JP2004135618A

JP2004135618A - Oncogene and its use

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Publication number: JP2004135618A
Application number: JP2002305473A
Authority: JP
Inventors: Toshinori Azuma; 我妻　利紀; Keisuke Fukuchi; 福地　圭介; Satoko Nishimura; 西村　聡子
Original assignee: Sankyo Co Ltd
Current assignee: Sankyo Co Ltd
Priority date: 2002-10-21
Filing date: 2002-10-21
Publication date: 2004-05-13

Abstract

<P>PROBLEM TO BE SOLVED: To provide a method for producing a cancer cell by using a cancer gene, a method for detecting cancers by using the cancer gene, a method for screening a compound having an effect for treating and/or preventing the cancers and to provide a medicinal composition for treating and/or preventing the cancers. <P>SOLUTION: The method for producing the cancer cell comprises excessively expressing a CD39L4 gene with cell and selecting a cell strain in which proliferation ability of the cell is changed. The method for detecting the cancers uses expression of CD39L4 as an index. The new method for screening the compound having effect treating and/or preventing the cancers comprises using CD39L4. The medicinal composition comprises an antibody specifically recognizing CD39L4. <P>COPYRIGHT: (C)2004,JPO

Description

【０００１】
【発明が属する技術分野】
本発明は、癌遺伝子を用いた癌細胞の製造方法、該癌遺伝子を用いた癌の検出方法、癌治療及び／または予防効果を有する化合物のスクリーニング方法、及び癌治療及び／または予防用医薬医薬組成物等に関する。
【０００２】
【従来の技術】
癌は、欧米や日本などの先進諸国において、依然として主たる死亡原因の一つである。臨床的には、外科的癌組織の切除、放射線治療及び化学療法を含む種々の医学的方法がとられてきているが、悪性形質転換及び癌細胞の増殖に関する十分正確な理解に基づくものとは言えず、多くの場合、その効果は部分的で多くの患者を満足させるものではない。そのような悪性形質転換及び癌細胞の増殖機構に関し、過去１０数年に渡り多くの研究施設において精力的な研究が進められてきた。現在では、正常細胞の増殖は、癌遺伝子（Ｏｎｃｏｇｅｎｅ）（増殖促進遺伝子）と癌抑制遺伝子（Ｔｕｍｏｒ　ｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒ　ｇｅｎｅ）（増殖阻害遺伝子）のバランスによって制御されていると考えられている（例えば、非特許文献１参照。）。
【０００３】
細胞内在性の癌遺伝子は、一般的にそれ自体は正常細胞を癌化させる効果は必ずしも強いものではないが、構造変異によりその調節機能が失われると、異常増殖、癌化の直接的な原因となる。例えば、点突然変異で癌を引き起こすＲａｓや、染色体転座により酵素活性の異常亢進を引き起こすＡｂｌ遺伝子などがその一例である。また、変異を生じなくとも、癌遺伝子の発現亢進が、癌化の引き金となる場合も多い。増殖因子受容体ＨＥＲ２／ｎｅｕの遺伝子増幅などによる発現亢進が転移性乳癌で惹起され、その阻害剤が転移性乳癌の治療に用いられているのはその一例である。以上のような事実は、これら癌遺伝子が、癌治療の標的として、極めて妥当な標的分子を提供するという作業仮説を強く示唆している。
【０００４】
癌疾患の中でも前立腺癌は、特に米国で最も頻繁に診断される癌であり、かつ男性の癌死原因の第二番目である。年間およそ３００，０００人の男性が新規に前立腺癌と診断され、また４０，０００人以上の男性が本疾患で死亡している。前立腺癌による死亡は主に転移した疾患に起因しているにも関わらず、新しく診断された患者の６０％近くは前立腺に限局した一次腫瘍を有している。こうした限局癌の患者に対しては外科手術及び放射線治療がしばしば有効であるが、転移伝播した癌患者の場合は、ほとんどの場合治療不能である。現在まで精力的な研究が進められてきているものの、前立腺癌の発生及び進行を引き起こす生物学的な機構に関してはごく僅かしか知られていない。
【０００５】
ヌクレオシド三リン酸脱リン酸化酵素（Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅ　ｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅｓ：ＮＴＰａｓｅｓ）は、細胞膜上に存在し、二価陽イオン依存的に細胞外に存在するヌクレオシド二リン酸および三リン酸を加水分解する酵素である。ＮＴＰａｓｅｓは、アピラーゼ保存領域（ＡＣＲ）と呼ばれるモチーフを４個もつことを特徴としている。ヌクレオシド三リン酸脱リン酸化酵素群の中で最もよく検討されている分子にＣＤ３９があるが、このＣＤ３９は、血管内皮細胞に発現しアデノシン二リン酸依存的な血小板凝集を阻害することが報告されており、ヌクレオシド二リン酸を脱リン酸化する酵素群に共通する役割の一つとして、ヌクレオシド加水分解による血小板凝集阻害が想定されている（例えば、非特許文献２及び３参照。）。
【０００６】
ＣＤ３９ファミリー分子の一つＣＤ３９Ｌ４は、４つのＡＣＲを持つ新規ＮＴＰａｓｅとして同定された遺伝子である（例えば、非特許文献４参照。）。本遺伝子をヒトＣＯＳ−７細胞株で発現させると、ＣＤ３９Ｌ４は、可溶性型蛋白として分泌され、また、そのリコンビナント蛋白は、アデノシン二リン酸を分解する酵素活性を有することが報告されており、血小板凝集阻害機能を有すると考えられている（例えば、非特許文献５参照。）。他方、シリアハムスター胎児繊維芽細胞より、発癌剤３−Ｍｅｔｈｙｌｃｈｏｌａｎｔｈｒｅｎｅ処理で活性化する癌遺伝子としてＰＣＰＨ遺伝子が発見されている。ＰＣＰＨ遺伝子は発癌剤処理により、アミノ酸をコードする領域内に一塩基対の欠失し、これによってオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）にずれが生じ、結果としてアミノ末端側に２１３個の正常ＰＣＰＨのアミノ酸配列と、カルボキシ末端側の正常ＰＣＰＨには見られない３３塩基短鎖からなる、異常型ＰＣＰＨ遺伝子ができる。このハムスターの異常型ＰＣＰＨは、ＮＩＨ３Ｔ３細胞を形質転換させることが報告されている（例えば、非特許文献６参照。）。これまでの比較解析結果では、異常型ＰＣＰＨと正常型ＰＣＰＨのいずれもＮＴＰａｓｅ活性を有するものの、様々なストレス刺激後の細胞の生存を促進する活性は、異常型で強く（例えば、非特許文献６参照。）、また、異常型では、癌遺伝子Ｈ−Ｒａｓの下流で増殖シグナルを正に制御するＥＲＫ１の持続的なリン酸化が観察されており（例えば、非特許文献７参照。）、その機能には違いが認められている。
【０００７】
最近、正常型ヒトＰＣＰＨは、ヒトＣＤ３９Ｌ４とアミノ酸配列レベルで９８％と高い類似性をもつことが報告され、また、ＣＤ３９Ｌ４様のＮＴＰａｓｅ活性を持つことから、ＰＣＰＨがＣＤ３９Ｌ４と同一分子であることが指摘された（例えば、非特許文献８参照。）。
【０００８】
Ｒｏｕｚａｕｔらは、ヒトＰＣＰＨの癌細胞株における発現をウェスタンブロット法で解析し、分子量約４７，０００の正常型相当のものに加え、いくつかの癌細胞株では分子量の約３０，０００の、サイズの小さいの遺伝子産物が存在し、このサイズの小さい遺伝子産物はその分子量が異常型と類似していることから、ヒト癌でも、異常型ＰＣＰＨがヒト組織の癌化の原因となる可能性があると推察している（例えば、非特許文献９参照。）。しかしながら、ヒトＰＣＰＨに関する、細胞形質転換能の証明は、正常型のみならずサイズの小さい異常型についてもこれまで全くなされていない。
【０００９】
以上のように、ＣＤ３９Ｌ４の形質転換能に関する解析は、ハムスターの異常型ＣＤ３９Ｌ４についてなされているのみであり、正常型ＣＤ３９Ｌ４とりわけヒト正常型ＣＤ３９Ｌ４に関するその役割については、全く調べられていない。
【００１０】
【非特許文献１】
新津洋司郎、横田淳編、「臨床家のための癌遺伝子／癌抑制遺伝子」、南江堂、１９９９年１０月１５日、ｐ．１−４６
【非特許文献２】
「ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）」、１９９６年１２月２０日、第２７１巻、第５１号、ｐ．３３１１６−３３１２２
【非特許文献３】
「ジャーナル・オブ・クリニカル・インベスティゲーション（Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｃｌｉｎｉｃａｌ　Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ）」、１９９７年３月１５日、第９９巻、第６号、ｐ．１３５１−１３６０
【非特許文献４】
「ジェノミックス（Ｇｅｎｏｍｉｃｓ）」、１９９８年７月１５日、第５０巻、第３号、ｐ．３５７−３５７
【非特許文献５】
「ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）」、１９９９年７月１６日、第２７４巻、第２９号、ｐ．２００６４−２００６７
【非特許文献６】
「オンコジーン（Ｏｎｃｏｇｅｎｅ）」、１９９９年１月２９日、弟１８巻、第３号、ｐ．６８９−７０１
【非特許文献７】
「キャンサー・リサーチ（Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ）」、２０００年３月１５日、第６０巻、第６号、ｐ．１７２０−１７２８
【非特許文献８】
「インターナショナル・ジャーナル・オブ・オンコロジー（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｏｎｃｏｌｏｇｙ）」、２００１年１２月、第１９巻、第６号、ｐ．１２４９−１２５４
【非特許文献９】
「ラジエーション・リサーチ（Ｒａｄｉａｔｉｏｎ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ）」、２００１年１月、第１５５巻、１Ｐｔ２）、ｐ．１８１−１８７
【００１１】
【発明が解決しようとする課題】
癌細胞と癌細胞の発生及び／または増殖に関連する遺伝子を見出し、該癌遺伝子を用いて癌細胞を製造する方法を開発し、該癌遺伝子を用いた癌の検出方法、癌治療及び／または予防効果を有する化合物のスクリーニング方法、及び癌治療及び／または予防用医薬医薬組成物を提供することを目的とする。
【００１２】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、ＣＤ３９Ｌ４遺伝子を過剰発現させることで癌細胞を製造することができることを見出し、また、ＣＤ３９Ｌ４を用いた、癌の検出方法、新規癌治療及び／または癌予防効果を有する化合物のスクリーニング方法を開発し、更に、ＣＤ３９Ｌ４の発現を抑制させる物質を提供し本発明を完成させた。
すなわち、本発明は、
（１）　下記の工程１）乃至２）を含むことからなる癌細胞の製造方法：
１）下記の▲１▼乃至▲５▼のいずれか一つに記載のポリヌクレオチドを用いて細胞を形質転換する工程；
▲１▼配列表の配列番号１のヌクレオチド番号２４７乃至１５３３に示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド、
▲２▼配列表の配列番号３のヌクレオチド番号２４７乃至１５３３に示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド、
▲３▼配列表の配列番号５のヌクレオチド番号２８３乃至１５６９に示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド、
▲４▼配列表の配列番号７のヌクレオチド番号３９８乃至１６２１に示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド、
▲５▼上記▲１▼乃至▲４▼のいずれか一つに記載のポリヌクレオチドと相補的なヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、ＣＤ３９Ｌ４と実質的に同一の蛋白質をコードするヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド、
２）工程１）により細胞の増殖能に変化が生じた細胞株を選択する工程、
（２）　細胞が、動物細胞であることを特徴とする、（１）に記載の癌細胞の製造方法、
（３）　動物細胞が、哺乳類由来であることを特徴とする、（２）に記載の癌細胞の製造方法、
（４）　哺乳類がヒト、サル、マウス、ラットであることを特徴とする（３）に記載の癌細胞の製造方法、
（５）　哺乳類がヒトであることを特徴とする（３）に記載の癌細胞の製造方法、
（６）　細胞がマウス繊維芽細胞株ＮＩＨ３Ｔ３細胞であることを特徴とする（１）に記載の癌細胞の製造方法、
（７）　組換えベクターで細胞を形質転換することを特徴とする（１）乃至（６）のいずれか一つに記載の癌細胞の製造方法、
（８）　（１）乃至（７）のいずれか一つに記載の癌細胞の製造方法によって得られた癌細胞、
（９）　（８）に記載の癌細胞を導入した非ヒト哺乳動物、
（１０）　被験者または被験動物より採取した検体における下記の１）乃至５）のいずれか一つに記載のポリヌクレオチドの発現量を解析する工程を含む、癌の検出方法：
１）配列表の配列番号１のヌクレオチド番号２４７乃至１５３３に示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド、
２）配列表の配列番号３のヌクレオチド番号２４７乃至１５３３に示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド；
３）配列表の配列番号５のヌクレオチド番号２８３乃至１５６９に示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド；
４）配列表の配列番号７のヌクレオチド番号３９８乃至１６２１に示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド；
５）上記１）乃至４）のいずれか一つに記載のポリヌクレオチドと相補的なヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、ＣＤ３９Ｌ４と実質的に同一の蛋白質をコードするヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド、
（１１）　被験者または被験動物より採取した検体における下記の１）乃至５）のいずれか一つに記載の蛋白質の発現量を解析する工程を含む、癌の検出方法：
１）配列表の配列番号２のアミノ酸番号１乃至４２８に示されるアミノ酸配列からなる蛋白質；
２）配列表の配列番号４のアミノ酸番号１乃至４２８に示されるアミノ酸配列からなる蛋白質；
３）配列表の配列番号６のアミノ酸番号１乃至４２８に示されるアミノ酸配列からなる蛋白質；
４）配列表の配列番号８のアミノ酸番号１乃至４０７に示されるアミノ酸配列からなる蛋白質；
５）上記工程１）乃至４）のいずれか一つに記載の蛋白質のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、ＣＤ３９Ｌ４と実質的に同一の蛋白質、
（１２）　下記の工程１）乃至４）を含む、癌の検出方法：
１）被験者または被験動物より採取した検体より、全ＲＮＡ画分を抽出する工程；
２）正常人または正常動物より採取した検体より、全ＲＮＡ画分を抽出する工程；
３）上記工程１）由来の全ＲＮＡ画分と上記工程２）由来の全ＲＮＡ画分における、下記の▲１▼乃至▲５▼のいずれか一つに記載のポリヌクレオチドの発現量を測定する工程；
▲１▼配列表の配列番号１のヌクレオチド番号２４７乃至１５３３に示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド、
▲２▼配列表の配列番号３のヌクレオチド番号２４７乃至１５３３に示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド、
▲３▼配列表の配列番号５のヌクレオチド番号２８３乃至１５６９に示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド、
▲４▼配列表の配列番号７のヌクレオチド番号３９８乃至１６２１に示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド、
▲５▼上記▲１▼乃至▲４▼に記載のポリヌクレオチドと相補的なヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、ＣＤ３９Ｌ４と実質的に同一の蛋白質をコードするヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド；
４）上記工程１）由来の全ＲＮＡ画分と上記工程２）由来の全ＲＮＡ画分との間における上記工程３）によって測定されたポリヌクレオチドの発現量の差を解析し、上記工程１）に記載の被験者または被験動物の癌を検出する工程、
（１３）　下記の工程１）乃至３）を含む、癌の検出方法：
１）被験者または被験動物から採取した検体における、下記の▲１▼乃至▲５▼のいずれか一つに記載の蛋白質の発現量を測定する工程；
▲１▼配列表の配列番号２のアミノ酸番号１乃至４２８に示されるアミノ酸配列からなる蛋白質、
▲２▼配列表の配列番号４のアミノ酸番号１乃至４２８に示されるアミノ酸配列からなる蛋白質、
▲３▼配列表の配列番号６のアミノ酸番号１乃至４２８に示されるアミノ酸配列からなる蛋白質、
▲４▼配列表の配列番号８のアミノ酸番号１乃至４０７に示されるアミノ酸配列からなる蛋白質、
▲５▼上記▲１▼乃至▲４▼のいずれか一つに記載の蛋白質のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、ＣＤ３９Ｌ４と実質的に同一の蛋白質、
２）正常人または正常動物から採取した検体における、上記工程１）の▲１▼乃至▲５▼のいずれか一つに記載の蛋白質の発現量を測定する工程；
３）上記工程１）で測定された蛋白質の発現量と上記工程２）で測定された該蛋白質の発現量の差を解析し、被験者または被験動物の癌を検出する工程、
（１４）　下記の工程１）乃至４）を含むことからなる、癌に対する治療効果及び／または予防効果を有する物質のスクリーニング方法：
１）被験物質を添加した培地で培養した哺乳動物由来培養細胞より、全ＲＮＡ画分を抽出する工程；
２）被験物質を添加しないで培養した哺乳動物由来培養細胞より、全ＲＮＡ画分を抽出する工程：
３）上記工程１）由来の全ＲＮＡ画分と上記工程２）由来の全ＲＮＡ画分における、下記の▲１▼乃至▲５▼のいずれか一つに記載のポリヌクレオチドの発現量を測定する工程；
▲１▼配列表の配列番号１のヌクレオチド番号２４７乃至１５３３に示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド、
▲２▼配列表の配列番号３のヌクレオチド番号２４７乃至１５３３に示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド、
▲３▼配列表の配列番号５のヌクレオチド番号２８３乃至１５６９に示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド、
▲４▼配列表の配列番号７のヌクレオチド番号３９８乃至１６２１に示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド、
▲５▼上記▲１▼乃至▲４▼に記載のポリヌクレオチドと相補的なヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、ＣＤ３９Ｌ４と実質的に同一の蛋白質をコードするヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド。
４）上記工程１）由来の全ＲＮＡ画分と上記工程２）由来の全ＲＮＡ画分との間における上記工程３）によって測定されたポリヌクレオチドの発現量の差を解析し、被験物質の、癌に対する治療効果及び／または予防効果を判定する工程、
（１５）　下記の工程１）乃至４）を含むことからなる、癌の治療効果及び／または予防効果を有する物質のスクリーニング方法：
１）被験物質を投与した哺乳動物個体より採取した検体より、全ＲＮＡ画分を抽出する工程；
２）被験物質を投与しなかった哺乳動物個体より採取した検体より、全ＲＮＡ画分を抽出する工程；
３）上記工程１）由来の全ＲＮＡ画分と上記工程２）由来の全ＲＮＡ画分における、下記の▲１▼乃至▲５▼のいずれか一つに記載のポリヌクレオチドの発現量を測定する工程；
▲１▼配列表の配列番号１のヌクレオチド番号２４７乃至１５３３に示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド、
▲２▼配列表の配列番号３のヌクレオチド番号２４７乃至１５３３に示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド、
▲３▼配列表の配列番号５のヌクレオチド番号２８３乃至１５６９に示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド、
▲４▼配列表の配列番号７のヌクレオチド番号３９８乃至１６２１に示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド、
▲５▼上記▲１▼乃至▲４▼に記載のポリヌクレオチドと相補的なヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、ＣＤ３９Ｌ４と実質的に同一の蛋白質をコードするヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド；
４）上記工程１）由来の全ＲＮＡ画分と上記工程２）由来の全ＲＮＡ画分との間における上記工程３）よって測定されたポリヌクレオチドの発現量の差を解析し、被験物質の癌に対する治療効果及び／または予防効果を判定する工程、
（１６）　下記の工程１）乃至３）を含むことからなる、癌の治療効果及び／または予防効果を有する物質のスクリーニング方法：
１）被験物質を添加した培地で培養した哺乳動物由来培養細胞における、下記の▲１▼乃至▲５▼のいずれか一つに記載の蛋白質の発現量を測定する工程；
▲１▼配列表の配列番号２のアミノ酸番号１乃至４２８に示されるアミノ酸配列からなる蛋白質、
▲２▼配列表の配列番号４のアミノ酸番号１乃至４２８に示されるアミノ酸配列からなる蛋白質、
▲３▼配列表の配列番号６のアミノ酸番号１乃至４２８に示されるアミノ酸配列からなる蛋白質、
▲４▼配列表の配列番号８のアミノ酸番号１乃至４０７に示されるアミノ酸配列からなる蛋白質、
▲５▼上記▲１▼乃至▲４▼のいずれか一つに記載の蛋白質のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、ＣＤ３９Ｌ４と実質的に同一の蛋白質；
２）被験物質を添加しない培地で培養した哺乳動物由来培養細胞における、上記工程１）の▲１▼乃至▲５▼のいずれか一つに記載の蛋白質の発現量を測定する工程；
３）上記工程１）で測定された蛋白質の発現量と、上記工程２）で測定された該蛋白質の発現量の差を解析し、被験物質の癌に対する治療効果及び／または予防効果を判定する工程、
（１７）　下記の工程１）乃至３）を含むことからなる、癌の治療効果及び／または予防効果を有する物質のスクリーニング方法：
１）被験物質を投与された哺乳動物個体より採取した検体における、下記の▲１▼乃至▲５▼のいずれか一つに記載の蛋白質の発現量を測定する工程；
▲１▼配列表の配列番号２のアミノ酸番号１乃至４２８に示されるアミノ酸配列からなる蛋白質、
▲２▼配列表の配列番号４のアミノ酸番号１乃至４２８に示されるアミノ酸配列からなる蛋白質、
▲３▼配列表の配列番号６のアミノ酸番号１乃至４２８に示されるアミノ酸配列からなる蛋白質、
▲４▼配列表の配列番号８のアミノ酸番号１乃至４０７に示されるアミノ酸配列からなる蛋白質、
▲５▼上記▲１▼乃至▲４▼のいずれか一つに記載の蛋白質のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、ＣＤ３９Ｌ４と実質的に同一の蛋白質；
２）被験物質を投与されなかった哺乳動物個体より採取した検体における、上記工程１）の▲１▼乃至▲５▼のいずれか一つに記載の蛋白質の発現量を測定する工程；
３）上記工程１）で測定された蛋白質の発現量と、上記工程２）で測定された該蛋白質の発現量の差を解析し、被験物質の癌に対する治療効果及び／または予防効果を判定する工程、
（１８）　哺乳動物培養細胞が（８）に記載の癌細胞であることを特徴とする（１４）または（１６）に記載のスクリーニング方法、
（１９）　哺乳動物個体が（９）に記載の非ヒト哺乳動物であることを特徴とする（１５）または（１７）に記載のスクリーニング方法、
（２０）　下記の１）乃至３）からなる群から選択される少なくとも一つ以上を含む、被験物質の癌に対する治療効果及び／または予防効果判定用、及び／または、癌の検出用、キット：
１）配列表の配列番号１、３、５及び７に示される群から選択されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドの少なくとも一つを特異的に増幅するための１５乃至３０塩基長の連続したオリゴヌクレオチドプライマー；
２）配列表の配列番号１、３、５及び７に示される群から選択されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドの少なくとも一つにストリンジェントな条件でハイブリダイズし、該ポリヌクレオチドを検出するための１５ヌクレオチド以上の連続したポリヌクレオチドプローブ；
３）配列表の配列番号１のヌクレオチド番号１７７乃至１０３１に示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド、配列番号３のヌクレオチド番号１３１乃至９８５に示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド、配列番号５のヌクレオチド番号５５乃至９０９に示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド及び配列番号７のヌクレオチド番号８７乃至９４１に示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドからなる群から選択される少なくとも一つのポリヌクレオチドが固定された固相化試料、
（２１）　下記の１）及び２）の少なくとも一つを含む、被験物質の癌に対する治療効果及び／または予防効果判定用、及び／または、癌の検出用、キット：
１）配列表の配列番号２、４、６及び８に示される群から選択されるアミノ酸配列からなる蛋白質に特異的に結合し、該蛋白質を検出するための抗体；
２）上記１）に記載の抗体に結合し得る二次抗体、
（２２）　ポリヌクレオチドの発現量を測定する方法が、ノーザンブロット法、ドットブロット法、スロットブロット法、ＲＴ−ＰＣＲ、リボヌクレアーゼ保護アッセイまたはランオン・アッセイであることを特徴とする、（１０）、（１２）、（１４）、（１５）、（１８）及び（１９）のいずれか一つに記載の方法、（２３）　ポリヌクレオチドの発現量を測定する方法が動物組織または動物細胞由来の相補的ＤＮＡ群または該ＤＮＡ群の各ＤＮＡの部分配列からなるＤＮＡで作製された遺伝子チップまたはアレイを用いることを特徴とする（１０）、（１２）、（１４）、（１５）、（１８）及び（１９）のいずれか一つに記載の方法、
（２４）　蛋白質の発現量の測定方法が、該蛋白質に特異的に結合する抗体またはリガンドを用いることを特徴とする、（１１）、（１３）、（１７）、（１８）及び（１９）のいずれか一つに記載の方法、
（２５）　蛋白質の発現量の測定方法が、ウエスタンブロット法、ドットブロット法、スロットブロット法または固相酵素免疫定量法（ＥＬＩＳＡ法）であることを特徴とする、（１１）、（１３）、（１７）、（１８）及び（１９）のいずれか一つに記載の方法、
（２６）　下記の１）乃至３）からなる群から選択される少なくとも一つのヌクレオチド配列または該配列の部分配列に相補的なヌクレオチド配列を有するオリゴヌクレオオチドを含む癌の治療及び／または予防用医薬組成物：
１）配列表の配列番号１のヌクレオチド番号２４７乃至１５３３に示されるヌクレオチド配列；
２）配列表の配列番号３のヌクレオチド番号２４７乃至１５３３に示されるヌクレオチド配列；
３）配列表の配列番号５のヌクレオチド番号２８３乃至１５６９に示されるヌクレオチド配列；
配列表の配列番号７のヌクレオチド番号３９８乃至１６２１に示されるヌクレオチド配列。
（２７）　ＣＤ３９Ｌ４を特異的に認識する抗体を含有する癌の治療及び／または予防用医薬組成物、
からなる。
【００１３】
【発明の実施の形態】
本明細書中において、癌治療及び／または癌予防効果を有する化合物とは、癌の増殖を抑制する活性、癌を縮小する活性、及び／または、癌の発生を予防する活性を有する化合物をいう。なお、本明細書中においては、「癌」と「腫瘍」は同じ意味に用いている。本明細書中において、「遺伝子」という語には、ＤＮＡのみならずそのｍＲＮＡ、ｃＤＮＡ及びそのｃＲＮＡも含まれるものとする。したがって、本発明における「ＣＤ３９Ｌ４遺伝子」には、ＣＤ３９Ｌ４のＤＮＡ、ｍＲＮＡ、ｃＤＮＡ及びｃＲＮＡが含まれる。本明細書中において、「ポリヌクレオチド」という語は核酸と同じ意味で用いており、ＤＮＡ、ＲＮＡ、プローブ、オリゴヌクレオチド、及びプライマーも含まれている。本明細中においては、「ポリペプチド」と「蛋白質」は区別せずに用いている。また、本明細書中において、「ＲＮＡ画分」とは、ＲＮＡを含んでいる画分をいう。また、本明細書中において、「細胞」には、動物個体内の細胞、培養細胞も含んでいる。本明細書中において、「細胞の癌化」とは、細胞が接触阻止現象への感受性を喪失することや、足場非依存性増殖を示すこと等、細胞が異常な増殖を示すことをいい、このような異常な増殖を示す細胞を「癌細胞」という。本明細書において、ＣＤ３９Ｌ４と「実質的に同一の蛋白質」とは、ＣＤ３９Ｌ４が有する細胞の癌化活性等と同一の機能を有する蛋白質をいう。なお本発明における癌遺伝子（Ｏｎｃｏｇｅ）という語には癌遺伝子の他に癌原遺伝子、前癌遺伝子（Ｐｒｏｔｏ−Ｏｎｃｏｇｅｎｅ）も含む。
【００１４】
１．ＣＤ３９Ｌ４遺伝子の取得
本発明で用いるヒトＣＤ３９Ｌ４のｃＤＮＡのヌクレオチド配列は例えば、配列表の配列番号１、３、５及び７のいずれかに示されている。また、ヒトＣＤ３９Ｌ４のアミノ酸配列は、例えば、配列表の配列番号２、４、６及び８のいずれかに示されている。また、ヒトＣＤ３９Ｌ４　ｃＤＮＡのヌクレオチド配列ＧｅｎＢａｎｋにアクセッション番号：ＡＦ０３９９１８（バージョン：ＡＦ０３９９１８．１）、アクセッション番号：ＮＭ＿００１２４９（バージョン：ＮＭ＿００１２４９．１）、アクセッション番号：ＡＦ１３６５７２（バージョン：ＡＦ１３６５７２．１）及びアクセッション番号：ＢＣ０２０９６６．１（バージョン：ＢＣ０２０９６６．１）で登録されている。すなわち、本明細書中において、「ＣＤ３９Ｌ４遺伝子」とは、配列表の配列番号１、３、５及び７のいずれか一つに記載のヌクレオチド配列からなる遺伝子、または、該ヌクレオチド配列からなる遺伝子と相補的なヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、ＣＤ３９Ｌ４と同一の生物活性を有する蛋白質をコードするヌクレオチド配列からなる遺伝子をいう。また、本明細書中において、「ＣＤ３９Ｌ４」とは、配列表の配列番号２、４、６及び８のいずれか一つに記載のアミノ酸配列からなる蛋白質、または、該蛋白質のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、ＣＤ３９Ｌ４と同一の生物活性を有する蛋白質をいう。
【００１５】
ＣＤ３９Ｌ４遺伝子は以下の方法によって取得することができる。
（１）ヒトｃＤＮＡライブラリーを用いる場合
ＣＤ３９Ｌ４遺伝子を発現しているｃＤＮＡライブラリーから、コロニーハイブリダイゼーション法等、公知の方法に従い、完全長ｃＤＮＡを取得する。この完全長ｃＤＮＡを鋳型としてＰＣＲ法を用いてヒトＣＤ３９Ｌ４　ｃＤＮＡを取得できる。ｃＤＮＡライブラリーは例えば、ヒト前立腺癌、ヒト肺癌、ヒト乳癌、ヒト胃癌、ヒト大腸癌、ヒト悪性黒色腫、ヒト膵臓癌、及びそれぞれの癌化していない正常な組織由来のｃＤＮＡライブラリーを用いることができる。市販のヒトｃＤＮＡライブラリーとしてＰｒｏｓｔａｔｅ−Ｌｅｉｏｍｙｏｓａｒｃｏｍａ　ｃＤＮＡ（インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）社：１１５９８−０１８）、Ｆｅｔａｌ　Ｂｒａｉｎ　ｃＤＮＡ（インビトロジェン社：１０６６２−０１３）、Ｍａｒａｔｈｏｎ−Ｒｅａｄｙ　ｃＤＮＡ、　Ｎｏｒｍａｌ　Ｐｒｏｓｔａｔｅ、　ｐｏｏｌｅｄ（クロンテック社：７４１８−１−１）を用いることもできるし、自ら調製することもできる。なお、ｃＤＮＡライブラリーを鋳型として直接ＰＣＲを行なってＣＤ３９Ｌ４　ｃＤＮＡを取得することもできる。ＰＣＲプライマーとしてはＣＤ３９Ｌ４　ｃＤＮＡを増幅することができればよく、公知の方法で適当なプライマーを選択することができる。ＣＤ３９Ｌ４　ｃＤＮＡを増幅するＰＣＲ用プライマーとしては例えば以下のヌクレオチド配列を有するオリゴヌクレオチドを選択することができる。
５’−　ｃａｃｃａｔｇｇｃｃａｃｔｔｃｔｔｇｇｇｇｃａｃａ　−３’（プライマー１：配列表の配列番号：９）及び、
５’−　ｔｃａａｔｇｇｇａｇａｔｇｃｃｃａｇａｇａ　−３’（プライマー２：配列表の配列番号：１０）。
【００１６】
ｃＤＮＡの調製方法としては以下の方法を挙げることができる。
【００１７】
ヒトより取り出した血液、各種組織、臓器から全ＲＮＡ画分を抽出するに際しては、血液、各種組織、臓器をＲＮＡ抽出用の溶媒（例えばフェノール等、リボヌクレアーゼを不活性化する作用を有する成分を含むもの）で直接溶解するのが好ましい。または、該組織の細胞を破壊しないように、スクレーパーで慎重に掻きとるか、もしくはトリプシン等の蛋白質分解酵素を用いて穏やかに組織から細胞を抽出するなどの方法により、細胞を回収した後、速やかにＲＮＡ画分抽出工程に移行する。
【００１８】
ＲＮＡ画分の抽出方法としては、チオシアン酸グアニジン・塩化セシウム超遠心法、チオシアン酸グアニジン・ホットフェノール法、グアニジン塩酸法、酸性チオシアン酸グアニジン・フェノール・クロロホルム法（Ｃｈｏｍｃｚｙｎｓｋｉ，　Ｐ．　ａｎｄ　Ｓａｃｃｈｉ，　Ｎ．，　（１９８７）　Ａｎａｌ．　Ｂｉｏｃｈｅｍ．，　１６２，　１５６−１５９）などを採用しうるが、酸性チオシアン酸グアニジン・フェノール・クロロホルム法が好適である。また、市販のＲＮＡ抽出用試薬（例えば、ＩＳＯＧＥＮ（ニッポンジーン社製）、ＴＲＩｚｏｌ試薬（インビトロジェン社製））等を試薬に添付のプロトコールに従って用いることもできる。例えばヒトの前立腺癌細胞株ＬＮＣａＰ（アメリカン・ティッシュ・カルチャー・コレクション（Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｉｓｓｕｅ　Ｃｕｌｔｕｒｅ　Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）　ＡＴＣＣ　Ｎｏ．：ＣＲＬ−１７４０）からＴＲＩｚｏｌ試薬を用いて全ＲＮＡ画分を抽出することができる。
【００１９】
得られた全ＲＮＡ画分は、必要に応じてさらにｍＲＮＡのみに精製して用いるのが好ましい。精製方法は特に限定されないが、真核細胞の細胞質に存在するｍＲＮＡの多くは、その３’末端にポリ（Ａ）配列を持つことが知られているので、この特徴を利用して例えばビオチン化したオリゴ（ｄＴ）プローブにｍＲＮＡを吸着させ、さらにストレプトアビジンを固定化した常磁性粒子に、ビオチン／ストレプトアビジン間の結合を利用してｍＲＮＡを捕捉し洗浄操作の後、ｍＲＮＡを溶出することにより、ｍＲＮＡを精製することができる。また、オリゴ（ｄＴ）セルロースカラムにｍＲＮＡを吸着させて、次にこれを溶出して精製する方法も採用し得る。さらにショ糖密度勾配遠心法などにより、ｍＲＮＡをさらに分画することもできる。
【００２０】
ｃＤＮＡは全ＲＮＡあるいはｍＲＮＡを鋳型として逆転写酵素（Ｒｅｖｅｒｓｅ　ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ）を用いて公知の方法により合成することができ、例えば、オムニ・スクリプト・リバーストランスクリプターゼ（Ｏｍｎｉｓｃｒｉｐｔ　Ｒｅｖｅｒｓｅ　Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ：キアゲン（ＱＩＡＧＥＮ）社製）を添付プロトコールの方法に従って用いることでｃＤＮＡを合成することができる。得られたｃＤＮＡに対してＣＤ３９Ｌ４遺伝子の増幅に特異的なＰＣＲプライマー（例えば配列表の配列番号９に示されるヌクレオチド配列からなるオリゴヌクレオチドプライマーと配列番号１０に示されるヌクレオチド配列からなるオリゴヌクレオチドプライマーの組み合わせ）を用いてＰＣＲを行なうことでＣＤ３９Ｌ４　ｃＤＮＡを取得することができる。ＰＣＲは通常の反応条件で行なうことができる。
【００２１】
なお、本発明の属する技術分野における通常の知識を有する者であれば、ヒトＣＤ３９Ｌ４遺伝子の天然型のヌクレオチド配列の一部を他のヌクレオチドへの置換やヌクレオチドの欠失、付加などの改変により、天然型のＣＤ３９Ｌ４遺伝子と同等に細胞の癌化を促進する生物活性を有するポリヌクレオチドを調製することが可能である。このように天然型のヌクレオチド配列においてヌクレオチドが置換、欠失、もしくは付加したヌクレオチド配列を有し、天然型のＣＤ３９Ｌ４遺伝子と同等の発現の変動を示すポリヌクレオチドもまた本発明に用いることができる。ヌクレオチド配列の改変は、例えば、制限酵素あるいはＤＮＡエキソヌクレアーゼによる欠失導入、部位特異的変異誘発法による変異導入、変異プライマーを用いたＰＣＲ法によるヌクレオチド配列の改変、合成変異ＤＮＡの直接導入などの方法により行うことができる。また、ＣＤ３９Ｌ４遺伝子と相補的なヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、ＣＤ３９Ｌ４と同様の癌細胞増殖活性を有するポリヌクレオチドを使用することもできる。
【００２２】
本発明において、「ストリンジェントな条件でハイブリダイズする」とは、市販のハイブリダイゼーション溶液ＥｘｐｒｅｓｓＨｙｂ　Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ　Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（クローンテック社製）中、６８℃でハイブリダイズすること、または、ＤＮＡを固定したフィルターを用いて０．７−１．０ＭのＮａＣｌ存在下６８℃でハイブリダイゼーションを行なった後、０．１−２倍濃度のＳＳＣ溶液（１倍濃度ＳＳＣとは１５０ｍＭ　ＮａＣｌ、１５ｍＭ　クエン酸ナトリウムからなる）を用い、６８℃で洗浄することにより同定することができる条件またはそれと同等の条件でハイブリダイズすることをいう。
【００２３】
２．ＣＤ３９Ｌ４遺伝子の発現
ＣＤ３９Ｌ４遺伝子を動物個体内で発現させるためには、得られた完全長ｃＤＮＡをウイルスベクターに組み込み、動物に投与する方法が挙げられる。ウイルスベクターによる遺伝子導入方法としては例えば、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ関連ウイルス、ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルス、ポックスウイルス、ポリオウイルス等のＤＮＡウイルス、またはＲＮＡウイルスにｃＤＮＡを組み込んで導入する方法が挙げられる。なかでも、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ関連ウイルス、ワクシニアウイルスを用いた方法が好ましい。
【００２４】
非ウイルス性の遺伝子導入方法としては、発現プラスミドを直接筋肉内に投与する方法（ＤＮＡワクチン法）、リポソーム法、リポフェクション法、マイクロインジェクション法、リン酸カルシウム法、エレクトロポレーション法等が挙げられ、なかでも、ＤＮＡワクチン法、リポソーム法が好ましい。
【００２５】
また、培養細胞に対して、完全長ｃＤＮＡをヒト、マウス、ラット等由来の筋肉細胞、肝細胞、脂肪細胞、前立腺細胞あるいは筋肉細胞、肝細胞、脂肪細胞に分化する細胞（例えば繊維芽細胞）等の細胞へ導入し、高発現させ、各標的細胞の有する機能、具体的には、細胞の癌化等、細胞の形態あるいは細胞の分化にどの様な影響が現れるかを検討することができる。逆に、試験する遺伝子に対するアンチセンス核酸を、細胞に導入し、各標的細胞の機能、形態あるいは細胞の分化にどの様な影響が出るかを調べることもできる。
【００２６】
完全長ｃＤＮＡを動物または細胞に導入するにあたっては、適当なプロモーター及び形質発現に関わる配列を含むベクターに該ｃＤＮＡを組み込み、該ベクターで宿主細胞を形質転換させる。脊椎動物細胞の発現プロモーターとしては、通常発現しようとする遺伝子の上流に位置するプロモーター、ＲＮＡのスプライス部位、ポリアデニル化部位、及び転写終結配列等を有するものを使用でき、さらにこれは必要により複製起点を有してもよい。該発現ベクターの例としては、ＳＶ４０の初期プロモーターを有するｐＳＶ２ｄｈｆｒ（Ｓｕｂｒａｍａｎｉ、　Ｓ．　ｅｔ　ａｌ．　（１９８１）　Ｍｏｌ．　Ｃｅｌｌ．　Ｂｉｏｌ．　１、　８５４−８６４）、レトロウイルスベクターｐＬＮＣＸ、ｐＬＮＳＸ、ｐＬＸＩＮ、ｐＳＩＲ（クロンテック（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）社製）等が挙げられるが、これらに限定されない。該発現ベクターは、ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）−デキストラン法（Ｌｕｔｈｍａｎ、　Ｈ．　ａｎｄ　Ｍａｇｎｕｓｓｏｎ、ｇ．（１９８３）　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ、１１、１２９５−１３０８）、リン酸カルシウム−ＤＮＡ共沈殿法（Ｇｒａｈａｍ、Ｆ．Ｌ．　ａｎｄ　ｖａｎ　ｄｅｒ　Ｅｂ、Ａ．Ｊ．（１９７３）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ　５２、４５６−４５７）、電気パルス穿孔法（Ｎｅｕｍａｎｎ、Ｅ．　ｅｔ　ａｌ．（１９８２）ＥＭＢＯ　Ｊ．　１、８４１−８４５）、あるいはＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ　２０００（インビトロジェン社製）、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ　ＰＬＵＳ　（インビトロジェン社製）、ＤＭＲＩＥ−Ｃ　Ｒｅａｇｅｎｔ（インビトロジェン社社製）、ＦｕＧＥＮＥ６（ロッシュ・ダイアグノスティクス社製）などによりＣＯＳ細胞やマウス繊維芽細胞株ＮＩＨ３Ｔ３（ＡＴＣＣ　Ｎｏ．：ＣＲＬ−１６５８）等に取り込ませることができ、あるいは、レトロウイルスベクターの場合は、パッケージング細胞株、例えば、２９３−１０Ａ１（ＩＭＧＥＮＥＸ社製）やＰＴ６７（クロンテック社製）に取り込ませるか、２９３細胞（宝酒造社製）やＮＩＨ３Ｔ３細胞にｐＣＬ−１０Ａ１やｐＣＬ−Ｅｃｏ（ＩＭＧＥＮＥＸ社製）等パッケージングプラスミドを一緒に取り込ませる（コ・トランスフェクトする）ことでウイルスを産生させ、これをＣＯＳ細胞やマウス繊維芽ＮＩＨ３Ｔ３等に感染させることで、所望の形質転換細胞を得ることができる。
【００２７】
また、遺伝子操作により、正常動物において対象とする遺伝子を破壊したノックアウト動物を作製し、腫瘍発生及び／または腫瘍増殖メカニズムにどの様な影響が現れるかを検討することも可能である。逆に、腫瘍を有する動物において、目的とする遺伝子が高発現するようにトランスジェニック動物を作製し、その腫瘍の形態変化を観察することでＣＤ３９Ｌ４の機能を調べることも可能である。前記トランスジェニック動物は、動物から受精卵を取得し、遺伝子導入の後、偽妊娠動物に移植し、発生させることにより得ることができ、その手順は公知の方法（発生工学実験マニュアル（野村達次　監修、勝木元也　編、１９８７年刊）、特開平５−４８０９３号等参照）に従えばよい。具体的には、例えば、マウスの場合にはまずメスマウスに排卵誘起剤を投与後、同系統のオスと交配し、翌日メスマウスの卵管より前核受精卵を採取する。次いで、導入するＤＮＡ断片溶液を微小ガラス管を用いて受精卵の前核に注入する。なお、導入する遺伝子を動物細胞内で発現させるためのプロモーターやエンハンサー等の調節遺伝子は、導入された動物の細胞内で機能するものであれば特に限定されない。ＤＮＡを注入した受精卵は、偽妊娠仮親メスマウス（Ｓｌｃ：ＩＣＲ等）の卵管に移植し、約２０日後に自然分娩または帝王切開により出生させる。
【００２８】
こうして得られた動物が、導入遺伝子を保持していることを確認する方法としては、例えば、前記動物の尾等からＤＮＡを抽出し、該ＤＮＡをこれに特異的なセンス及びアンチセンスプライマーを用いてＰＣＲ増幅する方法、該ＤＮＡを制限酵素で消化後、ゲル電気泳動し、ゲル中のＤＮＡをナイロン膜等にブロッティングした後、標識した導入遺伝子の全部または一部をプローブとしてサザンブロット解析を行なう方法等を挙げることができる。
【００２９】
３．ＣＤ３９Ｌ４遺伝子を用いた癌細胞の製造方法
対象とする遺伝子が、癌遺伝子として機能しうるかどうか、すなわち悪性形質能があるか否かは、それらを発現させた細胞株における接触阻止現象（Ｃｏｎｔａｃｔ　ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ）への感受性、あるいは、足場非依存性増殖（Ａｎｃｈｏｒａｇｅ　ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ　ｇｒｏｗｔｈ）などの有無によって調べることができる（横田淳、山本雅編、バイオマニュアルＵＰシリーズ　癌研究プロトコール　羊土社　１６８−１７４（１９９５．１０．１５）。すなわち、細胞に対して接触阻止現象に対する感受性を喪失させたり、足場非依存性増殖を示させたりする遺伝子は癌遺伝子といえる。
【００３０】
例えば、マウス繊維芽細胞株ＮＩＨ３Ｔ３細胞株中でＣＤ３９Ｌ４遺伝子を過剰に発現させると、上記の接触阻止能に対する感受性の喪失及び足場非依存性増殖が確認され、ＣＤ３９Ｌ４遺伝子は癌遺伝子として機能することが明らかとなった。多くの場合、癌遺伝子を過剰発現しているＮＩＨ３Ｔ３細胞をヌードマウスに注射すると注射部位に腫瘍を形成するので、ＣＤ３９Ｌ４遺伝子を過剰発現する細胞株は腫瘍形成実験に用いることもできる。
【００３１】
すなわち、ＣＤ３９Ｌ４遺伝子を用いることで、癌細胞を製造することができる。癌細胞の製造方法としては、例えば、以下の工程１）及び２）を含む癌細胞の製造方法を挙げることができる。
１）下記の▲１▼乃至▲５▼のいずれか一つに記載のポリヌクレオチドを用いて細胞を形質転換する工程；
▲１▼配列表の配列番号１のヌクレオチド番号２４７乃至１５３３に示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド、
▲２▼配列表の配列番号３のヌクレオチド番号２４７乃至１５３３に示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド、
▲３▼配列表の配列番号５のヌクレオチド番号２８３乃至１５６９に示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド、
▲４▼配列表の配列番号７のヌクレオチド番号３９８乃至１６２１に示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド、
▲５▼上記▲１▼乃至▲４▼のいずれか一つに記載のポリヌクレオチドと相補的なヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、ＣＤ３９Ｌ４と実質的に同一の蛋白質をコードするヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド、
２）１）に記載の細胞より増殖能に変化が生じた細胞株を選択する工程。
【００３２】
上記、１）の工程の細胞の形質転換では、動物個体内の細胞を形質転換し、動物個体内に癌細胞を発生させることもできるし、培養細胞を形質転換し癌細胞化することもできる。細胞の形質転換は、例えば、上記「２．ＣＤ３９Ｌ４遺伝子の発現」の項に記載した方法によって、動物あるいは培養細胞を用いて行なうことができる。
【００３３】
上記、２）の工程における細胞の増殖能の変化とは、形質転換細胞が、細胞に対する接触阻止現象に対する感受性を喪失したり、足場非依存性増殖を示したりすることをいう。細胞の増殖能の変化は、また、形質転換していない細胞に比べて形質転換した細胞において、以下に示すフォーカス形成試験によってフォーカス数が顕著に増加していること、コロニー形成試験においてコロニー数が顕著に増加していること、及び／または、スフェロイド増殖試験において、スフェロイドの直径の顕著な増加が観察されること等によって確認することもできるが、細胞の増殖能の変化を調べることができる限りにおいてこれらの方法に限定されない。細胞の増殖能に変化を生じた細胞株を癌細胞として選択することができる。
【００３４】
なお、ＣＤ３９Ｌ４を過剰に発現する細胞株では、以下の（１）乃至（３）に示すいずれか１つまたは２つ以上の性質を有する。
（１）フォーカス形成
ＮＩＨ３Ｔ３をはじめとする正常繊維芽細胞は、通常、増殖して密集状態になっても細胞が重なり合うことはなく、単層を形成したところで増殖は止まる。一方、形質転換した細胞、癌細胞では、接触阻止現象への感受性が喪失しており、重なり合いながら増殖を続けることが可能であり、何層にも重なった細胞集団を形成し、単層の細胞の広がりの中に高密度の細胞塊であるフォーカス（Ｆｏｃｕｓ）を作るという特性を持つ（横田淳、山本雅編、バイオマニュアルＵＰシリーズ　癌研究プロトコール　羊土社　１６８−１７４（１９９５年１０月１５日刊行）。この現象は、例えば、培養細胞に癌ウイルスを感染させた場合に観察されることから、癌ウイルスの定量にも用いられる場合もあるのみならず（Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ　Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ　ｉｎ　Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ（１９６９），ｐ１９８−２１１）、ウイルスや細胞由来の癌遺伝子を含むＤＮＡ断片を細胞にトランスフェクションすることによっても観察することができることから、癌遺伝子、癌抑制遺伝子のスクリーニングに用いられる。
【００３５】
ＣＤ３９Ｌ４遺伝子を過剰発現させた細胞株と過剰発現させなかった細胞株を通常の方法で培養し、新鮮な培養液に置換した後にマルチウェルプレート（例えば９６穴プレート：コーニング−コスター社製３５９８）に分注し一定時間培養した後に各ウェルあたりのフォーカス数を測定する。各ウェルあたりのフォーカス数を集計した後統計処理を行ない、各ウェルあたりの平均フォーカス数及び標準偏差を算出する。
【００３６】
ＣＤ３９Ｌ４遺伝子を過剰発現させたＮＩＨ３Ｔ３細胞ではＣＤ３９Ｌ４遺伝子を過剰発現させなかった細胞に比べ、フォーカス数が顕著に増加していることが観察される。
【００３７】
（２）コロニー形成試験
正常な細胞は、血液細胞を除き、接着する足場のない状態におくと増殖できないことが知られる。これに対して形質転換した細胞、癌細胞は、足場のない状態でも増殖しうる特性をもつ。この特性変化は、これは軟寒天培地中における増殖コロニーの形成で容易に調べることが可能である（横田淳、山本雅編、バイオマニュアルＵＰシリーズ　癌研究プロトコール　羊土社　１６８−１７４（１９９５年１０月１５日刊行）。
【００３８】
ＣＤ３９Ｌ４遺伝子を過剰発現させた細胞株と過剰発現させなかった細胞株を通常の方法で培養し、新鮮な培養液に置換した後に軟寒天培地（例えば０．３３％　Ｂａｃｔｏａｇａｒ（Ｄｉｆｃｏ社製）及び２０％ＦＣＳ含有ＲＰＭＩ１６４０）に懸濁し、寒天培地（例えば０．６６％　Ｂａｃｔｏａｇａｒ及び２０％ＦＣＳ含有ＲＰＭＩ１６４０）の上に重層する。通常の条件（例えば３７℃、５％ＣＯ_２）で培養し、形成された軟寒天中の増殖コロニー数を測定する。マルチウェルプレート（例えば１２穴プレート：コーニング−コスター社製３５１２）を用いて培養した場合には、一定時間培養した後に各ウェルあたりのコロニー数を測定する。各ウェルあたりのコロニー数を集計した後統計処理を行ない、各ウェルあたりの平均コロニー数及び標準偏差を算出する。
【００３９】
ＣＤ３９Ｌ４遺伝子を過剰発現させたＮＩＨ３Ｔ３細胞株ではＣＤ３９Ｌ４遺伝子を過剰発現させなかった細胞に比べ、コロニー数が顕著に増加していることが観察される。
【００４０】
（３）スフェロイド（Ｓｐｈｅｒｏｉｄ）増殖試験
形質転換した細胞、癌細胞の足場非依存的な増殖という特性は、スフェロイド（Ｓｐｈｅｒｏｉｄ）状態での培養によっても容易に評価することができる。スフェロイドは細胞が多数集合した凝集体のことであり、細胞接着を極めて低く抑えた培養プレートでの培養によって容易に形成しうる。スフェロイド状態での培養は、通常の単層培養とは異なり、３の（２）に示したのと同様に足場非依存的な状態での培養に類似し、生体内に近い条件下で機能を観察することができる（住友ベークライト社ＳＵＭＩＬＯＮ理化学機器総合カタログ）。
【００４１】
ＣＤ３９Ｌ４遺伝子を過剰発現させた細胞株と過剰発現させなかった細胞株を通常の方法で培養し、新鮮な培養液に置換し、細胞非付着性マルチウェルプレート（例えばスフェロイド９６Ｕ：住友ベークライト社製ＭＳ−００９６Ｓ）に分注する。通常の条件（例えば、３７℃、５％ＣＯ_２）で培養し、培養開始後一定時間経過後にプレート上に形成されるスフェロイドの大きさを測定する。スフェロイドの大きさは例えば顕微鏡下、接眼方眼ミクロメータ−（三啓社製：Ｓ−６）を用いて測定することができ、スフェロイドの大きさの指標としてスフェロイドの直径を用いることができる。
【００４２】
ＣＤ３９Ｌ４遺伝子を過剰発現させたＮＩＨ３Ｔ３細胞株ではＣＤ３９Ｌ４遺伝子を過剰発現させなかった細胞に比べ、スフェロイドの直径の顕著な増加が観察される。
【００４３】
４．腫瘍マーカー遺伝子
ＣＤ３９Ｌ４は細胞の癌化及び／または癌細胞の増殖に関与していると考えられる。したがって、ＣＤ３９Ｌ４の各細胞、及び／または各組織における発現量を測定することでＣＤ３９Ｌ４の過剰発現に起因して発生する癌化及び／または癌細胞の増殖の状態を判定することができる。このような癌としては、例えば、前立腺癌、精巣癌、陰茎癌、膀胱癌、腎臓癌、口腔癌、咽頭癌、口唇癌、舌癌、歯肉癌、鼻咽頭癌、食道癌、胃癌、小腸癌、大腸癌、結腸癌、肝臓癌、胆嚢癌、膵臓癌、鼻腔癌、肺癌、骨肉腫、軟部組織癌、皮膚癌、黒色腫、乳癌、子宮癌、卵巣癌、脳腫瘍、甲状腺癌、リンパ腫、白血病などを挙げることができる。
【００４４】
すなわち、ＣＤ３９Ｌ４遺伝子は腫瘍形成のマーカー遺伝子として用いることができる。遺伝子の発現量を測定する方法としては、検体より抽出した全ＲＮＡよりｃＲＮＡまたはｃＤＮＡを調製し、これを適当な標識でラベルすることにより、そのシグナル強度として検出することができる。
【００４５】
以下に、遺伝子の発現量の解析方法として、固相化試料を用いた解析方法と、その他のいくつかの解析方法について説明する。
【００４６】
（１）　固相化試料を用いた解析方法
ｉ）固相化試料
前記固相化試料としては、例えば以下のものが挙げられる。
ａ）遺伝子チップ：
データベース上のＥＳＴ（ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ　ｓｅｑｕｅｎｃｅ　ｔａｇ）配列またはｍＲＮＡ配列をもとに合成したアンチセンスオリゴヌクレオチドが固相化された遺伝子チップを用いることができる。このような遺伝子チップとしてはアフィメトリックス社製の遺伝子チップ（Ｌｉｐｓｈｕｔｚ，　Ｒ．　Ｊ．　ｅｔ　ａｌ．　（１９９９）　Ｎａｔｕｒｅ　ｇｅｎｅｔ．　２１，　ｓｕｐｐｌｉｍｅｎｔ、２０−２４）を用いることができるが、これに限定されず、公知の方法に基づき作製してもよい。遺伝子チップ上に固相化するアンチセンスオリゴヌクレオチドの基となるＥＳＴ配列またはｍＲＮＡ配列は、解析対象の動物あるいは動物細胞と、同種の動物由来のものであることが最も好ましい。マウスやマウス由来培養細胞を用いるときはマウス由来のものが望ましく、ヒト検体やヒト由来培養細胞を用いるときはヒト由来のものが望ましい。マウス腫瘍のｍＲＮＡを解析する場合はマウス由来のものが最も好ましく、例えば、アフィメトリックス社製マウス１９Ｋセット（Ｍｕｒｉｎｅ　１９Ｋ　ｓｅｔ：　１９ＫＡ，　１９ＫＢ，１９ＫＣ）やマウス１１Ｋセット（Ｍｕｒｉｎｅ　１１Ｋ　ｓｅｔ：　１１ＫＡ，　１１ｋＢ）を用いることができる。ヒト腫瘍（例えば前立腺癌細胞株ＬＮＣａＰ：ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ−１７４０、ＰＣ−３：ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ−１４３５、ＤＵ−１４５：ＡＴＣＣ番号ＨＴＢ−８１など）のｍＲＮＡを解析する場合には、ヒト由来のものが好ましく、例えば、アフィメトリックス社製ヒトＵ９５セットまたはＵ１３３セットを用いることができる。しかしながら、それらに限定されず、例えば近縁種の動物由来のものも使用可能である。近縁種としては、例えば哺乳類同士を挙げることができ、ヒトとマウス、ヒトとサル等組み合わせを挙げることができるがこれらに限定されない。
【００４７】
ｂ）マウスまたはヒト、全ＲＮＡあるいは特定の組織から得た全ＲＮＡより作製されたｃＤＮＡまたはＲＴ−ＰＣＲ産物が固相化された、アレイまたはメンブレンフィルター：
上記ｃＤＮＡまたはＲＴ−ＰＣＲ産物は、マウスまたはヒトのＥＳＴデータベース等の配列情報を基に作製されたプライマーで逆転写酵素反応やＰＣＲを実施することによりクローン化されたものである。このｃＤＮＡやＲＴ−ＰＣＲ産物は、ＣＤ３９Ｌ４遺伝子のみとハイブリダイズするものであってもよい。また、アレイやフィルターは市販のもの（例えば、インテリジーン：宝酒造社製等）を使用してもよいし、上記ｃＤＮＡやＲＴ−ＰＣＲ産物を市販のスポッターで（例えば、ＧＭＳ４１７アレイヤー：宝酒造社製等）を用いて固相化することにより作製してもよい。
【００４８】
ｉｉ）プローブの作製と解析
標識プローブは、特定のｍＲＮＡクローンではなく、発現している全てのｍＲＮＡを標識したものを用いる。プローブ作製のための出発材料としては精製していないｍＲＮＡを用いてもよいが、前述の方法で精製したポリ（Ａ）^＋ＲＮＡを用いることが望ましい。以下に、各種固相化試料を用いた場合の、標識プローブの調製方法と検出、解析方法について説明する。
【００４９】
ａ）アフィメトリックス社製遺伝子チップ：
アフィメトリクス社製遺伝子チップに添付されたプロトコール（アフィメトリックス社発現解析技術マニュアル）に従ってビオチン標識したｃＲＮＡプローブを作製する。次いでアフィメトリックス社製遺伝子チップに添付のプロトコール（発現解析技術マニュアル）に従って、アフィメトリックス社製の解析装置（ＧｅｎｅＣｈｉｐ　Ｆｌｕｉｄｉｃｓ　Ｓｔａｔｉｏｎ　４００）を用いてハイブリダイゼーションを行い、アビジンによる発光を検出、解析を行なう。
【００５０】
ｂ）アレイ：
逆転写酵素反応でポリ（Ａ）^＋ＲＮＡからｃＤＮＡを作製する際に、ｃＤＮＡの検出ができるようにｃＤＮＡを標識しておくことが必要であり、蛍光色素で標識する場合には、蛍光色素（例えばＣｙ３、Ｃｙ５など）で標識されたｄ−ＵＴＰなどを加えておくことによりｃＤＮＡを蛍光標識する。このとき、被験物質添加細胞由来のポリ（Ａ）^＋ＲＮＡと対照細胞由来のポリ（Ａ）^＋ＲＮＡをそれぞれ異なる色素で標識しておけば、後のハイブリダイゼーション時には両者を混合して用いることができる。アレイとして例えば、宝酒造（株）社の市販アレイを用いる場合、同社のプロトコールに従いハイブリダイゼーション及び洗浄を行って、蛍光シグナル検出機（例えばＧＭＳ４１８アレイスキャナー（宝酒造社製）等）で蛍光シグナルを検出後、解析を行う。ただし、使用するアレイとしては市販のものに限定されず、自家製のもの、特別に作製したのもでもよい。
【００５１】
ｃ）メンブレンフィルター：
逆転写酵素でポリ（Ａ）^＋ＲＮＡからｃＤＮＡを作製する際に、放射性同位元素（例えば、ｄ−ＣＴＰ［α−^３３Ｐ］）等を加えることにより標識プローブを調製し、常法によりハイブリダイゼーションを行ない、例えば、市販のフィルター製マイクロアレーである、アトラスシステム（クローンテック社製）を用いてハイブリダイゼーション及び洗浄を行なった後、解析装置（例えば、アトラスイメージ：クローンテック社製等）を用いて検出、解析を行なう。
【００５２】
蛍光標識プローブを用いる場合には、それぞれのプローブを異なる蛍光色素で標識しておけば一つの固相化試料に両プローブの混合物を一度にハイブリダイズさせて蛍光強度を読み取ることができる（Ｂｒｏｗｎ，　Ｐ．　Ｏ．　ｅｔ　ａｌ．　（１９９９）　Ｎａｔｕｒｅ　ｇｅｎｅｔ，　２１，　ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ，　３３−３７）。
【００５３】
（２）その他の解析方法
ａ）　ＲＴ−ＰＣＲ
まずＣＤ３９Ｌ４のｍＲＮＡを鋳型とする逆転写酵素反応を行ってから、ＰＣＲを実施して特異的にＤＮＡ断片を増幅する。この方法において、目的のヌクレオチド配列を特異的に増幅するためには、目的のｍＲＮＡの特定の部分配列に相補的なアンチセンスプライマーと、該アンチセンスプライマーから逆転写酵素により生成されるｃＤＮＡの配列中の特定の部分配列に相補的なセンスプライマーが用いられる。ＲＴ−ＰＣＲは市販のキット（例えば、ＲＮＡ　ＰＣＲキット　ＡＭＶ　ｖｅｒ２．１：宝酒造社製等）を用いて、キットに添付のマニュアルに従って行なうことができる。
【００５４】
逆転写酵素反応及びＰＣＲの両方に用いられるアンチセンスプライマーは、実質的にＣＤ３９Ｌ４遺伝子のヌクレオチド配列のアンチセンス配列中の、連続した１５ヌクレオチド乃至４０ヌクレオチド、好ましくは少なくとも１８ヌクレオチド乃至３０ヌクレオチド、更に好ましくは２３ヌクレオチド乃至３０ヌクレオチドのヌクレオチド配列からなる。
【００５５】
一方、ＰＣＲにおいて用いられるセンスプライマーの配列は、ＣＤ３９Ｌ４遺伝子のヌクレオチド配列において、上記アンチセンスプライマーの相補鎖にあたる配列中の最も５’末端側の位置よりもさらに５’末端側領域に存在する配列中の連続した１５乃至４０ヌクレオチド、好ましくは１８乃至３５ヌクレオチド、更に好ましくは２１乃至３０ヌクレオチドの任意の部分配列からなる。ただし、センスプライマーとアンチセンスプライマーに互いに相補的な配列が存在すると、プライマー同士がアニーリングすることにより非特異的な配列が増幅され、特異的なポリヌクレオチド検出の妨げとなるおそれがあるので、そのような組み合わせを避けたプライマーの設計を行うことが好ましい。
【００５６】
これらアンチセンスプライマー及びセンスプライマーには、いずれも上記で規定したそれらヌクレオチド配列の５’末端に、ＣＤ３９Ｌ４遺伝子のヌクレオチド配列とは無関係のヌクレオチド配列がリンカーとして付加されていてもよい。ただし、特異的なポリヌクレオチド検出の妨げとならないよう、該リンカーは反応中に反応液内の核酸と非特異的アニーリングを起こさないようなものであることが好ましい。
【００５７】
ＲＴ−ＰＣＲによって核酸の検出を行う態様における、各反応の条件は以下に記載する通りである。なお、ＲＴ−ＰＣＲによる検出のための試料は、通常ポリ（Ａ）^＋ＲＮＡにまで精製されている必要はない。
【００５８】
ｉ）逆転写酵素反応
反応液組成の例（全量２０μｌ）：
全ＲＮＡ　適宜；
塩化マグネシウム　２．５乃至５ｍＭ（好ましくは５ｍＭ）；
１×ＲＴ　ＰＣＲ緩衝液（１０ｍＭ　トリス−塩酸（２５℃におけるｐＨ８．３乃至９．０（好ましくは８．３））、５０ｍＭ　塩化カリウム）；
ｄＮＴＰｓ　０．５乃至１ｍＭ（好ましくは１ｍＭ）；
アンチセンスプライマー　１μＭ　（アンチセンスプライマーの代用として、市販のランダムプライマーやオリゴ（ｄＴ）プライマー（１２−２０ヌクレオチド）を２．５μＭ添加することもできる）；
逆転写酵素　０．２５乃至１単位／μｌ（好ましくは０．２５単位／μｌ）；
滅菌水で２０μｌに調整する。
【００５９】
反応温度条件：
３０℃で１０分間保温（ランダムプライマー使用時のみ）した後、４２乃至６０℃（好ましくは４２℃）で１５乃至３０分間（好ましくは３０分間）保温し、さらに９９℃で５分間加熱して酵素を失活させてから、４乃至５℃（好ましくは５℃）で５分間冷却する。
【００６０】
ｉｉ）ＰＣＲ
反応液組成の例：
塩化マグネシウム　２乃至２．５ｍＭ（好ましくは２．５ｍＭ）；
１×ＰＣＲ緩衝液（１０ｍＭ　トリス−塩酸（２５℃におけるｐＨ８．３乃至９．０（好ましくは８．３））、５０ｍＭ　塩化カリウム；
ｄＮＴＰｓ　０．２乃至０．２５ｍＭ（好ましくは０．２５ｍＭ）；
アンチセンスプライマー及びセンスプライマー　０．２乃至０．５μＭ（好ましくは０．２μＭ）；
Ｔａｑポリメラーゼ　１乃至２．５単位（好ましくは２．５単位）；
滅菌水を加えて全量を８０μｌに調整し、その全量を、逆転写反応を終了した反応液全量に加えてからＰＣＲを開始する。
【００６１】
反応温度条件：　まず９４℃で２分間加熱した後、９０乃至９５℃（好ましくは９４℃）で３０秒間、４０乃至６０℃（好ましくは、プライマーの特性から算出される解離温度（Ｔｍ）からそれより２０度低い温度までの範囲内で３０秒間、７０乃至７５℃（好ましくは７２℃）で１．５分間の温度サイクルを２８乃至５０サイクル（好ましくは２８サイクル）繰り返してから、４℃に冷却する。
【００６２】
ＰＣＲ終了後、反応液を電気泳動し、目的の大きさのバンドが増幅されているか否かを検出する。定量的検出を行うためには、予め段階希釈したｃＤＮＡクローンを標準の鋳型ＤＮＡとして同条件でＰＣＲを実施し、定量的検出が可能な温度サイクル数を定めておくか、または、例えば５サイクル毎に一部反応液をサンプリングしてそれぞれ電気泳動を行う。また例えばＰＣＲ反応時に放射標識ｄＣＴＰを用いることにより、バンド中に取り込まれた放射能の量を指標に定量を行うこともできる。遺伝子定量の信頼性を高めた方法として、上記ＲＴ−ＰＣＲ法を改良した競合ＲＴ−ＰＣＲ法（Ｓｏｕａｚｅ　ｅｔ　ａｌ．、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ　２１、２８０−２８５（１９９６））や、ＴａｑＭａｎ　ＰＣＲ法（Ｈｅｉｄ　ｅｔ　ａｌ．、Ｇｅｎｏｍ．　　Ｒｅｓ．　　６、９８６−９９４（１９９６））なども利用可能である。
ｂ）　リボヌクレアーゼ保護アッセイ（ＲＮａｓｅ　ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ　ａｓｓａｙ）：　ＲＮＡ試料中の、上記１）乃至５）のいずれか一つに記載のヌクレオチド配列を有するｍＲＮＡ（ただし配列中のｔはｕに読み替える）のみに標識プローブをハイブリダイズさせ、二本鎖ポリヌクレオチドを形成させておいてから、試料にリボヌクレアーゼを添加してインキュベーションすると、プローブがハイブリダイズしたｍＲＮＡは二本鎖を形成していることによってリボヌクレアーゼによる消化を免れ、それ以外のＲＮＡは消化されるので、該二本鎖ポリヌクレオチドのみが残る（検出されるｍＲＮＡよりプローブが短ければ、プローブの鎖長に相当する二本鎖ポリヌクレオチドが残る）。この二本鎖ポリヌクレオチドを定量することにより、目的のポリヌクレオチドの発現量を測定する。具体的には、例えば以下に記載する方法に従う。
【００６３】
二本鎖を形成せずに余った標識プローブを二本鎖ポリヌクレオチドと確実に分離して定量を容易にするために、余った標識プローブはリボヌクレアーゼに消化されることが好ましいが、リボヌクレアーゼとして一本鎖ＤＮＡも消化できるようなものを使用すれば、標識プローブはＤＮＡでもＲＮＡでもよい。標識プローブの調製方法は上記常法に従って行なうことができるが、リボヌクレアーゼアッセイにおいて用いられるプローブの長さは５０乃至５００ヌクレオチド程度が好ましい。また、二本鎖ＤＮＡを直接標識して熱変性したのみのプローブ等、相補鎖が混在するようなプローブは本法には好適ではない。
【００６４】
ＲＮＡプローブは、例えば下記の方法に従って調製される。まず鋳型ＤＮＡをバクテリオファージのプロモーター（Ｔ７、ＳＰ６、Ｔ３プロモーター等）を有するプラスミドベクター（例えばｐＧＥＭ−Ｔ（プロメガ社製）など）に挿入する。次にこの組換えプラスミドベクターを、制限酵素で、挿入断片のすぐ下流で一ヶ所だけ切断されるように消化する。得られた直鎖ＤＮＡを鋳型として、放射能標識されたリボヌクレオチド存在下で、イン・ビトロ転写反応を行う。この反応には、ベクター中のプロモーターに合わせてＴ７、ＳＰ６またはＴ３ポリメラーゼ等の酵素を用いる。以上の操作は例えばリボプローブシステム−Ｔ７、同−ＳＰ６または同−Ｔ３（いずれもプロメガ社製）を用いて行うことができる。
【００６５】
ＲＮＡ試料を調製するまでの工程は「１．ＣＤ３９Ｌ４遺伝子の取得」の項に示した方法にしたがって実施することができ、抽出された全ＲＮＡはさらに精製してｍＲＮＡとして使用することが望ましい。調製された全ＲＮＡ試料１０乃至２０μｇ相当分と、５×１０^５ｃｐｍ相当の過剰量の標識プローブとを用いてリボヌクレアーゼ保護アッセイを行う。この操作は市販のキット（ＨｙｂＳｐｅｅｄ　ＲＰＡ　Ｋｉｔ、アンビオン社製）を用いて行うことができる。得られたリボヌクレアーゼ消化後の試料を、８Ｍ　尿素を含む４乃至１２％ポリアクリルアミドゲルで電気泳動した後、ゲルを乾燥させ、Ｘ線フィルムでオートラジオグラフィーを行う。以上の操作により、リボヌクレアーゼ消化を免れた二本鎖ポリヌクレオチドのバンドを検出することができ、またその定量は常法に従って実施することができる。さらに、各試料間のＲＮＡ量の差等に起因するばらつきを補正する目的で、β−アクチン遺伝子の発現量を同時に測定しておけば、より精密な評価を行うことができる。
【００６６】
ｃ）　ランオン・アッセイ（Ｒｕｎ−ｏｎ　ａｓｓａｙ、Ｇｒｅｅｎｂｅｒｇ，　Ｍ．　Ｅ．　ａｎｄ　Ｚｉｆｆ，　Ｅ．　Ｂ．Ｂ．　（１９８４）　Ｎａｔｕｒｅ　３１１，　４３３−４３８、Ｇｒｏｕｄｉｎｅ，　Ｍ．　ｅｔ　ａｌ．　（１９８１）　Ｍｏｌ．　Ｃｅｌｌ　Ｂｉｏｌ．　１，　２８１−２８８参照）：本方法は、細胞から核を単離して目的の遺伝子の転写活性を測定する方法であり、細胞内のｍＲＮＡを検出する方法ではないが、本発明においては「遺伝子の発現量を測定する方法」に包含される。単離された細胞核を用いて、試験管内で転写反応を行わせると、核を単離する前に既に転写が開始されｍＲＮＡ鎖が生成されている途中のものが伸長していく反応のみが進行する。この反応時に放射標識したリボヌクレオチドを添加して、伸長していくｍＲＮＡを標識しておき、その中に含まれる、非標識プローブにハイブリダイズするｍＲＮＡを検出することにより、核を単離した時点における目的のポリヌクレオチドの転写活性を測定することができる。なお具体的操作方法は、標識しないプローブを調製する他は、上記参照文献の記載に準ずる。被験者または被験動物から採取した検体由来の試料と、正常人または正常動物由来の試料との間で測定結果を比較し、ＣＤ３９Ｌ４遺伝子の転写活性が正常人または正常動物より高い場合、腫瘍を有していると判断することができる。
【００６７】
ｄ）　ＣＤ３９Ｌ４遺伝子のプロモーター支配下に、該プロモーター活性の検出を可能にする遺伝子（以下「レポーター遺伝子」という。）を利用して、間接的にＣＤ３９Ｌ４遺伝子やＣＤ３９Ｌ４の発現を検出することもできる。以下、レポーター遺伝子を利用した検出方法について説明する。
【００６８】
ｄ−１）レポーター遺伝子
レポーター遺伝子は、宿主細胞が本試験方法の一連の過程において産生し得る他のいかなる蛋白質とも特異的に区別可能な、レポーター蛋白質をコードするものであればよい。好ましくは、形質転換前の細胞が該レポーター蛋白質と同一または類似の蛋白質をコードする遺伝子を持たないようなものがよい。例えば、レポーター蛋白質が該細胞に対して毒性を有するようなものや、該細胞が感受性を有する抗生物質の耐性を付与するものであるような場合でも、レポーター遺伝子の発現の有無は細胞の生存率で判定することが可能である。しかしながら、本発明で用いられるレポーター遺伝子としてより好ましいものは、発現量を特異的かつ定量的に検出することができる（例えば、該レポーター遺伝子にコードされる蛋白質に対する特異的抗体が取得されているような）構造遺伝子である。より好ましくは、外来の基質と特異的に反応することにより定量的測定が容易な代謝産物を生じるような酵素等をコードする遺伝子である。そのようなレポーター遺伝子としては、例えば、以下の蛋白質をコードする遺伝子を例示することができるが、本発明はそれらに限定されない。
【００６９】
ｄ−１−１）クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ：
クロラムフェニコールにアセチル基を付加する酵素で、いわゆるＣＡＴアッセイ等で検出することができる。プロモーターを組み込むだけでレポーターアッセイ用のベクターを調製できるベクターとして、ｐＣＡＴ３−Ｂａｓｉｃベクター（プロメガ社製）が市販されている。
【００７０】
ｄ−１−２）ホタルルシフェラーゼ：
ルシフェリンを代謝した際に生じる生物発光を測定することにより定量できる。レポーターアッセイ用のベクターとしては、ｐＧＬ３−Ｂａｓｉｃベクター（プロメガ社製）が市販されている。
【００７１】
ｄ−１−３）β−ガラクトシダーゼ：
呈色反応、蛍光または化学発光でそれぞれ測定可能な基質がある。レポーターアッセイ用のベクターとしては、ｐβｇａｌ−Ｂａｓｉｃ（プロメガ社製）が市販されている。
【００７２】
ｄ−１−４）分泌型アルカリホスファターゼ：
呈色反応、生物発光または化学発光でそれぞれ測定可能な基質がある。レポーターアッセイ用のベクターとしては、ｐＳＥＡＰ２−Ｂａｓｉｃ（クロンテック社製）が市販されている。
【００７３】
ｄ−１−５）緑色蛍光蛋白質（ｇｒｅｅｎ−ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ　ｐｒｏｔｅｉｎ）：
酵素ではないが、自らが蛍光を発するので直接定量できる。同じくレポーターアッセイ用のベクターとしてｐＥＧＦＰ−１（クロンテック社製）が市販されている。
【００７４】
ｄ−２）レポーター遺伝子の導入
公知の方法に従い、ＣＤ３９Ｌ４遺伝子のプロモーター支配下にレポーター遺伝子を発現し得るレポーター発現プラスミドを細胞にトランスフェクションする。
【００７５】
細胞に発現プラスミドを導入する方法としては、ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）−デキストラン法（Ｌｕｔｈｍａｎ、Ｈ．　ａｎｄ　Ｍａｇｎｕｓｓｏｎ、Ｇ．（１９８３）Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．　１１、１２９５−１３０８）、リン酸カルシウム−ＤＮＡ共沈殿法（Ｇｒａｈａｍ、Ｆ．Ｌ．　ａｎｄ　ｖａｎ　ｄｅｒ　Ｅｂ、Ａ．Ｊ．（１９７３）　Ｖｉｒｏｌｏｇｙ　５２、４５６−４５７）、電気パルス穿孔法（Ｎｅｕｍａｎｎ、Ｅ．　ｅｔ　ａｌ．（１９８２）ＥＭＢＯＪ．１、８４１−８４５）、リポフェクション法（Ｌｏｐａｔａ　ｅｔ　ａｌ．（１９８４）Ｎｕｃｌ．　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．　１２、５７０７−５７１７、Ｓｕｓｓｍａｎ　ａｎｄ　Ｍｉｌｍａｎ（１９８４）　Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．　Ｂｉｏｌ．　４、１６４１−１６４３）などを挙げることができるが、これらに限定されず、本発明の属する技術分野において汎用される任意の方法を採用することができる。ただし、細胞がいわゆる浮遊細胞である場合は、リン酸カルシウム−ＤＮＡ共沈殿法以外の方法を用いることが好ましい。いずれの方法においても、用いる細胞に応じて、至適化されたトランスフェクション条件を用いることが必要である。
【００７６】
ｄ−３）評価
かくして、ＣＤ３９Ｌ４遺伝子のレポーター発現プラスミドをトランスフェクションした細胞を培養すると、該ＣＤ３９Ｌ４遺伝子の発現と相関してレポーター遺伝子の転写が促進される。したがって、レポーター遺伝子の発現が可能な条件下において、培地中に任意の被検物質を添加した場合と添加しない場合でのレポーター遺伝子の発現量変化をみれば、ＣＤ３９Ｌ４遺伝子の発現量が評価できる。ここで、「レポーター遺伝子の発現が可能な条件」とは、レポーター発現ベクターによってトランスフェクトされた細胞が生存して、レポーター遺伝子の転写産物（レポーター蛋白質）の生産が可能な条件であればよい。好ましくは、使用される細胞株に適合した培地（ウシ胎児血清等の血清成分を添加してもよい）で、４〜６％（最も好適には５％）の炭酸ガスを含む空気存在下、３６〜３８℃（最も好適には３７℃）で２〜３日間（最も好適には２日間）培養する。
【００７７】
５．腫瘍マーカー蛋白質
ＣＤ３９Ｌ４は細胞の癌化を引き起こし腫瘍細胞で発現量が増大していると考えられるので腫瘍の存在を検出するための腫瘍マーカー蛋白質として使用することができる。
【００７８】
ＣＤ３９Ｌ４の検出方法の好適な態様として、抗体を利用した方法について説明する。まず、試料中の蛋白質を９６穴プレートや３８４穴プレート等のマルチウエルプレートのウエル内底面やメンブレン等に固相化しておいてから、ＣＤ３９Ｌ４を特異的に認識する抗体を用いた検出が行われる。このうち、９６穴プレートや３８４穴プレート等のマルチウエルプレートを用いるのは一般に固相酵素免疫定量法（ＥＬＩＳＡ法）や放射性同位元素免疫定量法（ＲＩＡ法）と呼ばれる方法である。一方、メンブレンに固相化する方法としては、試料のポリアクリルアミド電気泳動を経てメンブレンに蛋白質を転写する方法（ウエスタンブロット法）か、または直接メンブレンに試料またはその希釈液を染み込ませる、いわゆるドットブロット法やスロットブロット法が挙げられる。
【００７９】
（１）試料の調製
試料としては、ヒトやマウス等のヒト以外の哺乳動物全血、血清、肝臓、前立腺、精巣、陰茎、膀胱、腎臓、口腔、咽頭、口唇、舌、歯肉、鼻咽頭、食道、胃、小腸、大腸、結腸、肝臓、胆嚢、膵臓、鼻腔、肺、軟部組織、皮膚、乳房、子宮、卵巣、脳、甲状腺、リンパ等腫瘍の存在を検出する対象とする臓器または組織を任意に選択することができる。なお、試料の採取に当たっては各実験機関の実験倫理ガイドラインにしたがって行なう必要がある。上記試料は、必要に応じて高速遠心を行うことにより、不溶性の物質を除去した後、以下のようにＥＬＩＳＡ／ＲＩＡ用試料やウエスタンブロット用試料として調製する。
【００８０】
ＥＬＩＳＡ／ＲＩＡ用試料としては、例えば回収した、血清、肝臓、前立腺、精巣、陰茎、膀胱、腎臓、口腔、咽頭、口唇、舌、歯肉、鼻咽頭、食道、胃、小腸、大腸、結腸、肝臓、胆嚢、膵臓、鼻腔、肺、軟部組織、皮膚、乳房、子宮、卵巣、脳、甲状腺、リンパ等をそのまま使用するか、緩衝液で適宜希釈したものを用いる。ウエスタンブロット用（電気泳動用）試料は、例えば、血清、肝臓、前立腺、精巣、陰茎、膀胱、腎臓、口腔、咽頭、口唇、舌、歯肉、鼻咽頭、食道、胃、小腸、大腸、結腸、肝臓、胆嚢、膵臓、鼻腔、肺、軟部組織、皮膚、乳房、子宮、卵巣、脳、甲状腺、リンパ等の抽出液をそのまま使用するか、緩衝液で適宜希釈して、ＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動用の２−メルカトルエタノールを含むサンプル緩衝液（シグマ（Ｓｉｇｍａ）社製等）と混合する。ドット／スロットブロットの場合は、例えば回収した血清、肝臓、前立腺、精巣、陰茎、膀胱、腎臓、口腔、咽頭、口唇、舌、歯肉、鼻咽頭、食道、胃、小腸、大腸、結腸、肝臓、胆嚢、膵臓、鼻腔、肺、軟部組織、皮膚、乳房、子宮、卵巣、脳、甲状腺、リンパ等の抽出液そのもの、または緩衝液で適宜希釈したものを、ブロッティング装置を使用するなどして、直接メンブレンへ吸着させる。
【００８１】
（２）試料の固相化
上記のようにして得られた試料中の蛋白質を特異的に検出するためには、試料を免疫沈降法、リガントの結合を利用した方法等によって、沈殿させ、固相化せずに検出することもできるし、そのまま検出する該試料を固相化することもできる。蛋白質を固相化する場合において、ウエスタンブロット法、ドットブロット法またはスロットブロット法に用いられるメンブレンとしては、ニトロセルロースメンブレン（例えば、バイオラッド社製等）、ナイロンメンブレン（例えば、ハイボンド−ＥＣＬ（アマシャム・ファルマシア社製）等）、コットンメンブレン（例えば、ブロットアブソーベントフィルター（バイオラッド社製）等）またはポリビニリデン・ジフルオリド（ＰＶＤＦ）メンブレン（例えば、バイオラッド社製等）等が挙げられる。
【００８２】
電気泳動後のゲルからメンブレンに蛋白質を移す、いわゆるブロッティング方法としては、ウエット式ブロッティング法（ＣＵＲＲＥＮＴ　ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ　ＩＮ　ＩＭＭＵＮＯＬＯＧＹ　ｖｏｌｕｍｅ　２　ｅｄ　ｂｙ　Ｊ．　Ｅ．　Ｃｏｌｉｇａｎ，　Ａ．　Ｍ．　Ｋｒｕｉｓｂｅｅｋ，　Ｄ．　Ｈ．　Ｍａｒｇｕｌｉｅｓ，　Ｅ．　Ｍ．　Ｓｈｅｖａｃｈ，　Ｗ．　Ｓｔｒｏｂｅｒ）、セミドライ式ブロッティング法（上記ＣＵＲＲＥＮＴ　ＰＲＯＴＯＣＯＬＳＩＮ　ＩＭＭＵＮＯＬＯＧＹ　ｖｏｌｕｍｅ　２　参照）等を挙げることができる。ドットブロット法やスロットブロット法のための器材も市販されている（例えば、バイオ・ドット（バイオラッド）等）。
【００８３】
一方、ＥＬＩＳＡ法／ＲＩＡ法で検出・定量を行うためには、専用の９６穴プレート（例えば、イムノプレート・マキシソープ（ヌンク社製）等）に試料またはその希釈液（例えば０．０５％　アジ化ナトリウムを含むリン酸緩衝生理食塩水（以下「ＰＢＳ」という）で希釈したもの）を入れて４℃乃至室温で一晩、または３７℃で１乃至３時間静置することにより、ウエル内底面に蛋白質を吸着させて固相化する。
【００８４】
（３）抗体
用いられる抗体は、ＣＤ３９Ｌ４またはその一部を特異的に認識するものである。このような抗体としては、例えば、ＣＤ３９Ｌ４には結合するが、他のいかなるマウスまたはヒト由来の蛋白質とも結合しないような抗体を挙げることができる。
【００８５】
前記抗体は、常法を用いて（例えば、新生化学実験講座１、蛋白質１、ｐ．３８９−３９７、１９９２）、抗原となるポリペプチド、あるいはそのアミノ酸配列から選択される任意のポリペプチドを動物に免疫し、生体内に産生される抗体を採取、精製することによって得ることができる。また、公知の方法（例えば、Ｋｏｈｌｅｒ　ａｎｄ　Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，　Ｎａｔｕｒｅ　２５６，　４９５−４９７，　１９７５、Ｋｅｎｎｅｔ，　Ｒ．　ｅｄ．，　Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ　Ａｎｔｉｂｏｄｙ　ｐ．３６５−３６７，　１９８０，　Ｐｒｅｎｕｍ　Ｐｒｅｓｓ，　Ｎ．Ｙ．）に従って、ＣＤ３９Ｌ４に対する抗体を産生する抗体産生細胞とミエローマ細胞とを融合させることによりハイブリドーマを樹立し、モノクローナル抗体を得ることもできる。
【００８６】
抗体を作製するための抗原としては、ＣＤ３９Ｌ４またはその少なくとも６個の連続した部分アミノ酸配列からなるポリペプチド、あるいはこれらに任意のアミノ酸配列や担体が付加された誘導体を挙げることができる。
【００８７】
前記抗原ポリペプチドは本発明のＣＤ３９Ｌ４をｉｎ　ｖｉｔｒｏにて合成する、あるいは遺伝子操作により宿主細胞に産生させることによって得ることができる。具体的には、ＣＤ３９Ｌ４を発現可能なベクターに組み込んだ後、転写と翻訳に必要な酵素、基質及びエネルギー物質を含む溶液中で合成する、あるいは他の原核生物、または真核生物の宿主細胞を形質転換させることによってＣＤ３９Ｌ４を発現させることにより、該蛋白質を得ることが出来る。
【００８８】
ポリペプチドのイン・ビトロ（ｉｎ　ｖｉｔｒｏ）合成としては、例えばロシュ・ダイアグノスティックス社製のラピッドトランスレーションシステム（ＲＴＳ）が挙げられるが、これに限定されない。ＲＴＳを用いる場合を例に挙げると、目的の遺伝子をＴ７プロモーターにより制御される発現ベクターにクローニングし、これをｉｎ　ｖｉｔｒｏの反応系に添加すると、最初に鋳型ＤＮＡよりＴ７ＲＮＡポリメラーゼによりｍＲＮＡが転写され、その後大腸菌溶解液中のリボソーム等により翻訳が行われ、目的のポリペプチドが反応液中に合成される（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａ，　１，　２０−２３　（２００１），　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａ，　２，　２８−２９　（２００１）。
【００８９】
原核細胞の宿主としては、例えば、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）や枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｕｂｔｉｌｉｓ）などが挙げられる。目的の遺伝子をこれらの宿主細胞内で形質転換させるには、宿主と適合し得る種由来のレプリコンすなわち複製起点と、調節配列を含んでいるプラスミドベクターで宿主細胞を形質転換させる。また、ベクターとしては、形質転換細胞に表現形質（表現型）の選択性を付与することができる配列を有するものが好ましい。
【００９０】
例えば、大腸菌としてはＫ１２株などがよく用いられ、ベクターとしては、一般にｐＢＲ３２２やｐＵＣ系のプラスミドが用いられるが、これらに限定されず、公知の各種菌株、及びベクターがいずれも使用できる。
【００９１】
プロモーターとしては、大腸菌においては、トリプトファン（ｔｒｐ）プロモーター、ラクトース（ｌａｃ）プロモーター、トリプトファン・ラクトース（ｔａｃ）プロモーター、リポプロテイン（ｌｐｐ）プロモーター、ポリペプチド鎖伸張因子Ｔｕ（ｔｕｆＢ）プロモーター等が挙げられ、どのプロモーターも目的のポリペプチドの産生に使用することができる。
【００９２】
枯草菌としては、例えば２０７−２５株が好ましく、ベクターとしてはｐＴＵＢ２２８（Ｏｈｍｕｒａ，　Ｋ．　ｅｔ　ａｌ．　（１９８４）　Ｊ．　Ｂｉｏｃｈｅｍ．　９５，　８７−９３）などが用いられるが、これに限定されるものではない。枯草菌のα−アミラーゼのシグナルペプチド配列をコードするＤＮＡ配列を連結することにより、菌体外での分泌発現も可能となる。
【００９３】
真核細胞の宿主細胞には、脊椎動物、昆虫、酵母などの細胞が含まれ、脊椎動物細胞としては、例えば、サルの細胞であるＣＯＳ細胞（Ｇｌｕｚｍａｎ，　Ｙ．　（１９８１）　Ｃｅｌｌ　２３，　１７５−１８２、ＡＴＣＣ　ＣＲＬ−１６５０）、マウス繊維芽細胞ＮＩＨ３Ｔ３（ＡＴＣＣ　Ｎｏ．ＣＲＬ−１６５８）やチャイニーズ・ハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ細胞、ＡＴＣＣ　ＣＣＬ−６１）のジヒドロ葉酸還元酵素欠損株（Ｕｒｌａｕｂ，　Ｇ．　ａｎｄ　Ｃｈａｓｉｎ，　Ｌ．　Ａ．　（１９８０）　Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　ＵＳＡ　７７，　４１２６−４２２０）等がよく用いられているが、これらに限定されない。
【００９４】
脊椎動物細胞の発現プロモーターとしては、通常発現しようとする遺伝子の上流に位置するプロモーター、ＲＮＡのスプライス部位、ポリアデニル化部位、及び転写終結配列等を有するものを使用でき、さらにこれは必要により複製起点を有してもよい。該発現ベクターの例としては、サイトメガロウイルス初期プロモーターを有するｐＣＲ３．１（インビトロジェン社製）、ＳＶ４０の初期プロモーターを有するｐＳＶ２ｄｈｆｒ（Ｓｕｂｒａｍａｎｉ，　Ｓ．　ｅｔ　ａｌ．　（１９８１）　Ｍｏｌ．　Ｃｅｌｌ．　Ｂｉｏｌ．　１，　８５４−８６４）等が挙げられるが、これに限定されない。
【００９５】
宿主細胞として、ＣＯＳ細胞あるいはＮＩＨ３Ｔ３細胞を用いる場合を例に挙げると、発現ベクターとしては、ＳＶ４０複製起点を有し、ＣＯＳ細胞あるいはＮＩＨ３Ｔ３細胞において自立増殖が可能であり、さらに、転写プロモーター、転写終結シグナル、及びＲＮＡスプライス部位を備えたものを用いることができる。該発現ベクターは、ＤＥＡＥ−デキストラン法（Ｌｕｔｈｍａｎ，　Ｈ．　ａｎｄ　Ｍａｇｎｕｓｓｏｎ，　Ｇ．　（１９８３）　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．　１１，　１２９５−１３０８）、リン酸カルシウム−ＤＮＡ共沈殿法（Ｇｒａｈａｍ，　Ｆ．　Ｌ．　ａｎｄ　ｖａｎ　ｄｅｒ　Ｅｂ，　Ａ．　Ｊ．　（１９７３）　Ｖｉｒｏｌｏｇｙ　５２，　４５６−４５７）、及び電気パルス穿孔法（Ｎｅｕｍａｎｎ，　Ｅ．　ｅｔ　ａｌ．　（１９８２）　ＥＭＢＯ　Ｊ．　１，　８４１−８４５）などによりＣＯＳ細胞、あるいはＮＩＨ３Ｔ３細胞に取り込ませることができ、かくして所望の形質転換細胞を得ることができる。また、宿主細胞としてＣＨＯ細胞を用いる場合には、発現ベクターと共に、抗生物質Ｇ４１８耐性マーカーとして機能するｎｅｏ遺伝子を発現し得るベクター、例えばｐＲＳＶｎｅｏ（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，　Ｊ．　ｅｔ　ａｌ．　（１９８９）　：　”Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ”　Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，　ＮＹ）やｐＳＶ２ｎｅｏ（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ，　Ｐ．　Ｊ．　ａｎｄ　Ｂｅｒｇ，　Ｐ．　（１９８２）　Ｊ．　Ｍｏｌ．　Ａｐｐｌ．　Ｇｅｎｅｔ．　１，　３２７−３４１）などをコ・トランスフェクトし、Ｇ４１８耐性のコロニーを選択することにより、目的のポリペプチドを安定に産生する形質転換細胞を得ることができる。
【００９６】
昆虫細胞を宿主細胞として用いる場合には、鱗翅類ヤガ科のＳｐｏｄｏｐｔｅｒａ　ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａの卵巣細胞由来株化細胞（Ｓｆ−９またはＳｆ−２１）やＴｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ　ｎｉの卵細胞由来Ｈｉｇｈ　Ｆｉｖｅ細胞（Ｗｉｃｋｈａｍ，　Ｔ．　Ｊ．　ｅｔ　ａｌ．　（１９９２）　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．　Ｐｒｏｇ．　Ｉ：　３９１−３９６）などが宿主細胞としてよく用いられ、バキュロウイルストランスファーベクターとしてはオートグラファ核多角体ウイルス（ＡｃＮＰＶ）のポリヘドリン蛋白質のプロモーターを利用したｐＶＬ１３９２／１３９３がよく用いられる（Ｋｉｄｄ，　Ｉ．　Ｍ．　ａｎｄ　Ｖ．Ｃ．　Ｅｍｅｒｙ　（１９９３）　Ｔｈｅ　ｕｓｅ　ｏｆ　ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓｅｓ　ａｓ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｖｅｃｔｏｒｓ．　Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　ａｎｄ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　４２，　１３７−１５９）。この他にも、バキュロウイルスのＰ１０や同塩基性蛋白質のプロモーターを利用したベクターも使用できる。さらに、ＡｃＮＰＶのエンベロープ表面蛋白質ＧＰ６７の分泌シグナル配列を目的蛋白質のＮ末端側に繋げることにより、組換え蛋白質を分泌蛋白質として発現させることも可能である（Ｚｈｅ−ｍｅｉ　Ｗａｎｇ，　ｅｔ　ａｌ．　（１９９８）　Ｂｉｏｌ．　Ｃｈｅｍ．，　３７９，　１６７−１７４）。
【００９７】
真核微生物を宿主細胞とした発現系としては、酵母が一般によく知られており、その中でもサッカロミセス属酵母、例えばパン酵母Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅや石油酵母Ｐｉｃｈｉａ　ｐａｓｔｏｒｉｓが好ましい。該酵母などの真核微生物の発現ベクターとしては、例えば、アルコール脱水素酵素遺伝子のプロモーター（Ｂｅｎｎｅｔｚｅｎ，Ｊ．　Ｌ．　ａｎｄ　Ｈａｌｌ，　Ｂ．　Ｄ．　（１９８２）　Ｊ．　Ｂｉｏｌ．　Ｃｈｅｍ．　２５７，　３０１８−３０２５）や酸性フォスファターゼ遺伝子のプロモーター（Ｍｉｙａｎｏｈａｒａ，　Ａ．　ｅｔ　ａｌ．　（１９８３）　Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　ＵＳＡ　８０，　１−５）などを好ましく利用できる。また、分泌型蛋白質として発現させる場合には、分泌シグナル配列と宿主細胞の持つ内在性プロテアーゼあるいは既知のプロテアーゼの切断部位をＮ末端側に持つ組換え体として発現することも可能である。例えば、トリプシン型セリンプロテアーゼのヒトマスト細胞トリプターゼを石油酵母で発現させた系では、Ｎ末端側に酵母のαファクターの分泌シグナル配列と石油酵母の持つＫＥＸ２プロテアーゼの切断部位をつなぎ発現させることにより、活性型トリプターゼが培地中に分泌されることが知られている（Ａｎｄｒｅｗ，　Ｌ．　Ｎｉｌｅｓ，ｅｔ　ａｌ．　（１９９８）　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ａｐｐｌ．　Ｂｉｏｃｈｅｍ．　２８，
１２５−１３１）。
【００９８】
上記のようにして得られる形質転換体は、常法に従い培養することができ、該培養により細胞内、または細胞外に目的のポリペプチドが産生される。該培養に用いられる培地としては、採用した宿主細胞に応じて慣用される各種のものを適宜選択でき、例えば、上記ＣＯＳ細胞であれば、ＲＰＭＩ１６４０培地やダルベッコ変法イーグル培地（以下「ＤＭＥＭ」という）などの培地に、必要に応じウシ胎児血清などの血清成分を添加したものを使用できる。
【００９９】
上記培養により、形質転換体の細胞内または細胞外に産生される組換え蛋白質は、該蛋白質の物理的性質や化学的性質などを利用した各種の公知の分離操作法により分離・精製することができる。該方法としては、具体的には例えば、通常のタンパク沈殿剤による処理、限外濾過、分子ふるいクロマトグラフィー（ゲル濾過）、吸着クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）などの各種液体クロマトグラフィー、透析法、これらの組合せなどを例示できる。また、発現させる組換え蛋白質に６残基からなるヒスチジンを繋げることにより、ニッケルアフィニティーカラムで効率的に精製することができる。上記方法を組み合わせることにより容易に高収率、高純度で目的とするポリペプチドを大量に製造できる。
【０１００】
ＣＤ３９Ｌ４と特異的に結合する抗体の例として、ＣＤ３９Ｌ４と特異的に結合するモノクローナル抗体を挙げることができるが、その取得方法は、以下に記載する通りである。
【０１０１】
モノクローナル抗体の製造にあたっては、一般に下記のような作業工程が必要である。すなわち、
（ａ）抗原として使用する生体高分子の精製、
（ｂ）抗原を動物に注射することにより免疫した後、血液を採取しその抗体価を検定して脾臓摘出の時期を決定してから、抗体産生細胞を調製する工程、
（ｃ）骨髄腫細胞（以下「ミエローマ」という）の調製、
（ｄ）抗体産生細胞とミエローマとの細胞融合、
（ｅ）目的とする抗体を産生するハイブリドーマ群の選別、
（ｆ）単一細胞クローンへの分割（クローニング）、
（ｇ）場合によっては、モノクローナル抗体を大量に製造するためのハイブリドーマの培養、またはハイブリドーマを移植した動物の飼育、
（ｈ）このようにして製造されたモノクローナル抗体の生理活性、及びその認識特異性の検討、あるいは標識試薬としての特性の検定、等である。
【０１０２】
以下、モノクローナル抗体の作製法を上記工程に沿って詳述するが、該抗体の作製法はこれに制限されず、例えば脾細胞以外の抗体産生細胞及びミエローマを使用することもできる。
【０１０３】
（ａ）抗原の精製
抗原としては、前記したような方法で調製したＣＤ３９Ｌ４またはその一部を使用することができる。さらに、当業者に周知の方法を用いて、本発明の蛋白質の部分ペプチドを化学合成し、これを抗原として使用することもできる。
【０１０４】
（ｂ）抗体産生細胞の調製
工程（ａ）で得られた抗原と、フロインドの完全または不完全アジュバント、またはカリミョウバンのような助剤とを混合し、免疫原として実験動物に免疫する。実験動物としては、マウスが最も好適に用いられるが、これに限定されない。
【０１０５】
マウス免疫の際の免疫原投与法は、皮下注射、腹腔内注射、静脈内注射、皮内注射、筋肉内注射いずれでもよいが、皮下注射または腹腔内注射が好ましい。
【０１０６】
免疫は、一回、または、適当な間隔で（好ましくは１週間から５週間間隔で）複数回繰返し行なうことができる。その後、免疫した動物の血清中の抗原に対する抗体価を測定し、抗体価が十分高くなった動物を抗体産生細胞の供給原として用いれば、以後の操作の効果を高めることができる。一般的には、最終免疫後３〜５日後の動物由来の抗体産生細胞を後の細胞融合に用いることが好ましい。
【０１０７】
ここで用いられる抗体価の測定法としては、ＲＩＡ法、ＥＬＩＳＡ法、蛍光抗体法、受身血球凝集反応法など種々の公知技術があげられるが、検出感度、迅速性、正確性、及び操作の自動化の可能性などの観点から、ＲＩＡ法またはＥＬＩＳＡ法がより好適である。
【０１０８】
本発明における抗体価の測定は、例えばＥＬＩＳＡ法によれば、以下に記載するような手順により行うことができる。まず、精製または部分精製した抗原をＥＬＩＳＡ用９６穴プレート等の固相表面に吸着させ、さらに抗原が吸着していない固相表面を抗原と無関係な蛋白質、例えばウシ血清アルブミン（以下「ＢＳＡ」という）により覆い、該表面を洗浄後、第一抗体として段階希釈した試料（例えばマウス血清）に接触させ、上記抗原に試料中のモノクローナル抗体を結合させる。さらに第二抗体として酵素標識されたマウス抗体に対する抗体を加えてマウス抗体に結合させ、洗浄後該酵素の基質を加え、基質分解に基づく発色による吸光度の変化等を測定することにより、抗体価を算出する。
【０１０９】
（ｃ）ミエローマの調製工程
ミエローマとしては、一般的にはマウスから得られた株化細胞、例えば８−アザグアニン耐性マウス（ＢＡＬＢ／ｃ由来）ミエローマ株Ｐ３Ｘ６３Ａｇ８Ｕ．１（Ｐ３−Ｕ１）［Ｙｅｌｔｏｎ，　Ｄ．Ｅ．　ｅｔ　ａｌ．　Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｔｏｐｉｃｓ　ｉｎ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ　ａｎｄ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，　８１，　１−７（１９７８）］、Ｐ３／ＮＳＩ　／１−Ａｇ４−１（ＮＳ−１）　［Ｋｏｈｌｅｒ，　Ｇ．　ｅｔ　ａｌ．　Ｅｕｒｏｐｅａｎ　Ｊ．　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，　６，　５１１−５１９　（１９７６）　］、Ｓｐ２　／Ｏ−Ａｇ１４　（ＳＰ−２）　［Ｓｈｕｌｍａｎ，　Ｍ．　ｅｔ　ａｌ．　Ｎａｔｕｒｅ，　２７６，　２６９−２７０　（１９７８）］、Ｐ３Ｘ６３Ａｇ８．６５３　（６５３）　［Ｋｅａｒｎｅｙ，　Ｊ．　Ｆ．　ｅｔ　ａｌ．　Ｊ．　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，　１２３，　１５４８−１５５０　（１９７９）］、Ｐ３Ｘ６３Ａｇ８（Ｘ６３）　［Ｈｏｒｉｂａｔａ，　Ｋ．　ａｎｄ　Ｈａｒｒｉｓ，　Ａ．　Ｗ．　Ｎａｔｕｒｅ，　２５６，　４９５−４９７　（１９７５）］などを用いることが好ましい。これらの細胞株は、適当な培地、例えば８−アザグアニン培地［ＲＰＭＩ−１６４０培地にグルタミン、２−メルカプトエタノール、ゲンタマイシン、及びウシ胎児血清（以下「ＦＣＳ」という）を加えた培地に８−アザグアニンを加えた培地］　、イスコフ改変ダルベッコ培地（Ｉｓｃｏｖｅ’ｓ　Ｍｏｄｉｆｉｅｄ　Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ　Ｍｅｄｉｕｍ　；以下「ＩＭＤＭ」という）、またはダルベッコ改変イーグル培地（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ　Ｍｏｄｉｆｉｅｄ　Ｅａｇｌｅ　Ｍｅｄｉｕｍ；以下「ＤＭＥＭ」という）で継代培養するが、細胞融合の３乃至４日前に正常培地［例えば、１０％　ＦＣＳを含むＡＳＦ１０４培地（味の素（株）社製）］で継代培養し、融合当日に２×１０^７以上の細胞数を確保しておく。
【０１１０】
（ｄ）細胞融合
抗体産生細胞は、形質細胞、及びその前駆細胞であるリンパ球であり、これは個体のいずれの部位から得てもよく、一般には脾、リンパ節、末梢血、またはこれらを適宜組み合わせたもの等から得ることができるが、脾細胞が最も一般的に用いられる。
【０１１１】
最終免疫後、所定の抗体価が得られたマウスから抗体産生細胞が存在する部位、例えば脾臓を摘出し、抗体産生細胞である脾細胞を調製する。この脾細胞と工程（ｃ）で得られたミエローマを融合させる手段として現在最も一般的に行われているのは、細胞毒性が比較的少なく融合操作も簡単なポリエチレングリコールを用いる方法である。この方法は、例えば以下の手順よりなる。
【０１１２】
脾細胞とミエローマとを無血清培地（例えばＲＰＭＩ１６４０）、またはリン酸緩衝生理食塩液（以下「ＰＢＳ」という）でよく洗浄し、脾細胞とミエローマの細胞数の比が５：１〜１０：１程度になるように混合し、遠心分離する。上清を除去し、沈澱した細胞群をよくほぐした後、撹拌しながら１ｍｌの５０％（ｗ／ｖ）ポリエチレングリコール（分子量１０００〜４０００）を含む無血清培地を滴下する。その後、１０ｍｌの無血清培地をゆっくりと加えた後遠心分離する。再び上清を捨て、沈澱した細胞を適量のヒポキサンチン・アミノプテリン・チミジン（以下「ＨＡＴ」という）液及びマウスインターロイキン−２（以下「ＩＬ−２」という）を含む正常培地（以下「ＨＡＴ培地」という）中に懸濁して培養用プレート（以下「プレート」という）の各ウェルに分注し、５％炭酸ガス存在下、３７℃で２週間程度培養する。途中適宜ＨＡＴ培地を補う。
【０１１３】
（ｅ）ハイブリドーマ群の選択
上記ミエローマ細胞が、８−アザグアニン耐性株である場合、すなわち、ヒポキサンチン・グアニン・ホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＧＰＲＴ）欠損株である場合、融合しなかった該ミエローマ細胞、及びミエローマ細胞どうしの融合細胞は、ＨＡＴ含有培地中では生存できない。一方、抗体産生細胞どうしの融合細胞、あるいは、抗体産生細胞とミエローマ細胞とのハイブリドーマは生存することができるが、抗体産生細胞どうしの融合細胞には寿命がある。従って、ＨＡＴ含有培地中での培養を続けることによって、抗体産生細胞とミエローマ細胞とのハイブリドーマのみが生き残り、結果的にハイブリドーマを選択することができる。
【０１１４】
コロニー状に生育してきたハイブリドーマについて、ＨＡＴ培地からアミノプテリンを除いた培地（以下「ＨＴ培地」という）への培地交換を行う。以後、培養上清の一部を採取し、例えば、ＥＬＩＳＡ法により抗体価を測定する。
【０１１５】
以上、８−アザグアニン耐性の細胞株を用いる方法を例示したが、その他の細胞株もハイブリドーマの選択方法に応じて使用することができ、その場合使用する培地組成も変化する。
【０１１６】
（ｆ）クローニング
工程（ｂ）の記載と同様の方法で抗体価を測定することにより、特異的抗体を産生することが判明したハイブリドーマを、別のプレートに移しクローニングを行う。このクローニング法としては、プレートの１ウェルに１個のハイブリドーマが含まれるように希釈して培養する限界希釈法、軟寒天培地中で培養しコロニーを回収する軟寒天法、マイクロマニュピレーターによって１個づつの細胞を取り出し培養する方法、セルソーターによって１個の細胞を分離する「ソータクローン」などが挙げられるが、限界希釈法が簡便でありよく用いられる。
【０１１７】
抗体価の認められたウェルについて、例えば限界希釈法によるクローニングを２〜４回繰返し、安定して抗体価の認められたものを本発明のモノクローナル抗体産生ハイブリドーマ株として選択する。
【０１１８】
（ｇ）ハイブリドーマ培養によるモノクローナル抗体の調製
クローニングを完了したハイブリドーマは、培地をＨＴ培地から正常培地に換えて培養される。大量培養は、大型培養瓶を用いた回転培養、あるいはスピナー培養で行われる。この大量培養における上清を、ゲル濾過等、当業者に周知の方法を用いて精製することにより、本発明の蛋白質に特異的に結合するモノクローナル抗体を得ることができる。また、同系統のマウス（例えば、上記のＢＡＬＢ／ｃ）、あるいはＮｕ／Ｎｕマウスの腹腔内で該ハイブリド−マを増殖させることにより、本発明のモノクローナル抗体を大量に含む腹水を得ることができる。精製の簡便な方法としては、市販のモノクローナル抗体精製キット（例えば、ＭＡｂＴｒａｐ　ＧＩＩキット；ファルマシア社製）等を利用することもできる。
【０１１９】
かくして得られるモノクローナル抗体は、ＣＤ３９Ｌ４に対して高い抗原特異性を有する。
【０１２０】
（ｈ）モノクローナル抗体の検定
かくして得られたモノクローナル抗体のアイソタイプ及びサブクラスの決定は以下のように行うことができる。まず、同定法としてはオクテルロニー（Ｏｕｃｈｔｅｒｌｏｎｙ）法、ＥＬＩＳＡ法、またはＲＩＡ法が挙げられる。オクテルロニー法は簡便ではあるが、モノクローナル抗体の濃度が低い場合には濃縮操作が必要である。一方、ＥＬＩＳＡ法またはＲＩＡ法を用いた場合は、培養上清をそのまま抗原吸着固相と反応させ、さらに第二次抗体として各種イムノグロブリンアイソタイプ、サブクラスに対応する抗体を用いることにより、モノクローナル抗体のアイソタイプ、サブクラスを同定することが可能である。また、さらに簡便な方法として、市販の同定用のキット（例えば、マウスタイパーキット；バイオラッド社製）等を利用することもできる。
【０１２１】
さらに、蛋白質の定量は、フォーリンロウリー法、及び２８０ｎｍにおける吸光度［１．４（ＯＤ２８０）＝イムノグロブリン１ｍｇ／ｍｌ］より算出する方法により行うことができる。
【０１２２】
このようにして得られる本発明のモノクローナル抗体は、その特異性を利用したＣＤ３９Ｌ４の検出や分離精製に用いることができる。
【０１２３】
（４）検出
上記（３）記載の方法で得られる抗体は、それを直接標識するか、または該抗体を一次抗体とし、該抗体を特異的に認識する（抗体を作製した動物由来の抗体を認識する）標識二次抗体と協同で検出に用いられる。
【０１２４】
標識の種類として好ましいものは酵素（アルカリホスファターゼまたは西洋ワサビペルオキシダーゼ）またはビオチン（ただし二次抗体のビオチンにさらに酵素標識ストレプトアビジンを結合させる操作が加わる）であるが、これらに限定されない。標識二次抗体（または標識ストレプトアビジン）を使用する方法のための、予め標識された抗体（またはストレプトアビジン）は種々のものが市販されている。ＲＩＡの場合はＩ^１２５等の放射性同位元素で標識された抗体を用い、測定は液体シンチレーションカウンター等を用いて行う。
【０１２５】
これら標識された酵素の活性を検出することにより、抗原であるポリペプチドの量が測定される。アルカリホスファターゼまたは西洋ワサビペルオキシダーゼの場合、それら酵素の触媒により発色する基質や発光する基質が市販されている。
【０１２６】
発色する基質を用いた場合、ウエスタンブロット法やドット／スロットブロット法においては目視で検出できる。ＥＬＩＳＡ法においては、好ましくは市販のマイクロプレートリーダーを用いて各ウエルの吸光度（測定波長は基質により異なる）を測定することにより定量する。また好ましくは上記（３）において抗体作製のために使用した抗原の希釈系列を調製し、これを標準抗原試料として他の試料と同時に検出操作を行って、標準抗原濃度と測定値をプロットした標準曲線を作成することにより、他の試料中の抗原濃度を定量することが可能である。
【０１２７】
一方、発光する基質を使用した場合は、ウエスタンブロット法やドット／スロットブロット法においてはＸ線フィルムまたはイメージングプレートを用いたオートラジオグラフィーや、インスタントカメラを用いた写真撮影により検出することができ、デンシトメトリーやモレキュラー・イメージャーＦｘシステム（バイオラッド社製）等を利用した定量も可能である。また、ＥＬＩＳＡ法で発光基質を用いる場合は、発光マイクロプレートリーダー（例えば、バイオラッド社製等）を用いて酵素活性を測定する。
【０１２８】
（５）測定操作
ｉ）ウエスタンブロット、ドットブロットまたはスロットブロットの場合
まず、抗体の非特異的吸着を阻止するため、予めメンブレンをそのような非特異的吸着を阻害する物質（スキムミルク、カゼイン、ウシ血清アルブミン、ゼラチン、ポリビニルピロリドン等）を含む緩衝液中に一定時間浸しておく操作（ブロッキング）を行う。ブロッキング溶液の組成は、例えば５％　スキムミルク、０．０５乃至０．１％　ツイーン２０を含むリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）またはトリス緩衝生理食塩水（ＴＢＳ）が用いられる。スキムミルクの代わりに、ブロックエース（大日本製薬）、１乃至１０％のウシ血清アルブミン、０．５乃至３％のゼラチンまたは１％のポリビニルピロリドン等を用いてもよい。ブロッキングの時間は、４℃で１６乃至２４時間、または室温で１乃至３時間である。
【０１２９】
次に、メンブレンを０．０５乃至０．１％　ツイーン２０を含むＰＢＳまたはＴＢＳ（以下「洗浄液」という）で洗浄して余分なブロッキング溶液を除去した後、上記（３）記載の方法で作製された抗体をブロッキング溶液で適宜希釈した溶液中に一定時間浸して、抗体をメンブレン上の抗原に結合させる。このときの抗体の希釈倍率は、例えば上記３）記載の組換え抗原を段階希釈したものを試料とした予備のウエスタンブロッティング実験を行って決定することができる。この抗体反応操作は、好ましくは室温で２時間行う。抗体反応操作終了後、メンブレンを洗浄液で洗浄する。ここで、用いた抗体が標識されたものである場合は、ただちに検出操作を行うことができる。未標識の抗体を用いた場合には、引き続いて二次抗体反応を行う。標識二次抗体は、例えば市販のものを使用する場合はブロッキング溶液で２０００乃至２００００倍に希釈して用いる（添付の指示書に好適な希釈倍率が記載されている場合は、その記載に従う）。一次抗体を洗浄除去した後のメンブレンを二次抗体溶液に室温で４５分乃至１時間浸し、洗浄液で洗浄してから、標識方法に合わせた検出操作を行う。洗浄操作は、例えばまずメンブレンを洗浄液中で１５分間振盪してから、洗浄液を新しいものに交換して５分間振盪した後、再度洗浄液を交換して５分間振盪することにより行う。必要に応じてさらに洗浄液を交換して洗浄してもよい。
【０１３０】
ｉｉ）ＥＬＩＳＡ／ＲＩＡ
まず、上記（２）の方法で試料を固相化させたプレートのウェル内底面への抗体の非特異的吸着を阻止するため、ウエスタンブロットの場合と同様、予めブロッキングを行っておく。ブロッキングの条件については、ウエスタンブロットの項に記載した通りである。
【０１３１】
次に、ウェル内を０．０５乃至０．１％　ツイーン２０を含むＰＢＳまたはＴＢＳ（以下「洗浄液」という）で洗浄して余分なブロッキング溶液を除去した後、上記（３）記載の方法で作製された抗体を洗浄液で適宜希釈した溶液を分注して一定時間インキュベーションし、抗体を抗原に結合させる。このときの抗体の希釈倍率は、例えば上記（３）記載の組換え抗原を段階希釈したものを試料とした予備のＥＬＩＳＡ実験を行って決定することができる。この抗体反応操作は、好ましくは室温で１時間程度行う。抗体反応操作終了後、ウェル内を洗浄液で洗浄する。ここで、用いた抗体が標識されたものである場合は、ただちに検出操作を行うことができる。未標識の抗体を用いた場合には、引き続いて二次抗体反応を行う。標識二次抗体は、例えば市販のものを使用する場合は洗浄液で２０００乃至２００００倍に希釈して用いる（添付の指示書に好適な希釈倍率が記載されている場合は、その記載に従う）。一次抗体を洗浄除去した後のウェルに二次抗体溶液を分注して室温で１乃至３時間インキュベーションし、洗浄液で洗浄してから、標識方法に合わせた検出操作を行う。洗浄操作は、例えばまずウェル内に洗浄液を分注して５分間振盪してから、洗浄液を新しいものに交換して５分間振盪した後、再度洗浄液を交換して５分間振盪することにより行う。必要に応じてさらに洗浄液を交換して洗浄してもよい。
【０１３２】
また本発明において、いわゆるサンドイッチ法のＥＬＩＳＡは例えば以下に記載する方法により実施することができる。まず、ＣＤ３９Ｌ４のアミノ酸配列のいずれか一つにおいて、親水性に富む領域を２箇所選んで、それぞれの領域中のアミノ酸６残基以上からなる部分ペプチドを合成し、該部分ペプチドを抗原とした２種類の抗体を取得する。このうち一方の抗体を上記（４）記載のように標識しておく。標識しなかった方の抗体は、上記（２）記載の方法に準じて９６穴ＥＬＩＳＡ用プレートのウェル内底面に固相化する。ブロッキングの後、試料液をウェル内に入れて常温で１時間インキュベーションする。ウェル内を洗浄後、標識した方の抗体希釈液を各ウェルに分注してインキュベーションする。再びウェル内を洗浄後、標識方法に合わせた検出操作を行う。
【０１３３】
（６）リガンド
抗体の他に、ＣＤ３９Ｌ４に特異的に結合する基質、補酵素、調節因子等のリガンドを用いることによってもＣＤ３９Ｌ４を定量することができる。
【０１３４】
（７）判定
以上に記載した方法で、被験者または被験動物から採取した検体と、正常人または正常動物から採取した検体との間で検出結果を比較し、その結果上記（３）記載の方法で作製された抗体またはリガンドが特異的に結合するポリペプチドの量を各ＣＤ３９Ｌ４の発現量として、正常個体にＣＤ３９Ｌ４の発現量が増加している場合に腫瘍を有している可能性が高いと判定することができる。
【０１３５】
６．ＣＤ３９Ｌ４の機能
このようにしてＣＤ３９Ｌ４遺伝子を利用して遺伝子工学的手法により得られるＣＤ３９Ｌ４の生理機能は以下のような　ウイルスを用いた発現実験で調べることができる。
【０１３６】
ＣＤ３９Ｌ４遺伝子を例えばＰＣＲ法で増幅し、アデノウイルス用発現ベクターあるいはレトロウイルスベクターに組み込む。その際に市販のキットを用いることもできる（例えば、アデノウイルス・エクスプレッション・ベクター・キット（宝酒造社製）やＲｅｔｒｏ−Ｘ　Ｓｙｓｔｅｍ（クロンテック社製））。こうして得られたウイルスを例えば、糖尿病マウス（例えばＢａｌｂ／ｃマウス（日本クレア社））に尾静脈より接種し、コントロールとして上記ＣＤ３９Ｌ４遺伝子を含まないアデノウイルスを摂取したマウスとの間で血中のＡＬＴ値（アラニン　アミノ　トランスフェラーゼ値）、腫瘍マーカー遺伝子の発現量を測定する。また、マウスより各種組織を取り出して、組織の状態を調べる、この際、組織特異的なプロモーター（例えば、ラットプロバシンプロモーター（Ｇｒｅｅｎｂｅｒｇら，Ｍｏｌ．　　Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．（１９９４）　ｐ．２３０−２３９）、マウス乳癌ウイルスプロモーター（Ｗｙｎｓｈａｗ−Ｂｏｒｉｓ，　Ｃａｎｃｅｒ　Ｈａｎｄｂｏｏｋ　２　（２００２）、Ｎａｔｕｒｅ　Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ　Ｇｒｏｕｐ、Ｌｏｎｄｏｎ、ｐ．８９１−９０２等）を用いたときには該遺伝子が特異的に発現する組織を取り出して組織の状態を調べる。コントロールと各測定値を比較することによりＣＤ３９Ｌ４の生理機能を把握することができる。
【０１３７】
７．癌の検出方法
ＣＤ３９Ｌ４は細胞の癌化及び／または癌細胞の増殖に関与しており、癌細胞で高い発現が認められると考えられる。したがって、ＣＤ３９Ｌ４が過剰に発現している細胞においてＣＤ３９Ｌ４の発現量を抑制する物質は細胞の癌化を抑制し、また、癌細胞の増殖を抑制すると考えられる。なお、「検体」とは、被験者や臨床検体、被験動物等から得られた、血液、体液、前立腺、精巣、陰茎、膀胱、腎臓、口腔、咽頭、口唇、舌、歯肉、鼻咽頭、食道、胃、小腸、大腸、結腸、肝臓、胆嚢、膵臓、鼻、肺、骨、軟部組織、皮膚、乳房、子宮、卵巣、脳、甲状腺、リンパ節、筋肉、脂肪組織等の組織または排泄物等の試料を意味するが、本発明においては前立腺がより好ましい。
【０１３８】
本発明において、正常人及び正常動物とは、癌を有さない人及び動物を意味する。正常人あるいは正常動物であるか否かは、ＣＤ３９Ｌ４の濃度を測定し、あらかじめ正常人の値として決められている数値範囲に入るか否かで判定することもできる。ＣＤ３９Ｌ４の発現量と、正常人または正常動物の癌の形成度の相関をあらかじめ調べておくことによって、被験者または被験動物から採取した検体におけるＣＤ３９Ｌ４の発現量を測定することによって被験者または被験動物が、正常人または正常動物であるか否かを判定することができる。
【０１３９】
７．１　ＣＤ３９Ｌ４遺伝子を利用した癌の検出方法
ＣＤ３９Ｌ４を利用した癌の検出方法は、具体的には、７．１．１または７．１．２に記載するとおりである。
【０１４０】
７．１．１　以下の工程１）乃至４）を含む：
１）被験者または被験動物より採取した検体より、全ＲＮＡを抽出する工程；
２）上記工程１）に記載の検体由来の全ＲＮＡと正常人または正常動物より採取した検体より抽出した全ＲＮＡの間における、ＣＤ３９Ｌ４遺伝子の発現量の差を測定する工程；
３）上記工程２）に記載の遺伝子の発現量の差を解析し、上記工程１）に記載の被験者または被験動物の癌を検出する工程。
【０１４１】
７．１．２　以下の工程１）乃至４）を含む：
１）被験者または被験動物より採取した検体より、全ＲＮＡ画分を抽出する工程；
２）正常人または正常動物より採取した検体より、全ＲＮＡ画分を抽出する工程；
３）上記工程１）に記載の全ＲＮＡ画分と上記工程２）に記載の全ＲＮＡ画分の間におけるＣＤ３９Ｌ４遺伝子の発現量を測定する工程；
４）上記工程１）由来の全ＲＮＡ画分と上記工程２）由来の全ＲＮＡ画分との間における上記工程３）によって測定された遺伝子の発現量の差を解析し、上記工程１）に記載の被験者または被験動物の癌を検出する工程。
【０１４２】
７．１．３　ここで、７．１．１の工程１）及び７．１．２の工程１）及び工程２）における全ＲＮＡの抽出は上記、「１．ＣＤ３９Ｌ４遺伝子の取得」の項に示した方法にしたがって実施することができ、抽出された全ＲＮＡはさらに精製してｍＲＮＡとして使用することが望ましい。また、７．１．１の工程２）及び７．１．２の工程３）におけるＣＤ３９Ｌ４遺伝子の発現量の測定は上記、「４．腫瘍マーカー遺伝子」の項に記載の方法を用いて測定することができ、ノーザンブロット法、ドットブロット法、スロットブロット法、ＲＴ−ＰＣＲ、リボヌクレアーゼ保護アッセイ、ランオン・アッセイ、遺伝子チップ、ｃＤＮＡアレイ等の固相化試料を用いた核酸ハイブリダイゼーションを用いて測定することが望ましい。
【０１４３】
７．２　ＣＤ３９Ｌ４を利用した癌の検出方法
本発明のＣＤ３９Ｌ４を利用した癌の検出方法は、具体的には以下の７．２．１、７．２．２、７．２．３または７．２．４からなる。
７．２．１　以下の工程１）乃至２）を含む：
１）被験者または被験動物から採取した検体における、ＣＤ３９Ｌ４の発現量を測定する工程；
２）上記工程１）で検出された蛋白質の発現量と正常人または正常動物から採取した検体における該蛋白質の発現量の差を解析し、上記工程１）における被験者または被験動物の癌を検出する工程。
【０１４４】
７．２．２　以下の工程１）乃至３）を含む：
１）被験者または被験動物より採取した検体における、ＣＤ３９Ｌ４の発現量を測定する工程：
２）正常人または正常動物より採取した検体における、上記１）に記載の蛋白質の発現量を測定する工程：
３）上記工程１）で測定された蛋白質の発現量と上記工程２）で測定された該蛋白質の発現量の差を解析し、被験者または被験動物の癌を検出する工程。
【０１４５】
７．２．３　以下の工程１）乃至３）を含む：
１）被験者または被験動物より採取した検体より得た全蛋白質を固相化する工程；
２）上記工程１）に記載の固相化蛋白質における、ＣＤ３９Ｌ４の発現量を測定する工程；
３）上記工程２）で測定された蛋白質の発現量と正常人または正常動物より採取した検体より得た全蛋白質における該蛋白質の発現量の差を解析し、上記工程１）における被験者または被験動物の癌を検出する工程。
【０１４６】
７．２．４　以下の工程１）乃至５）を含む、癌の検出方法：
１）被験者または被験動物より採取した検体より得た全蛋白質を固相化する工程；
２）正常人または正常動物より採取した検体より得た全蛋白質を固相化する工程；
３）上記工程１）に記載の固相化蛋白質における、ＣＤ３９Ｌ４の発現量を測定する工程：
４）上記工程２）に記載の固相化蛋白質における、上記工程３）で発現量を測定した蛋白質の発現量を測定する工程；
５）上記工程３）で測定された蛋白質の発現量と上記工程４）で測定された蛋白質の発現量の差を解析し、上記工程１）に記載の被験者または被験動物の癌を検出する工程。
【０１４７】
７．２．５　ここで、７．２．１の工程１）、工程２）、７．２．２の工程１）、工程２）、７．２．３の工程２）、工程３）、７．２．４の工程３）及び工程４）における蛋白質の発現量の測定は上記「５．腫瘍マーカー蛋白質」の項に記載した方法を用いることができ、好ましくはＣＤ３９Ｌ４に特異的に結合する抗体またはリガンドを用いた方法、より好ましくは、ウエスタンブロット法、ドットブロット法、スロットブロット法または固相酵素免疫定量法（ＥＬＩＳＡ法）を用いることができる。
【０１４８】
７．３　判定
７．１．１の工程３）、７．１．２の工程４）、７．２．１の工程１）、７．２．２の工程３）、７．２．３の工程３）及び７．２．４の工程５）における癌の検出は、発現量の差を総合的に評価して行なうことが望ましい。なお、「発現量の差」は、被験者または被験動物由来の検体と、正常人または正常動物由来の検体におけるＣＤ３９Ｌ４の発現量を定量的に比較できる限り、発現量差であっても発現量比であってもよい。
【０１４９】
上記分析の結果、被験者または被験動物から採取した検体由来の試料と、正常人または正常動物由来の試料との間で測定結果を比較し、ＣＤ３９Ｌ４の発現量が正常人または正常動物より高い場合、癌を有すると判断することができる。
【０１５０】
８．ＣＤ３９Ｌ４遺伝子及び／またはＣＤ３９Ｌ４検出用キット
ＣＤ３９Ｌ４遺伝子及び／またはＣＤ３９Ｌ４は、以下の１）乃至５）からなる群から選択される少なくとも一つ以上を含むキットを用いて検出することができる。
１）配列表の配列番号１、５及び７に示される群から選択されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドを特異的に増幅するための１５乃至３０塩基長の連続したオリゴヌクレオチドプライマー；
２）配列表の配列番号１、３、５及び７に示される群から選択されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドにストリンジェントな条件でハイブリダイズし、該ポリヌクレオチドを検出するための１５ヌクレオチド以上の連続したポリヌクレオチドプローブ；
３）配列表の配列番号１、３、５及び７に示される群から選択されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドが固定された固相化試料；
４）配列表の配列番号２、４、６及び８に示される群から選択されるアミノ酸配列からなる蛋白質に特異的に結合し、該蛋白質を検出するための抗体；
５）上記４）に記載の抗体に結合し得る二次抗体。
【０１５１】
前記１）記載のプライマーは、ＣＤ３９Ｌ４遺伝子のヌクレオチド配列（配列表の配列番号１、３、５及び７のいずれか一つに示されるヌクレオチド配列）に基づき市販のプライマー設計ソフト（たとえば、Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ　ＧＣＧ　ｐａｃｋａｇｅ　Ｖｅｒｓｉｏｎ　１０．２）を用いる等、常法により容易に設計し、増幅することができる。このようなプライマーとしては例えば、配列表の配列番号１に記載のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドを増幅するためには配列表の配列番号９に示されるヌクレオチド配列からなるオリゴヌクレオチドと配列表の配列番号１０に示されるヌクレオチド配列からなるオリゴヌクレオチドの組み合わせを使用することができる。また、前記２）に記載のプローブは、ＣＤ３９Ｌ４に特異的にハイブリダイズするポリヌクレオチドであって、１００乃至１５００塩基長、好ましくは３００乃至６００塩基長である。これらのプライマーやプローブは、適当な標識によりラベル（例えば、酵素標識、放射性標識、蛍光標識等）されていてもよく、また、リンカーを付加していてもよい。
【０１５２】
上記３）に記載の固相化試料は、上記２）に記載のプローブをガラス板、ナイロンメンブレン等の固相に固定することにより作製される。このような固相化試料の作成方法については、既に「４．腫瘍マーカー遺伝子」の項中、「（１）固相化試料を用いた解析方法」の項で説明した通りであり、例えば、遺伝子チップ、ｃＤＮＡアレイ、オリゴアレイ、メンブレンフィルター等を挙げることができる。
【０１５３】
本発明のキットには、更に耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ、ｄＮＴＰ（ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰの混合物）及び緩衝液を含めることもできる。耐熱性ＤＮＡポリメラーゼとしてはＴａｑ　ＤＮＡポリメラーゼ、ＬＡ　Ｔａｑ　ＤＡＮ　ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（宝酒造社製）、Ｔｔｈ　ＤＮＡポリメラーゼ、ＰｆｕＤＮＡポリメラーゼなどが例示できる。緩衝液は使用するＤＮＡポリメラーゼに応じて選ばれ、必要に応じてＭｇ^２＋などが添加されている。
【０１５４】
前記、４）及び５）に記載の抗体は３．２に記載した方法により作製することができる。該抗体は、適当な標識によりラベル（例えば、酵素標識、放射性標識、蛍光標識等）されていてもよい。
【０１５５】
本発明のキットはＣＤ３９Ｌ４遺伝子及び／またはＣＤ３９Ｌ４の検出に用いることができ、癌の有無の判定や、癌の増殖を抑制する物質のスクリーニングにも用いることができる。
【０１５６】
９．癌の治療効果及び／または予防効果を有する物質のスクリーニング方法
ＣＤ３９Ｌ４遺伝子またはＣＤ３９Ｌ４の少なくとも一つの発現量を測定することによって癌に対して治療及び／または予防効果を有する物質のスクリーニングをすることができる。
【０１５７】
なお、「被験物質」とは、本発明のスクリーニング方法で癌の増殖抑制活性を調べる対象となる物質をいう。被験物質としては、化合物、微生物の代謝産物、植物や動物組織の抽出物、それらの誘導体またはそれらの混合物等が挙げられる。また、ＣＤ３９Ｌ４の発現量を低下するように設計された核酸またはその誘導体（アンチセンスオリゴヌクレオチド、リボザイム、ｄｓＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ等を含む）を、被験物質として使用することも可能である。被験物質の投与量や濃度は適宜設定するか、または例えば希釈系列を作成するなどして複数種の投与量を設定してもよく、固体、液体等適当な状態で投与することができ、適当なバッファーに溶解したり、安定化剤等を加えてもよい。培養細胞を用いるスクリーニング方法の場合には、培地に添加して培養することができる。培地に添加する場合には培養開始時から添加してもよいし、培養途中で添加しても良く、また、添加の回数も１回に限らない。被験物質存在下で培養する期間も適宜設定してよいが、好ましくは３０分乃至２週間であり、より好ましくは、３０分乃至４８時間である。哺乳動物個体に被験物質を投与する場合は、被験物質の物性等により経口投与、静脈注射、腹腔内注射、経皮投与、皮下注射等の投与形態を使い分ける。また、癌に直接塗布または注射することもできる。なお被験物質の投与から、検体を得るまでの時間は適当に選択することができる。
【０１５８】
本発明のスクリーニング方法において用いられる培養細胞は、ＣＤ３９Ｌ４を発現する哺乳動物細胞である限りにおいて、正常な細胞でも、癌細胞等の異常な増殖を示す細胞でもよく、例えば、マウス繊維芽細胞由来細胞株ＮＩＨ３Ｔ３細胞、ヒト前立腺癌細胞株ＬｎＣａＰ、マウス、ラット及びヒト遊離脂肪細胞、マウス、ラット及びヒト初代肝細胞等を挙げることができるがこれらに限定されない。培養細胞の哺乳動物種としては、ヒト、マウスまたはハムスターが好ましく、ヒトまたはマウスがより好ましいが、これらに限定されない。なお、培養細胞としてはＣＤ３９Ｌ４を過剰発現している哺乳動物細胞を用いるのがより好ましく、例えばＣＤ３９Ｌ４遺伝子をそのプロモーター領域とともに導入し、ＣＤ３９Ｌ４を過剰発現するＮＩＨ３Ｔ３細胞などを挙げることができる。
【０１５９】
本発明のスクリーニング方法には、培養細胞を用いず、哺乳動物個体に被験物質を投与して、その後該動物個体から摘出されたその臓器または組織細胞における本発明のＣＤ３９Ｌ４遺伝子の発現を検出する方法も含まれる。遺伝子発現の検出対象となる臓器または組織は、ＣＤ３９Ｌ４を発現するものであればよいが、好ましくは癌が発生している組織である。哺乳動物種としては非ヒト哺乳動物を用いることができ、マウス、ラットまたはハムスターが好ましく、マウスまたはラットがより好ましい。なお、ヒト、サル、マウスまたはラット由来の腫瘍を皮下、皮内あるいは腹腔等に移植した腫瘍モデル動物である、担癌動物（ヒト癌株を移植したヌードマウス、同種移植マウスなど）、あるいは、癌を自然発生する系統の動物（天然に同定された動物及び遺伝子改変動物を含む。例えば、ｐ５３ノックアウトマウス（Ｄｏｎｅｈｏｗｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ（１９９２）、３５６巻、ｐ．２１５−２２１）、Ｍｙｃトランスジェニックマウス（Ａｄａｍｓら、Ｎａｔｕｒｅ（１９８５）、３１８巻、ｐ．５３３−５３８）、ＴＲＡＭＰマウス（Ｆｏｓｔｅｒら、　Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ．（１９９７）、５７巻、ｐ．３３２５−３３３０）などを用いることもできる。更に、ＣＤ３９Ｌ４を過剰発現させた動物を用いることもできる。また、癌誘発処置を行なった動物を用いることもできる。
【０１６０】
本発明の方法において用いられる培養細胞は、被験物質を添加しない場合にはＣＤ３９Ｌ４を発現可能な条件であれば、いかなる条件で培養してもよい。例えば、該培養細胞について公知の培養条件が知られており、該条件下において該細胞がＣＤ３９Ｌ４を発現する場合は、該条件で培養してもよい。また、哺乳動物個体から摘出した臓器または組織におけるＣＤ３９Ｌ４の発現を検出する場合における、該動物の飼育条件も、被験物質を添加しない場合にＣＤ３９Ｌ４を発現可能な条件であればよい。
【０１６１】
なお、被験物質の、ＣＤ３９Ｌ４遺伝子の発現に対する影響を調べるためには、ＣＤ３９Ｌ４遺伝子の発現量を測定する方法と、ＣＤ３９Ｌ４遺伝子の翻訳産物である、ＣＤ３９Ｌ４の発現量を測定する方法がある。ＣＤ３９Ｌ４遺伝子またはＣＤ３９Ｌ４の発現を抑える被験物質は癌に対する治療効果及び／または予防効果を有する物質であると考えられる。
【０１６２】
培養細胞からの、全ＲＮＡの抽出、ＣＤ３９Ｌ４遺伝子の発現量の測定、ＣＤ３９Ｌ４の発現量の測定については、上記「１．ＣＤ３９Ｌ４遺伝子の取得」、「４．腫瘍マーカー遺伝子」及び「５．腫瘍マーカー蛋白質」の項に記載した方法に従って行うことができる。
【０１６３】
９．１　ＣＤ３９Ｌ４遺伝子を用いる方法
本発明のスクリーニング方法としては例えば、哺乳動物由来培養細胞を用いる方法、及び哺乳動物個体を用いる方法についてそれぞれ以下のようになる。
【０１６４】
Ａ）哺乳動物由来培養細胞を用いる方法
Ａ−１）以下の工程１）乃至３）を含む。
１）被験物質を添加した培地で培養した哺乳動物由来培養細胞より、全ＲＮＡを抽出する工程；
２）１）由来の全ＲＮＡと被験物質を添加しないで培養した哺乳動物培養細胞由来全ＲＮＡの間における、ＣＤ３９Ｌ４遺伝子の発現量の差を検出する工程；
３）ＣＤ３９Ｌ４遺伝子の発現量の差を解析し、被験物質の、癌に対する治療、及び／または予防効果を判定する工程。
【０１６５】
Ａ−２）以下の工程１）乃至４）を含む。
１）被験物質を添加した培地で培養した哺乳動物由来培養細胞より、全ＲＮＡ画分を抽出する工程；
２）被験物質を添加しない培地で培養した哺乳動物由来培養細胞より、全ＲＮＡ画分を抽出する工程；
３）上記工程１）由来の全ＲＮＡ画分と上記工程２）由来の全ＲＮＡ画分における、ＣＤ３９Ｌ４遺伝子の発現量を測定する工程；
４）上記工程１）由来の全ＲＮＡ画分と上記工程２）由来の全ＲＮＡ画分との間における上記工程３）によって測定されたポリヌクレオチドの発現量の差を解析し、被験物質の、癌に対する治療、及び／または治療効果を判定する工程。
【０１６６】
Ｂ）哺乳動物個体を用いる方法
Ｂ−１）以下の工程１）乃至３）を含む。
１）被験物質を投与した哺乳動物個体より採取した検体より、全ＲＮＡを抽出する工程；
２）上記工程１）由来の全ＲＮＡと被験物質を投与しなかった動物個体より採取した検体より得た全ＲＮＡの間における、ＣＤ３９Ｌ４遺伝子の発現量の差を検出する工程；
３）上記工程２）に記載のＣＤ３９Ｌ４遺伝子の発現量の差を解析し、被験物質の癌に対する治療、及び／または予防効果を判定する工程。
【０１６７】
Ｂ−２）以下の工程１）乃至４）を含む。
１）被験物質を投与した哺乳動物個体より採取した検体より、全ＲＮＡを抽出する工程；
２）被験物質を投与しなかった哺乳動物個体より採取した検体より、全ＲＮＡを抽出する工程；
３）上記工程１）由来の全ＲＮＡと上記工程２）由来の全ＲＮＡにおける、ＣＤ３９Ｌ４遺伝子の発現量を測定する工程；
４）３）に記載のＣＤ３９Ｌ４遺伝子の発現量の差を解析し、被験物質の癌に対する治療及び／または予防効果を判定する工程。
【０１６８】
９．２　ＣＤ３９Ｌ４を用いる方法
ＣＤ３９Ｌ４の発現量を測定することを利用したスクリーニング方法については哺乳動物培養細胞を用いた方法と動物個体を用いた方法についてそれぞれ以下の工程を含む。
【０１６９】
Ａ）哺乳動物由来培養細胞を用いる方法
Ａ−１）以下の工程１）及び２）を含む：
１）被験物質を添加した培地で培養した哺乳動物由来培養細胞における、ＣＤ３９Ｌ４の発現量を測定する工程；
２）１）で測定されたＣＤ３９Ｌ４の発現量と、被験物質を添加しない培地で培養した哺乳動物由来培養細胞における該蛋白質の発現量の差を解析し、被験物質の癌に対する治療効果及び／または予防効果を判定する工程。
【０１７０】
Ａ−２）以下の工程１）乃至３）を含む：
１）被験物質を添加した培地で培養した哺乳動物由来培養細胞における、ＣＤ３９Ｌ４の発現量を測定する工程；
２）被験物質を添加しない培地で培養した哺乳動物由来培養細胞における、上記１）に記載のＣＤ３９Ｌ４の発現量を測定する工程；
３）上記工程１）で測定されたＣＤ３９Ｌ４の発現量と、上記工程２）で測定されたＣＤ３９Ｌ４の発現量の差を検出し、被験物質の癌に対する治療効果及び／または予防効果を判定する工程。
【０１７１】
Ａ−３）以下の工程１）乃至３）を含む：
１）被験物質を添加した培地で培養した哺乳動物由来培養細胞から得た全蛋白質を固相化する工程；
２）上記固相化蛋白質における、本発明のＣＤ３９Ｌ４の発現量を測定する工程；
３）上記２）で検出されたＣＤ３９Ｌ４の発現量と、被験物質を添加しない培地で培養した哺乳動物由来培養細胞から得た全蛋白質における該蛋白質の発現量の差を解析し、被験物質の癌に対する治療効果及び／または予防効果を判定する工程。
【０１７２】
Ａ−４）以下の工程１）乃至５）を含む：
１）被験物質を添加した培地で培養した哺乳動物由来培養細胞から得た全蛋白質を固相化する工程；
２）被験物質を添加しない培地で培養した哺乳動物由来培養細胞から得た全蛋白質を固相化する工程；
３）上記工程１）に記載の固相化蛋白質におけるＣＤ３９Ｌ４の発現量を該蛋白質に特異的に結合する抗体またはリガンドを用いて測定する工程；
４）上記工程２）に記載の固相化蛋白質におけるＣＤ３９Ｌ４の発現量を該蛋白質に特異的に結合する抗体またはリガンドを用いて測定する工程；
５）上記工程３）で測定された蛋白質の発現量と、上記工程４）で測定された蛋白質の発現量の差を解析し、被験物質の、癌に対する治療効果及び／または予防効果を判定する工程。
【０１７３】
Ｂ）哺乳動物個体を用いる方法
Ｂ−１）以下の工程１）及び２）を含む：
１）被験物質を投与された哺乳動物個体より採取した検体における、ＣＤ３９Ｌ４タンパクの発現量を測定する工程；
２）上記工程１）で測定されたＣＤ３９Ｌ４の発現量と、被験物質を投与されなかった哺乳動物個体から採取した検体における該蛋白質の発現量の差を解析し、被験物質の癌に対する治療効果及び／または予防効果を判定する工程。
【０１７４】
Ｂ−２）以下の工程１）乃至３）を含む：
１）被験物質を投与された哺乳動物個体より採取した検体における、ＣＤ３９Ｌ４の発現量を該蛋白質に特異的に結合する抗体またはリガンドを用いて測定する工程；
２）被験物質を投与されなかった哺乳動物個体より採取した検体における、該蛋白質の発現量を測定する工程；
３）１）で測定されたＣＤ３９Ｌ４の発現量と、２）で測定されたＣＤ３９Ｌ４の発現量の差を解析し、被験物質の癌に対する治療効果及び／または予防効果を判定する工程。
【０１７５】
Ｂ−３）以下の工程１）乃至３）を含む：
１）被験物質を投与された哺乳動物個体より採取した検体中の全蛋白質を固相化する工程；
２）上記固相化蛋白質における、ＣＤ３９Ｌ４の発現量を測定する工程；
３）上記工程２）で検出されたＣＤ３９Ｌ４の発現量と、被験物質を投与されなかった哺乳動物個体より採取した検体中における該蛋白質の発現量の差を解析し、被験物質の癌に対する治療及び／または予防効果を判定する工程。
【０１７６】
Ｂ−４）以下の工程１）乃至５）を含む：
１）被験物質を投与された哺乳動物個体より採取した検体中の全蛋白質を固相化する工程；
２）被験物質を投与されなかった哺乳動物個体より採取した検体中の全蛋白質を固相化する工程；
３）上記工程１）に記載の固相化蛋白質における、ＣＤ３９Ｌ４の発現量を該蛋白質に特異的に結合する抗体またはリガンドを用いて検出する工程；
４）上記２）に記載の固相化蛋白質における、ＣＤ３９Ｌ４の発現量を該蛋白質に特異的に結合する抗体またはリガンドを用いて検出する工程；
５）上記３）で検出されたＣＤ３９Ｌ４の発現量と、上記４）で検出されたＣＤ３９Ｌ４の発現量の差を解析し、被験物質の癌に対する治療効果及び／または予防効果を判定する工程。
【０１７７】
９．３　その他の方法
ＣＤ３９Ｌ４を過剰発現させた哺乳動物個体に被験物質を投与した場合と投与しなかった場合について、経時的に癌の発生率、癌の大きさ、及び／または生存率等を測定する。被験物質を投与した哺乳動物で癌の発生率が有意に低下している、癌の大きさが有意に小さい、及び／または、生存率が約１０％以上、好ましくは約３０％以上、より好ましくは、約５０％以上上昇した場合に、被験物質は癌に対して癌に対する治療及び／または予防効果を有する化合物として選択することができる。
【０１７８】
１０．直接相互作用する物質の探索
本発明の他の一つの態様としては、ＣＤ３９Ｌ４の活動を抑制するような物質を得ることを目的とした、該蛋白質の立体構造をベースとしたドラッグデザインの手法を含む。このような手法は、ラショナルドラッグデザイン法として知られており、酵素活性などの機能や、リガンド、コファクター、またはＤＮＡへの結合などを効率よく阻害もしくは活性化させるような化合物の探索に利用されている。この例として、すでに上市されている抗ＨＩＶ剤であるプロテアーゼの阻害剤がよく知られている。本発明のＣＤ３９Ｌ４の三次元構造解析においても、Ｘ―線結晶解析や核磁気共鳴法といった一般的によく知られている手法が利用できると考えられる。さらに、ＣＤ３９Ｌ４の機能を抑制する物質の探索には、コンピュータードラッグデザイン（ＣＡＤＤ）を活用した設計も可能である。この例としては、慢性関節リウマチ治療の新たなゲノム新薬として期待されているＡＰ−１の働きを阻害する低分子化合物（国際特許出願公開ＷＯ９９／５８５１５号）などが知られている。このような方法により、ＣＤ３９Ｌ４に直接結合したり、あるいはＣＤ３９Ｌ４と他の因子との相互作用を阻害することにより、ＣＤ３９Ｌ４の機能を抑制するような物質を得ることができる。
【０１７９】
さらに、他の一つの態様は、本発明のＣＤ３９Ｌ４が会合するポリペプチド、すなわちＣＤ３９Ｌ４のパートナー蛋白質に関する。すなわち、本発明は、ＣＤ３９Ｌ４の活性を調節するパートナー蛋白質のスクリーニング方法に関する。
【０１８０】
このスクリーニング方法の一つの態様は、ＣＤ３９Ｌ４に被験蛋白質試料を接触させ、ＣＤ３９Ｌ４に結合する蛋白質を選択する工程を含む。このような方法としては、例えば、精製したＣＤ３９Ｌ４を用いて、これに結合する蛋白質のアフィニティー精製を行う方法が挙げられる。具体的な方法の一例を示せば、ＣＤ３９Ｌ４にヒスチジン６個よりなる配列をアフィニティータグとして融合したものを作製して、これを細胞の抽出液（予めニッケル−アガロースカラムにチャージして、このカラムを素通りした画分）と４℃で１２時間インキュベートし、次いで、この混合物に別途ニッケル−アガロース担体を加えて４℃で１時間インキュベートする。ニッケル−アガロース担体を洗浄バッファーで十分洗浄した後、１００ｍＭイミダゾールを加えることにより、ＣＤ３９Ｌ４と特異的に結合する細胞抽出液中の蛋白質を溶出させて精製し、この構造を決定する。このようにして、ＣＤ３９Ｌ４と直接結合する蛋白質、及びＣＤ３９Ｌ４との結合活性は持たないが、サブユニットとしてＣＤ３９Ｌ４に直接結合する蛋白質と複合体を形成することにより間接的にＣＤ３９Ｌ４に結合する蛋白質が精製できる［実験医学別冊、バイオマニュアルシリーズ５「転写因子研究法」ｐｐ２１５−２１９（羊土社刊）］。
【０１８１】
別の方法としては、ファーウエスタンブロット法［実験医学別冊、「新遺伝子工学ハンドブック」ｐｐ７６−８１（羊土社刊）］や、酵母や哺乳類動物細胞を用いたツーハイブリッドシステム法［実験医学別冊、「新遺伝子工学ハンドブック」ｐｐ６６−７５（羊土社刊）、「チェックメイト・マンマリアン・ツーハイブリッドシステム」（プロメガ社製）］によるクローニングも可能であるが、これらの方法に限定されない。
【０１８２】
このようにして、ＣＤ３９Ｌ４と直接もしくは間接的に相互作用するパートナー蛋白質のｃＤＮＡが得られれば、ＣＤ３９Ｌ４と該パートナー蛋白質との相互作用を阻害する物質の機能的スクリーニングに利用することができる。具体的には、例えば、ＣＤ３９Ｌ４とグルタチオンＳ−トランスフェラーゼとの融合蛋白質を調製して、抗グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ抗体で覆ったマイクロプレートに結合させた後、ビオチン化した該パートナー蛋白質をこの融合蛋白質と接触させ、該融合蛋白質との結合をストレプトアビジン化アルカリフォスファターゼで検出する。ビオチン化した該パートナー蛋白質添加の際、被験物質も添加し、融合蛋白質と該パートナー蛋白質との結合を促進あるいは阻害する物質を選択する。この方法では、融合蛋白質に直接作用する物質または該パートナー蛋白質に直接作用する物質が得られる。
【０１８３】
融合蛋白質と該パートナー蛋白質との結合が間接的であり、何らかの別の因子を介しているような場合には、例えば該因子を含むような細胞抽出液存在下で、同様に上記アッセイを行う。この場合には、該因子に対して作用するような物質も選択される可能性がある。
【０１８４】
また、得られたパートナー蛋白質が、ＣＤ３９Ｌ４の機能を抑制する活性を有している場合には、既に記載したＣＤ３９Ｌ４遺伝子の発現ベクターを応用した試験方法に従って、抗癌剤、例えば、前立腺癌の治療または予防剤として有用な候補物質のスクリーニングを行うことができる。また、得られたパートナー蛋白質が、ＣＤ３９Ｌ４の機能を抑制する活性を有している場合には、このような抑制因子をコードするヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドは、癌の遺伝子治療に用いることができる。
【０１８５】
そのようなポリヌクレオチドは、例えば同定された阻害因子のアミノ酸配列を解析し、該アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列からなるオリゴヌクレオチドプローブを合成してｃＤＮＡライブラリーやゲノムライブラリーのスクリーニングを行うことにより取得できる。また、ＣＤ３９Ｌ４の機能の阻害活性を有するぺプチドが、ランダムに合成された人工ペプチドライブラリー由来である場合は、該ペプチドのアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列からなるＤＮＡを化学合成する。
【０１８６】
遺伝子治療においては、そのようにして得られた阻害因子をコードする遺伝子を、例えばウイルスベクターに組み込んで、該組換えウイルスベクターを有するウイルス（無毒化されたもの）を患者に感染させる。患者体内では抗癌因子が産生され、癌細胞の増殖抑制機能を有するので、癌の治療が可能となる。
【０１８７】
遺伝子治療剤を細胞内に導入する方法としては、ウイルスベクターを利用した遺伝子導入方法、あるいは非ウイルス性の遺伝子導入方法（日経サイエンス，１９９４年４月号，２０−４５頁、実験医学増刊，１２（１５）（１９９４）、実験医学別冊「遺伝子治療の基礎技術」，羊土社（１９９６））のいずれの方法も適用することができる。
【０１８８】
ウイルスベクターによる遺伝子導入方法としては、例えばレトロウイルス、アデノウイルス、アデノ関連ウイルス、ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルス、ポックスウイルス、ポリオウイルス、シンビスウイルス等のＤＮＡウイルスまたはＲＮＡウイルスに、ＴＲ４あるいは変異ＴＲ４をコードするＤＮＡを組み込んで導入する方法が挙げられる。このうち、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ関連ウイルス、ワクシニアウイルスを用いた方法が、特に好ましい。非ウイルス性の遺伝子導入方法としては、発現プラスミドを直接筋肉内に投与する方法（ＤＮＡワクチン法）、リポソーム法、リポフェクチン法、マイクロインジェクション法、リン酸カルシウム法、エレクトロポレーション法等が挙げられ、特にＤＮＡワクチン法、リポソーム法が好ましい。
【０１８９】
また遺伝子治療剤を実際に医薬として作用させるには、ＤＮＡを直接体内に導入するインビボ（ｉｎ　ｖｉｖｏ）法及びヒトからある種の細胞を取り出し体外でＤＮＡを該細胞に導入し、その細胞を体内に戻すエクスビボ（ｅｘ　ｖｉｖｏ）法がある（日経サイエンス，１９９４年４月号，２０−４５頁、月刊薬事，３６（１），２３−４８（１９９４）、実験医学増刊，　１２　（１５）（１９９４））。
【０１９０】
例えば、該遺伝子治療剤がインビボ法により投与される場合は、疾患、症状等に応じ、静脈、動脈、皮下、皮内、筋肉内等、適当な投与経路により投与される。またインビボ法により投与する場合は、該遺伝子治療剤は一般的には注射剤等とされるが、必要に応じて慣用の担体を加えてもよい。また、リポソームまたは膜融合リポソーム（センダイウイルス−リポソーム等）の形態にした場合は、懸濁剤、凍結剤、遠心分離濃縮凍結剤等のリポソーム製剤とすることができる。
【０１９１】
配列表の配列番号１のヌクレオチド番号２４７乃至１５３３、配列番号３のヌクレオチド番号２４７乃至１５３３、配列番号５のヌクレオチド番号２８３乃至１５６９または配列番号７のヌクレオチド番号３９８乃至１６２１に示されるヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列または該配列の部分配列に相補的なヌクレオチド配列は、いわゆるアンチセンス治療に用いることができる。アンチセンス分子は、配列表の配列番号１のヌクレオチド番号２４７乃至１５３３、配列番号３のヌクレオチド番号２４７乃至１５３３、配列番号５のヌクレオチド番号２８３乃至１５６９または配列番号７のヌクレオチド番号３９８乃至１６２１に示されるヌクレオチド配列の一部に相補的な、通常１５乃至３０ｍｅｒからなるＤＮＡ、もしくはそのホスホロチオエート、メチルホスホネートまたはモルフォリノ誘導体などの安定なＤＮＡ誘導体、２’−Ｏ−アルキルＲＮＡなどの安定なＲＮＡ誘導体として用いられ得る。そのようなアンチセンス分子を、微量注入、リポソームカプセル化により、あるいはアンチセンス配列を有するベクターを利用して発現させるなど、本発明の技術分野において周知の方法で、細胞に導入することができる。このようなアンチセンス療法は、配列表の配列番号１のヌクレオチド番号２４７乃至１５３３、配列番号３のヌクレオチド番号２４７乃至１５３３、配列番号５のヌクレオチド番号２８３乃至１５６９または配列番号７のヌクレオチド番号３９８乃至１６２１に示されるヌクレオチド配列がコードする蛋白質の活性が増加しすぎることによって引き起こされる病気の治療または予防に有用である。
【０１９２】
上記アンチセンスオリゴヌクレオチドを含む医薬として有用な組成物は、医薬として許容できる担体の混合などの公知の方法によって製造され得る。このような担体と製造方法の例は、Ａｐｐｌｉｅｄ　Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ　Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（１９９８　Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ、Ｉｎｃ．）に記載されている。アンチセンスオリゴヌクレオチドを含む製剤は、それ自体あるいは適宜の薬理学的に許容される、賦形剤、希釈剤等と混合し、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤若しくはシロップ剤等により経口的に、または、注射剤、坐剤、貼付剤、若しくは、外用剤等により非経口的に投与することができる。これらの製剤は、賦形剤（例えば、乳糖、白糖、葡萄糖、マンニトール、ソルビトールのような糖誘導体；トウモロコシデンプン、バレイショデンプン、α澱粉、デキストリンのような澱粉誘導体；結晶セルロースのようなセルロース誘導体；アラビアゴム；デキストラン；プルランのような有機系賦形剤；及び、軽質無水珪酸、合成珪酸アルミニウム、珪酸カルシウム、メタ珪酸アルミン酸マグネシウムのような珪酸塩誘導体；燐酸水素カルシウムのような燐酸塩；炭酸カルシウムのような炭酸塩；硫酸カルシウムのような硫酸塩等の無機系賦形剤を挙げることができる。）、滑沢剤（例えば、ステアリン酸、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウムのようなステアリン酸金属塩；タルク；コロイドシリカ；ビーズワックス、ゲイ蝋のようなワックス類；硼酸；アジピン酸；硫酸ナトリウムのような硫酸塩；グリコール；フマル酸；安息香酸ナトリウム；ＤＬロイシン；ラウリル硫酸ナトリウム、ラウリル硫酸マグネシウムのようなラウリル硫酸塩；無水珪酸、珪酸水和物のような珪酸類；及び、上記澱粉誘導体を挙げることができる。）、結合剤（例えば、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポリビニルピロリドン、マクロゴール、及び、前記賦形剤と同様の化合物を挙げることができる。）、崩壊剤（例えば、低置換度ヒドロキシプロピルセルロース、カルボキシメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースカルシウム、内部架橋カルボキシメチルセルロースナトリウムのようなセルロース誘導体；カルボキシメチルスターチ、カルボキシメチルスターチナトリウム、架橋ポリビニルピロリドンのような化学修飾されたデンプン・セルロース類を挙げることができる。）、乳化剤（例えば、ベントナイト、ビーガムのようなコロイド性粘土；水酸化マグネシウム、水酸化アルミニウムのような金属水酸化物；ラウリル硫酸ナトリウム、ステアリン酸カルシウムのような陰イオン界面活性剤；塩化ベンザルコニウムのような陽イオン界面活性剤；及び、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、ショ糖脂肪酸エステルのような非イオン界面活性剤を挙げることができる。）、安定剤（メチルパラベン、プロピルパラベンのようなパラオキシ安息香酸エステル類；クロロブタノール、ベンジルアルコール、フェニルエチルアルコールのようなアルコール類；塩化ベンザルコニウム；フェノール、クレゾールのようなフェノール類；チメロサール；デヒドロ酢酸；及び、ソルビン酸を挙げることができる。）、矯味矯臭剤（例えば、通常使用される、甘味料、酸味料、香料等を挙げることができる。）、希釈剤等の添加剤を用いて周知の方法で製造される。
【０１９３】
本発明の化合物を患者へ導入する方法については、上記に加えてコロイド分散系を用いることができる。コロイド分散系は化合物の生体内の安定性を高める効果や、特定の臓器、組織または細胞へ化合物を効率的に輸送する効果が期待される。コロイド分散系は、通常用いられるものであれば限定しないが、高分子複合体、ナノカプセル、ミクロスフェア、ビーズ、及び水中油系の乳化剤、ミセル、混合ミセル及びリポソームを包含する脂質をベースとする分散系を挙げる事ができ、好ましくは、特定の臓器、組織または細胞へ化合物を効率的に輸送する効果のある、複数のリポソーム、人工膜の小胞である（Ｍａｎｎｉｎｏ　ｅｔ　ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，１９８８，６，６８２；Ｂｌｕｍｅ　ａｎｄ　Ｃｅｖｃ，Ｂｉｏｃｈｅｍ．ｅｔ　Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，１９９０，１０２９，９１；Ｌａｐｐａｌａｉｎｅｎ　ｅｔ　ａｌ．，Ａｎｔｉｖｉｒａｌ　Ｒｅｓ．，１９９４，２３，１１９；Ｃｈｏｎｎ　ａｎｄ　Ｃｕｌｌｉｓ，Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｏｐ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．，１９９５，６，６９８　）。
【０１９４】
０．２−０．４　μｍのサイズ範囲をとる単膜リポソームは、巨大分子を含有する水性緩衝液のかなりの割合を被包化し得、化合物はこの水性内膜に被胞化され、生物学的に活性な形態で脳細胞へ輸送される（Ｆｒａｌｅｙ　ｅｔ　ａｌ．，Ｔｒｅｎｄｓ　Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．，１９８１，６，７７　）。リポソームの組成は、通常、脂質、特にリン脂質、とりわけ相転移温度の高いリン脂質を１種またはそれ以上のステロイド、特にコレステロールと通常複合したものである。リポソーム生産に有用な脂質の例は、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルコリン、ホスファチジルセリン、スフィンゴ脂質、ホスファチジルエタノールアミン、セレブロシド及びガングリオシドのようなホスファチジル化合物を包含する。特に有用なのはジアシルホスファチジルグリセロールであり、ここでは脂質部分が１４−１８の炭素原子、特に１６−１８の炭素原子を含有し、飽和している（１４−１８の炭素原子鎖の内部に二重結合を欠いている）。代表的なリン脂質は、ホスファチジルコリン、ジパルミトイルホスファチジルコリン及びジステアロイルホスファチジルコリンを包含する。
【０１９５】
リポソームを包含するコロイド分散系の標的化は、受動的または能動的のいずれかであってもよい。受動的な標的化は、洞様毛細血管を含有する臓器の網内系細胞へ分布しようとするリポソーム本来の傾向を利用することによって達成される。一方、能動的な標的化は、例えば、ウイルスの蛋白質コート（Ｍｏｒｉｓｈｉｔａ　ｅｔａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（Ｕ．Ｓ．Ａ．），１９９３，９０，８４７４　）、モノクローナル抗体（またはその適切な結合部分）、糖、糖脂質または蛋白質（またはその適切なオリゴペプチドフラグメント）のような特定のリガンドをリポソームへ結合させること、または天然に存在する局在部位以外の臓器及び細胞型への分布を達成するためにリポソームの組成を変えることによってリポソームを修飾する手法等を挙げる事ができる。標的化されたコロイド分散系の表面は様々なやり方で修飾され得る。リポソームで標的したデリバリーシステムでは、脂質二重層との緊密な会合において標的リガンドを維持するために、リポソームの脂質二重層へ脂質基が取込まれ得る。脂質鎖を標的リガンドと結びつけるために様々な連結基が使用され得る。本発明のオリゴヌクレオチドのデリバリーが所望される細胞の上に支配的に見出される特定の細胞表面分子に結合する標的リガンドは、例えば、（１）デリバリーが所望される細胞によって支配的に発現される特定の細胞受容体と結合している、ホルモン、成長因子またはその適切なオリゴペプチドフラグメント、または（２）標的細胞上で支配的に見出される抗原性エピトープと特異的に結合する、ポリクローナルまたはモノクローナル抗体、またはその適切なフラグメント（例えば、Ｆａｂ　；Ｆ　（ａｂ’）２　）、であり得る。２　種またはそれ以上の生物活性剤は、単一のリポソーム内部で複合し、投与することもできる。内容物の細胞内安定性及び／または標的化を高める薬剤をコロイド分散系へ追加することも可能である。
【０１９６】
その使用量は症状、年齢等により異なるが、経口投与の場合には、１回当り下限１ｍｇ（好適には、３０ｍｇ）、上限２０００ｍｇ（好適には、１５００ｍｇ）を、注射の場合には、１回当り下限０．１ｍｇ（好適には、５ｍｇ）、上限１０００ｍｇ（好適には、５００ｍｇ）を皮下注射、筋肉注射または静脈注射によって投与することができる。
【０１９７】
１１．ＣＤ３９Ｌ４に対する抗体を含有する医薬
ＣＤ３９Ｌ４を過剰発現させると細胞が癌化することから、ＣＤ３９Ｌ４に対する抗体は、癌の治療及び／または予防剤となり得る。ＣＤ３９Ｌ４に対する抗体をヒトに対する医薬として用いる場合、抗原性の問題からヒト型抗ヒトＣＤ３９Ｌ４抗体を作製することが望ましい。ヒト型抗ヒトＣＤ３９Ｌ４抗体の作製は、次に述べるような手法により得ることができる。即ち、▲１▼ヒト末梢血あるいは脾臓から採取したヒトリンパ球をｉｎ　ｖｉｔｒｏでＩＬ−４存在下、抗原であるヒトＣＤ３９Ｌ４で感作し、感作したヒトリンパ球をマウスとヒトとのヘテロハイブリドーマであるＫ_６Ｈ_６／Ｂ_５（ＡＴＣＣ　ＣＲＬ−１８２３）と細胞融合させることにより目的の抗体産生ハイブリドーマをスクリーニングする。得られた抗体産生ハイブリドーマが生産する抗体は、ヒト型抗ヒトＣＤ３９Ｌ４モノクローナル抗体である。これらの抗体の中からヒトＣＤ３９Ｌ４の活性を中和する抗体を選別する。しかしながら、このようにヒトリンパ球をｉｎ　ｖｉｔｒｏで感作する方法では、一般的に抗原に対して高親和性の抗体を得るのは困難である。従って、ヒトＣＤ３９Ｌ４に高親和性のモノクローナル抗体を得るには、上記のようにして得られた低親和性のヒト型抗ヒトＣＤ３９Ｌ４モノクローナル抗体を高親和化する必要がある。それには、上記のようにして得られ、中和抗体であるものの低親和性であるヒト型抗ヒトＣＤ３９Ｌ４モノクローナル抗体のＣＤＲ領域（特にＣＤＲ−３）にランダム変異を導入し、これをファージで発現させてヒトＣＤ３９Ｌ４を固相化したプレートを用いてファージディスプレー法により、抗原であるヒトＣＤ３９Ｌ４に強力に結合するファージを選択し、そのファージを大腸菌で増やし、その塩基配列から高親和性を有するＣＤＲのアミノ酸配列を決定すればよい。このようにして得られたヒト型抗ヒトＣＤ３９Ｌ４モノクローナル抗体をコードする遺伝子を一般的に使用されている哺乳動物細胞用発現ベクターに組み込んで、発現させることによりヒト型抗ヒトＣＤ３９Ｌ４モノクローナル抗体が得られる。これらの中から、ヒトＣＤ３９Ｌ４の生物活性を中和し、かつ高親和性である目的のヒト型抗ＣＤ３９Ｌ４モノクローナル抗体を選別することができる。また、▲２▼Ｂａｌｂ／ｃマウスを用いて、本発明と同じように常法（Ｋｏｈｌｅｒ　ｅｔ　ａｌ．：　Ｎａｔｕｒｅ　２５６，　ｐ．４９５−４９７，　１９７５）によりマウス型抗ヒトＣＤ３９Ｌ４モノクローナル抗体を作製し、ヒトＣＤ３９Ｌ４の生物活性を中和し、かつ高親和性を有するモノクローナル抗体を選択する。この高親和性マウス型抗ヒトＣＤ３９Ｌ４モノクローナル抗体のＣＤＲ−領域（ＣＤＲ−１、２および３）をヒトＩｇＧのＣＤＲ領域に移植するＣＤＲ−ｇｒａｆｔｉｎｇ（Ｗｉｎｔｅｒ　ａｎｄＭｉｌｓｔｅｉｎ：　Ｎａｔｕｒｅ　３４９，　ｐ２９３−２９９，　１９９１）の手法を駆使することによりヒト型化が可能である。上記に加え、さらに▲３▼ヒト抹消血リンパ球をＳｅｖｅｒｅ　ｃｏｍｂｉｎｅｄ　ｉｍｍｕｎｅ　ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ（ＳＣＩＤ）マウスに移植し、この移植されたＳＣＩＤマウスはヒト型抗体を生産する（Ｍｏｓｉｅｒ　Ｄ．　Ｅ．　ｅｔ　ａｌ．：　Ｎａｔｕｒｅ　３３５，　ｐ２５６−２５９，　１９８８；　Ｄｕｃｈｏｓａｌ　Ｍ．　Ａ．　ｅｔ　ａｌ．：　Ｎａｔｕｒｅ　３５５，　ｐ２５８−２６２，　１９９２）ので、抗原としてヒトＣＤ３９Ｌ４を抗原として感作し、スクリーニングすることにより、ヒトＣＤ３９Ｌ４に特異的なヒト型モノクローナル抗体を生産するリンパ球をそのマウスから採取することができる。得られたリンパ球を前述のヒト型抗体の作製法▲１▼と同様に、マウスとヒトとのヘテロハイブリドーマであるＫ_６Ｈ_６／Ｂ_５（ＡＴＣＣ　ＣＲＬ−１８２３）と細胞融合させ、得られたハイブリドーマをスクリーニングすることにより、目的のヒト型モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを得ることができる。このようにして得られたハイブリドーマを培養することにより、目的のヒト型モノクローナル抗体を大量に製造でき、該タンパク質の物理的性質や化学的性質などを利用した各種の公知の分離操作法により分離・精製することができる。該方法としては、具体的には例えば、通常のタンパク沈殿剤による処理、限外濾過、分子ふるいクロマトグラフィー（ゲル濾過）、吸着クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）などの各種液体クロマトグラフィー、透析法、これらの組合せなどを例示できる。また、目的のヒト型モノクローナル抗体をコードする遺伝子（ｃＤＮＡ）をクローニングし、この遺伝子を遺伝子工学的手法により適当なベクターに組み込み、各種動物細胞、混注細胞、あるいは大腸菌などを宿主として発現させることにより、遺伝子組換えヒト型モノクローナル抗体を大量に製造することができる。得られた培養液から上述と同様の方法により精製することにより、精製されたヒト型モノクローナル抗体を大量に得ることができる。更に、上述の方法で得られた抗ＣＤ３９Ｌ４モノクローナル抗体の中から、ＣＤ３９Ｌ４の生物活性を中和する抗体を得ることができる。これらＣＤ３９Ｌ４の生物活性を中和する抗体は、生体内でのＣＤ３９Ｌ４の生物活性、即ち、細胞の癌化を阻害することから、医薬として、特に癌に対する治療及び／または予防剤として期待される。ｉｎ　ｖｉｔｒｏでの抗ＣＤ３９Ｌ４抗体によるＣＤ３９Ｌ４の生物活性の中和活性は例えば、ＣＤ３９Ｌ４を過剰発現している細胞における細胞の癌化の抑制活性で測定することができる。例えば、ＣＤ３９Ｌ４を過剰発現しているマウス繊維芽細胞株ＮＩＨ３Ｔ３を培養し、培養系に種々の濃度で抗ＣＤ３９Ｌ４抗体を添加し、フォーカス形成、コロニー形成及びスフェロイド増殖に対する抑制活性を測定することができる。ｉｎ　ｖｉｖｏでの実験動物を利用した抗ＣＤ３９Ｌ４抗体の癌に対する治療及び／または予防効果は、例えば、ＣＤ３９Ｌ４を過剰に発現しているトランスジェニック動物に同ＣＤ３９Ｌ４抗体を投与し、癌細胞の変化を測定することができる。
【０１９８】
このようにして得られたＣＤ３９Ｌ４の生物活性を中和する抗体は、医薬として特に癌の治療及び／または予防を目的とした医薬組成物として、あるいはこのような疾患の免疫学的診断のための抗体として有用である。本発明の抗体は製剤化して経口的あるいは非経口的に投与することができる。本発明抗体を含む製剤は、ＣＤ３９Ｌ４を認識する抗体を有効成分として含有する医薬組成物として、ヒトあるいは動物に対し安全に投与されるものである。医薬組成物の形態としては、点滴を含む注射剤、坐剤、経鼻剤、舌下剤、経皮吸収剤などが挙げられる。モノクローナル抗体は高分子蛋白質であることから、バイアル瓶などのガラス容器や注射筒などへの吸着が著しい上に不安定であり、種々の物理化学的因子、例えば、熱、ｐＨ及び湿度等により容易に失活する。従って、安定な形で製剤化するために、安定化剤、ｐＨ調整剤、緩衝剤、可溶化剤、界面活性剤などを添加する。安定化剤としてはグリシン、アラニン等のアミノ酸類、デキストラン４０及びマンノース等の糖類、ソルビトール、マンニトール、キシリトール等の糖アルコール等が挙げられ、またこれらの二種以上を併用してもよい。これらの安定化剤の添加量は、抗体の重量にたいして０．０１〜１００倍、特に０．１〜１０倍添加するのが好ましい。これら安定化剤を加えることにより、液状製剤あるいは凍結乾燥製剤の保存安定性を向上することができる。緩衝剤としては、例えばリン酸バッファー、クエン酸バッファー等が挙げられる。緩衝剤は、液状製剤あるいは凍結乾燥製剤の再溶解後の水溶液のｐＨを調製し、抗体の安定性、溶解性に寄与する。緩衝剤の添加量としては、例えば液状製剤あるいは凍結乾燥製剤を採用解した後の水量に対し、１〜１０ｍＭとするのが好ましい。界面活性剤としては、好ましくはポリソルベート２０、プルロニックＦ−６８、ポリエチレングリコール等、特に好ましくはポリソルベート８０が挙げられ、またこれらの２種以上を併用してもよい。抗体のような高分子蛋白質は容器の材質であるガラスや樹脂などに吸着しやすい。従って、界面活性剤を添加することによって、液状製剤あるいは凍結乾燥製剤の再溶解後の抗体の、容器への吸着を防止することができる。界面活性剤の添加量としては、液状製剤あるいは凍結乾燥製剤の再溶解後の水重量に対して０．００１〜１．０％添加することが好ましい。以上のような安定化剤、緩衝剤、あるいは吸着防止剤を加えて本発明抗体の製剤を調製することができるが、特に医療用または動物用注射剤として用いる場合は、浸透圧として許容される浸透圧比は１〜２が好ましい。浸透圧比は、製剤化に際して塩化ナトリウムの増減により調製することができる。製剤中の抗体含量は、適用疾患、適用投与経路などに応じて適宜調整することができ、ヒトに対するヒト型抗体の投与量は、抗体のヒトＣＤ３９Ｌ４に対する親和性、即ち、ヒトＣＤ３９Ｌ４に対する解離定数（Ｋｄ値）に対し、親和性が高い（Ｋｄ値が低い）ほど、ヒトへの投与量を少なく薬効を発揮することができる。ヒト型抗ＣＤ３９Ｌ４抗体をヒトに対して投与する際には、約０．１〜１００ｍｇ／ｋｇを１〜３０日間に１回投与すればよい。
【０１９９】
【０２００】
【実施例】
以下、実施例によって本発明を説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。なお、下記実施例において、遺伝子操作に関する各操作は特に明示がない限り、「モレキュラークローニング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ）」［Ｓａｍｂｒｏｏｋ，　Ｊ．，Ｆｒｉｔｓｃｈ，　Ｅ．Ｆ．およびＭａｎｉａｔｉｓ，　Ｔ．　著、Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓより１９８９年に発刊］に記載の方法により行うか、または、市販の試薬やキットを用いる場合には市販品の指示書に従って使用した。
【０２０１】
実施例１．ヒトＣＤ３９Ｌ４　ｃＤＮＡクローンの取得
ａ）全ＲＮＡの単離
ヒト前立腺癌細胞株ＬＮＣａＰ（Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｉｓｓｕｅ　Ｃｕｌｔｕｒｅ　Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ　ＡＴＣＣ　Ｎｏ．：ＣＲＬ−１７４０）を、１０％牛胎児血清（ＦＣＳ：Ｈｙｃｌｏｎｅ社製）を含むＲＰＭＩ１６４０培地（旭テクノグラス社製）を用いて、７５ｃｍ^２の組織培養フラスコ（住友ベークライト社製：ＭＳ−２３２５０）中で培養した。コンフルエント（ｃｏｎｆｌｕｅｎｔ）にならないよう注意しつつ５％ＣＯ_２、３７℃条件下で培養し、対数増殖期のうちにトリプシン−ＥＤＴＡ溶液（シグマ社製）を用いて組織培養フラスコより剥がし回収しその一部を新しい組織培養フラスコに移して継代培養した。全ＲＮＡの単離は、対数増殖期のヒト前立腺癌細胞株ＬＮＣａＰを集め、添付プロトコールに従ってＴＲＩｚｏｌ（インビトロジェン社製）を用いて行なった。
【０２０２】
ｂ）ファーストストランドｃＤＮＡ合成
Ｏｍｎｉｓｃｒｉｐｔ　Ｒｅｖｅｒｓｅ　Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ（キアゲン社製）を用いて、その添付プロトコールに従って実施例１ａ）で得た全ＲＮＡから、ファーストストランドｃＤＮＡを合成した。なお、反応は２０μｌの容量で行った。
【０２０３】
ｃ）ＰＣＲ反応
ＣＤ３９Ｌ４　ｃＤＮＡをＰＣＲで増幅するためのプライマーとして
５’−ｃａｃｃａｔｇｇｃｃａｃｔｔｃｔｔｇｇｇｇｃａｃａ−３’（プライマー１：配列表の配列番号９）
および、
５’−ｔｃａａｔｇｇｇａｇａｔｇｃｃｃａｇａｇａ−３’（プライマー２：配列表の配列番号１０）
の配列を有するオリゴヌクレオチドを常法に従って合成した。なお、プライマー１はＣＤ３９Ｌ４遺伝子の開始コドン上流にＫｏｚａｋ配列として４塩基、ＣＡＣＣを付加したオリゴヌクレオチドであり、配列表の配列番号１のヌクレオチド番号３９５乃至４１０からなるヌクレオチド配列の５’側に４塩基配列（ＣＡＣＣ）付加した塩基配列からなるオリゴヌクレオチドである。このＣＡＣＣ配列は、クローニングベクターｐＥＮＴＲ／ＳＤ／Ｄ−ＴＯＰＯへの組み込みの際にベクター３’末端と相補鎖を形成するため、遺伝子の方向性を保持したベクターへの組み込みを可能としている。プライマー２は配列表の配列番号１のヌクレオチド番号１４９８乃至１５１９ならなるヌクレオチド配列の相補鎖からなるオリゴヌクレオチドである。
【０２０４】
ＰＣＲ反応はＰｒｏｏｆＳｔａｒｔ　ＤＮＡ　Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（キアゲン社製）を添付プロトコールに従って用いて行った。具体的には、得られたファーストストランドｃＤＮＡ　１μｌに１００ｐｍｏｌ／μｌの濃度の合成プライマー１と合成プライマー２をそれぞれ０．５μｌ、１０Ｘ　ＰｒｏｏｆＳｔａｒｔ　ＰＣＲ　Ｂｕｆｆｅｒ　５μｌ、１０ｍＭ　ｄＮＴＰ　Ｍｉｘを１．５μｌ、ＰｒｏｏｆＳｔａｒｔ　ＤＮＡ　Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ　２μｌ、５ｘＱ−Ｓｏｌｕｔｉｏｎ　１０μｌ、滅菌精製水　２９．５μｌを添加し、５０μｌのＰＣＲ反応溶液を作製した。ＰＣＲ反応は、ＧｅｎｅＡｍｐ　ＰＣＲ　Ｓｙｓｔｅｍ　９７００（アプライド・バイオシステムズ（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）社製）により行なった。まず９５℃で５分加熱した後、引き続き９４℃で３０秒、５７℃で３０秒、７２℃で４分の温度サイクルを３５回繰り返し、最後に７２℃で２０分間保温してから、４℃に保存した。目的ｃＤＮＡは、反応物を１％のアガロースゲルで電気泳動し、ＣＤ３９Ｌ４　ｃＤＮＡ（１２８７ｂｐ）の増幅を確認後、ＱＩＡｑｕｉｃｋ　Ｇｅｌ　Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ　Ｋｉｔ（キアゲン社製）をその添付プロトコールに従って用いることによりアガロースゲルよりＤＮＡを精製した。精製されたＣＤ３９Ｌ４　ｃＤＮＡの濃度は、吸光光度計（Ｇｅｎｅ　Ｓｐｅｃ　Ｉ：日立計測器サービス社製）により測定した。
【０２０５】
ｄ）　ＣＤ３９Ｌ４　ｃＤＮＡのｐＥＮＴＲ／ＳＤ／Ｄ−ＴＯＰＯベクターへのクローニング
ｐＥＮＴＲ　Ｄｉｒｅｃｔｉｏｎａｌ　ＴＯＰＯ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　Ｋｉｔｓ（インビトロジェン社製）を添付プロトコールに従って用い、実施例１ｃ）によって得られたＣＤ３９Ｌ４　ｃＤＮＡをｐＥＮＴＲ／ＳＤ／Ｄ−ＴＯＰＯベクターにクローニングした。ＣＤ３９Ｌ４　ｃＤＮＡを、キット付属の反応バッファー中でＴｏｐｏｉｓｏｍｅｒａｓｅを結合させてあるｐＥＮＴＲ／ＳＤ／Ｄ−ＴＯＰＯベクターと混合し室温で５分間インキュベートした。得られた反応物を用いて大腸菌ＯｎｅＳｈｏｔ　ＴＯＰ１０　Ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ　Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ　Ｅ．ｃｏｌｉ（インビトロジェン社製）を形質転換し、５０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含むＬＢ寒天培地上で培養した。その結果カナマイシン耐性を示して生育してきた大腸菌コロニーを選択して、０．３ｍｌの５０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含む液体ＬＢ培地中で３７℃で一晩培養し、ＢＩＯ　ＲＯＢＯＴ　９６００（キアゲン社製）を利用することによりプラスミドＤＮＡを単離精製した。得られたプラスミドＤＮＡについて、ＡＢＩ　ＰＲＩＳＭ　３７００　ＤＮＡ　Ａｎａｌｙｚｅｒ（アプライド・バイオシステムズ社製）によりヌクレオチド配列解析を行ない、ＧｅｎＢａｎｋ　アクセッション番号（ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ　ＮＯ．）ＡＦ０３９９１８に示されるヌクレオチド配列のＯｐｅｎ　Ｒｅａｄｉｎｇ　Ｆｒａｍｅを有するｃＤＮＡ（配列表の配列番号１）が、ｐＥＮＴＲ／ＳＤ／Ｄ−ＴＯＰＯベクターに組み込まれていることを確認した。
【０２０６】
ｅ）レトロウイルスベクターｐＬＮＣＸへのクローニング
ＧＡＴＥＷＡＹ　Ｖｅｃｔｏｒ　Ｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ　Ｓｙｓｔｅｍ（インビトロジェン社製）に含まれるＤＮＡ断片、Ｒｅａｄｉｎｇ　Ｆｒａｍｅ　Ｃａｓｓｅｔｔｅ　Ａを、ＲｅｔｒｏＸｐｒｅｓｓ　Ｓｙｓｔｅｍ（クロンテック社製）に含まれるレトロウイルスベクターｐＬＮＣＸ（図１）のＨｐａＩ部位に、プラスミド上のＣＭＶプロモーターに対し順方向に挿入し、改変ベクターｐＬＮＣＸ−ＧＷを作製した。ＬＲ　ＣＬＯＮＡＳＥ　Ｅｎｚｙｍｅ　Ｍｉｘ（インビトロジェン社製）を添付のプロトコールに従って用い、ｐＥＮＴＲ／ＳＤ／Ｄ−ＴＯＰＯベクターにクローニングしたＣＤ３９Ｌ４　ｃＤＮＡをｐＬＮＣＸ−ＧＷに移し換えた組換えベクターを作製した。この組換えベクターで大腸菌ＯｎｅＳｈｏｔ　ＴＯＰ１０　Ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ　Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ　Ｅ．ｃｏｌｉを形質転換し、５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ寒天培地上で培養した。その結果アンピシリン耐性を示して生育してきた大腸菌コロニーを選択して、０．３ｍｌの５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含む液体ＴＢＧ培地中で３７℃で一晩培養後、増殖した大腸菌クローンを１５０ｍｌの容量の５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ培地中で一晩培養し、この培養液よりＥｎｄｏ　Ｆｒｅｅ　Ｐｌａｓｍｉｄ　Ｍａｘｉ　Ｋｉｔｓ（キアゲン社製）を添付のプロトコールに従って用いて、プラスミドを精製した。このプラスミドをｐＬＮＣＸ−ＧＷ−ＣＤ３９Ｌ４と命名した。本プラスミドの挿入遺伝子がＣＤ３９Ｌ４　ｃＤＮＡであることは、制限酵素による消化後のＤＮＡ断片の長さをアガロース電気泳動で検定することで確認した。
【０２０７】
実施例２　ＣＤ３９Ｌ４遺伝子発現レトロウイルスの作製とＣＤ３９Ｌ４安定発現細胞株の樹立
ａ）細胞株とその継代培養
パッケージング細胞株２９３−１０Ａ１（ＩＭＧＥＮＥＸ社製）及びマウス繊維芽細胞株ＮＩＨ３Ｔ３（Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｉｓｓｕｅ　Ｃｕｌｔｕｒｅ　Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）の培養は、１０％牛胎児血清（ＦＣＳ：Ｈｙｃｌｏｎｅ社製）を含むＲＰＭＩ１６４０培地（旭テクノグラス社製）を用いて、２５、７５乃至２２５ｃｍ^２の組織培養フラスコ（コーニング・コスター社製あるいは住友ベークライト社製）中で行った。コンフルエント（ｃｏｎｆｌｕｅｎｔ）にならないよう注意しつつ５％ＣＯ_２、３７℃条件下で培養し、対数増殖期のうちにトリプシン−ＥＤＴＡ溶液（シグマ社製）を用いて組織培養フラスコより剥がし回収しその一部を新しい組織培養フラスコに移して継代培養した。
【０２０８】
ｂ）遺伝子発現レトロウイルスの作製と安定発現株の樹立
Ｉ型コラーゲンをコートしてある直径１０ｃｍの組織培養シャーレ（旭テクノグラス社製）に２９３−１０Ａ１細胞を２ｘ１０^６個ずつまき、１０ｍｌの１０％ＦＣＳ含有ＲＰＭＩ１６４０培地中で一晩培養した。培養上清を新鮮なＲＰＭＩ１６４０培地２ｍｌに交換した後、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ　２０００（インビトロジェン社製）を添付のプロトコールに従い用いてｐＬＮＣＸ−ＧＷ−ＣＤ３９Ｌ４ベクター約１０μｇを遺伝子導入した。６時間培養後、２０％ＦＣＳ含有ＲＰＭＩ１６４０培地を６ｍｌ加えさらに一晩培養した。培養液を新鮮な２０％ＦＣＳ含有ＲＰＭＩ１６４０培地に交換し、さらに２４時間培養することでウイルスを産生させた。ウイルスを含む培養上清を回収し、ポアサイズ０．４５μｍのフィルター（ＭＩＬＬＥＸ−ＨＶ：ミリポア社製）でろ過し、ろ液に２倍量の新鮮な１０％ＦＣＳ含有ＲＰＭＩ１６４０培地及び最終濃度８μｇ／ｍｌのポリブレン（Ｐｏｌｙｂｒｅｎｅ、別名：Ｈｅｘａｄｉｍｅｔｈｒｉｎｅ　ｂｒｏｍｉｄｅ）（シグマ社製）を加え混合しウイルス感染溶液を調製した。１．２ｘ１０^６個ずつのＮＩＨ３Ｔ３細胞をまいて一晩培養した組織培養シャーレ（４３０２９３：コーニング・コスター社製）にこのウイルス感染溶液を添加し細胞をこのウイルスに感染させた。この感染の手順を１２時間ごとに４回繰り返した。さらに、３日間培養後、非感染細胞すなわち目的遺伝子の発現がない細胞を除去するために、培養液をＧｅｎｅｔｉｃｉｎ（インビトロジェン社製）を５００μｇ／ｍｌ含む１０％ＦＣＳ含有ＲＰＭＩ１６４０培地に交換した。引き続き２〜３日間に１回、培養液を新鮮なＧｅｎｅｔｉｃｉｎ含有培地に交換し７日間培養を継続することにより、目的遺伝子を安定発現する細胞株を樹立した。本細胞株における目的遺伝子の発現は、ｐＬＮＣＸ−ＧＷに挿入した断片を増幅しうるプライマーセット、
５’−ｃｃａａａａｔｇｔｃｇｔａａｃａａｃｔｃ−３’（プライマー３：配列表の配列番号：１１）
５’−ｇａｃｃｔｔｇａｔｃｔｇａａｃｔｔｃｔｃ−３’（プライマー４：配列表の配列番号：１２）
を用いたＲＴ−ＰＣＲによって確認した。プライマー３及びプライマー４はｐＬＮＣＸヌクレオチド配列に基づいて設計されたオリゴヌクレオチドであり、ｐＬＮＣＸに挿入されたＤＮＡ断片を増幅することができる。
【０２０９】
実施例３　フォーカス形成試験
実施例２で樹立したＣＤ３９Ｌ４遺伝子安定発現株及び遺伝子導入を行なわなかったＮＩＨ３Ｔ３細胞株を、トリプシン−ＥＤＴＡ処理により回収し、新鮮培養液で２回洗浄したのち、新鮮培養液で細胞懸濁液を調整し１ウェル当り約１，０００個ずつ１００μｌの容量で９６ウェルプレート（コーニング−コスター社製３５９８）に分注した。同様のウェルをそれぞれ６つずつ作製した。３７℃、５％ＣＯ_２条件下１４日間培養した後１ウェル当りのフォーカス（Ｆｏｃｕｓ）数を測定した。
その結果、対照とした遺伝子を導入しなかったＮＩＨ３Ｔ３細胞株では、１ウェルあたりそれぞれ０．５±０．５（平均±標準偏差）個しかフォーカスを検出できなかったのに対し、ＣＤ３９Ｌ４を発現させた細胞では３６．３±８．０（平均±標準偏差）個のフォーカスが検出され（表１）、ＣＤ３９Ｌ４がフォーカス形質を顕著に惹起する活性を有することが強く示唆された。
【０２１０】
【表１】

【０２１１】
実施例４　コロニー形成試験
樹立したＣＤ３９Ｌ４遺伝子安定発現株及び対照として非遺伝子導入親株を、トリプシン−ＥＤＴＡ処理により回収し、新鮮培地で２回洗浄したのち、１ウェル当り５０，０００個の各細胞を、約３８〜３９℃に暖め、液状化してある０．３３％Ｂａｃｔｏａｇａｒ及び２０％ＦＣＳ含有ＲＰＭＩ１６４０　１ｍｌに懸濁し、これをすばやくあらかじめ０．６６％Ｂａｃｔｏａｇａｒ（Ｄｉｆｃｏ社製）及び２０％ＦＣＳ含有ＲＰＭＩ１６４０を分注固化してある１２ウェルプレート（３５１２：コーニングーコスター社製）に全量分注した。同様のウェルをそれぞれ３つずつ作製した。室温で３０分放置し、Ｂａｃｔｏａｇａｒを完全に固化させたのち、３７℃、５％ＣＯ_２条件下、１７日間培養した後、形成された軟寒天中の増殖コロニー数を測定した
培養後の顕微鏡観察像（ニコン社製ＤＩＡＰＨＯＴＯ３００）を図２に示す。対照としたＮＩＨ３Ｔ３親株では１ウェルあたり２．０±２．０（平均±標準偏差）個しかコロニーを検出できなかったのに対し、ＣＤ３９Ｌ４を発現させた細胞では３３７．０±６０．１（平均±標準偏差）個のコロニーが検出され（表２）、ＣＤ３９Ｌ４がコロニー形成を誘発する活性を有することが強く示唆された。
【０２１２】
【表２】

【０２１３】
実施例５　スフェロイド（ｓｐｈｅｒｏｉｄ）増殖試験
樹立したＣＤ３９Ｌ４遺伝子安定発現株及び遺伝子を導入しなかったＮＩＨ３Ｔ３親株を、トリプシン−ＥＤＴＡ処理により回収し、新鮮培養液で２回洗浄したのち、新鮮培養液で細胞懸濁液を調整し１ウェル当り約１，０００個ずつ２００μｌの容量で細胞非付着性９６ウェルプレート（スフェロイド９６Ｕ：住友ベークライト社製ＭＳ−００９６Ｓ）に分注した。同様のウェルをそれぞれ３つずつ作製した。３７℃、５％ＣＯ_２条件下培養し、培養開始１、４、５、６、７、８、１１日後にプレート上に形成される球状細胞塊（スフェロイド；ｓｐｈｅｒｏｉｄ）を、顕微鏡（ニコン社製ＤＩＡＰＨＯＴＯ３００）下、接眼方眼ミクロメータ（三啓社製：Ｓ−６）を使用して観察しその直径を測定した。
【０２１４】
その結果を表３及び図３に示す。対照とした親株では、スフェロイド直径は一定のままであり、非付着性プレート上でのスフェロイド状態での増殖能は全く認められなかったのに対し、ＣＤ３９Ｌ４を発現させた細胞では、顕著なスフェロイド直径の増加が継時的に観察された。このことからＣＤ３９Ｌ４が、ＮＩＨ３Ｔ３細胞のスフェロイド状態での増殖を誘発することが強く示唆された。
【０２１５】
【表３】

【０２１６】
【発明の効果】
本発明により、ヒトＣＤ３９Ｌ４を用いて、癌細胞を製造することが可能となり、さらに癌の特異的検出も可能となった。また、ＣＤ３９Ｌ４遺伝子を標的とした阻害剤を開発することにより、癌に対する治療及び／または予防効果の極めて高い新規抗癌剤のスクリーニングが可能となった。更に、ＣＤ３９Ｌ４に特異的に結合する抗体は癌の治療及び／予防剤となり得る。
【０２１７】
【配列表フリーテキスト】
配列番号９：ＣＤ３９Ｌ４遺伝子用のＰＣＲプライマー
配列番号１０：ＣＤ３９Ｌ４遺伝子用のＰＣＲアンチセンスプライマー
配列番号１１：ＣＤ３９Ｌ４遺伝子検出用ＲＴ−ＰＣＲセンスプライマー
配列番号１２：ＣＤ３９Ｌ４遺伝子検出用ＲＴ−ＰＣＲ用アンチセンスプライマー
【０２１８】
【配列表】

【図面の簡単な説明】
【図１】発現ベクターｐＬＮＣＸ。
【図２】ＣＤ３９Ｌ４発現株によるコロニー形成図。
【図３】スフェロイド増殖試験。[0001]
TECHNICAL FIELD OF THE INVENTION
The present invention relates to a method for producing cancer cells using an oncogene, a method for detecting cancer using the oncogene, a method for screening for a compound having a cancer therapeutic and / or preventive effect, and a medicament for treating and / or preventing cancer. It relates to a composition and the like.
[0002]
[Prior art]
Cancer remains one of the leading causes of death in developed countries such as Europe, the United States and Japan. Clinically, various medical approaches have been taken, including surgical resection of cancerous tissue, radiation therapy and chemotherapy, but no one based on a sufficiently accurate understanding of malignant transformation and cancer cell growth. Unfortunately, in many cases, the effect is partial and not satisfactory for many patients. With regard to such malignant transformation and cancer cell growth mechanism, intensive research has been carried out in many research facilities over the past several decades. At present, it is thought that the growth of normal cells is controlled by the balance between an oncogene (Oncogene) (proliferation promoting gene) and a tumor suppressor gene (Tumor suppressor gene) (growth inhibitory gene) (for example, Non-patent). Reference 1).
[0003]
Intrinsic oncogenes are not generally effective in causing normal cells to become cancerous in general, but when their regulatory functions are lost due to structural mutations, they are a direct cause of abnormal growth and canceration. It becomes. For example, Ras, which causes cancer by point mutation, and Abl gene, which causes abnormal enhancement of enzyme activity by chromosomal translocation, are examples. In addition, even without mutation, increased expression of an oncogene often triggers canceration. Increased expression of the growth factor receptor HER2 / neu by gene amplification or the like is induced in metastatic breast cancer, and its inhibitor is used for the treatment of metastatic breast cancer. The above facts strongly suggest the working hypothesis that these oncogenes provide extremely valid target molecules as targets for cancer therapy.
[0004]
Among cancer diseases, prostate cancer is the most frequently diagnosed cancer, especially in the United States, and is the second leading cause of cancer death in men. Approximately 300,000 men are newly diagnosed with prostate cancer each year, and more than 40,000 men die from the disease. Although death from prostate cancer is primarily due to metastatic disease, nearly 60% of newly diagnosed patients have primary tumors confined to the prostate. Surgery and radiation therapy are often effective for patients with such localized cancers, but most are incurable for patients with metastatic spread of cancer. Despite intensive research to date, very little is known about the biological mechanisms that cause the development and progression of prostate cancer.
[0005]
Nucleoside triphosphate phosphatase (NTPases) is an enzyme that exists on a cell membrane and hydrolyzes nucleoside diphosphate and triphosphate existing outside the cell in a divalent cation-dependent manner. NTPases are characterized by having four motifs called apyrase conserved regions (ACRs). Among the nucleoside triphosphate phosphatase enzymes, CD39 is one of the most studied molecules. CD39 is reported to be expressed on vascular endothelial cells and inhibit adenosine diphosphate-dependent platelet aggregation. As one of the roles common to a group of enzymes that dephosphorylate nucleoside diphosphate, platelet aggregation inhibition by nucleoside hydrolysis is assumed (for example, see Non-Patent Documents 2 and 3).
[0006]
One of the CD39 family molecules, CD39L4, is a gene identified as a novel NTPase having four ACRs (for example, see Non-Patent Document 4). It has been reported that when this gene is expressed in a human COS-7 cell line, CD39L4 is secreted as a soluble protein, and that the recombinant protein has an enzymatic activity to degrade adenosine diphosphate. It is considered to have an aggregation inhibiting function (for example, see Non-Patent Document 5). On the other hand, a PCPH gene has been discovered as an oncogene activated by treatment with the carcinogen 3-methylcholanthrene from Syrian hamster fetal fibroblasts. The PCPH gene is deleted by a single base pair in the amino acid-encoding region by treatment with a carcinogen, thereby causing a shift in the open reading frame (ORF). As a result, the amino acid sequence of 213 normal PCPHs at the amino terminal side Thus, an abnormal PCPH gene consisting of a 33-base short chain not found in normal PCPH on the carboxy terminal side is produced. It has been reported that this abnormal hamster PCPH transforms NIH3T3 cells (for example, see Non-Patent Document 6). According to the results of comparative analysis so far, although both abnormal PCPH and normal PCPH have NTPase activity, the activity of promoting survival of cells after various stress stimuli is abnormal and strong (see Non-Patent Document 6, for example). In addition, in the abnormal form, persistent phosphorylation of ERK1 that positively controls the growth signal downstream of the oncogene H-Ras has been observed (for example, see Non-Patent Document 7), and its function. Has a difference.
[0007]
Recently, it has been reported that normal human PCPH has a high similarity of 98% to human CD39L4 at the amino acid sequence level, and that it has the same NTPase activity as CD39L4, indicating that PCPH is the same molecule as CD39L4. It was pointed out (for example, see Non-Patent Document 8).
[0008]
Rouzout et al. Analyzed the expression of human PCPH in cancer cell lines by Western blotting and found that, in addition to the normal equivalent of about 47,000 in molecular weight, some cancer cell lines had a size of about 30,000 in molecular weight. Because of the presence of a gene product of small size and the molecular weight of this small size gene product is similar to that of the abnormal type, even in human cancer, abnormal PCPH may cause canceration of human tissues (For example, see Non-Patent Document 9). However, no proof of the cell transforming ability of human PCPH has been made for not only the normal type but also the abnormal type having a small size.
[0009]
As described above, the analysis of the transforming ability of CD39L4 has been performed only on the abnormal CD39L4 of hamster, and its role on normal CD39L4, particularly human normal CD39L4, has not been investigated.
[0010]
[Non-patent document 1]
Yojiro Niitsu and Jun Yokota, “Oncogenes / Cancer Suppressor Genes for Clinicians”, Nankodo, October 15, 1999, p. 1-46
[Non-patent document 2]
"Journal of Biological Chemistry", December 20, 1996, Vol. 271, No. 51, p. 33116-33122
[Non-Patent Document 3]
"Journal of Clinical Investigation", March 15, 1997, Vol. 99, No. 6, p. 1351-1360
[Non-patent document 4]
"Genomics", July 15, 1998, Volume 50, Issue 3, p. 357-357
[Non-Patent Document 5]
"Journal of Biological Chemistry", July 16, 1999, Vol. 274, No. 29, p. 20064-20067
[Non-Patent Document 6]
"Oncogene", January 29, 1999, Younger Brother, Vol. 18, No. 3, p. 689-701
[Non-Patent Document 7]
"Cancer Research", March 15, 2000, Vol. 60, No. 6, p. 1720-1728
[Non-Patent Document 8]
"International Journal of Oncology", December 2001, Vol. 19, No. 6, p. 1249-1254
[Non-Patent Document 9]
"Radiation Research", January 2001, Vol. 155, 1Pt2), p. 181-187
[0011]
[Problems to be solved by the invention]
Cancer cells and genes related to the development and / or proliferation of cancer cells are found, a method for producing cancer cells using the cancer genes is developed, a method for detecting cancer using the cancer genes, cancer treatment and / or An object of the present invention is to provide a method for screening a compound having a prophylactic effect, and a pharmaceutical or pharmaceutical composition for treating and / or preventing cancer.
[0012]
[Means for Solving the Problems]
The present inventors have found that a cancer cell can be produced by overexpressing the CD39L4 gene, and a method for detecting cancer using CD39L4 and a compound having a novel cancer treatment and / or cancer prevention effect. The present invention was completed by developing a screening method and providing a substance that suppresses the expression of CD39L4.
That is, the present invention
(1) A method for producing a cancer cell, comprising the following steps 1) and 2):
1) a step of transforming a cell with the polynucleotide according to any one of the following (1) to (5);
(1) a polynucleotide having a nucleotide sequence represented by nucleotide numbers 247 to 1533 of SEQ ID NO: 1 in the sequence listing,
(2) a polynucleotide having a nucleotide sequence represented by nucleotide numbers 247 to 1533 of SEQ ID NO: 3 in the sequence listing,
(3) a polynucleotide having a nucleotide sequence represented by nucleotide numbers 283 to 1569 of SEQ ID NO: 5 in the sequence listing,
(4) a polynucleotide having a nucleotide sequence represented by nucleotide numbers 398 to 1621 of SEQ ID NO: 7 in the sequence listing,
(5) a protein that hybridizes under stringent conditions to a polynucleotide consisting of a nucleotide sequence complementary to the polynucleotide according to any one of (1) to (4) above, and a protein substantially identical to CD39L4; A polynucleotide consisting of the encoding nucleotide sequence,
2) a step of selecting a cell line in which the cell proliferation ability has changed in step 1);
(2) The method for producing a cancer cell according to (1), wherein the cell is an animal cell;
(3) The method for producing a cancer cell according to (2), wherein the animal cell is derived from a mammal.
(4) The method for producing a cancer cell according to (3), wherein the mammal is a human, monkey, mouse, or rat;
(5) The method for producing a cancer cell according to (3), wherein the mammal is a human.
(6) The method for producing a cancer cell according to (1), wherein the cell is a mouse fibroblast cell line NIH3T3 cell,
(7) The method for producing a cancer cell according to any one of (1) to (6), wherein the cell is transformed with a recombinant vector.
(8) a cancer cell obtained by the method for producing a cancer cell according to any one of (1) to (7),
(9) a non-human mammal into which the cancer cell according to (8) has been introduced,
(10) A method for detecting cancer, comprising the step of analyzing the expression level of the polynucleotide according to any one of the following 1) to 5) in a sample collected from a subject or a test animal:
1) a polynucleotide having a nucleotide sequence represented by nucleotide numbers 247 to 1533 of SEQ ID NO: 1 in the sequence listing,
2) a polynucleotide having a nucleotide sequence represented by nucleotide numbers 247 to 1533 of SEQ ID NO: 3 in the sequence listing;
3) a polynucleotide having a nucleotide sequence represented by nucleotide numbers 283 to 1569 in SEQ ID NO: 5 in the sequence listing;
4) a polynucleotide having a nucleotide sequence represented by nucleotide numbers 398 to 1621 in SEQ ID NO: 7 in the sequence listing;
5) a nucleotide that hybridizes under stringent conditions to a polynucleotide consisting of a nucleotide sequence complementary to the polynucleotide of any one of 1) to 4) above and encodes a protein substantially identical to CD39L4 A polynucleotide consisting of a sequence,
(11) A method for detecting cancer, comprising a step of analyzing the expression level of the protein according to any one of the following 1) to 5) in a sample collected from a subject or a test animal:
1) a protein comprising an amino acid sequence represented by amino acid numbers 1 to 428 of SEQ ID NO: 2 in the sequence listing;
2) a protein having an amino acid sequence represented by amino acid numbers 1 to 428 of SEQ ID NO: 4 in the sequence listing;
3) a protein having an amino acid sequence represented by amino acid numbers 1 to 428 of SEQ ID NO: 6 in the sequence listing;
4) a protein having the amino acid sequence of amino acids 1 to 407 of SEQ ID NO: 8 in the sequence listing;
5) An amino acid sequence of the protein according to any one of the above steps 1) to 4), wherein the protein comprises an amino acid sequence in which one or several amino acids have been deleted, substituted or added, and is substantially the same as CD39L4. Protein,
(12) A method for detecting cancer, comprising the following steps 1) to 4):
1) a step of extracting a total RNA fraction from a specimen collected from a subject or a test animal;
2) a step of extracting a total RNA fraction from a specimen collected from a normal human or a normal animal;
3) The expression level of the polynucleotide described in any one of the following (1) to (5) in the total RNA fraction derived from the above step 1) and the total RNA fraction derived from the above step 2) is measured. Process;
(1) a polynucleotide having a nucleotide sequence represented by nucleotide numbers 247 to 1533 of SEQ ID NO: 1 in the sequence listing,
(2) a polynucleotide having a nucleotide sequence represented by nucleotide numbers 247 to 1533 of SEQ ID NO: 3 in the sequence listing,
(3) a polynucleotide having a nucleotide sequence represented by nucleotide numbers 283 to 1569 of SEQ ID NO: 5 in the sequence listing,
(4) a polynucleotide having a nucleotide sequence represented by nucleotide numbers 398 to 1621 of SEQ ID NO: 7 in the sequence listing,
(5) From a nucleotide sequence that hybridizes under stringent conditions with a polynucleotide consisting of a nucleotide sequence complementary to the polynucleotide described in (1) to (4) above and encodes a protein substantially identical to CD39L4. A polynucleotide comprising;
4) Analyze the difference in the expression level of the polynucleotide measured in the above step 3) between the total RNA fraction derived from the above step 1) and the total RNA fraction derived from the above step 2). A step of detecting cancer in a subject or a test animal according to,
(13) A method for detecting cancer, comprising the following steps 1) to 3):
1) a step of measuring the expression level of the protein according to any one of the following (1) to (5) in a sample collected from a subject or a test animal;
(1) a protein comprising an amino acid sequence represented by amino acid numbers 1 to 428 of SEQ ID NO: 2 in the sequence listing,
(2) a protein comprising an amino acid sequence represented by amino acid numbers 1 to 428 of SEQ ID NO: 4 in the sequence listing,
(3) a protein comprising an amino acid sequence represented by amino acid numbers 1 to 428 of SEQ ID NO: 6 in the sequence listing,
(4) a protein comprising an amino acid sequence represented by amino acid numbers 1 to 407 of SEQ ID NO: 8 in the sequence listing,
(5) An amino acid sequence of the protein according to any one of the above (1) to (4), wherein the protein has an amino acid sequence in which one or several amino acids have been deleted, substituted or added, and is substantially equivalent to CD39L4. The same protein,
2) a step of measuring the expression level of the protein according to any one of (1) to (5) of the above step 1) in a sample collected from a normal human or a normal animal;
3) analyzing the difference between the expression level of the protein measured in the step 1) and the expression level of the protein measured in the step 2), and detecting cancer in the subject or the test animal;
(14) A method for screening a substance having a therapeutic and / or prophylactic effect on cancer, comprising the following steps 1) to 4):
1) a step of extracting a total RNA fraction from cultured cells derived from mammals cultured in a medium to which a test substance has been added;
2) Step of extracting total RNA fraction from mammalian-derived cultured cells cultured without adding a test substance:
3) The expression level of the polynucleotide described in any one of the following (1) to (5) in the total RNA fraction derived from the above step 1) and the total RNA fraction derived from the above step 2) is measured. Process;
(1) a polynucleotide having a nucleotide sequence represented by nucleotide numbers 247 to 1533 of SEQ ID NO: 1 in the sequence listing,
(2) a polynucleotide having a nucleotide sequence represented by nucleotide numbers 247 to 1533 of SEQ ID NO: 3 in the sequence listing,
(3) a polynucleotide having a nucleotide sequence represented by nucleotide numbers 283 to 1569 of SEQ ID NO: 5 in the sequence listing,
(4) a polynucleotide having a nucleotide sequence represented by nucleotide numbers 398 to 1621 of SEQ ID NO: 7 in the sequence listing,
(5) From a nucleotide sequence that hybridizes under stringent conditions with a polynucleotide consisting of a nucleotide sequence complementary to the polynucleotide described in (1) to (4) above and encodes a protein substantially identical to CD39L4. A polynucleotide comprising
4) Analyze the difference in the expression level of the polynucleotide measured in the above step 3) between the total RNA fraction derived from the above step 1) and the total RNA fraction derived from the above step 2). A step of determining a therapeutic effect and / or a preventive effect on cancer;
(15) A method for screening a substance having a therapeutic and / or prophylactic effect for cancer, comprising the following steps 1) to 4):
1) a step of extracting a total RNA fraction from a specimen collected from a mammalian individual to which the test substance has been administered;
2) a step of extracting a total RNA fraction from a specimen collected from a mammal individual to which the test substance has not been administered;
3) The expression level of the polynucleotide described in any one of the following (1) to (5) in the total RNA fraction derived from the above step 1) and the total RNA fraction derived from the above step 2) is measured. Process;
(1) a polynucleotide having a nucleotide sequence represented by nucleotide numbers 247 to 1533 of SEQ ID NO: 1 in the sequence listing,
(2) a polynucleotide having a nucleotide sequence represented by nucleotide numbers 247 to 1533 of SEQ ID NO: 3 in the sequence listing,
(3) a polynucleotide having a nucleotide sequence represented by nucleotide numbers 283 to 1569 of SEQ ID NO: 5 in the sequence listing,
(4) a polynucleotide having a nucleotide sequence represented by nucleotide numbers 398 to 1621 of SEQ ID NO: 7 in the sequence listing,
(5) From a nucleotide sequence that hybridizes under stringent conditions with a polynucleotide consisting of a nucleotide sequence complementary to the polynucleotide described in (1) to (4) above and encodes a protein substantially identical to CD39L4. A polynucleotide comprising;
4) Analyze the difference in the expression level of the polynucleotide measured in the above step 3) between the total RNA fraction derived from the above step 1) and the total RNA fraction derived from the above step 2), and analyze the cancer of the test substance. Determining the therapeutic and / or preventive effect on
(16) A method for screening a substance having a therapeutic and / or prophylactic effect for cancer, comprising the following steps 1) to 3):
1) a step of measuring the expression level of a protein according to any one of the following (1) to (5) in cultured cells derived from a mammal cultured in a medium to which a test substance is added;
(1) a protein comprising an amino acid sequence represented by amino acid numbers 1 to 428 of SEQ ID NO: 2 in the sequence listing,
(2) a protein comprising an amino acid sequence represented by amino acid numbers 1 to 428 of SEQ ID NO: 4 in the sequence listing,
(3) a protein comprising an amino acid sequence represented by amino acid numbers 1 to 428 of SEQ ID NO: 6 in the sequence listing,
(4) a protein comprising an amino acid sequence represented by amino acid numbers 1 to 407 of SEQ ID NO: 8 in the sequence listing,
(5) An amino acid sequence of the protein according to any one of the above (1) to (4), wherein the protein has an amino acid sequence in which one or several amino acids have been deleted, substituted or added, and is substantially equivalent to CD39L4. A protein identical to
2) a step of measuring the expression level of the protein according to any one of (1) to (5) in the above step 1) in cultured cells derived from a mammal cultured in a medium to which a test substance is not added;
3) Analyze the difference between the expression level of the protein measured in step 1) and the expression level of the protein measured in step 2) to determine the therapeutic and / or prophylactic effect of the test substance on cancer. Process,
(17) A method for screening a substance having a therapeutic and / or prophylactic effect for cancer, comprising the following steps 1) to 3):
1) a step of measuring the expression level of the protein according to any one of the following (1) to (5) in a sample collected from a mammalian individual to which the test substance has been administered;
(1) a protein comprising an amino acid sequence represented by amino acid numbers 1 to 428 of SEQ ID NO: 2 in the sequence listing,
(2) a protein comprising an amino acid sequence represented by amino acid numbers 1 to 428 of SEQ ID NO: 4 in the sequence listing,
(3) a protein comprising an amino acid sequence represented by amino acid numbers 1 to 428 of SEQ ID NO: 6 in the sequence listing,
(4) a protein comprising an amino acid sequence represented by amino acid numbers 1 to 407 of SEQ ID NO: 8 in the sequence listing,
(5) An amino acid sequence of the protein according to any one of the above (1) to (4), wherein the protein has an amino acid sequence in which one or several amino acids have been deleted, substituted or added, and is substantially equivalent to CD39L4. A protein identical to
2) a step of measuring the expression level of the protein according to any one of (1) to (5) in the above step 1) in a sample collected from a mammal individual to which the test substance has not been administered;
3) Analyze the difference between the expression level of the protein measured in step 1) and the expression level of the protein measured in step 2) to determine the therapeutic and / or prophylactic effect of the test substance on cancer. Process,
(18) The screening method according to (14) or (16), wherein the cultured mammalian cell is the cancer cell according to (8).
(19) The screening method according to (15) or (17), wherein the mammal individual is the non-human mammal according to (9).
(20) A kit for determining the therapeutic and / or prophylactic effect of a test substance on cancer and / or detecting cancer, comprising at least one or more selected from the group consisting of the following 1) to 3):
1) A continuous oligonucleotide having a length of 15 to 30 bases for specifically amplifying at least one of the polynucleotides consisting of the nucleotide sequences selected from the groups shown in SEQ ID NOs: 1, 3, 5 and 7 in the sequence listing Primer;
2) for hybridizing under stringent conditions to at least one of the polynucleotides consisting of the nucleotide sequences selected from the groups shown in SEQ ID NOs: 1, 3, 5 and 7 in the sequence listing under stringent conditions to detect the polynucleotides A continuous polynucleotide probe of 15 nucleotides or more;
3) a polynucleotide having the nucleotide sequence of nucleotides 177 to 1031 of SEQ ID NO: 1 in the sequence listing, a polynucleotide having the nucleotide sequence of nucleotides 131 to 985 of SEQ ID NO: 3, and nucleotide 55 of SEQ ID NO: 5 Immobilized sample on which at least one polynucleotide selected from the group consisting of a polynucleotide consisting of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NOs: 909 and 909 and a nucleotide sequence consisting of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 7 to 941 is immobilized ,
(21) A kit for determining a therapeutic effect and / or a preventive effect of a test substance on cancer and / or detecting cancer, comprising at least one of the following 1) and 2):
1) an antibody that specifically binds to a protein consisting of an amino acid sequence selected from the group shown in SEQ ID NOs: 2, 4, 6, and 8 in the sequence listing, and detects the protein;
2) a secondary antibody capable of binding to the antibody of 1) above;
(22) The method for measuring the expression level of a polynucleotide is a Northern blot method, a dot blot method, a slot blot method, RT-PCR, a ribonuclease protection assay or a run-on assay, (10), ( 12), (14), (15), (18) and (19), the method for measuring the expression level of a polynucleotide is complementary to animal tissue or animal cell-derived complementary method. (10), (12), (14), (15), (18), and (10), wherein a gene chip or an array prepared from a DNA group or a DNA comprising a partial sequence of each DNA of the DNA group is used. The method according to any one of (19),
(24) (11), (13), (17), (18), and (19), wherein the method of measuring the expression level of the protein uses an antibody or a ligand that specifically binds to the protein. The method according to any one of
(25) (11), (13), wherein the method for measuring the expression level of the protein is Western blotting, dot blotting, slot blotting, or enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). (17) The method according to any one of (18) and (19),
(26) A medicament for treating and / or preventing cancer comprising an oligonucleotide having at least one nucleotide sequence selected from the group consisting of the following 1) to 3) or a nucleotide sequence complementary to a partial sequence of the sequence: Composition:
1) a nucleotide sequence represented by nucleotide numbers 247 to 1533 of SEQ ID NO: 1 in the sequence listing;
2) a nucleotide sequence represented by nucleotide numbers 247 to 1533 of SEQ ID NO: 3 in the sequence listing;
3) a nucleotide sequence represented by nucleotide numbers 283 to 1569 of SEQ ID NO: 5 in the sequence listing;
A nucleotide sequence represented by nucleotide numbers 398 to 1621 of SEQ ID NO: 7 in the sequence listing.
(27) a pharmaceutical composition for treating and / or preventing cancer, comprising an antibody that specifically recognizes CD39L4;
Consists of
[0013]
BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION
As used herein, the compound having a cancer therapeutic and / or cancer preventive effect refers to a compound having an activity of inhibiting the growth of cancer, an activity of reducing cancer, and / or an activity of preventing the occurrence of cancer. . In this specification, “cancer” and “tumor” are used interchangeably. In this specification, the term "gene" includes not only DNA but also its mRNA, cDNA and its cRNA. Therefore, the “CD39L4 gene” in the present invention includes CD39L4 DNA, mRNA, cDNA and cRNA. In the present specification, the term "polynucleotide" is used synonymously with nucleic acid, and also includes DNA, RNA, probes, oligonucleotides, and primers. In the present specification, "polypeptide" and "protein" are used without distinction. Further, in the present specification, the “RNA fraction” refers to a fraction containing RNA. In addition, in the present specification, “cells” include cells in animal individuals and cultured cells. As used herein, "cancer of a cell" refers to a cell exhibiting abnormal proliferation, such as a cell losing sensitivity to a contact inhibition phenomenon, or exhibiting anchorage-independent proliferation, Cells showing such abnormal growth are called "cancer cells". As used herein, “substantially the same protein” as CD39L4 refers to a protein having the same function as CD39L4, such as a cell carcinogenic activity. The term oncogene in the present invention includes proto-oncogene and proto-oncogene in addition to oncogene.
[0014]
1. Acquisition of CD39L4 gene
The nucleotide sequence of the cDNA of human CD39L4 used in the present invention is shown in, for example, any one of SEQ ID NOs: 1, 3, 5, and 7 in the sequence listing. The amino acid sequence of human CD39L4 is shown in, for example, any of SEQ ID NOs: 2, 4, 6, and 8 in the sequence listing. In addition, accession number: AF039918 (version: AF03998.1), accession number: NM_001249 (version: NM_001249.1), accession number: AF136572 (version: AF136572. 1) and accession number: Nucleotide sequence GenBank of human CD39L4 cDNA Session number: BC020966.1 (version: BC020966.1). That is, in the present specification, the “CD39L4 gene” refers to a gene consisting of the nucleotide sequence of any one of SEQ ID NOs: 1, 3, 5, and 7 in the sequence listing, or a gene consisting of the nucleotide sequence. A gene that hybridizes with a polynucleotide consisting of a complementary nucleotide sequence under stringent conditions and encodes a protein having the same biological activity as CD39L4. In the present specification, “CD39L4” refers to a protein consisting of the amino acid sequence of any one of SEQ ID NOs: 2, 4, 6, and 8 in the sequence listing, or 1% in the amino acid sequence of the protein. Alternatively, it refers to a protein consisting of an amino acid sequence in which several amino acids have been deleted, substituted or added, and having the same biological activity as CD39L4.
[0015]
The CD39L4 gene can be obtained by the following method.
(1) When using a human cDNA library
A full-length cDNA is obtained from a cDNA library expressing the CD39L4 gene according to a known method such as a colony hybridization method. Using this full-length cDNA as a template, a human CD39L4 cDNA can be obtained by a PCR method. As the cDNA library, for example, a cDNA library derived from human prostate cancer, human lung cancer, human breast cancer, human stomach cancer, human colorectal cancer, human malignant melanoma, human pancreatic cancer, and each non-cancerous normal tissue can be used. Can be. As commercially available human cDNA libraries, Prostate-Leiomyosarcoma cDNA (Invitrogen: 11598-018), Fetal Brain cDNA (Invitrogen: 10662-013), Marathon-Ready cDNA, Normal Prostate, -Coloed: -74 1-1) can be used or can be prepared by itself. In addition, CD39L4 cDNA can also be obtained by directly performing PCR using the cDNA library as a template. Any PCR primer may be used as long as it can amplify CD39L4 cDNA, and an appropriate primer can be selected by a known method. As a PCR primer for amplifying CD39L4 cDNA, for example, an oligonucleotide having the following nucleotide sequence can be selected.
5′-caccatggccactctttggggcaca-3 ′ (primer 1: SEQ ID NO: 9 in the sequence listing) and
5′-tcaatgggagatgcccagaga-3 ′ (primer 2: SEQ ID NO: 10 in Sequence Listing).
[0016]
The following method can be mentioned as a method for preparing cDNA.
[0017]
When extracting a total RNA fraction from blood, various tissues, and organs taken from humans, a solvent for extracting RNA from blood, various tissues, and organs (including a component having an action to inactivate ribonuclease such as phenol) It is preferred to dissolve directly in Alternatively, the cells in the tissue are carefully scraped with a scraper or gently extracted from the tissue using a protease such as trypsin so as not to destroy the cells in the tissue. Then, the process proceeds to the RNA fraction extraction step.
[0018]
Examples of the method for extracting the RNA fraction include guanidine thiocyanate / cesium chloride ultracentrifugation, guanidine thiocyanate / hot phenol method, guanidine hydrochloride method, guanidine thiocyanate / phenol / chloroform method (Chomczynski, P. and Sacchi, N.C. , (1987) Anal. Biochem., 162, 156-159), but the guanidine acid thiocyanate-phenol-chloroform method is preferred. In addition, commercially available reagents for RNA extraction (for example, ISOGEN (manufactured by Nippon Gene), TRIzol reagent (manufactured by Invitrogen)) and the like can be used according to the protocol attached to the reagent. For example, a total RNA fraction can be extracted from a human prostate cancer cell line LNCaP (American Tissue Culture Collection ATCC No .: CRL-1740) using a TRIzol reagent.
[0019]
It is preferable that the obtained total RNA fraction is further purified and used only for mRNA if necessary. Although the purification method is not particularly limited, it is known that many mRNAs present in the cytoplasm of eukaryotic cells have a poly (A) sequence at the 3′-terminal. The mRNA is adsorbed on the oligo (dT) probe thus obtained, and the mRNA is captured on the paramagnetic particles on which streptavidin is immobilized using the binding between biotin / streptavidin, and after washing, the mRNA is eluted. , MRNA can be purified. Alternatively, a method in which mRNA is adsorbed on an oligo (dT) cellulose column and then eluted and purified may be employed. Further, mRNA can be further fractionated by sucrose density gradient centrifugation or the like.
[0020]
cDNA can be synthesized by a known method using reverse transcriptase (Reverse transcriptase) using total RNA or mRNA as a template. For example, Omniscript Reverse Transcriptase (QIAGEN) ) Can be used in accordance with the attached protocol to synthesize cDNA. For the obtained cDNA, PCR primers specific to the amplification of the CD39L4 gene (for example, an oligonucleotide primer consisting of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 9 and an oligonucleotide primer consisting of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 10 in the sequence listing) CD39L4 cDNA can be obtained by performing PCR using the combination. PCR can be performed under ordinary reaction conditions.
[0021]
Anyone having ordinary knowledge in the technical field to which the present invention pertains may substitute a part of the natural nucleotide sequence of the human CD39L4 gene with another nucleotide, or delete or add a nucleotide to the nucleotide, thereby modifying the nucleotide sequence. It is possible to prepare a polynucleotide having the same biological activity as that of the natural CD39L4 gene, which promotes cell carcinogenesis. Thus, a polynucleotide having a nucleotide sequence in which a nucleotide has been substituted, deleted, or added in a natural nucleotide sequence and showing expression fluctuation equivalent to that of the natural CD39L4 gene can also be used in the present invention. Modification of the nucleotide sequence includes, for example, introduction of a deletion by a restriction enzyme or DNA exonuclease, mutagenesis by a site-directed mutagenesis method, modification of the nucleotide sequence by a PCR method using a mutation primer, direct introduction of a synthetic mutant DNA, and the like. It can be done by a method. Alternatively, a polynucleotide that hybridizes with a polynucleotide consisting of a nucleotide sequence complementary to the CD39L4 gene under stringent conditions and has the same cancer cell growth activity as CD39L4 can be used.
[0022]
In the present invention, “hybridize under stringent conditions” refers to hybridization at 68 ° C. in a commercially available hybridization solution ExpressHyb Hybridization Solution (manufactured by Clontech), or using a DNA-immobilized filter. After hybridization at 68 ° C. in the presence of 0.7-1.0 M NaCl, 0.1-fold concentration SSC solution (1x concentration SSC is composed of 150 mM NaCl and 15 mM sodium citrate). As used herein, refers to hybridization under conditions that can be identified by washing at 68 ° C. or under conditions equivalent thereto.
[0023]
2. Expression of CD39L4 gene
In order to express the CD39L4 gene in an animal individual, a method of incorporating the obtained full-length cDNA into a viral vector and administering it to an animal can be mentioned. Examples of the method of gene transfer using a viral vector include a method of incorporating cDNA into a retrovirus, an adenovirus, an adeno-associated virus, a herpes virus, a vaccinia virus, a pox virus, a polio virus, or another DNA virus, or an RNA virus to introduce cDNA. . Among them, a method using a retrovirus, an adenovirus, an adeno-associated virus, and a vaccinia virus is preferable.
[0024]
Examples of non-viral gene transfer methods include a method of directly administering an expression plasmid intramuscularly (DNA vaccine method), a liposome method, a lipofection method, a microinjection method, a calcium phosphate method, an electroporation method, and the like. The DNA vaccine method and the liposome method are preferred.
[0025]
In addition, cells that differentiate full-length cDNA into muscle cells, hepatocytes, adipocytes, prostate cells or muscle cells, hepatocytes, adipocytes derived from humans, mice, rats, etc., for cultured cells (eg, fibroblasts) Can be introduced into cells and highly expressed to examine the functions of each target cell, specifically, what effects appear on cell morphology or cell differentiation such as canceration of cells. . Conversely, an antisense nucleic acid against the gene to be tested can be introduced into cells, and the effect on the function, morphology or differentiation of each target cell can be examined.
[0026]
In introducing the full-length cDNA into an animal or a cell, the cDNA is incorporated into a vector containing an appropriate promoter and a sequence involved in expression of a gene, and a host cell is transformed with the vector. As a vertebrate cell expression promoter, those having a promoter, an RNA splice site, a polyadenylation site, and a transcription termination sequence, which are usually located upstream of the gene to be expressed, can be used. May be provided. Examples of the expression vector include pSV2dhfr having an early promoter of SV40 (Subramani, S. et al. (1981) Mol. Cell. Biol. 1, 854-864), retrovirus vectors pLNCX, pLNSX, pLXIN, pSIR ( Clontech) and the like, but are not limited thereto. The expression vector is prepared by a diethylaminoethyl (DEAE) -dextran method (Luthman, H. and Magnusson, g. (1983) Nucleic Acids Res, 11, 1295-1308), a calcium phosphate-DNA coprecipitation method (Graham, FL. and van der Eb, AJ (1973) Virology 52, 456-457), electric pulse drilling (Neumann, E. et al. (1982) EMBO J. 1, 841-845), or Lipofectamine 2000 (Invitrogen) ), Lipofectamine PLUS (Invitrogen), DMRIE-C Reagent (Invitrogen), FuGENE6 (Roche Diagnostics) COS cells or mouse fibroblast cell line NIH3T3 (ATCC No .: CRL-1658) or the like, or in the case of a retroviral vector, a packaging cell line such as 293-10A1 (IMGENEX) or PT67 (Clontech), or 293 cells (Takara Shuzo) or NIH3T3 cells together with a packaging plasmid such as pCL-10A1 or pCL-Eco (IMGENEX) ( Co-transfected) to produce a virus, which is then infected with COS cells, mouse fibroblast NIH3T3, etc., to obtain the desired transformed cells.
[0027]
It is also possible to prepare knockout animals in which the target gene is disrupted in normal animals by genetic manipulation, and to examine what effects appear on tumor development and / or tumor growth mechanisms. Conversely, it is also possible to examine the function of CD39L4 by preparing a transgenic animal so that the gene of interest is highly expressed in an animal having a tumor and observing the morphological change of the tumor. The transgenic animal can be obtained by obtaining a fertilized egg from the animal, transferring the gene, transplanting the animal into a pseudopregnant animal, and developing the animal. The procedure is known in the art (Developmental Engineering Experiment Manual (Tatsuji Nomura Supervision, edited by Motoya Katsuki, published in 1987), and JP-A-5-48093). Specifically, for example, in the case of a mouse, first, an ovulation-inducing agent is administered to a female mouse, then mated with a male of the same strain, and the pronuclear fertilized egg is collected from the oviduct of the female mouse the next day. Next, the DNA fragment solution to be introduced is injected into the pronucleus of a fertilized egg using a micro glass tube. Regulatory genes such as promoters and enhancers for expressing the gene to be introduced in animal cells are not particularly limited as long as they function in the cell of the introduced animal. The fertilized egg into which the DNA has been injected is transplanted into the oviduct of a pseudopregnant foster female mouse (Slc: ICR, etc.), and is born about 20 days later by spontaneous delivery or cesarean section.
[0028]
As a method for confirming that the thus obtained animal carries the transgene, for example, DNA is extracted from the tail of the animal, and the DNA is extracted using specific sense and antisense primers. After digesting the DNA with a restriction enzyme, gel electrophoresis, blotting the DNA in the gel onto a nylon membrane or the like, and performing Southern blot analysis using all or a part of the labeled transgene as a probe Methods and the like can be mentioned.
[0029]
3. Method for producing cancer cells using CD39L4 gene
Whether a gene of interest can function as an oncogene, that is, whether it has a malignant trait, depends on the sensitivity to contact inhibition in a cell line in which the gene is expressed, or whether it is anchorage-independent. It can be examined by the presence or absence of proliferation (Anchorage independent growth) and the like (Jun Yokota, Masaru Yamamoto, Bio Manual UP Series Cancer Research Protocol Yodosha 168-174 (1995.10.15)). Genes that cause a loss of susceptibility to the inhibitory phenomenon or exhibit anchorage-independent growth can be called oncogenes.
[0030]
For example, when the CD39L4 gene is overexpressed in the mouse fibroblast cell line NIH3T3 cell line, the above-described loss of sensitivity to contact inhibition ability and anchorage-independent growth are confirmed, and the CD39L4 gene may function as an oncogene. It became clear. In many cases, injection of NIH3T3 cells overexpressing an oncogene into a nude mouse forms a tumor at the injection site, so that a cell line overexpressing the CD39L4 gene can also be used for tumorigenesis experiments.
[0031]
That is, cancer cells can be produced by using the CD39L4 gene. Examples of the method for producing a cancer cell include a method for producing a cancer cell including the following steps 1) and 2).
1) a step of transforming a cell with the polynucleotide according to any one of the following (1) to (5);
(1) a polynucleotide having a nucleotide sequence represented by nucleotide numbers 247 to 1533 of SEQ ID NO: 1 in the sequence listing,
(2) a polynucleotide having a nucleotide sequence represented by nucleotide numbers 247 to 1533 of SEQ ID NO: 3 in the sequence listing,
(3) a polynucleotide having a nucleotide sequence represented by nucleotide numbers 283 to 1569 of SEQ ID NO: 5 in the sequence listing,
(4) a polynucleotide having a nucleotide sequence represented by nucleotide numbers 398 to 1621 of SEQ ID NO: 7 in the sequence listing,
(5) a protein that hybridizes under stringent conditions to a polynucleotide consisting of a nucleotide sequence complementary to the polynucleotide according to any one of (1) to (4) above, and a protein substantially identical to CD39L4; A polynucleotide consisting of the encoding nucleotide sequence,
2) A step of selecting a cell line having a change in proliferation ability from the cells described in 1).
[0032]
In the cell transformation in the above step 1), cells in an animal individual can be transformed to generate cancer cells in the animal individual, or cultured cells can be transformed into cancer cells. . Cell transformation can be performed using animals or cultured cells, for example, by the method described in the section “2. Expression of CD39L4 gene” above.
[0033]
The change in the proliferation ability of the cell in the step 2) means that the transformed cell loses the sensitivity to the phenomenon of cell contact inhibition or exhibits anchorage-independent growth. Changes in the cell growth ability also indicate that the number of foci was significantly increased in the transformed cells compared to the untransformed cells in the foci formation test described below, and the number of colonies in the colony formation test was It can also be confirmed by a remarkable increase and / or a remarkable increase in the diameter of the spheroid in the spheroid proliferation test, but as long as the change in cell proliferation ability can be examined. Are not limited to these methods. A cell line in which the proliferation ability of the cell has changed can be selected as a cancer cell.
[0034]
In addition, a cell line that overexpresses CD39L4 has one or more of the following properties (1) to (3).
(1) Focus formation
Normally, normal fibroblasts such as NIH3T3 do not overlap even if they proliferate and become dense, and the growth stops when a monolayer is formed. On the other hand, transformed cells and cancer cells have lost their susceptibility to the contact inhibition phenomenon and can continue to grow while overlapping, forming a layered cell population and forming a monolayer of cells. Has the property of creating a high-density cell mass, Focus, in the spread of the cell (Jun Yokota, Masaru Yamamoto, Bio Manual UP Series Cancer Research Protocol Yodosha 168-174 (Oct. 15, 1995) Since this phenomenon is observed, for example, when a cultured cell is infected with a cancer virus, it may be used not only for quantification of the cancer virus (Fundamental Technologies in Virology, Academic Press (1969)). ), P198-211), a DNA fragment containing an oncogene derived from a virus or a cell. Since it can be observed by transfecting cells, it is used for screening for oncogenes and tumor suppressor genes.
[0035]
A cell line in which the CD39L4 gene is overexpressed and a cell line in which the CD39L4 gene is not overexpressed are cultured by a usual method, and replaced with a fresh culture solution. After dispensing and culturing for a certain time, the number of focuses per well is measured. Statistical processing is performed after totaling the number of focuses per well, and the average number of focuses and standard deviation per well are calculated.
[0036]
It is observed that the number of foci is significantly increased in NIH3T3 cells overexpressing the CD39L4 gene as compared with cells not overexpressing the CD39L4 gene.
[0037]
(2) Colony formation test
Normal cells, with the exception of blood cells, are known to be unable to proliferate without an attached scaffold. In contrast, transformed cells and cancer cells have the property of being able to proliferate without a scaffold. This characteristic change can be easily examined by the formation of a proliferating colony in a soft agar medium (Jun Yokota, Masaru Yamamoto, Bio Manual UP Series Cancer Research Protocol Yodosha 168-174 (Oct. 1995) Published on March 15).
[0038]
A cell line in which the CD39L4 gene is overexpressed and a cell line in which the CD39L4 gene is not overexpressed are cultured by a usual method, replaced with a fresh culture solution, and then replaced with a soft agar medium (for example, 0.33% Bactogar (manufactured by Difco)). % RPMS containing RPMI 1640) and overlay on an agar medium (eg, RPMI 1640 containing 0.66% Bactogar and 20% FCS). Under normal conditions (eg, 37 ° C, 5% CO ₂ ), And the number of proliferating colonies in the formed soft agar is measured. When culturing is performed using a multiwell plate (for example, 12-well plate: 3512 manufactured by Corning-Costar), the number of colonies per well is measured after culturing for a certain period of time. After totaling the number of colonies per well, statistical processing is performed, and the average number of colonies per standard and the standard deviation are calculated.
[0039]
It is observed that the number of colonies is remarkably increased in the NIH3T3 cell line overexpressing the CD39L4 gene, as compared with the cells not overexpressing the CD39L4 gene.
[0040]
(3) Spheroid proliferation test
The characteristic of anchorage-independent growth of transformed cells and cancer cells can also be easily evaluated by culturing in a spheroid state. Spheroids are aggregates of a large number of cells and can be easily formed by culturing on a culture plate in which cell adhesion is extremely low. Culture in a spheroid state is different from ordinary monolayer culture, and is similar to culture in an anchorage-independent state, as shown in (2) of 3 above, and functions under conditions close to in vivo. It can be observed (Sumitomo Bakelite Co., Ltd., SUMILON physical and chemical instrument general catalog).
[0041]
A cell line in which the CD39L4 gene is overexpressed and a cell line in which the CD39L4 gene is not overexpressed are cultured by a usual method, replaced with a fresh culture solution, and a cell non-adhesive multiwell plate (for example, spheroid 96U: MS manufactured by Sumitomo Bakelite Co., Ltd.) -0096S). Under normal conditions (eg, 37 ° C, 5% CO ₂ ), And the size of spheroids formed on the plate is measured after a certain period of time from the start of the culture. The size of the spheroid can be measured using, for example, an ocular micrometer (S-6, manufactured by Sankeisha) under a microscope, and the diameter of the spheroid can be used as an index of the size of the spheroid.
[0042]
In the NIH3T3 cell line overexpressing the CD39L4 gene, a remarkable increase in the diameter of the spheroid is observed as compared with the cells not overexpressing the CD39L4 gene.
[0043]
4. Tumor marker gene
CD39L4 is thought to be involved in canceration of cells and / or proliferation of cancer cells. Therefore, by measuring the expression level of CD39L4 in each cell and / or each tissue, it is possible to determine the state of canceration and / or proliferation of cancer cells caused by overexpression of CD39L4. Such cancers include, for example, prostate cancer, testicular cancer, penis cancer, bladder cancer, kidney cancer, oral cancer, pharyngeal cancer, lip cancer, tongue cancer, gingival cancer, nasopharyngeal cancer, esophageal cancer, gastric cancer, small intestine cancer , Colorectal cancer, colon cancer, liver cancer, gallbladder cancer, pancreatic cancer, nasal cavity cancer, lung cancer, osteosarcoma, soft tissue cancer, skin cancer, melanoma, breast cancer, uterine cancer, ovarian cancer, brain tumor, thyroid cancer, lymphoma, leukemia And the like.
[0044]
That is, the CD39L4 gene can be used as a tumorigenic marker gene. As a method of measuring the expression level of a gene, cRNA or cDNA is prepared from total RNA extracted from a sample, and labeled with an appropriate label, whereby the signal intensity can be detected.
[0045]
Hereinafter, as a method of analyzing the expression level of a gene, an analysis method using a solid-phased sample and some other analysis methods will be described.
[0046]
(1) Analysis method using solid-phased sample
i) Immobilized sample
Examples of the immobilized sample include the following.
a) Gene chip:
A gene chip on which an antisense oligonucleotide synthesized based on an EST (expressed sequence tag) sequence or an mRNA sequence on a database can be used. As such a gene chip, a gene chip manufactured by Affymetrix (Lipshutz, RJ et al. (1999) Nature genet. 21, supplement, 20-24) can be used, but it is not limited thereto. It may be manufactured based on a known method. It is most preferable that the EST sequence or mRNA sequence serving as the base of the antisense oligonucleotide immobilized on the gene chip be derived from an animal of the same species as the animal or animal cell to be analyzed. When a mouse or a mouse-derived cultured cell is used, a mouse-derived cell is desirable, and when a human specimen or a human-derived cultured cell is used, a human-derived cell is desirable. In the case of analyzing mRNA of a mouse tumor, those derived from a mouse are most preferable. Can be used. When analyzing mRNA of a human tumor (for example, prostate cancer cell line LNCaP: ATCC No. CRL-1740, PC-3: ATCC No. CRL-1435, DU-145: ATCC No. HTB-81, etc.), human-derived mRNA is used. Preferably, for example, a human U95 set or U133 set manufactured by Affymetrix can be used. However, the present invention is not limited thereto, and for example, those derived from animals of closely related species can also be used. Examples of closely related species include, but are not limited to, mammals, such as humans and mice, and humans and monkeys.
[0047]
b) Array or membrane filter on which cDNA or RT-PCR product prepared from mouse or human, total RNA or total RNA obtained from a specific tissue is immobilized:
The cDNA or RT-PCR product is cloned by performing a reverse transcriptase reaction or PCR using primers prepared based on sequence information such as a mouse or human EST database. This cDNA or RT-PCR product may be one that hybridizes with only the CD39L4 gene. In addition, a commercially available array (eg, Intelligene: manufactured by Takara Shuzo Co., Ltd.) may be used for the array or the filter, or the above cDNA or RT-PCR product may be used with a commercially available spotter (eg, GMS417 Alayer: manufactured by Takara Shuzo Co., Ltd.). , Etc.) to produce a solid phase.
[0048]
ii) Preparation and analysis of probe
The labeling probe used is not a specific mRNA clone but a label of all expressed mRNAs. Although unpurified mRNA may be used as a starting material for preparing the probe, poly (A) purified by the above-described method may be used. ⁺ It is desirable to use RNA. Hereinafter, a method for preparing a labeled probe and a method for detecting and analyzing a labeled probe when various types of immobilized samples are used will be described.
[0049]
a) Gene chip manufactured by Affymetrix:
A biotin-labeled cRNA probe is prepared according to the protocol (Affymetrix Expression Analysis Technical Manual) attached to the gene chip manufactured by Affymetrix. Next, hybridization is performed using an analysis device (GeneChip Fluidics Station 400) manufactured by Affymetrix Co., Ltd. according to the protocol (expression analysis technical manual) attached to the gene chip manufactured by Affymetrix Co., and the light emission by avidin is detected and analyzed.
[0050]
b) Array:
Poly (A) by reverse transcriptase reaction ⁺ When preparing cDNA from RNA, it is necessary to label the cDNA so that the cDNA can be detected. When the cDNA is labeled with a fluorescent dye, the cDNA is labeled with a fluorescent dye (eg, Cy3, Cy5, etc.). The cDNA is fluorescently labeled by adding d-UTP or the like. At this time, poly (A) derived from the test substance-added cells ⁺ RNA and poly (A) from control cells ⁺ If the RNAs are labeled with different dyes, both can be mixed and used in the subsequent hybridization. For example, when a commercially available array of Takara Shuzo Co., Ltd. is used as an array, hybridization and washing are performed according to the protocol of the company, and after detecting a fluorescent signal with a fluorescent signal detector (for example, GMS418 array scanner (Takara Shuzo) or the like). Perform the analysis. However, the array to be used is not limited to a commercially available array, and may be a homemade array or a specially manufactured array.
[0051]
c) Membrane filter:
Poly (A) with reverse transcriptase ⁺ When producing cDNA from RNA, radioisotopes (eg, d-CTP [α- ³³ P]) and the like to prepare a labeled probe and perform hybridization by a conventional method. For example, hybridization and washing are performed using an atlas system (manufactured by Clontech), which is a commercially available filter microarray. After that, detection and analysis are performed using an analyzer (for example, an atlas image: manufactured by Clontech).
[0052]
When fluorescently labeled probes are used, by labeling each probe with a different fluorescent dye, a mixture of both probes can be hybridized at once to one solid-phased sample, and the fluorescence intensity can be read (Brown, P.O. et al. (1999) Nature genet, 21, supplement, 33-37).
[0053]
(2) Other analysis methods
a) RT-PCR
First, after performing a reverse transcriptase reaction using CD39L4 mRNA as a template, PCR is performed to specifically amplify a DNA fragment. In this method, in order to specifically amplify the nucleotide sequence of interest, an antisense primer complementary to a specific partial sequence of the mRNA of interest and a sequence of cDNA generated by reverse transcriptase from the antisense primer are used. A sense primer complementary to a specific partial sequence therein is used. RT-PCR can be performed using a commercially available kit (for example, RNA PCR kit AMV ver2.1: manufactured by Takara Shuzo Co., Ltd.) according to the manual attached to the kit.
[0054]
The antisense primer used for both the reverse transcriptase reaction and the PCR is substantially 15 to 40 contiguous nucleotides, preferably at least 18 to 30 nucleotides, more preferably, in the antisense sequence of the nucleotide sequence of the CD39L4 gene. Consists of a nucleotide sequence of 23 to 30 nucleotides.
[0055]
On the other hand, in the nucleotide sequence of the CD39L4 gene, the sequence of the sense primer used in the PCR is the sequence located in the 5 ′ terminal region further than the most 5 ′ terminal position in the sequence corresponding to the complementary strand of the antisense primer. Consists of an arbitrary partial sequence of 15 to 40 nucleotides, preferably 18 to 35 nucleotides, more preferably 21 to 30 nucleotides. However, if the sense primer and the antisense primer have mutually complementary sequences, non-specific sequences may be amplified by annealing the primers, which may hinder detection of a specific polynucleotide. It is preferable to design primers that avoid such combinations.
[0056]
In each of the antisense primer and the sense primer, a nucleotide sequence irrelevant to the nucleotide sequence of the CD39L4 gene may be added as a linker to the 5 ′ end of the nucleotide sequence defined above. However, it is preferable that the linker does not cause non-specific annealing with the nucleic acid in the reaction solution during the reaction so as not to hinder the detection of the specific polynucleotide.
[0057]
In the embodiment in which the nucleic acid is detected by RT-PCR, the conditions of each reaction are as described below. The sample for detection by RT-PCR is usually poly (A) ⁺ It need not be purified to RNA.
[0058]
i) Reverse transcriptase reaction
Example of reaction solution composition (total volume 20 μl):
Total RNA as appropriate;
Magnesium chloride 2.5 to 5 mM (preferably 5 mM);
1 × RT PCR buffer (10 mM Tris-HCl (pH 8.3 to 9.0 (preferably 8.3) at 25 ° C., 50 mM potassium chloride));
dNTPs 0.5 to 1 mM (preferably 1 mM);
Antisense primer 1 μM (2.5 μM of a commercially available random primer or oligo (dT) primer (12-20 nucleotides) can be added as a substitute for the antisense primer);
Reverse transcriptase 0.25 to 1 unit / μl (preferably 0.25 unit / μl);
Adjust to 20 μl with sterile water.
[0059]
Reaction temperature conditions:
After incubating at 30 ° C for 10 minutes (only when using a random primer), incubating at 42 to 60 ° C (preferably 42 ° C) for 15 to 30 minutes (preferably 30 minutes), and further heating at 99 ° C for 5 minutes, the enzyme And then cooled at 4-5 ° C (preferably 5 ° C) for 5 minutes.
[0060]
ii) PCR
Example of reaction solution composition:
Magnesium chloride 2 to 2.5 mM (preferably 2.5 mM);
1 × PCR buffer (10 mM Tris-HCl (pH 8.3 to 9.0 (preferably 8.3) at 25 ° C.)), 50 mM potassium chloride;
dNTPs 0.2 to 0.25 mM (preferably 0.25 mM);
Antisense primer and sense primer 0.2 to 0.5 μM (preferably 0.2 μM);
1 to 2.5 units (preferably 2.5 units) of Taq polymerase;
The total volume is adjusted to 80 μl by adding sterile water, and the total volume is added to the total volume of the reaction solution after the completion of the reverse transcription reaction before PCR is started.
[0061]
Reaction temperature conditions: First, heating at 94 ° C for 2 minutes, then at 90 to 95 ° C (preferably 94 ° C) for 30 seconds, 40 to 60 ° C (preferably from the dissociation temperature (Tm) calculated from the characteristics of the primer). A temperature cycle of 70 to 75 ° C. (preferably 72 ° C.) for 1.5 seconds at 28 to 50 cycles (preferably 28 cycles) at a temperature lower than 20 ° C. for 30 seconds, and then cooling to 4 ° C. I do.
[0062]
After completion of the PCR, the reaction solution is subjected to electrophoresis to detect whether or not a band of a desired size has been amplified. In order to perform quantitative detection, PCR is performed under the same conditions using a serially diluted cDNA clone as a standard template DNA, and the number of temperature cycles at which quantitative detection can be performed is determined. A part of the reaction solution is sampled and subjected to electrophoresis. Also, for example, by using radiolabeled dCTP during the PCR reaction, quantification can be performed using the amount of radioactivity incorporated in the band as an index. As methods for increasing the reliability of gene quantification, competitive RT-PCR methods (Souaze et al., BioTechniques 21, 280-285 (1996)) and TaqMan PCR methods (Heid et al. 6, Genom. Res. 6, 986-994 (1996)).
b) ribonuclease protection assay (RNase protection assay): a labeled probe in an RNA sample having only the mRNA having the nucleotide sequence according to any one of 1) to 5) above (where t in the sequence is replaced with u) After hybridizing to form a double-stranded polynucleotide and then incubating the sample with ribonuclease, the probe-hybridized mRNA is not digested by ribonuclease due to its double-stranded form. Since the other RNAs are digested, only the double-stranded polynucleotide remains (if the probe is shorter than the mRNA to be detected, the double-stranded polynucleotide corresponding to the length of the probe remains). By quantifying the double-stranded polynucleotide, the expression level of the target polynucleotide is measured. Specifically, for example, the method described below is used.
[0063]
To ensure that the extra labeled probe that does not form a double strand is separated from the double-stranded polynucleotide to facilitate quantification, the extra labeled probe is preferably digested with ribonuclease. The labeling probe may be DNA or RNA as long as it is capable of digesting the main-strand DNA. The method for preparing a labeled probe can be performed according to the above-mentioned conventional method, but the length of the probe used in the ribonuclease assay is preferably about 50 to 500 nucleotides. Further, a probe in which complementary strands are mixed, such as a probe obtained by directly labeling a double-stranded DNA and thermally denaturing it, is not suitable for this method.
[0064]
The RNA probe is prepared, for example, according to the following method. First, the template DNA is inserted into a plasmid vector (for example, pGEM-T (promega)) having a bacteriophage promoter (T7, SP6, T3 promoter, etc.). Next, this recombinant plasmid vector is digested with a restriction enzyme so that it is cleaved only one point immediately downstream of the inserted fragment. Using the obtained linear DNA as a template, an in vitro transcription reaction is carried out in the presence of radiolabeled ribonucleotides. In this reaction, an enzyme such as T7, SP6 or T3 polymerase is used in accordance with the promoter in the vector. The above operation can be performed using, for example, Riboprobe System-T7, -SP6 or -T3 (all manufactured by Promega).
[0065]
The steps up to the preparation of the RNA sample can be performed according to the method described in the section “1. Acquisition of CD39L4 gene”, and it is preferable that the extracted total RNA be further purified and used as mRNA. 10 to 20 μg of the prepared total RNA sample and 5 × 10 ⁵ A ribonuclease protection assay is performed using an excess of labeled probe equivalent to cpm. This operation can be performed using a commercially available kit (HybSpeed RPA Kit, manufactured by Ambion). The obtained ribonuclease digested sample is electrophoresed on a 4 to 12% polyacrylamide gel containing 8 M urea, the gel is dried, and autoradiography is performed with an X-ray film. By the above operation, the band of the double-stranded polynucleotide which escaped the ribonuclease digestion can be detected, and the quantification can be carried out according to a conventional method. Furthermore, if the expression level of the β-actin gene is simultaneously measured for the purpose of correcting the variation caused by the difference in the RNA amount between the samples, a more precise evaluation can be performed.
[0066]
c) Run-on assay, Greenberg, ME and Ziff, EBBB (1984) Nature 311, 433-438, Groudine, M. et al. (1981) Mol. Cell Biol. 1, 281-288): This method is a method for measuring the transcriptional activity of a target gene by isolating a nucleus from a cell, and is not a method for detecting mRNA in a cell. Method for Measuring Gene Expression Level ”. When a transcription reaction is performed in a test tube using the isolated cell nucleus, only the reaction in which transcription is already started before the nucleus is isolated and the one where the mRNA chain is being generated elongates proceeds. I do. At the time of isolating the nucleus by adding a radiolabeled ribonucleotide during this reaction to label the elongating mRNA and detecting the mRNA contained therein that hybridizes to the unlabeled probe The transcription activity of the target polynucleotide in can be measured. The specific operation method is the same as that described in the above-mentioned reference except that an unlabeled probe is prepared. A measurement result is compared between a sample derived from a sample collected from a subject or a test animal and a sample derived from a normal human or a normal animal. If the transcription activity of the CD39L4 gene is higher than that of a normal human or a normal animal, the patient has a tumor. It can be determined that.
[0067]
d) Under the control of the CD39L4 gene promoter, the expression of the CD39L4 gene or CD39L4 can also be detected indirectly by using a gene capable of detecting the promoter activity (hereinafter referred to as “reporter gene”). Hereinafter, a detection method using a reporter gene will be described.
[0068]
d-1) Reporter gene
The reporter gene may be any that encodes a reporter protein that can be specifically distinguished from any other protein that the host cell can produce in the series of steps of the test method. Preferably, cells before transformation do not have a gene encoding the same or similar protein as the reporter protein. For example, even if the reporter protein is toxic to the cell or if the cell confers resistance to sensitive antibiotics, the presence or absence of reporter gene expression will determine the viability of the cell. Can be determined. However, a more preferable reporter gene used in the present invention can specifically and quantitatively detect the expression level (for example, a specific antibody against the protein encoded by the reporter gene has been obtained). Na) structural gene. More preferably, it is a gene encoding an enzyme or the like which specifically reacts with a foreign substrate to generate a metabolite which can be easily measured quantitatively. Examples of such reporter genes include, for example, genes encoding the following proteins, but the present invention is not limited thereto.
[0069]
d-1-1) Chloramphenicol acetyltransferase:
An enzyme that adds an acetyl group to chloramphenicol, and can be detected by a so-called CAT assay or the like. As a vector for preparing a reporter assay vector simply by incorporating a promoter, a pCAT3-Basic vector (promega) is commercially available.
[0070]
d-1-2) Firefly luciferase:
It can be quantified by measuring bioluminescence generated when luciferin is metabolized. As a vector for the reporter assay, a pGL3-Basic vector (promega) is commercially available.
[0071]
d-1-3) β-galactosidase:
There are substrates that can be measured by color reaction, fluorescence or chemiluminescence, respectively. As a vector for a reporter assay, pβgal-Basic (promega) is commercially available.
[0072]
d-1-4) Secreted alkaline phosphatase:
There are substrates that can be measured by color reaction, bioluminescence or chemiluminescence, respectively. As a vector for a reporter assay, pSEAP2-Basic (manufactured by Clontech) is commercially available.
[0073]
d-1-5) Green-fluorescent protein:
Although it is not an enzyme, it can quantify directly because it emits fluorescence. Similarly, pEGFP-1 (manufactured by Clontech) is commercially available as a vector for a reporter assay.
[0074]
d-2) Introduction of a reporter gene
According to a known method, cells are transfected with a reporter expression plasmid capable of expressing a reporter gene under the control of the CD39L4 gene promoter.
[0075]
As a method for introducing an expression plasmid into cells, a diethylaminoethyl (DEAE) -dextran method (Luthman, H. and Magnusson, G. (1983) Nucleic Acids Res. 11, 1295-1308), a calcium phosphate-DNA coprecipitation method ( Graham, FL and van der Eb, AJ (1973) Virology 52, 456-457), electric pulse drilling (Neumann, E. et al. (1982) EMBOJ. 1, 841-845), Lipofection method (Lopata et al. (1984) Nucl. Acids Res. 12, 5707-5717, Sussman and Milman (1984) Mol. Cell. Biol. 4, 1641-164). ) And the like, but not limited thereto, and it can employ any of the methods commonly used in the art to which this invention belongs. However, when the cells are so-called floating cells, it is preferable to use a method other than the calcium phosphate-DNA coprecipitation method. In any method, it is necessary to use optimized transfection conditions according to the cells used.
[0076]
d-3) Evaluation
Thus, when the cells transfected with the CD39L4 gene reporter expression plasmid are cultured, the transcription of the reporter gene is promoted in correlation with the expression of the CD39L4 gene. Therefore, the expression level of the CD39L4 gene can be evaluated by observing the change in the expression level of the reporter gene between the case where the test substance is added to the medium and the case where the test substance is not added under the conditions where the reporter gene can be expressed. Here, the "conditions under which the reporter gene can be expressed" may be any conditions under which cells transfected with the reporter expression vector can survive and produce a transcript (reporter protein) of the reporter gene. Preferably, in a medium suitable for the cell line to be used (a serum component such as fetal bovine serum may be added) in the presence of air containing 4 to 6% (most preferably 5%) carbon dioxide, Incubate at 36-38 ° C (most preferably 37 ° C) for 2-3 days (most preferably 2 days).
[0077]
5. Tumor marker protein
Since CD39L4 is considered to cause canceration of cells and increase the expression level in tumor cells, it can be used as a tumor marker protein for detecting the presence of a tumor.
[0078]
As a preferred embodiment of the method for detecting CD39L4, a method using an antibody will be described. First, the protein in the sample is immobilized on the inner bottom of a well of a multi-well plate such as a 96-well plate or a 384-well plate, or on a membrane, and then detection using an antibody that specifically recognizes CD39L4 is performed. . Among them, a multi-well plate such as a 96-well plate or a 384-well plate is generally used as a method called an enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) or a radioisotope immunoassay (RIA). On the other hand, as a method for immobilizing a sample on a membrane, a method of transferring a protein onto a membrane via polyacrylamide electrophoresis of a sample (Western blotting), or a so-called dot blot in which a sample or a dilution thereof is directly permeated into the membrane. And a slot blot method.
[0079]
(1) Sample preparation
Samples include whole blood of non-human mammals such as humans and mice, serum, liver, prostate, testis, penis, bladder, kidney, oral cavity, pharynx, lips, tongue, gingiva, nasopharynx, esophagus, stomach, small intestine, It is possible to arbitrarily select an organ or tissue to be detected for the presence of a tumor such as the large intestine, colon, liver, gallbladder, pancreas, nasal cavity, lung, soft tissue, skin, breast, uterus, ovary, brain, thyroid, and lymph. it can. In addition, it is necessary to perform sampling in accordance with the experimental ethical guidelines of each laboratory. The sample is subjected to high-speed centrifugation as necessary to remove insoluble substances, and then prepared as an ELISA / RIA sample or a Western blot sample as described below.
[0080]
Examples of samples for ELISA / RIA include, for example, collected serum, liver, prostate, testis, penis, bladder, kidney, oral cavity, pharynx, lips, tongue, gingiva, nasopharynx, esophagus, stomach, small intestine, large intestine, colon, liver , Gall bladder, pancreas, nasal cavity, lung, soft tissue, skin, breast, uterus, ovary, brain, thyroid, lymph, etc. may be used as they are or appropriately diluted with a buffer. Samples for Western blot (for electrophoresis) include, for example, serum, liver, prostate, testis, penis, bladder, kidney, oral cavity, pharynx, lips, tongue, gingiva, nasopharynx, esophagus, stomach, small intestine, large intestine, colon, SDS-polyacrylamide gel electrophoresis using the extract of liver, gallbladder, pancreas, nasal cavity, lung, soft tissue, skin, breast, uterus, ovary, brain, thyroid, lymph, etc. as it is or appropriately diluting it with a buffer solution And a sample buffer containing 2-mercatorethanol for use (eg, manufactured by Sigma). In the case of dot / slot blot, for example, collected serum, liver, prostate, testis, penis, bladder, kidney, oral cavity, pharynx, lips, tongue, gingiva, nasopharynx, esophagus, stomach, small intestine, large intestine, colon, liver, Extracts of the gallbladder, pancreas, nasal cavity, lungs, soft tissue, skin, breast, uterus, ovary, brain, thyroid, lymph, etc., or those appropriately diluted with a buffer solution, directly using a blotting device, etc. Adsorb to the membrane.
[0081]
(2) Immobilization of sample
In order to specifically detect the protein in the sample obtained as described above, the sample must be precipitated by immunoprecipitation, a method utilizing the binding of ligand, and detected without immobilization. Alternatively, the sample to be detected can be immobilized as it is. When a protein is immobilized, a nitrocellulose membrane (for example, manufactured by Bio-Rad) or a nylon membrane (for example, Hybond-ECL (Amersham) is used as a membrane for Western blotting, dot blotting, or slot blotting. Pharmacia), a cotton membrane (for example, a blot absorbent filter (manufactured by Bio-Rad), etc.) or a polyvinylidene difluoride (PVDF) membrane (for example, manufactured by Bio-Rad, etc.).
[0082]
As a so-called blotting method for transferring a protein from a gel after electrophoresis to a membrane, a wet blotting method (CURRENT PROTOCOLS IN IMMUNOLOGY volume 2 ed by JE Corigan, A.M. Kruisbek, D.E. M. Shevach, W. Strober), a semi-dry blotting method (see CURRENT PROTOCOLSIN IMMUNOLOGY volume 2), and the like. Equipment for dot blotting and slot blotting is also commercially available (for example, Biodot (Biorad)).
[0083]
On the other hand, in order to perform detection and quantification by the ELISA method / RIA method, a sample or a diluted solution thereof (for example, 0.05% adjuvant) is placed in a dedicated 96-well plate (for example, Immunoplate Maxisorp (manufactured by Nunc Corporation) or the like). A phosphate buffered saline solution containing sodium chloride (diluted with “PBS”) is added and left at 4 ° C. to room temperature overnight, or at 37 ° C. for 1 to 3 hours to form a bottom surface of the well. Is immobilized by adsorbing protein.
[0084]
(3) Antibody
The antibody used specifically recognizes CD39L4 or a part thereof. Such antibodies include, for example, antibodies that bind to CD39L4 but do not bind to any other mouse or human protein.
[0085]
The antibody can be obtained by using a conventional method (for example, Shinsei Kagaku Kenkyusho 1, Protein 1, p. 389-397, 1992) to obtain a polypeptide serving as an antigen or any polypeptide selected from its amino acid sequence in an animal. , And collecting and purifying antibodies produced in the living body. Also, according to a known method (for example, Kohler and Milstein, Nature 256, 495-497, 1975, Kennet, R. ed., Monoclonal Antibody p. 365-367, 1980, Prenum Press, NY 39). A hybridoma can be established by fusing an antibody-producing cell producing an antibody with a myeloma cell to obtain a monoclonal antibody.
[0086]
Examples of an antigen for producing an antibody include CD39L4 or a polypeptide comprising at least six consecutive partial amino acid sequences thereof, or a derivative obtained by adding an arbitrary amino acid sequence or a carrier to these polypeptides.
[0087]
The antigen polypeptide can be obtained by synthesizing the CD39L4 of the present invention in vitro, or by producing it in host cells by genetic engineering. Specifically, after integrating CD39L4 into a vector capable of expressing, it is synthesized in a solution containing enzymes, substrates and energy substances necessary for transcription and translation, or other prokaryotic or eukaryotic host cells are prepared. The protein can be obtained by expressing CD39L4 by transformation.
[0088]
In vitro synthesis of polypeptides includes, but is not limited to, for example, the Rapid Translation System (RTS) manufactured by Roche Diagnostics. For example, when RTS is used, the target gene is cloned into an expression vector controlled by a T7 promoter, and this is added to an in vitro reaction system. First, mRNA is transcribed from a template DNA by T7 RNA polymerase, Thereafter, translation is performed by ribosomes or the like in an Escherichia coli lysate, and the target polypeptide is synthesized in the reaction solution (Biochemical, 1, 20-23 (2001), Biochemical, 2, 28-29 (2001)).
[0089]
Examples of prokaryotic host cells include Escherichia coli and Bacillus subtilis. To transform a gene of interest into these host cells, the host cells are transformed with a plasmid vector that contains replicons or origins of replication from species compatible with the host and regulatory sequences. Further, the vector is preferably a vector having a sequence capable of imparting phenotypic (phenotypic) selectivity to transformed cells.
[0090]
For example, K12 strain or the like is often used as Escherichia coli, and pBR322 or a pUC-type plasmid is generally used as a vector. However, the present invention is not limited thereto, and any known various strains and vectors can be used.
[0091]
Examples of the promoter include, in Escherichia coli, tryptophan (trp) promoter, lactose (lac) promoter, tryptophan lactose (tac) promoter, lipoprotein (lpp) promoter, polypeptide chain elongation factor Tu (tufB) promoter, and the like. Any promoter can be used to produce the polypeptide of interest.
[0092]
As Bacillus subtilis, for example, strain 207-25 is preferable, and as a vector, pTUB228 (Ohmura, K. et al. (1984) J. Biochem. 95, 87-93) is used, but it is not limited thereto. is not. By ligating a DNA sequence encoding the signal peptide sequence of Bacillus subtilis α-amylase, extracellular secretory expression becomes possible.
[0093]
Eukaryotic host cells include cells such as vertebrates, insects, and yeast. Examples of vertebrate cells include COS cells, which are monkey cells (Gluzman, Y. (1981) Cell 23, 175-). 182, ATCC CRL-1650), mouse fibroblasts NIH3T3 (ATCC No. CRL-1658) and Chinese hamster ovary cells (CHO cells, ATCC CCL-61) lacking dihydrofolate reductase (Urlaub, G. and Chasin). Natl. Acad. Sci. USA 77, 4126-4220), etc., but are not limited thereto.
[0094]
As a vertebrate cell expression promoter, those having a promoter, an RNA splice site, a polyadenylation site, and a transcription termination sequence, which are usually located upstream of the gene to be expressed, can be used. May be provided. Examples of the expression vector include pCR3.1 (manufactured by Invitrogen) having a cytomegalovirus early promoter, and pSV2dhfr having an early promoter of SV40 (Subramani, S. et al. (1981) Mol. Cell. Biol. 1, 854-864), but is not limited thereto.
[0095]
When a COS cell or a NIH3T3 cell is used as a host cell, for example, the expression vector has an SV40 origin of replication, is capable of autonomous growth in a COS cell or an NIH3T3 cell, and further has a transcription promoter and a transcription termination. Those provided with a signal and an RNA splice site can be used. The expression vector is prepared by a DEAE-dextran method (Luthman, H. and Magnusson, G. (1983) Nucleic Acids Res. 11, 1295-1308), and a calcium phosphate-DNA coprecipitation method (Graham, F.L. , AJ (1973) Virology 52, 456-457), and electric pulse perforation (Neumann, E. et al. (1982) EMBO J. 1, 841-845) to COS cells or NIH3T3 cells. Thus, the desired transformed cells can be obtained. When a CHO cell is used as a host cell, a vector capable of expressing a neo gene functioning as an antibiotic G418 resistance marker together with an expression vector, for example, pRSVneo (Sambrook, J. et al. (1989): "Molecular Cloning") A Laboratory Manual "Cold Spring Harbor Laboratory, NY) and pSV2neo (Southern, PJ and Berg, P. (1982) J. Mol. Appl. Genet. 1, 327-3 Trans. By selecting a G418-resistant colony, a transformed cell stably producing the desired polypeptide can be obtained.
[0096]
When insect cells are used as host cells, ovarian cell-derived cell lines (Sf-9 or Sf-21) of Spodoptera frugiperda of Lepidoptera and Noctuidae and High Five cells (Wickham, T. J. et al.) Derived from egg cells of Trichoplusia ni. al. (1992) Biotechnol. Prog. I: 391-396) and the like, and as a baculovirus transfer vector, pVL1392 / 1393 using the promoter of the polyhedrin protein of autographa nucleopolyhedrovirus (AcNPV). (Kidd, IM and VC Emery (1993) The use of baculoviruses as expression vectors). Applied Biochemistry and Biotechnology 42, 137-159). In addition, vectors using baculovirus P10 or a promoter of the same basic protein can also be used. Furthermore, the recombinant protein can be expressed as a secreted protein by linking the secretory signal sequence of the AcNPV envelope surface protein GP67 to the N-terminal side of the target protein (Zhe-mei Wang, et al. (1998)). Biol. Chem., 379, 167-174).
[0097]
As an expression system using a eukaryotic microorganism as a host cell, yeast is generally well known. Among them, yeast of the genus Saccharomyces, for example, baker's yeast Saccharomyces cerevisiae and petroleum yeast Pichia pastoris are preferable. Examples of expression vectors for eukaryotic microorganisms such as the yeast include, for example, a promoter of an alcohol dehydrogenase gene (Bennetzen, JL and Hall, BD (1982) J. Biol. Chem. 257, 3018-3025). ) Or a promoter of an acid phosphatase gene (Miyanohara, A. et al. (1983) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80, 1-5). When expressed as a secretory protein, it can be expressed as a recombinant having a secretory signal sequence and a cleavage site of an endogenous protease or a known protease possessed by the host cell at the N-terminal side. For example, in a system in which human mast cell tryptase of a trypsin-type serine protease is expressed in petroleum yeast, the activity is achieved by connecting the secretory signal sequence of α-factor of yeast and the cleavage site of KEX2 protease possessed by petroleum yeast to the N-terminal side and expressing it. It is known that type tryptase is secreted into the medium (Andrew, L. Niles, et al. (1998) Biotechnol. Appl. Biochem. 28,
125-131).
[0098]
The transformant obtained as described above can be cultured according to a conventional method, and the culture produces the target polypeptide inside or outside the cell. The medium used for the culture can be appropriately selected from various ones commonly used depending on the host cell used. For example, in the case of the above-mentioned COS cells, RPMI1640 medium or Dulbecco's modified Eagle medium (hereinafter referred to as “DMEM”) ), To which a serum component such as fetal bovine serum may be added as necessary.
[0099]
Recombinant proteins produced in the cells of the transformants or outside the cells by the above culture can be separated and purified by various known separation procedures utilizing the physical properties and chemical properties of the proteins. it can. As the method, specifically, for example, treatment with a normal protein precipitant, ultrafiltration, molecular sieve chromatography (gel filtration), adsorption chromatography, ion exchange chromatography, affinity chromatography, high-performance liquid chromatography ( Examples thereof include various liquid chromatography such as HPLC, dialysis, and combinations thereof. In addition, by connecting histidine consisting of 6 residues to the recombinant protein to be expressed, it can be efficiently purified with a nickel affinity column. By combining the above methods, the desired polypeptide can be easily produced in large quantities with high yield and high purity.
[0100]
As an example of an antibody that specifically binds to CD39L4, a monoclonal antibody that specifically binds to CD39L4 can be mentioned. The method for obtaining the monoclonal antibody is as described below.
[0101]
In the production of monoclonal antibodies, the following working steps are generally required. That is,
(A) purification of a biopolymer used as an antigen,
(B) after immunizing the animal by injecting the antigen, collecting blood and assaying the antibody titer to determine the timing of splenectomy, and then preparing antibody-producing cells;
(C) preparation of myeloma cells (hereinafter referred to as “myeloma”);
(D) cell fusion between antibody-producing cells and myeloma,
(E) selecting a hybridoma group producing the desired antibody,
(F) division into single cell clones (cloning),
(G) In some cases, culturing a hybridoma to produce a large amount of a monoclonal antibody, or breeding an animal into which the hybridoma has been transplanted,
(H) Examination of the physiological activity of the monoclonal antibody thus produced and its recognition specificity, or assay of properties as a labeling reagent.
[0102]
Hereinafter, a method for preparing a monoclonal antibody will be described in detail along the above steps, but the method for preparing the antibody is not limited thereto. For example, antibody-producing cells other than splenocytes and myeloma can also be used.
[0103]
(A) Purification of antigen
As the antigen, CD39L4 prepared by the method described above or a part thereof can be used. Furthermore, a partial peptide of the protein of the present invention can be chemically synthesized using a method well known to those skilled in the art and used as an antigen.
[0104]
(B) Preparation of antibody-producing cells
The antigen obtained in step (a) is mixed with an adjuvant such as Freund's complete or incomplete adjuvant or alum, and the animal is immunized as an immunogen. A mouse is most preferably used as an experimental animal, but is not limited thereto.
[0105]
The method of immunogen administration for mouse immunization may be any of subcutaneous injection, intraperitoneal injection, intravenous injection, intradermal injection, and intramuscular injection, but subcutaneous injection or intraperitoneal injection is preferred.
[0106]
Immunization can be performed once or multiple times at appropriate intervals (preferably at one to five week intervals). Thereafter, the antibody titer to the antigen in the serum of the immunized animal is measured, and the effect of the subsequent operations can be enhanced by using the animal whose antibody titer is sufficiently high as a source of antibody-producing cells. Generally, it is preferable to use antibody-producing cells derived from an animal 3 to 5 days after the final immunization for subsequent cell fusion.
[0107]
Examples of the method for measuring the antibody titer used herein include various known techniques such as RIA, ELISA, fluorescent antibody, and passive hemagglutination, and the detection sensitivity, speed, accuracy, and automation of the operation are known. In view of the possibility of the above, the RIA method or the ELISA method is more preferable.
[0108]
The measurement of the antibody titer in the present invention can be performed, for example, by the following procedure according to the ELISA method. First, a purified or partially purified antigen is adsorbed on a solid surface such as a 96-well plate for ELISA, and the solid surface on which the antigen is not adsorbed is a protein unrelated to the antigen, for example, bovine serum albumin (hereinafter referred to as “BSA”). ), And after washing the surface, it is brought into contact with a serially diluted sample (for example, mouse serum) as the first antibody to bind the monoclonal antibody in the sample to the antigen. Further, an antibody against a mouse antibody that is enzyme-labeled as a second antibody is added to bind to the mouse antibody, a substrate of the enzyme is added after washing, and a change in absorbance due to color development based on the decomposition of the substrate is measured. calculate.
[0109]
(C) Myeloma preparation process
As the myeloma, a cell line generally obtained from a mouse, for example, an 8-azaguanine-resistant mouse (derived from BALB / c) myeloma strain P3X63Ag8U. 1 (P3-U1) [Yelton, D .; E. FIG. et al. Current Topics in Microbiology and Immunology, 81, 1-7 (1978)], P3 / NSI / 1-Ag4-1 (NS-1) [Kohler, G. et al. et al. European J. et al. Immunology, 6, 511-519 (1976)], Sp2 / O-Ag14 (SP-2) [Shulman, M .; et al. Nature, 276, 269-270 (1978)], P3X63Ag8.653 (653) [Kearney, J. et al. F. et al. J. Immunology, 123, 1548-1550 (1979)], P3X63Ag8 (X63) [Horibata, K. et al. and Harris, A. W. Nature, 256, 495-497 (1975)]. These cell lines are prepared by adding 8-azaguanine to an appropriate medium, for example, 8-azaguanine medium [RPMI-1640 medium supplemented with glutamine, 2-mercaptoethanol, gentamicin, and fetal calf serum (hereinafter referred to as “FCS”). Added medium], Iscove's Modified Dulbecco's Medium (hereinafter referred to as "IMDM"), or Dulbecco's Modified Eagle Medium (Dulbecco's Modified Eagle Medium; hereinafter referred to as "DMEM"). Was subcultured 3 to 4 days before cell fusion in a normal medium [for example, ASF104 medium containing 10% FCS (manufactured by Ajinomoto Co., Inc.)]. ⁷ Keep the above cell number.
[0110]
(D) Cell fusion
Antibody-producing cells are plasma cells and lymphocytes which are precursor cells thereof, which may be obtained from any site of an individual, such as spleen, lymph node, peripheral blood, or a combination thereof as appropriate. , But splenocytes are most commonly used.
[0111]
After the final immunization, a site where antibody-producing cells are present, for example, a spleen is removed from a mouse having a predetermined antibody titer, and spleen cells as antibody-producing cells are prepared. Currently, the most commonly used means for fusing the spleen cells with the myeloma obtained in step (c) is a method using polyethylene glycol, which has relatively low cytotoxicity and simple fusion operation. This method includes, for example, the following procedure.
[0112]
The spleen cells and myeloma are thoroughly washed with a serum-free medium (for example, RPMI 1640) or a phosphate buffered saline (hereinafter, referred to as “PBS”), and the ratio of spleen cells to myeloma is 5: 1 to 10: 1. Mix to the extent necessary and centrifuge. After removing the supernatant and thoroughly loosening the precipitated cell group, 1 ml of a serum-free medium containing 50% (w / v) polyethylene glycol (molecular weight: 1,000 to 4,000) is added dropwise with stirring. Thereafter, 10 ml of serum-free medium is slowly added, followed by centrifugation. The supernatant was discarded again, and the precipitated cells were placed in a normal medium (hereinafter, referred to as "HAT") containing an appropriate amount of hypoxanthine / aminopterin / thymidine (hereinafter referred to as "HAT") solution and mouse interleukin-2 (hereinafter referred to as "IL-2"). Medium)), dispensed into each well of a culture plate (hereinafter, referred to as “plate”), and cultured at 37 ° C. for about 2 weeks in the presence of 5% carbon dioxide gas. HAT medium is supplemented as needed on the way.
[0113]
(E) Selection of hybridoma group
When the myeloma cell is an 8-azaguanine resistant strain, that is, a hypoxanthine guanine phosphoribosyltransferase (HGPRT) deficient strain, the unfused myeloma cell and a fusion cell of myeloma cells are: Cannot survive in HAT containing medium. On the other hand, a fusion cell of antibody-producing cells or a hybridoma of antibody-producing cells and myeloma cells can survive, but a fusion cell of antibody-producing cells has a long life. Therefore, by continuing the culture in the HAT-containing medium, only the hybridoma of the antibody-producing cell and the myeloma cell survives, and as a result, the hybridoma can be selected.
[0114]
With respect to the hybridomas that have grown in a colony, the medium is replaced with a medium obtained by removing aminopterin from the HAT medium (hereinafter referred to as “HT medium”). Thereafter, a part of the culture supernatant is collected, and the antibody titer is measured by, for example, an ELISA method.
[0115]
The method using an 8-azaguanine-resistant cell line has been described above, but other cell lines can also be used according to the selection method of the hybridoma, and in that case, the composition of the medium used also changes.
[0116]
(F) Cloning
By measuring the antibody titer in the same manner as described in the step (b), the hybridoma that has been found to produce a specific antibody is transferred to another plate and cloned. The cloning method includes a limiting dilution method in which one hybridoma is diluted and cultured so that one hybridoma is contained in one well of the plate, a soft agar method in which the colony is collected by culturing in a soft agar medium, and a micromanipulator. And a cell sorter for separating one cell using a cell sorter. The limiting dilution method is simple and often used.
[0117]
For the wells in which the antibody titer has been recognized, for example, cloning by the limiting dilution method is repeated 2 to 4 times, and those having a stable antibody titer are selected as the monoclonal antibody-producing hybridoma strain of the present invention.
[0118]
(G) Preparation of monoclonal antibody by hybridoma culture
The hybridoma that has completed cloning is cultured by changing the medium from an HT medium to a normal medium. Large-scale culture is performed by rotary culture using a large culture bottle or spinner culture. The monoclonal antibody that specifically binds to the protein of the present invention can be obtained by purifying the supernatant from this large-scale culture using a method known to those skilled in the art such as gel filtration. In addition, ascites containing a large amount of the monoclonal antibody of the present invention can be obtained by growing the hybridoma in the abdominal cavity of a mouse of the same strain (for example, BALB / c described above) or a Nu / Nu mouse. . As a simple purification method, a commercially available monoclonal antibody purification kit (for example, MAbTrap GII kit; manufactured by Pharmacia) or the like can also be used.
[0119]
The monoclonal antibody thus obtained has high antigen specificity for CD39L4.
[0120]
(H) Monoclonal antibody assay
The isotype and subclass of the monoclonal antibody thus obtained can be determined as follows. First, examples of the identification method include the Ouchterlony method, the ELISA method, and the RIA method. The Otterlony method is simple but requires a concentration operation when the concentration of the monoclonal antibody is low. On the other hand, when the ELISA method or the RIA method is used, the culture supernatant is allowed to react with the antigen-adsorbed solid phase as it is, and further, antibodies corresponding to various immunoglobulin isotypes and subclasses are used as secondary antibodies. Isotypes and subclasses can be identified. As a simpler method, a commercially available kit for identification (for example, Mouse Typer Kit; manufactured by Bio-Rad) can be used.
[0121]
Further, the protein can be quantified by the Foreign Lowry method and a method of calculating from the absorbance at 280 nm [1.4 (OD280) = 1 mg / ml of immunoglobulin].
[0122]
The monoclonal antibody of the present invention thus obtained can be used for CD39L4 detection or separation / purification utilizing its specificity.
[0123]
(4) Detection
The antibody obtained by the method described in the above (3) may be directly labeled, or may be used as a primary antibody to specifically recognize the antibody (recognize an antibody derived from the animal in which the antibody was produced). Used for detection in cooperation with secondary antibodies.
[0124]
Preferred examples of the type of label include, but are not limited to, an enzyme (alkaline phosphatase or horseradish peroxidase) or biotin (however, an operation of further binding enzyme-labeled streptavidin to biotin of the secondary antibody is added). Various pre-labeled antibodies (or streptavidin) are commercially available for methods that use labeled secondary antibodies (or labeled streptavidin). I for RIA ¹²⁵ The measurement is carried out using a liquid scintillation counter or the like using an antibody labeled with a radioisotope such as
[0125]
By detecting the activity of these labeled enzymes, the amount of the polypeptide that is the antigen is measured. In the case of alkaline phosphatase or horseradish peroxidase, substrates that emit color or emit light by the catalyst of those enzymes are commercially available.
[0126]
When a color-developing substrate is used, it can be visually detected by Western blotting or dot / slot blotting. In the ELISA method, quantification is preferably performed by measuring the absorbance (measurement wavelength varies depending on the substrate) of each well using a commercially available microplate reader. Also preferably, a dilution series of the antigen used for the production of the antibody in the above (3) is prepared, and this is used as a standard antigen sample, and the detection operation is performed simultaneously with other samples, and the standard antigen concentration and the measured value are plotted. By creating a curve, it is possible to quantify the antigen concentration in another sample.
[0127]
On the other hand, when a substrate that emits light is used, it can be detected by Western radiography or dot / slot blotting by autoradiography using an X-ray film or an imaging plate, or photography using an instant camera, Quantitation using densitometry, Molecular Imager Fx system (manufactured by Bio-Rad), or the like is also possible. When a luminescent substrate is used in the ELISA method, the enzyme activity is measured using a luminescent microplate reader (for example, manufactured by Bio-Rad).
[0128]
(5) Measurement operation
i) Western blot, dot blot or slot blot
First, in order to prevent non-specific adsorption of antibodies, the membrane is previously placed in a buffer containing a substance that inhibits such non-specific adsorption (skim milk, casein, bovine serum albumin, gelatin, polyvinylpyrrolidone, etc.) for a certain period of time. Perform the soaking operation (blocking). The composition of the blocking solution is, for example, phosphate buffered saline (PBS) or Tris buffered saline (TBS) containing 5% skim milk, 0.05 to 0.1% Tween 20. Instead of skim milk, Block Ace (Dainippon Pharmaceutical), 1 to 10% bovine serum albumin, 0.5 to 3% gelatin, 1% polyvinylpyrrolidone, or the like may be used. The blocking time is 16 to 24 hours at 4 ° C. or 1 to 3 hours at room temperature.
[0129]
Next, the membrane is washed with PBS or TBS containing 0.05 to 0.1% Tween 20 (hereinafter referred to as “washing solution”) to remove an excess blocking solution, and then manufactured by the method described in (3) above. The antibody thus obtained is immersed in a solution appropriately diluted with a blocking solution for a certain period of time to bind the antibody to the antigen on the membrane. The dilution ratio of the antibody at this time can be determined, for example, by performing a preliminary Western blotting experiment using a sample obtained by serially diluting the recombinant antigen described in 3) above. This antibody reaction operation is preferably performed at room temperature for 2 hours. After completion of the antibody reaction operation, the membrane is washed with a washing solution. Here, when the used antibody is labeled, the detection operation can be performed immediately. When an unlabeled antibody is used, a secondary antibody reaction is subsequently performed. When using a labeled secondary antibody, for example, when a commercially available product is used, it is used after diluting 2,000 to 20,000-fold with a blocking solution (if a suitable dilution ratio is described in the attached instruction, follow the description). After washing and removing the primary antibody, the membrane is immersed in a secondary antibody solution at room temperature for 45 minutes to 1 hour, washed with a washing solution, and then subjected to a detection operation according to the labeling method. The washing operation is performed, for example, by first shaking the membrane in the washing solution for 15 minutes, exchanging the washing solution for a new one, shaking for 5 minutes, exchanging the washing solution again, and shaking for 5 minutes. If necessary, the washing solution may be further exchanged for washing.
[0130]
ii) ELISA / RIA
First, as in the case of Western blotting, blocking is performed in advance to prevent nonspecific adsorption of the antibody to the bottom surface in the well of the plate on which the sample is immobilized by the method (2). The blocking conditions are as described in the section of Western blot.
[0131]
Next, after the inside of the well is washed with PBS or TBS containing 0.05 to 0.1% Tween 20 (hereinafter referred to as “washing solution”) to remove an excess blocking solution, the well is prepared by the method described in (3) above. A solution obtained by appropriately diluting the washed antibody with a washing solution is dispensed and incubated for a certain period of time to allow the antibody to bind to the antigen. The dilution ratio of the antibody at this time can be determined, for example, by performing a preliminary ELISA experiment using a serially diluted recombinant antigen described in (3) above as a sample. This antibody reaction operation is preferably performed at room temperature for about 1 hour. After completion of the antibody reaction operation, the inside of the well is washed with a washing solution. Here, when the used antibody is labeled, the detection operation can be performed immediately. When an unlabeled antibody is used, a secondary antibody reaction is subsequently performed. For example, when a commercially available product is used, the labeled secondary antibody is diluted 2,000 to 20,000 times with a washing solution and used (if a suitable dilution ratio is described in the attached instruction, follow the description). After washing and removing the primary antibody, a secondary antibody solution is dispensed into the wells, incubated at room temperature for 1 to 3 hours, washed with a washing solution, and then subjected to a detection operation according to the labeling method. The washing operation is performed by, for example, dispensing a washing solution into a well and shaking for 5 minutes, replacing the washing solution with a new one, shaking for 5 minutes, exchanging the washing solution again and shaking for 5 minutes. If necessary, the washing solution may be further exchanged for washing.
[0132]
In the present invention, the so-called sandwich ELISA can be carried out, for example, by the method described below. First, in any one of the amino acid sequences of CD39L4, two highly hydrophilic regions were selected, and a partial peptide consisting of 6 or more amino acids in each region was synthesized. Get different types of antibodies. One of the antibodies is labeled as described in (4) above. The unlabeled antibody is immobilized on the bottom surface in the well of a 96-well ELISA plate according to the method described in (2) above. After blocking, the sample solution is placed in a well and incubated at room temperature for 1 hour. After washing the wells, the labeled antibody diluent is dispensed into each well and incubated. After washing the inside of the well again, a detection operation according to the labeling method is performed.
[0133]
(6) ligand
In addition to antibodies, CD39L4 can be quantified by using ligands such as substrates, coenzymes, and regulators that specifically bind to CD39L4.
[0134]
(7) Judgment
The detection results are compared between a sample collected from a subject or a test animal and a sample collected from a normal person or a normal animal by the method described above, and as a result, the antibody prepared by the method described in (3) above is used. Alternatively, the amount of a polypeptide to which a ligand specifically binds is taken as the expression level of each CD39L4, and when the expression level of CD39L4 is increased in a normal individual, it can be determined that the possibility of having a tumor is high. .
[0135]
6. Functions of CD39L4
Thus, the physiological function of CD39L4 obtained by genetic engineering using the CD39L4 gene can be examined by expression experiments using the following viruses.
[0136]
The CD39L4 gene is amplified by, for example, a PCR method and incorporated into an expression vector for adenovirus or a retrovirus vector. At that time, a commercially available kit can also be used (for example, adenovirus expression vector kit (manufactured by Takara Shuzo) or Retro-X System (manufactured by Clontech)). The virus thus obtained is inoculated into a diabetic mouse (for example, Balb / c mouse (CLEA Japan)) through the tail vein, and the blood between the mouse and a control that receives the adenovirus containing no CD39L4 gene as a control. The ALT value (alanine aminotransferase value) and the expression level of the tumor marker gene are measured. In addition, various tissues are taken out from the mouse to examine the state of the tissue. At this time, a tissue-specific promoter (for example, rat probasin promoter (Greenberg, et al., Mol. Endocrinol. (1994) p. 230-239), mouse When a breast cancer virus promoter (Wynshaw-Boris, Cancer Handbook 2 (2002), Nature Publishing Group, London, p. 891-902, etc.) is used, a tissue in which the gene is specifically expressed is taken out and the state of the tissue is examined. By comparing each measured value with the control, the physiological function of CD39L4 can be grasped.
[0137]
7. How to detect cancer
CD39L4 is involved in canceration of cells and / or proliferation of cancer cells, and is considered to be highly expressed in cancer cells. Therefore, it is considered that a substance that suppresses the expression level of CD39L4 in a cell in which CD39L4 is overexpressed suppresses cell carcinogenesis and suppresses cancer cell proliferation. In addition, "sample" refers to blood, body fluid, prostate, testis, penis, bladder, kidney, oral cavity, pharynx, lips, tongue, gingiva, nasopharynx, esophagus, Stomach, small intestine, large intestine, colon, liver, gallbladder, pancreas, nose, lung, bone, soft tissue, skin, breast, uterus, ovary, brain, thyroid, lymph node, muscle, adipose tissue, etc. Although it means a sample, in the present invention, the prostate is more preferable.
[0138]
In the present invention, normal humans and normal animals refer to humans and animals without cancer. Whether a human is a normal human or a normal animal can also be determined by measuring the concentration of CD39L4 and determining whether the value falls within a numerical range determined in advance as a normal human value. By previously examining the correlation between the expression level of CD39L4 and the degree of cancer formation in a normal human or animal, the subject or test animal is determined by measuring the expression level of CD39L4 in a sample collected from the test subject or test animal, It can be determined whether the animal is a normal person or a normal animal.
[0139]
7.1 Method for detecting cancer using CD39L4 gene
The method for detecting cancer using CD39L4 is specifically as described in 7.1.1 or 7.1.2.
[0140]
7.1.1 Including the following steps 1) to 4):
1) a step of extracting total RNA from a specimen collected from a subject or a test animal;
2) a step of measuring a difference in the expression level of the CD39L4 gene between the total RNA derived from the sample described in the above step 1) and the total RNA extracted from a sample collected from a normal human or a normal animal;
3) A step of analyzing the difference in the expression level of the gene described in the above step 2) and detecting cancer in the subject or the test animal described in the above step 1).
[0141]
7.1.2 Including the following steps 1) to 4):
1) a step of extracting a total RNA fraction from a specimen collected from a subject or a test animal;
2) a step of extracting a total RNA fraction from a specimen collected from a normal human or a normal animal;
3) a step of measuring the expression level of the CD39L4 gene between the total RNA fraction described in the above step 1) and the total RNA fraction described in the above step 2);
4) Analyze the difference in the expression level of the gene measured in the above step 3) between the total RNA fraction derived from the above step 1) and the total RNA fraction derived from the above step 2). Detecting the cancer of the subject or test animal described above.
[0142]
7.1.3 Here, extraction of total RNA in step 1) of 7.1.1 and step 1) and step 2) of 7.1.2 is described in the section “1. Acquisition of CD39L4 gene” above. It can be carried out according to the method shown, and it is desirable that the extracted total RNA be further purified and used as mRNA. In addition, the measurement of the expression level of the CD39L4 gene in step 2) of 7.1.1 and step 3) of 7.1.2 is measured using the method described in the section “4. Tumor marker gene” above. It can be measured using nucleic acid hybridization using solid-phased samples such as Northern blot, dot blot, slot blot, RT-PCR, ribonuclease protection assay, run-on assay, gene chip, and cDNA array. It is desirable.
[0143]
7.2 Method for detecting cancer using CD39L4
The method for detecting cancer using CD39L4 of the present invention specifically includes the following 7.2.1, 7.2.2, 7.2.3 or 7.2.4.
7.2.1 Including the following steps 1) and 2):
1) a step of measuring the expression level of CD39L4 in a sample collected from a subject or a test animal;
2) Analyze the difference between the expression level of the protein detected in the above step 1) and the expression level of the protein in a sample collected from a normal human or normal animal, and detect cancer in the subject or the test animal in the above step 1). Process.
[0144]
7.2.2 Including the following steps 1) to 3):
1) Step of measuring the expression level of CD39L4 in a sample collected from a subject or a test animal:
2) a step of measuring the expression level of the protein according to 1) in a sample collected from a normal human or a normal animal:
3) a step of analyzing the difference between the expression level of the protein measured in the above step 1) and the expression level of the protein measured in the above step 2) to detect cancer in a subject or a test animal.
[0145]
7.2.3 Including the following steps 1) to 3):
1) immobilizing all proteins obtained from a specimen collected from a subject or a test animal;
2) a step of measuring the expression level of CD39L4 in the immobilized protein according to the above step 1);
3) Analyze the difference between the expression level of the protein measured in the above step 2) and the expression level of the protein in the total protein obtained from a sample collected from a normal human or a normal animal. Detecting cancer of the subject.
[0146]
7.2.4 A method for detecting cancer, comprising the following steps 1) to 5):
1) immobilizing all proteins obtained from a specimen collected from a subject or a test animal;
2) immobilizing all proteins obtained from a specimen collected from a normal human or a normal animal;
3) A step of measuring the expression level of CD39L4 in the immobilized protein according to the above step 1):
4) a step of measuring the expression level of the protein whose expression level has been measured in step 3) in the immobilized protein according to step 2);
5) analyzing the difference between the expression level of the protein measured in the above step 3) and the expression level of the protein measured in the above step 4), and detecting the cancer of the subject or test animal according to the above step 1); .
[0147]
7.2.5 Here, 7.2.1 step 1), step 2), 7.2.2 step 1), step 2), 7.2.3 step 2), step 3), For the measurement of the expression level of the protein in step 3) and step 4) of 7.2.4, the method described in the above section “5. Tumor marker protein” can be used, and preferably, it specifically binds to CD39L4. Methods using antibodies or ligands, more preferably Western blotting, dot blotting, slot blotting or enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) can be used.
[0148]
7.3 Judgment
7.1.1 step 3), 7.1.2 step 4), 7.2.1 step 1), 7.2.2 step 3), 7.2.3 step 3) and It is desirable that the detection of cancer in step 5) of 7.2.4 is performed by comprehensively evaluating the difference in expression level. The “difference in expression level” refers to the expression level ratio, even if the difference is in the expression level, as long as the expression level of CD39L4 in a sample derived from a subject or a test animal and a sample derived from a normal person or normal animal can be quantitatively compared. It may be.
[0149]
As a result of the above analysis, a measurement result is compared between a sample derived from a sample collected from a subject or a test animal and a sample derived from a normal human or a normal animal, and when the expression level of CD39L4 is higher than that of a normal human or a normal animal, It can be determined that the subject has cancer.
[0150]
8. CD39L4 gene and / or kit for detecting CD39L4
The CD39L4 gene and / or CD39L4 can be detected using a kit containing at least one or more selected from the group consisting of the following 1) to 5).
1) a continuous oligonucleotide primer having a length of 15 to 30 bases for specifically amplifying a polynucleotide consisting of a nucleotide sequence selected from the group shown in SEQ ID NOs: 1, 5 and 7 in the sequence listing;
2) It hybridizes under stringent conditions to a polynucleotide consisting of a nucleotide sequence selected from the group shown in SEQ ID NOs: 1, 3, 5 and 7 in the sequence listing, and has a length of at least 15 nucleotides for detecting the polynucleotide. A continuous polynucleotide probe;
3) an immobilized sample on which a polynucleotide consisting of a nucleotide sequence selected from the group shown in SEQ ID NOs: 1, 3, 5, and 7 in the sequence listing is fixed;
4) an antibody that specifically binds to a protein consisting of an amino acid sequence selected from the group shown in SEQ ID NOs: 2, 4, 6, and 8 in the sequence listing, and detects the protein;
5) A secondary antibody capable of binding to the antibody according to 4).
[0151]
The primer described in 1) above is a commercially available primer design software (for example, Wisconsin GCG package) based on the nucleotide sequence of CD39L4 gene (nucleotide sequence shown in any one of SEQ ID NOs: 1, 3, 5, and 7 in the sequence listing). Version 10.2) can be easily designed and amplified by a conventional method. As such a primer, for example, in order to amplify a polynucleotide consisting of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1 in the Sequence Listing, an oligonucleotide consisting of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 9 in the Sequence Listing and SEQ ID NO: A combination of oligonucleotides consisting of the nucleotide sequence shown in No. 10 can be used. The probe described in 2) above is a polynucleotide that specifically hybridizes to CD39L4, and has a length of 100 to 1500 bases, preferably 300 to 600 bases. These primers and probes may be labeled with an appropriate label (for example, an enzyme label, a radioactive label, a fluorescent label, and the like), and may be added with a linker.
[0152]
The solid-phased sample described in 3) above is prepared by fixing the probe described in 2) above to a solid phase such as a glass plate or a nylon membrane. The method for preparing such an immobilized sample is as described in the section “(1) Analysis method using immobilized sample” in the section “4. Tumor marker gene”. Gene chips, cDNA arrays, oligo arrays, membrane filters and the like can be mentioned.
[0153]
The kit of the present invention can further include a thermostable DNA polymerase, dNTP (a mixture of dATP, dCTP, dGTP, and dTTP) and a buffer. Examples of the heat-resistant DNA polymerase include Taq DNA polymerase, LA Taq DAN polymerase (manufactured by Takara Shuzo), Tth DNA polymerase, and Pfu DNA polymerase. The buffer is selected depending on the DNA polymerase to be used. ²⁺ Etc. are added.
[0154]
The antibodies described in 4) and 5) above can be prepared by the method described in 3.2. The antibody may be labeled with a suitable label (for example, an enzyme label, a radioactive label, a fluorescent label, etc.).
[0155]
The kit of the present invention can be used for detecting the CD39L4 gene and / or CD39L4, and can also be used for determining the presence or absence of cancer and for screening for a substance that suppresses cancer growth.
[0156]
9. Method for screening substance having cancer therapeutic and / or prophylactic effect
By measuring the expression level of at least one of the CD39L4 gene or CD39L4, a substance having a therapeutic and / or preventive effect on cancer can be screened.
[0157]
The “test substance” refers to a substance whose cancer growth inhibitory activity is to be examined by the screening method of the present invention. The test substance includes compounds, metabolites of microorganisms, extracts of plant and animal tissues, derivatives thereof, and mixtures thereof. In addition, a nucleic acid designed to reduce the expression level of CD39L4 or a derivative thereof (including an antisense oligonucleotide, a ribozyme, a dsRNA, an siRNA, and the like) can be used as a test substance. The dose and concentration of the test substance may be set as appropriate, or a plurality of doses may be set, for example, by creating a dilution series, and the test substance may be administered in an appropriate state such as a solid or liquid. Or a stabilizer or the like may be added. In the case of a screening method using cultured cells, the cells can be added to a medium and cultured. When it is added to the medium, it may be added from the start of the culture, or may be added during the culture, and the number of additions is not limited to one. The period for culturing in the presence of the test substance may be appropriately set, but is preferably 30 minutes to 2 weeks, and more preferably 30 minutes to 48 hours. When a test substance is administered to a mammal individual, administration forms such as oral administration, intravenous injection, intraperitoneal injection, transdermal administration, and subcutaneous injection are used depending on the properties of the test substance. It can also be applied or injected directly to the cancer. The time from the administration of the test substance until the specimen is obtained can be appropriately selected.
[0158]
Cultured cells used in the screening method of the present invention may be normal cells or cells showing abnormal proliferation such as cancer cells, as long as they are mammalian cells expressing CD39L4. For example, mouse fibroblast-derived cells Strain NIH3T3 cells, human prostate cancer cell line LnCaP, mouse, rat and human free adipocytes, mouse, rat and human primary hepatocytes, but are not limited thereto. The mammalian species of the cultured cells are preferably humans, mice or hamsters, and more preferably humans or mice, but are not limited thereto. It is more preferable to use mammalian cells overexpressing CD39L4 as the cultured cells. Examples thereof include NIH3T3 cells into which CD39L4 gene is introduced together with its promoter region and CD39L4 is overexpressed.
[0159]
The screening method of the present invention includes a method of administering a test substance to a mammalian individual without using cultured cells, and then detecting the expression of the CD39L4 gene of the present invention in the organ or tissue cell extracted from the animal individual. Is also included. The organ or tissue to be detected for gene expression may be any organ or tissue that expresses CD39L4, but is preferably a tissue in which cancer has occurred. As the mammalian species, non-human mammals can be used, and mice, rats or hamsters are preferred, and mice or rats are more preferred. In addition, tumor-bearing animals (nude mice transplanted with human cancer strains, allografted mice, etc.), which are tumor model animals in which tumors derived from humans, monkeys, mice or rats are transplanted subcutaneously, intradermally, or intraperitoneally, or Animals of a strain that naturally produces cancer (including naturally identified animals and genetically modified animals; for example, p53 knockout mice (Donehower et al., Nature (1992), 356, pp. 215-221), Myc transgenic mice (Adams et al., Nature (1985), Vol. 318, p. 533-538), TRAMP mouse (Foster et al., Cancer Res. (1997), Vol. 57, p. 3325-3330) and the like can also be used. Animals overexpressing CD39L4 can also be used. It is also possible to use the animal was subjected to the calling procedure.
[0160]
The cultured cells used in the method of the present invention may be cultured under any conditions that can express CD39L4 when no test substance is added. For example, known culture conditions are known for the cultured cells, and when the cells express CD39L4 under the conditions, the cells may be cultured under the conditions. In addition, when detecting the expression of CD39L4 in an organ or tissue isolated from a mammalian individual, the breeding condition of the animal may be any condition that allows expression of CD39L4 when no test substance is added.
[0161]
In order to examine the effect of the test substance on the expression of the CD39L4 gene, there are a method of measuring the expression level of the CD39L4 gene and a method of measuring the expression level of CD39L4, which is a translation product of the CD39L4 gene. A test substance that suppresses the expression of the CD39L4 gene or CD39L4 is considered to be a substance that has a therapeutic and / or prophylactic effect on cancer.
[0162]
For extraction of total RNA, measurement of the expression level of CD39L4 gene, and measurement of the expression level of CD39L4 from cultured cells, the above-mentioned “1. Acquisition of CD39L4 gene”, “4. Tumor marker gene” and “5. Protein ".
[0163]
9.1 Method Using CD39L4 Gene
As the screening method of the present invention, for example, a method using cultured cells derived from mammals and a method using mammalian individuals are as follows.
[0164]
A) Method using mammalian-derived cultured cells
A-1) The following steps 1) to 3) are included.
1) a step of extracting total RNA from mammalian-derived cultured cells cultured in a medium to which a test substance has been added;
2) detecting the difference in the expression level of the CD39L4 gene between the total RNA derived from 1) and the total RNA derived from cultured mammalian cells cultured without adding a test substance;
3) a step of analyzing the difference in the expression level of the CD39L4 gene and determining the therapeutic and / or preventive effect of the test substance on cancer.
[0165]
A-2) It includes the following steps 1) to 4).
1) a step of extracting a total RNA fraction from cultured cells derived from mammals cultured in a medium to which a test substance has been added;
2) a step of extracting a total RNA fraction from mammalian-derived cultured cells cultured in a medium to which a test substance is not added;
3) a step of measuring the expression level of the CD39L4 gene in the total RNA fraction derived from the above step 1) and the total RNA fraction derived from the above step 2);
4) Analyze the difference in the expression level of the polynucleotide measured in the above step 3) between the total RNA fraction derived from the above step 1) and the total RNA fraction derived from the above step 2). A step of treating cancer and / or determining a therapeutic effect.
[0166]
B) Method using a mammalian individual
B-1) The following steps 1) to 3) are included.
1) a step of extracting total RNA from a specimen collected from a mammalian individual to which the test substance has been administered;
2) a step of detecting a difference in the expression level of the CD39L4 gene between the total RNA derived from the above step 1) and the total RNA obtained from a specimen collected from an animal individual to which the test substance has not been administered;
3) a step of analyzing the difference in the expression level of the CD39L4 gene described in step 2) and determining the therapeutic and / or prophylactic effect of the test substance on cancer.
[0167]
B-2) The following steps 1) to 4) are included.
1) a step of extracting total RNA from a specimen collected from a mammalian individual to which the test substance has been administered;
2) a step of extracting total RNA from a specimen collected from a mammal individual to which the test substance has not been administered;
3) a step of measuring the expression level of the CD39L4 gene in the total RNA from step 1) and the total RNA from step 2);
4) a step of analyzing the difference in the expression level of the CD39L4 gene described in 3) and determining the therapeutic and / or preventive effect of the test substance on cancer.
[0168]
9.2 Method using CD39L4
The screening method using the measurement of the expression level of CD39L4 includes the following steps for a method using mammalian cultured cells and a method using animal individuals.
[0169]
A) Method using mammalian-derived cultured cells
A-1) Including the following steps 1) and 2):
1) a step of measuring the expression level of CD39L4 in cultured cells derived from a mammal cultured in a medium to which a test substance is added;
2) The difference between the expression level of CD39L4 measured in 1) and the expression level of the protein in cultured cells derived from mammals cultured in a medium without the test substance was analyzed, and the therapeutic effect on cancer of the test substance and / or A step of determining a preventive effect;
[0170]
A-2) Including the following steps 1) to 3):
1) a step of measuring the expression level of CD39L4 in cultured cells derived from a mammal cultured in a medium to which a test substance is added;
2) a step of measuring the expression level of CD39L4 according to the above 1) in a cultured cell derived from a mammal cultured in a medium to which a test substance is not added;
3) a step of detecting the difference between the expression level of CD39L4 measured in the above step 1) and the expression level of CD39L4 measured in the above step 2) to determine the therapeutic effect and / or preventive effect of the test substance on cancer .
[0171]
A-3) Including the following steps 1) to 3):
1) immobilizing all proteins obtained from cultured cells derived from mammals cultured in a medium to which a test substance is added;
2) a step of measuring the expression level of the CD39L4 of the present invention in the solid-phased protein;
3) Analyze the difference between the expression level of CD39L4 detected in 2) above and the expression level of the protein in the total protein obtained from cultured cells derived from mammals cultured in a medium to which the test substance is not added. Determining the therapeutic and / or prophylactic effect of the drug.
[0172]
A-4) Including the following steps 1) to 5):
1) immobilizing all proteins obtained from cultured cells derived from mammals cultured in a medium to which a test substance is added;
2) immobilizing all proteins obtained from cultured cells derived from mammals cultured in a medium to which no test substance is added;
3) a step of measuring the expression level of CD39L4 in the immobilized protein according to the above step 1) using an antibody or a ligand that specifically binds to the protein;
4) a step of measuring the expression level of CD39L4 in the immobilized protein according to the above step 2) using an antibody or a ligand that specifically binds to the protein;
5) Analyze the difference between the expression level of the protein measured in step 3) and the expression level of the protein measured in step 4) to determine the therapeutic and / or prophylactic effect of the test substance on cancer. Process.
[0173]
B) Method using a mammalian individual
B-1) Including the following steps 1) and 2):
1) a step of measuring the expression level of CD39L4 protein in a sample collected from a mammal individual to which the test substance has been administered;
2) Analyzing the difference between the expression level of CD39L4 measured in the above step 1) and the expression level of the protein in a specimen collected from a mammal individual to which the test substance was not administered, And / or a step of determining a preventive effect.
[0174]
B-2) Including the following steps 1) to 3):
1) a step of measuring the expression level of CD39L4 in a specimen collected from a mammalian individual to which the test substance has been administered, using an antibody or ligand that specifically binds to the protein;
2) a step of measuring the expression level of the protein in a sample collected from a mammal individual to which the test substance has not been administered;
3) analyzing the difference between the expression level of CD39L4 measured in 1) and the expression level of CD39L4 measured in 2), and determining the therapeutic and / or prophylactic effect of the test substance on cancer.
[0175]
B-3) Including the following steps 1) to 3):
1) immobilizing all proteins in a sample collected from a mammal individual to which the test substance has been administered;
2) measuring the expression level of CD39L4 in the immobilized protein;
3) Analyze the difference between the expression level of CD39L4 detected in the above step 2) and the expression level of the protein in a sample collected from a mammal individual to which the test substance has not been administered, to treat the test substance for cancer and And / or a step of determining a preventive effect.
[0176]
B-4) Including the following steps 1) to 5):
1) immobilizing all proteins in a sample collected from a mammal individual to which the test substance has been administered;
2) immobilizing all proteins in a sample collected from a mammal individual to which the test substance has not been administered;
3) a step of detecting the expression level of CD39L4 in the solid-phased protein according to the above step 1) using an antibody or a ligand that specifically binds to the protein;
4) a step of detecting the expression level of CD39L4 in the solid-phased protein according to 2) above, using an antibody or a ligand that specifically binds to the protein;
5) analyzing the difference between the expression level of CD39L4 detected in 3) and the expression level of CD39L4 detected in 4), and determining the therapeutic and / or prophylactic effect of the test substance on cancer.
[0177]
9.3 Other methods
The incidence of cancer, the size of cancer, and / or the survival rate are measured over time when the test substance is administered to a mammal individual overexpressing CD39L4 and when the test substance is not administered. The incidence of cancer is significantly reduced in the mammal to which the test substance is administered, the size of the cancer is significantly smaller, and / or the survival rate is about 10% or more, preferably about 30% or more, more preferably When the test substance increases by about 50% or more, the test substance can be selected as a compound having a therapeutic and / or prophylactic effect on cancer against cancer.
[0178]
10. Search for directly interacting substances
Another embodiment of the present invention includes a drug design technique based on the three-dimensional structure of the protein, which aims at obtaining a substance that suppresses the activity of CD39L4. Such a technique is known as a rational drug design method, and is used for searching for a compound that efficiently inhibits or activates functions such as enzyme activity and binding to a ligand, cofactor, or DNA. ing. As an example of this, inhibitors of proteases, which are already marketed anti-HIV agents, are well known. In the three-dimensional structure analysis of CD39L4 of the present invention, it is considered that generally well-known techniques such as X-ray crystallography and nuclear magnetic resonance can be used. Furthermore, in order to search for a substance that suppresses the function of CD39L4, design utilizing computer drug design (CADD) is also possible. As this example, a low molecular weight compound (International Patent Application Publication No. WO 99/58515) which inhibits the function of AP-1 which is expected as a new genomic drug for the treatment of rheumatoid arthritis is known. By such a method, a substance that suppresses the function of CD39L4 by directly binding to CD39L4 or inhibiting the interaction of CD39L4 with other factors can be obtained.
[0179]
Still another embodiment relates to a polypeptide to which the CD39L4 of the present invention associates, ie, a CD39L4 partner protein. That is, the present invention relates to a method for screening a partner protein that regulates the activity of CD39L4.
[0180]
One embodiment of this screening method includes a step of contacting a test protein sample with CD39L4 and selecting a protein that binds to CD39L4. As such a method, for example, a method of performing affinity purification of a protein binding thereto using purified CD39L4 can be mentioned. An example of a specific method is as follows. A sequence obtained by fusing a sequence consisting of six histidines with CD39L4 as an affinity tag is prepared, and this is extracted from a cell (a nickel-agarose column is charged in advance, and the column is charged). (Passed fraction) at 4 ° C. for 12 hours, and then separately add a nickel-agarose carrier to the mixture and incubate at 4 ° C. for 1 hour. After sufficiently washing the nickel-agarose carrier with a washing buffer, 100 mM imidazole is added to elute and purify the protein in the cell extract specifically binding to CD39L4, and the structure is determined. In this way, a protein that directly binds to CD39L4 and a protein that does not have CD39L4 binding activity but binds indirectly to CD39L4 by forming a complex with a protein that directly binds to CD39L4 as a subunit are purified. [Experimental Medicine Separate Volume, Bio Manual Series 5, “Transcription Factor Research Methods”, pp. 215-219 (published by Yodosha)].
[0181]
As another method, a far western blot method [Experimental Medicine Separate Volume, “New Genetic Engineering Handbook”, pp76-81 (published by Yodosha)] and a two-hybrid system method using yeast or mammalian cells [Experimental Medicine Separate Volume, Cloning by "New Genetic Engineering Handbook" pp66-75 (published by Yodosha), "Checkmate Manmarian Two Hybrid System" (promega)] is also possible, but is not limited to these methods.
[0182]
If a cDNA of a partner protein that directly or indirectly interacts with CD39L4 is obtained in this manner, it can be used for functional screening of a substance that inhibits the interaction between CD39L4 and the partner protein. Specifically, for example, a fusion protein of CD39L4 and glutathione S-transferase is prepared, bound to a microplate covered with an anti-glutathione S-transferase antibody, and then the biotinylated partner protein is combined with this fusion protein. After contact, the binding to the fusion protein is detected with streptavidinated alkaline phosphatase. When the biotinylated partner protein is added, a test substance is also added, and a substance that promotes or inhibits the binding between the fusion protein and the partner protein is selected. According to this method, a substance that directly acts on the fusion protein or a substance that directly acts on the partner protein is obtained.
[0183]
If the binding between the fusion protein and the partner protein is indirect and mediated by some other factor, the above assay is performed in the same manner, for example, in the presence of a cell extract containing the factor. In this case, a substance that acts on the factor may be selected.
[0184]
When the obtained partner protein has an activity of suppressing the function of CD39L4, an anticancer agent, for example, treatment or prevention of prostate cancer, according to the test method using a CD39L4 gene expression vector described above. Screening of a candidate substance useful as an agent can be performed. When the obtained partner protein has an activity of suppressing the function of CD39L4, a polynucleotide having a nucleotide sequence encoding such an inhibitor can be used for gene therapy of cancer. .
[0185]
Such a polynucleotide can be obtained by, for example, analyzing the amino acid sequence of the identified inhibitor, synthesizing an oligonucleotide probe consisting of a nucleotide sequence encoding the amino acid sequence, and screening a cDNA library or genomic library. Can be obtained. When the peptide having the activity of inhibiting the function of CD39L4 is derived from a randomly synthesized artificial peptide library, a DNA consisting of a nucleotide sequence encoding the amino acid sequence of the peptide is chemically synthesized.
[0186]
In gene therapy, a gene encoding the inhibitor thus obtained is incorporated into, for example, a viral vector, and a virus (detoxified) having the recombinant viral vector is transmitted to a patient. Since an anticancer factor is produced in the patient and has a function of suppressing the growth of cancer cells, cancer can be treated.
[0187]
As a method for introducing a gene therapy agent into cells, a gene transfer method using a viral vector or a non-viral gene transfer method (Nikkei Science, April 1994, pp. 20-45, Experimental Medicine Special Edition, 12 (15) (1994), Experimental Medicine Separate Volume, “Basic Technology for Gene Therapy”, Youtosha (1996)).
[0188]
As a method for gene transfer using a virus vector, for example, TR4 or mutant TR4 is encoded in a DNA virus or RNA virus such as retrovirus, adenovirus, adeno-associated virus, herpes virus, vaccinia virus, pox virus, polio virus, and simbis virus. And a method of incorporating and introducing DNA to be incorporated. Among them, a method using a retrovirus, an adenovirus, an adeno-associated virus, and a vaccinia virus is particularly preferable. Examples of non-viral gene transfer methods include a method of directly administering an expression plasmid intramuscularly (DNA vaccine method), a liposome method, a lipofectin method, a microinjection method, a calcium phosphate method, and an electroporation method. The vaccine method and the liposome method are preferred.
[0189]
Further, in order for a gene therapy agent to actually act as a medicine, an in vivo method of directly introducing DNA into the body, or a method of removing certain cells from a human and introducing the DNA into the cells outside the body, and then transferring the cells to the body (Nikkei Science, April 1994, pp. 20-45, Monthly Pharmaceutical Affairs, 36 (1), 23-48 (1994), Experimental Medicine Special Edition, 12 (15) (1994) )).
[0190]
For example, when the gene therapy agent is administered by an in vivo method, it is administered by an appropriate administration route, such as vein, artery, subcutaneous, intradermal, intramuscular, etc., depending on the disease, condition and the like. When administered by an in vivo method, the gene therapy agent is generally used as an injection or the like, but if necessary, a conventional carrier may be added. In the case of a liposome or a membrane-fused liposome (Sendai virus-liposome or the like), a liposome preparation such as a suspension, a freezing agent, a centrifugal concentrated frozen agent and the like can be obtained.
[0191]
Complementary to the nucleotide sequence represented by nucleotide numbers 247 to 1533 of SEQ ID NO: 1, nucleotides 247 to 1533 of SEQ ID NO: 3, nucleotides 283 to 1569 of SEQ ID NO: 5, or nucleotides 398 to 1621 of SEQ ID NO: 7 in the sequence listing A nucleotide sequence complementary to a complete nucleotide sequence or a partial sequence thereof can be used for so-called antisense therapy. The antisense molecule is represented by nucleotide numbers 247 to 1533 of SEQ ID NO: 1, nucleotide numbers 247 to 1533 of SEQ ID NO: 3, nucleotide numbers 283 to 1569 of SEQ ID NO: 5, or nucleotide numbers 398 to 1621 of SEQ ID NO: 7 in the sequence listing. Used as a DNA consisting of usually 15 to 30 mer complementary to a part of the nucleotide sequence, or a stable DNA derivative such as phosphorothioate, methylphosphonate or morpholino derivative thereof, or a stable RNA derivative such as 2'-O-alkyl RNA. obtain. Such antisense molecules can be introduced into cells by methods well known in the art of the present invention, such as by microinjection, liposome encapsulation, or expression using a vector having an antisense sequence. Such antisense therapy is performed by using nucleotide numbers 247 to 1533 of SEQ ID NO: 1, nucleotide numbers 247 to 1533 of SEQ ID NO: 3, nucleotide numbers 283 to 1569 of SEQ ID NO: 5, or nucleotide numbers 398 to 1621 of SEQ ID NO: 7 in the sequence listing. Is useful for treating or preventing a disease caused by excessively increasing the activity of the protein encoded by the nucleotide sequence shown in (1).
[0192]
A composition useful as a medicine containing the antisense oligonucleotide can be produced by a known method such as mixing a pharmaceutically acceptable carrier. Examples of such carriers and methods of manufacture are described in Applied Antisense Oligonucleotide Technology (1998 Wiley-Liss, Inc.). The preparation containing the antisense oligonucleotide is itself or a mixture with an appropriate pharmacologically acceptable excipient, diluent, or the like, and is orally administered as a tablet, capsule, granule, powder, or syrup. Alternatively, it can be administered parenterally by injection, suppository, patch, or external preparation. These formulations include excipients (e.g., sugar derivatives such as lactose, sucrose, glucose, mannitol, sorbitol; starch derivatives such as corn starch, potato starch, alpha starch, dextrin; cellulose derivatives such as crystalline cellulose; Arabic gum; dextran; organic excipients such as pullulan; and silicate derivatives such as light anhydrous silicic acid, synthetic aluminum silicate, calcium silicate, magnesium metasilicate aluminate; phosphates such as calcium hydrogen phosphate; Inorganic excipients such as carbonates such as calcium; sulfates such as calcium sulfate; and lubricants (eg, stearic acid, metal stearate such as calcium stearate, magnesium stearate). Salt; talc; colloidal silica; beeswax; Waxes such as wax; boric acid; adipic acid; sulfates such as sodium sulfate; glycol; fumaric acid; sodium benzoate; DL leucine; lauryl sulfates such as sodium lauryl sulfate and magnesium lauryl sulfate; Silicic acids such as silicic acid hydrate; and the above-mentioned starch derivatives.), Binders (eg, hydroxypropylcellulose, hydroxypropylmethylcellulose, polyvinylpyrrolidone, macrogol, and the same as the above-mentioned excipients) And disintegrants (for example, cellulose derivatives such as low-substituted hydroxypropylcellulose, carboxymethylcellulose, carboxymethylcellulose calcium, and internally cross-linked sodium carboxymethylcellulose); Starch, cellulose modified chemically such as sodium carboxymethyl starch, crosslinked polyvinylpyrrolidone), emulsifiers (eg, colloidal clays such as bentonite and veegum); magnesium hydroxide, hydroxide Metal hydroxides such as aluminum; anionic surfactants such as sodium lauryl sulfate and calcium stearate; cationic surfactants such as benzalkonium chloride; and polyoxyethylene alkyl ethers and polyoxyethylene sorbitan fatty acids Esters, nonionic surfactants such as sucrose fatty acid esters, and stabilizers (paraoxybenzoic acid esters such as methylparaben and propylparaben; chlorobutanol, benzyl alcohol, phenylethyl) Alcohols such as alcohol; benzalkonium chloride; phenols, phenols such as cresol; thimerosal; dehydroacetic acid; and sorbic acid and the. ), Flavoring agents (for example, commonly used sweeteners, sour agents, flavors, etc.) and diluents can be used in a well-known method.
[0193]
As for the method of introducing the compound of the present invention into a patient, a colloid dispersion system can be used in addition to the above. The colloidal dispersion system is expected to have the effect of increasing the stability of the compound in vivo and the effect of efficiently transporting the compound to a specific organ, tissue or cell. Colloidal dispersions are not limited as long as they are commonly used, but are based on polymer complexes, nanocapsules, microspheres, beads, and lipids including oil-in-water emulsifiers, micelles, mixed micelles, and liposomes. Dispersed systems can be mentioned, and are preferably a plurality of liposomes and artificial membrane vesicles having an effect of efficiently transporting a compound to a specific organ, tissue or cell (Mannino et al., Biotechniques, 1988). , 6,682; Blume and Cevc, Biochem. Et Biophys. Acta, 1990, 1029, 91; Lappalainen et al., Antiviral Res., 1994, 23, 119; Chonn and Cullis, Curent. 995,6,698).
[0194]
Unilamellar liposomes, ranging in size from 0.2-0.4 μm, can encapsulate a significant proportion of the aqueous buffer containing macromolecules, and the compound is encapsulated in this aqueous inner membrane, Is transported to brain cells in a more active form (Fraley et al., Trends Biochem. Sci., 1981, 6, 77). The composition of the liposome is usually a complex of a lipid, especially a phospholipid, especially a phospholipid having a high phase transition temperature, with one or more steroids, especially cholesterol. Examples of lipids useful for liposome production include phosphatidyl compounds such as phosphatidylglycerol, phosphatidylcholine, phosphatidylserine, sphingolipids, phosphatidylethanolamine, cerebroside and ganglioside. Particularly useful are diacylphosphatidylglycerols, wherein the lipid moiety contains 14-18 carbon atoms, especially 16-18 carbon atoms, and is saturated (with a double bond within the 14-18 carbon atom chain). Lack). Representative phospholipids include phosphatidylcholine, dipalmitoyl phosphatidylcholine, and distearoyl phosphatidylcholine.
[0195]
Targeting colloidal dispersion systems, including liposomes, may be either passive or active. Passive targeting is achieved by taking advantage of the liposome's natural tendency to distribute to cells of the reticuloendothelial system of organs containing sinusoidal capillaries. On the other hand, active targeting can be performed, for example, by using a protein coat of a virus (Morishita et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 1993, 90, 8474), a monoclonal antibody (or its appropriate). Specific ligands such as sugars, glycolipids or proteins (or suitable oligopeptide fragments thereof) to liposomes, or distribution to organs and cell types other than the naturally occurring localized sites In order to achieve the above, there can be mentioned a method of modifying the liposome by changing the composition of the liposome. The surface of the targeted colloidal dispersion can be modified in various ways. In liposome-targeted delivery systems, lipid groups can be incorporated into the lipid bilayer of the liposome to maintain the target ligand in intimate association with the lipid bilayer. Various linking groups can be used to link the lipid chain to the targeting ligand. Target ligands that bind to specific cell surface molecules that are predominantly found on cells where delivery of the oligonucleotides of the invention are desired are, for example, (1) predominantly expressed by cells where delivery is desired Polyclonal or monoclonal antibodies that specifically bind to hormones, growth factors or suitable oligopeptide fragments thereof, or (2) antigenic epitopes predominantly found on target cells, which bind to specific cell receptors Or a suitable fragment thereof (eg, Fab; F (ab ') 2). The two or more bioactive agents can also be complexed and administered within a single liposome. Agents that increase the intracellular stability and / or targeting of the contents can also be added to the colloidal dispersion.
[0196]
The dosage varies depending on symptoms, age, etc., but in the case of oral administration, the lower limit is 1 mg (preferably 30 mg) and the upper limit is 2000 mg (preferably 1500 mg) per dose. A lower limit of 0.1 mg (preferably 5 mg) and an upper limit of 1000 mg (preferably 500 mg) can be administered by subcutaneous injection, intramuscular injection or intravenous injection.
[0197]
11. Pharmaceuticals containing an antibody against CD39L4
Since cells become cancerous when CD39L4 is overexpressed, an antibody against CD39L4 can be a therapeutic and / or prophylactic agent for cancer. When an antibody against CD39L4 is used as a pharmaceutical for humans, it is desirable to prepare a humanized anti-human CD39L4 antibody from the viewpoint of antigenicity. Preparation of a humanized anti-human CD39L4 antibody can be obtained by the following method. That is, (1) human lymphocytes collected from human peripheral blood or spleen are sensitized in vitro with human CD39L4 as an antigen in the presence of IL-4, and the sensitized human lymphocytes are heterohybridomas of mice and humans. K ₆ H ₆ / B ₅ (ATCC CRL-1823) to screen the desired antibody-producing hybridoma. The antibody produced by the obtained antibody-producing hybridoma is a humanized anti-human CD39L4 monoclonal antibody. An antibody that neutralizes the activity of human CD39L4 is selected from these antibodies. However, in the method of sensitizing human lymphocytes in vitro as described above, it is generally difficult to obtain an antibody having a high affinity for an antigen. Therefore, in order to obtain a monoclonal antibody having a high affinity for human CD39L4, it is necessary to increase the affinity of the low-affinity human anti-human CD39L4 monoclonal antibody obtained as described above. To do so, a random mutation is introduced into the CDR region (particularly CDR-3) of the humanized anti-human CD39L4 monoclonal antibody which is obtained as described above and is a low-affinity neutralizing antibody, and this is expressed in phage. A phage that strongly binds to human CD39L4 as an antigen is selected by a phage display method using a plate on which human CD39L4 is immobilized, and the phage is expanded in E. coli. May be determined. A human-type anti-human CD39L4 monoclonal antibody can be obtained by incorporating the gene encoding the human-type anti-human CD39L4 monoclonal antibody thus obtained into a commonly used expression vector for mammalian cells and expressing it. . From these, the desired human anti-CD39L4 monoclonal antibody that neutralizes the biological activity of human CD39L4 and has high affinity can be selected. (2) A mouse-type anti-human CD39L4 monoclonal antibody was prepared using Balb / c mice by a conventional method (Kohler et al .: Nature 256, p. 495-497, 1975) in the same manner as in the present invention. A monoclonal antibody that neutralizes the biological activity of human CD39L4 and has high affinity is selected. CDR-grafting (Winter and Milstein: Nature 349, p293-299, 1991) in which the CDR-regions (CDR-1, 2 and 3) of this high-affinity mouse anti-human CD39L4 monoclonal antibody are transplanted into the CDR regions of human IgG. Humanization is possible by making full use of the technique. In addition to the above, {circle around (3)} human peripheral blood lymphocytes are transplanted into Severe combined immune definition (SCID) mice, and the transplanted SCID mice produce human antibodies (Mosier DE et al .: Nature). 335, p256-259, 1988; Duchosal MA et al .: Nature 355, p258-262, 1992), by sensitizing and screening with human CD39L4 as an antigen, thereby screening specific for human CD39L4. Lymphocytes producing a humanized monoclonal antibody can be collected from the mouse. The obtained lymphocytes were purified from a mouse and human heterohybridoma K in the same manner as in the above-mentioned method (1) for preparing a human antibody. ₆ H ₆ / B ₅ (ATCC CRL-1823), and the resulting hybridomas are screened to obtain hybridomas producing the desired humanized monoclonal antibody. By culturing the hybridoma thus obtained, the desired humanized monoclonal antibody can be produced in a large amount, and separated and purified by various known separation procedures utilizing the physical properties, chemical properties, etc. of the protein. It can be purified. As the method, specifically, for example, treatment with a normal protein precipitant, ultrafiltration, molecular sieve chromatography (gel filtration), adsorption chromatography, ion exchange chromatography, affinity chromatography, high-performance liquid chromatography ( Examples thereof include various liquid chromatography such as HPLC, dialysis, and combinations thereof. Also, by cloning the gene (cDNA) encoding the desired humanized monoclonal antibody, incorporating this gene into an appropriate vector by genetic engineering techniques, and expressing it in various animal cells, co-injected cells, or Escherichia coli as a host. Thus, a large amount of recombinant humanized monoclonal antibodies can be produced. By purifying the obtained culture solution in the same manner as described above, a large amount of the purified humanized monoclonal antibody can be obtained. Furthermore, from the anti-CD39L4 monoclonal antibodies obtained by the above-described method, an antibody that neutralizes the biological activity of CD39L4 can be obtained. Since antibodies that neutralize the biological activity of CD39L4 inhibit the biological activity of CD39L4 in a living body, that is, inhibit the canceration of cells, they are expected to be used as pharmaceuticals, particularly as therapeutic and / or preventive agents against cancer. In vitro, the activity of neutralizing the biological activity of CD39L4 by the anti-CD39L4 antibody can be measured, for example, by the activity of suppressing cell carcinogenesis in cells overexpressing CD39L4. For example, mouse fibroblast cell line NIH3T3 overexpressing CD39L4 is cultured, anti-CD39L4 antibody is added to the culture system at various concentrations, and the inhibitory activity on focus formation, colony formation and spheroid proliferation can be measured. . The therapeutic and / or prophylactic effect of anti-CD39L4 antibody on cancer using experimental animals in vivo can be measured, for example, by administering the CD39L4 antibody to a transgenic animal overexpressing CD39L4 and measuring the change in cancer cells. can do.
[0198]
The thus obtained antibody that neutralizes the biological activity of CD39L4 can be used as a pharmaceutical, particularly as a pharmaceutical composition for the treatment and / or prevention of cancer, or for immunodiagnosis of such a disease. Useful as antibodies. The antibody of the present invention can be formulated and administered orally or parenterally. The preparation containing the antibody of the present invention can be safely administered to humans or animals as a pharmaceutical composition containing an antibody that recognizes CD39L4 as an active ingredient. Examples of the form of the pharmaceutical composition include injection preparations including infusion, suppositories, nasal preparations, sublingual preparations, transdermal absorption agents and the like. Since monoclonal antibodies are high-molecular proteins, they are remarkably adsorbed on glass containers such as vials and syringes and are unstable, and are easily absorbed by various physicochemical factors such as heat, pH and humidity. To be deactivated. Therefore, a stabilizer, a pH adjuster, a buffer, a solubilizing agent, a surfactant and the like are added in order to formulate the composition in a stable form. Examples of the stabilizer include amino acids such as glycine and alanine, sugars such as dextran 40 and mannose, and sugar alcohols such as sorbitol, mannitol, and xylitol, and two or more of these may be used in combination. These stabilizers are preferably added in an amount of 0.01 to 100 times, especially 0.1 to 10 times the weight of the antibody. By adding these stabilizers, the storage stability of the liquid preparation or freeze-dried preparation can be improved. Examples of the buffer include a phosphate buffer and a citrate buffer. The buffer adjusts the pH of the aqueous solution after re-dissolving the liquid preparation or the lyophilized preparation, and contributes to the stability and solubility of the antibody. The amount of the buffer added is preferably, for example, 1 to 10 mM based on the amount of water after adopting a liquid preparation or a lyophilized preparation. Examples of the surfactant include preferably polysorbate 20, Pluronic F-68, polyethylene glycol, and the like, and particularly preferably polysorbate 80. Two or more of these may be used in combination. High-molecular proteins such as antibodies are easily adsorbed to glass or resin, which is a material of the container. Therefore, by adding a surfactant, adsorption of the antibody after re-dissolving the liquid preparation or the freeze-dried preparation to the container can be prevented. The surfactant is preferably added in an amount of 0.001 to 1.0% based on the weight of water after reconstitution of the liquid preparation or the freeze-dried preparation. The preparation of the antibody of the present invention can be prepared by adding the above-mentioned stabilizing agent, buffering agent, or anti-adsorption agent, but particularly when used as a medical or animal injection, it is acceptable as an osmotic pressure. The osmotic pressure ratio is preferably from 1 to 2. The osmotic pressure ratio can be adjusted by increasing or decreasing sodium chloride during formulation. The antibody content in the preparation can be appropriately adjusted depending on the disease to be applied, the administration route, and the like. The dose of the human antibody to humans depends on the affinity of the antibody for human CD39L4, that is, the dissociation constant for human CD39L4 ( The higher the affinity (lower the Kd value) with respect to the (Kd value), the smaller the dose to humans, and the more effective the drug. When the human anti-CD39L4 antibody is administered to a human, about 0.1 to 100 mg / kg may be administered once every 1 to 30 days.
[0199]
[0200]
【Example】
Hereinafter, the present invention will be described with reference to examples, but the present invention is not limited to these examples. In the following examples, unless otherwise specified, each operation relating to gene manipulation is referred to as “Molecular Cloning” [Sambrook, J. et al. Fritsch, E .; F. And Maniatis, T .; Published by Cold Spring Harbor Laboratory Press in 1989], or in the case of using a commercially available reagent or kit, according to the instructions of the commercially available product.
[0201]
Embodiment 1 FIG. Obtaining human CD39L4 cDNA clone
a) Isolation of total RNA
The human prostate cancer cell line LNCaP (American Tissue Culture Collection ATCC No .: CRL-1740) was used for 75 cm using RPMI1640 medium (manufactured by Asahi Techno Glass) containing 10% fetal calf serum (FCS: manufactured by Hyclone). ² In a tissue culture flask (MS-23250, manufactured by Sumitomo Bakelite Co., Ltd.). 5% CO while taking care not to become confluent ₂ During the logarithmic growth phase, the cells were removed from the tissue culture flask using a trypsin-EDTA solution (manufactured by Sigma), collected, partially transferred to a new tissue culture flask, and subcultured. Isolation of total RNA was performed by collecting human prostate cancer cell line LNCaP in logarithmic growth phase and using TRIzol (Invitrogen) according to the attached protocol.
[0202]
b) First-strand cDNA synthesis
First-strand cDNA was synthesized from total RNA obtained in Example 1a) according to the attached protocol using Omniscript Reverse Transcriptase (manufactured by Qiagen). The reaction was performed in a volume of 20 μl.
[0203]
c) PCR reaction
As a primer for amplifying CD39L4 cDNA by PCR
5'-caccatggccacttctttggggcaca-3 '(Primer 1: SEQ ID NO: 9 in Sequence Listing)
and,
5'-tcaatggggagatgccccaga-3 '(Primer 2: SEQ ID NO: 10 in Sequence Listing)
An oligonucleotide having the sequence was synthesized according to a conventional method. The primer 1 is an oligonucleotide obtained by adding 4 bases as a Kozak sequence and CACC upstream of the start codon of the CD39L4 gene, and 4 bases on the 5 'side of the nucleotide sequence consisting of nucleotide numbers 395 to 410 of SEQ ID NO: 1 in the sequence listing. An oligonucleotide consisting of a base sequence to which a sequence (CACC) is added. This CACC sequence forms a complementary chain with the 3 'end of the vector upon integration into the cloning vector pENTR / SD / D-TOPO, thereby enabling integration into the vector maintaining the orientation of the gene. Primer 2 is an oligonucleotide comprising a complementary strand of a nucleotide sequence consisting of nucleotide numbers 1498 to 1519 of SEQ ID NO: 1 in the sequence listing.
[0204]
The PCR reaction was performed using ProofStart DNA Polymerase (Qiagen) according to the attached protocol. Specifically, 1 μl of the obtained first-strand cDNA was mixed with 0.5 μl each of synthetic primer 1 and synthetic primer 2 at a concentration of 100 pmol / μl, 5 μl of 10X ProofStart PCR Buffer, 1.5 μl of 10 mM dNTP Mix, and 2 μl of ProofStart DNA Polymerase. 10 μl of 5 × Q-Solution and 29.5 μl of sterilized purified water were added to prepare a 50 μl PCR reaction solution. The PCR reaction was performed by GeneAmp PCR System 9700 (manufactured by Applied Biosystems). After heating at 95 ° C for 5 minutes, a temperature cycle of 94 ° C for 30 seconds, 57 ° C for 30 seconds and 72 ° C for 4 minutes was repeated 35 times, and finally, the temperature was kept at 72 ° C for 20 minutes, and then 4 ° C. Saved. For the target cDNA, the reaction product was electrophoresed on a 1% agarose gel to confirm the amplification of CD39L4 cDNA (1287 bp). Purified. The concentration of the purified CD39L4 cDNA was measured with an absorptiometer (Gene Spec I: manufactured by Hitachi Keiki Service Co., Ltd.).
[0205]
d) Cloning of CD39L4 cDNA into pENTR / SD / D-TOPO vector
Using pENTR Directional TOPO Cloning Kits (manufactured by Invitrogen) according to the attached protocol, the CD39L4 cDNA obtained by Example 1c) was cloned into pENTR / SD / D-TOPO vector. The CD39L4 cDNA was mixed with the pENTR / SD / D-TOPO vector conjugated with Topoisomerase in the reaction buffer provided with the kit, and incubated at room temperature for 5 minutes. Escherichia coli OneShot TOP10 Chemically Competent E.C. E. coli (Invitrogen) was transformed and cultured on an LB agar medium containing 50 μg / ml kanamycin. As a result, Escherichia coli colonies that had grown showing kanamycin resistance were selected and cultured overnight at 37 ° C. in 0.3 ml of liquid LB medium containing 50 μg / ml of kanamycin, and BIO ROBOT 9600 (manufactured by Qiagen) was obtained. Plasmid DNA was isolated and purified by utilizing it. The obtained plasmid DNA was subjected to nucleotide sequence analysis by ABI PRISM 3700 DNA Analyzer (manufactured by Applied Biosystems), and cDNA having Open Reading Frame of the nucleotide sequence shown in GenBank Accession No. (ACCESSION NO.) AF039918 ( It was confirmed that SEQ ID NO: 1) in the sequence listing was incorporated into the pENTR / SD / D-TOPO vector.
[0206]
e) Cloning into retroviral vector pLNCX
The DNA fragment, Reading Frame Cassette A, contained in the GATEWAY Vector Conversion System (manufactured by Invitrogen) was placed on the HpaV site of the plasmid at the HpaI site of the promoter in the retroviral vector pLNCX (FIG. 1) contained in the RetroXpress System (manufactured by Clontech). On the other hand, insertion was performed in the forward direction to prepare a modified vector pLNCX-GW. Using LR CLONASE Enzyme Mix (manufactured by Invitrogen) according to the attached protocol, a recombinant vector was prepared in which the CD39L4 cDNA cloned in the pENTR / SD / D-TOPO vector was transferred to pLNCX-GW. Escherichia coli OneShot TOP10 Chemically Competent E.C. E. coli was transformed and cultured on LB agar medium containing 50 μg / ml ampicillin. As a result, Escherichia coli colonies that showed resistance to ampicillin were selected and cultured overnight at 37 ° C. in 0.3 ml of liquid TBG medium containing 50 μg / ml of ampicillin. The cells were cultured overnight in an LB medium containing 50 μg / ml of ampicillin, and the plasmid was purified from the culture using Endo Free Plasmid Maxi Kits (Qiagen) according to the attached protocol. This plasmid was designated as pLNCX-GW-CD39L4. The fact that the inserted gene of this plasmid was CD39L4 cDNA was confirmed by agarose gel electrophoresis assay of the length of the DNA fragment after digestion with restriction enzymes.
[0207]
Example 2 Preparation of CD39L4 Gene-Expressing Retrovirus and Establishment of Cell Line Stably Expressing CD39L4
a) Cell lines and their subculture
The culturing of the packaging cell line 293-10A1 (manufactured by IMGENEX) and the mouse fibroblast cell line NIH3T3 (American Tissue Culture Collection) was performed using RPMI1640 medium (manufactured by Asahi Techno Glass Co.) containing 10% fetal calf serum (FCS: manufactured by Hyclone). 25), 75 to 225 cm ² In a tissue culture flask (manufactured by Corning Costar or Sumitomo Bakelite). 5% CO while taking care not to become confluent ₂ During the logarithmic growth phase, the cells were removed from the tissue culture flask using a trypsin-EDTA solution (manufactured by Sigma), collected, partially transferred to a new tissue culture flask, and subcultured.
[0208]
b) Preparation of gene expression retrovirus and establishment of stable expression strain
293-10A1 cells were placed in a 10 cm diameter tissue culture dish coated with type I collagen (manufactured by Asahi Techno Glass Co.) at 2 × 10 5 ⁶ The cells were sown individually and cultured overnight in 10 ml of RPMI1640 medium containing 10% FCS. After replacing the culture supernatant with 2 ml of fresh RPMI1640 medium, about 10 μg of the pLNCX-GW-CD39L4 vector was transfected using Lipofectamine 2000 (manufactured by Invitrogen) according to the attached protocol. After culturing for 6 hours, 6 ml of RPMI1640 medium containing 20% FCS was added, and the cells were further cultured overnight. The culture solution was replaced with a fresh 20% FCS-containing RPMI 1640 medium, and the cells were further cultured for 24 hours to produce a virus. The culture supernatant containing the virus was collected, filtered through a 0.45 μm pore size filter (MILLEX-HV: manufactured by Millipore), and the filtrate was doubled in volume with fresh 10% FCS-containing RPMI1640 medium and a final concentration of 8 μg / ml. (Polybrene, also known as Hexadimethrine bromide) (manufactured by Sigma) was added and mixed to prepare a virus infection solution. 1.2x10 ⁶ The virus-infected solution was added to a tissue culture dish (430293: manufactured by Corning Costar) in which individual NIH3T3 cells were sowed and cultured overnight, and the cells were infected with the virus. This infection procedure was repeated four times every 12 hours. Further, after culturing for 3 days, in order to remove non-infected cells, that is, cells having no expression of the target gene, the culture solution was replaced with RPMI1640 medium containing 10% FCS containing Geneticin (manufactured by Invitrogen) at 500 μg / ml. Subsequently, once every 2 to 3 days, the culture solution was replaced with a fresh Geneticin-containing medium, and the culture was continued for 7 days, thereby establishing a cell line stably expressing the target gene. Expression of the target gene in the present cell line is determined by a primer set capable of amplifying a fragment inserted into pLNCX-GW,
5'-ccaaatgtcgtaacaactc-3 '(Primer 3: SEQ ID NO: 11 in Sequence Listing)
5'-gacctgattctgaactctc-3 '(Primer 4: SEQ ID NO: 12 in Sequence Listing)
Was confirmed by RT-PCR.

Primers

3 and 4 are oligonucleotides designed based on the pLNCX nucleotide sequence, and can amplify a DNA fragment inserted into pLNCX.
[0209]
Example 3 Focus formation test
The CD39L4 gene stable expression strain established in Example 2 and the NIH3T3 cell strain not transfected were collected by trypsin-EDTA treatment, washed twice with a fresh culture solution, and then the cell suspension was washed with the fresh culture solution. The mixture was adjusted and dispensed into a 96-well plate (3598, manufactured by Corning-Costar) in a volume of about 1,000 cells per well in a volume of 100 μl. Six similar wells were prepared. 37 ° C, 5% CO ₂ After culturing under the conditions for 14 days, the number of focuses per well was measured.
As a result, in the NIH3T3 cell line into which the control gene was not introduced, only 0.5 ± 0.5 (mean ± standard deviation) focuses could be detected per well, whereas CD39L4 was expressed. 36.3 ± 8.0 (mean ± standard deviation) foci were detected in the recovered cells (Table 1), strongly suggesting that CD39L4 has an activity to significantly induce the focus trait.
[0210]
[Table 1]

[0211]
Example 4 Colony formation test
The established CD39L4 gene stable expression strain and the non-transgenic parent strain as a control were recovered by trypsin-EDTA treatment, washed twice with fresh medium, and then 50,000 cells per well were subjected to about 38-39 ° C. The suspension was suspended in 1 ml of liquefied RPMI1640 containing 0.33% Bactogar and 20% FCS, and this was quickly and preliminarily dispensed and solidified with RPMI1640 containing 0.66% Bactogar (manufactured by Difco) and 20% FCS. The whole amount was dispensed into a 12-well plate (3512: manufactured by Corning Costar). Three similar wells were prepared. After leaving at room temperature for 30 minutes to completely solidify the Bactoagar, 37 ° C, 5% CO ₂ After culturing for 17 days under the conditions, the number of growing colonies in the formed soft agar was measured.
FIG. 2 shows a microscope observation image (DIAPHOTO300 manufactured by Nikon Corporation) after the culture. In the control NIH3T3 parent strain, only 2.0 ± 2.0 (mean ± standard deviation) colonies could be detected per well, whereas in the cell expressing CD39L4, 337.0 ± 60.1 (mean). ± standard deviation) colonies were detected (Table 2), strongly suggesting that CD39L4 has activity to induce colony formation.
[0212]
[Table 2]

[0213]
Example 5 Spheroid proliferation test
The established CD39L4 gene stable expression strain and the NIH3T3 parent strain into which the gene was not introduced were recovered by trypsin-EDTA treatment, washed twice with a fresh culture solution, and then adjusted with a fresh culture solution to prepare a cell suspension. About 1,000 cells were dispensed in a volume of 200 μl into a non-cell-adherent 96-well plate (Spheroid 96U: MS-0096S, manufactured by Sumitomo Bakelite). Three similar wells were prepared. 37 ° C, 5% CO ₂ The cells were cultured under the conditions, and the spherical cell mass (spheroid) formed on the

plate

1, 4, 5, 6, 7, 8, 11 days after the start of the culture was examined under a microscope (DIAPHOTO300 manufactured by Nikon Corporation) under an eyepiece microscopic microscope. Observation was performed using a meter (manufactured by Sankeisha: S-6), and the diameter was measured.
[0214]
The results are shown in Table 3 and FIG. In the control parent strain, the spheroid diameter remained constant, and no growth ability was observed in the spheroid state on the non-adherent plate, whereas in the cells expressing CD39L4, the remarkable spheroid diameter was observed. Increase over time was observed. This strongly suggested that CD39L4 induces proliferation of NIH3T3 cells in a spheroid state.
[0215]
[Table 3]

[0216]
【The invention's effect】
According to the present invention, it has become possible to produce cancer cells using human CD39L4, and it has also become possible to specifically detect cancer. Further, by developing an inhibitor targeting the CD39L4 gene, it has become possible to screen for a novel anticancer agent having an extremely high therapeutic and / or preventive effect against cancer. Furthermore, an antibody that specifically binds to CD39L4 can be a therapeutic and / or prophylactic agent for cancer.
[0217]
[Sequence List Free Text]
SEQ ID NO: 9: PCR primer for CD39L4 gene
SEQ ID NO: 10: PCR antisense primer for CD39L4 gene
SEQ ID NO: 11: RT-PCR sense primer for detecting CD39L4 gene
SEQ ID NO: 12: RT-PCR antisense primer for CD39L4 gene detection
[0218]
[Sequence list]

[Brief description of the drawings]
FIG. 1. Expression vector pLNCX.
FIG. 2 is a diagram showing colony formation by a CD39L4 expression strain.
FIG. 3. Spheroid proliferation test.

Claims

A method for producing a cancer cell, comprising the following steps 1) and 2):
1) a step of transforming a cell with the polynucleotide according to any one of the following (1) to (5);
(1) a polynucleotide having a nucleotide sequence represented by nucleotide numbers 247 to 1533 of SEQ ID NO: 1 in the sequence listing,
(2) a polynucleotide having a nucleotide sequence represented by nucleotide numbers 247 to 1533 of SEQ ID NO: 3 in the sequence listing,
(3) a polynucleotide having a nucleotide sequence represented by nucleotide numbers 283 to 1569 of SEQ ID NO: 5 in the sequence listing,
(4) a polynucleotide having a nucleotide sequence represented by nucleotide numbers 398 to 1621 of SEQ ID NO: 7 in the sequence listing,
(5) a protein that hybridizes under stringent conditions to a polynucleotide consisting of a nucleotide sequence complementary to the polynucleotide according to any one of (1) to (4) above, and a protein substantially identical to CD39L4; A polynucleotide consisting of the encoding nucleotide sequence,
2) a step of selecting a cell line in which the cell growth ability has changed in step 1);

The method for producing a cancer cell according to claim 1, wherein the cell is an animal cell.

The method for producing a cancer cell according to claim 2, wherein the animal cell is derived from a mammal.

The method for producing cancer cells according to claim 3, wherein the mammal is a human, monkey, mouse, or rat.

The method for producing cancer cells according to claim 3, wherein the mammal is a human.

The method for producing a cancer cell according to claim 1, wherein the cell is a mouse fibroblast cell line NIH3T3 cell.

The method for producing a cancer cell according to any one of claims 1 to 6, wherein the cell is transformed with a recombinant vector.

A cancer cell obtained by the method for producing a cancer cell according to any one of claims 1 to 7.

A non-human mammal into which the cancer cell according to claim 8 has been introduced.

A method for detecting cancer, comprising a step of analyzing the expression level of the polynucleotide according to any one of the following 1) to 5) in a sample collected from a subject or a test animal:
1) a polynucleotide having a nucleotide sequence represented by nucleotide numbers 247 to 1533 of SEQ ID NO: 1 in the sequence listing,
2) a polynucleotide having a nucleotide sequence represented by nucleotide numbers 247 to 1533 of SEQ ID NO: 3 in the sequence listing;
3) a polynucleotide having a nucleotide sequence represented by nucleotide numbers 283 to 1569 in SEQ ID NO: 5 in the sequence listing;
4) a polynucleotide having a nucleotide sequence represented by nucleotide numbers 398 to 1621 in SEQ ID NO: 7 in the sequence listing;
5) a nucleotide that hybridizes under stringent conditions with a polynucleotide consisting of a nucleotide sequence complementary to the polynucleotide according to any one of 1) to 4) above, and that encodes a protein substantially identical to CD39L4 A polynucleotide consisting of a sequence.

A method for detecting cancer, comprising a step of analyzing the expression level of the protein according to any one of the following 1) to 5) in a sample collected from a subject or a test animal:
1) a protein comprising an amino acid sequence represented by amino acid numbers 1 to 428 of SEQ ID NO: 2 in the sequence listing;
2) a protein having an amino acid sequence represented by amino acid numbers 1 to 428 of SEQ ID NO: 4 in the sequence listing;
3) a protein having an amino acid sequence represented by amino acid numbers 1 to 428 of SEQ ID NO: 6 in the sequence listing;
4) a protein having the amino acid sequence of amino acids 1 to 407 of SEQ ID NO: 8 in the sequence listing;
5) An amino acid sequence of the protein according to any one of the above steps 1) to 4), wherein the protein comprises an amino acid sequence in which one or several amino acids have been deleted, substituted or added, and is substantially the same as CD39L4. Protein.

A method for detecting cancer, comprising the following steps 1) to 4):
1) a step of extracting a total RNA fraction from a specimen collected from a subject or a test animal;
2) a step of extracting a total RNA fraction from a specimen collected from a normal human or a normal animal;
3) The expression level of the polynucleotide described in any one of the following (1) to (5) in the total RNA fraction derived from the above step 1) and the total RNA fraction derived from the above step 2) is measured. Process;
(1) a polynucleotide having a nucleotide sequence represented by nucleotide numbers 247 to 1533 of SEQ ID NO: 1 in the sequence listing,
(2) a polynucleotide having a nucleotide sequence represented by nucleotide numbers 247 to 1533 of SEQ ID NO: 3 in the sequence listing,
(3) a polynucleotide having a nucleotide sequence represented by nucleotide numbers 283 to 1569 of SEQ ID NO: 5 in the sequence listing,
(4) a polynucleotide having a nucleotide sequence represented by nucleotide numbers 398 to 1621 of SEQ ID NO: 7 in the sequence listing,
(5) From a nucleotide sequence that hybridizes under stringent conditions with a polynucleotide consisting of a nucleotide sequence complementary to the polynucleotide described in (1) to (4) above and encodes a protein substantially identical to CD39L4. A polynucleotide comprising;
4) Analyze the difference in the expression level of the polynucleotide measured in the above step 3) between the total RNA fraction derived from the above step 1) and the total RNA fraction derived from the above step 2). 2. The step of detecting cancer in a subject or a test animal according to the above.

A method for detecting cancer, comprising the following steps 1) to 3):
1) a step of measuring the expression level of the protein according to any one of the following (1) to (5) in a sample collected from a subject or a test animal;
(1) a protein comprising an amino acid sequence represented by amino acid numbers 1 to 428 of SEQ ID NO: 2 in the sequence listing,
(2) a protein comprising an amino acid sequence represented by amino acid numbers 1 to 428 of SEQ ID NO: 4 in the sequence listing,
(3) a protein comprising an amino acid sequence represented by amino acid numbers 1 to 428 of SEQ ID NO: 6 in the sequence listing,
(4) a protein comprising an amino acid sequence represented by amino acid numbers 1 to 407 of SEQ ID NO: 8 in the sequence listing,
(5) An amino acid sequence of the protein according to any one of the above (1) to (4), wherein the protein has an amino acid sequence in which one or several amino acids have been deleted, substituted or added, and is substantially equivalent to CD39L4. The same protein,
2) a step of measuring the expression level of the protein according to any one of (1) to (5) of the above step 1) in a sample collected from a normal human or a normal animal;
3) a step of analyzing the difference between the expression level of the protein detected in step 1) and the expression level of the protein detected in step 2) to detect cancer in the subject or test animal.

A method for screening a substance having a therapeutic and / or prophylactic effect on cancer, comprising the following steps 1) to 4):
1) a step of extracting a total RNA fraction from cultured cells derived from mammals cultured in a medium to which a test substance has been added;
2) Step of extracting total RNA fraction from mammalian-derived cultured cells cultured without adding a test substance:
3) The expression level of the polynucleotide described in any one of the following (1) to (5) in the total RNA fraction derived from the above step 1) and the total RNA fraction derived from the above step 2) is measured. Process;
(1) a polynucleotide having a nucleotide sequence represented by nucleotide numbers 247 to 1533 of SEQ ID NO: 1 in the sequence listing,
(2) a polynucleotide having a nucleotide sequence represented by nucleotide numbers 247 to 1533 of SEQ ID NO: 3 in the sequence listing,
(3) a polynucleotide having a nucleotide sequence represented by nucleotide numbers 283 to 1569 of SEQ ID NO: 5 in the sequence listing,
(4) a polynucleotide having a nucleotide sequence represented by nucleotide numbers 398 to 1621 of SEQ ID NO: 7 in the sequence listing,
(5) From a nucleotide sequence that hybridizes under stringent conditions with a polynucleotide consisting of a nucleotide sequence complementary to the polynucleotide described in (1) to (4) above and encodes a protein substantially identical to CD39L4. A polynucleotide comprising
4) Analyze the difference in the expression level of the polynucleotide measured in the above step 3) between the total RNA fraction derived from the above step 1) and the total RNA fraction derived from the above step 2). A step of determining a therapeutic effect and / or a preventive effect on cancer.

A method for screening a substance having a therapeutic and / or prophylactic effect on cancer, comprising the following steps 1) to 4):
1) a step of extracting a total RNA fraction from a specimen collected from a mammalian individual to which the test substance has been administered;
2) a step of extracting a total RNA fraction from a specimen collected from a mammal individual to which the test substance has not been administered;
3) The expression level of the polynucleotide described in any one of the following (1) to (5) in the total RNA fraction derived from the above step 1) and the total RNA fraction derived from the above step 2) is measured. Process;
(1) a polynucleotide having a nucleotide sequence represented by nucleotide numbers 247 to 1533 of SEQ ID NO: 1 in the sequence listing,
(2) a polynucleotide having a nucleotide sequence represented by nucleotide numbers 247 to 1533 of SEQ ID NO: 3 in the sequence listing,
(3) a polynucleotide having a nucleotide sequence represented by nucleotide numbers 283 to 1569 of SEQ ID NO: 5 in the sequence listing,
(4) a polynucleotide having a nucleotide sequence represented by nucleotide numbers 398 to 1621 of SEQ ID NO: 7 in the sequence listing,
(5) From a nucleotide sequence that hybridizes under stringent conditions with a polynucleotide consisting of a nucleotide sequence complementary to the polynucleotide described in (1) to (4) above and encodes a protein substantially identical to CD39L4. A polynucleotide comprising;
4) Analyze the difference in the expression level of the polynucleotide measured in the above step 3) between the total RNA fraction derived from the above step 1) and the total RNA fraction derived from the above step 2), and analyze the cancer of the test substance. Determining the therapeutic and / or prophylactic effect of the drug.

A method for screening a substance having a therapeutic and / or prophylactic effect on cancer, comprising the following steps 1) to 3):
1) a step of measuring the expression level of a protein according to any one of the following (1) to (5) in cultured cells derived from a mammal cultured in a medium to which a test substance is added;
(1) a protein comprising an amino acid sequence represented by amino acid numbers 1 to 428 of SEQ ID NO: 2 in the sequence listing,
(2) a protein comprising an amino acid sequence represented by amino acid numbers 1 to 428 of SEQ ID NO: 4 in the sequence listing,
(3) a protein comprising an amino acid sequence represented by amino acid numbers 1 to 428 of SEQ ID NO: 6 in the sequence listing,
(4) a protein comprising an amino acid sequence represented by amino acid numbers 1 to 407 of SEQ ID NO: 8 in the sequence listing,
(5) An amino acid sequence of the protein according to any one of the above (1) to (4), wherein the protein has an amino acid sequence in which one or several amino acids have been deleted, substituted or added, and is substantially equivalent to CD39L4. A protein identical to
2) Specific binding of the expression level of the protein according to any one of (1) to (5) of the above step 1) to the protein in a cultured cell derived from a mammal cultured in a medium to which no test substance is added. Detecting with an antibody or ligand that performs the detection;
3) Analyze the difference between the expression level of the protein detected in the above step 1) and the expression level of the protein detected in the above step 2) to determine the therapeutic effect and / or preventive effect of the test substance on cancer. Process.

A method for screening a substance having a therapeutic and / or prophylactic effect on cancer, comprising the following steps 1) to 3):
1) a step of measuring the expression level of the protein according to any one of the following (1) to (5) in a sample collected from a mammalian individual to which the test substance has been administered;
(1) a protein comprising an amino acid sequence represented by amino acid numbers 1 to 428 of SEQ ID NO: 2 in the sequence listing,
(2) a protein comprising an amino acid sequence represented by amino acid numbers 1 to 428 of SEQ ID NO: 4 in the sequence listing,
(3) a protein comprising an amino acid sequence represented by amino acid numbers 1 to 428 of SEQ ID NO: 6 in the sequence listing,
(4) a protein comprising an amino acid sequence represented by amino acid numbers 1 to 407 of SEQ ID NO: 8 in the sequence listing,
(5) An amino acid sequence of the protein according to any one of the above (1) to (4), wherein the protein has an amino acid sequence in which one or several amino acids have been deleted, substituted or added, and is substantially equivalent to CD39L4. A protein identical to
2) a step of measuring the expression level of the protein according to any one of (1) to (5) in the above step 1) in a sample collected from a mammal individual to which the test substance has not been administered;
3) Analyze the difference between the expression level of the protein detected in the above step 1) and the expression level of the protein detected in the above step 2) to determine the therapeutic effect and / or preventive effect of the test substance on cancer. Process.

The screening method according to claim 14 or 16, wherein the cultured mammalian cell is the cancer cell according to claim 8.

18. The screening method according to claim 15, wherein the mammal individual is the non-human mammal according to claim 9.

A kit for determining the therapeutic and / or prophylactic effect of a test substance on cancer and / or detecting cancer, comprising at least one or more selected from the group consisting of 1) to 3) below:
1) A continuous oligonucleotide having a length of 15 to 30 bases for specifically amplifying at least one of the polynucleotides consisting of the nucleotide sequences selected from the groups shown in SEQ ID NOs: 1, 3, 5 and 7 in the sequence listing Primer;
2) for hybridizing under stringent conditions to at least one of the polynucleotides consisting of the nucleotide sequences selected from the groups shown in SEQ ID NOs: 1, 3, 5 and 7 in the sequence listing under stringent conditions to detect the polynucleotides A continuous polynucleotide probe of 15 nucleotides or more;
3) a polynucleotide having the nucleotide sequence of nucleotides 177 to 1031 of SEQ ID NO: 1 in the sequence listing, a polynucleotide having the nucleotide sequence of nucleotides 131 to 985 of SEQ ID NO: 3, and nucleotide 55 of SEQ ID NO: 5 Immobilized sample on which at least one polynucleotide selected from the group consisting of a polynucleotide consisting of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NOs: 909 and 909 and a nucleotide sequence consisting of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 7 to 941 is immobilized .

A kit for determining the therapeutic and / or prophylactic effect of a test substance on cancer and / or detecting cancer, comprising at least one of the following 1) and 2):
1) an antibody that specifically binds to a protein consisting of an amino acid sequence selected from the group shown in SEQ ID NOs: 2, 4, 6, and 8 in the sequence listing, and detects the protein;
2) A secondary antibody capable of binding to the antibody according to 1).

The method for measuring the expression level of a polynucleotide is a Northern blot method, a dot blot method, a slot blot method, an RT-PCR, a ribonuclease protection assay or a run-on assay, wherein: 20. The method according to any one of 15, 18 and 19.

The method for measuring the expression level of a polynucleotide uses a gene chip or an array made of a DNA group consisting of a complementary DNA group derived from animal tissue or animal cell or a partial sequence of each DNA of the DNA group. Item 19. The method according to any one of Items 10, 12, 14, 15, 18, and 19.

The method according to any one of claims 11, 13, 17, 18, and 19, wherein the method for measuring the expression level of the protein uses an antibody or a ligand that specifically binds to the protein.

The method for measuring the expression level of a protein is Western blotting, dot blotting, slot blotting, or enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA), characterized in that it is characterized in that: The method according to any one of the above.

A pharmaceutical composition for treating and / or preventing cancer, comprising an oligonucleotide having at least one nucleotide sequence selected from the group consisting of the following 1) to 3) or a nucleotide sequence complementary to a partial sequence of the sequence:
1) a nucleotide sequence represented by nucleotide numbers 247 to 1533 of SEQ ID NO: 1 in the sequence listing;
2) a nucleotide sequence represented by nucleotide numbers 247 to 1533 of SEQ ID NO: 3 in the sequence listing;
3) a nucleotide sequence represented by nucleotide numbers 283 to 1569 of SEQ ID NO: 5 in the sequence listing;
A nucleotide sequence represented by nucleotide numbers 398 to 1621 of SEQ ID NO: 7 in the sequence listing.

A pharmaceutical composition for treating and / or preventing cancer, comprising an antibody that specifically recognizes CD39L4.