発現量と、ロ）で測定された該蛋白質の発現量の差を解析し、被験物質の前立腺癌に対する治療効果及び／または予防効果を判定する工程。
【００９１】
（ｉｉｉ）以下の工程イ）乃至ハ）を含む：
イ）被験物質を投与された哺乳動物個体より採取した検体中の全蛋白質を固相化する工程；
ロ）上記固相化蛋白質における、ＴＲＰＭ４、ＰＬＡ１Ａ及びＢＵＣＳ１の少なくともいずれか一つの蛋白質の発現量を測定する工程；
ハ）上記ロ）で検出されたＴＲＰＭ４、ＰＬＡ１Ａ及びＢＵＣＳ１の少なくともいずれか一つの蛋白質の発現量と、被験物質を投与されなかった哺乳動物個体より採取した検体中における該蛋白質の発現量の差を解析し、被験物質の前立腺癌に対する治療及び／または予防効果を判定する工程。
【００９２】
（ｉｖ）以下の工程イ）乃至ホ）を含む：
イ）被験物質を投与された哺乳動物個体より採取した検体中の全蛋白質を固相化する工程；
ロ）被験物質を投与されなかった哺乳動物個体より採取した検体中の全蛋白質を固相化する工程；
ハ）上記工程イ）に記載の固相化蛋白質における、ＴＲＰＭ４、ＰＬＡ１Ａ及びＢＵＣＳ１の少なくともいずれか一つの蛋白質の発現量を該蛋白質に特異的に結合する抗体またはリガンドを用いて検出する工程；
ニ）上記ロ）に記載の固相化蛋白質における、ＴＲＰＭ４、ＰＬＡ１Ａ及びＢＵＣＳ１の少なくともいずれか一つの蛋白質の発現量を該蛋白質に特異的に結合する抗体またはリガンドを用いて検出する工程；
ホ）上記ハ）で検出された蛋白質の発現量と、上記ニ）で検出された該蛋白質の発現量の差を解析し、被験物質の前立腺癌に対する治療効果及び／または予防効果を判定する工程。
【００９３】
（３）ＴＲＰＭ４、ＰＬＡ１Ａ及びＢＵＣＳ１のいずれかの活性を阻害する物質を同定することによる、前立腺癌に対する治療効果及び／または予防効果を有する物質の決定方法
ＴＲＰＭ４、ＰＬＡ１Ａ及びＢＵＣＳ１は正常な前立腺に比べ前立腺癌で有意に発現量が増加しているので、ＴＲＰＭ４、ＰＬＡ１Ａ及びＢＵＣＳ１の少なくともいずれか一つの活性を阻害する物質は前立腺癌に対する治療効果及び／または予防効果を有する物質となり得る。ＴＲＰＭ４はカルシウムイオン存在下で陽イオン透過チャンネルとしての機能を有する（例えば、Ｃｅｌｌ，２００２，Ｖｏｌ．１０９，ｐ３９７−４０７及びＰｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，２００１，Ｖｏｌ．９８，ｐ１０６９２−１０６９７参照。）。ＰＬＡ１ＡはフォスフォリパーゼＡ１（ＰｈｏｓｐｈｏｌｉｐａｓｅＡ１）メンバー蛋白質であり、フォスフォリパーゼＡ１活性を有する。フォスフォリパーゼＡ１活性とはリン脂質のグリセロールの１位（リン酸エステルが結合している部位を３位とした場合）における脂肪酸とのエステル結合を特異的に加水分解する活性である。ＢＵＣＳ１はアシル−ＣｏＡ・シンテターゼ（Ａｃｙｌ−ＣｏＡＳｙｎｔｈｅｔａｓｅ）の１種であり、炭素数４〜１６の脂肪酸、好適にはオクタン酸をアシル−ＣｏＡ（Ａｃｙｌ−ＣｏＡ）に活性化する活性を有する酵素である。以下，ＴＲＰＭ４、ＰＬＡ１Ａ、ＢＵＣＳのそれぞれについて活性を阻害する物質を取得することを特徴とする、前立腺癌に対する治療効果及び／または予防効果を有する物質の決定方法を示す。
【００９４】
▲１▼ ＴＲＰＭ４
ＴＲＰＭ４の陽イオン透過チャンネルを阻害する物質を同定することを特徴とし、以下の工程イ）乃至ハ）を含むことからなる、前立腺癌に対する治療効果及び／または予防効果を有する物質の決定方法：
イ）ＴＲＰＭ４を細胞表面に発現している細胞を供給する工程；
ロ）Ｃａ^２＋の存在下においてイ）に記載の細胞と被験物質を接触する工程；
ハ）細胞内への陽イオンの取り込みが減少するかどうかを決定する工程（ここで、細胞内への陽イオンの取り込みが減少することは被験物質がＴＲＰＭ４の陽イオン透過チャンネルを阻害していることを示す。）。
【００９５】
以下、各工程を更に詳しく説明する。
イ）ＴＲＰＭ４を細胞表面に発現している細胞は、当業者に公知の方法で取得することができ、例えば、Ｃｅｌｌ，２００２，Ｖｏｌ．１０９，ｐ３９７−４０７に記載されている方法で取得することができる。すなわち、ＴＲＰＭ４のｃＤＮＡをアミノ末端にフラッグ・エピトープ・タグ（Ｆｌａｇｅｐｉｔｏｐｅｔａｇ）を付けたｐＣＤＮＡ４／ＴＯｖｅｃｔｏｒ（インビトロジェン社製）に挿入し、そのプラスミドをあらかじめｐＣＤＮＡ６／ＴＲ（インビトロジェン社製）で形質転換されたＨＥＫ−２９３細胞にエレクトロポレーションで導入し、ゼオシンを用いて細胞表面にフラッグ・タグが付いたＴＲＰＭ４が発現している細胞を選択する。
ロ）Ｃａ^２＋の存在下においてイ）に記載の細胞と被験物質を接触する工程においては、フラッグ・タグが付いたＴＲＰＭ４を細胞表面に発現するＨＥＫ−２９３細胞をＣａ^２＋を含む適当な培地で培養し、被験物質を添加する。なお、細胞の培養は例えば、Ｃｅｌｌ，２００２，Ｖｏｌ．１０９，ｐ３９７−４０７に記載されている方法に準じて行うことができる。また、被験物質の濃度は測定条件に応じて適当に定めることができる。
ハ）細胞内への陽イオンの取り込みが減少するかどうかを決定する工程における、細胞内の陽イオン濃度の測定は、例えば、Ｃｅｌｌ，２００２，Ｖｏｌ．１０９，ｐ３９７−４０７に記載されている方法に準じて行うことができるがこれらの方法に限られず、例えば、ＦＬＩＰＲＣａｌｃｉｕｍＡｓｓａｙＫｉｔやＦＬＩＰＲＭｅｍｂｒａｎｅＰｏｔｅｎｔｉａｌＡｓｓａｙＫｉｔ（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＤｅｖｉｃｅｓ社）等を用いて測定することもできる。
このような方法によって測定された細胞内の陽イオン濃度の上昇が被験物質を添加しない場合に比べ減少する場合、被験物質はＴＲＰＭ４の陽イオン透過チャンネルを阻害していることを示し、そのような被験物質はＴＲＰＭ４の陽イオン透過チャンネルを阻害する物質であると同定され、前立腺癌に対する治療効果及び／または予防効果を有する物質であると決定することができる。
【００９６】
▲２▼ ＰＬＡ１Ａ
フォスフォリパーゼＡ１活性を阻害する物質を同定することを特徴とし、以下の工程イ）及びロ）を含むことからなる、前立腺癌に対する治療効果及び／または予防効果を有する物質の決定方法：
イ）ＰＬＡ１Ａの基質とＰＬＡ１Ａを被験物質と接触する工程；
ロ）被験物質の存在下で基質を加水分解する活性が減少するかどうかを決定する工程（ここで、基質を加水分解する活性が減少することは被験物質がフォスフォリパーゼＡ１活性を阻害することを示す。）。
【００９７】
以下、各工程を更に詳しく説明する。
【００９８】
イ）ＰＬＡ１Ａの基質とＰＬＡ１Ａを被験物質と接触する工程におけるＰＬＡ１の基質としては、ＰＬＡ１の基質になり得るグリセロリン脂質であれば特に制限はなく、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルイノシトールポリリン酸、ジホスファチジルグリセロール、ホスファチジン酸、リゾリン脂質などを挙げることができ好適には、ホスファチジルセリンを用いることができる。
ＰＬＡ１ＡはＰＬＡ１Ａの活性を測定できる限りにおいて、どの様な状態でも良く、培養上清、部分製製品、精製品を適当に選択して用いることができ、例えば、下記の「６．」の項の「（１）抗原の調製」に記載した方法によって調整することができる。
【００９９】
ロ）被験物質の存在下で基質を加水分解する活性が減少するかどうかを決定する工程における基質を加水分解する活性は、例えば、特開平１０−２０１４７９に記載の方法によって測定することができる。具体的には公知の方法（Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１０１，１９８７，ｐ５３−６１）に従って調製した１−［^１４Ｃ］パルミトイル−２−アシル−ｓｎ−グリセロ−３−フォスフォセリンを基質として、０．４ｍＭ塩化カルシウムを含む１００ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）に４．０ｍＭの基質と酵素をＰＬＡ１Ａを加え３７℃で適当な時間反応させた後、Ｄｏｌｅの溶液（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，Ｖｏｌ．２３５，１９６０，ｐ．２５９５−２５９９）を加えて反応を停止、遊離された脂肪酸を抽出した後、放射能を測定する。
【０１００】
このような方法によって測定されたＰＬＡ１Ａの基質を加水分解する活性が、被験物質を添加なかった場合に比べ減少している場合、被験物質がフォスフォリパーゼＡ１活性を阻害することを示し、そのような被験物質はフォスフォリパーゼＡ１活性を阻害する物質として同定され、前立腺癌に対する治療効果及び／または予防効果を有する物質であると決定することができる。
【０１０１】
▲３▼ ＢＵＣＳ１
ＢＵＣＳ１のアシル−ＣｏＡ（Ａｃｙｌ−ＣｏＡ）の合成活性を阻害する物質を同定することを特徴とし、以下の工程イ）乃至ロ）を含むことからなる、前立腺癌に対する治療効果及び／または予防効果を有する物質の決定方法：
イ）ＢＵＣＳ１の基質とＢＵＣＳ１を被験物質と接触する工程；
ロ）被験物質の存在下でアシル−ＣｏＡの合成量が減少するかどうかを決定する工程（ここで、アシル−ＣｏＡの合成量が減少することは被験物質がＢＵＣＳ１のアシル−ＣｏＡの合成活性を阻害することを示す。）
以下、各工程を更に詳しく説明する。
イ）ＢＵＣＳ１の基質とＢＵＣＳ１を被験物質と接触する工程における、ＢＵＣＳ１の基質としてはオクタン酸（Ｏｃｔａｎｏａｔｅ）を用いることができ、ＢＵＣＳ１はＢＵＣＳ１の活性を測定できる限りにおいて、どの様な状態でも良く、培養上清、部分製製品、精製品を適当に選択して用いることができ、例えば、下記の「６．」の項の「（１）抗原の調製」に記載した方法によって調整することができる。
【０１０２】
ロ）被験物質の存在下でアシル−ＣｏＡの合成量が減少するかどうかを決定する工程における、アシル−ＣｏＡの合成量が減少するかどうかは、ＢＵＣＳ１の活性を測定することによって決定することができる。ＢＵＣＳ１の活性測定は例えば、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，Ｖｏｌ．２７６，２００１，ｐ．３５９６１−３５９６６やＪ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，Ｖｏｌ．２７６，２００１，ｐ．１１４２０−１１４２６に記載の方法によってできるＢＵＣＳ１の活性を測定できる限りにおいて、これらの方法に限定されない。以下に具体例を示す。１００ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ８．０，１０ｍＭＭｇＣｌ２，１０ｍＭＡＴＰ，１ｍＭＣｏＡ，１０ｍＭ［^１４Ｃｉ］オクタン酸（ｏｃｔａｎｏａｔｅ）（１０００ｃｐｍ／ｎｍｏｌ）に適当量の被験物質を添加して全量０．２ｍｌにする。オクタン酸はＴｒｉｔｏｎＸ−１００で最終濃度１％ｗ／ｖにしたものを用いる。３７℃で１分間プレインキュベーションし、ＢＵＣＳ１の酵素溶液を添加して酵素反応を開始する。３０分間のインキュベーションの後に５０μｌの３０％のメタリン酸を添加して酵素反応を停止する。酵素反応産物である［^１４Ｃ］アシル−ＣｏＡはクロマトグラフィー・メディア（Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙｍｅｄｉａ）（ＩＴＬＣ−ＳＧタイプ、ゲルマン・サイエンシーズ（ＧｅｌｍａｎＳｃｉｅｎｃｅｓ）にスポットし、水飽和エーテル／ギ酸（７：１）で洗浄し放射活性を測定し、アシル−ＣｏＡの合成量を決定する。同様の実験を被験物質を添加しない条件でも行い、アシル−ＣｏＡの合成量を決定する。このような方法によって測定されたＢＵＣＳ１の活性が被験物質を添加しなかった場合に比べ減少している場合、被験物質がＢＵＣＳ１の活性を阻害することを示し、そのような被験物質はＢＵＣＳ１の活性を阻害する物質として同定され、前立腺癌に対する治療効果及び／または予防効果を有する物質であると決定することができる。
【０１０３】
（４）その他の方法
ＴＲＰＭ４、ＰＬＡ１Ａ及びＢＵＣＳ１の少なくともいずれか一つを過剰発現させた哺乳動物個体に被験物質を投与した場合と投与しなかった場合について、経時的に癌の発生率、癌の大きさ、及び／または生存率等を測定する。被験物質を投与した哺乳動物で癌の発生率が有意に低下している、癌の大きさが有意に小さい、及び／または、生存率が約１０％以上、好ましくは約３０％以上、より好ましくは、約５０％以上上昇した場合に、被験物質は癌に対する治療及び／または予防効果を有する化合物として選択することができる。
【０１０４】
６．抗ＴＲＰＭ４、ＰＬＡ１Ａ及びＢＵＣＳ１抗体の製造
（１）抗原の調製
抗ＴＲＰＭ４、ＰＬＡ１Ａ及びＢＵＣＳ１抗体のいずれかを作製するための抗原としては、ＴＲＰＭ４、ＰＬＡ１Ａ及びＢＵＣＳ１のいずれかまたはその少なくとも６個の連続した部分アミノ酸配列からなるポリペプチド、あるいはこれらに任意のアミノ酸配列や担体が付加された誘導体を挙げることができる。
【０１０５】
前記抗原ポリペプチドはＴＲＰＭ４、ＰＬＡ１Ａ及びＢＵＣＳ１のいずれかをヒトの腫瘍組織あるいは腫瘍細胞から直接精製して使用することができ、また、ＴＲＰＭ４、ＰＬＡ１Ａ及びＢＵＣＳ１をｉｎｖｉｔｒｏにて合成する、あるいは遺伝子操作により宿主細胞に産生させることによって得ることができる。遺伝子操作では、具体的には、ＴＲＰＭ４、ＰＬＡ１Ａ及びＢＵＣＳ１のいずれかの遺伝子を発現可能なベクターに組み込んだ後、転写と翻訳に必要な酵素、基質及びエネルギー物質を含む溶液中で合成する、あるいは他の原核生物、または真核生物の宿主細胞を形質転換させることによってＴＲＰＭ４、ＰＬＡ１Ａ及びＢＵＣＳ１のいずれかを発現させることにより、該蛋白質を得ることが出来る。ＴＲＰＭ４、ＰＬＡ１Ａ及びＢＵＣＳ１のいずれかのｃＤＮＡは例えば、ＴＲＰＭ４、ＰＬＡ１Ａ及びＢＵＣＳ１のいずれかを発現しているｃＤＮＡライブラリーを鋳型として、ＴＲＰＭ４、ＰＬＡ１Ａ及びＢＵＣＳ１のいずれかのｃＤＮＡを特異的に増幅するプライマーを用いてポリメラーゼ連鎖反応（以下「ＰＣＲ」という）［Ｓａｉｋｉ，Ｒ．Ｋ．，ｅｔａｌ．（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ２３９，４８７−４９参照］を行なう、いわゆるＰＣＲ法により取得することができる。
【０１０６】
ポリペプチドのイン・ビトロ（ｉｎｖｉｔｒｏ）合成としては、例えばロシュ・ダイアグノスティックス社製のラピッドトランスレーションシステム（ＲＴＳ）が挙げられるが、これに限定されない。ＲＴＳを用いる場合を例に挙げると、目的の遺伝子をＴ７プロモーターにより制御される発現ベクターにクローニングし、これをｉｎｖｉｔｒｏの反応系に添加すると、最初に鋳型ＤＮＡよりＴ７ＲＮＡポリメラーゼによりｍＲＮＡが転写され、その後大腸菌溶解液中のリボソーム等により翻訳が行われ、目的のポリペプチドが反応液中に合成される（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａ，１，２０−２３（２００１），Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａ，２，２８−２９（２００１）。
【０１０７】
原核細胞の宿主としては、例えば、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ）や枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓ）などが挙げられる。目的の遺伝子をこれらの宿主細胞内で形質転換させるには、宿主と適合し得る種由来のレプリコンすなわち複製起点と、調節配列を含んでいるプラスミドベクターで宿主細胞を形質転換させる。また、ベクターとしては、形質転換細胞に表現形質（表現型）の選択性を付与することができる配列を有するものが好ましい。
【０１０８】
例えば、大腸菌としてはＫ１２株などがよく用いられ、ベクターとしては、一般にｐＢＲ３２２やｐＵＣ系のプラスミドが用いられるが、これらに限定されず、公知の各種菌株、及びベクターがいずれも使用できる。
【０１０９】
プロモーターとしては、大腸菌においては、トリプトファン（ｔｒｐ）プロモーター、ラクトース（ｌａｃ）プロモーター、トリプトファン・ラクトース（ｔａｃ）プロモーター、リポプロテイン（ｌｐｐ）プロモーター、ポリペプチド鎖伸張因子Ｔｕ（ｔｕｆＢ）プロモーター等が挙げられ、どのプロモーターも目的のポリペプチドの産生に使用することができる。
【０１１０】
枯草菌としては、例えば２０７−２５株が好ましく、ベクターとしてはｐＴＵＢ２２８（Ｏｈｍｕｒａ，Ｋ．ｅｔａｌ．（１９８４）Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．９５，８７−９３）などが用いられるが、これに限定されるものではない。枯草菌のα−アミラーゼのシグナルペプチド配列をコードするＤＮＡ配列を連結することにより、菌体外での分泌発現も可能となる。
【０１１１】
真核細胞の宿主細胞には、脊椎動物、昆虫、酵母などの細胞が含まれ、脊椎動物細胞としては、例えば、サルの細胞であるＣＯＳ細胞（Ｇｌｕｚｍａｎ，Ｙ．（１９８１）Ｃｅｌｌ２３，１７５−１８２、ＡＴＣＣＣＲＬ−１６５０）、マウス繊維芽細胞ＮＩＨ３Ｔ３（ＡＴＣＣＮｏ．ＣＲＬ−１６５８）やチャイニーズ・ハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ細胞、ＡＴＣＣＣＣＬ−６１）のジヒドロ葉酸還元酵素欠損株（Ｕｒｌａｕｂ，Ｇ．ａｎｄＣｈａｓｉｎ，Ｌ．Ａ．（１９８０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ７７，４１２６−４２２０）等がよく用いられているが、これらに限定されない。
【０１１２】
脊椎動物細胞の発現プロモーターとしては、通常発現しようとする遺伝子の上流に位置するプロモーター、ＲＮＡのスプライス部位、ポリアデニル化部位、及び転写終結配列等を有するものを使用でき、さらにこれは必要により複製起点を有してもよい。該発現ベクターの例としては、サイトメガロウイルス初期プロモーターを有するｐｃＤＮＡ３．１（インビトロジェン社製）、ＳＶ４０の初期プロモーターを有するｐＳＶ２ｄｈｆｒ（Ｓｕｂｒａｍａｎｉ，Ｓ．ｅｔａｌ．（１９８１）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１，８５４−８６４）等が挙げられるが、これに限定されない。
【０１１３】
宿主細胞として、ＣＯＳ細胞あるいはＮＩＨ３Ｔ３細胞を用いる場合を例に挙げると、発現ベクターとしては、ＳＶ４０複製起点を有し、ＣＯＳ細胞あるいはＮＩＨ３Ｔ３細胞において自立増殖が可能であり、さらに、転写プロモーター、転写終結シグナル、及びＲＮＡスプライス部位を備えたものを用いることができる。該発現ベクターは、ＤＥＡＥ−デキストラン法（Ｌｕｔｈｍａｎ，Ｈ．ａｎｄＭａｇｎｕｓｓｏｎ，Ｇ．（１９８３）ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．１１，１２９５−１３０８）、リン酸カルシウム−ＤＮＡ共沈殿法（Ｇｒａｈａｍ，Ｆ．Ｌ．ａｎｄｖａｎｄｅｒＥｂ，Ａ．Ｊ．（１９７３）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ５２，４５６−４５７）、及び電気パルス穿孔法（Ｎｅｕｍａｎｎ，Ｅ．ｅｔａｌ．（１９８２）ＥＭＢＯＪ．１，８４１−８４５）などによりＣＯＳ細胞、あるいはＮＩＨ３Ｔ３細胞に取り込ませることができ、かくして所望の形質転換細胞を得ることができる。また、宿主細胞としてＣＨＯ細胞を用いる場合には、発現ベクターと共に、抗生物質Ｇ４１８耐性マーカーとして機能するｎｅｏ遺伝子を発現し得るベクター、例えばｐＲＳＶｎｅｏ（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．ｅｔａｌ．（１９８９）： ”ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ” ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ，ＮＹ）やｐＳＶ２ｎｅｏ（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ，Ｐ．Ｊ．ａｎｄＢｅｒｇ，Ｐ．（１９８２）Ｊ．Ｍｏｌ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．１，３２７−３４１）などをコ・トランスフェクトし、Ｇ４１８耐性のコロニーを選択することにより、目的のポリペプチドを安定に産生する形質転換細胞を得ることができる。
【０１１４】
昆虫細胞を宿主細胞として用いる場合には、鱗翅類ヤガ科のＳｐｏｄｏｐｔｅｒａｆｒｕｇｉｐｅｒｄａの卵巣細胞由来株化細胞（Ｓｆ−９またはＳｆ−２１）やＴｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａｎｉの卵細胞由来ＨｉｇｈＦｉｖｅ細胞（Ｗｉｃｋｈａｍ，Ｔ．Ｊ．ｅｔａｌ．（１９９２）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｐｒｏｇ．Ｉ：３９１−３９６）などが宿主細胞としてよく用いられ、バキュロウイルストランスファーベクターとしてはオートグラファ核多角体ウイルス（ＡｃＮＰＶ）のポリヘドリン蛋白質のプロモーターを利用したｐＶＬ１３９２／１３９３がよく用いられる（Ｋｉｄｄ，Ｉ．Ｍ．ａｎｄＶ．Ｃ．Ｅｍｅｒｙ（１９９３）Ｔｈｅｕｓｅｏｆｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓｅｓａｓｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｖｅｃｔｏｒｓ．ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙａｎｄＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ４２，１３７−１５９）。この他にも、バキュロウイルスのＰ１０や同塩基性蛋白質のプロモーターを利用したベクターも使用できる。さらに、ＡｃＮＰＶのエンベロープ表面蛋白質ＧＰ６７の分泌シグナル配列を目的蛋白質のＮ末端側に繋げることにより、組換え蛋白質を分泌蛋白質として発現させることも可能である（Ｚｈｅ−ｍｅｉＷａｎｇ，ｅｔａｌ．（１９９８）Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，３７９，１６７−１７４）。
【０１１５】
真核微生物を宿主細胞とした発現系としては、酵母が一般によく知られており、その中でもサッカロミセス属酵母、例えばパン酵母Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅや石油酵母Ｐｉｃｈｉａｐａｓｔｏｒｉｓが好ましい。該酵母などの真核微生物の発現ベクターとしては、例えば、アルコール脱水素酵素遺伝子のプロモーター（Ｂｅｎｎｅｔｚｅｎ，Ｊ．Ｌ．ａｎｄＨａｌｌ，Ｂ．Ｄ．（１９８２）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５７，３０１８−３０２５）や酸性フォスファターゼ遺伝子のプロモーター（Ｍｉｙａｎｏｈａｒａ，Ａ．ｅｔａｌ．（１９８３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８０，１−５）などを好ましく利用できる。また、分泌型蛋白質として発現させる場合には、分泌シグナル配列と宿主細胞の持つ内在性プロテアーゼあるいは既知のプロテアーゼの切断部位をＮ末端側に持つ組換え体として発現することも可能である。例えば、トリプシン型セリンプロテアーゼのヒトマスト細胞トリプターゼを石油酵母で発現させた系では、Ｎ末端側に酵母のαファクターの分泌シグナル配列と石油酵母の持つＫＥＸ２プロテアーゼの切断部位をつなぎ発現させることにより、活性型トリプターゼが培地中に分泌されることが知られている（Ａｎｄｒｅｗ，Ｌ．Ｎｉｌｅｓ，ｅｔａｌ．（１９９８）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２８，
１２５−１３１）。
【０１１６】
上記のようにして得られる形質転換体は、常法に従い培養することができ、該培養により細胞内、または細胞外に目的のポリペプチドが産生される。該培養に用いられる培地としては、採用した宿主細胞に応じて慣用される各種のものを適宜選択でき、例えば、上記ＣＯＳ細胞であれば、ＲＰＭＩ１６４０培地やダルベッコ変法イーグル培地（以下「ＤＭＥＭ」という）などの培地に、必要に応じウシ胎児血清などの血清成分を添加したものを使用できる。
【０１１７】
上記培養により、形質転換体の細胞内または細胞外に産生される組換え蛋白質は、該蛋白質の物理的性質や化学的性質などを利用した各種の公知の分離操作法により分離・精製することができる。該方法としては、具体的には例えば、通常の蛋白質沈殿剤による処理、限外濾過、分子ふるいクロマトグラフィー（ゲル濾過）、吸着クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）などの各種液体クロマトグラフィー、透析法、これらの組合せなどを例示できる。また、発現させる組換え蛋白質に６残基からなるヒスチジンを繋げることにより、ニッケルアフィニティーカラムで効率的に精製することができる。上記方法を組み合わせることにより容易に高収率、高純度で目的とするポリペプチドを大量に製造できる。
【０１１８】
（２）抗ＴＲＰＭ４、ＰＬＡ１Ａ及びＢＵＣＳ１モノクローナル抗体の製造ＴＲＰＭ４、ＰＬＡ１Ａ及びＢＵＣＳ１のいずれかと特異的に結合する抗体の例として、ＴＲＰＭ４、ＰＬＡ１Ａ及びＢＵＣＳ１のいずれかと特異的に結合するモノクローナル抗体を挙げることができるが、その取得方法は、以下に記載する通りである。
【０１１９】
モノクローナル抗体の製造にあたっては、一般に下記のような作業工程が必要である。すなわち、
（ａ）抗原として使用する生体高分子の精製、
（ｂ）抗原を動物に注射することにより免疫した後、血液を採取しその抗体価を検定して脾臓摘出の時期を決定してから、抗体産生細胞を調製する工程、
（ｃ）骨髄腫細胞（以下「ミエローマ」という）の調製、
（ｄ）抗体産生細胞とミエローマとの細胞融合、
（ｅ）目的とする抗体を産生するハイブリドーマ群の選別、
（ｆ）単一細胞クローンへの分割（クローニング）、
（ｇ）場合によっては、モノクローナル抗体を大量に製造するためのハイブリドーマの培養、またはハイブリドーマを移植した動物の飼育、
（ｈ）このようにして製造されたモノクローナル抗体の生理活性、及びその認識特異性の検討、あるいは標識試薬としての特性の検定、等である。
【０１２０】
以下、モノクローナル抗体の作製法を上記工程に沿って詳述するが、該抗体の作製法はこれに制限されず、例えば脾細胞以外の抗体産生細胞及びミエローマを使用することもできる。
【０１２１】
（ａ）抗原の精製
抗原としては、前記したような方法で調製したＴＲＰＭ４、ＰＬＡ１Ａ及びＢＵＣＳ１のいずれかまたはその一部を使用することができる。また、ＴＲＰＭ４、ＰＬＡ１Ａ及びＢＵＣＳ１のいずれかを発現する組換え体細胞より調製した膜画分、またはＴＲＰＭ４、ＰＬＡ１Ａ及びＢＵＣＳ１のいずれかを発現する組換え体細胞自身、さらに、当業者に周知の方法を用いて、化学合成した本発明の蛋白質の部分ペプチドを抗原として使用することもできる。
【０１２２】
（ｂ）抗体産生細胞の調製
工程（ａ）で得られた抗原と、フロインドの完全または不完全アジュバント、またはカリミョウバンのような助剤とを混合し、免疫原として実験動物に免疫する。実験動物は公知のハイブリドーマ作製法に用いられる動物を支障なく使用することができる。具体的には、たとえばマウス、ラット、ヤギ、ヒツジ、ウシ、ウマ等を使用することができる。ただし、摘出した抗体産生細胞と融合させるミエローマ細胞の入手容易性等の観点から、マウスまたはラットを被免疫動物とするのが好ましい。また、実際に使用するマウスおよびラットの系統は特に制限はなく、マウスの場合には、たとえば各系統ＡＫＲ、ＢＡＬＢ／ｃ、ＢＤＰ、ＢＡ、ＣＥ、Ｃ３Ｈ、５７ＢＬ、Ｃ５７ＢＲ、Ｃ５７Ｌ、ＤＢＡ、ＦＬ、ＨＴＨ、ＨＴ１、ＬＰ、ＮＺＢ、ＮＺＷ、ＲＦ、ＲＩＩＩ、ＳＪＬ、ＳＷＲ、ＷＢ、１２９等が、またラットの場合には、たとえば、Ｌｏｗ、Ｌｅｗｉｓ、Ｓｐｒａｑｕｅ、Ｄａｗｅｌｅｙ、ＡＣＩ、ＢＮ、Ｆｉｓｃｈｅｒ等を用いることができる。これらのマウス及びラットは例えば日本チャ−ルスリバー、日本ＳＬＣ、ＴｈｅＪａｃｋｓｏｎＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ等実験動物飼育販売業者より入手することができる。このうち、後述のミエローマ細胞との融合適合性を勘案すれば、マウスではＢＡＬＢ／ｃ系統が、ラットではｌｏｗ系統が被免疫動物として特に好ましい。また、抗原のヒトとマウスでの相同性を考慮し、自己抗体を除去する生体機構を低下させたマウス、すなわち自己免疫疾患マウスを用いることも好ましい。なお、これらマウスまたはラットの免疫時の週齢は、好ましくは５〜１２週齢、さらに好ましくは６〜８週齢である。
【０１２３】
ＴＲＰＭ４、ＰＬＡ１Ａ及びＢＵＣＳ１のいずれかまたはこの組換え体によって動物を免疫するには、例えば、Ｗｅｉｒ，Ｄ．Ｍ．，ＨａｎｄｂｏｏｋｏｆＥｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌＩｍｍｕｎｏｌｏｇｙＶｏｌ．Ｉ．ＩＩ．ＩＩＩ．，ＢｌａｃｋｗｅｌｌＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃＰｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｏｘｆｏｒｄ（１９８７）、Ｋａｂａｔ，Ｅ．Ａ．ａｎｄＭａｙｅｒ，Ｍ．Ｍ．，ＥｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌＩｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，ＣｈａｒｌｅｓＣ．ＴｈｏｍａｓＰｕｂｌｉｓｈｅｒＳｐｉｇｆｉｅｌｄ，Ｉｌｌｉｎｏｉｓ（１９６４）等に詳しく記載されている公知の方法を用いることができる。これらの免疫法のうち、この発明において好適な方法を具体的に示せば、たとえば以下のとおりである。すなわち、まず、抗原である膜蛋白画分、もしくは抗原を発現させた細胞を動物の皮内または腹腔内に投与する。ただし、免疫効率を高めるためには両者の併用が好ましく、前半は皮内投与を行い、後半または最終回のみ腹腔内投与を行うと、特に免疫効率を高めることができる。抗原の投与スケジュールは、被免疫動物の種類、個体差等により異なるが、一般には、抗原投与回数３〜６回、投与間隔２〜６週間が好ましく、投与回数３〜４回、投与間隔２〜４週間がさらに好ましい。投与回数を過度に増やすと抗原を浪費し、また投与間隔を広げすぎると動物の老化による細胞の低活性化を招くために好ましくない。また、抗原の投与量は、動物の種類、個体差等により異なるが、一般には、０．０５〜５ｍｌ、好ましくは０．１〜０．５ｍｌ程度とする。追加免疫は、以上の通りの抗原投与の１〜６週間後、好ましくは２〜４週間後、さらに好ましくは２〜３週間後に行う。この追加免疫の時期が６週間目より遅すぎたり、１週間目より早すぎると追加免疫の効果が少ない。なお、追加免疫を行う際の抗原投与量は、動物の種類、大きさ等により異なるが、一般に、例えばマウスの場合には、０．０５〜５ｍｌ、好ましくは０．１〜０．５ｍｌ、さらに好ましくは０．１〜０．２ｍｌ程度とする。不必要の大量投与は免疫効果を低下させるだけでなく、被免疫動物にとっても好ましものではない。
【０１２４】
上記追加免疫から１〜１０日後、好ましくは２〜５日後、さらに好ましくは２〜３日後に被免疫動物から抗体産生細胞を含む脾臓細胞またはリンパ球を無菌的に取り出す。なお、その際に抗体価を測定し、抗体価が十分高くなった動物を抗体産生細胞の供給源として用いれば、以後の操作の効率を高めることができる。
【０１２５】
ここで用いられる抗体価の測定法としては、ＲＩＡ法、ＥＬＩＳＡ法、蛍光抗体法、受身血球凝集反応法など種々の公知技術があげられるが、検出感度、迅速性、正確性、及び操作の自動化の可能性などの観点から、ＲＩＡ法またはＥＬＩＳＡ法がより好適である。
【０１２６】
本発明における抗体価の測定は、例えばＥＬＩＳＡ法によれば、以下に記載するような手順により行うことができる。まず、精製または部分精製した抗原をＥＬＩＳＡ用９６穴プレート等の固相表面に吸着させ、さらに抗原が吸着していない固相表面を抗原と無関係な蛋白質、例えばウシ血清アルブミン（以下「ＢＳＡ」という）により覆い、該表面を洗浄後、第一抗体として段階希釈した試料（例えばマウス血清）に接触させ、上記抗原に試料中のモノクローナル抗体を結合させる。さらに第二抗体として酵素標識されたマウス抗体に対する抗体を加えてマウス抗体に結合させ、洗浄後該酵素の基質を加え、基質分解に基づく発色による吸光度の変化等を測定することにより、抗体価を算出する。
【０１２７】
これらの脾臓細胞またはリンパ球からの抗体産生細胞の分離は、公知の方法（例えば、Ｋｏｈｌｅｒｅｔａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，２５６，４９５，１９７５；Ｋｏｈｌｅｒｅｔａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｎｏｌ．，６，５１１，１９７７；Ｍｉｌｓｔｅｉｎｅｔａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，２６６，５５０，１９７７；Ｗａｌｓｈ，Ｎａｔｕｒｅ，２６６，４９５，１９７７）に従って行うことができる。例えば、脾臓細胞の場合には、細胞を細切してステンレスメッシュで濾過した後、イーグル最小必須培地（ＭＥＭ）に浮遊させて抗体産生細胞を分離する一般的方法を採用することができる。
【０１２８】
（ｃ）骨髄腫細胞（以下、「ミエローマ」という）の調製
細胞融合に用いるミエローマ細胞には特段の制限はなく、公知の細胞株から適宜に選択して用いることができる。ただし、融合細胞からハイブリドーマを選択する際の利便性を考慮して、その選択手続が確立しているＨＧＰＲＴ（Ｈｐｏｘａｎｔｈｉｎｅ−ｇｕａｎｉｎｅｐｈｏｓｐｈｏｒｉｂｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）欠損株を用いるのが好ましい。すなわち、マウス由来のＸ６３−Ａｇ８（Ｘ６３）、ＮＳ１−Ａｇ４／１（ＮＳ１）、Ｐ３Ｘ６３−Ａｇ８．Ｕｌ（Ｐ３Ｕｌ）、Ｘ６３−Ａｇ８．６５３（Ｘ６３．６５３）、ＳＰ２／０−Ａｇ１４（ＳＰ２／０）、ＭＰＣ１１−４５．６ＴＧ１．７（４５．６ＴＧ）、ＦＯ、Ｓ１４９／５ＸＸＯ、ＢＵ．１等、ラット由来の２１０．ＲＳＹ３．Ａｇ．１．２．３（Ｙ３）等、ヒト由来のＵ２６６ＡＲ（ＳＫＯ−００７）、ＧＭ１５００・ＧＴＧ−Ａ１２（ＧＭ１５００）、ＵＣ７２９−６、ＬＩＣＲ−ＬＯＷ−ＨＭｙ２（ＨＭｙ２）、８２２６ＡＲ／ＮＩＰ４−１（ＮＰ４１）等である。これらのＨＧＰＲＴ欠損株は例えば、ＡｍｅｒｉｃａｎＴｙｐｅＣｕｌｔｕｒｅＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）等から入手することができる。
【０１２９】
これらの細胞株は、適当な培地、例えば８−アザグアニン培地［ＲＰＭＩ−１６４０培地にグルタミン、２−メルカプトエタノール、ゲンタマイシン、及びウシ胎児血清（以下「ＦＣＳ」という）を加えた培地に８−アザグアニンを加えた培地］、イスコフ改変ダルベッコ培地（Ｉｓｃｏｖｅ’ｓＭｏｄｉｆｉｅｄＤｕｌｂｅｃｃｏ’ｓＭｅｄｉｕｍ；以下「ＩＭＤＭ」という）、またはダルベッコ改変イーグル培地（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓＭｏｄｉｆｉｅｄＥａｇｌｅＭｅｄｉｕｍ；以下「ＤＭＥＭ」という）で継代培養するが、細胞融合の３乃至４日前に正常培地［例えば、１０％ＦＣＳを含むＡＳＦ１０４培地（味の素（株）社製）］で継代培養し、融合当日に２×１０^７以上の細胞数を確保しておく。
【０１３０】
（ｄ）細胞融合
抗体産生細胞とミエローマ細胞との融合は、公知の方法（Ｗｅｉｒ，Ｄ．Ｍ．，ＨａｎｄｂｏｏｋｏｆＥｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌＩｍｍｕｎｏｌｏｇｙＶｏｌ．Ｉ．ＩＩ．ＩＩＩ．，ＢｌａｃｋｗｅｌｌＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃＰｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｏｘｆｏｒｄ（１９８７）、Ｋａｂａｔ，Ｅ．Ａ．ａｎｄＭａｙｅｒ，Ｍ．Ｍ．，ＥｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌＩｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，ＣｈａｒｌｅｓＣＴｈｏｍａｓＰｕｂｌｉｓｈｅｒＳｐｉｇｆｉｅｌｄ，Ｉｌｌｉｎｏｉｓ（１９６４）等）に従い、細胞の生存率を極度に低下させない程度の条件下で適宜実施することができる。そのような方法は、例えば、ポリエチレングリコール等の高濃度ポリマー溶液中で抗体産生細胞とミエローマ細胞とを混合する化学的方法、電気的刺激を利用する物理的方法等を用いることができる。このうち、上記化学的方法の具体例を示せば以下のとおりである。すなわち、高濃度ポリマー溶液としてポリエチレングリコールを用いる場合には、分子量１５００〜６０００、好ましくは２０００〜４０００のポリエチレングリコール溶液中で、３０〜４０℃、好ましくは３５〜３８℃の温度で抗体産生細胞とミエローマ細胞とを１〜１０分間、好ましくは５〜８分間混合する。
【０１３１】
（ｅ）ハイブリドーマ群の選択
上記細胞融合により得られるハイブリドーマの選択方法は特に制限はないが、通常ＨＡＴ（ヒポキサンチン・アミノプテリン・チミジン）選択法〔Ｋｏｈｌｅｒｅｔａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，２５６，４９５（１９７５）；Ｍｉｌｓｔｅｉｎａｔａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ２６６，５５０（１９７７）〕が用いられる。この方法は、アミノプテリンで生存し得ないＨＧＰＲＴ欠損株のミエローマ細胞を用いてハイブリドーマを得る場合に有効である。すなわち、未融合細胞およびハイブリドーマをＨＡＴ培地で培養することにより、アミノブテリンに対する耐性を持ち合わせたハイブリドーマのみを選択的に残存させ、かつ増殖させることができる。
【０１３２】
（ｆ）単一細胞クローンへの分割（クローニング）
ハイブリドーマのクローニング法としては、例えばメチルセルロース法、軟アガロース法、限界希釈法等の公知の方法を用いることができる〔例えばＢａｒｂａｒａ，Ｂ．Ｍ．ａｎｄＳｔａｎｌｅｙ，Ｍ．Ｓ．：ＳｅｌｅｃｔｅｄＭｅｔｈｏｄｓｉｎＣｅｌｌｕｌａｒＩｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｗ．Ｈ．ＦｒｅｅｍａｎａｎｄＣｏｍｐａｎｙ，ＳａｎＦｒａｎｃｉｓｃｏ（１９８０）参照〕。このクローニング法としては、プレートの１ウェルに１個のハイブリドーマが含まれるように希釈して培養する限界希釈法、軟寒天培地中で培養しコロニーを回収する軟寒天法、マイクロマニュピレーターによって１個づつの細胞を取り出し培養する方法、セルソーターによって１個の細胞を分離する「ソータクローン」などが挙げられる。これらの方法のうち、特に限界希釈法が好適である。この方法では、マイクロプレートにラット胎児由来繊維芽細胞株、あるいは正常マウス脾臓細胞、胸腺細胞、腹水細胞などのフィーダー（ｆｅｅｄｅｒ）を接種しておく。一方、あらかじめハイブリドーマを０．２〜０．５個／０．２ｍｌになるように培地中で希釈し、この希釈したハイブリドーマの浮遊液を各ウェルに０．１ｍｌずつ入れ、一定期間毎（例えば３日毎）に約１／３の培地を新しいものに交換しながら２週間程度培養を続けることによってハイブリドーマのクローンを増殖させることができる。
【０１３３】
抗体価の認められたウェルについて、例えば限界希釈法によるクローニングを２〜４回繰返し、安定して抗体価の認められたものを抗ＴＲＰＭ４、抗ＰＬＡ１Ａ及び抗ＢＵＣＳ１のいずれかのモノクローナル抗体産生ハイブリドーマ株として選択する。
【０１３４】
（ｇ）ハイブリドーマ培養によるモノクローナル抗体の調製
このようにして選択されたハイブリドーマは、これを培養することにより、モノクローナル抗体を効率よく得ることができるが、培養に先立ち、目的とするモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマをスクリーニングすることが望ましい。このスクリーニングにはそれ自体既知の方法が採用できる。
【０１３５】
本発明における抗体価の測定は、例えばＥＬＩＳＡ法によれば、以下に記載するような手順により行うことができる。まず、精製または部分精製したＴＲＰＭ４、ＰＬＡ１Ａ及びＢＵＣＳ１の少なくともいずれか一つ、もしくはＴＲＰＭ４、ＰＬＡ１Ａ及びＢＵＣＳ１の少なくともいずれか一つを発現させた細胞をＥＬＩＳＡ用９６穴プレート等の固相表面に吸着させ、さらに抗原が吸着していない固相表面を抗原と無関係な蛋白質、例えばウシ血清アルブミン（以下「ＢＳＡ」という）により覆い、該表面を洗浄後、第一抗体として段階希釈した試料（例えばマウス血清）に接触させ、上記抗原に試料中の抗ＴＲＰＭ４抗体、抗ＰＬＡ１Ａ抗体及び抗ＢＵＣＳ１抗体の少なくともいずれか一つを結合させる。さらに第二抗体として酵素標識されたマウス抗体に対する抗体を加えてマウス抗体に結合させ、洗浄後該酵素の基質を加え、基質分解に基づく発色による吸光度の変化等を測定することにより、抗体価を算出する。なお、このようなスクリーニングは、上記のようにハイブリドーマをクローニングした後で行なってもよいし、その前に行なってもよい。
【０１３６】
以上の通りの方法によって得たハイブリドーマは、液体窒素中または−８０℃以下の冷凍庫中に凍結状態で保存することができる。
【０１３７】
クローニングを完了したハイブリドーマは、培地をＨＴ培地から正常培地に換えて培養される。大量培養は、大型培養瓶を用いた回転培養、あるいはスピナー培養で行われる。この大量培養における上清を、ゲル濾過等、当業者に周知の方法を用いて精製することにより、本発明の蛋白質に特異的に結合するモノクローナル抗体を得ることができる。また、同系統のマウス（例えば、上記のＢＡＬＢ／ｃ）、あるいはＮｕ／Ｎｕマウスの腹腔内にハイブリドーマを注射し、該ハイブリド−マを増殖させることにより、本発明のモノクローナル抗体を大量に含む腹水を得ることができる。腹腔内に投与する場合には、事前（３〜７日前）に２，６，１０，１４−テトラメチルペンタデカン（２，６，１０，１４−ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｐｅｎｔａｄｅｃａｎｅ）（プリスタン）等の鉱物油を投与すると、より多量の腹水が得られる。たとえば，ハイブリドーマと同系統のマウスの腹腔内に予め免疫抑制剤を注射し、Ｔ細胞を不活性化した後、２０日後に１０^６〜１０^７個のハイブリドーマ・クローン細胞を血清を含まない培地中に浮遊（０．５ｍｌ）させて腹腔内に投与し、通常腹部が膨満し、腹水にたまったところでマウスより腹水を採取する。この方法により、培養液中に比べて約１００倍以上の濃度のモノクローナル抗体が得られる。
【０１３８】
上記方法により得たモノクローナル抗体は、例えばＷｅｉｒ，Ｄ．Ｍ．：ＨａｎｄｂｏｏｋｏｆＥｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌＩｍｍｕｎｏｌｏｇｙＶｏｌ．Ｉ，ＩＩ，ＩＩＩ，ＢｌａｃｋｗｅｌｌＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃＰｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｏｘｆｏｒｄ（１９７８）に記載されている方法で精製することができる。すなわち、硫安塩析法、ゲル濾過法、イオン交換クロマトグラフィー法、アフィニティークロマトグラフィー法等である。これらの方法のうち、硫安塩析法を３〜４回、好ましくは３〜６回繰り返すことによって、モノクローナル抗体を精製することが可能である。しかしこの方法では精製モノクローナル抗体の収率が極めて低くなる。そのため、硫安分画法を１〜２回行なった粗精製モノクローナル抗体について、ゲル濾過法、イオン交換クロマトグラフィー法、アフィニティークロマトグラフィー法等から選ばれた少なくとも１種類、好ましくは２種類の方法を行なうことによって、高純度に精製されたモノクローナル抗体を高収率で得ることができる。硫安塩析法と他法との組合せおよび順序としては、▲１▼硫安塩析法−イオン交換クロマトグラフィー法−ゲル濾過法、▲２▼硫安塩析法−イオン交換クロマトグラフィー法−アフィニティークロマトグラフィー法、▲３▼硫安塩析法−ゲル濾過法−アフィニティークロマトグラフィー法等を例示することができるが、高純度でかつ高収率にモノクローナル抗体を得るためには、上記▲３▼の組合せが好ましい。
【０１３９】
精製の簡便な方法としては、市販のモノクローナル抗体精製キット（例えば、ＭＡｂＴｒａｐＧＩＩキット；ファルマシア社製）等を利用することもできる。
【０１４０】
かくして得られるモノクローナル抗体は、ＴＲＰＭ４を抗原として用いた場合には、ＴＲＰＭ４に対して、ＰＬＡ１Ａを抗原として用いた場合には、ＰＬＡ１Ａに対して、そしてＢＵＣＳ１を抗原として用いた場合にはＢＵＣＳ１に対して高い抗原特異性を有する。
【０１４１】
（ｈ）モノクローナル抗体の検定
かくして得られたモノクローナル抗体のアイソタイプ及びサブクラスの決定は以下のように行うことができる。まず、同定法としてはオクテルロニー（Ｏｕｃｈｔｅｒｌｏｎｙ）法、ＥＬＩＳＡ法、またはＲＩＡ法が挙げられる。オクテルロニー法は簡便ではあるが、モノクローナル抗体の濃度が低い場合には濃縮操作が必要である。一方、ＥＬＩＳＡ法またはＲＩＡ法を用いた場合は、培養上清をそのまま抗原吸着固相と反応させ、さらに第二次抗体として各種イムノグロブリンアイソタイプ、サブクラスに対応する抗体を用いることにより、モノクローナル抗体のアイソタイプ、サブクラスを同定することが可能である。また、さらに簡便な方法として、市販の同定用のキット（例えば、マウスタイパーキット；バイオラッド社製）等を利用することもできる。
【０１４２】
さらに、蛋白質の定量は、フォーリンロウリー法、及び２８０ｎｍにおける吸光度［１．４（ＯＤ２８０）＝イムノグロブリン１ｍｇ／ｍｌ］より算出する方法により行うことができる。
【０１４３】
（３）ヒト化抗ＴＲＰＭ４抗体、ヒト化抗ＰＬＡ１Ａ抗体及びヒト化抗ＢＵＣＳ１抗体の作製
得られた抗体をヒトに対する医薬として用いる場合、抗原性の問題からヒト型抗ヒトＴＲＰＭ４、抗ヒトＰＬＡ１Ａ及び抗ヒトＢＵＣＳ１抗体を作製することが望ましい。ヒト型抗ヒトＴＲＰＭ４、抗ヒトＰＬＡ１Ａ及び抗ヒトＢＵＣＳ１抗体の作製は、次に述べるような手法により得ることができる。即ち、▲１▼ヒト末梢血あるいは脾臓から採取したヒトリンパ球をｉｎｖｉｔｒｏでＩＬ−４存在下、抗原であるＴＲＰＭ４、ＰＬＡ１Ａ及ＢＵＣＳ１のいずれかで感作し、感作したヒトリンパ球をマウスとヒトとのヘテロハイブリドーマであるＫ_６Ｈ_６／Ｂ_５（ＡＴＣＣＣＲＬ−１８２３）と細胞融合させることにより目的の抗体産生ハイブリドーマをスクリーニングする。得られた抗体産生ハイブリドーマが生産する抗体は、ヒトＴＲＰＭ４に対してはヒト型抗ヒトＴＲＰＭ４、ヒトＰＬＡ１Ａに対しては抗ヒトＰＬＡ１Ａ及びＢＵＣＳ１に対しては抗ヒトＢＵＣＳ１モノクローナル抗体である。これらの抗体の中からＴＲＰＭ４、ＰＬＡ１Ａ及びＢＵＣＳ１の活性を中和する抗体をそれぞれ選別する。しかしながら、このようにヒトリンパ球をｉｎｖｉｔｒｏで感作する方法では、一般的に抗原に対して高親和性の抗体を得るのは困難である。従って、ＴＲＰＭ４、ＰＬＡ１Ａ及びＢＵＣＳ１のいずれかに高親和性のモノクローナル抗体を得るには、上記のようにして得られた低親和性のヒト型抗ヒトＴＲＰＭ４、抗ヒトＰＬＡ１Ａ及び抗ヒトＢＵＣＳ１モノクローナル抗体を高親和化する必要がある。それには、上記のようにして得られ、中和抗体であるものの低親和性であるヒト型抗ヒトＴＲＰＭ４、抗ヒトＰＬＡ１Ａ及び抗ヒトＢＵＣＳ１モノクローナル抗体のそれぞれのＣＤＲ領域（特にＣＤＲ−３）にランダム変異を導入し、これをファージで発現させてヒトＴＲＰＭ４、ＰＬＡ１Ａ及びＢＵＣＳ１のいずれかを固相化したプレートを用いてファージディスプレー法により、抗原であるＴＲＰＭ４、ＰＬＡ１Ａ及びＢＵＣＳ１のそれぞれに強力に結合するファージを選択し、そのファージを大腸菌で増やし、その塩基配列から高親和性を有するＣＤＲのアミノ酸配列を決定すればよい。このようにして得られたヒト型抗ヒトＴＲＰＭ４、抗ヒトＰＬＡ１Ａ及び抗ヒトＢＵＣＳ１モノクローナル抗体をコードする遺伝子を一般的に使用されている哺乳動物細胞用発現ベクターに組み込んで、発現させることによりヒト型抗ヒトＴＲＰＭ４、抗ヒトＰＬＡ１Ａ及び抗ヒトＢＵＣＳ１モノクローナル抗体が得られる。これらの中から、ＴＲＰＭ４、ＰＬＡ１Ａ及びＢＵＣＳ１のそれぞれの生物活性を中和し、かつ高親和性である目的のヒト型抗ヒトＴＲＰＭ４、抗ヒトＰＬＡ１Ａ及び抗ヒトＢＵＣＳ１モノクローナル抗体を選別することができる。また、▲２▼Ｂａｌｂ／ｃマウスを用いて、本発明と同じように常法（Ｋｏｈｌｅｒｅｔａｌ．：Ｎａｔｕｒｅ２５６，ｐ．４９５−４９７，１９７５）によりマウス型抗ヒトＴＲＰＭ４、抗ヒトＰＬＡ１Ａ及び抗ヒトＢＵＣＳ１モノクローナル抗体を作製し、ヒトＴＲＰＭ４、ヒトＰＬＡ１Ａ及びヒトＢＵＣＳ１のいずれかの生物活性を中和し、かつ高親和性を有するモノクローナル抗体を選択する。この高親和性マウス型抗ヒトＴＲＰＭ４、抗ヒトＰＬＡ１Ａ及び抗ヒトＢＵＣＳ１モノクローナル抗体のＣＤＲ−領域（ＣＤＲ−１、２および３）をヒトＩｇＧのＣＤＲ領域に移植するＣＤＲ−ｇｒａｆｔｉｎｇ（ＷｉｎｔｅｒａｎｄＭｉｌｓｔｅｉｎ：Ｎａｔｕｒｅ３４９，ｐ２９３−２９９，１９９１）の手法を駆使することによりヒト型化が可能である。上記に加え、さらに▲３▼ヒト抹消血リンパ球をＳｅｖｅｒｅｃｏｍｂｉｎｅｄｉｍｍｕｎｅｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ（ＳＣＩＤ）マウスに移植し、この移植されたＳＣＩＤマウスはヒト型抗体を生産する（ＭｏｓｉｅｒＤ．Ｅ．ｅｔａｌ．：Ｎａｔｕｒｅ３３５，ｐ２５６−２５９，１９８８；ＤｕｃｈｏｓａｌＭ．Ａ．ｅｔａｌ．：Ｎａｔｕｒｅ３５５，ｐ２５８−２６２，１９９２）ので、ＴＲＰＭ４、ＰＬＡ１Ａ及びＢＵＣＳ１のいずれかを抗原として感作し、スクリーニングすることにより、ＴＲＰＭ４、ＰＡＬ１Ａ及びＢＵＣＳ１のいずれかに特異的なヒト型モノクローナル抗体を生産するリンパ球をそのマウスから採取することができる。得られたリンパ球を前述のヒト型抗体の作製法▲１▼と同様に、マウスとヒトとのヘテロハイブリドーマであるＫ_６Ｈ_６／Ｂ_５（ＡＴＣＣＣＲＬ−１８２３）と細胞融合させ、得られたハイブリドーマをスクリーニングすることにより、目的のヒト型モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを得ることができる。このようにして得られたハイブリドーマを培養することにより、目的のヒト型モノクローナル抗体を大量に製造でき、上述の方法と同様に精製することにより精製品を得ることができる。また、目的のヒト型モノクローナル抗体をコードする遺伝子（ｃＤＮＡ）をクローニングし、この遺伝子を遺伝子工学的手法により適当なベクターに組み込み、各種動物細胞、混注細胞、あるいは大腸菌などを宿主として発現させることにより、遺伝子組換えヒト型モノクローナル抗体を大量に製造することができる。得られた培養液から上述と同様の方法により精製することにより、精製されたヒト型モノクローナル抗体を大量に得ることができる。更に、上述の方法で得られた抗ヒトＴＲＰＭ４、抗ヒトＰＬＡ１Ａ及び抗ヒトＢＵＣＳ１モノクローナル抗体の中から、ＴＲＰＭ４、ＰＬＡ１Ａ及びＢＵＣＳ１のいずれかの生物活性を中和する抗体を得ることができる。これらＴＲＰＭ４、ＰＬＡ１Ａ及びＢＵＣＳ１のいずれかの生物活性を中和する抗体は、生体内でのＴＲＰＭ４、ＰＬＡ１Ａ及びＢＵＣＳ１のいずれかの生物活性、即ち、癌細胞の増殖を阻害することから、医薬として、特に癌、好適には前立腺癌に対する治療及び／または予防剤として期待される。ｉｎｖｉｔｒｏでのＴＲＰＭ４、ＰＬＡ１Ａ及びＢＵＣＳ１のいずれかの生物活性の中和活性は例えば、ＴＲＰＭ４、ＰＬＡ１Ａ及びＢＵＣＳ１のいずれかを過剰発現している細胞における細胞の癌化の抑制活性で測定することができる。例えば、ＴＲＰＭ４、ＰＬＡ１Ａ及びＢＵＣＳ１の少なくともいずれか一つを過剰発現しているマウス繊維芽細胞株ＮＩＨ３Ｔ３を培養し、培養系に種々の濃度で過剰発現している蛋白質に応じて、抗ヒトＴＲＰＭ４、抗ヒトＰＬＡ１Ａ及び抗ヒトＢＵＣＳ１抗体の少なくともいずれか一つを添加し、フォーカス形成、コロニー形成及びスフェロイド増殖に対する抑制活性を測定することができる。ｉｎｖｉｖｏでの実験動物を利用した抗ヒトＴＲＰＭ４、抗ヒトＰＬＡ１Ａ及び抗ヒトＢＵＣＳ１抗体の前立腺癌に対する治療及び／または予防効果は、例えば、ＴＲＰＭ４、ＰＬＡ１Ａ及びＢＵＣＳ１の少なくともいずれか一つを過剰に発現しているトランスジェニック動物に過剰発現している蛋白質に応じて、抗ＴＲＰＭ４、抗ＰＬＡ１Ａ及び抗ＢＵＣＳ１抗体の少なくともいずれか一つを投与し、癌細胞の変化を測定することができる。
【０１４４】
６．抗ＴＲＰＭ４モノクローナル抗体、抗ＰＬＡ１Ａモノクローナル抗体及び抗ＢＵＣＳ１モノクローナル抗体を含有する医薬
上述の「５．抗ＴＲＰＭ４モノクローナル抗体、抗ＰＬＡ１Ａモノクローナル抗体及び抗ＢＵＣＳ１モノクローナル抗体の製造」の項に記載された方法で得られる抗ヒトモノクローナル抗体の中から、ＴＲＰＭ４、ＰＬＡ１Ａ及び抗ＢＵＣＳ１のそれぞれの生物活性を中和する抗体を得ることができる。これらＴＲＰＭ４、ＰＬＡ１Ａ及び抗ＢＵＣＳ１のそれぞれの生物活性を中和する抗体は、生体内でのＴＲＰＭ４、ＰＬＡ１Ａ及び抗ＢＵＣＳ１のそれぞれの生物活性、即ち、細胞の癌化を阻害することから、医薬として、特に癌に対する治療及び／または予防剤として期待される。ｉｎｖｉｔｒｏでの抗ＴＲＰＭ４抗体、抗ＰＬＡ１Ａ抗体及び抗ＢＵＣＳ１抗体のそれぞれの生物活性の中和活性は例えば、ＴＲＰＭ４、ＰＬＡ１Ａ及びＢＵＣＳ１の少なくともいずれか一つを過剰発現している細胞における細胞の癌化の抑制活性で測定することができる。例えば、ＴＲＰＭ４、ＰＬＡ１Ａ及びＢＵＣＳ１の少なくともいずれか一つを過剰発現しているマウス繊維芽細胞株ＮＩＨ３Ｔ３を培養し、培養系に種々の濃度で抗ＴＲＰＭ４抗体、抗ＰＬＡ１Ａ抗体及び抗ＢＵＣＳ１抗体の少なくともいずれか一つを添加し、フォーカス形成、コロニー形成及びスフェロイド増殖に対する抑制活性を測定することができる。ｉｎｖｉｖｏでの実験動物を利用した抗ＴＲＰＭ４抗体、抗ＰＬＡ１Ａ抗体及び抗ＢＵＣＳ１抗体のそれぞれの前立腺癌に対する治療及び／または予防効果は、例えば、ＴＲＰＭ４、ＰＬＡ１Ａ及びＢＵＣＳ１のいずれかを過剰に発現しているトランスジェニック動物に過剰に発現している蛋白質に対する抗体を投与し、癌細胞の変化を測定することができる。
【０１４５】
このようにして得られたＴＲＰＭ４、ＰＬＡ１Ａ及びＢＵＣＳ１から選択されるいずれかの生物活性を中和する抗体は、医薬として特に癌の治療及び／または予防を目的とした医薬組成物として、あるいはこのような疾患の免疫学的診断のための抗体として有用である。
【０１４６】
本発明の抗体はドキソルビシン、エビルビシン、ダウノルビシン、パクリタキセル、ドセタキセル、イリノテカン、トポテカン、９−カンプトテシン、シスプラチン、ＡｒａＣ、５ＦＵ、ネオカルチノシタチン、抗ＨＥＲ２抗体、ＴＲＡ８、ＴＲＡＩＬ等の抗癌活性を有する物質と併用して用いることもできる。併用する場合は、同時に投与しても良いし、別個に投与しても良い。本発明の抗体は製剤化して経口的あるいは非経口的に投与することができる。本発明の抗体を含む製剤は、ＴＲＰＭ４、ＰＬＡ１Ａ及びＢＵＣＳ１のいずれかを認識する抗体を有効成分として含有する医薬組成物として、ヒトあるいは動物に対し安全に投与されるものである。また、製剤は、ドキソルビシン、エビルビシン、ダウノルビシン、パクリタキセル、ドセタキセル、イリノテカン、トポテカン、９−カンプトテシン、シスプラチン、ＡｒａＣ、５ＦＵ、ネオカルチノシタチン、抗ＨＥＲ２抗体、ＴＲＡ８、ＴＲＡＩＬ等の抗癌活性を有する物質も含有する製剤でも良い。医薬組成物の形態としては、点滴を含む注射剤、坐剤、経鼻剤、舌下剤、経皮吸収剤などが挙げられる。モノクローナル抗体は高分子蛋白質であることから、バイアル瓶などのガラス容器や注射筒などへの吸着が著しい上に不安定であり、種々の物理化学的因子、例えば、熱、ｐＨ及び湿度等により容易に失活する。従って、安定な形で製剤化するために、安定化剤、ｐＨ調整剤、緩衝剤、可溶化剤、界面活性剤などを添加する。安定化剤としてはグリシン、アラニン等のアミノ酸類、デキストラン４０及びマンノース等の糖類、ソルビトール、マンニトール、キシリトール等の糖アルコール等が挙げられ、またこれらの二種以上を併用してもよい。これらの安定化剤の添加量は、抗体の重量にたいして０．０１〜１００倍、特に０．１〜１０倍添加するのが好ましい。これら安定化剤を加えることにより、液状製剤あるいは凍結乾燥製剤の保存安定性を向上することができる。緩衝剤としては、例えばリン酸バッファー、クエン酸バッファー等が挙げられる。緩衝剤は、液状製剤あるいは凍結乾燥製剤の再溶解後の水溶液のｐＨを調製し、抗体の安定性、溶解性に寄与する。緩衝剤の添加量としては、例えば液状製剤あるいは凍結乾燥製剤を採用解した後の水量に対し、１〜１０ｍＭとするのが好ましい。界面活性剤としては、好ましくはポリソルベート２０、プルロニックＦ−６８、ポリエチレングリコール等、特に好ましくはポリソルベート８０が挙げられ、またこれらの２種以上を併用してもよい。界面活性剤の添加量としては、液状製剤あるいは凍結乾燥製剤の再溶解後の水重量に対して０．００１〜１．０％添加することが好ましい。以上のような安定化剤、緩衝剤、あるいは吸着防止剤を加えて本発明抗体の製剤を調製することができるが、特に医療用または動物用注射剤として用いる場合は、浸透圧として許容される浸透圧比は１〜２が好ましい。浸透圧比は、製剤化に際して塩化ナトリウムの増減により調製することができる。製剤中の抗体含量は、適用疾患、適用投与経路などに応じて適宜調整することができ、ヒトに対するヒト型抗体の投与量は、それぞれの抗体のＴＲＰＭ４、ＰＬＡ１Ａ及びＢＵＣＳ１に対する親和性、即ち、ＴＲＰＭ４、ＰＬＡ１Ａ及びＢＵＣＳ１のそれぞれに対する解離定数（Ｋｄ値）に対し、親和性が高い（Ｋｄ値が低い）ほど、ヒトへの投与量を少なく薬効を発揮することができる。ヒト型抗ＴＲＰＭ４抗体、ヒト型抗ＰＬＡ１Ａ抗体及びヒト型抗ＢＵＣＳ１抗体をヒトに対して投与する際には、約０．１〜１００ｍｇ／ｋｇを１〜３０日間に１回投与すればよい。
【０１４７】
７．直接相互作用する物質の探索
本発明の他の一つの態様としては、ＴＲＰＭ４、ＰＬＡ１Ａ及びＢＵＣＳ１の少なくともいずれか一つの活動を抑制するような物質を得ることを目的とした、該蛋白質の立体構造をベースとしたドラッグデザインの手法を含む。このような手法は、ラショナルドラッグデザイン法として知られており、酵素活性などの機能や、リガンド、コファクター、またはＤＮＡへの結合などを効率よく阻害もしくは活性化させるような化合物の探索に利用されている。この例として、すでに上市されている抗ＨＩＶ剤であるプロテアーゼの阻害剤がよく知られている。ＴＲＰＭ４、ＰＬＡ１Ａ及びＢＵＣＳ１の三次元構造解析においても、Ｘ線結晶解析や核磁気共鳴法といった一般的によく知られている手法が利用できると考えられる。さらに、ＴＲＰＭ４、ＰＬＡ１Ａ及びＢＵＣＳ１の機能を抑制する物質の探索には、コンピュータードラッグデザイン（ＣＡＤＤ）を活用した設計も可能である。この例としては、慢性関節リウマチ治療の新たなゲノム新薬として期待されているＡＰ−１の働きを阻害する低分子化合物（国際特許出願公開ＷＯ９９／５８５１５号）などが知られている。このような方法により、ＴＲＰＭ４、ＰＬＡ１Ａ及びＢＵＣＳ１の少なくともいずれか一つに直接結合したり、あるいはＴＲＰＭ４、ＰＬＡ１Ａ及びＢＵＣＳ１の少なくともいずれか一つと他の因子との相互作用を阻害することにより、ＴＲＰＭ４、ＰＬＡ１Ａ及びＢＵＣＳ１の機能を抑制するような物質を得ることができる。
【０１４８】
さらに、他の一つの態様は、ＴＲＰＭ４、ＰＬＡ１Ａ及びＢＵＣＳ１のいずれかが会合するポリペプチド、すなわち、ＴＲＰＭ４、ＰＬＡ１Ａ及びＢＵＣＳ１のいずれかのパートナー蛋白質に関する。すなわち、本発明は、ＴＲＰＭ４、ＰＬＡ１Ａ及びＢＵＣＳ１の活性を調節するパートナー蛋白質のスクリーニング方法に関する。
【０１４９】
このスクリーニング方法の一つの態様は、ＴＲＰＭ４、ＰＬＡ１Ａ及びＢＵＣＳ１のいずれかに被験蛋白質試料を接触させ、ＴＲＰＭ４、ＰＬＡ１Ａ及びＢＵＣＳ１のいずれかに結合する蛋白質を選択する工程を含む。このような方法としては、例えば、精製したＴＲＰＭ４、ＰＬＡ１Ａ及びＢＵＣＳ１のいずれかを用いて、これに結合する蛋白質のアフィニティー精製を行う方法が挙げられる。具体的な方法の一例を示せば、ＴＲＰＭ４、ＰＬＡ１Ａ及びＢＵＣＳ１にヒスチジン６個よりなる配列をアフィニティータグとして融合したものを作製して、これを細胞の抽出液（予めニッケル−アガロースカラムにチャージして、このカラムを素通りした画分）と４℃で１２時間インキュベートし、次いで、この混合物に別途ニッケル−アガロース担体を加えて４℃で１時間インキュベートする。ニッケル−アガロース担体を洗浄バッファーで十分洗浄した後、１００ｍＭイミダゾールを加えることにより、ＴＲＰＭ４、ＰＬＡ１Ａ及びＢＵＣＳ１のいずれかと特異的に結合する細胞抽出液中の蛋白質を溶出させて精製し、この構造を決定する。このようにして、ＴＲＰＭ４、ＰＬＡ１Ａ及びＢＵＣＳ１のいずれかと直接結合する蛋白質、及びＴＲＰＭ４、ＰＬＡ１Ａ及びＢＵＣＳ１のいずれかとの結合活性は持たないが、サブユニットとしてＴＲＰＭ４、ＰＬＡ１Ａ及びＢＵＣＳ１のいずれかに直接結合する蛋白質と複合体を形成することにより間接的にＴＲＰＭ４、ＰＬＡ１Ａ及びＢＵＣＳ１のいずれかに結合する蛋白質が精製できる［実験医学別冊、バイオマニュアルシリーズ５「転写因子研究法」ｐｐ２１５−２１９（羊土社刊）］。
【０１５０】
別の方法としては、ファーウエスタンブロット法［実験医学別冊、「新遺伝子工学ハンドブック」ｐｐ７６−８１（羊土社刊）］や、酵母や哺乳類動物細胞を用いたツーハイブリッドシステム法［実験医学別冊、「新遺伝子工学ハンドブック」ｐｐ６６−７５（羊土社刊）、「チェックメイト・マンマリアン・ツーハイブリッドシステム」（プロメガ社製）］によるクローニングも可能であるが、これらの方法に限定されない。
【０１５１】
このようにして、ＴＲＰＭ４、ＰＬＡ１Ａ及びＢＵＣＳ１のいずれかと直接もしくは間接的に相互作用するパートナー蛋白質のｃＤＮＡが得られれば、ＴＲＰＭ４、ＰＬＡ１Ａ及びＢＵＣＳ１のいずれかと該パートナー蛋白質との相互作用を阻害する物質の機能的スクリーニングに利用することができる。具体的には、例えば、ＴＲＰＭ４、ＰＬＡ１Ａ及びＢＵＣＳ１のいずれかとグルタチオンＳ−トランスフェラーゼとの融合蛋白質を調製して、抗グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ抗体で覆ったマイクロプレートに結合させた後、ビオチン化した該パートナー蛋白質をこの融合蛋白質と接触させ、該融合蛋白質との結合をストレプトアビジン化アルカリフォスファターゼで検出する。ビオチン化した該パートナー蛋白質添加の際、被験物質も添加し、融合蛋白質と該パートナー蛋白質との結合を促進あるいは阻害する物質を選択する。この方法では、融合蛋白質に直接作用する物質または該パートナー蛋白質に直接作用する物質が得られる。
【０１５２】
融合蛋白質と該パートナー蛋白質との結合が間接的であり、何らかの別の因子を介しているような場合には、例えば該因子を含むような細胞抽出液存在下で、同様に上記アッセイを行う。この場合には、該因子に対して作用するような物質も選択される可能性がある。
【０１５３】
また、得られたパートナー蛋白質が、ＴＲＰＭ４、ＰＬＡ１Ａ及びＢＵＣＳ１のいずれかの機能を抑制する活性を有している場合には、既に記載したＴＲＰＭ４、ＰＬＡ１Ａ及びＢＵＣＳ１のいずれかの遺伝子の発現ベクターを応用した試験方法に従って、抗癌剤、例えば、前立腺癌の治療または予防剤として有用な候補物質のスクリーニングを行うことができる。また、得られたパートナー蛋白質が、ＴＲＰＭ４、ＰＬＡ１Ａ及びＢＵＣＳ１のいずれかの機能を抑制する活性を有している場合には、このような抑制因子をコードするヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドは、前立腺癌の遺伝子治療に用いることができる。
【０１５４】
そのようなポリヌクレオチドは、例えば同定された阻害因子のアミノ酸配列を解析し、該アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列からなるオリゴヌクレオチドプローブを合成してｃＤＮＡライブラリーやゲノムライブラリーのスクリーニングを行うことにより取得できる。また、ＴＲＰＭ４、ＰＬＡ１Ａ及びＢＵＣＳ１の少なくともいずれか一つの機能の阻害活性を有するぺプチドが、ランダムに合成された人工ペプチドライブラリー由来である場合は、該ペプチドのアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列からなるＤＮＡを化学合成する。
【０１５５】
遺伝子治療においては、そのようにして得られた阻害因子をコードする遺伝子を、例えばウイルスベクターに組み込んで、該組換えウイルスベクターを有するウイルス（無毒化されたもの）を患者に感染させる。患者体内では抗癌因子が産生され、癌細胞の増殖抑制機能を有するので、前立腺癌の治療が可能となる。
【０１５６】
遺伝子治療剤を細胞内に導入する方法としては、ウイルスベクターを利用した遺伝子導入方法、あるいは非ウイルス性の遺伝子導入方法（日経サイエンス，１９９４年４月号，２０−４５頁、実験医学増刊，１２（１５）（１９９４）、実験医学別冊「遺伝子治療の基礎技術」，羊土社（１９９６））のいずれの方法も適用することができる。
【０１５７】
ウイルスベクターによる遺伝子導入方法としては、例えばレトロウイルス、アデノウイルス、アデノ関連ウイルス、ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルス、ポックスウイルス、ポリオウイルス、シンビスウイルス等のＤＮＡウイルスまたはＲＮＡウイルスに、ＴＲ４あるいは変異ＴＲ４をコードするＤＮＡを組み込んで導入する方法が挙げられる。このうち、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ関連ウイルス、ワクシニアウイルスを用いた方法が、特に好ましい。非ウイルス性の遺伝子導入方法としては、発現プラスミドを直接筋肉内に投与する方法（ＤＮＡワクチン法）、リポソーム法、リポフェクチン法、マイクロインジェクション法、リン酸カルシウム法、エレクトロポレーション法等が挙げられ、特にＤＮＡワクチン法、リポソーム法が好ましい。
【０１５８】
また遺伝子治療剤を実際に医薬として作用させるには、ＤＮＡを直接体内に導入するインビボ（ｉｎｖｉｖｏ）法及びヒトからある種の細胞を取り出し体外でＤＮＡを該細胞に導入し、その細胞を体内に戻すエクスビボ（ｅｘｖｉｖｏ）法がある（日経サイエンス，１９９４年４月号，２０−４５頁、月刊薬事，３６（１），２３−４８（１９９４）、実験医学増刊，１２（１５）（１９９４））。
【０１５９】
例えば、該遺伝子治療剤がインビボ法により投与される場合は、疾患、症状等に応じ、静脈、動脈、皮下、皮内、筋肉内等、適当な投与経路により投与される。またインビボ法により投与する場合は、該遺伝子治療剤は一般的には注射剤等とされるが、必要に応じて慣用の担体を加えてもよい。また、リポソームまたは膜融合リポソーム（センダイウイルス−リポソーム等）の形態にした場合は、懸濁剤、凍結剤、遠心分離濃縮凍結剤等のリポソーム製剤とすることができる。
【０１６０】
配列表の配列番号１のヌクレオチド番号１、３、５、７及び９から選択される少なくとも一つに示されるヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列または該配列の部分配列に相補的なヌクレオチド配列は、いわゆるアンチセンス治療に用いることができる。アンチセンス分子は、配列表の配列番号１、３、５、７及び９からなる群から選択される少なくとも一つに示されるヌクレオチド配列の一部に相補的な、通常１５乃至３０ｍｅｒからなるＤＮＡ、もしくはそのホスホロチオエート、メチルホスホネートまたはモルフォリノ誘導体などの安定なＤＮＡ誘導体、２’−Ｏ−アルキルＲＮＡなどの安定なＲＮＡ誘導体として用いられ得る。そのようなアンチセンス分子を、微量注入、リポソームカプセル化により、あるいはアンチセンス配列を有するベクターを利用して発現させるなど、本発明の技術分野において周知の方法で、細胞に導入することができる。このようなアンチセンス療法は、配列表の配列番号１に示されるヌクレオチド配列がコードする蛋白質の活性が増加しすぎることによって引き起こされる病気の治療または予防に有用である。
【０１６１】
上記アンチセンスオリゴヌクレオチドを含む医薬として有用な組成物は、医薬として許容できる担体の混合などの公知の方法によって製造され得る。このような担体と製造方法の例は、ＡｐｐｌｉｅｄＡｎｔｉｓｅｎｓｅＯｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（１９９８Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ、Ｉｎｃ．）に記載されている。アンチセンスオリゴヌクレオチドを含む製剤は、それ自体あるいは適宜の薬理学的に許容される、賦形剤、希釈剤等と混合し、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤若しくはシロップ剤等により経口的に、または、注射剤、坐剤、貼付剤、若しくは、外用剤等により非経口的に投与することができる。これらの製剤は、賦形剤（例えば、乳糖、白糖、葡萄糖、マンニトール、ソルビトールのような糖誘導体；トウモロコシデンプン、バレイショデンプン、α澱粉、デキストリンのような澱粉誘導体；結晶セルロースのようなセルロース誘導体；アラビアゴム；デキストラン；プルランのような有機系賦形剤；及び、軽質無水珪酸、合成珪酸アルミニウム、珪酸カルシウム、メタ珪酸アルミン酸マグネシウムのような珪酸塩誘導体；燐酸水素カルシウムのような燐酸塩；炭酸カルシウムのような炭酸塩；硫酸カルシウムのような硫酸塩等の無機系賦形剤を挙げることができる。）、滑沢剤（例えば、ステアリン酸、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウムのようなステアリン酸金属塩；タルク；コロイドシリカ；ビーズワックス、ゲイ蝋のようなワックス類；硼酸；アジピン酸；硫酸ナトリウムのような硫酸塩；グリコール；フマル酸；安息香酸ナトリウム；ＤＬロイシン；ラウリル硫酸ナトリウム、ラウリル硫酸マグネシウムのようなラウリル硫酸塩；無水珪酸、珪酸水和物のような珪酸類；及び、上記澱粉誘導体を挙げることができる。）、結合剤（例えば、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポリビニルピロリドン、マクロゴール、及び、前記賦形剤と同様の化合物を挙げることができる。）、崩壊剤（例えば、低置換度ヒドロキシプロピルセルロース、カルボキシメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースカルシウム、内部架橋カルボキシメチルセルロースナトリウムのようなセルロース誘導体；カルボキシメチルスターチ、カルボキシメチルスターチナトリウム、架橋ポリビニルピロリドンのような化学修飾されたデンプン・セルロース類を挙げることができる。）、乳化剤（例えば、ベントナイト、ビーガムのようなコロイド性粘土；水酸化マグネシウム、水酸化アルミニウムのような金属水酸化物；ラウリル硫酸ナトリウム、ステアリン酸カルシウムのような陰イオン界面活性剤；塩化ベンザルコニウムのような陽イオン界面活性剤；及び、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、ショ糖脂肪酸エステルのような非イオン界面活性剤を挙げることができる。）、安定剤（メチルパラベン、プロピルパラベンのようなパラオキシ安息香酸エステル類；クロロブタノール、ベンジルアルコール、フェニルエチルアルコールのようなアルコール類；塩化ベンザルコニウム；フェノール、クレゾールのようなフェノール類；チメロサール；デヒドロ酢酸；及び、ソルビン酸を挙げることができる。）、矯味矯臭剤（例えば、通常使用される、甘味料、酸味料、香料等を挙げることができる。）、希釈剤等の添加剤を用いて周知の方法で製造される。
【０１６２】
本発明の化合物を患者へ導入する方法については、上記に加えてコロイド分散系を用いることができる。コロイド分散系は化合物の生体内の安定性を高める効果や、特定の臓器、組織または細胞へ化合物を効率的に輸送する効果が期待される。コロイド分散系は、通常用いられるものであれば限定しないが、高分子複合体、ナノカプセル、ミクロスフェア、ビーズ、及び水中油系の乳化剤、ミセル、混合ミセル及びリポソームを包含する脂質をベースとする分散系を挙げる事ができ、好ましくは、特定の臓器、組織または細胞へ化合物を効率的に輸送する効果のある、複数のリポソーム、人工膜の小胞である（Ｍａｎｎｉｎｏｅｔａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，１９８８，６，６８２；ＢｌｕｍｅａｎｄＣｅｖｃ，Ｂｉｏｃｈｅｍ．ｅｔＢｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，１９９０，１０２９，９１；Ｌａｐｐａｌａｉｎｅｎｅｔａｌ．，ＡｎｔｉｖｉｒａｌＲｅｓ．，１９９４，２３，１１９；ＣｈｏｎｎａｎｄＣｕｌｌｉｓ，ＣｕｒｒｅｎｔＯｐ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．，１９９５，６，６９８）。
【０１６３】
０．２−０．４ μｍのサイズ範囲をとる単膜リポソームは、巨大分子を含有する水性緩衝液のかなりの割合を被包化し得、化合物はこの水性内膜に被胞化され、生物学的に活性な形態で脳細胞へ輸送される（Ｆｒａｌｅｙｅｔａｌ．，ＴｒｅｎｄｓＢｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．，１９８１，６，７７）。リポソームの組成は、通常、脂質、特にリン脂質、とりわけ相転移温度の高いリン脂質を１種またはそれ以上のステロイド、特にコレステロールと通常複合したものである。リポソーム生産に有用な脂質の例は、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルコリン、ホスファチジルセリン、スフィンゴ脂質、ホスファチジルエタノールアミン、セレブロシド及びガングリオシドのようなホスファチジル化合物を包含する。特に有用なのはジアシルホスファチジルグリセロールであり、ここでは脂質部分が１４−１８の炭素原子、特に１６−１８の炭素原子を含有し、飽和している（１４−１８の炭素原子鎖の内部に二重結合を欠いている）。代表的なリン脂質は、ホスファチジルコリン、ジパルミトイルホスファチジルコリン及びジステアロイルホスファチジルコリンを包含する。
【０１６４】
リポソームを包含するコロイド分散系の標的化は、受動的または能動的のいずれかであってもよい。受動的な標的化は、洞様毛細血管を含有する臓器の網内系細胞へ分布しようとするリポソーム本来の傾向を利用することによって達成される。一方、能動的な標的化は、例えば、ウイルスの蛋白質コート（Ｍｏｒｉｓｈｉｔａｅｔａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（Ｕ．Ｓ．Ａ．），１９９３，９０，８４７４）、モノクローナル抗体（またはその適切な結合部分）、糖、糖脂質または蛋白質（またはその適切なオリゴペプチドフラグメント）のような特定のリガンドをリポソームへ結合させること、または天然に存在する局在部位以外の臓器及び細胞型への分布を達成するためにリポソームの組成を変えることによってリポソームを修飾する手法等を挙げる事ができる。標的化されたコロイド分散系の表面は様々なやり方で修飾され得る。リポソームで標的したデリバリーシステムでは、脂質二重層との緊密な会合において標的リガンドを維持するために、リポソームの脂質二重層へ脂質基が取込まれ得る。脂質鎖を標的リガンドと結びつけるために様々な連結基が使用され得る。本発明のオリゴヌクレオチドのデリバリーが所望される細胞の上に支配的に見出される特定の細胞表面分子に結合する標的リガンドは、例えば、（１）デリバリーが所望される細胞によって支配的に発現される特定の細胞受容体と結合している、ホルモン、成長因子またはその適切なオリゴペプチドフラグメント、または（２）標的細胞上で支配的に見出される抗原性エピトープと特異的に結合する、ポリクローナルまたはモノクローナル抗体、またはその適切なフラグメント（例えば、Ｆａｂ；Ｆ（ａｂ’）２）、であり得る。２種またはそれ以上の生物活性剤は、単一のリポソーム内部で複合し、投与することもできる。内容物の細胞内安定性及び／または標的化を高める薬剤をコロイド分散系へ追加することも可能である。
【０１６５】
その使用量は症状、年齢等により異なるが、経口投与の場合には、１回当り下限１ｍｇ（好適には、３０ｍｇ）、上限２０００ｍｇ（好適には、１５００ｍｇ）を、注射の場合には、１回当り下限０．１ｍｇ（好適には、５ｍｇ）、上限１０００ｍｇ（好適には、５００ｍｇ）を皮下注射、筋肉注射または静脈注射によって投与することができる。
【０１６６】
【実施例】
以下、実施例によって本発明を説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。なお、下記実施例において、遺伝子操作に関する各操作は特に明示がない限り、「モレキュラークローニング（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ）」［Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．，Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｅ．Ｆ．およびＭａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．著、ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓより１９８９年に発刊］に記載の方法により行うか、または、市販の試薬やキットを用いる場合には市販品の指示書に従って使用した。
【０１６７】
実施例１ヒトＴＲＰＭ４の発現プロファイル解析
配列表の配列番号１に示されるヌクレオチド配列と部分的に重複するヌクレオチド配列を有するＥＳＴプローブ（ＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘＧｅｎｅＣｈｉｐＨＧ−Ｕ１３３ｐｒｏｂｅ２１９３６０＿ｓ＿ａｔ：アフィメトリックス社製）について、ＧｅｎｅＬｏｇｉｃ社製のデータベース（ＧｅｎｅＥｘｐｒｅｓｓＳｏｆｔｗａｒｅＳｙｓｔｅｍＲｅｌｅａｓｅ１．４．２）を用いて発現プロファイル解析を行なった。
【０１６８】
まず、前立腺由来・正常組織サンプル５４例と前立腺由来・腫瘍サンプル８７例について遺伝子発現量を比較したところ、前立腺由来・腫瘍サンプルにおいて有意に高く転写されていた（Ｐ値＜０．０００１：図１）。
【０１６９】
次に、該データベースにおける前立腺由来・正常組織サンプル５４例と前立腺以外の正常組織サンプル群（脂肪組織サンプル３７例、骨サンプル８例、乳房サンプル７４例、心臓サンプル５２２例、腎臓サンプル９９例、肝臓サンプル６１例、肺サンプル１２２例、リンパ節サンプル１３例、筋肉サンプル４２例、卵巣サンプル９６例、膵臓サンプル４６例、胎盤サンプル８例、皮膚サンプル６６例、脾臓サンプル４１例、胸腺サンプル７０例、甲状腺サンプル２７例、子宮サンプル５９例）についてＴＲＰＭ４の遺伝子発現量を比較したところ、前立腺以外の正常組織サンプル群において有意に低く抑えられていた（乳房サンプルでのＰ値＝０．０００２、胎盤サンプルでのＰ値＝０．００３５、それ以外の臓器サンプルでのＰ値＜０．０００１：図２）。
【０１７０】
実施例２ヒトＰＬＡ１Ａの発現プロファイル解析
配列表の配列番号７に示されるヌクレオチド配列と部分的に重複するヌクレオチド配列を有するＥＳＴプローブ（ＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘＧｅｎｅＣｈｉｐＨＧ−Ｕ１３３ｐｒｏｂｅ２１９５８４＿ａｔ：アフィメトリックス社製）について、ＧｅｎｅＬｏｇｉｃ社製のデータベース（ＧｅｎｅＥｘｐｒｅｓｓＳｏｆｔｗａｒｅＳｙｓｔｅｍＲｅｌｅａｓｅ１．４．２）を用いて発現プロファイル解析を行なった。
【０１７１】
まず、前立腺由来・正常組織サンプル５４例と前立腺由来・腫瘍サンプル８７例について遺伝子発現量を比較したところ、前立腺由来・腫瘍サンプルにおいて有意に高く転写されていた（Ｐ値＜０．０００１：図３）。
【０１７２】
次に、該データベースにおける前立腺由来・正常組織サンプル５４例と前立腺以外の正常組織サンプル群（脂肪組織サンプル３７例、乳房サンプル７４例、大腸サンプル２２１例、十二指腸サンプル８２例、胆のうサンプル８例、心臓サンプル５２２例、卵巣サンプル９６例、直腸サンプル４９例、皮膚サンプル６６例、小腸サンプル９５例、脾臓サンプル４１例、胸腺サンプル７０例、甲状腺サンプル２７例）についてＰＬＡ１Ａの遺伝子発現量を比較したところ、前立腺以外の正常組織サンプル群において有意に低く抑えられていた（脂肪組織サンプルでのＰ値＝０．０００３、胆のうサンプルでのＰ値＝０．００４１、甲状腺サンプルでのＰ値＝０．０１２７、それ以外の臓器サンプルでのＰ値＜０．０００１：図４）。
【０１７３】
実施例３ヒトＢＵＣＳ１の発現プロファイル解析
配列表の配列番号９に示されるヌクレオチド配列と部分的に重複するヌクレオチド配列を有するＥＳＴプローブ（ＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘＧｅｎｅＣｈｉｐＨＧ−Ｕ１３３ｐｒｏｂｅ２１５４３２＿ａｔ：アフィメトリックス社製）について、ＧｅｎｅＬｏｇｉｃ社製のデータベース（ＧｅｎｅＥｘｐｒｅｓｓＳｏｆｔｗａｒｅＳｙｓｔｅｍＲｅｌｅａｓｅ１．４．２）を用いて発現プロファイル解析を行なった。
【０１７４】
まず、前立腺由来・正常組織サンプル５４例と前立腺由来・腫瘍サンプル８７例について転写量を比較したところ、前立腺由来・腫瘍サンプルにおいて有意に高く転写されていた（Ｐ値＜０．０００１：図５）。
【０１７５】
次に、該データベースにおける前立腺由来・正常組織サンプル５４例と前立腺以外の正常組織サンプル群（脂肪組織サンプル３７例、大腸サンプル２２１例、十二指腸サンプル８２例、腎臓サンプル９９例、肺サンプル１２２例、直腸サンプル４９例、小腸サンプル９５例、胸腺サンプル７０例、甲状腺サンプル２７例）についてＢＵＣＳ１の遺伝子発現量を比較したところ、前立腺以外の正常組織サンプル群において有意に低く抑えられていた（Ｐ値は順に、０．０２７、０．００９１、０．００５３、０．０２８８、０．０００６、０．００２２、０．００５６、０．０００９、０．０４４１：図６）。
【０１７６】
実施例４ヒト前立腺癌細胞株ＬＮＣａＰおよびＰＣ−３のｓｉＲＮＡによる増殖抑制
（１）細胞株とその継代培養
ヒト前立腺癌細胞株ＬＮＣａＰ（ＡｍｅｒｉｃａｎＴｉｓｓｕｅＣｕｌｔｕｒｅＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎＡＴＣＣＮｏ．：ＣＲＬ−１７４０）あるいはヒト前立腺癌細胞株ＰＣ−３（ＡｍｅｒｉｃａｎＴｉｓｓｕｅＣｕｌｔｕｒｅＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎＡＴＣＣＮｏ．：ＣＲＬ−１４３５）を１０％牛胎児血清（ＦＣＳ：Ｈｙｃｌｏｎｅ社製）を含むＲＰＭＩ１６４０培地（旭テクノグラス社製）を用いて、７５ｃｍ^２の組織培養フラスコ（住友ベークライト社製：ＭＳ−２３２５０）中でコンフルエント（ｃｏｎｆｌｕｅｎｔ）にならないよう注意しつつ５％ＣＯ_２，３７℃条件下で培養し、対数増殖期のうちにトリプシン−ＥＤＴＡ溶液（シグマ社製）を用いて新しい組織培養フラスコに移して継代培養した。
【０１７７】
（２）ヒト前立腺癌細胞株ＬＮＣａＰおよびＰＣ−３のｓｉＲＮＡによる増殖抑制試験および遺伝子発現抑制試験
ポリＤ−リジンコートされた組織培養２４穴シャーレ（Ｐｏｌｙ−Ｄ−ＬｙｓｉｎｅＣｅｌｌｗａｒｅ２４−ＷｅｌｌＰｌａｔｅ：ベクトンディッキンソン社製）にヒト前立腺癌細胞株ＬＮＣａＰあるいはＰＣ−３を４ｘ１０^４個ずつまき、０．４ｍｌの１０％ＦＣＳ含有ＲＰＭＩ１６４０培地中で一晩培養した。培養上清を０．４ｍｌのＲＰＭＩ１６４０培地に交換した後、さらにいずれかの遺伝子に相同なｓｉＲＮＡ、２００ｎＭおよび１．２％ＤＭＲＩＥ−ＣＲｅａｇｅｎｔ（インビトロジェン社）を含む０．２ｍｌのＲＰＭＩ１６４０培地に交換し４時間培養することでｓｉＲＮＡを細胞に導入した。
ここで、ＴＲＰＭ４用のｓｉＲＮＡのヌクレオチド配列は配列表の配列番号１のヌクレオチド番号３３０乃至３４８に相同であり、配列表の以下の配列：
５’−ＧＣＡＣＡＧＣＡＡＵＵＵＣＣＵＣＣＧＧＡＴＴ−３’（配列表の配列番号１１）及び、
５’−ＵＣＣＧＧＡＧＧＡＡＡＵＵＧＣＵＧＵＧＣＴＴ−３’（配列表の配列番号１２）の組み合わせからなり、
ＰＬＡ１Ａ用のｓｉＲＮＡのヌクレオチド配列は配列表の配列番号７のヌクレオチド番号１３２乃至１５０に相同であり、以下の配列：
５’−ＡＧＵＧＣＧＣＵＧＡＣＵＵＣＣＡＧＡＧＴＴ−３’（配列表の配列番号１３）
５’−ＣＵＣＵＧＧＡＡＧＵＣＡＧＣＧＣＡＣＵＴＴ−３’（配列表の配列番号１４）の組み合わせからなり、ＢＵＣＳ１用のｓｉＲＮＡのヌクレオチド配列は配列表の配列番号９のヌクレオチド番号６２３乃至６４１に相同であり、以下の配列：
５’−ＧＣＵＣＣＵＧＧＵＧＵＣＵＧＡＵＣＡＣＴＴ−３’（配列表の配列番号１５）
５’−ＧＵＧＡＵＣＡＧＡＣＡＣＣＡＧＧＡＧＣＴＴ−３’（配列表の配列番号１６）の組み合わせからなる。
【０１７８】
培養液を新鮮な０．４ｍｌの１０％ＦＣＳ含有ＲＰＭＩ１６４０培地に交換し、一晩培養した。トリプシン−ＥＤＴＡ溶液（シグマ社製）を用いて細胞を回収し、２ｍｌの１０％ＦＣＳ含有ＲＰＭＩ１６４０培地に懸濁後、９６ウェルプレート（コーニングコースター社製カタログ番号３５９８あるいは３９１７）に０．１ｍｌずつ分注し５％ＣＯ_２、３７℃条件下で培養した。ｓｉＲＮＡを細胞に導入２４時間後及び６日後にＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ^ＴＭＬｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔＣｅｌｌＶｉａｂｉｌｉｔｙＡｓｓａｙ（プロメガ株式会社製）を添付のプロトコールに従い用いて細胞内ＡＴＰを測定した。ネガティブコントロールとしてヒトには存在しないルシフェラーゼ遺伝子に対するｓｉＲＮＡ、ポジティブコントロールとしてヒトの必須遺伝子であるＥｇ５遺伝子に対するｓｉＲＮＡを用いた。
【０１７９】
ルシフェラーゼ用のｓｉＲＮＡのヌクレオチド配列は以下の配列：
５’−ＣＧＵＡＣＧＣＧＧＡＡＵＡＣＵＵＣＧＡＴＴ−３’（配列表の配列番号１７）、
５’−ＵＣＧＡＡＧＵＡＵＵＣＣＧＣＧＵＡＣＧＴＴ−３’（配列表の配列番号１８）の組み合わせからなる。
また、ヒトＥｇ５に対するｓｉＲＮＡのヌクレオチド配列は以下の配列：
５’−ＣＵＧＧＡＵＣＧＵＡＡＧＡＡＧＧＣＡＧＴＴ−３’（配列表の配列番号１９）、
５’−ＣＵＧＣＣＵＵＣＵＵＡＣＧＡＵＣＣＡＧＴＴ−３’（配列表の配列番号２０）の組み合わせからなる。
【０１８０】
ｓｉＲＮＡを細胞に導入した２日後にＲＮｅａｓｙ９６Ｋｉｔ（４）（キアゲン社製）を添付のプロトコールに従い用いて細胞内全ＲＮＡを抽出した。得られた全ＲＮＡをＯｍｎｉｓｃｒｉｐｔＲＴＫｉｔ（５０）（キアゲン社製）を添付のプロトコールに従い用いてｃＤＮＡを合成した。得られたｃＤＮＡをＱｕａｎｔｉＴｅｃｔＳＹＢＲＧｒｅｅｎＰＣＲＫｉｔ−ｆｏｒｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅｒｅａｌ−ｔｉｍｅＰＣＲａｎｄｔｗｏ−ｓｔｅｐＲＴ−ＰＣＲ（キアゲン社製）を添付のプロトコールに従い用いて対象遺伝子の発現量を測定した。この発現量の測定には対象遺伝子内部配列を特異的に増幅することができるオリゴヌクレオチドＤＮＡを用いた。
ＴＲＰＭ４増幅用のＲＴ−ＰＣＲプライマーは、以下の配列：
５’−ＴＴＣＴＣＧＣＣＴＴＣＴＴＴＴＧＣＣＣＴＣＣＡＣＴＣ−３’（プライマー１：配列表の配列番号２１）、
５’−ＡＣＡＣＴＡＴＣＣＡＴＧＴＣＡＡＡＣＴＣＴＡＧＣＴＣＣＴＣＣ−３’（プライマー２：配列表の配列番号２２）からなり、
ＰＬＡ１Ａ増幅用のＲＴ−ＰＣＲプライマーは、以下の配列：
５’−ＡＣＣＣＣＡＣＡＡＴＧＣＣＡＧＡＴＡＡＡＣＣＡＡＧ−３’（プライマー３：配列表の配列番号２３）、
５’−ＴＴＣＡＧＧＴＣＡＣＡＧＧＡＡＡＣＡＧＴＣＡＣＡＣ−３’（プライマー４：配列表の配列番号２４）からなり、
ＢＵＣＳ１増幅用のＲＴ−ＰＣＲプライマーは、以下の配列：
５’−ＡＣＡＡＡＴＣＣＴＴＣＣＡＣＡＡＣＡＴＣＣ−３’（プライマー５：配列表の配列番号２５）、
５’−ＣＣＡＴＴＣＡＣＣＣＡＣＣＡＡＡＡＡＧＣ−３”（プライマー６：配列表の配列番号２６）からなる。
【０１８１】
また、ヒト前立腺癌細胞株ＬＮＣａＰについての結果を表１にまとめた。
【０１８２】
【表１】

【０１８３】
ルシフェラーゼ遺伝子配列に対応するｓｉＲＮＡをヒト前立腺癌細胞株ＬＮＣａＰに導入後１〜６日目までの５日間での細胞増殖率を１００％とした場合、ポジティブコントロールとしてヒトの必須遺伝子であるＥｇ５遺伝子配列に対するｓｉＲＮＡ、ＴＲＰＭ４、ＰＬＡ１ＡおよびＢＵＣＳ１遺伝子配列に対応するｓｉＲＮＡを用いるとそれぞれ３０％±１０％、７２％±１０％、５２％±７％、７２％±１３％（平均±標準偏差（ＳＤ））に細胞増殖率が低下した。ｓｉＲＮＡ導入２日後に実施した遺伝子発現量の測定では、ルシフェラーゼ遺伝子配列に対応するｓｉＲＮＡを導入した場合の遺伝子発現量を１００％とした場合、対象遺伝子ＴＲＰＭ４、ＰＬＡ１ＡおよびＢＵＣＳ１の発現量は、それぞれ２５％、３６％、０％に抑制されていることが示された。対象遺伝子ＴＲＰＭ４、ＰＬＡ１ＡおよびＢＵＣＳ１の発現を抑制することでヒト前立腺癌細胞株ＬＮＣａＰの増殖が抑制されることが示唆された。
【０１８４】
ヒト前立腺癌細胞ＰＣ−３についての結果を表２にまとめた。
【０１８５】
【表２】

【０１８６】
ルシフェラーゼ遺伝子配列に対応するｓｉＲＮＡをヒト前立腺癌細胞株ＰＣ−３に導入後の１〜６日目の５日間での細胞増殖率を１００％とした場合、ＴＲＰＭ４、ＰＬＡ１ＡおよびＢＵＣＳ１遺伝子配列に対応するｓｉＲＮＡを用いるとそれぞれ７１％±１０％，７４％±８％，８５％±１０％に細胞増殖率が低下した。ｓｉＲＮＡ導入２日後に実施した遺伝子発現量の測定では、ルシフェラーゼ遺伝子配列に対応するｓｉＲＮＡ、ＬＵＣを導入した場合の遺伝子発現量を１００％とした場合、対象遺伝子ＴＲＰＭ４、ＰＬＡ１ＡおよびＢＵＣＳ１の発現量は、それぞれ６７％，５１％，０％に抑制されていることが示された。対象遺伝子ＴＲＰＭ４、ＰＬＡ１ＡおよびＢＵＣＳ１の発現を抑制することでヒト前立腺癌細胞株ＰＣ−３の増殖が抑制されることが示唆された。
【０１８７】
【配列表フリーテキスト】
配列番号１１：ＴＲＰＭ４に対するｓｉＲＮＡセンスストランド；
配列番号１２：ＴＲＰＭ４に対するｓｉＲＮＡアンチセンスストランド；
配列番号１３：ＰＬＡ１Ａに対するｓｉＲＮＡセンスストランド；
配列番号１４：ＰＬＡ１Ａに対するｓｉＲＮＡアンチセンスストランド；
配列番号１５：ＢＵＣＳ１に対するｓｉＲＮＡセンスストランド；
配列番号１６：ＢＵＣＳ１に対するｓｉＲＮＡアンチセンスストランド；
配列番号１７：ルシフェラーゼに対するｓｉＲＮＡセンスストランド；
配列番号１８：ルシフェラーゼに対するｓｉＲＮＡアンチセンスストランド；
配列番号１９：Ｅｇ５に対するｓｉＲＮＡセンスストランド；
配列番号２０：Ｅｇ５に対するｓｉＲＮＡアンチセンスストランド；
配列番号２１：ＴＲＰＭ４に対するＲＴ−ＰＣＲ用センスプライマー；
配列番号２２：ＴＲＰＭ４に対するＲＴ−ＰＣＲ用アンチセンスプライマー；
配列番号２３：ＰＬＡ１Ａに対するＲＴ−ＰＣＲ用センスプライマー；
配列番号２４：ＰＬＡ１Ａに対するＲＴ−ＰＣＲ用アンチセンスプライマー；
配列番号２５：ＢＵＣＳ１に対するＲＴ−ＰＣＲ用センスプライマー；
配列番号２６：ＢＵＣＳ１に対するＲＴ−ＰＣＲ用アンチセンスプライマー。
【０１８８】
【配列表】

【０１８９】
【発明の効果】
本発明により、前立腺癌で特異的に発現している、ＴＲＰＭ４、ＰＬＡ１Ａ及びＢＵＣＳ１を見出し、該遺伝子が癌細胞の発生及び／または増殖に関連する遺伝子であることを見出し、該癌遺伝子を用いた前立腺癌の検出方法、前立腺癌治療及び／または予防効果を有する化合物のスクリーニング方法、及び癌治療及び／または予防用医薬組成物を提供することができた。
【図面の簡単な説明】
【図１】ＴＲＰＭ４の前立腺正常組織と腫瘍組織における発現量を示す図。
【図２】ＴＲＰＭ４の各臓器（正常組織）ごとの発現量を示す図。
【図３】ＰＬＡ１Ａの前立腺正常組織と腫瘍組織における発現量を示す図。
【図４】ＰＬＡ１Ａの各臓器（正常組織）ごとの発現量を示す図。
【図５】ＢＵＣＳ１の前立腺正常組織と腫瘍組織における発現量を示す図。
【図６】ＢＵＣＳ１の各臓器（正常組織）ごとの発現量を示す図。[0001]
TECHNICAL FIELD OF THE INVENTION
The present invention relates to a method for detecting prostate cancer using a gene whose expression level is remarkably high in prostate cancer, a method for screening a compound having a therapeutic and / or prophylactic effect for prostate cancer, and a medicament for treating and / or preventing prostate cancer. It relates to compositions and the like.
[0002]
[Prior art]
Cancer remains one of the leading causes of death in developed countries such as Europe, the United States and Japan. Clinically, various medical approaches have been taken, including surgical resection of cancerous tissue, radiation therapy and chemotherapy, but no one based on a sufficiently accurate understanding of malignant transformation and cancer cell growth. Unfortunately, in many cases, the effect is partial and not satisfactory for many patients. With regard to such malignant transformation and cancer cell growth mechanism, intensive research has been carried out in many research facilities over the past several decades. At present, the growth of normal cells is controlled by qualitative and quantitative changes of various genes such as oncogene (Oncogene) (proliferation promoting gene) and tumor suppressor gene (Tumor suppressor gene) (growth inhibiting gene). (For example, see Non-Patent Document 1).
[0003]
Cellular endogenous oncogenes generally do not necessarily have a strong effect of causing normal cells to become cancerous, but if their regulatory functions are lost due to structural mutations, they become oncogenes, which lead to abnormal growth and direct canceration. Cause. For example, Ras, which causes cancer by point mutation, and Abl gene, which causes abnormal enhancement of enzyme activity by chromosomal translocation, are examples. In addition, even without mutation, increased expression of an oncogene often triggers canceration. Increased expression of the growth factor receptor HER2 / neu by gene amplification or the like is induced in metastatic breast cancer, and its inhibitor is used for the treatment of metastatic breast cancer. The above facts strongly suggest the working hypothesis that these oncogenes provide extremely valid target molecules as targets for cancer therapy.
[0004]
Among cancer diseases, prostate cancer is the most frequently diagnosed cancer, especially in the United States, and is the second leading cause of cancer death in men. Approximately 300,000 men are newly diagnosed with prostate cancer each year, and more than 40,000 men die from the disease. Although death from prostate cancer is primarily due to metastatic disease, nearly 60% of newly diagnosed patients have primary tumors confined to the prostate. Surgery and radiation therapy are often effective for patients with such localized cancers, but most are incurable for patients with metastatic spread of cancer. Despite intensive research to date, very little is known about the biological mechanisms that cause the development and progression of prostate cancer.
[0005]
The discovery of genes related to the development and progression of these cancers (including prostate cancer) is extremely useful in elucidating the mechanism and developing therapeutic drugs. In particular, those that can inhibit the growth of cancer cells and induce cell death by inhibiting their molecular functions can be expected as target molecules for new cancer treatments.
[0006]
As an alternative method of knowing the effect of inhibiting the function of a target molecule, a method of reducing the expression of the gene by some method is used. Examples thereof include a method using an antisense oligonucleotide which is a single-stranded DNA having a sequence complementary to the target gene and a ribozyme which is a single-stranded RNA having RNA cleavage activity. In addition to these, recently, RNA interference (RNAi) using double-stranded RNA (dsRNA) has become available (for example, see Non-Patent Document 2).
[0007]
RNA interference (RNAi) is a phenomenon in which homologous mRNAs present in cells are specifically degraded by dsRNA, and was reported as a phenomenon occurring in nematodes for the first time in 1998 (for example, see Non-Patent Document 3). . In mammals, long-chain dsRNA causes an interferon response (for example, see Non-Patent Documents 4 and 5), and it is initially considered difficult to use the RNAi effect as a specific gene suppression technique. However, in 2001, Elbashir et al. Reported that the use of a short dsRNA (siRNA) of 21-23mer, which is an intermediate product of RNAi, could induce the RNAi effect while avoiding the interferon response (for example, see Non-Patent Documents). 6)), RNAi using this siRNA has attracted attention as an unprecedented simple and powerful method for suppressing gene expression.
[0008]
Homo sapiens transient receptor potential cation channel, subfamily M, member 4 (hereinafter referred to as "TRPM4") was first cloned by Xu et al. As a channel-like molecule expressed in the heart, prostate, and large intestine, and was converted to a single-chain (PM) 4a (TR). And a long-chain type (TRPM4b) are reported to exist (for example, see Non-Patent Document 7). Laubary et al. Report that TRPM4b transmits sodium and potassium ions instead of calcium and that channels are opened by stimulation by mobilization of calcium ions (for example, see Non-Patent Document 8). TRPM4, also called TRP9, has been shown to be expressed in the prostate, but it has been reported that there is no difference in the expression level between normal prostate and prostate cancer (eg, Patent Document 1), and the relationship between its function and cancer has not been clarified at all.
[0009]
Homo sapiens phospholipase A1 member A (hereinafter referred to as “PLA1A”) is a protein purified and identified by Sato et al. From thrombin-stimulated culture supernatant of rat platelets, such as phosphatidylserine or lysophosphatidylserine. It is known that it acts specifically on serine phospholipids and acts as a lipase that cleaves fatty acids (for example, see Non-Patent Document 9). The human ortholog gene was cloned from human liver by Nagai et al. (For example, see Non-Patent Document 10). In the rat, although abundantly expressed in platelets, it is scarcely present in human platelets, and expression is observed in various organs.
[0010]
In a cell, phosphatidylserine is a protein kinase C (for example, see Non-Patent Document 11), c-raf-1 (for example, see Non-Patent Document 12), a nitric oxide synthase (for example, Non-Patent Document 12). Reference 13), Na + / K + -ATPase (for example, see Non-patent Document 14), GTPase (for example, see Non-Patent Document 15), and diacylglycerol kinase (see, for example, Non-Patent Document 16). ) Is known to be controlled. On the other hand, extracellularly, it is known to activate the blood coagulation reaction (for example, see Non-Patent Document 17) and the phagocytic activity of macrophages (for example, see Non-Patent Document 18), and it is a degrading enzyme. PLA1A is expected to act to suppress the action of these phosphatidylserines (for example, see Non-Patent Document 19). Lysophosphatidylserine transiently increases the intracellular calcium concentration of human ovarian and breast cancer cell lines (see, for example, Non-Patent Document 20), and also intracellularly expresses lymphoma cell line Jurkat T cells. There is a report that calcium concentration is increased (for example, see Non-Patent Document 21). It has also been reported that keratinocytes enhance their cell proliferation (for example, see Non-Patent Document 22). Regarding the association with cancer, Van Groningen et al. Reported that they were the same as the gene nmd1 (for example, see Non-Patent Document 23), which was isolated as a gene whose metastasis and its expression were inversely correlated. Except for the above, there are no reports pointing out the association with cancer cells, and the relationship between its function and cancer, particularly prostate cancer, has not been clarified (for example, see Patent Document 2).
[0011]
Homo sapiens butyryl Coenzyme A synthase 1 (hereinafter referred to as “BUCS1”) is a oxidase that is involved in the oxidation of octanoate, specifically, octanoate of carbon chain 8 among fatty acids having 4 to 16 carbon chains by Fijino et al. It was identified (for example, see Non-Patent Document 24). The expression of the BUCS1 gene is mainly observed in the liver and kidney, and it has been reported that it is localized in the mitochondrial matrix, which is considered to contribute to the production of acyl-CoA. Although it has been reported that the expressed sequence tag (EST) of this enzyme is highly expressed in prostate cancer (for example, see Patent Document 3), the relationship between this enzyme and prostate cancer has not been clarified. .
[0012]
[Patent Document 1]
WO02 / 10382 pamphlet
[Patent Document 2]
WO 00/24911 pamphlet
[Patent Document 3]
International Publication No. 01/60860 pamphlet
[Non-patent document 1]
Y. Niitsu and Atsushi Yokota, "Cancer Genes / Tumor Suppressor Genes for Clinicians," Nankodo, October 16, 1999, P.S. 1-46
[Non-patent document 2]
Kazumasa Tahira, ed., “Experimental method for inhibiting gene function”, Youtosha, September 20, 2001, p. 190-203
[Non-Patent Document 3]
"Nature", February 19, 1998, Vol. 391, No. 6669, p. 806-811
[Non-patent document 4]
"Microbiology and Molecular Biology Reviews", December 1998, Vol. 62, No. 4, p. 1415-1434
[Non-Patent Document 5]
"The International Journal of Biochemistry and Cell Biology", 1997, July, Vol. 29, No. 7, p. 945-949
[Non-Patent Document 6]
"Jeans and Developments", January 15, 2001, Vol. 15, No. 2, p. 188-200
[Non-Patent Document 7]
"Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of the United States, 9/200", "Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America," Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 11, Vol. 98, No. 19, p. 10692-10697
[Non-Patent Document 8]
"Cell", May 3, 2002, Vol. 109, No. 3, p. 397-407
[Non-Patent Document 9]
"Journal of Biological Chemistry", January 24, 1997, Vol. 272, No. 4, p. 2192-2198
[Non-Patent Document 10]
"Journal of Biological Chemistry", April 16, 1999, Vol. 274, No. 16, p. 11053-11959
[Non-Patent Document 11]
"Science", Oct. 23, 1992, Vol. 258, No. 5082, p. 607-614)
[Non-Patent Document 12]
"Journal of Biological Chemistry", April 1, 1994, Vol. 269, No. 13, p. 10,000-10007
[Non-patent document 13]
"Journal of Experimental Medicine", September 1, 1994, Volume 180, Issue 3, p. 945-958
[Non-patent document 14]
"Advances in Experimental Medicine and Biology", August 13, 1992, Vol. 318, p. 325-330
[Non-Patent Document 15]
"Journal of Biological Chemistry", August 15, 1993, Vol. 268, No. 23, p. 17240-17246
[Non-Patent Document 16]
"Journal of Biological Chemistry", April 15, 1991, Vol. 266, No. 11, p. 7096-7100
[Non-Patent Document 17]
"Annual Review of Biochemistry", 1988, vol. 57, p. 915-956
[Non-Patent Document 18]
"Journal of Biological Chemistry", March 25, 1990, Vol. 265, No. 9, p. 5226-5231
[Non-Patent Document 19]
"Protein Nucleic Acid Enzyme," May 23, 1999, Volume 44, Volume 8, p. 1038-1042
[Non-Patent Document 20]
"Clinical Cancer Research", October 1995, Vol. 1, No. 10, p. 1223-1232
[Non-Patent Document 21]
"Journal of Cell Physiology", June 1995, Vol. 163, No. 3, p. 441-450
[Non-Patent Document 22]
"American Journal of Physiology", April 1998, Vol. 274, No. 4, Part 1, p. C1065-C1074
[Non-Patent Document 23]
"Cancer Research", December 15, 1995, Vol. 55, No. 24, p. 6237-6243
[Non-Patent Document 24]
"Journal of Biological Chemistry", September 21, 2001, Vol. 276, No. 38, p. 35561-35966
[0013]
[Problems to be solved by the invention]
The present invention finds a gene associated with the development and / or proliferation of prostate cancer cells, detects prostate cancer using the oncogene, screens a compound having a therapeutic and / or preventive effect on prostate cancer, and prostate An object of the present invention is to provide a pharmaceutical composition for treating and / or preventing cancer.
[0014]
[Means for Solving the Problems]
The present inventors have found TMPM4, PLA1A and BUCS1 as genes having higher expression levels in prostate cancer among genes having higher expression levels in prostate compared to other tissues. They found that they could suppress cell proliferation, developed a method for detecting prostate cancer, and a method for screening a compound having a novel therapeutic and / or prophylactic effect using the gene, and further suppressed the expression of the gene. And completed the present invention.
That is, the present invention
(1) A method for detecting prostate cancer, comprising the following steps 1) to 4):
1) a step of extracting a total RNA fraction from a sample collected from a subject;
2) a step of extracting a total RNA fraction from a sample collected from a normal person;
3) the polynucleotide or the partial polynucleotide thereof according to any one of the following (1) to (3) in the total RNA fraction derived from the above step 1) and the total RNA fraction derived from the above step 2) Measuring the expression level;
(1) selected from the group consisting of a polynucleotide consisting of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing, a polynucleotide consisting of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 3 and a polynucleotide consisting of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 5 At least one polynucleotide,
(2) a polynucleotide having a nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 7 in the sequence listing,
(3) a polynucleotide having a nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 9 in the sequence listing,
4) Analyze the difference in the expression level of the polynucleotide measured in the above step 3) between the total RNA fraction derived from the above step 1) and the total RNA fraction derived from the above step 2). The step of detecting prostate cancer in the subject according to,
(2) A method for detecting prostate cancer, comprising the following steps 1) to 3):
1) a step of measuring the expression level of a protein or a partial polypeptide thereof according to any one of the following (1) to (3) in a sample collected from a subject;
(1) at least one selected from the group consisting of a protein consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2, a protein consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 4 and a protein consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 6 in the sequence listing One protein,
(2) a protein consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 8 in the sequence listing,
(3) a protein comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 10 in the sequence listing,
2) a step of measuring the expression level of the protein according to any one of (1) to (3) of the above step 1) in a sample collected from a normal person;
3) analyzing the difference between the expression level of the protein detected in the above step 1) and the expression level of the protein detected in the above step 2) to detect prostate cancer in the subject or test animal;
(3) A method for screening a substance having a therapeutic effect and / or a preventive effect on prostate cancer, comprising the following steps 1) to 4):
1) a step of extracting a total RNA fraction from mammalian-derived cultured cells cultured in a medium to which a test substance has been added;
2) Step of extracting total RNA fraction from mammalian-derived cultured cells cultured without adding a test substance:
3) the polynucleotide or the partial polynucleotide thereof according to any one of the following (1) to (3) in the total RNA fraction derived from the above step 1) and the total RNA fraction derived from the above step 2) Measuring the expression level;
(1) selected from the group consisting of a polynucleotide consisting of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing, a polynucleotide consisting of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 3 and a polynucleotide consisting of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 5 At least one polynucleotide,
(2) a polynucleotide having a nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 7 in the sequence listing,
(3) a polynucleotide having a nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 9 in the sequence listing,
4) Analyze the difference in the expression level of the polynucleotide measured in the above step 3) between the total RNA fraction derived from the above step 1) and the total RNA fraction derived from the above step 2). Determining the therapeutic and / or prophylactic effect on prostate cancer,
(4) A method for screening a substance having a therapeutic and / or prophylactic effect on prostate cancer, comprising the following steps 1) to 4):
1) a step of extracting a total RNA fraction from a specimen collected from a mammal individual to which the test substance has been administered;
2) a step of extracting a total RNA fraction from a specimen collected from a mammal individual to which the test substance has not been administered;
3) the polynucleotide or the partial polynucleotide thereof according to any one of the following (1) to (3) in the total RNA fraction derived from the above step 1) and the total RNA fraction derived from the above step 2) Measuring the expression level;
(1) selected from the group consisting of a polynucleotide consisting of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing, a polynucleotide consisting of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 3 and a polynucleotide consisting of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 5 At least one polynucleotide,
(2) a polynucleotide having a nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 7 in the sequence listing,
(3) a polynucleotide having a nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 9 in the sequence listing,
4) The difference in the expression level of the polynucleotide measured in the above step 3) between the total RNA fraction derived from the above step 1) and the total RNA fraction derived from the above step 2) is analyzed, and the test substance prostate is analyzed. A step of determining a therapeutic effect and / or a preventive effect on cancer;
(5) A method for screening a substance having a therapeutic and / or prophylactic effect on prostate cancer, comprising the following steps 1) to 3):
1) a step of measuring the expression level of a protein or a partial polypeptide thereof according to any one of the following (1) to (3) in cultured cells derived from a mammal cultured in a medium to which a test substance is added;
(1) at least one selected from the group consisting of a protein consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2, a protein consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 4 and a protein consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 6 in the sequence listing One protein,
(2) a protein consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 8 in the sequence listing,
(3) a protein comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 10 in the sequence listing,
2) Specific binding of the expression level of the protein according to any one of (1) to (3) of the above step 1) to cultured proteins derived from mammals cultured in a medium to which the test substance is not added. Detecting with an antibody or ligand that performs the detection;
3) Analyze the difference between the expression level of the protein detected in the above step 1) and the expression level of the protein detected in the above step 2) to determine the therapeutic and / or prophylactic effect of the test substance on prostate cancer. Process,
(6) A method for screening a substance having a therapeutic and / or prophylactic effect on prostate cancer, comprising the following steps 1) to 3):
1) a step of measuring the expression level of a protein or a partial polypeptide thereof according to any one of the following (1) to (3) in a specimen collected from a mammalian individual to which a test substance has been administered;
(1) at least one selected from the group consisting of a protein consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2, a protein consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 4 and a protein consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 6 in the sequence listing One protein,
(2) a protein consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 8 in the sequence listing,
(3) a protein comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 10 in the sequence listing,
2) The amount of expression of the protein or its partial polypeptide according to any one of (1) to (3) in the above step 1) is measured in a sample collected from a mammal individual to which the test substance has not been administered. Process;
3) Analyze the difference between the expression level of the protein detected in the above step 1) and the expression level of the protein detected in the above step 2) to determine the therapeutic and / or prophylactic effect of the test substance on prostate cancer. Process,
(7) Transient receptor potential cation channel, subfamily M, inhibits the cation permeation channel of member 4 (transient receptor potential channel, subfamily M, member 4: hereinafter referred to as "TRPM4"). A method for determining a substance having a therapeutic effect and / or a prophylactic effect on prostate cancer, characterized by identifying the substance and comprising the following steps 1) to 3):
1) supplying a cell expressing TRPM4 on the cell surface;
2) Ca ²⁺ Contacting the test substance with the cell according to 1) in the presence of
3) a step of determining whether the uptake of cations into cells is reduced (where the decrease in uptake of cations into cells indicates that the test substance inhibits the cation permeation channel of TRPM4) It indicates that.)
(8) A method for determining a substance having a therapeutic effect and / or a prophylactic effect on prostate cancer, comprising identifying a substance that inhibits phospholipase A1 activity and comprising the following steps 1) and 2): :
1) contacting the substrate of phospholipase A1 member A with phospholipase A1 member A with a test substance;
2) a step of determining whether the activity of hydrolyzing the substrate in the presence of the test substance is reduced (where the decrease in the activity of hydrolyzing the substrate means that the test substance inhibits the phospholipase A1 activity) .),
(9) Identifying a substance that inhibits the acyl-CoA synthesis activity of butyryl coenzyme A synthetase 1: (hereinafter referred to as “BUCS1”); 2) A method for determining a substance having a therapeutic effect and / or a prophylactic effect on prostate cancer, comprising:
1) contacting the BUCS1 substrate with BUCS1 with a test substance;
2) A step of determining whether the amount of acyl-CoA synthesis decreases in the presence of the test substance (where the decrease in the amount of acyl-CoA synthesis indicates that the test substance reduces the acyl-CoA synthesis activity of BUCS1). Inhibition.),
(10) The method for measuring the expression level of a polynucleotide is a Northern blot method, a dot blot method, a slot blot method, an RT-PCR, a ribonuclease protection assay, or a run-on assay. And the method according to any one of 4 and 4,
(11) The method for measuring the expression level of a polynucleotide uses a gene chip or an array prepared from a DNA consisting of a complementary DNA group derived from animal tissues or animal cells or a partial sequence of each DNA of the DNA group. The method according to any one of

claims

1, 3 and 4, wherein
(12) The method according to any one of (2), (5) and (6), wherein the method for measuring the expression level of the protein uses an antibody or a ligand that specifically binds to the protein. Method,
(13) (2), (5), and (5), wherein the method of measuring the expression level of the protein is Western blotting, dot blotting, slot blotting or enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). The method according to any one of (6),
(14) A kit for determining a therapeutic effect and / or a preventive effect of a test substance on prostate cancer, comprising at least one selected from the group consisting of the following 1) to 3):
1) a polynucleotide consisting of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing, a polynucleotide consisting of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 3, a polynucleotide consisting of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 5, and a polynucleotide consisting of SEQ ID NO: 7 A continuous oligo of 15 to 30 bases in length for specifically amplifying at least one polynucleotide selected from the group consisting of a polynucleotide consisting of a nucleotide sequence and a polynucleotide consisting of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 9 Nucleotide primers;
2) a polynucleotide consisting of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing, a polynucleotide consisting of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 3, a polynucleotide consisting of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 5, and a polynucleotide consisting of SEQ ID NO: 7 Hybridize under stringent conditions to at least any one polynucleotide selected from the group consisting of a polynucleotide consisting of a nucleotide sequence and a polynucleotide consisting of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 9, and detect the polynucleotide A continuous polynucleotide probe of 15 nucleotides or more for:
3) a polynucleotide consisting of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1 of the sequence listing, a polynucleotide consisting of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 3, a polynucleotide consisting of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 5, and shown in SEQ ID NO: 7 A solid-phased sample on which at least one polynucleotide selected from the group consisting of a polynucleotide consisting of a nucleotide sequence and a polynucleotide consisting of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 9 is fixed,
(15) A kit for determining a therapeutic effect and / or a preventive effect of a test substance on prostate cancer, comprising at least one of the following 1) and 2):
1) a protein consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 of the sequence listing, a protein consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 4, a protein consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 6, and a protein consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 8 An antibody which specifically binds to at least one protein selected from the group consisting of a protein consisting of a protein consisting of a protein consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 10 and detecting the protein;
2) a secondary antibody capable of binding to the antibody of 1) above;
(16) A kit for detecting prostate cancer, comprising at least one selected from the group consisting of the following 1) to 3):
1) a polynucleotide consisting of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing, a polynucleotide consisting of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 3, a polynucleotide consisting of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 5, and a polynucleotide consisting of SEQ ID NO: 7 A continuous oligo of 15 to 30 bases in length for specifically amplifying at least one polynucleotide selected from the group consisting of a polynucleotide consisting of a nucleotide sequence and a polynucleotide consisting of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 9 Nucleotide primers;
2) a polynucleotide consisting of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing, a polynucleotide consisting of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 3, a polynucleotide consisting of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 5, and a polynucleotide consisting of SEQ ID NO: 7 Hybridize under stringent conditions to at least any one polynucleotide selected from the group consisting of a polynucleotide consisting of a nucleotide sequence and a polynucleotide consisting of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 9, and detect the polynucleotide A continuous polynucleotide probe of 15 nucleotides or more for:
3) a polynucleotide consisting of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1 of the sequence listing, a polynucleotide consisting of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 3, a polynucleotide consisting of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 5, and shown in SEQ ID NO: 7 A solid-phased sample on which at least one polynucleotide selected from the group consisting of a polynucleotide consisting of a nucleotide sequence and a polynucleotide consisting of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 9 is fixed,
(17) A kit for detecting prostate cancer, comprising at least one of the following 1) and 2):
1) a protein consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 of the sequence listing, a protein consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 4, a protein consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 6, and a protein consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 8 An antibody which specifically binds to at least one protein selected from the group consisting of a protein consisting of a protein consisting of a protein consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 10 and detecting the protein;
2) a secondary antibody capable of binding to the antibody of 1) above;
(18) Treatment and / or prevention of prostate cancer containing an oligonucleotide having any one nucleotide sequence selected from the group consisting of the following 1) to 5) or a nucleotide sequence complementary to a partial sequence thereof: Pharmaceutical composition for:
1) a nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1 in the sequence listing;
2) a nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 3 in the sequence listing;
3) a nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 5 in the sequence listing;
4) a nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 7 in the sequence listing;
5) a nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 9 in the sequence listing,
(19) a protein consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 in the sequence listing, a protein consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 4, a protein consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 6, and an amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 8 For treating and / or preventing prostate cancer, comprising an antibody that specifically recognizes at least one protein selected from the group consisting of a protein consisting of a protein consisting of: and a protein consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 10. ,
Consists of
[0015]
BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION
As used herein, the term “compound having a therapeutic and / or prophylactic effect for prostate cancer” refers to an activity of inhibiting the growth of prostate cancer, an activity of reducing prostate cancer, and / or an activity of preventing the development of prostate cancer. Refers to a compound having In this specification, “cancer” and “tumor” are used interchangeably. In this specification, the term "gene" includes not only DNA but also its mRNA, cDNA and its cRNA. Therefore, the TRPM4 gene, PLA1A gene and BUCS1 gene in the present invention include the DNA, mRNA, cDNA and cRNA of TRPM4, PLA1A and BUCS1. In the present specification, the term "polynucleotide" is used synonymously with nucleic acid, and also includes DNA, RNA, probes, oligonucleotides, and primers. In the present specification, "polypeptide" and "protein" are used without distinction. Further, in the present specification, the “RNA fraction” refers to a fraction containing RNA. In addition, in the present specification, “cells” include cells in animal individuals and cultured cells. As used herein, "cancer of a cell" refers to a cell exhibiting abnormal proliferation, such as a cell losing sensitivity to a contact inhibition phenomenon, or exhibiting anchorage-independent proliferation, Cells showing such abnormal growth are called "cancer cells". As used herein, “substantially the same protein” as each of TRPM4, PLA1A, and BUCS1 refers to a protein that has the same function as TRPM4, PLA1A, and BUCS1, and has the same function as canceration of cells. The term oncogene in the present invention includes proto-oncogene and proto-oncogene in addition to oncogene.
[0016]
1. Detect genes with high expression in prostate cancer
Analysis of the expression levels of TRPM4, PLA1A and BUCS1 genes in prostate-derived / normal tissue samples and prostate-derived / tumor samples revealed that the present inventors have significantly higher expression levels in prostate-derived tumors. Further, in comparison between normal various organs and tissues, the present inventors have found that the expression levels of the TRPM4, PLA1A and BUCS1 genes are significantly lower in other tissues than in the prostate. TRPM4 includes a long-chain type (TRPM4b) and a single-chain type (TRPM4a), and a single-chain type further includes a splicing variant. In this specification, the term “TRPM4” is particularly used. These are used without distinction unless otherwise limited. The nucleotide sequence of the cDNA of TRPM4b is shown in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing, its open reading frame (ORF) is shown in nucleotides 73 to 3714 of SEQ ID NO: 1, and the amino acid sequence is shown in the sequence listing. This is shown at number 2. The nucleotide sequence of the cDNA of TRPM4a is shown in SEQ ID NO: 3 in the sequence listing, its ORF is shown in nucleotide numbers 223 to 3342 of SEQ ID NO: 3, and the amino acid sequence is shown in SEQ ID NO: 4 in the sequence listing . The nucleotide sequence of the cDNA of the splicing variant of TRPM4a is shown in SEQ ID NO: 5 in the sequence listing, its ORF is shown in nucleotide numbers 324 to 3371 of SEQ ID NO: 5, and the amino acid sequence is shown in SEQ ID NO: 6 in the sequence listing. It is shown. The nucleotide sequence of the cDNA of PLA1A is shown in SEQ ID NO: 7 in the sequence listing, its open reading frame (ORF) is shown in nucleotides 32 to 1399 of SEQ ID NO: 7, and the amino acid sequence is shown in the sequence listing. This is shown at number 8. The nucleotide sequence of the cDNA of BUCS1 is shown in SEQ ID NO: 9 in the sequence listing, its open reading frame (ORF) is shown in nucleotides 69 to 1799 of SEQ ID NO: 9, and the amino acid sequence is as shown in the sequence listing. This is shown at number 10. In addition, the gene of TRPM4b is registered in GenBank as Homo sapiens transient receptor potential cation channel, subfamily M, member 4 (TRPM4), mRNA (accession number: NM_017636). The gene for TRPM4a is described in GenBank in Homo sapiens TRP-related cation influx channel (TRPM4) mRNA, complete cds. (Accession number: AY046396). The gene for the splicing variant of TRPM4a is described in GenBank in Homo sapiens cDNA FLJ20041 fis, clone COL00423. (Accession number: AK000048). The PLA1A gene has been registered in GenBank as Homo sapiens phospholipase A1 member A (PLA1A), mRNA (accession number: NM_015900). BUCS1 is registered in GenBank as Homo sapiens butyryl Coenzyme A synthase 1 (BUCS1), mRNA (accession number: NM_052956).
[0017]
In the present specification, the term "TRPM4 gene" refers to a polynucleotide consisting of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing, a polynucleotide consisting of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 3, and a nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 5 Or a polynucleotide consisting of a nucleotide sequence complementary to a polynucleotide consisting of said nucleotide sequence. In the present specification, the “PLA1A gene” refers to a polynucleotide consisting of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 7 in the sequence listing, or a polynucleotide consisting of a nucleotide sequence complementary to the polynucleotide consisting of the nucleotide sequence. . As used herein, the term "BUCS1 gene" refers to a polynucleotide consisting of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 9 in the sequence listing, or a polynucleotide consisting of a nucleotide sequence complementary to the polynucleotide consisting of the nucleotide sequence. . In this specification, “TRPM4” refers to a protein consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 in the sequence listing, a protein consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 4 in the sequence listing, and SEQ ID NO: 6 in the sequence listing. At least one of the proteins consisting of the amino acid sequence shown in the above, an amino acid sequence in which one or several amino acids have been deleted, substituted or added in the amino acid sequence of the protein; A protein having a function as an ion permeation channel. "PLA1A" is a protein consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 8 in the sequence listing, or an amino acid sequence in which one or several amino acids are deleted, substituted or added in the amino acid sequence of the protein, In addition, it refers to a protein having phospholipase A1 activity. "BUCS1" refers to a protein consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 10 in the sequence listing, or an amino acid sequence in which one or several amino acids are deleted, substituted or added in the amino acid sequence of the protein, In addition, it refers to a protein having acyl-CoA synthetase activity.
[0018]
2. Prostate cancer detection method
Since TRPM4, PLA1A and BUCS1 are highly expressed in the prostate, especially in prostate cancer, they are considered to be involved in canceration of the prostate and / or proliferation of cancer cells. The “specimen” refers to blood, body fluid, prostate, testis, penis, bladder, kidney, oral cavity, pharynx, lips, tongue, gingiva, nasopharynx, esophagus, stomach, small intestine obtained from a subject or clinical specimen, etc. , Large intestine, colon, liver, gallbladder, pancreas, nose, lung, bone, soft tissue, skin, breast, uterus, ovary, brain, thyroid, lymph node, muscle, adipose tissue, etc., part of tissue or excrement In the present invention, the prostate or a part of the prostate is more preferable.
[0019]
(1) A method for detecting prostate cancer using the expression level of at least one gene selected from the TRPM4 gene, PLA1A gene and BUCS1 gene
Specifically, a method for detecting prostate cancer using the expression level of at least one gene selected from the TRPM4 gene, PLA1A gene and BUCS1 gene is a method including the following steps 1) to 4).
1) a step of extracting a total RNA fraction from a sample collected from a subject;
2) a step of extracting a total RNA fraction from a sample collected from a normal person;
3) a step of measuring the expression level of at least one gene selected from the TRPM4 gene, PLA1A gene and BUCS1 gene in the total RNA fraction described in the above step 1) and the total RNA fraction described in the above step 2);
4) Analyze the difference in the expression level of the gene measured in the above step 3) between the total RNA fraction derived from the above step 1) and the total RNA fraction derived from the above step 2). Detecting prostate cancer in the subject.
Hereinafter, each step will be described specifically.
[0020]
(1) Step 1) a step of extracting a total RNA fraction from a sample collected from a subject;
When extracting a total RNA fraction from a sample, a human-derived tissue obtained by a method suitable for ethical standards of an appropriate experiment is used to extract a solvent for RNA extraction (for example, phenol or a component having an action of inactivating ribonuclease). ) Or by carefully scraping with a scraper or gently extracting the cells from the tissue with a protease such as trypsin so as not to destroy the cells of the tissue. After the cells are collected, the process immediately proceeds to the RNA extraction step.
[0021]
RNA extraction methods include guanidine thiocyanate / cesium chloride ultracentrifugation method, guanidine thiocyanate / hot phenol method, guanidine hydrochloride method, guanidine thiocyanate / phenol / chloroform method (Chomczynski, P. and Sacchi, N., Anal). Biochem. (1987), 162, 156-159), but the guanidine acid thiocyanate-phenol-chloroform method is preferred. In addition, commercially available reagents for RNA extraction (for example, ISOGEN (manufactured by Nippon Gene Co., Ltd.), TRIZOL reagent (manufactured by Gibco BRL)) and the like can also be used according to the protocol attached to the reagent.
[0022]
It is preferable that the obtained total RNA fraction is further purified and used only for mRNA if necessary. The purification method is not particularly limited. For example, mRNA is adsorbed to a biotinylated oligo (dT) probe, and further, the mRNA is captured on the paramagnetic particles on which streptavidin is immobilized using the binding between biotin / streptavidin. After the washing operation, the mRNA can be purified by eluting the mRNA. Alternatively, a method in which mRNA is adsorbed on an oligo (dT) cellulose column and then eluted and purified may be employed. However, for the method of the present invention, the step of purifying these mRNAs is not essential, and the total RNA fraction can be used in subsequent steps as long as the expression of the polynucleotide to be detected can be detected. .
[0023]
{Circle around (2)} Step 2) Step of extracting total RNA fraction from a sample collected from a normal person:
In the present invention, a normal person means a person who does not have cancer. Whether the subject is a normal person or not is determined by measuring the expression level of at least one gene selected from the TRPM4 gene, PLA1A gene and BUCS1 gene, and determining whether the value falls within a numerical range determined in advance as a normal person value. Alternatively, it can be determined that the expression is within a normal range by previously examining the correlation between the expression levels of the TRPM4 gene, PLA1A gene, and BUCS1 gene and the degree of formation of prostate cancer. The preparation of the total RNA fraction from a normal person can be performed in the same manner as in the above step 1).
[0024]
{Circle around (3)} Step 3) Determine the expression level of at least one gene selected from the TRPM4 gene, PLA1A gene and BUCS1 gene in the total RNA fraction described in step 1) and the total RNA fraction described in step 2). Measurement process:
As a method for measuring the expression level of at least one gene selected from the TRPM4 gene, the PLA1A gene and the BUCS1 gene, a measurement method using a solid-phased sample and some other measurement methods will be described.
[0025]
(A) Measurement method using solid-phased sample
(I) Immobilized sample
Examples of the immobilized sample include the following.
[0026]
(A) Gene chip:
A gene chip on which an antisense oligonucleotide synthesized based on an EST (expressed sequence tag) sequence or an mRNA sequence on a database can be used. As such a gene chip, a gene chip manufactured by Affymetrix (Lipshutz, RJ et al., Nature Genet. (1999) 21, suppliment, 20-24) can be used. The present invention is not limited to this, and may be manufactured based on a known method. When analyzing mRNA derived from human cells, those derived from human are preferable. For example, human U95 set or U133 set manufactured by Affymetrix can be used. However, the present invention is not limited thereto, and for example, those derived from animals of closely related species can also be used.
[0027]
(B) An array or a membrane filter in which cDNA or RT-PCR product prepared from human, total RNA or total RNA obtained from a specific tissue is immobilized:
The cDNA or the RT-PCR product is cloned by performing a reverse transcriptase reaction or PCR with a primer prepared based on sequence information of a human EST database or the like. This cDNA or RT-PCR product can be obtained by subtracting total RNA having different expression levels between humans who have tumors in advance and those who do not have tumors by the subtraction method (Diatchenki, L, et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, (1996) 93, 6025-6030), and a differential display method (Liang, P., et al Nucleic Acids Res., (1992) 23, 3684-3690). . In addition, a commercially available array (eg, Intelligene: manufactured by Takara Bio Inc.) may be used as the array or filter, or the above cDNA or RT-PCR product may be obtained using a commercially available spotter (eg, GMS417 Alayer: Takara Bio Inc.). And the like.
[0028]
(Ii) Preparation and analysis of probe
The labeling probe used is not a specific mRNA clone but a label of all expressed mRNAs. Although unpurified mRNA may be used as a starting material for preparing a probe, it is preferable to use poly (A) + RNA purified by the above-described method. Hereinafter, a method for preparing a labeled probe and a method for detecting and analyzing a labeled probe when various types of immobilized samples are used will be described.
[0029]
(B) Gene chip manufactured by Affymetrix:
A biotin-labeled cRNA probe is prepared according to a protocol (Affymetrix Expression Analysis Technical Manual) attached to a gene chip manufactured by Affymetrix. Then, according to the protocol (expression analysis technology manual) attached to the gene chip manufactured by Affymetrix, hybridization and analysis were performed using an analysis device (GeneChip Fluidics Station 400) manufactured by Affymetrix, and the emission by avidin was detected and analyzed. Do.
[0030]
(B) Array:
Poly (A) by reverse transcriptase reaction ⁺ When preparing cDNA from RNA, it is necessary to label the cDNA so that the cDNA can be detected. When labeling with a fluorescent dye, the cDNA is labeled with a fluorescent dye (for example, Cy3, Cy5, etc.). The cDNA is fluorescently labeled by adding d-UTP or the like. At this time, poly (A) derived from prostate cancer cells ⁺ RNA and poly (A) from control cells ⁺ If the RNAs are labeled with different dyes, both can be mixed and used in the subsequent hybridization. For example, when a commercially available array of Takara Bio Inc. is used as the array, hybridization and washing are performed according to the company's protocol, and a fluorescent signal detector (for example, GMS418 array scanner (manufactured by Takara Bio Inc.) or the like) is used. After detecting the fluorescent signal, analysis is performed. However, the array to be used is not limited to a commercially available array, and may be a homemade array or a specially manufactured array.
[0031]
(C) Membrane filter:
Poly (A) with reverse transcriptase ⁺ When preparing cDNA from RNA, a labeled probe is prepared by adding a radioisotope (for example, d-CTP or the like), and hybridization is performed by a conventional method. For example, a commercially available filter microarray, Atlas System After performing hybridization and washing using (Clontech), detection and analysis are performed using an analyzer (for example, Atlas image: Clontech).
[0032]
In each of the methods (a) to (c), a probe derived from each human tissue is hybridized to the solid-phased sample of the same lot. At this time, the conditions other than the hybridization other than the probe to be used are the same. When fluorescently labeled probes are used, by labeling each probe with a different fluorescent dye, a mixture of both probes can be hybridized at once to one immobilized sample, and the fluorescence intensity can be read (Brown, PO et al. Nature Genet., (1999) 21, supplement, pp. 33-37).
[0033]
(B) Other measurement methods
As other measurement methods, subtraction cloning method (see Experimental Medicine Separate Volume New Genetic Engineering Handbook, published by Yodosha (1996), pp. 32-35), differential display method (Basic Biochemical Experiment Method 4 Nucleic Acid / Gene Experiment II. Ed., Tokyo Kagaku Dojin (2001), p125-128), a method using a reporter gene (chloramphenicol acetyltransferase (for example, pCAT3-Basic vector: manufactured by Promega) or β-galactosidase (for example, pβgal -Basic: manufactured by Promega, secretory alkaline phosphatase (for example, pSEAP2-Basic: used by Clontech), green-fluorescent protein (for example, pEGFP-) 1: Use of Clontech Co.))), but is not limited thereto.
[0034]
{Circle around (4)} Step 4) Analyze the difference in the expression level of the gene measured in the above step 3) between the total RNA fraction derived from the above step 1) and the total RNA fraction derived from the above step 2). The step of detecting prostate cancer in a subject according to step 1).
[0035]
Analyzing the difference in the expression level of at least one gene selected from TRPM4, PLA1A and BUCS1 between a sample derived from a normal person and a sample derived from a subject, and selected from the TRPM4 gene, PLA1A gene and BUCS1 gene In a sample in which the expression level of at least one gene is significantly increased, it is possible to determine that there is a high possibility that cancer, especially prostate cancer, is present, and it is possible to detect prostate cancer. The expression level is significantly increased, for example, by using a gene chip of Affymetrix Co., Ltd., and using Microarray Suite Ver. When analyzed using 3.0, it means that the gene expression level (Average difference value) of the gene derived from prostate cancer cells is significantly increased as compared to normal prostate cells. The detection can be performed by individually evaluating the expression level of any one gene selected from the TRPM4 gene, the PLA1A gene and the BUCS1 gene, and the expression of the TRPM4 gene, the PLA1A gene, and the BUCS1 gene. The amount can be evaluated comprehensively.
[0036]
In addition, the concentrations of the TRPM4, PLA1A and BUCS1 genes are measured, and whether or not they fall within a numerical range determined in advance as normal values is analyzed. Can detect prostate cancer by judging that the subject has prostate cancer, and by previously examining the correlation between the expression levels of TRPM4, PLA1A and BUCS1 genes and the degree of prostate cancer formation in normal subjects, By measuring the expression levels of the TRPM4, PLA1A, and BUCS1 genes in a sample collected from a subject, it is also possible to determine whether or not the subject has prostate cancer.
[0037]
(2) A method for detecting prostate cancer using the expression level of at least one protein selected from TRPM4, PLA1A and BUCS1
A method for detecting prostate cancer using the expression level of at least one protein selected from TRPM4, PLA1A and BUCS1 is a method including the following steps 1) to 3).
1) A step of measuring the expression level of at least one protein of TRPM4, PLA1A and BUCS1 in a sample collected from a subject:
2) a step of measuring the expression level of the protein according to 1) in a sample collected from a normal person:
3) a step of analyzing the difference between the expression level of the protein measured in step 1) and the expression level of the protein measured in step 2) to detect prostate cancer in the subject.
Hereinafter, each step will be described specifically.
[0038]
{Circle around (1)} Step 1) measuring the expression level of at least one protein selected from TRPM4, PLA1A and BUCS1 in a sample collected from a subject:
(A) Preparation of a sample for protein measurement from a sample
The sample is subjected to high-speed centrifugation as necessary to remove insoluble substances, and then prepared as a sample for ELISA / RIA or a sample for Western blot as follows.
[0039]
As a sample for ELISA / RIA, for example, the collected prostate is used as it is, or a sample appropriately diluted with a buffer is used. The sample for western blotting (for electrophoresis) contains, for example, 2-mercatorethanol for SDS-polyacrylamide electrophoresis, using the prostate or an extract of the prostate as it is, or appropriately diluting it with a buffer. Mix with sample buffer (eg, from Sigma). In the case of the dot / slot blot, for example, the collected prostate or a part of the prostate extract itself or appropriately diluted with a buffer is directly adsorbed to the membrane by using a blotting apparatus or the like.
[0040]
(B) Immobilization of sample
In order to specifically detect the protein in the sample obtained as described above, the sample must be precipitated by immunoprecipitation, a method utilizing ligand binding, and detected without being immobilized. Alternatively, the sample to be detected can be immobilized as it is. When a protein is immobilized, a nitrocellulose membrane (for example, manufactured by Bio-Rad) or a nylon membrane (for example, Hybond-ECL (Amersham) is used as a membrane for Western blotting, dot blotting, or slot blotting. Pharmacia), a cotton membrane (for example, a blot absorbent filter (manufactured by Bio-Rad), etc.) or a polyvinylidene difluoride (PVDF) membrane (for example, manufactured by Bio-Rad, etc.).
[0041]
In order to detect and quantify proteins by the ELISA method / RIA method, a sample or a dilution thereof (for example, 0.05% adjuvant) is placed in a dedicated 96-well plate (for example, Immunoplate Maxisorp (manufactured by Nunc Corporation)). A phosphate buffered saline solution containing sodium chloride (diluted with “PBS”) is added and left at 4 ° C. to room temperature overnight, or at 37 ° C. for 1 to 3 hours to form a bottom surface of the well. Is immobilized by adsorbing protein.
[0042]
Antibodies to TRPM4, PLA1A and BUCS1 can be obtained by a conventional method (see, for example, Shinsei Kagaku Kenkyusho 1, Protein 1, p. 389-397, 1992) by using the amino acids of TRPM4, PLA1A and BUCS1 or TRPM4, PLA1A and BUCS1. It can be obtained by immunizing an animal with an arbitrary polypeptide selected from the sequence and collecting and purifying an antibody produced in the living body. Also, according to known methods (eg, Kohler and Milstein, Nature 256, 495-497, 1975, Kennet, R. ed., Monoclonal Antibody p. 365-367, 1980, Prenum Press, N.Y., TR). A hybridoma can be established by fusing an antibody-producing cell producing an antibody against any protein selected from PLA1A and BUCS1 with a myeloma cell to obtain a monoclonal antibody.
[0043]
In addition, TRPM4, PLA1A and BUCS1 serving as antigens can be obtained by producing TRPM4, PLA1A and BUCS1 genes in host cells by genetic manipulation. Specifically, a vector capable of expressing the TRPM4 gene, the PLA1A gene and the BUCS1 gene may be prepared, introduced into a host cell to express the gene, and the expressed TRPM4, PLA1A and BUCS1 may be purified.
[0044]
(C) Measurement of the expression level of at least one protein selected from TRPM4, PLA1A and BUCS1
The expression level can be measured using a known method such as a Western blot method or a dot / slot blot method using any antibody selected from anti-TRPM4 antibody, anti-PLA1A antibody and anti-BUCS1.
[0045]
(2) Step 2) Step of measuring the expression level of the protein described in 1) above in a sample collected from a normal person:
The measurement of the expression level of any protein selected from TRPM4, PLA1A and BUCS1 in a sample collected from a normal person can be performed in the same manner as in the above step (1).
[0046]
(3) Step 3) a step of analyzing the difference between the expression level of the protein measured in the above step 1) and the expression level of the protein measured in the above step 2) to detect prostate cancer in the subject.
[0047]
Analyzing the difference in the expression level of at least one protein selected from TRPM4, PLA1A and BUCS1 between a sample derived from a normal person and a sample derived from a subject, the expression level of TRPM4, PLA1A and BUCS1 is significantly increased It is possible to determine that there is a high possibility that cancer, particularly prostate cancer, is present in the sample, and prostate cancer can be detected. This determination can be made individually based on the expression level of any one protein selected from TRPM4, PLA1A and BUCS1, or by comprehensively evaluating the expression levels of TRPM4, PLA1A and BUCS1. You can also.
[0048]
Further, the concentrations of TRPM4, PLA1A and BUCS1 are measured, and it is analyzed whether or not the values fall within a numerical range determined in advance as normal values. Prostate cancer can be detected by determining that the patient has prostate cancer, and can be collected from a subject by previously examining the correlation between the expression levels of TRPM4, PLA1A and BUCS1 and the degree of prostate cancer formation in normal subjects. By measuring the expression levels of TRPM4, PLA1A and BUCS1 in the sample thus determined, it can be determined whether or not the subject has prostate cancer.
[0049]
3. Test for TRPM4 gene, PLA1A gene and BUCS1 gene, TRPM4, PLA1A and BUCS1
The expression levels of TRPM4 gene, PLA1A gene and BUCS1 gene, TRPM4, PLA1A and BUCS1 are significantly lower in normal tissues of other humans than in prostate, and furthermore, in prostate cancer compared to normal prostate. It was found by the present inventors that the expression level was significantly increased in. The functions of TRPM4, PLA1A and BUCS1 can be checked by the following method.
[0050]
(1) As a first method for examining the functions of TRPM4, PLA1A and BUCS1, first, a human cDNA library derived from cells expressing TRPM4, PLA1A and BUCS1 is used according to a known method such as colony hybridization. To obtain a full-length cDNA. This full-length cDNA is introduced into a mouse or human cell and highly expressed, and it is examined whether or not the cell is affected.
[0051]
In order to express the cDNA in an animal individual, a method of incorporating the obtained full-length cDNA into a viral vector and administering it to an animal can be mentioned. Examples of the method of gene transfer using a viral vector include a method of incorporating cDNA into a retrovirus, an adenovirus, an adeno-associated virus, a herpes virus, a vaccinia virus, a pox virus, a polio virus, or another DNA virus, or an RNA virus to introduce cDNA. . Among them, a method using a retrovirus, an adenovirus, an adeno-associated virus, and a vaccinia virus is preferable.
[0052]
Examples of non-viral gene transfer methods include a method of directly administering an expression plasmid intramuscularly (DNA vaccine method), a liposome method, a lipofection method, a microinjection method, a calcium phosphate method, an electroporation method, and the like. The DNA vaccine method and the liposome method are preferred.
[0053]
Further, by introducing the full-length cDNA into cultured cells, muscle cells, hepatocytes, adipocytes, or muscle cells, hepatocytes, adipocytes, skin cells, prostate cells, etc., derived from humans, mice, rats, etc. To express the function of each target cell, specifically, the function of regulating glycolipid metabolism such as production or uptake of sugar or lipid, or accumulation of glycogen, or how it affects cell morphology Can be considered.
[0054]
In introducing the full-length cDNA into an animal or a cell, the cDNA is incorporated into a vector containing an appropriate promoter and a sequence involved in expression of a gene, and a host cell is transformed with the vector. As a vertebrate cell expression promoter, those having a promoter, an RNA splice site, a polyadenylation site, and a transcription termination sequence, which are usually located upstream of the gene to be expressed, can be used. May be provided. Examples of the expression vector include pSV2dhfr having an early promoter of SV40 (Subramani, S. et al., Mol. Cell. Biol., (1981) 1, p. 854-864), retrovirus vectors pLNCX, pLNSX, Examples include, but are not limited to, pLXIN, pSIR (manufactured by Clontech), cosmid vector pAxCw (manufactured by Takara Bio). The expression vector is prepared by a diethylaminoethyl (DEAE) -dextran method (Luthman, H. and Magnusson, G., Nucleic Acids Res. (1983) 11, p.1295-1308), a calcium phosphate-DNA coprecipitation method (Graham, F.). L. and van der Eb, A. J. Virology, (1973) 52, p. 456-457), and electric pulse drilling (Neumann, E. et al., EMBO J. (1982) 1, p. COS cells (Gluzman, Y. Cell (1981) 23, p. 175-182, ATCC: CRL-1650) and Chinese hamster ovary cells (CHO cells, ATCC: CCL- 61) Drofolate reductase deficient strain (Urlaub, G. and Chasin, LA Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1980) 77, p. 4126-4220), 293 cells derived from human fetal kidney (ATCC: CRL- 1573), but is not limited thereto. Thus, a desired transformant can be obtained.
[0055]
In addition, it is also possible to prepare transgenic animals by gene manipulation so that the target gene is highly expressed in normal animals, and to examine what effects appear on cell morphology. Conversely, in an animal having prostate cancer, a knockout animal in which the target gene has been disrupted can be prepared to determine the state of cells.
[0056]
(2) A second method for examining the functions of TRPM4, PLA1A and BUCS1 is to suppress the expression of at least one of TRPM4, PLA1A and BUCS1 in a cancer cell line, and to determine the function of the cells and the form of proliferation. You can also see if it will affect you.
[0057]
An antisense nucleic acid against the total RNA of the gene to be tested can be introduced into cells, and the effect on the function and morphology of each target cell can be examined.
[0058]
As another method for suppressing gene expression, a method using double-stranded single-stranded RNA (siRNA) can also be mentioned (“Jeans and Developments”), January 2001. 15, Vol. 15, No. 2, p. 188-200). For example, the TRPMA gene and the PLA gene for the human prostate cell line LNCaP (American Tissue Culture Collection ATCC No .: CRL-1740) or the human prostate cancer cell line PC-3 (American Tissue Culture Collection ATCC No .: CRL-1435). And the siRNA against any one of the BUCS1 genes were introduced according to the method described in the literature, and the expression level of the target gene of the siRNA and the growth rate of the cells were examined. The expression level of any of the TRPM4 gene, PLA1A gene and BUCS1 gene was determined. In addition, suppression of cell proliferation is also observed when S.sup. That is, it becomes clear that the increase in the expression level of TRPM4, PLA1A and BUCS1 is related to the growth of prostate cancer.
[0059]
4. Kit for detecting TRPM4 gene, PLA1A gene and BUCS1 gene, TRPM4, PLA1A and BUCS1, and / or TRPM4, PLA1A and BUCS1
The TRPM4 gene, PLA1A gene and BUCS1 gene, TRPM4, PLA1A and BUCS1, and / or TRPM4, PLA1A and BUCS1 are prepared using a kit containing at least one selected from the group consisting of 1) to 5) below. Can be detected.
1) a polynucleotide consisting of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing, a polynucleotide consisting of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 3, a polynucleotide consisting of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 5, and a polynucleotide consisting of SEQ ID NO: 7 A continuous oligo of 15 to 30 bases in length for specifically amplifying at least one polynucleotide selected from the group consisting of a polynucleotide consisting of a nucleotide sequence and a polynucleotide consisting of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 9 Nucleotide primers;
2) a polynucleotide consisting of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing, a polynucleotide consisting of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 3, a polynucleotide consisting of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 5, and a polynucleotide consisting of SEQ ID NO: 7 Hybridize under stringent conditions to at least any one polynucleotide selected from the group consisting of a polynucleotide consisting of a nucleotide sequence and a polynucleotide consisting of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 9, and detect the polynucleotide A continuous polynucleotide probe of 15 nucleotides or more for:
3) a polynucleotide consisting of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1 of the sequence listing, a polynucleotide consisting of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 3, a polynucleotide consisting of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 5, and shown in SEQ ID NO: 7 A solid-phased sample on which at least one polynucleotide selected from the group consisting of a polynucleotide consisting of a nucleotide sequence and a polynucleotide consisting of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 9 is immobilized.
4) a protein consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 in the sequence listing, a protein consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 4, a protein consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 6, and the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 8 An antibody which specifically binds to at least one protein selected from the group consisting of a protein consisting of a protein consisting of a protein consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 10 and detecting the protein;
5) A secondary antibody capable of binding to the antibody according to 4).
[0060]
The primer described in 1) above is easily designed and amplified by a conventional method, for example, using commercially available primer design software (for example, Wisconsin GCG package Version 10.2) based on the nucleotide sequences of the TRPM4 gene, the PLA1A gene and the BUCS1 gene. can do. The probe according to 2) is a polynucleotide that specifically hybridizes to TRPM4, PLA1A and BUCS1, and has a length of 100 to 1500 bases, preferably 300 to 600 bases. These primers and probes may be labeled with an appropriate label (for example, an enzyme label, a radioactive label, a fluorescent label, and the like), and may be added with a linker.
[0061]
The solid-phased sample described in 3) above is prepared by fixing the probe described in 2) above to a solid phase such as a glass plate or a nylon membrane. Regarding the method for preparing such an immobilized sample, the expression level of at least one gene selected from (1) TRPM4 gene, PLA1A gene and BUCS1 gene in the section of “2. As described in the section of “Method for Detecting Prostate Cancer Using DNA”, examples thereof include a gene chip, a cDNA array, an oligo array, and a membrane filter.
[0062]
The kit of the present invention can further include a thermostable DNA polymerase, dNTP (a mixture of dATP, dCTP, dGTP, and dTTP) and a buffer. Examples of the heat-resistant DNA polymerase include Taq DNA polymerase, LA Taq DNA polymerase (manufactured by Takara Shuzo), Tth DNA polymerase, and Pfu DNA polymerase. The buffer is selected depending on the DNA polymerase to be used. ²⁺ Etc. are added.
[0063]
The antibody described in the above 4) and 5) utilizes the expression level of at least one protein selected from (2) TRPM4, PLA1A and BUCS1 in the above section “2. Method for detecting prostate cancer”. Prostate cancer detection method "and the method described in the following section" 6. Production of anti-TRPM4, PLA1A and BUCS1 antibodies ". The antibody may be labeled with a suitable label (for example, an enzyme label, a radioactive label, a fluorescent label, etc.).
[0064]
The kit of the present invention can be used for the detection of TRPM4 gene, PLA1A gene and BUCS1 gene, TRPM4, PLA1A and BUCS1, and / or TRPM4, PLA1A and BUCS1, and is used for the determination of the presence or absence of prostate cancer and the growth of prostate cancer. It can also be used to screen for inhibitors.
[0065]
5. Screening method for substance having therapeutic and / or prophylactic effect on prostate cancer
In one embodiment of the present invention, prostate cancer is treated and treated by measuring at least one expression level of TRPM4 gene, PLA1A gene and BUCS1 gene, TRPM4, PLA1A and BUCS1, and / or TRPM4, PLA1A and BUCS1. A substance having a prophylactic effect can be screened.
[0066]
In one embodiment of the present invention, a substance having a therapeutic and / or prophylactic effect on prostate cancer is screened by identifying a substance that inhibits the activity of any one protein selected from TRPM4, PLA1A and BUCS1. be able to.
[0067]
The “test substance” refers to a substance whose cancer growth inhibitory activity is to be examined by the screening method of the present invention. The test substance includes compounds, metabolites of microorganisms, extracts of plant and animal tissues, derivatives thereof, and mixtures thereof. Further, a nucleic acid or a derivative thereof (including an antisense oligonucleotide, a ribozyme, a dsRNA, an siRNA, etc.) designed to reduce the expression level of at least one of TRPM4, PLA1A and BUCS1 may be used as a test substance. It is possible. The dose and concentration of the test substance may be set as appropriate, or a plurality of doses may be set, for example, by creating a dilution series, and the test substance may be administered in an appropriate state such as a solid or liquid. Or a stabilizer or the like may be added. In the case of a screening method using cultured cells, the cells can be added to a medium and cultured. When it is added to the medium, it may be added from the start of the culture or during the culture, and the number of additions is not limited to one. The period for culturing in the presence of the test substance may be appropriately set, but is preferably 30 minutes to 2 weeks, and more preferably 30 minutes to 48 hours. When a test substance is administered to a mammal individual, administration forms such as oral administration, intravenous injection, intraperitoneal injection, transdermal administration, and subcutaneous injection are used depending on the properties of the test substance. It can also be applied or injected directly to prostate cancer. The time from the administration of the test substance until the specimen is obtained can be appropriately selected.
[0068]
As long as the cultured cells used in the screening method of the present invention are mammalian cells expressing at least one of TRPM4, PLA1A and BUCS1, they may be normal cells or cells showing abnormal proliferation such as cancer cells. Well, for example, mouse fibroblast-derived cell line NIH3T3 cells, human prostate cancer cell line LNCaP, human prostate cancer cell line PC-3, mouse, rat and human free adipocytes, mouse, rat and human primary hepatocytes, etc. But not limited to these. The mammalian species of the cultured cells are preferably humans, mice or hamsters, and more preferably humans or mice, but are not limited thereto. It is more preferable to use mammalian cells overexpressing at least one of TRPM4, PLA1A and BUCS1 as the cultured cells. For example, TRPM4, PLA1A and BUCS1 genes are introduced together with their promoter regions, and TRPM4, Examples include NIH3T3 cells that overexpress PLA1A and BUCS1.
[0069]
Tumor cells often exhibit abnormal growth different from normal cells, such as (1) focus formation, (2) colony formation, and (3) spheroid growth. Therefore, there is a high possibility that such a substance that reduces proliferation is a substance that has a therapeutic and / or prophylactic effect for cancer. These properties are specifically as follows.
[0070]
(1) Focus formation test
Normally, normal fibroblasts such as NIH3T3 do not overlap even if they proliferate and become dense, and the growth stops when a monolayer is formed. On the other hand, transformed cells and cancer cells have lost their susceptibility to the contact inhibition phenomenon and can continue to grow while overlapping, forming a layered cell population and forming a monolayer of cells. Has the property of creating a high-density cell mass, Focus, in the spread of the cell (Jun Yokota, Masaru Yamamoto, Biomanual UP Series Cancer Research Protocol Yodosha 168-174 (Oct. 15, 1995) Since this phenomenon is observed, for example, when a cultured cell is infected with a cancer virus, it may be used not only for quantification of the cancer virus (Fundamental Technologies in Virology, Academic Press (1969)). ), P198-211), DNA fragments containing oncogenes derived from viruses and cells. Because it can also be observed by transfecting the cells, oncogenes, is used for screening of tumor suppressor genes.
[0071]
A cell line overexpressing TRPM4, PLA1A and BUCS1 genes and a cell line not overexpressing TRPM4, PLA1A and BUCS1 genes are cultured by a usual method, and replaced with a fresh culture solution. Then, a multiwell plate (for example, 96-well plate: Corning-Costar) And the number of focuses per well is measured after culturing for a certain period of time. Statistical processing is performed after totaling the number of focuses per well, and the average number of focuses and standard deviation per well are calculated. Observed that NIH3T3 cells overexpressing at least one of the TRPM4 gene, PLA1A gene and BUCS1 gene have a remarkably increased number of focuses compared to cells not overexpressing TRPM4, PLA1A and BUCS1 genes. Is done.
[0072]
(2) Colony formation test
Normal cells, with the exception of blood cells, are known to be unable to proliferate without an attached scaffold. In contrast, transformed cells and cancer cells have the property of being able to proliferate without a scaffold. This characteristic change can be easily examined by the formation of a proliferating colony in a soft agar medium (Jun Yokota, Masaru Yamamoto, Bio Manual UP Series Cancer Research Protocol Yodosha 168-174 (Oct. 1995) Published on March 15).
[0073]
A cell line overexpressing at least one of the TRPM4 gene, PLA1A gene and BUCS1 gene and a cell line not overexpressing the same are cultured by a conventional method, replaced with a fresh culture solution, and then replaced with a soft agar medium (eg, The suspension is suspended in 0.33% Bactogar (manufactured by Difco) and RPMI1640 containing 20% FCS, and layered on an agar medium (for example, RPMI1640 containing 0.66% Bactogar and 20% FCS). Under normal conditions (eg, 37 ° C, 5% CO ₂ ), And the number of proliferating colonies in the formed soft agar is measured. When culturing is performed using a multiwell plate (for example, 12-well plate: 3512 manufactured by Corning-Costar), the number of colonies per well is measured after culturing for a certain period of time. After totaling the number of colonies per well, statistical processing is performed, and the average number of colonies per standard and the standard deviation are calculated. The number of colonies in the NIH3T3 cell line overexpressing at least one of the TRPM4 gene, PLA1A gene and BUCS1 gene is remarkably increased as compared with the cells not overexpressing at least one of the TRPM4, PLA1A and BUCS1 genes. Is observed.
[0074]
(3) Spheroid proliferation test
The characteristic of anchorage-independent growth of transformed cells and cancer cells can also be easily evaluated by culturing in a spheroid state. Spheroids are aggregates of a large number of cells and can be easily formed by culturing on a culture plate in which cell adhesion is extremely low. Culture in the spheroid state is different from ordinary monolayer culture, and is similar to culture in an anchorage-independent state, similar to that described in "(2) Colony formation test", under conditions similar to those in vivo. The function can be observed by using (Sumitomo Bakelite Co., Ltd. SUMILON physical and chemical instrument general catalog). A cell line overexpressing at least one of the TRPM4 gene, PLA1A gene and BUCS1 gene and a cell line not overexpressing the gene are cultured by a usual method, and replaced with a fresh culture solution. Dispense into an adhesive multiwell plate (for example, Spheroid 96U: MS-0096S manufactured by Sumitomo Bakelite Co., Ltd.). Under normal conditions (eg, 37 ° C, 5% CO ₂ ), And the size of spheroids formed on the plate is measured after a certain period of time from the start of the culture. The size of the spheroid can be measured using, for example, an eyepiece micrometer (S-6, manufactured by Sankeisha) under a microscope, and the diameter of the spheroid can be used as an index of the size of the spheroid. In the NIH3T3 cell line overexpressing at least one of the TRPM4 gene, PLA1A gene and BUCS1 gene, a remarkable increase in the diameter of the spheroid is observed as compared with the cell not overexpressing the gene.
[0075]
In the screening method of the present invention, a test substance is administered to a mammalian individual without using cultured cells, and then at least one of the TRPM4 gene, PLA1A gene, and BUCS1 gene in the organ or tissue cell extracted from the animal individual. A method for detecting any one expression is also included. The organ or tissue for which gene expression is to be detected may be any organ or tissue that expresses TRPM4, PLA1A and BUCS1, but is preferably a tissue in which cancer has occurred, more preferably the prostate. As the mammalian species, non-human mammals can be used, and mice, rats or hamsters are preferred, and mice or rats are more preferred. In addition, tumor-bearing animals (nude mice transplanted with human cancer strains, allografted mice, etc.), which are tumor model animals in which tumors derived from humans, monkeys, mice or rats are transplanted subcutaneously, intradermally, or intraperitoneally, or Animals of spontaneous lineage of cancer (including naturally identified animals and genetically modified animals; for example, p53 knockout mice (Donehower et al., Nature (1992), 356, pp. 215-221), Myc transgenic mice (Adams et al., Nature (1985), Vol. 318, p. 533-538), TRAMP mouse (Foster et al., Cancer Res. (1997), Vol. 57, p. 3325-3330) and the like can also be used. Over at least one of TRPM4, PLA1A and BUCS Can also be used to express an animal. It is also possible to use animal was subjected to cancer induction treatment.
[0076]
The cultured cells used in the method of the present invention may be cultured under any conditions as long as at least one of TRPM4, PLA1A and BUCS1 can be expressed when no test substance is added. For example, when known culture conditions are known for the cultured cells, and the cells express at least one of TRPM4, PLA1A and BUCS1 under the conditions, the cells may be cultured under the conditions. In addition, when detecting expression of at least one of TRPM4, PLA1A and BUCS1 in an organ or tissue isolated from a mammal individual, the breeding conditions of the animal are also determined from TRPM4, PLA1A and BUCS1 when no test substance is added. Any condition can be used as long as at least one of the selected conditions can be expressed.
[0077]
In addition, in order to examine the effect of the test substance on the expression of at least one of TRPM4, PLA1A and BUCS1, a method of measuring the expression level of at least one of the TRPM4 gene, PLA1A gene and BUCS1 gene, There is a method for measuring the expression level of at least one of TRPM4, PLA1A and BUCS1, which is a translation product of at least one of TRPM4 gene, PLA1A gene and BUCS1 gene. A test substance that suppresses the expression of at least one of TRPM4 gene, PLA1A gene and BUCS1 gene and / or at least one of TRPM4, PLA1A and BUCS1 is effective for treating cancer, preferably prostate cancer and / or It is considered to be a substance having a preventive effect.
[0078]
Extraction of total RNA from cultured cells, measurement of expression level of at least one of TRPM4 gene, PLA1A gene and BUCS1 gene, measurement of expression level of at least one gene of TRPM4, PLA1A and BUCS1 The method can be performed according to the method described in the section “2.
[0079]
(1) Method using at least one of TRPM4 gene, PLA1A gene and BUCS1 gene
As the screening method of the present invention, for example, a method using cultured cells derived from mammals and a method using mammalian individuals are as follows.
[0080]
(1) Method using mammalian-derived cultured cells
(I) Including the following steps a) to c):
B) a step of extracting total RNA from mammalian-derived cultured cells cultured in a medium to which a test substance has been added;
B) a step of detecting a difference in the expression level of at least one of the TRPM4 gene, the PLA1A gene and the BUCS1 gene between the total RNA derived from a) and the total RNA derived from cultured mammalian cells cultured without adding a test substance; ;
C) a step of analyzing the difference in the expression level of the gene described in b) and determining the therapeutic and / or prophylactic effect of the test substance on prostate cancer.
[0081]
(Ii) The following steps a) to d) are included.
A) a step of extracting a total RNA fraction from mammalian-derived cultured cells cultured in a medium to which a test substance has been added;
B) a step of extracting a total RNA fraction from mammalian-derived cultured cells cultured in a medium to which a test substance is not added;
C) a step of measuring the expression level of at least one of the TRPM4 gene, the PLA1A gene and the BUCS1 gene in the total RNA fraction derived from a) and the total RNA fraction derived from b);
D) analyzing the difference in the expression level of the gene measured in c) between the total RNA fraction derived from a) and the total RNA fraction derived from b), and treating the test substance with respect to prostate cancer; And / or determining the therapeutic effect.
[0082]
(2) Method using a mammalian individual
(I) It includes the following steps 1) to 3).
A) a step of extracting total RNA from a specimen collected from a mammalian individual to which the test substance has been administered;
B) The expression level of at least one of the TRPM4 gene, the PLA1A gene and the BUCS1 gene between the total RNA derived from a) and the total RNA obtained from a specimen collected from an animal individual to which the test substance was not administered. Detecting the difference;
C) a step of analyzing the difference in the expression level of the gene described in b) above and determining the therapeutic and / or prophylactic effect of the test substance on prostate cancer.
[0083]
(Ii) The following steps a) to d) are included.
A) a step of extracting total RNA from a specimen collected from a mammalian individual to which the test substance has been administered;
B) a step of extracting total RNA from a specimen collected from a mammal individual to which the test substance has not been administered;
C) measuring the expression level of at least one of the TRPM4 gene, the PLA1A gene and the BUCS1 gene in the total RNA derived from the above step a) and the total RNA derived from the above step b);
D) a step of analyzing the difference in the expression level of the gene described in c) and determining the therapeutic and / or prophylactic effect of the test substance on prostate cancer.
[0084]
(2) Method using TRPM4, PLA1A and BUCS1
The screening method using the measurement of the expression level of at least one of TRPM4, PLA1A and BUCS1 includes the following steps for a method using cultured mammalian cells and a method using animal individuals, respectively.
[0085]
(1) Method using mammalian-derived cultured cells
(I) Including the following steps 1) and 2):
B) measuring the expression level of at least one of TRPM4, PLA1A and BUCS1 in cultured cells derived from mammals cultured in a medium to which a test substance is added;
B) Analyzing the difference between the expression level of the protein measured in a) and the expression level of the protein in mammalian cell culture cultured in a medium without the test substance, the therapeutic effect of the test substance on prostate cancer and / or Or a step of determining a preventive effect.
[0086]
(Ii) including the following steps a) to c):
A) a step of measuring the expression level of at least one of TRPM4, PLA1A and BUCS1 in a mammalian-derived cultured cell cultured in a medium to which a test substance is added;
B) a step of measuring the expression level of the protein according to the above a) in cultured cells derived from a mammal cultured in a medium to which a test substance is not added;
C) a step of detecting the difference between the expression level of the protein measured in a) and the expression level of the protein measured in b) to determine the therapeutic effect and / or the prophylactic effect of the test substance on prostate cancer .
[0087]
(Iii) including the following steps a) to c):
A) immobilizing all proteins obtained from cultured cells derived from mammals cultured in a medium to which a test substance is added;
B) a step of measuring the expression level of at least one of TRPM4, PLA1A and BUCS1 in the solid-phased protein;
C) analyzing the difference between the expression levels of TRPM4, PLA1A and BUCS1 detected in the above b) and the expression levels of the protein in the total protein obtained from cultured cells derived from mammals cultured in a medium without the addition of the test substance, A step of determining the therapeutic and / or prophylactic effect of the test substance on prostate cancer.
[0088]
(Iv) including the following steps a) to e):
A) immobilizing all proteins obtained from cultured cells derived from mammals cultured in a medium to which a test substance is added;
B) immobilizing all proteins obtained from cultured cells derived from mammals cultured in a medium to which no test substance is added;
C) a step of measuring the expression level of at least one of TRPM4, PLA1A and BUCS1 in the solid-phased protein according to the above step a) using an antibody or ligand which specifically binds to the protein;
D) a step of measuring the expression level of at least one of TRPM4, PLA1A and BUCS1 in the solid-phased protein according to the above step b) using an antibody or a ligand that specifically binds to the protein;
E) Analyze the difference between the expression level of the protein measured in step c) and the expression level of the protein measured in step d) to determine the therapeutic and / or prophylactic effect of the test substance on prostate cancer. Process.
[0089]
(2) Method using a mammalian individual
(I) Including the following steps a) and b):
A) a step of measuring the expression level of at least one protein of TRPM4, PLA1A and BUCS1 in a specimen collected from a mammalian individual to which the test substance has been administered;
B) Analyzing the difference between the expression level of at least one of TRPM4, PLA1A and BUCS1 measured in the above step a) and the expression level of the protein in a sample collected from a mammal individual to which the test substance was not administered. Determining the therapeutic and / or prophylactic effect of the test substance on prostate cancer.
[0090]
(Ii) including the following steps a) to c):
A) a step of measuring the expression level of at least one protein of TRPM4, PLA1A and BUCS1 in a sample collected from a mammal to which the test substance has been administered, using an antibody or ligand which specifically binds to the protein; ;
B) a step of measuring the expression level of the protein in a sample collected from a mammal individual to which the test substance has not been administered;
C) Analyzing the difference between the expression level of at least one of TRPM4, PLA1A and BUCS1 measured in a) and the expression level of the protein measured in b), and treating the test substance with a therapeutic effect on prostate cancer And / or determining a preventive effect.
[0091]
(Iii) including the following steps a) to c):
A) immobilizing all proteins in a sample collected from a mammal to which the test substance has been administered;
B) a step of measuring the expression level of at least one of TRPM4, PLA1A and BUCS1 in the solid-phased protein;
C) The difference between the expression level of at least one protein of TRPM4, PLA1A and BUCS1 detected in the above step b) and the expression level of the protein in a sample collected from a mammal individual to which the test substance has not been administered is determined. Analyzing and determining the therapeutic and / or prophylactic effect of the test substance on prostate cancer.
[0092]
(Iv) including the following steps a) to e):
A) immobilizing all proteins in a sample collected from a mammal to which the test substance has been administered;
B) immobilizing all proteins in a sample collected from a mammal individual to which the test substance has not been administered;
C) detecting the expression level of at least one of TRPM4, PLA1A and BUCS1 in the solid-phased protein according to the above step a) using an antibody or a ligand that specifically binds to the protein;
D) detecting the expression level of at least one of TRPM4, PLA1A and BUCS1 in the solid-phased protein described in b) above using an antibody or a ligand that specifically binds to the protein;
E) a step of analyzing the difference between the expression level of the protein detected in c) and the expression level of the protein detected in d) to determine the therapeutic and / or prophylactic effect of the test substance on prostate cancer .
[0093]
(3) A method for determining a substance having a therapeutic effect and / or a preventive effect on prostate cancer by identifying a substance that inhibits any activity of TRPM4, PLA1A and BUCS1
Since the expression levels of TRPM4, PLA1A and BUCS1 are significantly increased in prostate cancer compared to normal prostate, a substance that inhibits the activity of at least one of TRPM4, PLA1A and BUCS1 has a therapeutic effect on prostate cancer and / or It can be a substance having a preventive effect. TRPM4 has a function as a cation permeation channel in the presence of calcium ions (eg, Cell, 2002, Vol. 109, p397-407 and Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2001, Vol. 98, p10692-10697). reference.). PLA1A is a phospholipase A1 (Phospholipase A1) member protein and has phospholipase A1 activity. The phospholipase A1 activity refers to an activity of specifically hydrolyzing an ester bond with a fatty acid at position 1 of glycerol of a phospholipid (where the position where a phosphate ester is bonded is position 3). BUCS1 is one type of acyl-CoA synthetase and has an activity of activating a fatty acid having 4 to 16 carbon atoms, preferably octanoic acid, to acyl-CoA (Acyl-CoA). is there. Hereinafter, a method for determining a substance having a therapeutic effect and / or a preventive effect on prostate cancer, which comprises obtaining a substance that inhibits the activity of each of TRPM4, PLA1A, and BUCS, will be described.
[0094]
▲ 1 ▼ TRPM4
A method for determining a substance having a therapeutic effect and / or a preventive effect on prostate cancer, comprising identifying a substance that inhibits a cation permeation channel of TRPM4, and comprising the following steps a) to c):
A) supplying a cell expressing TRPM4 on the cell surface;
B) Ca ²⁺ Contacting the test substance with the cell according to a) in the presence of:
C) a step of determining whether the uptake of cations into cells decreases (where the decrease in uptake of cations into cells indicates that the test substance inhibits the cation permeation channel of TRPM4) It shows that.)
[0095]
Hereinafter, each step will be described in more detail.
B) Cells expressing TRPM4 on the cell surface can be obtained by a method known to those skilled in the art, for example, see Cell, 2002, Vol. 109, pp. 397-407. That is, the cDNA of TRPM4 is inserted into pCDNA4 / TO vector (manufactured by Invitrogen) having a flag epitope tag attached to the amino terminus, and the plasmid is previously transformed with pCDNA6 / TR (manufactured by Invitrogen). The HEK-293 cells thus obtained are introduced by electroporation, and cells expressing TRPM4 tagged with a flag tag on the cell surface are selected using zeocin.
B) Ca ²⁺ In the step of contacting the test substance with the cells described in a) in the presence of the above, HEK-293 cells expressing TRPM4 with a flag tag on the cell surface are converted to Ca ²⁺ After culturing in a suitable medium containing, the test substance is added. The cell culture is performed, for example, in Cell, 2002, Vol. 109, p397-407. Further, the concentration of the test substance can be appropriately determined according to the measurement conditions.
C) In the step of determining whether the incorporation of cations into cells decreases, the measurement of cation concentration in cells can be performed, for example, by the method described in Cell, 2002, Vol. 109, p397-407, but not limited to these methods. For example, measurement can be performed using a FLIPR Calcium Assay Kit or a FLIPR Membrane Potential Assay Kit (Molecular Devices). You can also.
If the increase in intracellular cation concentration measured by such a method is reduced as compared to the case where no test substance is added, it indicates that the test substance inhibits the cation permeation channel of TRPM4. The test substance is identified as a substance that inhibits the cation permeation channel of TRPM4, and can be determined to be a substance having a therapeutic effect and / or a preventive effect on prostate cancer.
[0096]
(2) PLA1A
A method for determining a substance having a therapeutic effect and / or a prophylactic effect on prostate cancer, comprising identifying a substance that inhibits phospholipase A1 activity, and comprising the following steps a) and b):
B) contacting the PLA1A substrate with the test substance;
B) a step of determining whether the activity of hydrolyzing the substrate in the presence of the test substance decreases (where the decrease in the activity of hydrolyzing the substrate means that the test substance inhibits the phospholipase A1 activity) Is shown.).
[0097]
Hereinafter, each step will be described in more detail.
[0098]
B) The PLA1A substrate and the PLA1 substrate in the step of contacting the PLA1A with the test substance are not particularly limited as long as they are glycerophospholipids that can be PLA1 substrates. Inositol polyphosphate, diphosphatidylglycerol, phosphatidic acid, lysophospholipid and the like can be mentioned, and phosphatidylserine can be preferably used.
The PLA1A may be in any state as long as the activity of the PLA1A can be measured, and the culture supernatant, the partially manufactured product, and the purified product can be appropriately selected and used. For example, the following “6.” It can be adjusted by the method described in “(1) Preparation of antigen”.
[0099]
B) The activity of hydrolyzing the substrate in the step of determining whether the activity of hydrolyzing the substrate in the presence of the test substance decreases can be measured, for example, by the method described in JP-A-10-201479. Specifically, 1-[-] was prepared according to a known method (J. Biochem., 101, 1987, p53-61). ¹⁴ C] Using palmitoyl-2-acyl-sn-glycero-3-phosphoserine as a substrate, PLA1A was added to 4.0 mM substrate and enzyme in 100 mM Tris-HCl buffer (pH 7.5) containing 0.4 mM calcium chloride. After reacting at 37 ° C. for an appropriate time, a solution of Dole (J. Biol. Chem., Vol. 235, 1960, p. 2595-2599) was added to stop the reaction, and the released fatty acid was extracted. Measure the radioactivity.
[0100]
When the activity of hydrolyzing the substrate of PLA1A measured by such a method is reduced as compared with the case where the test substance is not added, it indicates that the test substance inhibits the phospholipase A1 activity. Such a test substance is identified as a substance that inhibits phospholipase A1 activity, and can be determined to be a substance having a therapeutic effect and / or a preventive effect on prostate cancer.
[0101]
▲ 3 ▼ BUCS1
The present invention is characterized by identifying a substance that inhibits the acyl-CoA (Acyl-CoA) synthesis activity of BUCS1, and comprising the following steps a) to b), wherein the therapeutic and / or prophylactic effect against prostate cancer is obtained How to determine the substance possessed:
B) contacting the BUCS1 substrate with the test substance;
B) a step of determining whether the amount of acyl-CoA synthesis decreases in the presence of the test substance (where the decrease in the amount of acyl-CoA synthesis indicates that the test substance reduces the acyl-CoA synthesis activity of BUCS1) Inhibit.)
Hereinafter, each step will be described in more detail.
B) In the step of contacting the BUCS1 substrate and BUCS1 with the test substance, octanoate can be used as the BUCS1 substrate, and BUCS1 may be in any state as long as the activity of BUCS1 can be measured. A culture supernatant, a partial product, and a purified product can be appropriately selected and used, and can be adjusted, for example, by the method described in “(1) Preparation of antigen” in the section “6.” below. .
[0102]
B) In the step of determining whether the synthesis amount of acyl-CoA decreases in the presence of the test substance, whether the synthesis amount of acyl-CoA decreases can be determined by measuring the activity of BUCS1. it can. The activity measurement of BUCS1 is described in, for example, Biol. Chem. , Vol. 276, 2001, p. 35962-35966 and J.P. Biol. Chem. , Vol. 276, 2001, p. The method is not limited to these methods as long as the activity of BUCS1 produced by the method described in 11420-11426 can be measured. Specific examples are shown below. 100 mM Tris-HCl, pH 8.0, 10 mM MgCl2, 10 mM ATP, 1 mM CoA, 10 mM [ ¹⁴ Ci] Octanoate (1000 cpm / nmol) is added with an appropriate amount of a test substance to make a total volume of 0.2 ml. Octanoic acid is used at a final concentration of 1% w / v with Triton X-100. Pre-incubate at 37 ° C. for 1 minute and add enzyme solution of BUCS1 to start enzyme reaction. After a 30 minute incubation, the enzyme reaction is stopped by adding 50 μl of 30% metaphosphoric acid. Enzyme reaction product [ ¹⁴ [C] Acyl-CoA was spotted on Chromatography media (ITLC-SG type, Gelman Sciences), washed with water-saturated ether / formic acid (7: 1), and measured for radioactivity. Determine the amount of acyl-CoA synthesized The same experiment is performed under the condition that no test substance is added, and the amount of acyl-CoA synthesized is determined. A decrease relative to the absence of the test substance indicates that the test substance inhibits the activity of BUCS1, such a test substance is identified as a substance that inhibits the activity of BUCS1, and has a therapeutic effect on prostate cancer and / or It can be determined that the substance has a prophylactic effect.
[0103]
(4) Other methods
The incidence of cancer, the size of cancer, and / or the time course of administration and non-administration of a test substance to a mammal individual overexpressing at least one of TRPM4, PLA1A and BUCS1 Measure the survival rate. The incidence of cancer is significantly reduced in the mammal to which the test substance is administered, the size of the cancer is significantly smaller, and / or the survival rate is about 10% or more, preferably about 30% or more, more preferably When the test substance increases by about 50% or more, the test substance can be selected as a compound having a therapeutic and / or prophylactic effect on cancer.
[0104]
6. Production of anti-TRPM4, PLA1A and BUCS1 antibodies
(1) Preparation of antigen
As an antigen for preparing any of the anti-TRPM4, PLA1A and BUCS1 antibodies, any one of TRPM4, PLA1A and BUCS1 or a polypeptide comprising at least six consecutive partial amino acid sequences thereof, or any amino acid sequence thereof And a derivative to which a carrier is added.
[0105]
The antigen polypeptide can be used by directly purifying any of TRPM4, PLA1A and BUCS1 from human tumor tissue or tumor cells, and also synthesizing TRPM4, PLA1A and BUCS1 in vitro, or performing genetic engineering. By causing the host cell to produce the protein. In the genetic manipulation, specifically, any one of TRPM4, PLA1A and BUCS1 is inserted into an expressible vector, and then synthesized in a solution containing enzymes, substrates and energy substances necessary for transcription and translation, or The protein can be obtained by expressing any of TRPM4, PLA1A and BUCS1 by transforming another prokaryotic or eukaryotic host cell. Any of the cDNAs of TRPM4, PLA1A and BUCS1 is, for example, a primer specifically amplifying any of the cDNAs of TRPM4, PLA1A and BUCS1 using a cDNA library expressing any of TRPM4, PLA1A and BUCS1 as a template. Polymerase chain reaction (hereinafter referred to as “PCR”) [Saiki, R .; K. , Et al. (1988) Science 239, 487-49], which is a so-called PCR method.
[0106]
In vitro synthesis of polypeptides includes, but is not limited to, for example, the Rapid Translation System (RTS) manufactured by Roche Diagnostics. For example, when RTS is used, a target gene is cloned into an expression vector controlled by a T7 promoter, and this is added to an in vitro reaction system. First, mRNA is transcribed from a template DNA by T7 RNA polymerase, Thereafter, translation is performed by ribosomes or the like in an Escherichia coli lysate, and the target polypeptide is synthesized in the reaction solution (Biochemical, 1, 20-23 (2001), Biochemical, 2, 28-29 (2001)).
[0107]
Examples of prokaryotic host cells include Escherichia coli and Bacillus subtilis. To transform a gene of interest into these host cells, the host cells are transformed with a plasmid vector that contains replicons or origins of replication from species compatible with the host and regulatory sequences. Further, the vector is preferably a vector having a sequence capable of imparting phenotypic (phenotypic) selectivity to transformed cells.
[0108]
For example, K12 strain or the like is often used as Escherichia coli, and pBR322 or a pUC-type plasmid is generally used as a vector. However, the present invention is not limited thereto, and any known various strains and vectors can be used.
[0109]
Examples of the promoter include, in Escherichia coli, tryptophan (trp) promoter, lactose (lac) promoter, tryptophan lactose (tac) promoter, lipoprotein (lpp) promoter, polypeptide chain elongation factor Tu (tufB) promoter, and the like. Any promoter can be used to produce the polypeptide of interest.
[0110]
As Bacillus subtilis, for example, strain 207-25 is preferable, and as a vector, pTUB228 (Ohmura, K. et al. (1984) J. Biochem. 95, 87-93) is used, but it is not limited thereto. is not. By ligating a DNA sequence encoding the signal peptide sequence of Bacillus subtilis α-amylase, extracellular secretory expression becomes possible.
[0111]
Eukaryotic host cells include cells such as vertebrates, insects, and yeast. Examples of vertebrate cells include COS cells, which are monkey cells (Gluzman, Y. (1981) Cell 23, 175-). 182, ATCC CRL-1650), mouse fibroblast NIH3T3 (ATCC No. CRL-1658) and Chinese hamster ovary cells (CHO cells, ATCC CCL-61) deficient in dihydrofolate reductase (Urlaub, G. and Chasin). Natl. Acad. Sci. USA 77, 4126-4220), etc., but are not limited thereto.
[0112]
As a vertebrate cell expression promoter, those having a promoter, an RNA splice site, a polyadenylation site, and a transcription termination sequence, which are usually located upstream of the gene to be expressed, can be used. May be provided. Examples of the expression vector include pcDNA3.1 (manufactured by Invitrogen) having a cytomegalovirus early promoter and pSV2dhfr having an SV40 early promoter (Subramani, S. et al. (1981) Mol. Cell. Biol. 1, 854-864), but is not limited thereto.
[0113]
For example, when a COS cell or NIH3T3 cell is used as a host cell, the expression vector has an SV40 origin of replication, is capable of autonomous growth in COS cells or NIH3T3 cells, and further has a transcription promoter and a transcription termination. Those provided with a signal and an RNA splice site can be used. The expression vector is prepared by a DEAE-dextran method (Luthman, H. and Magnusson, G. (1983) Nucleic Acids Res. 11, 1295-1308), and a calcium phosphate-DNA coprecipitation method (Graham, F.L. , AJ (1973) Virology 52, 456-457), and electric pulse perforation (Neumann, E. et al. (1982) EMBO J. 1, 841-845) to COS cells or NIH3T3 cells. Thus, the desired transformed cells can be obtained. When a CHO cell is used as a host cell, a vector capable of expressing a neo gene functioning as an antibiotic G418 resistance marker together with an expression vector, for example, pRSVneo (Sambrook, J. et al. (1989): "Molecular Cloning") A Laboratory Manual "Cold Spring Harbor Laboratory, NY) and pSV2neo (Southern, PJ and Berg, P. (1982) J. Mol. Appl. Genet. 1, 327-3, Trans. By selecting a G418-resistant colony, a transformed cell stably producing the desired polypeptide can be obtained.
[0114]
When insect cells are used as host cells, ovarian cell-derived cell lines (Sf-9 or Sf-21) of Spodoptera frugiperda of Lepidoptera and Noctuidae and High Five cells (Wickham, T. J. et al.) Derived from egg cells of Trichoplusia ni. al. (1992) Biotechnol. Prog. I: 391-396) and the like, and as a baculovirus transfer vector, pVL1392 / 1393 using the promoter of the polyhedrin protein of autographa nucleopolyhedrovirus (AcNPV). (Kidd, IM and VC Emery (1993) The use of baculoviruses as expression vectors). Applied Biochemistry and Biotechnology 42, 137-159). In addition, vectors using baculovirus P10 or a promoter of the same basic protein can also be used. Furthermore, the recombinant protein can be expressed as a secreted protein by connecting the secretory signal sequence of the envelope surface protein GP67 of AcNPV to the N-terminal side of the target protein (Zhe-mei Wang, et al. (1998)). Biol. Chem., 379, 167-174).
[0115]
As an expression system using a eukaryotic microorganism as a host cell, yeast is generally well known. Among them, yeast of the genus Saccharomyces, for example, baker's yeast Saccharomyces cerevisiae and petroleum yeast Pichia pastoris are preferable. Examples of expression vectors for eukaryotic microorganisms such as yeast include, for example, a promoter for an alcohol dehydrogenase gene (Bennetzen, JL and Hall, BD (1982) J. Biol. Chem. 257, 3018-3025). ) Or a promoter of an acid phosphatase gene (Miyanohara, A. et al. (1983) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80, 1-5). When expressed as a secretory protein, it can be expressed as a recombinant having a secretory signal sequence and a cleavage site of an endogenous protease or a known protease possessed by the host cell at the N-terminal side. For example, in a system in which human mast cell tryptase of a trypsin-type serine protease is expressed in petroleum yeast, the activity is achieved by connecting the secretory signal sequence of α-factor of yeast and the cleavage site of KEX2 protease possessed by petroleum yeast to the N-terminal side and expressing it. It is known that type tryptase is secreted into the medium (Andrew, L. Niles, et al. (1998) Biotechnol. Appl. Biochem. 28,
125-131).
[0116]
The transformant obtained as described above can be cultured according to a conventional method, and the culture produces the target polypeptide inside or outside the cell. The medium used for the culture can be appropriately selected from various ones commonly used depending on the host cell used. For example, in the case of the above-mentioned COS cells, RPMI1640 medium or Dulbecco's modified Eagle medium (hereinafter referred to as “DMEM”) ), To which a serum component such as fetal bovine serum may be added as necessary.
[0117]
Recombinant proteins produced in the cells of the transformants or outside the cells by the above culture can be separated and purified by various known separation procedures utilizing the physical properties and chemical properties of the proteins. it can. Specific examples of the method include, for example, treatment with a normal protein precipitant, ultrafiltration, molecular sieve chromatography (gel filtration), adsorption chromatography, ion exchange chromatography, affinity chromatography, and high performance liquid chromatography ( Examples thereof include various liquid chromatography such as HPLC, dialysis, and combinations thereof. In addition, by connecting histidine consisting of 6 residues to the recombinant protein to be expressed, it can be efficiently purified with a nickel affinity column. By combining the above methods, the desired polypeptide can be easily produced in large quantities with high yield and high purity.
[0118]
(2) Production of Anti-TRPM4, PLA1A and BUCS1 Monoclonal Antibodies Examples of antibodies that specifically bind to any of TRPM4, PLA1A and BUCS1 include monoclonal antibodies that specifically bind to any of TRPM4, PLA1A and BUCS1. Although it can be obtained, the acquisition method is as described below.
[0119]
In the production of monoclonal antibodies, the following working steps are generally required. That is,
(A) purification of a biopolymer used as an antigen,
(B) after immunizing the animal by injecting the antigen, collecting blood and assaying the antibody titer to determine the timing of splenectomy, and then preparing antibody-producing cells;
(C) preparation of myeloma cells (hereinafter referred to as “myeloma”);
(D) cell fusion between antibody-producing cells and myeloma,
(E) selecting a hybridoma group producing the desired antibody,
(F) division into single cell clones (cloning),
(G) In some cases, culturing a hybridoma to produce a large amount of a monoclonal antibody, or breeding an animal into which the hybridoma has been transplanted,
(H) Examination of the physiological activity of the monoclonal antibody thus produced and its recognition specificity, or assay of properties as a labeling reagent.
[0120]
Hereinafter, a method for preparing a monoclonal antibody will be described in detail along the above steps, but the method for preparing the antibody is not limited thereto. For example, antibody-producing cells other than splenocytes and myeloma can also be used.
[0121]
(A) Purification of antigen
As the antigen, any of TRPM4, PLA1A, and BUCS1 prepared by the method described above or a part thereof can be used. Further, a membrane fraction prepared from a recombinant cell expressing any of TRPM4, PLA1A and BUCS1, or a recombinant cell itself expressing any of TRPM4, PLA1A and BUCS1, and a method known to those skilled in the art The partial peptide of the protein of the present invention, which is chemically synthesized using the above method, can also be used as an antigen.
[0122]
(B) Preparation of antibody-producing cells
The antigen obtained in step (a) is mixed with an adjuvant such as Freund's complete or incomplete adjuvant or alum, and the animal is immunized as an immunogen. As an experimental animal, an animal used for a known hybridoma production method can be used without any trouble. Specifically, for example, mice, rats, goats, sheep, cows, horses and the like can be used. However, it is preferable to use a mouse or rat as an animal to be immunized from the viewpoint of availability of myeloma cells to be fused with the extracted antibody-producing cells. The strains of mice and rats actually used are not particularly limited. In the case of mice, for example, each strain AKR, BALB / c, BDP, BA, CE, C3H, 57BL, C57BR, C57L, DBA, FL, HTH, HT1, LP, NZB, NZW, RF, RIII, SJL, SWR, WB, 129, etc., and in the case of rats, for example, Low, Lewis, Sprague, Dawley, ACI, BN, Fischer, etc. are used. be able to. These mice and rats can be obtained from experimental animal rearing distributors such as, for example, Japan Charles River, Japan SLC, The Jackson Laboratories. Among these, the BALB / c strain is particularly preferred as a mouse and the low strain is preferred as a rat in consideration of fusion compatibility with myeloma cells described below. It is also preferable to use a mouse in which the biological mechanism for removing autoantibodies is reduced, that is, an autoimmune disease mouse, in consideration of the homology of the antigen between human and mouse. The age of these mice or rats at the time of immunization is preferably 5 to 12 weeks, and more preferably 6 to 8 weeks.
[0123]
To immunize an animal with any of TRPM4, PLA1A and BUCS1 or a recombinant thereof, see, for example, Weir, D .; M. , Handbook of Experimental Immunology Vol. I. II. III. , Blackwell Scientific Publications, Oxford (1987), Kabat, E .; A. and Mayer, M .; M. , Experimental Immunochemistry, Charles C. et al. A well-known method described in detail in, for example, Thomas Publisher Spigfield, Illinois (1964) can be used. Of these immunization methods, a preferred method in the present invention is specifically described as follows, for example. That is, first, a membrane protein fraction, which is an antigen, or cells expressing the antigen is administered intradermally or intraperitoneally to an animal. However, in order to enhance immunity efficiency, it is preferable to use both of them. Intradermal administration is performed in the first half and intraperitoneal administration is performed only in the second half or the last time, whereby immunity efficiency can be particularly increased. The administration schedule of the antigen varies depending on the type of the animal to be immunized, individual differences, and the like. In general, the number of times of administration of the antigen is preferably 3 to 6 times, and the administration interval is preferably 2 to 6 weeks. Four weeks are more preferred. If the number of administrations is excessively increased, the antigen is wasted, and if the administration interval is excessively widened, the cells become less active due to aging of the animal, which is not preferable. The dose of the antigen varies depending on the type of animal, individual differences, and the like, but is generally about 0.05 to 5 ml, preferably about 0.1 to 0.5 ml. The booster immunization is performed 1 to 6 weeks, preferably 2 to 4 weeks, more preferably 2 to 3 weeks after the antigen administration as described above. If the timing of this booster is too late after 6 weeks or too early than 1 week, the effect of booster is small. The dose of the antigen at the time of booster immunization varies depending on the type and size of the animal, but is generally 0.05 to 5 ml, preferably 0.1 to 0.5 ml for a mouse, for example. And more preferably about 0.1 to 0.2 ml. Unnecessary large doses not only reduce the immune effect, but are not preferred for the immunized animals.
[0124]
1 to 10 days, preferably 2 to 5 days, more preferably 2 to 3 days after the booster, spleen cells or lymphocytes containing antibody-producing cells are aseptically removed from the animal to be immunized. At this time, the antibody titer is measured, and the efficiency of subsequent operations can be increased by using an animal having a sufficiently high antibody titer as a source of antibody-producing cells.
[0125]
Examples of the method for measuring the antibody titer used herein include various known techniques such as RIA, ELISA, fluorescent antibody, and passive hemagglutination, and the detection sensitivity, speed, accuracy, and automation of the operation are known. In view of the possibility of the above, the RIA method or the ELISA method is more preferable.
[0126]
The measurement of the antibody titer in the present invention can be performed, for example, by the following procedure according to the ELISA method. First, a purified or partially purified antigen is adsorbed on a solid surface such as a 96-well plate for ELISA, and the solid surface on which the antigen is not adsorbed is a protein unrelated to the antigen, for example, bovine serum albumin (hereinafter referred to as “BSA”). ), And after washing the surface, it is brought into contact with a serially diluted sample (for example, mouse serum) as the first antibody to bind the monoclonal antibody in the sample to the antigen. Further, an antibody against a mouse antibody that is enzyme-labeled as a second antibody is added to bind to the mouse antibody, a substrate of the enzyme is added after washing, and a change in absorbance due to color development based on the decomposition of the substrate is measured. calculate.
[0127]
Isolation of antibody-producing cells from these spleen cells or lymphocytes can be performed by a known method (for example, Kohler et al., Nature, 256, 495, 1975; Kohler et al., Eur. J. Immunol., 6, 511). , 1977; Milstein et al., Nature, 266, 550, 1977; Walsh, Nature, 266, 495, 1977). For example, in the case of spleen cells, it is possible to employ a general method of separating antibody-producing cells by slicing the cells, filtering the cells through a stainless mesh, and suspending the cells in Eagle's minimum essential medium (MEM).
[0128]
(C) Preparation of myeloma cells (hereinafter, “myeloma”)
Myeloma cells used for cell fusion are not particularly limited, and can be appropriately selected from known cell lines and used. However, in consideration of the convenience in selecting hybridomas from the fused cells, it is preferable to use an HGPRT (Hpoxanthine-guanine phosphoribosyl transferase) -deficient strain for which the selection procedure has been established. That is, mouse-derived X63-Ag8 (X63), NS1-Ag4 / 1 (NS1), P3X63-Ag8. Ul (P3Ul), X63-Ag8.653 (X633.653), SP2 / 0-Ag14 (SP2 / 0), MPC11-45.6TG1.7 (45.6TG), FO, S149 / 5XXO, BU. 210. Rat-derived 210. RSY3. Ag. Human-derived U266AR (SKO-007), GM1500.GTG-A12 (GM1500), UC729-6, LICR-LOW-HMy2 (HMy2), 8226AR / NIP4-1 (NP41) such as 1.2.3 (Y3) And so on. These HGPRT-deficient strains can be obtained, for example, from the American Type Culture Collection (ATCC).
[0129]
These cell lines are prepared by adding 8-azaguanine to an appropriate medium, for example, 8-azaguanine medium [RPMI-1640 medium supplemented with glutamine, 2-mercaptoethanol, gentamicin, and fetal calf serum (hereinafter referred to as “FCS”). Added medium], Iscove's Modified Dulbecco's Medium (hereinafter referred to as “IMDM”), or Dulbecco's Modified Eagle Medium (Dulbecco's Modified Eagle Medium; hereinafter referred to as “DMEM”). Was subcultured 3 to 4 days before cell fusion in a normal medium [for example, ASF104 medium containing 10% FCS (manufactured by Ajinomoto Co., Inc.)]. ⁷ Keep the above cell number.
[0130]
(D) Cell fusion
Fusion of antibody-producing cells with myeloma cells can be accomplished by known methods (Weir, DM, Handbook of Experimental Immunology Vol. I. II. III., Blackwell Scientific Publications, Oxford. A., 1987). Mayer, MM, Experimental Immunochemistry, Charles C Thomas Publishers Spigfield, Illinois (1964), etc.) can be appropriately carried out under conditions that do not extremely reduce the cell viability. As such a method, for example, a chemical method of mixing antibody-producing cells and myeloma cells in a high-concentration polymer solution such as polyethylene glycol or a physical method using electrical stimulation can be used. Among them, specific examples of the above chemical methods are as follows. That is, when polyethylene glycol is used as the high-concentration polymer solution, antibody-producing cells are reacted at a temperature of 30 to 40 ° C., preferably 35 to 38 ° C. in a polyethylene glycol solution having a molecular weight of 1500 to 6000, preferably 2000 to 4000. Mix with myeloma cells for 1-10 minutes, preferably 5-8 minutes.
[0131]
(E) Selection of hybridoma group
The method for selecting a hybridoma obtained by the cell fusion is not particularly limited, but is usually a HAT (hypoxanthine / aminopterin / thymidine) selection method [Kohler et al. , Nature, 256, 495 (1975); Milstein at al. , Nature 266, 550 (1977)]. This method is effective when hybridomas are obtained using myeloma cells of an HGPRT-deficient strain that cannot survive aminopterin. In other words, by culturing unfused cells and hybridomas in a HAT medium, only hybridomas having aminobuterin resistance can be selectively left and grown.
[0132]
(F) Division into single cell clones (cloning)
Known methods such as the methylcellulose method, the soft agarose method, and the limiting dilution method can be used as the cloning method of the hybridoma [for example, Barbara, B. et al. M. and Stanley, M .; S. : Selected Methods in Cellular Immunology, W.W. H. Freeman and Company, San Francisco (1980)]. The cloning method includes a limiting dilution method in which one hybridoma is diluted and cultured so that one hybridoma is contained in one well of the plate, a soft agar method in which the colony is collected by culturing in a soft agar medium, and a micromanipulator. And a cell sorter for separating one cell using a cell sorter. Among these methods, the limiting dilution method is particularly preferable. In this method, a microplate is inoculated with a feeder such as a rat embryo-derived fibroblast cell line or a normal mouse spleen cell, thymocyte, or ascites cell. On the other hand, the hybridomas are previously diluted in the medium to 0.2 to 0.5 cells / 0.2 ml, and 0.1 ml of the diluted suspension of the hybridomas is added to each well, and the suspension is added at regular intervals (for example, 3 ml / well). The culture of hybridomas can be expanded by continuing the culture for about 2 weeks while replacing about 1/3 of the medium with a new one every day).
[0133]
For the wells in which the antibody titer was recognized, for example, cloning by the limiting dilution method was repeated 2 to 4 times, and those in which the antibody titer was stably recognized were replaced with any of the anti-TRPM4, anti-PLA1A and anti-BUCS1 monoclonal antibody-producing hybridoma strains. Select as
[0134]
(G) Preparation of monoclonal antibody by hybridoma culture
By culturing the hybridomas selected in this manner, a monoclonal antibody can be obtained efficiently, but it is desirable to screen for hybridomas producing the desired monoclonal antibody prior to culturing. For this screening, a method known per se can be employed.
[0135]
The measurement of the antibody titer in the present invention can be performed, for example, by the following procedure according to the ELISA method. First, cells expressing at least one of purified or partially purified TRPM4, PLA1A and BUCS1, or at least one of TRPM4, PLA1A and BUCS1 are adsorbed onto a solid surface such as a 96-well plate for ELISA. Further, a solid phase surface on which no antigen is adsorbed is covered with a protein irrelevant to the antigen, for example, bovine serum albumin (hereinafter, referred to as “BSA”), and after washing the surface, a sample serially diluted as a first antibody (eg, mouse serum) ) To allow at least one of the anti-TRPM4 antibody, anti-PLA1A antibody and anti-BUCS1 antibody in the sample to bind to the antigen. Further, an antibody against a mouse antibody that is enzyme-labeled as a second antibody is added to bind to the mouse antibody, a substrate of the enzyme is added after washing, and a change in absorbance due to color development based on the decomposition of the substrate is measured. calculate. Such screening may be performed after cloning the hybridoma as described above, or may be performed before it.
[0136]
The hybridoma obtained by the above method can be stored in a frozen state in liquid nitrogen or a freezer at -80 ° C or lower.
[0137]
The hybridoma that has completed cloning is cultured by changing the medium from an HT medium to a normal medium. Large-scale culture is performed by rotary culture using a large culture bottle or spinner culture. The monoclonal antibody that specifically binds to the protein of the present invention can be obtained by purifying the supernatant from this large-scale culture using a method known to those skilled in the art such as gel filtration. Hybridomas are injected intraperitoneally into mice of the same strain (for example, BALB / c as described above) or Nu / Nu mice, and the hybridomas are allowed to proliferate, whereby ascites containing a large amount of the monoclonal antibody of the present invention. Can be obtained. When administered intraperitoneally, mineral oil such as 2,6,10,14-tetramethylpentadecane (pristane) or the like is administered in advance (3 to 7 days before). As a result, a larger amount of ascites is obtained. For example, after intraperitoneally injecting an immunosuppressive agent intraperitoneally into mice of the same strain as the hybridoma to inactivate T cells, ⁶ -10 ⁷ The individual hybridoma clone cells are suspended (0.5 ml) in a serum-free medium and administered intraperitoneally. When the abdomen is normally swollen and accumulated in ascites, ascites is collected from the mouse. According to this method, a monoclonal antibody having a concentration of about 100 times or more as compared with that in a culture solution can be obtained.
[0138]
Monoclonal antibodies obtained by the above method are described, for example, in Weir, D .; M. : Handbook of Experimental Immunology Vol. I, II, III, Blackwell Scientific Publications, Oxford (1978). That is, ammonium sulfate precipitation, gel filtration, ion exchange chromatography, affinity chromatography and the like. Among these methods, it is possible to purify the monoclonal antibody by repeating the ammonium sulfate salting-out method three to four times, preferably three to six times. However, this method results in a very low yield of the purified monoclonal antibody. Therefore, at least one, preferably two, methods selected from gel filtration, ion-exchange chromatography, affinity chromatography, etc. are performed on the crude monoclonal antibody that has been subjected to ammonium sulfate fractionation once or twice. Thereby, a highly purified monoclonal antibody can be obtained in a high yield. Combinations and sequences of the ammonium sulfate precipitation method and other methods include (1) ammonium sulfate precipitation-ion exchange chromatography-gel filtration, and (2) ammonium sulfate precipitation-ion exchange chromatography-affinity chromatography. Method, (3) ammonium sulfate precipitation-gel filtration-affinity chromatography, etc., but in order to obtain a monoclonal antibody with high purity and high yield, the combination of (3) above must be used. preferable.
[0139]
As a simple purification method, a commercially available monoclonal antibody purification kit (for example, MAbTrap GII kit; manufactured by Pharmacia) or the like can also be used.
[0140]
The monoclonal antibody thus obtained is directed against TRPM4 when TRPM4 is used as an antigen, against PLA1A when using PLA1A as an antigen, and against BUCS1 when using BUCS1 as an antigen. High antigen specificity.
[0141]
(H) Monoclonal antibody assay
The isotype and subclass of the thus obtained monoclonal antibody can be determined as follows. First, examples of the identification method include the Ouchterlony method, the ELISA method, and the RIA method. The Otterlony method is simple but requires a concentration operation when the concentration of the monoclonal antibody is low. On the other hand, when the ELISA method or the RIA method is used, the culture supernatant is allowed to react with the antigen-adsorbed solid phase as it is, and further, antibodies corresponding to various immunoglobulin isotypes and subclasses are used as secondary antibodies. Isotypes and subclasses can be identified. As a simpler method, a commercially available kit for identification (for example, Mouse Typer Kit; manufactured by Bio-Rad) can be used.
[0142]
Further, the protein can be quantified by the Foreign Lowry method and a method of calculating from the absorbance at 280 nm [1.4 (OD280) = 1 mg / ml of immunoglobulin].
[0143]
(3) Preparation of humanized anti-TRPM4 antibody, humanized anti-PLA1A antibody and humanized anti-BUCS1 antibody
When the obtained antibody is used as a drug for humans, it is desirable to prepare human anti-human TRPM4, anti-human PLA1A and anti-human BUCS1 antibodies due to the problem of antigenicity. Production of human anti-human TRPM4, anti-human PLA1A and anti-human BUCS1 antibodies can be obtained by the following method. (1) Human lymphocytes collected from human peripheral blood or spleen were sensitized in vitro with any of the antigens TRPM4, PLA1A or BUCS1 in the presence of IL-4, and the sensitized human lymphocytes were used as mice and humans. Is a heterohybridoma with ₆ H ₆ / B ₅ (ATCC CRL-1823) to screen the desired antibody-producing hybridoma. The antibodies produced by the obtained antibody-producing hybridomas are human anti-human TRPM4 for human TRPM4, anti-human PLA1A for human PLA1A, and anti-human BUCS1 monoclonal antibody for BUCS1. Antibodies that neutralize the activity of TRPM4, PLA1A and BUCS1 are selected from these antibodies. However, in the method of sensitizing human lymphocytes in vitro as described above, it is generally difficult to obtain an antibody having a high affinity for an antigen. Therefore, in order to obtain a high-affinity monoclonal antibody to any of TRPM4, PLA1A and BUCS1, the low-affinity human anti-human TRPM4, anti-human PLA1A and anti-human BUCS1 monoclonal antibodies obtained as described above were used. High affinity is required. This includes randomizing the respective CDR regions (particularly CDR-3) of the humanized anti-human TRPM4, anti-human PLA1A and anti-human BUCS1 monoclonal antibodies, which are obtained as described above and are low-affinity but low-affinity antibodies. Mutations are introduced, expressed by phage, and strongly bind to antigens TRPM4, PLA1A and BUCS1 by phage display using a plate on which any of human TRPM4, PLA1A and BUCS1 is immobilized. A phage is selected, the phage is expanded in Escherichia coli, and the amino acid sequence of CDR having high affinity may be determined from the base sequence. Genes encoding the thus obtained human anti-human TRPM4, anti-human PLA1A and anti-human BUCS1 monoclonal antibodies are incorporated into a commonly used expression vector for mammalian cells and expressed to express human-type. Anti-human TRPM4, anti-human PLA1A and anti-human BUCS1 monoclonal antibodies are obtained. From these, human anti-human TRPM4, anti-human PLA1A and anti-human BUCS1 monoclonal antibodies which neutralize the respective biological activities of TRPM4, PLA1A and BUCS1 and have high affinity can be selected. (2) Using Balb / c mice, mouse-type anti-human TRPM4, anti-human PLA1A and anti-human PLA1A were obtained by a conventional method (Kohler et al .: Nature 256, p. 495-497, 1975) in the same manner as in the present invention. A human BUCS1 monoclonal antibody is prepared, and a monoclonal antibody that neutralizes the biological activity of any of human TRPM4, human PLA1A and human BUCS1 and has high affinity is selected. CDR-grafting (Winter and Milstein: Nature: CDR-region (CDR-1, 2 and 3) of the high-affinity mouse anti-human TRPM4, anti-human PLA1A and anti-human BUCS1 monoclonal antibodies into the CDR region of human IgG. 349, p293-299, 1991) can be humanized. In addition to the above, {circle around (3)} human peripheral blood lymphocytes are transplanted into Severe combined immune definition (SCID) mice, and the transplanted SCID mice produce human antibodies (Mosier DE et al .: Nature). 335, p256-259, 1988; Duchosal MA et al .: Nature 355, p258-262, 1992), and sensitizing any of TRPM4, PLA1A and BUCS1 as an antigen, and screening for TRPM4, Lymphocytes producing a humanized monoclonal antibody specific to either PAL1A or BUCS1 can be collected from the mouse. The obtained lymphocytes were purified from a mouse and human heterohybridoma K in the same manner as in the above-mentioned method (1) for preparing a human antibody. ₆ H ₆ / B ₅ (ATCC CRL-1823), and the resulting hybridomas are screened to obtain hybridomas producing the desired humanized monoclonal antibody. By culturing the hybridoma thus obtained, the desired humanized monoclonal antibody can be produced in large quantities, and purified by the same method as described above to obtain a purified product. Also, by cloning the gene (cDNA) encoding the desired humanized monoclonal antibody, incorporating this gene into an appropriate vector by genetic engineering techniques, and expressing it in various animal cells, co-injected cells, or Escherichia coli as a host. Thus, a large amount of recombinant humanized monoclonal antibodies can be produced. By purifying the obtained culture solution in the same manner as described above, a large amount of the purified humanized monoclonal antibody can be obtained. Furthermore, from the anti-human TRPM4, anti-human PLA1A, and anti-human BUCS1 monoclonal antibodies obtained by the above-described method, an antibody that neutralizes any biological activity of TRPM4, PLA1A, and BUCS1 can be obtained. Antibodies that neutralize any of the biological activities of TRPM4, PLA1A and BUCS1 inhibit any of the biological activities of TRPM4, PLA1A and BUCS1 in vivo, that is, inhibit the growth of cancer cells. In particular, it is expected as a therapeutic and / or prophylactic agent for cancer, preferably prostate cancer. The neutralizing activity of any biological activity of TRPM4, PLA1A and BUCS1 in vitro can be measured, for example, by the activity of suppressing cell carcinogenesis in a cell overexpressing any of TRPM4, PLA1A and BUCS1. it can. For example, a mouse fibroblast cell line NIH3T3 overexpressing at least one of TRPM4, PLA1A and BUCS1 is cultured, and depending on the protein overexpressed at various concentrations in the culture system, anti-human TRPM4, By adding at least one of an anti-human PLA1A and an anti-human BUCS1 antibody, the inhibitory activity on focus formation, colony formation and spheroid proliferation can be measured. The therapeutic and / or prophylactic effects of anti-human TRPM4, anti-human PLA1A and anti-human BUCS1 antibodies on prostate cancer using in vivo experimental animals include, for example, overexpression of at least one of TRPM4, PLA1A and BUCS1 Depending on the protein overexpressed in the transgenic animal, at least one of anti-TRPM4, anti-PLA1A and anti-BUCS1 antibodies is administered, and the change in cancer cells can be measured.
[0144]
6. Pharmaceuticals containing anti-TRPM4 monoclonal antibody, anti-PLA1A monoclonal antibody and anti-BUCS1 monoclonal antibody
Among the anti-human monoclonal antibodies obtained by the method described in the above section “5. Production of anti-TRPM4 monoclonal antibody, anti-PLA1A monoclonal antibody and anti-BUCS1 monoclonal antibody”, respective organisms of TRPM4, PLA1A and anti-BUCS1 Antibodies that neutralize the activity can be obtained. Antibodies that neutralize the respective biological activities of TRPM4, PLA1A and anti-BUCS1 inhibit the respective biological activities of TRPM4, PLA1A and anti-BUCS1 in vivo, that is, inhibit the canceration of cells. In particular, it is expected as a therapeutic and / or prophylactic agent for cancer. The neutralizing activity of the respective biological activities of anti-TRPM4 antibody, anti-PLA1A antibody and anti-BUCS1 antibody in vitro is, for example, canceration of cells in cells overexpressing at least one of TRPM4, PLA1A and BUCS1. Can be measured. For example, a mouse fibroblast cell line NIH3T3 overexpressing at least one of TRPM4, PLA1A and BUCS1 is cultured, and various concentrations of anti-TRPM4 antibody, anti-PLA1A antibody and / or anti-BUCS1 antibody are cultured at various concentrations in the culture system. By adding only one of them, the inhibitory activity on focus formation, colony formation and spheroid proliferation can be measured. The therapeutic and / or prophylactic effects of anti-TRPM4 antibody, anti-PLA1A antibody and anti-BUCS1 antibody on prostate cancer using experimental animals in vivo, for example, may be caused by overexpression of any of TRPM4, PLA1A and BUCS1. By administering an antibody against an overexpressed protein to a certain transgenic animal, a change in cancer cells can be measured.
[0145]
The thus-obtained antibody that neutralizes any biological activity selected from TRPM4, PLA1A and BUCS1 can be used as a medicament, particularly as a pharmaceutical composition for treating and / or preventing cancer, or as such. It is useful as an antibody for immunological diagnosis of various diseases.
[0146]
Antibodies of the present invention include substances having anti-cancer activity such as doxorubicin, evirubicin, daunorubicin, paclitaxel, docetaxel, irinotecan, topotecan, 9-camptothecin, cisplatin, AraC, 5FU, neocarzinocitatin, anti-HER2 antibody, TRA8, and TRAIL. They can be used in combination. When used in combination, they may be administered simultaneously or separately. The antibody of the present invention can be formulated and administered orally or parenterally. The preparation containing the antibody of the present invention is safely administered to humans or animals as a pharmaceutical composition containing an antibody that recognizes any of TRPM4, PLA1A and BUCS1 as an active ingredient. In addition, the formulation also includes substances having anticancer activity such as doxorubicin, evirubicin, daunorubicin, paclitaxel, docetaxel, irinotecan, topotecan, 9-camptothecin, cisplatin, AraC, 5FU, neocarzinocitatin, anti-HER2 antibody, TRA8, and TRAIL. It may be a formulation containing it. Examples of the form of the pharmaceutical composition include injection preparations including infusion, suppositories, nasal preparations, sublingual preparations, transdermal absorption agents and the like. Since monoclonal antibodies are high-molecular proteins, they are remarkably adsorbed on glass containers such as vials and syringes and are unstable, and are easily absorbed by various physicochemical factors such as heat, pH and humidity. To be deactivated. Therefore, a stabilizer, a pH adjuster, a buffer, a solubilizing agent, a surfactant and the like are added in order to formulate the composition in a stable form. Examples of the stabilizer include amino acids such as glycine and alanine, sugars such as dextran 40 and mannose, and sugar alcohols such as sorbitol, mannitol, and xylitol, and two or more of these may be used in combination. These stabilizers are preferably added in an amount of 0.01 to 100 times, especially 0.1 to 10 times the weight of the antibody. By adding these stabilizers, the storage stability of the liquid preparation or freeze-dried preparation can be improved. Examples of the buffer include a phosphate buffer and a citrate buffer. The buffer adjusts the pH of the aqueous solution after re-dissolving the liquid preparation or the lyophilized preparation, and contributes to the stability and solubility of the antibody. The amount of the buffer added is preferably, for example, 1 to 10 mM based on the amount of water after adopting a liquid preparation or a lyophilized preparation. Examples of the surfactant include preferably polysorbate 20, Pluronic F-68, polyethylene glycol, and the like, and particularly preferably polysorbate 80. Two or more of these may be used in combination. The surfactant is preferably added in an amount of 0.001 to 1.0% based on the weight of water after reconstitution of the liquid preparation or the freeze-dried preparation. The preparation of the antibody of the present invention can be prepared by adding the above-mentioned stabilizing agent, buffering agent, or anti-adsorption agent, but particularly when used as a medical or veterinary injection, it is acceptable as an osmotic pressure. The osmotic pressure ratio is preferably from 1 to 2. The osmotic pressure ratio can be adjusted by increasing or decreasing sodium chloride during formulation. The antibody content in the preparation can be appropriately adjusted depending on the disease to be applied, the administration route, and the like. The dose of the human antibody to humans is determined by the affinity of each antibody for TRPM4, PLA1A and BUCS1, ie, TRPM4 The higher the affinity (the lower the Kd value) with respect to the dissociation constant (Kd value) for each of PLA1A and BUCS1, the smaller the dose to humans, the more effective the drug. When human anti-TRPM4 antibody, human anti-PLA1A antibody and human anti-BUCS1 antibody are administered to humans, about 0.1 to 100 mg / kg may be administered once every 1 to 30 days.
[0147]
7. Search for directly interacting substances
In another aspect of the present invention, there is provided a drug design method based on the three-dimensional structure of the protein, for the purpose of obtaining a substance that suppresses the activity of at least one of TRPM4, PLA1A and BUCS1. including. Such a technique is known as a rational drug design method, and is used for searching for a compound that efficiently inhibits or activates functions such as enzyme activity and binding to a ligand, cofactor, or DNA. ing. As an example of this, inhibitors of proteases, which are already marketed anti-HIV agents, are well known. In the three-dimensional structural analysis of TRPM4, PLA1A and BUCS1, generally well-known techniques such as X-ray crystallography and nuclear magnetic resonance can be used. Furthermore, in search of a substance that suppresses the functions of TRPM4, PLA1A and BUCS1, a design utilizing computer drug design (CADD) is also possible. As this example, a low molecular weight compound (International Patent Application Publication No. WO 99/58515) which inhibits the function of AP-1 which is expected as a new genomic drug for the treatment of rheumatoid arthritis is known. By such a method, TRPM4, PLA1A and BUCS1 are directly bound to, or TRPM4, PLA1A and BUCS1 by inhibiting the interaction of at least one of the other factors with TRPM4, A substance that suppresses the functions of PLA1A and BUCS1 can be obtained.
[0148]
Still another embodiment relates to a polypeptide to which any of TRPM4, PLA1A and BUCS1 associates, that is, a partner protein of any of TRPM4, PLA1A and BUCS1. That is, the present invention relates to a method for screening a partner protein that regulates the activity of TRPM4, PLA1A and BUCS1.
[0149]
One embodiment of this screening method includes a step of bringing a test protein sample into contact with any of TRPM4, PLA1A, and BUCS1, and selecting a protein that binds to any of TRPM4, PLA1A, and BUCS1. As such a method, for example, a method of performing affinity purification of a protein bound thereto using any of the purified TRPM4, PLA1A and BUCS1 is exemplified. As an example of a specific method, a fusion of a sequence consisting of six histidines as an affinity tag to TRPM4, PLA1A, and BUCS1 is prepared, and this is extracted from a cell extract (a nickel-agarose column is charged in advance. And the fraction passed through the column) at 4 ° C. for 12 hours, and then separately add a nickel-agarose carrier to the mixture and incubate at 4 ° C. for 1 hour. After sufficiently washing the nickel-agarose carrier with a washing buffer, 100 mM imidazole is added to elute and purify the protein in the cell extract specifically binding to any of TRPM4, PLA1A and BUCS1, and determine its structure. I do. In this manner, a protein that directly binds to any of TRPM4, PLA1A and BUCS1, and has no binding activity to any of TRPM4, PLA1A and BUCS1, but directly binds to any of TRPM4, PLA1A and BUCS1 as a subunit A protein binding to any of TRPM4, PLA1A and BUCS1 can be purified indirectly by forming a complex with the protein [Experimental Medicine Separate Volume, Bio Manual Series 5, “Transcription Factor Research Methods”, pp. 215-219 (published by Yodosha) )].
[0150]
As another method, a far western blot method [Experimental Medicine Separate Volume, “New Genetic Engineering Handbook”, pp76-81 (published by Yodosha)] and a two-hybrid system method using yeast or mammalian cells [Experimental Medicine Separate Volume, Cloning by "New Genetic Engineering Handbook" pp66-75 (published by Yodosha), "Checkmate Manmarian Two Hybrid System" (promega)] is also possible, but is not limited to these methods.
[0151]
In this way, if a cDNA of a partner protein that interacts directly or indirectly with any of TRPM4, PLA1A and BUCS1 is obtained, a substance that inhibits the interaction of any of TRPM4, PLA1A and BUCS1 with the partner protein can be obtained. It can be used for functional screening. Specifically, for example, a fusion protein of glutathione S-transferase with any of TRPM4, PLA1A and BUCS1 is prepared, bound to a microplate covered with an anti-glutathione S-transferase antibody, and then biotinylated. The protein is contacted with the fusion protein, and the binding to the fusion protein is detected with streptavidinated alkaline phosphatase. When the biotinylated partner protein is added, a test substance is also added, and a substance that promotes or inhibits the binding between the fusion protein and the partner protein is selected. According to this method, a substance that directly acts on the fusion protein or a substance that directly acts on the partner protein is obtained.
[0152]
If the binding between the fusion protein and the partner protein is indirect and mediated by some other factor, the above assay is performed in the same manner, for example, in the presence of a cell extract containing the factor. In this case, a substance that acts on the factor may be selected.
[0153]
When the obtained partner protein has the activity of suppressing any of the functions of TRPM4, PLA1A and BUCS1, the expression vector for any of the genes of TRPM4, PLA1A and BUCS1 described above is applied. According to the test method described above, screening of a candidate substance useful as an anticancer agent, for example, a therapeutic or prophylactic agent for prostate cancer, can be performed. When the obtained partner protein has an activity of suppressing any of TRPM4, PLA1A and BUCS1, the polynucleotide having a nucleotide sequence encoding such a suppressor may be used for prostate cancer. Can be used for gene therapy.
[0154]
Such a polynucleotide can be obtained by, for example, analyzing the amino acid sequence of the identified inhibitor, synthesizing an oligonucleotide probe consisting of a nucleotide sequence encoding the amino acid sequence, and screening a cDNA library or genomic library. Can be obtained. When a peptide having an inhibitory activity of at least one of TRPM4, PLA1A and BUCS1 is derived from a randomly synthesized artificial peptide library, the peptide comprises a nucleotide sequence encoding the amino acid sequence of the peptide. DNA is chemically synthesized.
[0155]
In gene therapy, a gene encoding the inhibitor thus obtained is incorporated into, for example, a viral vector, and a virus (detoxified) having the recombinant viral vector is transmitted to a patient. Since an anticancer factor is produced in the patient and has a function of suppressing the growth of cancer cells, prostate cancer can be treated.
[0156]
As a method for introducing a gene therapy agent into cells, a gene transfer method using a viral vector or a non-viral gene transfer method (Nikkei Science, April 1994, pp. 20-45, Experimental Medicine Special Edition, 12 (15) (1994), Experimental Medicine Separate Volume, “Basic Technology for Gene Therapy”, Youtosha (1996)).
[0157]
As a method for gene transfer using a virus vector, for example, TR4 or mutant TR4 is encoded in a DNA virus or RNA virus such as retrovirus, adenovirus, adeno-associated virus, herpes virus, vaccinia virus, pox virus, polio virus, and simbis virus. And a method of incorporating and introducing DNA to be incorporated. Among them, a method using a retrovirus, an adenovirus, an adeno-associated virus, and a vaccinia virus is particularly preferable. Examples of non-viral gene transfer methods include a method of directly administering an expression plasmid intramuscularly (DNA vaccine method), a liposome method, a lipofectin method, a microinjection method, a calcium phosphate method, and an electroporation method. The vaccine method and the liposome method are preferred.
[0158]
Further, in order for a gene therapy agent to actually act as a medicine, an in vivo method of directly introducing DNA into the body, or a method of removing certain cells from a human and introducing the DNA into the cells outside the body, and then transferring the cells to the body (Nikkei Science, April 1994, pp. 20-45, Monthly Pharmaceutical Affairs, 36 (1), 23-48 (1994), Experimental Medicine Special Edition, 12 (15) (1994) )).
[0159]
For example, when the gene therapy agent is administered by an in vivo method, it is administered by an appropriate administration route, such as vein, artery, subcutaneous, intradermal, intramuscular, etc., depending on the disease, condition and the like. When administered by an in vivo method, the gene therapy agent is generally used as an injection or the like, but if necessary, a conventional carrier may be added. In the case of a liposome or a membrane-fused liposome (Sendai virus-liposome or the like), a liposome preparation such as a suspension, a freezing agent, a centrifugal concentrated frozen agent and the like can be obtained.
[0160]
A nucleotide sequence complementary to the nucleotide sequence shown in at least one selected from

nucleotide numbers

1, 3, 5, 7, and 9 of SEQ ID NO: 1 in the sequence listing, or a nucleotide sequence complementary to a partial sequence of the sequence, It can be used for so-called antisense treatment. The antisense molecule is a DNA consisting of usually 15 to 30 mer, which is complementary to a part of the nucleotide sequence shown in at least one selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 1, 3, 5, 7, and 9 in the sequence listing; Alternatively, it can be used as a stable DNA derivative such as phosphorothioate, methylphosphonate or morpholino derivative thereof, or a stable RNA derivative such as 2′-O-alkyl RNA. Such antisense molecules can be introduced into cells by methods well known in the art of the present invention, such as by microinjection, liposome encapsulation, or expression using a vector having an antisense sequence. Such antisense therapy is useful for treating or preventing a disease caused by excessively increasing the activity of the protein encoded by the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing.
[0161]
A composition useful as a medicine containing the antisense oligonucleotide can be produced by a known method such as mixing a pharmaceutically acceptable carrier. Examples of such carriers and methods of manufacture are described in Applied Antisense Oligonucleotide Technology (1998 Wiley-Liss, Inc.). The preparation containing the antisense oligonucleotide is itself or a mixture with an appropriate pharmacologically acceptable excipient, diluent, or the like, and is orally administered as a tablet, capsule, granule, powder, or syrup. Alternatively, it can be administered parenterally by injection, suppository, patch, or external preparation. These formulations include excipients (e.g., sugar derivatives such as lactose, sucrose, glucose, mannitol, sorbitol; starch derivatives such as corn starch, potato starch, alpha starch, dextrin; cellulose derivatives such as crystalline cellulose; Gum arabic; dextran; organic excipients such as pullulan; and silicate derivatives such as light anhydrous silicic acid, synthetic aluminum silicate, calcium silicate, magnesium metasilicate aluminate; phosphates such as calcium hydrogen phosphate; Inorganic excipients such as carbonates such as calcium; sulfates such as calcium sulfate; and lubricants (eg, metal stearate such as stearic acid, calcium stearate, magnesium stearate). Salt; talc; colloidal silica; beeswax; Boric acid; adipic acid; sulfates such as sodium sulfate; glycol; fumaric acid; sodium benzoate; DL leucine; lauryl sulfates such as sodium lauryl sulfate and magnesium lauryl sulfate; Silicic acids such as silicic acid hydrate; and the above-mentioned starch derivatives.), Binders (for example, hydroxypropylcellulose, hydroxypropylmethylcellulose, polyvinylpyrrolidone, macrogol, and the same as the above-mentioned excipients) And disintegrants (for example, cellulose derivatives such as low-substituted hydroxypropylcellulose, carboxymethylcellulose, carboxymethylcellulose calcium, and internally cross-linked sodium carboxymethylcellulose); Starch, celluloses such as sodium carboxymethyl starch, crosslinked polyvinylpyrrolidone, and emulsifiers (eg, colloidal clays such as bentonite and veegum); magnesium hydroxide, hydroxide Metal hydroxides such as aluminum; anionic surfactants such as sodium lauryl sulfate and calcium stearate; cationic surfactants such as benzalkonium chloride; and polyoxyethylene alkyl ether, polyoxyethylene sorbitan fatty acid Esters, nonionic surfactants such as sucrose fatty acid esters), stabilizers (paraoxybenzoic acid esters such as methylparaben and propylparaben; chlorobutanol, benzyl alcohol, phenylethyl) Alcohols such as alcohol; benzalkonium chloride; phenols, phenols such as cresol; thimerosal; dehydroacetic acid; and sorbic acid and the. ), Flavoring agents (for example, commonly used sweeteners, sour agents, flavors, etc.) and diluents can be used in a well-known method.
[0162]
As for the method of introducing the compound of the present invention into a patient, a colloid dispersion system can be used in addition to the above. The colloidal dispersion system is expected to have the effect of increasing the stability of the compound in vivo and the effect of efficiently transporting the compound to a specific organ, tissue or cell. Colloidal dispersions are not limited as long as they are commonly used, but are based on polymer complexes, nanocapsules, microspheres, beads, and lipids including oil-in-water emulsifiers, micelles, mixed micelles, and liposomes. Dispersed systems can be mentioned, and are preferably a plurality of liposomes and artificial membrane vesicles having an effect of efficiently transporting a compound to a specific organ, tissue or cell (Mannino et al., Biotechniques, 1988). , 6,682; Blume and Cevc, Biochem. Et Biophys. Acta, 1990, 1029, 91; Lappalainen et al., Antiviral Res., 1994, 23, 119; Chonn and Cullis, Curent. 995,6,698).
[0163]
Unilamellar liposomes, ranging in size from 0.2-0.4 μm, can encapsulate a significant proportion of the aqueous buffer containing macromolecules, and the compound is encapsulated in this aqueous inner membrane, Is transported to brain cells in a more active form (Fraley et al., Trends Biochem. Sci., 1981, 6, 77). The composition of the liposome is usually a complex of a lipid, especially a phospholipid, especially a phospholipid having a high phase transition temperature, with one or more steroids, especially cholesterol. Examples of lipids useful for liposome production include phosphatidyl compounds such as phosphatidylglycerol, phosphatidylcholine, phosphatidylserine, sphingolipids, phosphatidylethanolamine, cerebroside and ganglioside. Particularly useful are diacylphosphatidylglycerols, wherein the lipid moiety contains 14-18 carbon atoms, especially 16-18 carbon atoms, and is saturated (with a double bond within the 14-18 carbon atom chain). Lack). Representative phospholipids include phosphatidylcholine, dipalmitoyl phosphatidylcholine, and distearoyl phosphatidylcholine.
[0164]
Targeting colloidal dispersion systems, including liposomes, may be either passive or active. Passive targeting is achieved by taking advantage of the liposome's natural tendency to distribute to cells of the reticuloendothelial system of organs containing sinusoidal capillaries. On the other hand, active targeting can be performed, for example, by using a protein coat of a virus (Morishita et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 1993, 90, 8474), a monoclonal antibody (or a monoclonal antibody thereof). Specific ligands such as sugars, glycolipids or proteins (or suitable oligopeptide fragments thereof) can be attached to liposomes, or can be attached to organs and cell types other than the naturally occurring localization sites. Techniques for modifying the liposome by changing the composition of the liposome to achieve distribution can be mentioned. The surface of the targeted colloidal dispersion can be modified in various ways. In liposome-targeted delivery systems, lipid groups can be incorporated into the lipid bilayer of the liposome to maintain the target ligand in intimate association with the lipid bilayer. Various linking groups can be used to link the lipid chain to the targeting ligand. Target ligands that bind to specific cell surface molecules that are predominantly found on cells where delivery of the oligonucleotides of the invention are desired are, for example, (1) predominantly expressed by cells where delivery is desired Polyclonal or monoclonal antibodies that specifically bind to hormones, growth factors or suitable oligopeptide fragments thereof, or (2) antigenic epitopes predominantly found on target cells, which bind to specific cell receptors Or a suitable fragment thereof (eg, Fab; F (ab ') 2). The two or more bioactive agents can also be complexed and administered within a single liposome. Agents that increase the intracellular stability and / or targeting of the contents can also be added to the colloidal dispersion.
[0165]
The dosage varies depending on symptoms, age, etc., but in the case of oral administration, the lower limit is 1 mg (preferably 30 mg) and the upper limit is 2000 mg (preferably 1500 mg) per dose. A lower limit of 0.1 mg (preferably 5 mg) and an upper limit of 1000 mg (preferably 500 mg) can be administered by subcutaneous injection, intramuscular injection or intravenous injection.
[0166]
【Example】
Hereinafter, the present invention will be described with reference to examples, but the present invention is not limited to these examples. In the following examples, unless otherwise specified, each operation relating to gene manipulation is referred to as “Molecular Cloning” [Sambrook, J. et al. Fritsch, E .; F. And Maniatis, T .; Published by Cold Spring Harbor Laboratory Press in 1989], or in the case of using a commercially available reagent or kit, according to the instructions of the commercially available product.
[0167]
Example 1 Human TRPM4 Expression Profile Analysis
Regarding an EST probe (Affymetrix GeneChip HG-U133 probe 219360_s_at: manufactured by Affymetrix) having a nucleotide sequence partially overlapping with the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing, a database (GeneExpress Software) made by GeneLogic, Inc. The expression profile analysis was performed using 4.4.2).
[0168]
First, when the gene expression level was compared between the prostate-derived / normal tissue sample (54 cases) and the prostate-derived / tumor sample (87 cases), the gene expression was significantly higher in the prostate-derived / tumor sample (P value <0.0001: FIG. ).
[0169]
Next, in the database, 54 prostate-derived / normal tissue samples and a normal tissue sample group other than the prostate (37 adipose tissue samples, 8 bone samples, 74 breast samples, 522 heart samples, 99 kidney samples, 99 liver samples) 61 samples, 122 lung samples, 13 lymph node samples, 42 muscle samples, 96 ovarian samples, 46 pancreatic samples, 8 placental samples, 66 skin samples, 41 spleen samples, 70 thymus samples, When the gene expression levels of TRPM4 were compared for 27 thyroid samples and 59 uterine samples), they were significantly lower in the normal tissue sample group other than the prostate (P value of breast sample = 0.0002, placental sample) P value at 0.0035, P value at other organ samples <0.0 01: Fig. 2).
[0170]
Example 2 Human PLA1A expression profile analysis
Regarding an EST probe (Affymetrix GeneChip HG-U133 probe 219584_at: manufactured by Affymetrix) having a nucleotide sequence partially overlapping with the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 7 in the sequence listing, a database (GeneExpress SoftwareRestore1) from GeneLogic, Inc. The expression profile analysis was performed using 4.4.2).
[0171]
First, when gene expression levels were compared between the prostate-derived / normal tissue sample 54 and the prostate-derived / tumor sample 87, the transcript was significantly higher in the prostate-derived / tumor sample (P value <0.0001: FIG. 3). ).
[0172]
Next, in the database, 54 prostate-derived / normal tissue samples and a normal tissue sample group other than the prostate (37 adipose tissue samples, 74 breast samples, 221 large intestine samples, 82 duodenal samples, 8 gallbladder samples, 8 heart samples) 522 samples, 96 ovarian samples, 49 rectum samples, 66 skin samples, 95 small intestine samples, 41 spleen samples, 70 thymus samples, and 27 thyroid samples). It was significantly lower in the normal tissue sample group other than the prostate (P value = 0.0003 in adipose tissue sample, P value = 0.0041 in gallbladder sample, P value = 0.0127 in thyroid sample, P value <0.0001 in other organ samples: FIG. 4).
[0173]
Example 3 Expression analysis of human BUCS1
About an EST probe (Affymetrix GeneChip HG-U133 probe 215432_at: manufactured by Affymetrix) having a nucleotide sequence partially overlapping with the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 9 in the sequence listing, a database (GeneExpress SoftwareRestore1) from GeneLogic, Inc. The expression profile analysis was performed using 4.4.2).
[0174]
First, when the transcription amount was compared between 54 cases of prostate-derived / normal tissue samples and 87 cases of prostate-derived / tumor samples, the transcription was significantly higher in the prostate-derived / tumor samples (P value <0.0001: FIG. 5). .
[0175]
Next, in the database, 54 prostate-derived / normal tissue samples and a normal tissue sample group other than the prostate (37 adipose tissue samples, 221 large intestine samples, 82 duodenum samples, 99 kidney samples, 122 lung samples, 122 rectum samples) When the gene expression level of BUCS1 was compared for 49 samples, 95 small intestine samples, 70 thymus samples, and 27 thyroid samples), it was found to be significantly lower in the normal tissue sample group other than the prostate (P values were in order). , 0.027, 0.0091, 0.0053, 0.0288, 0.0006, 0.0022, 0.0056, 0.0009, 0.0441: FIG.
[0176]
Example 4 Growth Inhibition of Human Prostate Cancer Cell Lines LNCaP and PC-3 by siRNA
(1) Cell line and its subculture
The human prostate cancer cell line LNCaP (American Tissue Culture Collection ATCC No .: CRL-1740) or the human prostate cancer cell line PC-3 (American Tissue Culture Collection ATCC No .: CRL-1435) is 10% fetal calf serum (FC: SRL). 75 cm using RPMI1640 medium (manufactured by Asahi Techno Glass Co.) containing Hyclone. ² 5% CO while taking care not to become confluent in a tissue culture flask (MS-23250, manufactured by Sumitomo Bakelite Co., Ltd.). ₂ At 37 ° C., and transferred to a new tissue culture flask using a trypsin-EDTA solution (manufactured by Sigma) during the logarithmic growth phase, and subcultured.
[0177]
(2) Growth inhibition test and gene expression suppression test of human prostate cancer cell lines LNCaP and PC-3 by siRNA
A human prostate cancer cell line LNCaP or PC-3 was placed in a poly-D-lysine-coated 24-well Petri dish (Poly-D-Lysine Cellware 24-Well Plate: manufactured by Becton Dickinson) in 4 × 10 4. ⁴ It was sown individually and cultured overnight in 0.4 ml of RPMI1640 medium containing 10% FCS. After replacing the culture supernatant with 0.4 ml of RPMI1640 medium, the culture supernatant was further replaced with 0.2 ml of RPMI1640 medium containing siRNA homologous to any of the genes, 200 nM and 1.2% DMRIE-C Reagent (Invitrogen). By culturing for 4 hours, the siRNA was introduced into the cells.
Here, the nucleotide sequence of the siRNA for TRPM4 is homologous to nucleotide numbers 330 to 348 of SEQ ID NO: 1 in the sequence listing, and the following sequence in the sequence listing:
5′-GCACAGCAAUUUCCUCCGGATT-3 ′ (SEQ ID NO: 11 in the sequence listing) and
5'-UCCGGAGGAAAUUGCUUGUGCTT-3 '(SEQ ID NO: 12 in the sequence listing),
The nucleotide sequence of the siRNA for PLA1A is homologous to nucleotide numbers 132 to 150 of SEQ ID NO: 7 in the sequence listing, and has the following sequence:
5'-AGUGCGCUGACUUCAGAGTT-3 '(SEQ ID NO: 13 in Sequence Listing)
The nucleotide sequence of siRNA for BUCS1 is homologous to nucleotide numbers 623 to 641 of SEQ ID NO: 9 in the sequence list, and comprises the following sequence: 5′-CUCUGGAAGUCAGCGCACUTT-3 ′ (SEQ ID NO: 14 in the sequence listing).
5'-GCUCCUGGUGUCUGAUCACTT-3 '(SEQ ID NO: 15 in Sequence Listing)
5'-GUGAUCAGACACCAGGAGCTT-3 '(SEQ ID NO: 16 in the sequence listing).
[0178]
The culture broth was replaced with fresh 0.4 ml of RPMI 1640 medium containing 10% FCS, and cultured overnight. The cells were collected using a trypsin-EDTA solution (manufactured by Sigma), suspended in 2 ml of RPMI1640 medium containing 10% FCS, and then dispersed in a 96-well plate (Catalog No. 3598 or 3917 manufactured by Corning Coaster Co., Ltd.) in 0.1 ml portions. Note 5% CO ₂ At 37 ° C. CellTiter-Glo 24 hours and 6 days after introduction of siRNA into cells ^TM Intracellular ATP was measured using Luminescent Cell Viability Assay (promega) according to the attached protocol. As a negative control, an siRNA against a luciferase gene not present in humans was used, and as a positive control, an siRNA against an Eg5 gene, which is a human essential gene, was used.
[0179]
The nucleotide sequence of the siRNA for luciferase is as follows:
5′-CGUACGCGGAAUACUUCGATT-3 ′ (SEQ ID NO: 17 in the sequence listing),
5'-UCGAAGUAUUCCCGCGUACGTT-3 '(SEQ ID NO: 18 in Sequence Listing).
The nucleotide sequence of the siRNA against human Eg5 is as follows:
5′-CUGGAUCGUAAGAAGGCAGTT-3 ′ (SEQ ID NO: 19 in Sequence Listing),
5'-CUGCCUUCUACGAUCCAGTT-3 '(SEQ ID NO: 20 in the sequence listing).
[0180]
Two days after the introduction of the siRNA into the cells, total intracellular RNA was extracted using RNeasy 96 Kit (4) (manufactured by Qiagen) according to the attached protocol. CDNA was synthesized from the obtained total RNA using Omniscript RT Kit (50) (manufactured by Qiagen) according to the attached protocol. Using the obtained cDNA, the expression level of the target gene was measured using QuantiTect SYBR Green PCR Kit-for quantitative real-time PCR and two-step RT-PCR (manufactured by Qiagen) according to the attached protocol. For the measurement of the expression level, an oligonucleotide DNA capable of specifically amplifying the internal sequence of the target gene was used.
RT-PCR primers for TRPM4 amplification have the following sequence:
5′-TTCTCGCCTTCTTTTGCCCTCCACTC-3 ′ (primer 1: SEQ ID NO: 21 in the sequence listing),
5'-ACACTATCCATGTCAAAACTCTAGCTCCTCC-3 '(primer 2: SEQ ID NO: 22 in the sequence listing),
RT-PCR primers for PLA1A amplification have the following sequence:
5′-ACCCCACAATGCCAGATAAACCAAG-3 ′ (Primer 3: SEQ ID NO: 23 in Sequence Listing),
5′-TTCAGGTCACAGGAAACAGTCACAC-3 ′ (primer 4: SEQ ID NO: 24 in Sequence Listing),
RT-PCR primers for BUCS1 amplification have the following sequence:
5'-ACAAATCCTTCCACAACATCC-3 '(primer 5: SEQ ID NO: 25 in the sequence listing),
5'-CCATTCACCCACCAAAAAGC-3 "(primer 6: SEQ ID NO: 26 in the sequence listing).
[0181]
Table 1 summarizes the results for the human prostate cancer cell line LNCaP.
[0182]
[Table 1]

[0183]
Eg5 gene sequence which is a human essential gene as a positive control, assuming that the cell growth rate in 5 days from 1 to 6 days after introduction of siRNA corresponding to the luciferase gene sequence into human prostate cancer cell line LNCaP is 100%. 30% ± 10%, 72% ± 10%, 52% ± 7%, 72% ± 13% (mean ± standard deviation (SD)) using siRNA corresponding to the siRNA, TRPM4, PLA1A and BUCS1 gene sequences for The cell proliferation rate decreased. In the measurement of the gene expression level performed two days after the introduction of the siRNA, when the gene expression level when the siRNA corresponding to the luciferase gene sequence was introduced was set to 100%, the expression levels of the target genes TRPM4, PLA1A and BUCS1 were 25% each. %, 36%, and 0%. It was suggested that suppressing the expression of target genes TRPM4, PLA1A and BUCS1 would suppress the growth of human prostate cancer cell line LNCaP.
[0184]
Table 2 summarizes the results for human prostate cancer cell PC-3.
[0185]
[Table 2]

[0186]
Assuming that the cell growth rate on day 1 to day 6 after introducing the siRNA corresponding to the luciferase gene sequence into the human prostate cancer cell line PC-3 is 100%, it corresponds to the TRPM4, PLA1A and BUCS1 gene sequences. When siRNA was used, the cell proliferation rates were reduced to 71% ± 10%, 74% ± 8%, and 85% ± 10%, respectively. In the measurement of the gene expression level performed two days after the introduction of the siRNA, the expression levels of the target genes TRPM4, PLA1A and BUCS1 were as follows, assuming that the gene expression level when the siRNA corresponding to the luciferase gene sequence and LUC were introduced was 100%. It was shown that they were suppressed to 67%, 51% and 0%, respectively. It was suggested that suppressing the expression of target genes TRPM4, PLA1A and BUCS1 would suppress the growth of human prostate cancer cell line PC-3.
[0187]
[Sequence List Free Text]
SEQ ID NO: 11: siRNA sense strand for TRPM4;
SEQ ID NO: 12: siRNA antisense strand to TRPM4;
SEQ ID NO: 13: siRNA sense strand for PLA1A;
SEQ ID NO: 14: siRNA antisense strand to PLA1A;
SEQ ID NO: 15: siRNA sense strand for BUCS1;
SEQ ID NO: 16: siRNA antisense strand to BUCS1;
SEQ ID NO: 17: siRNA sense strand for luciferase;
SEQ ID NO: 18: siRNA antisense strand for luciferase;
SEQ ID NO: 19: siRNA sense strand for Eg5;
SEQ ID NO: 20: siRNA antisense strand to Eg5;
SEQ ID NO: 21: RT-PCR sense primer for TRPM4;
SEQ ID NO: 22: RT-PCR antisense primer for TRPM4;
SEQ ID NO: 23: Sense primer for RT-PCR to PLA1A;
SEQ ID NO: 24: Antisense primer for RT-PCR to PLA1A;
SEQ ID NO: 25: Sense primer for RT-PCR for BUCS1;
SEQ ID NO: 26: RT-PCR antisense primer for BUCS1.
[0188]
[Sequence list]

[0189]
【The invention's effect】
According to the present invention, TRPM4, PLA1A and BUCS1, which are specifically expressed in prostate cancer, have been found, and the genes have been found to be genes related to the development and / or proliferation of cancer cells. The present invention can provide a method for detecting prostate cancer, a method for screening for a compound having a therapeutic and / or preventive effect on prostate cancer, and a pharmaceutical composition for treating and / or preventing cancer.
[Brief description of the drawings]
FIG. 1 shows the expression levels of TRPM4 in normal prostate tissue and tumor tissue.
FIG. 2 is a graph showing the expression level of TRPM4 in each organ (normal tissue).
FIG. 3 shows the expression level of PLA1A in normal prostate tissues and tumor tissues.
FIG. 4 shows the expression level of PLA1A in each organ (normal tissue).
FIG. 5 is a view showing the expression levels of BUCS1 in normal prostate tissues and tumor tissues.
FIG. 6 shows the expression level of BUCS1 in each organ (normal tissue).

Claims

A method for detecting prostate cancer, comprising the following steps 1) to 4):
1) a step of extracting a total RNA fraction from a sample collected from a subject;
2) a step of extracting a total RNA fraction from a sample collected from a normal person;
3) the polynucleotide or the partial polynucleotide thereof according to any one of the following (1) to (3) in the total RNA fraction derived from the above step 1) and the total RNA fraction derived from the above step 2) Measuring the expression level;
(1) selected from the group consisting of a polynucleotide consisting of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing, a polynucleotide consisting of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 3 and a polynucleotide consisting of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 5 At least one polynucleotide,
(2) a polynucleotide having a nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 7 in the sequence listing,
(3) a polynucleotide having a nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 9 in the sequence listing,
4) Analyze the difference in the expression level of the polynucleotide measured in the above step 3) between the total RNA fraction derived from the above step 1) and the total RNA fraction derived from the above step 2). 2. The step of detecting prostate cancer in the subject according to the above.

A method for detecting prostate cancer, comprising the following steps 1) to 3):
1) a step of measuring the expression level of a protein or a partial polypeptide thereof according to any one of the following (1) to (3) in a sample collected from a subject;
(1) at least one selected from the group consisting of a protein consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2, a protein consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 4 and a protein consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 6 in the sequence listing One protein,
(2) a protein consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 8 in the sequence listing,
(3) a protein comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 10 in the sequence listing,
2) a step of measuring the expression level of the protein according to any one of (1) to (3) of the above step 1) in a sample collected from a normal person;
3) a step of analyzing the difference between the expression level of the protein detected in step 1) and the expression level of the protein detected in step 2) to detect prostate cancer in the subject or test animal.

A method for screening a substance having a therapeutic and / or prophylactic effect on prostate cancer, comprising the following steps 1) to 4):
1) a step of extracting a total RNA fraction from mammalian-derived cultured cells cultured in a medium to which a test substance has been added;
2) Step of extracting total RNA fraction from mammalian-derived cultured cells cultured without adding a test substance:
3) the polynucleotide or the partial polynucleotide thereof according to any one of the following (1) to (3) in the total RNA fraction derived from the above step 1) and the total RNA fraction derived from the above step 2) Measuring the expression level;
(1) selected from the group consisting of a polynucleotide consisting of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing, a polynucleotide consisting of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 3 and a polynucleotide consisting of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 5 At least one polynucleotide,
(2) a polynucleotide having a nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 7 in the sequence listing,
(3) a polynucleotide having a nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 9 in the sequence listing,
4) Analyze the difference in the expression level of the polynucleotide measured in the above step 3) between the total RNA fraction derived from the above step 1) and the total RNA fraction derived from the above step 2). A step of determining a therapeutic effect and / or a preventive effect on prostate cancer.

A method for screening a substance having a therapeutic and / or prophylactic effect on prostate cancer, comprising the following steps 1) to 4):
1) a step of extracting a total RNA fraction from a specimen collected from a mammal individual to which the test substance has been administered;
2) a step of extracting a total RNA fraction from a specimen collected from a mammal individual to which the test substance has not been administered;
3) the polynucleotide or the partial polynucleotide thereof according to any one of the following (1) to (3) in the total RNA fraction derived from the above step 1) and the total RNA fraction derived from the above step 2) Measuring the expression level;
(1) selected from the group consisting of a polynucleotide consisting of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing, a polynucleotide consisting of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 3 and a polynucleotide consisting of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 5 At least one polynucleotide,
(2) a polynucleotide having a nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 7 in the sequence listing,
(3) a polynucleotide having a nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 9 in the sequence listing,
4) The difference in the expression level of the polynucleotide measured in the above step 3) between the total RNA fraction derived from the above step 1) and the total RNA fraction derived from the above step 2) is analyzed, and the test substance prostate is analyzed. A step of determining a therapeutic effect and / or a preventive effect on cancer.

A method for screening a substance having a therapeutic and / or prophylactic effect on prostate cancer, comprising the following steps 1) to 3):
1) a step of measuring the expression level of a protein or a partial polypeptide thereof according to any one of the following (1) to (3) in cultured cells derived from a mammal cultured in a medium to which a test substance is added;
(1) at least one selected from the group consisting of a protein consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2, a protein consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 4 and a protein consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 6 in the sequence listing One protein,
(2) a protein consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 8 in the sequence listing,
(3) a protein comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 10 in the sequence listing,
2) Specific binding of the expression level of the protein according to any one of (1) to (3) of the above step 1) to cultured proteins derived from mammals cultured in a medium to which the test substance is not added. Detecting with an antibody or ligand that performs the detection;
3) Analyze the difference between the expression level of the protein detected in the above step 1) and the expression level of the protein detected in the above step 2) to determine the therapeutic and / or prophylactic effect of the test substance on prostate cancer. Process.

A method for screening a substance having a therapeutic and / or prophylactic effect on prostate cancer, comprising the following steps 1) to 3):
1) a step of measuring the expression level of a protein or a partial polypeptide thereof according to any one of the following (1) to (3) in a specimen collected from a mammalian individual to which a test substance has been administered;
(1) at least one selected from the group consisting of a protein consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2, a protein consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 4 and a protein consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 6 in the sequence listing One protein,
(2) a protein consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 8 in the sequence listing,
(3) a protein comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 10 in the sequence listing,
2) The amount of expression of the protein or its partial polypeptide according to any one of (1) to (3) in the above step 1) is measured in a sample collected from a mammal individual to which the test substance has not been administered. Process;
3) Analyze the difference between the expression level of the protein detected in the above step 1) and the expression level of the protein detected in the above step 2) to determine the therapeutic and / or prophylactic effect of the test substance on prostate cancer. Process.

Transient receptor potential cation channel, subfamily M, member 4 (transient receptor potential channel, subfamily M, member 4: hereinafter referred to as “TRPM4”). A method for determining a substance having a therapeutic and / or prophylactic effect on prostate cancer, comprising the following steps 1) to 3):
1) supplying a cell expressing TRPM4 on the cell surface;
2) contacting the test substance with the cell according to 1) in the presence of Ca ²⁺ ;
3) a step of determining whether the uptake of cations into cells is reduced (where the decrease in uptake of cations into cells indicates that the test substance inhibits the cation permeation channel of TRPM4) It indicates that.)

A method for determining a substance having a therapeutic effect and / or a preventive effect on prostate cancer, comprising identifying a substance that inhibits phospholipase A1 activity, and comprising the following steps 1) and 2):
1) contacting the substrate of phospholipase A1 member A with phospholipase A1 member A with a test substance;
2) a step of determining whether the activity of hydrolyzing the substrate in the presence of the test substance is reduced (where the decrease in the activity of hydrolyzing the substrate means that the test substance inhibits the phospholipase A1 activity) Is shown.).

It is characterized by identifying a substance that inhibits the acyl-CoA synthesis activity of butyryl coenzyme A synthetase 1: (hereinafter referred to as “BUCS1”), and comprises the following steps 1) to 2): A method for determining a substance having a therapeutic effect and / or a prophylactic effect on prostate cancer, comprising:
1) contacting the BUCS1 substrate with BUCS1 with a test substance;
2) A step of determining whether the amount of acyl-CoA synthesis decreases in the presence of the test substance (where the decrease in the amount of acyl-CoA synthesis indicates that the test substance reduces the acyl-CoA synthesis activity of BUCS1). Inhibition.).

5. The method according to claim 1, wherein the method for measuring the expression level of the polynucleotide is Northern blotting, dot blotting, slot blotting, RT-PCR, ribonuclease protection assay or run-on assay. The method according to any one of the above.

The method for measuring the expression level of a polynucleotide comprises using a gene chip or an array made of a complementary DNA group derived from animal tissues or animal cells or a DNA comprising a partial sequence of each DNA of the DNA group. Item 5. The method according to any one of Items 1, 3 and 4.

The method according to any one of claims 2, 5, and 6, wherein the method for measuring the expression level of the protein uses an antibody or a ligand that specifically binds to the protein.

7. The method according to claim 2, wherein the method for measuring the expression level of the protein is Western blotting, dot blotting, slot blotting, or enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). The method described in one.

A kit for determining a therapeutic and / or prophylactic effect of a test substance on prostate cancer, comprising at least one selected from the group consisting of 1) to 3) below:
1) a polynucleotide consisting of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing, a polynucleotide consisting of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 3, a polynucleotide consisting of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 5, and a polynucleotide consisting of SEQ ID NO: 7 A continuous oligo of 15 to 30 bases in length for specifically amplifying at least one polynucleotide selected from the group consisting of a polynucleotide consisting of a nucleotide sequence and a polynucleotide consisting of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 9 Nucleotide primers;
2) a polynucleotide consisting of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing, a polynucleotide consisting of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 3, a polynucleotide consisting of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 5, and a polynucleotide consisting of SEQ ID NO: 7 Hybridize under stringent conditions to at least any one polynucleotide selected from the group consisting of a polynucleotide consisting of a nucleotide sequence and a polynucleotide consisting of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 9, and detect the polynucleotide A continuous polynucleotide probe of 15 nucleotides or more for:
3) a polynucleotide consisting of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1 of the sequence listing, a polynucleotide consisting of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 3, a polynucleotide consisting of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 5, and shown in SEQ ID NO: 7 A solid-phased sample on which at least one polynucleotide selected from the group consisting of a polynucleotide consisting of a nucleotide sequence and a polynucleotide consisting of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 9 is immobilized.

A kit for determining a therapeutic effect and / or a preventive effect of a test substance on prostate cancer, comprising at least one of the following 1) and 2):
1) a protein consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 of the sequence listing, a protein consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 4, a protein consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 6, and a protein consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 8 An antibody which specifically binds to at least one protein selected from the group consisting of a protein consisting of a protein consisting of a protein consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 10 and detecting the protein;
2) A secondary antibody capable of binding to the antibody according to 1).

A kit for detecting prostate cancer, comprising at least one selected from the group consisting of the following 1) to 3):
1) a polynucleotide consisting of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing, a polynucleotide consisting of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 3, a polynucleotide consisting of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 5, and a polynucleotide consisting of SEQ ID NO: 7 A continuous oligo of 15 to 30 bases in length for specifically amplifying at least one polynucleotide selected from the group consisting of a polynucleotide consisting of a nucleotide sequence and a polynucleotide consisting of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 9 Nucleotide primers;
2) a polynucleotide consisting of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing, a polynucleotide consisting of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 3, a polynucleotide consisting of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 5, and a polynucleotide consisting of SEQ ID NO: 7 Hybridize under stringent conditions to at least any one polynucleotide selected from the group consisting of a polynucleotide consisting of a nucleotide sequence and a polynucleotide consisting of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 9, and detect the polynucleotide A continuous polynucleotide probe of 15 nucleotides or more for:
3) a polynucleotide consisting of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1 of the sequence listing, a polynucleotide consisting of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 3, a polynucleotide consisting of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 5, and shown in SEQ ID NO: 7 A solid-phased sample on which at least one polynucleotide selected from the group consisting of a polynucleotide consisting of a nucleotide sequence and a polynucleotide consisting of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 9 is immobilized.

A kit for detecting prostate cancer, comprising at least one of the following 1) and 2):
1) a protein consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 of the sequence listing, a protein consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 4, a protein consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 6, and a protein consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 8 An antibody which specifically binds to at least one protein selected from the group consisting of a protein consisting of a protein consisting of a protein consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 10 and detecting the protein;
2) A secondary antibody capable of binding to the antibody according to 1).

Pharmaceutical composition for treating and / or preventing prostate cancer, comprising an oligonucleotide having any one nucleotide sequence selected from the group consisting of the following 1) to 5) or a nucleotide sequence complementary to a partial sequence of the sequence: object:
1) a nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1 in the sequence listing;
2) a nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 3 in the sequence listing;
3) a nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 5 in the sequence listing;
4) a nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 7 in the sequence listing;
5) The nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 9 in the sequence listing.

A protein consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2, a protein consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 4, a protein consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 6, and a protein consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 8 And a pharmaceutical composition for treating and / or preventing prostate cancer, comprising an antibody that specifically recognizes at least one protein selected from the group consisting of proteins consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 10.