JP2004264265A

JP2004264265A - Probe solution composition, reactive chip using the same, and manufacturing method therefor

Info

Publication number: JP2004264265A
Application number: JP2003057722A
Authority: JP
Inventors: Yasuko Yoshida; 安子吉田; Saichi Yamada; 佐一山田; Shogo Takeno; 省吾武野
Original assignee: NGK Insulators Ltd
Current assignee: NGK Insulators Ltd
Priority date: 2003-03-04
Filing date: 2003-03-04
Publication date: 2004-09-24
Anticipated expiration: 2023-03-04
Also published as: JP3939260B2

Abstract

<P>PROBLEM TO BE SOLVED: To stably immobilize a favorable shape of probe spot on a substrate. <P>SOLUTION: This probe solution composition is a liquid composition for spotting-immobilizing a probe coupled specifically to a target substance on the substrate, and contains the probe and a basic amino acid. <P>COPYRIGHT: (C)2004,JPO&NCIPI

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
この出願の発明は、標的物質に特異的に結合するプローブを基板上に高密度で整列固定した反応性チップを製造する際に用いるプローブ溶液組成物と、この組成物を用いて製造した反応性チップ、並びにこの反応性チップの製造方法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
遺伝子の構造や遺伝子発現様式の大量かつ迅速な解析を目的として、様々な反応性チップが用いられている。この反応性チップは、スライドガラス等の基板上に数千から数万種以上の異なるローブがスポットとして整列固定されており、蛍光等によって標識した標的物質のプローブへの結合の有無を指標として、標的物質の特定やサンプル中における標的物質の量を定量することができるようになっている。チップ上に固定されるプローブは、解析する標的物質の種類によって異なる。例えばＤＮＡやＲＮＡが標的物質となる場合は、それらと相補性結合（ハイブリダイゼーション）が可能な２本鎖および１本鎖ＤＮＡ断片やポリヌクレオチド鎖、オリゴヌクレオチド鎖等がプローブとして採用され、これらはＤＮＡチップ（またはＤＮＡアレイ）と呼ばれている（例えば、特許文献１−４、非特許文献１、２を参照）。また、タンパク質チップの場合には、タンパク質やペプチドと、それらと特異的に結合する受容体や抗体が、標的物質−プローブの関係を構成する。
【０００３】
プローブのスポットは、例えばＤＮＡ断片等をプローブとする場合、ＤＮＡ断片それ自体を基板上に固定化する方法か、あるいは基板上で所定塩基配列のＤＮＡ断片を合成する方法によって形成される。いずれの方法の場合も、それらのプローブ材料を所定位置に一定量、正確にスポッティングする必要がある。
【０００４】
基板上にプローブ材料をスポッティングする方法としては、ＱＵＩＬＬ方式、ピン＆リング方式、スプリングピン方式といった、いわゆるピンによる基板上へのプローブ溶液の供給（打ち込み）を行う方法が知られている。
【０００５】
これに対して、この出願の出願人は、ジェットノズルを使用することによって、極微量のプローブ溶液を迅速かつ正確に基板所定位置にスポッティングする方法を発明し、特許出願している（特許文献５）。また、この出願人は、ＤＮＡプローブ溶液を複数回スポッティングすること（重ね打ちスポッティング）によって、プローブ溶液の使用効率の向上と、スポット径の均一化を可能とするＤＮＡチップの製造法を特許出願している（特許文献６）。
【０００６】
一方、プローブ溶液には、プローブスポットを基板上に安定的に固定するためにカルボキシルメチルセルロース等を含有されているが、さらなる検出感度の向上やスポットの高密度化を目的としたプローブ溶液組成の改良も行われている。例えば、特許文献７には、親水性ポリマーを含有するプローブ溶液（ＤＮＡ溶液）が開示されている。また、特許文献８には、インクジェット法のプローブ溶液として、プローブ、尿素、グリセリン、チオジグリコールおよびアセチレンアルコールからなる液体組成物が開示されている。
【０００７】
【特許文献１】
米国特許第５，４７４，７９６号明細書
【特許文献２】
米国特許第５，６０５，６６２号明細書
【特許文献３】
国際公開第９５／２５１１１６号パンフレット
【特許文献４】
国際公開第９５／３５５０５号パンフレット
【特許文献５】
特開２００１−１１６７５０号公報
【特許文献６】
特開２００１−１８６８８０号公報
【特許文献７】
特開２０００−２９５９９０号公報
【特許文献８】
特開２００１−６６３０５号公報
【非特許文献１】
Ｓｃｈｅｎａ，Ｍ．ｅｔａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．９３：１０６１４−１０６１９，１９９６
【非特許文献２】
Ｈｅｌｌｅｒ，Ｒ．Ａ．ｅｔａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９４：２１５０−２１５５，１９９７
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】
高精度に標的物質の特定や定量を可能とする反応性チップを効率よく大量製造し、安価に提供するためには、プローブスポットを安定的に基板上に固定する必要がある。そのために前記のとおり、プローブ溶液の組成改良が様々に試みられている。しかしながら、そのような改良されたプローブ溶液を用いた場合であっても、反応性チップの製造工程では、スポッティングの後にスポットの乾燥を防ぐための水分付加工程が不可欠であった。すなわち、スポットが乾燥する際に水の移動に伴って高分子の形状が変化してしまうために、スポットがドーナツ化してしまう。このドーナツ化したスポットの形状を回復する手段として、一定量の水分をスポットに付加するが、この水分付加工程を経ても、従来のプローブ溶液を使用した場合には、好ましいスポット形状（台形型）を形成することは困難であった。このため、各ピクセル（スキャナーによる解像度四方範囲。例えば５μｍ×５μｍ）間でシグナル強度にバラツキを生じさせていた。
【０００９】
この出願の発明は、以上のとおりの事情に鑑みてなされたものであって、プローブスポットを、水分付加工程を省略しても、好ましい台形形状で安定的に基板上に固定することを可能とするプローブ溶液組成物を提供することを課題とする。
【００１０】
また、この出願の発明は、前記の組成物を用いて製造された反応性チップと、この反応性チップの製造方法を提供することを課題としてもいる。
【００１１】
【課題を解決するための手段】
この出願は、前記の課題を解決するための発明として、標的物質に特異的に結合するプローブを基板上にスポッティング固定するための液体組成物であって、プローブと塩基性アミノ酸とを含有することを特徴とするプローブ溶液組成物を提供する。
【００１２】
この発明のプローブ溶液組成物においては、塩基性アミノ酸の含有量が１５重量％であることを好ましい態様としている。
【００１３】
また、この発明のプローブ溶液組成物は、さらにリン酸を含有し、ｐＨが７〜９であること、またその場合の塩基性アミノ酸がＬ−アルギニンであることをそれぞれ好ましい態様としている。
【００１４】
さらにこのプローブ溶液組成物においては、プローブが、ＤＮＡ断片、ＲＮＡ断片、ヌクレオチド鎖、タンパク質、ペプチド、またはそれらの任意の複合物であることを好ましい態様としている。
【００１５】
この出願の発明は、前記のいずれかのプローブ溶液組成物がスポットとして基板上に固定化されていることを特徴とする反応性チップを提供する。
【００１６】
またさらにこの出願の発明は、前記のいずれかのプローブ溶液組成物を基板上にスポッティングし、この液体組成物のスポットを基板上で固定化することを特徴とする反応性チップの製造方法を提供する。
【００１７】
この製造方法においては、インクジェット方式でスポッティングを行うこと、プローブ溶液組成物スポットを、水分付加を行わずに固定化すること、並びにスポッティングを２回以上繰り返して、プローブ溶液組成物を積層化して固定化することをそれぞれ好ましい態様としている。
【００１８】
以下、この出願の各発明について実施形態を詳しく説明する。
【００１９】
【発明の実施の形態】
この発明のプローブ溶液組成物は、標的物質に特異的に結合するプローブと塩基性アミノ酸とを含有することを特徴としている。
【００２０】
塩基性アミノ酸は、リジン、ヒスチジンおよびアルギニンからなる群より選択される１種以上のアミノ酸残基である。Ｌ体またはＤ体のいずれであってもよいが、Ｌ体の使用が好ましい。またこの塩基性アミノ酸は、非天然のもの（アミノ酸模倣物）であってもよい。例えば、リジン模倣物は、リシニルを、例えば無水コハク酸または他の無水カルボン酸と反応させることにより生成する（またアミノ末端残基が変更される）ことができる。リジンおよび他のα−アミノ−含有残基模倣物はまた、メチルピコリンイミダート、ピリドキサールホスファート、ピリドキサール、クロロボロヒドリド、トリニトロベンゼンアスルホン酸、Ｏ−メチルイソ尿素、２，４ペンタンジオンといったイミドエステルを用いた反応、およびトランスアミダーゼに触媒されるグリオキシラートを用いた反応により生成することができる。ヒスチジン残基模倣物は、ヒスチジルを、例えばジエチルプロカルボナートまたはパラーブロモフェナシルブロミドと反応させることにより生成することができる。またアルギニン残基模倣物は、アルギニルを例えば１以上の例えばフェニルグリオキサール、２，３−ブタンジオン、１，２−シクロヘキサンヂオン、またはニンヒドリンを含む試薬と、好ましくはアルカリ性の条件下に反応させることにより生成することができる。さらに、このような模倣物は、各塩基性アミノ酸残のα−アミノ基のメチル化、Ｎ−末端アミンのアセチル化、主鎖アミド残基のメチル化またはＮ−メチルアミノ酸による置換、およびＣ−末端のカルボキシル基のアミド化等であってもよい。
【００２１】
これらの塩基性アミノ酸の含有量は、アミノ酸の種類や、他の成分の種類等に応じて適宜とすることができるが、１５重量％以下、好ましくは１〜１５重量％の範囲とする。
【００２２】
この発明の溶液組成物に使用するプローブは、標的物質と特異的に結合する生体分子である。例えば、標的物質がゲノムＤＮＡ由来のＤＮＡ断片（例えばｃＤＮＡ等）の場合には、プローブは、相補性に基づいてこれらＤＮＡ断片とハイブリダイズする１本鎖のＤＮＡ断片、ＲＮＡ断片、ヌクレオチド鎖（１００塩基以上のポリヌクレオチドまたは１００塩基未満のオリゴヌクレオチド）等である。また、標的物質がタンパク質の場合は、そのアミノ酸配列の一部に特異的に結合するタンパク質やペプチド等である。また、タンパク質のエピトープに結合することができる抗体またはそのＦａｂ、Ｆ（ａｂ’）_２、Ｆｖ断片等をプローブとすることもできる。
【００２３】
このプローブ溶液組成物におけるプローブの濃度は、プローブの種類や分子量等に応じて適宜とすることができるが、例えばＤＮＡ断片やヌクレオチド鎖の場合には０．１〜５μｇ／μｌ程度とすることができる。
【００２４】
この発明の溶液組成物におけるプローブおよび塩基性アミノ酸以外の成分は、通常の反応性チップ製造に用いられるプローブ溶液のそれと同一とすることができる。例えば、プローブとしてＤＮＡ断片を用いた場合の溶液組成物の組成例は、最終濃度が、Ｌ−アルギニン１０％（ｗ／ｖ）、ＤＮＡ断片０．０１％（ｗ／ｖ）になるように、ＴＥバッファー（ｐＨ８、０．０１ＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ、０．００１ＭＥＤＴＡ）または水（蒸留水、純水等）に溶解したものである。
【００２５】
さらにこの発明のプローブ溶液組成物においては、特にＬ−アルギニンを含有する場合には、そのｐＨを７〜９、より好ましくはｐＨ８付近に中和させることもできる。ｐＨの調製はリン酸、またはリン酸およびクエン酸をそれぞれ１〜１０％重量の割合で添加することによって行うことができる。
【００２６】
なお、塩基性アミノ酸を含む溶液とプローブを含む溶液とを別途に調製し、それらを混合してプローブ溶液組成物を作成するようにしてもよい。この場合、塩基性アミノ酸の溶液を大量に準備し、複数種のプローブ溶液と個々に混合することによって、反応性チップにスポッティングする全種類のプローブ溶液組成物を効率よく作成することができる。
【００２７】
次に、この発明の反応性チップとその製造方法について説明する。
【００２８】
この発明の反応性チップは、前記のプローブ溶液組成物がスポットとして基板上に固定化されていることを特徴とする。基板は、通常の反応性チップに用いられるスライドグラス等であり、特に、特開２００１−１８６８８０号公報に開示されているポリＬ―リジンを被覆した基板が好ましい。スポッティングされるプローブ溶液組成物は、例えば１００〜２０，０００種の異なったプローブを含む溶液組成物であり、スポッティングされたこれらの組成物が１００〜１０００μｍ程度の距離をもって、それぞれ直径５０〜５００μｍの大きさのスポットを形成している。
【００２９】
このような反応性チップを製造する場合のスポッティング方法は、従来のピン方式によって行うこともできるが、好ましくは、特開２００１−１１６７５０号公報や特開２００１−１８６８８１号公報に開示されているインクジェット方式を採用することが好ましい。
【００３０】
スポッティングの後は、通常の反応性チップ製造と同様にして、冷却、スポットに対する水分付加（湿度〜８０％程度に一定時間保持）、焼成乾燥による固定化処理等を行うことによって、各スポットを基板上に固定する。ただし、この発明の製造方法では、スポッティングされたプローブ溶液組成物が乾燥によってドーナツ化することがないため、前記の水分付加工程を省略しても、スポット形状が不良化することはない。
【００３１】
さらに、この発明の製造方法では、特開２００１−１８６８８０号公報に開示されているような、スポッティング重ね打ちを行うことを好ましい態様としている。この場合も、個々のスポッティングにおいてスポット形状が良好に保たれるため、より一層の重ね打ち効果が得られる。また、重ね打ちにおける水分付加も必要としないため、より少ない工程で反応性チップを製造することもできる。
【００３２】
以下、実施例を示してこの出願の発明についてさらに詳細かつ具体的に説明するが、この出願の発明は以下の例によって限定されるものではない。
【００３３】
なお、以下の実施例における実験手順は以下のとおりとした。
（ｉ）ＤＮＡチップの作成
↓液体組成物（ＤＮＡ／塩基性アミノ酸水溶液または酸）を用意
↓インクジェットノズルのマイクロピペットに充填
↓ポリＬ−リジンでコーティングしたスライドガラスに２００ｐｌずつスポッティング
↓−１０℃に２０分、２０℃に３０分放置（水分付加）
↓８０℃で１時間焼成
↓固定化処理
（ｉｉ）標識ｃＤＮＡの調製（ＤＮＡチップ２．５枚当たり）
↓ＤＥＰＣ処理水１μｌ、ｏｌｉｇｏｐｒｉｍｅｒ１μｌ、ＲａｔＬｉｖｅｒのｍＲＮＡ５μｌを混合
↓７０℃、５分間
↓４２℃、３分間
↓５×ＦｉｒｓｔＳｔｒａｎｄＢｕｆｆｅｒ４μｌ、ｄＮＴＰｍｉｘｔｕｒｅ２μｌ、１００ｍＭＤＴＴ２μｌ、４０ＵＲＮａｓｅｉｎｈｉｂｉｔｏｒ２．５μｌ、１ｍＭｆｌｕｏｒｏＬｉｎｋｄＵＴＰ２μｌを混合
↓ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＩＩ１μｌを添加
↓４２℃で４０分間反応
↓さらに、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＩＩ１μｌを添加
↓４０分間反応
↓滅菌水２０μｌ、０．５ＭＥＤＴＡ５μｌ、１ＮＮａＯＨ１０μｌを添加
↓６５℃で６０分間加熱
↓Ｔｒｉｓ（１Ｍ，ｐＨ７．５）を２５μｌ添加
ＱＩＡＧＥＮ精製
↓５倍量のＰＭバッファーを添加
↓ＱＩＡｑｕｉｃｋカラムとｃｏｌｌｅｃｔｒｉｏｎチューブをセットし、１分間遠心
↓７５０μｌのＰＥバッファーでカラムを洗浄
↓更に、１分間遠心
↓新しい１．５ｍｌチューブを用意し、カラムの中央に２２μｌの滅菌水を滴下
↓１分間遠心して溶出
（ｉｉｉ）ハイブリダイゼーション
↓標識ｃＤＮＡ１７．５μｌ、２０×ＳＳＣ６．２５μｌ、１０％ＳＤＳ１．２５μｌを混合
↓９５℃で３分間加熱
↓室温で１５分放置
↓ＤＮＡチップ１枚につき、１２μｌずつ滴下
↓静かにカバーガラスをかけ、６５℃の暗所湿潤環境下で１６時間反応
（ｉｖ）ハイブリダイゼーション洗浄
↓２×ＳＳＣ−０．１％ＳＤＳ中で静かにカバーガラスをはずす
↓２×ＳＳＣ−０．１％ＳＤＳで２回洗浄
↓５５℃に加熱した２×ＳＳＣ−０．１％ＳＤＳで２回洗浄
↓０．２×ＳＳＣ−０．１％ＳＤＳ、０．２×ＳＳＣ、０．０５×ＳＳＣで洗浄
↓遠心乾燥
（ｖ）蛍光測定
↓チップをＡｇｉｌｅｎｔＳｃａｎｎｅｒにセットし、ＰＭＴ感度１００％、解像度５μｍで測定
また全ての実験を通じてのスポッティング条件は以下のとおりとした。
【００３４】
スポッテイング方式：インクジェット
スライドガラス：ＰＬＬコート基板
スポット径：１２０μｍ
プローブＤＮＡ：Ｒａｔ由来
プローブＤＮＡ種類：１２種類
プローブＤＮＡ長さ：５００ｂｐ〜３０００ｂｐ
プローブＤＮＡ濃度：０．１μｇ／μｌ
【００３５】
【実施例】
（１）塩基性アミノ酸の効果
塩基性アミノ酸であるＬ−リジン、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−アルギニンをそれぞれ単独で水に溶解させ、これにＤＮＡを添加して最終濃度を０．１μｇ／μｌとして、塩基性アミノ酸濃度を変えた溶液を調整した。スポット後、ハイブリダイゼーション、解析を行った。プローブＤＮＡ１２種類のうちｃｌｏｎｅＩＤがＵＩ−Ｒ−Ｃ０−ＩＹ−Ｂ−０１−０−ＵＩ（ｍｅｍｂｒａｎｅｃｈａｎｎｅｌｐｒｏｔｅｉｎ）とＵＩ−Ｒ−Ａ１−ＤＷ−Ｂ−０８−０−ＵＩ（ｓｔｅｒｏｌｃａｒｒｉｅｒｐｒｏｔｅｉｎ）の結果を表１に示す。
【００３６】
【表１】

【００３７】
比較として、塩基性アミノ酸の代わりにカルボキシルメチルセルロース（ＣＭＣ）０．５％を添加したプローブ溶液について同様に測定した結果、Ｃｙ３蛍光強度はＵＩ−Ｒ−Ｃ０−ＩＹ−Ｂ−０１−０−ＵＩで１９２００、ＵＩ−Ｒ−Ａ１−ＤＷ−Ｂ−０８−０−ＵＩで８８００であった。従って、各塩基性アミノ酸水溶液を添加したプローブ溶液組成物によって、ＣＭＣ添加と同等の蛍光強度が得られた。
【００３８】
なお、表１から明らかなように、Ｌ−リジンは５〜１５％重量、Ｌ−ヒスチジンは４％が、Ｌ−アルギニンは５〜１５％重要の濃度とした場合に強い蛍光強度がえられた。参考までに、Ｌ−ヒスチジンは４％、Ｌ−アルギニンは１５％まで可溶である。この中で、最も蛍光強度が大きかったのは、１０％Ｌ−アルギニン水溶液であった。
（２）Ｌ−アルギニン中和物の検討
１０％Ｌ−アルギニン水溶液を作成し、ＨＣｌ、ラクトビオン酸、リン酸、クエン酸でｐＨ８に調製し、ＤＮＡ水溶液と混合させ、最終１０％Ｌ−アルギニン、ＤＮＡ濃度０．１μｇ／μｌからなるプローブ溶液組成物を調製し、Ｃｙｓ蛍光強度と飛沫発生割合を検討した。
【００３９】
結果は表２に示したとおりであり、リン酸で中和することにより、蛍光強度を下げることなく中性にすることが可能となった。
【００４０】
【表２】

【００４１】
また、リン酸バッファー単独での検討も行った。ＮａＨ２ＰＯ４とＮａ２ＨＰＯ４を混合し、ｐＨを８とし、最終リン酸濃度を１０，１００，３００ｍＭとした。結果は表３に示したとおりである。
【００４２】
同様の条件で測定したＣＭＣ（０．５％）添加でのＣｙ３蛍光強度は１４７００であり、リン酸バッファーの添加によってＣＭＣ添加と同等以上の蛍光強度が得られた。
【００４３】
【表３】

【００４４】
（３）リン酸：クエン酸混合酸による中和物の検討
表２に示したとおり、リン酸による中和によって強い蛍光が得られたが、スポット時に飛沫が多数発生したので、飛沫が発生しないクエン酸とリン酸との混合酸の効果を検討した。
【００４５】
前記（２）と同様に、１２％Ｌ−アルギニン水溶液にリン酸でｐＨ８にしたものとクエン酸でｐＨ８にしたものを作成し、その混合割合を変えて、ＤＮＡ水溶液と混ぜ、Ｅ〜Ｇのプローブ溶液組成物を調製した。最終濃度は、Ｌ−アルギニンが１０％、その他は表４のとおりとし、ＤＮＡは０．１μｇ／μｌとした。
【００４６】
結果は表４に示したとおりである。混合酸のリン酸割合が８１％以上では、従来以上の蛍光強度を得ることができた。さらに、Ｆ液のリン酸割合８１％の混合液では、飛沫発生割合を２．１％と低く抑えることができた。なお、対照として測定したＣＭＣ（０．５％）添加では、Ｃｙ３蛍光強度は１６５００であった。
【００４７】
【表４】

【００４８】
（４）スポット形状の検討
温度２０℃、湿度３０％の環境下でそれぞれ１００スポット終了後の形状変化を観察し、ドーナツ化の割合を評価した。なお、正常型（台形型）、ドーナツ型、不完全回復型のそれぞれのスポット断面形状は図１に示した蛍光断面型を指標として判定した。
【００４９】
結果は表５に示したとおりである。溶液Ｈ（ＣＭＣ添加）ではスポット後の時間が経過するにつれて、スポットのドーナツ化が生じた。しかし、溶液Ｆ、Ｇはいずれもスポットのドーナツ化は観察されなかった。この溶液Ｆ、Ｇは、添加剤が低分子であるため、大きな分子内運動が起こらない。したがって、スポットが乾燥し析出しても、スポット内の水の流れによって、分子の形状が大きく変化しない。このことにより、スポット内の均一な厚みの台形型の蛍光断面が得られ、蛍光強度のピクセル間の差が小さくなり、再現性が良好となる。
【００５０】
【表５】

【００５１】
次に、いくつかの添加剤における代表として５つずつスポットを選び、スポット間のＣｙ３蛍光強度の再現性と、スポット形状を検討した。
【００５２】
結果は表６に示したとおりである。スポット形状（蛍光断面型）がＦ液で見られる「台形型」であれば、平均値と中央値の差が小さく、スポット間の再現性は良好であった。
【００５３】
【表６】

【００５４】
【発明の効果】
以上詳しく説明したとおり、この出願によって、標的物質に特異的に結合するプローブを基板上にスポッティング固定するための新しいプローブ溶液組成物が提供される。これによって、好ましい形状のプローブスポットを安定的に基板上に固定することが可能となり、反応性チップにおける検出感度の向上、高密度化、製造工程の省略化が実現され、高精度の反応性チップを低価格で大量に提供することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【図１】スポット断面形状の台形型、ドーナツ型、不完全回復型のそれぞれの蛍光断面型である。[0001]
TECHNICAL FIELD OF THE INVENTION
The invention of this application relates to a probe solution composition used for producing a reactive chip in which probes specifically binding to a target substance are aligned and fixed on a substrate at a high density, and a reactive solution produced using this composition. The present invention relates to a chip and a method for producing the reactive chip.
[0002]
[Prior art]
Various reactive chips have been used for the purpose of mass and rapid analysis of gene structures and gene expression patterns. In this reactive chip, thousands to tens of thousands of different lobes are aligned and fixed as spots on a substrate such as a slide glass, and the presence or absence of binding of the target substance labeled by fluorescence or the like to the probe is used as an index, It has become possible to specify a target substance and quantify the amount of the target substance in a sample. The probe immobilized on the chip differs depending on the type of the target substance to be analyzed. For example, when DNA or RNA is the target substance, a double-stranded or single-stranded DNA fragment, a polynucleotide chain, an oligonucleotide chain, or the like capable of complementary binding (hybridization) thereto is employed as a probe. It is called a DNA chip (or DNA array) (for example, see Patent Documents 1-4 and Non-Patent Documents 1 and 2). In the case of a protein chip, a protein or peptide and a receptor or antibody that specifically binds to them constitute a target substance-probe relationship.
[0003]
For example, when a DNA fragment or the like is used as a probe, the probe spot is formed by a method of immobilizing the DNA fragment itself on a substrate or a method of synthesizing a DNA fragment having a predetermined base sequence on the substrate. In either case, it is necessary to accurately spot a certain amount of the probe material at a predetermined position.
[0004]
As a method of spotting the probe material on the substrate, there is known a method of supplying (implanting) the probe solution onto the substrate by using a so-called pin, such as a QUILL method, a pin & ring method, and a spring pin method.
[0005]
On the other hand, the applicant of the present application has invented a method of spotting a trace amount of probe solution quickly and accurately at a predetermined position on a substrate by using a jet nozzle, and has filed a patent application (Patent Document 5). ). In addition, the applicant has filed a patent application for a DNA chip manufacturing method capable of improving the use efficiency of the probe solution and making the spot diameter uniform by spotting the DNA probe solution a plurality of times (overstrike spotting). (Patent Document 6).
[0006]
On the other hand, the probe solution contains carboxymethylcellulose etc. to stably fix the probe spot on the substrate, but the probe solution composition has been improved to further improve the detection sensitivity and increase the density of the spot. Has also been done. For example, Patent Document 7 discloses a probe solution (DNA solution) containing a hydrophilic polymer. Patent Document 8 discloses a liquid composition comprising a probe, urea, glycerin, thiodiglycol, and acetylene alcohol as a probe solution for an inkjet method.
[0007]
[Patent Document 1]
US Patent No. 5,474,796 [Patent Document 2]
US Patent No. 5,605,662 [Patent Document 3]
International Publication No. 95/251116 pamphlet [Patent Document 4]
International Publication No. 95/35505 pamphlet [Patent Document 5]
JP 2001-116750 A [Patent Document 6]
JP 2001-186880 A [Patent Document 7]
JP 2000-295990 A [Patent Document 8]
JP 2001-66305 A [Non-Patent Document 1]
Schena, M .; et al. , Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 93: 10614-10619, 1996.
[Non-patent document 2]
Heller, R.A. A. et al. , Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94: 2150-2155, 1997.
[0008]
[Problems to be solved by the invention]
In order to efficiently mass-produce a reactive chip capable of specifying and quantifying a target substance with high accuracy and to provide it at a low cost, it is necessary to stably fix a probe spot on a substrate. Therefore, as described above, various attempts have been made to improve the composition of the probe solution. However, even when such an improved probe solution is used, a step of adding moisture to prevent drying of spots after spotting was indispensable in the step of producing a reactive chip. That is, when the spot dries, the shape of the polymer changes with movement of water, so that the spot becomes donut. As a means for recovering the shape of the spot formed into a donut, a fixed amount of water is added to the spot. However, even if the conventional probe solution is used even after the water addition step, a preferable spot shape (trapezoid type) is used. Was difficult to form. For this reason, the signal intensity varies among the pixels (square resolution range by the scanner, for example, 5 μm × 5 μm).
[0009]
The invention of this application has been made in view of the circumstances as described above, and makes it possible to stably fix a probe spot on a substrate in a preferable trapezoidal shape even if the step of adding water is omitted. It is an object of the present invention to provide a probe solution composition that can be used.
[0010]
Another object of the invention of this application is to provide a reactive chip manufactured using the above-described composition and a method for manufacturing the reactive chip.
[0011]
[Means for Solving the Problems]
This application is a liquid composition for spotting and immobilizing a probe that specifically binds to a target substance on a substrate as an invention for solving the above-mentioned problem, comprising a probe and a basic amino acid. A probe solution composition is provided.
[0012]
In a preferred embodiment of the probe solution composition of the present invention, the content of the basic amino acid is 15% by weight.
[0013]
Further, the probe solution composition of the present invention preferably further contains phosphoric acid, has a pH of 7 to 9, and the basic amino acid in that case is L-arginine.
[0014]
In a preferred embodiment of the probe solution composition, the probe is a DNA fragment, an RNA fragment, a nucleotide chain, a protein, a peptide, or any complex thereof.
[0015]
The invention of this application provides a reactive chip, wherein any one of the probe solution compositions is immobilized on a substrate as a spot.
[0016]
Still further, the invention of this application provides a method for producing a reactive chip, comprising spotting any one of the probe solution compositions described above on a substrate and fixing a spot of the liquid composition on the substrate. I do.
[0017]
In this manufacturing method, spotting is performed by an ink jet method, probe solution composition spots are fixed without adding water, and spotting is repeated two or more times to laminate and fix the probe solution composition. Is a preferred embodiment.
[0018]
Hereinafter, embodiments of each invention of this application will be described in detail.
[0019]
BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION
The probe solution composition of the present invention is characterized by containing a probe that specifically binds to a target substance and a basic amino acid.
[0020]
The basic amino acid is one or more amino acid residues selected from the group consisting of lysine, histidine and arginine. Any of the L-form and the D-form may be used, but the use of the L-form is preferred. The basic amino acid may be a non-natural one (amino acid mimetic). For example, a lysine mimetic can be generated (and the amino terminal residue altered) by reacting ricinyl with, for example, succinic or other carboxylic anhydrides. Lysine and other α-amino-containing residue mimetics are also known as imide esters such as methylpicolinimidate, pyridoxal phosphate, pyridoxal, chloroborohydride, trinitrobenzene asulfonic acid, O-methylisourea, 2,4-pentanedione. And transamidase-catalyzed reactions using glyoxylate. Histidine residue mimetics can be produced by reacting histidyl with, for example, diethyl procarbonate or para-bromophenacyl bromide. Arginine residue mimetics can also be obtained by reacting arginyl with, for example, one or more reagents containing, for example, phenylglyoxal, 2,3-butanedione, 1,2-cyclohexanedione, or ninhydrin, preferably under alkaline conditions. Can be generated. In addition, such mimetics include methylation of the α-amino group of each basic amino acid residue, acetylation of the N-terminal amine, methylation of the main chain amide residue or substitution with an N-methyl amino acid, and C- The terminal carboxyl group may be amidated.
[0021]
The content of these basic amino acids can be appropriately determined according to the type of amino acid, the type of other components, and the like, but is 15% by weight or less, preferably 1 to 15% by weight.
[0022]
The probe used in the solution composition of the present invention is a biomolecule that specifically binds to a target substance. For example, when the target substance is a DNA fragment derived from genomic DNA (for example, cDNA or the like), the probe may be a single-stranded DNA fragment, an RNA fragment, a nucleotide chain (100 Polynucleotides with more than 100 bases or oligonucleotides with less than 100 bases). When the target substance is a protein, the target substance is a protein, peptide, or the like that specifically binds to a part of the amino acid sequence. In addition, an antibody capable of binding to an epitope of a protein or its Fab, F (ab ') ₂ , Fv fragment or the like can be used as a probe.
[0023]
The concentration of the probe in the probe solution composition can be appropriately determined according to the type and molecular weight of the probe. For example, in the case of a DNA fragment or a nucleotide chain, it is preferably about 0.1 to 5 μg / μl. it can.
[0024]
The components other than the probe and the basic amino acid in the solution composition of the present invention can be the same as those of the probe solution used for the production of a normal reactive chip. For example, a composition example of a solution composition when a DNA fragment is used as a probe is such that the final concentration is 10% (w / v) of L-arginine and 0.01% (w / v) of a DNA fragment. It is dissolved in TE buffer (pH 8, 0.01 M Tris-HCl, 0.001 M EDTA) or water (distilled water, pure water, etc.).
[0025]
Furthermore, in the probe solution composition of the present invention, particularly when L-arginine is contained, the pH can be neutralized to 7 to 9, more preferably around pH 8. The pH can be adjusted by adding phosphoric acid or phosphoric acid and citric acid at a ratio of 1 to 10% by weight, respectively.
[0026]
Note that a solution containing a basic amino acid and a solution containing a probe may be separately prepared, and then mixed to prepare a probe solution composition. In this case, by preparing a large amount of a basic amino acid solution and individually mixing it with a plurality of types of probe solutions, it is possible to efficiently prepare all types of probe solution compositions to be spotted on a reactive chip.
[0027]
Next, the reactive chip of the present invention and a method for producing the same will be described.
[0028]
The reactive chip of the present invention is characterized in that the probe solution composition is immobilized on a substrate as spots. The substrate is a slide glass or the like used for an ordinary reactive chip, and a substrate coated with poly-L-lysine disclosed in JP-A-2001-186880 is particularly preferable. The probe solution composition to be spotted is, for example, a solution composition containing 100 to 20,000 kinds of different probes, and these spotted compositions have a distance of about 100 to 1000 μm and a diameter of 50 to 500 μm, respectively. A spot having a size is formed.
[0029]
The spotting method for producing such a reactive chip can be performed by a conventional pin method, but is preferably an ink jet method disclosed in JP-A-2001-116750 and JP-A-2001-186881. It is preferable to adopt a method.
[0030]
After spotting, in the same manner as in the production of a reactive chip, cooling, addition of moisture to the spots (holding at a humidity of about 80% for a certain period of time), and fixation by baking and drying, etc. Fix on top. However, in the production method of the present invention, the spotted probe solution composition does not become a donut due to drying, and thus, even if the above-described water addition step is omitted, the spot shape does not deteriorate.
[0031]
Further, in the manufacturing method of the present invention, it is a preferable embodiment to perform spotting overlapping as disclosed in JP-A-2001-186880. Also in this case, the spot shape is kept good in each spotting, so that a further overlapping effect can be obtained. In addition, since it is not necessary to add moisture in the overstrike, a reactive chip can be manufactured with fewer steps.
[0032]
Hereinafter, the invention of this application will be described in more detail and specifically with reference to examples, but the invention of this application is not limited to the following examples.
[0033]
The experimental procedure in the following examples was as follows.
(I) Preparation of DNA chip ↓ Preparation of liquid composition (DNA / basic amino acid aqueous solution or acid) ↓ Filling into micropipette of inkjet nozzle ↓ Spotting 200 pl each on slide glass coated with poly L-lysine ↓ Leave for 20 minutes at 20 ° C for 30 minutes (add water)
↓ Bake at 80 ° C for 1 hour ↓ Immobilization treatment (ii) Preparation of labeled cDNA (per 2.5 DNA chips)
↓ 1 μl of DEPC-treated water, 1 μl of oligo primer, and 5 μl of Rat Liver mRNA are mixed. 5 μl, 2 μl of 1 mM FluoroLink dUTP mixed ↓ Add 1 μl of SuperScript II ↓ Reaction at 42 ° C. for 40 minutes ↓ Add 1 μl of SuperScript II ↓ Reaction for 40 minutes ↓ Sterilized water 20 μl, 0.5 M EDTA 5 μl, 1N NaOH Addition ↓ Heat at 65 ° C for 60 minutes ↓ Add 25 μl of Tris (1M, pH 7.5) QIAGEN purification ↓ Add 5 volumes of PM buffer ↓ QIAquick column and colle Set the ctrion tube and centrifuge for 1 minute ↓ Wash the column with 750 μl of PE buffer ↓ Further centrifuge for 1 minute ↓ Prepare a new 1.5 ml tube, drop 22 μl of sterile water in the center of the column ↓ Centrifuge for 1 minute to elute (Iii) Hybridization ↓ Mix 17.5 μl of labeled cDNA, 6.25 μl of 20 × SSC, and 1.25 μl of 10% SDS ↓ Heat at 95 ° C. for 3 minutes ↓ Leave at room temperature for 15 minutes ↓ Drop 12 μl per DNA chip ↓ Gently cover the cover glass, react for 16 hours in a dark and humid environment at 65 ° C. (iv) Hybridization wash ↓ Gently remove the cover glass in 2 × SSC-0.1% SDS ↓ 2 × SSC-0 Wash twice with 1% SDS ↓ Wash twice with 2 × SSC-0.1% SDS heated to 55 ° C. ↓ 0.2 × SSC-0.1% SDS, Wash with 0.2 × SSC, 0.05 × SSC ↓ Centrifugal drying (v) Fluorescence measurement ↓ Set the chip in Agilent Scanner, measure with PMT sensitivity 100%, resolution 5 μm. Spotting conditions throughout all experiments are as follows. As expected.
[0034]
Spotting method: Inkjet slide glass: PLL coated substrate Spot diameter: 120 μm
Probe DNA: Rat-derived probe DNA type: 12 types Probe DNA length: 500 bp to 3000 bp
Probe DNA concentration: 0.1 μg / μl
[0035]
【Example】
(1) Effect of basic amino acids L-lysine, L-histidine and L-arginine, which are basic amino acids, are individually dissolved in water, and DNA is added thereto to a final concentration of 0.1 μg / μl. A solution with a different basic amino acid concentration was prepared. After spotting, hybridization and analysis were performed. Of the 12 types of probe DNAs, the clone IDs of UI-R-C0-IY-B-01-0-UI (membrane channel protein) and UI-R-A1-DW-B-08-0-UI (sterol carrier protein). Table 1 shows the results.
[0036]
[Table 1]

[0037]
As a comparison, a probe solution to which 0.5% of carboxymethylcellulose (CMC) was added instead of a basic amino acid was similarly measured. As a result, the Cy3 fluorescence intensity was UI-R-C0-IY-B-01-0-UI. 19200, UI-R-A1-DW-B-08-0-UI was 8,800. Therefore, the same fluorescence intensity as in the case of adding CMC was obtained by the probe solution composition to which each basic amino acid aqueous solution was added.
[0038]
In addition, as is clear from Table 1, a strong fluorescence intensity was obtained when the concentration of L-lysine was 5 to 15% by weight, the concentration of L-histidine was 4%, and the concentration of L-arginine was 5 to 15%. . For reference, L-histidine is soluble up to 4% and L-arginine is soluble up to 15%. Among these, the 10% L-arginine aqueous solution had the highest fluorescence intensity.
(2) Examination of L-arginine neutralized product A 10% L-arginine aqueous solution was prepared, adjusted to pH 8 with HCl, lactobionic acid, phosphoric acid, and citric acid, mixed with a DNA aqueous solution, and finally mixed with 10% L-arginine. A probe solution composition having a DNA concentration of 0.1 μg / μl was prepared, and the Cys fluorescence intensity and the droplet generation ratio were examined.
[0039]
The results are as shown in Table 2, and neutralization with phosphoric acid enabled neutralization without lowering the fluorescence intensity.
[0040]
[Table 2]

[0041]
In addition, a study was conducted using only a phosphate buffer. NaH2PO4 and Na2HPO4 were mixed, the pH was set to 8, and the final phosphoric acid concentration was 10,100,300 mM. The results are as shown in Table 3.
[0042]
Under the same conditions, the fluorescence intensity of Cy3 when CMC (0.5%) was added was 14,700, and the addition of the phosphate buffer gave a fluorescence intensity equal to or higher than that of CMC.
[0043]
[Table 3]

[0044]
(3) Phosphoric acid: Examination of neutralized product with citric acid mixed acid As shown in Table 2, strong fluorescence was obtained by neutralization with phosphoric acid, but no droplets were generated because many droplets were generated at the time of spotting. The effect of the mixed acid of citric acid and phosphoric acid was studied.
[0045]
In the same manner as in the above (2), a 12% aqueous L-arginine solution was prepared by adjusting the pH to 8 with phosphoric acid and the aqueous solution to pH 8 with citric acid, and the mixing ratio was changed. A probe solution composition was prepared. The final concentration was 10% for L-arginine, the others were as shown in Table 4, and the DNA was 0.1 μg / μl.
[0046]
The results are as shown in Table 4. When the phosphoric acid ratio of the mixed acid was 81% or more, it was possible to obtain a fluorescence intensity higher than the conventional one. Furthermore, in the case of the mixed solution having a phosphoric acid ratio of 81% in the solution F, the droplet generation ratio could be suppressed as low as 2.1%. In addition, when CMC (0.5%) measured as a control was added, the Cy3 fluorescence intensity was 16,500.
[0047]
[Table 4]

[0048]
(4) Examination of spot shape Under a temperature of 20 ° C. and a humidity of 30%, a change in shape after completion of 100 spots was observed, and the ratio of donut formation was evaluated. The spot cross-sectional shape of each of the normal type (trapezoid type), the donut type, and the incomplete recovery type was determined using the fluorescence cross-section type shown in FIG. 1 as an index.
[0049]
The results are as shown in Table 5. In solution H (with CMC added), as the time after the spot elapses, donut formation of the spot occurred. However, in each of the solutions F and G, donut formation of the spot was not observed. Since the additives of the solutions F and G are low molecules, large intramolecular motion does not occur. Therefore, even if the spot is dried and precipitated, the shape of the molecule does not change significantly due to the flow of water in the spot. As a result, a trapezoidal fluorescence cross section having a uniform thickness in the spot is obtained, the difference in fluorescence intensity between pixels is reduced, and the reproducibility is improved.
[0050]
[Table 5]

[0051]
Next, five spots were selected as representatives of several additives, and the reproducibility of the Cy3 fluorescence intensity between the spots and the spot shape were examined.
[0052]
The results are as shown in Table 6. When the spot shape (fluorescence cross section type) was “trapezoidal type” seen in the F solution, the difference between the average value and the median value was small, and the reproducibility between spots was good.
[0053]
[Table 6]

[0054]
【The invention's effect】
As described in detail above, the present application provides a novel probe solution composition for spotting and immobilizing a probe that specifically binds to a target substance on a substrate. This makes it possible to stably fix the probe spot of a preferable shape on the substrate, thereby improving the detection sensitivity of the reactive chip, increasing the density, and omitting the manufacturing process. Can be provided in large quantities at low prices.
[Brief description of the drawings]
FIG. 1 shows a trapezoidal shape, a donut shape, and an incomplete recovery type having a spot cross-sectional shape, respectively.

Claims

A probe solution composition comprising a probe and a basic amino acid, which is a liquid composition for spotting and immobilizing a probe that specifically binds to a target substance on a substrate.

The probe solution composition according to claim 1, wherein the content of the basic amino acid is 15% by weight or less.

The probe solution composition according to claim 1 or 2, further comprising phosphoric acid and having a pH of 7 to 9.

4. The probe solution composition according to claim 3, wherein the basic amino acid is L-arginine.

The probe solution composition according to claim 1, wherein the probe is a DNA fragment, an RNA fragment, a nucleotide chain, a protein, a peptide, or any complex thereof.

A reactive chip, wherein the probe solution composition according to any one of claims 1 to 5 is immobilized on a substrate as a spot.

A method for producing a reactive chip, comprising spotting the probe solution composition according to any one of claims 1 to 5 on a substrate, and fixing a spot of the liquid composition on the substrate.

The method according to claim 7, wherein spotting is performed by an inkjet method.

9. The method according to claim 7, wherein the probe solution composition spot is immobilized without adding water.

10. The method according to claim 7, wherein the probe solution composition is laminated and fixed by repeating spotting two or more times.