JP2004264174A - Aryl hydrocarbon receptor fixing electrode, manufacturing method and application of the same - Google Patents

Aryl hydrocarbon receptor fixing electrode, manufacturing method and application of the same Download PDF

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均 宮坂
Masaharu Murata
正治 村田
Yoshiki Katayama
佳樹 片山
Hatsumi Gonda
初美 権田
Tatsuo Suzutani
達夫 錫谷
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Kyushu University NUC
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Abstract

<P>PROBLEM TO BE SOLVED: To provide an aryl hydrocarbon receptor fixing electrode for quickly and sensitively detecting a coupling between an aryl hydrocarbon receptor and a ligand as an electrochemical signal. <P>SOLUTION: The aryl hydrocarbon receptor fixing electrode includes elements (1)-(4). The element (1) is a conductive substrate; the element (2) is a bifunctional fixing reagent, having an adsorption region to the conductive substrate and two complex ligands to a nickel complex or a cobalt complex and fixed to the conductive substrate via the adsorption region; the element (3) is the nickel complex or the cobalt complex bonded to two complex ligands of the bifunctional fixing reagent; and the element (4) is the aryl hydrocarbon receptor, having a histidine tag and coupled to the nickel complex or the cobalt complex via the histidine tag. <P>COPYRIGHT: (C)2004,JPO&NCIPI

Description

【０００１】
【発明が属する技術分野】
本発明は受容体とリガンドの間の結合を電気化学的シグナルとして検出するための電気化学センサ（受容体固定化電極）に関する。特に、本発明はダイオキシン類や多環芳香族炭化水素化合物などの環境汚染物質を検出するための電気化学センサに関する。また、本発明はかかる電気化学センサの製造方法、かかる電気化学センサを含む電気化学的分析装置、及びかかる電気化学センサの用途にも関する。
【０００２】
【従来の技術】
化学物質の中にはホルモンの代わりに受容体に結合して内分泌系を攪乱するものがある。例えば、ＤＤＴやビスフェノールＡなどはエストロゲン（女性ホルモン）受容体に結合してしまい、生体の必要性に関係なくエストロゲン（女性ホルモン）作用を起こさせることが知られている。
【０００３】
ホルモンは組織の発生や分化、成長、体内の恒常性の維持などの様々な生理的作用を有する物質である。ホルモンがその作用を発揮するためには受容体と結合することが必要である。つまり、内分泌臓器の細胞で合成されたホルモンは血液を介して標的臓器に到達し、そこで受容体と結合して複合体を形成する。次にこの複合体が細胞核へと輸送されて標的遺伝子の発現を誘導し、これにより生理作用を起こす標的タンパク質が生産されて様々な作用を起こす。
【０００４】
アリールハイドロカーボン受容体（通称ダイオキシン受容体、ＡｈＲ）はヒトの代謝系にかかわる重要な転写因子である。アリールハイドロカーボン受容体はいわゆるオーファンレセプターの一種であり、その正規のリガンド（つまり、結合すべきホルモン）はいまだ明らかとなっていない。しかし、ダイオキシン類や多環芳香族炭化水素化合物などの環境汚染物質はアリールハイドロカーボン受容体に結合し、人体に重篤な傷害をもたらすことが知られている。即ち、ダイオキシン類や多環芳香族炭化水素化合物などの環境汚染物質がアリールハイドロカーボン受容体に結合すると肝臓のミクロソーム中のチトクロームＰ４５０酵素を誘導し、様々な物質の代謝を変化させ、抗男性ホルモン作用、抗女性ホルモン作用、甲状腺ホルモンの機能低下、免疫異常、アレルギー反応の異常、口蓋裂などの奇形を生じさせる。従って、環境の安全性を確認するため、環境中の上記環境汚染物質を検出又は測定する技術の開発が求められている。
【０００５】
また、上述のダイオキシン類や多環芳香族炭化水素化合物以外に、現在流通する１０万種類に及ぶ化学物質の中にはアリールハイドロカーボン受容体と結合し、類似の毒性を示すものが多数含まれていると考えられている。従って、これらの化学物質の安全性を確認するため、これらの化学物質の健康リスクを評価する技術の開発が求められている。
【０００６】
また、生理的作用に関わる受容体がリガンドと結合したときにどのような構造変化又は機能変化が誘起されるのかを知ることは医薬品や疾病治療方法を開発する上で重要であるが、アリールハイドロカーボン受容体がリガンドと結合したときに誘起される受容体の構造変化又は機能変化の詳細はいまだ明らかとなっていない。
【０００７】
現在、環境汚染物質を測定する方法としては大型機器を用いる機器分析方法と、培養細胞又は抗体を用いるバイオアッセイ方法の２つが主に知られている。前者はレーザー照射によって化合物をフラグメンテーション化し、その質量を分析する方法である。この方法は毒性が既知の物質の測定方法としては優れているが、化学物質の毒性評価（アリールハイドロカーボン受容体との結合活性評価）に用いることは不可能である。また使用する機器が大型であり、かつ非常に高価であることも欠点である。一方、後者のバイオアッセイ方法は測定物質の毒性評価が可能ではあるが、測定に長時間（最短５時間から一週間程度）を要する上、数段階にわたる煩雑な実験操作が必要である。また培養細胞を用いるアッセイ方法では、測定物質の細胞膜透過性により測定の定量性が損なわれてしまうことも大きな問題点である。
【０００８】
これらの方法の欠点に鑑み、本発明者らは金電極の如き導電性基板上に一官能性固定化試薬を介してニッケル錯体又はコバルト錯体が固定化され、さらに前記錯体に結合したヒスチジンタグを介して受容体が固定化されて構成される受容体固定化電極（電気化学センサ）及びかかる電気化学センサを用いた内分泌攪乱物質検出方法を提案している（非特許文献１）。この電気化学センサは受容体とリガンドの間の結合を電気化学的シグナルとして検出するため、短時間で内分泌攪乱物質を検出することができるという利点を有する。しかし、この電気化学センサは応答感度が十分でなく、実用に耐えうるものではなかった。
【０００９】
【非特許文献１】
第７９回日本化学会講演予稿集（２００１年）、講演番号３Ｆ４０４及び３Ｆ４０７他
【００１０】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の第１の目的は、アリールハイドロカーボン受容体とリガンドの間の結合を短時間でかつ高感度で電気化学的シグナルとして検出することができるアリールハイドロカーボン受容体固定化電極を提供することである。
【００１１】
本発明の第２の目的は、かかるアリールハイドロカーボン受容体固定化電極の製造方法を提供することである。
【００１２】
本発明の第３の目的は、かかるアリールハイドロカーボン受容体固定化電極を含む電気化学的分析装置を提供することである。
【００１３】
本発明の第４の目的は、短時間でかつ高感度で環境汚染物質を定性的に検出する方法を提供することである。
【００１４】
本発明の第５の目的は、短時間でかつ高感度で環境汚染物質を定量的に測定する方法を提供することである。
【００１５】
本発明の第６の目的は、短時間でかつ高感度で化学物質の健康リスクを評価する方法を提供することである。
【００１６】
本発明の第７の目的は、アリールハイドロカーボン受容体がリガンドと結合したときに誘起される受容体の構造変化又は機能変化を解析する方法を提供することである。
【００１７】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは上記課題を解決すべくアリールハイドロカーボン受容体の電極への固定化方法について鋭意研究した結果、先に提案した受容体固定化電極の構成要素中の一官能性固定化試薬を二官能性固定化試薬に置換することによりアリールハイドロカーボン受容体固定化電極の感度が著しく増大すること、かかるアリールハイドロカーボン受容体固定化電極を用いると環境汚染物質の定性的検出もしくは定量的測定、又は化学物質の健康リスクの評価を短時間でかつ高感度で行うことができること、及びかかるアリールハイドロカーボン受容体固定化電極を用いるとアリールハイドロカーボン受容体がリガンドと結合したときに誘起される受容体の構造変化又は機能変化を解析することができることを見出し、遂に本発明を想到するに至った。
【００１８】
本発明の第１の側面によれば、以下の（１）〜（４）の要素を含むことを特徴とするアリールハイドロカーボン受容体固定化電極が提供される：
（１） 導電性基板；
（２） 導電性基板に対する吸着部位とニッケル錯体又はコバルト錯体に対する２つの錯体配位子とを有する二官能性固定化試薬であって、吸着部位を介して導電性基板に固定化されている二官能性固定化試薬；
（３） 二官能性固定化試薬の２つの錯体配位子にそれぞれ結合されているニッケル錯体又はコバルト錯体；及び
（４） ヒスチジンタグを有するアリールハイドロカーボン受容体であって、ヒスチジンタグを介してニッケル錯体又はコバルト錯体に結合されているアリールハイドロカーボン受容体。
【００１９】
本発明のアリールハイドロカーボン受容体固定化電極の好ましい実施態様においては、導電性基板は金電極であり、吸着部位はジスルフィド基の如きイオウ含有基であり、錯体配位子はニトリルトリ酢酸又はイミノ二酢酸である。
【００２０】
本発明のアリールハイドロカーボン受容体固定化電極の好ましい実施態様においては、二官能性固定化試薬の錯体配位子と吸着部位との間にリンカー部位が設けられており、二官能性固定化試薬はその分子構造の両端にそれぞれ錯体配位子を有し、その分子構造の中央に吸着部位を有する。
【００２１】
本発明のアリールハイドロカーボン受容体固定化電極の好ましい実施態様においては、アリールハイドロカーボン受容体はヒト由来の組換えアリールハイドロカーボン受容体であり、前記組換えアリールハイドロカーボン受容体はリガンド結合部位及びＨｓｐ９０結合部位を少なくとも含む。
【００２２】
本発明の第２の側面によれば、以下の（イ）〜（ニ）の工程を含むことを特徴とするアリールハイドロカーボン受容体固定化電極の製造方法が提供される：
（イ） 以下の（１）〜（４）の要素を準備する：
（１） 導電性基板；
（２） 導電性基板に対する吸着部位とニッケル錯体又はコバルト錯体に対する２つの錯体配位子とを有する二官能性固定化試薬；
（３） ニッケル錯体又はコバルト錯体；及び
（４） ヒスチジンタグを有するアリールハイドロカーボン受容体；
（ロ） 導電性基板に二官能性固定化試薬を吸着部位を介して固定化させる；
（ハ）二官能性固定化試薬の２つの錯体配位子にそれぞれニッケル錯体又はコバルト錯体を結合させる；及び
（ニ）ニッケル錯体又はコバルト錯体にアリールハイドロカーボン受容体をヒスチジンタグを介して結合させる。
【００２３】
本発明のアリールハイドロカーボン受容体固定化電極の製造方法の好ましい実施態様においては、上記（ロ）〜（二）の各工程は溶液中で行われる。
【００２４】
本発明の第３の側面によれば、作用電極としてのかかるアリールハイドロカーボン受容体固定化電極、及び酸化還元性マーカーを含むことを特徴とする電気化学的分析装置が提供される。
【００２５】
本発明の電気化学的分析装置の好ましい実施態様においては、酸化還元性マーカーはＫ４Ｆｅ（ＣＮ）６／Ｋ３Ｆｅ（ＣＮ）６、フェロセン、又はヘキサアミンルテニウム（ＩＩＩ）錯体であり、電気化学的分析装置は参照電極及び対極をさらに含み、電気化学的分析はサイクリックボルタンメトリー、微分パルスボルタンメトリー、又はアンペロメトリーによって電流電位特性を測定することを含む。
【００２６】
本発明の第４の側面によれば、以下の工程を含むことを特徴とする、試料溶液中にアリールハイドロカーボン受容体に対するリガンドが存在するか否かを判断する方法が提供される：
アリールハイドロカーボン受容体に対するリガンドを含有する可能性がある試料溶液を準備する；
本発明のアリールハイドロカーボン受容体固定化電極を作用電極とし、酸化還元性マーカーの存在下に前記試料溶液の電流電位特性を測定するか又は本発明の電気化学的分析装置を用いて前記試料溶液の電流電位特性を測定する；及び
測定された試料溶液の電流電位特性を、アリールハイドロカーボン受容体に対するリガンドを含有しないコントロール溶液の電流電位特性と比較し、両者の間に有意な差があれば前記試料溶液中にアリールハイドロカーボン受容体に対するリガンドが存在すると判断し、一方両者の間に有意な差がなければ前記試料溶液中にアリールハイドロカーボン受容体に対するリガンドが存在しないと判断する。
【００２７】
本発明の試料溶液中にアリールハイドロカーボン受容体に対するリガンドが存在するか否かを判断する方法の好ましい実施態様においては、試料溶液は環境から採取された試料から調製されたものであり、リガンドはダイオキシン、ベンゾ（ａ）ピレン、又はβ−ナフトフラボンであり、酸化還元性マーカーはＫ４Ｆｅ（ＣＮ）６／Ｋ３Ｆｅ（ＣＮ）６、フェロセン、又はヘキサアミンルテニウム（ＩＩＩ）錯体であり、電流電位特性はサイクリックボルタンメトリー、微分パルスボルタンメトリー、又はアンペロメトリーによって測定される。
【００２８】
本発明の第５の側面によれば、以下の工程を含むことを特徴とする、試料溶液中に存在するアリールハイドロカーボン受容体に対するリガンドの濃度を決定する方法が提供される：
アリールハイドロカーボン受容体に対するリガンドを含有する試料溶液を準備する；
本発明のアリールハイドロカーボン受容体固定化電極を作用電極とし、酸化還元性マーカーの存在下に前記試料溶液の電流電位特性を測定するか又は本発明の電気化学的分析装置を用いて前記試料溶液の電流電位特性を測定する；及び
測定された試料溶液の電流電位特性を、アリールハイドロカーボン受容体に対するリガンドを既知の濃度で含有するコントロール溶液の電流電位特性と比較し、それによって前記試料溶液中に存在するアリールハイドロカーボン受容体に対するリガンドの濃度を決定する。
【００２９】
本発明の試料溶液中に存在するアリールハイドロカーボン受容体に対するリガンドの濃度を決定する方法の好ましい実施態様においては、試料溶液は環境から採取された試料から調製されたものであり、リガンドはダイオキシン、ベンゾ（ａ）ピレン、又はβ−ナフトフラボンであり、酸化還元性マーカーはＫ４Ｆｅ（ＣＮ）６／Ｋ３Ｆｅ（ＣＮ）６、フェロセン、又はヘキサアミンルテニウム（ＩＩＩ）錯体であり、電流電位特性はサイクリックボルタンメトリー、微分パルスボルタンメトリー、又はアンペロメトリーによって測定され、アリールハイドロカーボン受容体に対するリガンドを既知の濃度で含有するコントロール溶液の電流電位特性は、検量線として表されている。
【００３０】
本発明の第６の側面によれば、以下の工程を含むことを特徴とする、化学物質がアリールハイドロカーボン受容体に対する結合活性を有するか否かを判断する方法が提供される：
化学物質を含有する可試料溶液を準備する；
本発明のアリールハイドロカーボン受容体固定化電極を作用電極とし、酸化還元性マーカーの存在下に前記試料溶液の電流電位特性を測定するか又は本発明の電気化学的分析装置を用いて前記試料溶液の電流電位特性を測定する；
測定された試料溶液の電流電位特性を、アリールハイドロカーボン受容体に対するいかなるリガンドをも含有しないコントロール溶液の電流電位特性と比較する；及び
比較の結果、両者の間に有意な差があれば前記化学物質がアリールハイドロカーボン受容体に対する結合活性を有すると判断し、一方両者の間に有意な差がなければ前記化学物質がアリールハイドロカーボン受容体に対する結合活性を有さないと判断する。
【００３１】
本発明の化学物質がアリールハイドロカーボン受容体に対する結合活性を有するか否かを判断する方法の好ましい実施態様によれば、酸化還元性マーカーはＫ４Ｆｅ（ＣＮ）６／Ｋ３Ｆｅ（ＣＮ）６、フェロセン、又はヘキサアミンルテニウム（ＩＩＩ）錯体であり、電流電位特性はサイクリックボルタンメトリー、微分パルスボルタンメトリー、又はアンペロメトリーによって測定される。
【００３２】
本発明の第７の側面によれば、以下の工程を含むことを特徴とする、アリールハイドロカーボン受容体が前記受容体に対するリガンドと結合したときに誘起される前記受容体の構造変化又は機能変化を解析する方法が提供される：
アリールハイドロカーボン受容体に対するリガンドを含有する試料溶液を準備する；
本発明のアリールハイドロカーボン受容体固定化電極を作用電極とし、酸化還元性マーカーの存在下に前記試料溶液の電流電位特性を測定するか又は本発明の電気化学的分析装置を用いて前記試料溶液の電流電位特性を測定する；及び
測定された試料溶液の電流電位特性を解析する。
【００３３】
本発明のアリールハイドロカーボン受容体が前記受容体に対するリガンドと結合したときに誘起される前記受容体の構造変化又は機能変化を解析する方法の好ましい実施態様によれば、リガンドはダイオキシン、ベンゾ（ａ）ピレン、又はβ−ナフトフラボンであり、酸化還元性マーカーはＫ４Ｆｅ（ＣＮ）６／Ｋ３Ｆｅ（ＣＮ）６、フェロセン、又はヘキサアミンルテニウム（ＩＩＩ）錯体であり、電流電位特性はサイクリックボルタンメトリー、微分パルスボルタンメトリー、又はアンペロメトリーによって測定される。
【００３４】
【発明の実施の形態】
本発明のアリールハイドロカーボン受容体固定化電極は（１）導電性基板；（２）導電性基板に対する吸着部位とニッケル錯体又はコバルト錯体に対する２つの錯体配位子とを有する二官能性固定化試薬；（３）ニッケル錯体又はコバルト錯体；及び（４）ヒスチジンタグを有するアリールハイドロカーボン受容体の４つの要素から構成される。本発明のアリールハイドロカーボン受容体固定化電極においては、二官能性固定化試薬は吸着部位を介して導電性基板に固定化され、ニッケル錯体又はコバルト錯体は二官能性固定化試薬の２つの錯体配位子にそれぞれ結合され、アリールハイドロカーボン受容体はヒスチジンタグを介してニッケル錯体又はコバルト錯体に結合されるように構成されている。
【００３５】
本発明のアリールハイドロカーボン受容体固定化電極で用いる導電性基板は、電気化学反応の作用電極としての役割とアリールハイドロカーボン受容体を固定化する支持体としての役割を有する。導電性基板は上述の２つの役割を有するものであればいかなる材料から作ることができるが、例えば金から作られることが安定性の観点から好ましい。
【００３６】
本発明のアリールハイドロカーボン受容体固定化電極で用いる二官能性固定化試薬は、アリールハイドロカーボン受容体を導電性基板に固定化させる役割を有する。二官能性固定化試薬は導電性基板に対する吸着部位とニッケル錯体又はコバルト錯体に対する２つの錯体配位子とを有し、吸着部位を介して導電性基板に固定化されている。吸着部位は導電性基板の材料に応じて適宜選択すればよく、例えば導電性基板として金電極を用いる場合は吸着部位としてジスルフィド基の如きイオウ含有基を用いればよい。ニッケル錯体又はコバルト錯体に対する錯体配位子は特に限定されるものではなく、例えばこの分野で慣用されるニトリロトリ酢酸（ＮＴＡ）やイミノ二酢酸（ＩＤＡ）を用いることができる。
【００３７】
本発明のアリールハイドロカーボン受容体固定化電極で用いる二官能性固定化試薬は錯体配位子と吸着部位との間にリンカー部位が設けられていることが好ましい。二官能性固定化試薬中の２つの官能基（錯体配位子）及び吸着部位の位置は特に限定されないが、二官能性固定化試薬の分子構造の両端にそれぞれ錯体配位子が位置し、分子構造の中央に吸着部位が位置することが電極の感度を向上させるために好ましい。
【００３８】
本発明のアリールハイドロカーボン受容体固定化電極で用いるニッケル錯体又はコバルト錯体は、二官能性固定化試薬とアリールハイドロカーボン受容体を結合させる役割を有する。本発明のアリールハイドロカーボン受容体固定化電極で用いるアリールハイドロカーボン受容体にはヒスチジンタグが付与されている。ヒスチジンタグは少数個（通常５〜１０個）のヒスチジン残基を含む短いアミノ酸配列であり、ヒスチジン残基中のイミダゾール基の存在によりニッケル錯体又はコバルト錯体と強く結合する性質を有する。従って、ニッケル錯体又はコバルト錯体とヒスチジンタグの組合せを用いることにより、アリールハイドロカーボン受容体を二官能性固定化試薬に結合させることができ、結果として導電性電極に好適に固定化することができる。
【００３９】
本発明のアリールハイドロカーボン受容体固定化電極で用いるアリールハイドロカーボン受容体は、特定の化学物質のみと結合することにより本発明のセンサの検出対象の特異性を決定する役割を有する。つまり、アリールハイドロカーボン受容体はダイオキシン類や多環芳香族炭化水素化合物などの環境汚染物質と特異的に結合するため、アリールハイドロカーボン受容体を電極上に固定化した本発明のセンサはダイオキシン類や多官芳香族炭化水素化合物などの環境汚染物質を特異的に検出することができる。
【００４０】
アリールハイドロカーボン受容体の構造は生物種ごとに異なっており、環境汚染物質に対する生物の感受性は生物種によって異なる。従って、ヒトに対する環境の安全性の確認又は化学物質の健康リスクの評価に本発明のセンサを用いる場合、アリールハイドロカーボン受容体はヒト由来であることが好ましい。また、天然のアリールハイドロカーボン受容体を用いることもできるが、得られるアリールハイドロカーボン受容体の収率及び純度の観点からは、アリールハイドロカーボン受容体は組換えアリールハイドロカーボン受容体であることが好ましい。組換えアリールハイドロカーボン受容体は天然のアリールハイドロカーボン受容体のアミノ酸配列全てを含む必要はなく、リガンド結合部位及びＨｓｐ９０結合部位を少なくとも含んでいればその機能を発揮することができる。かかる組換えアリールハイドロカーボン受容体は、当該技術分野で周知の遺伝子組換え技術により簡単に調製することができる。
【００４１】
本発明のアリールハイドロカーボン受容体固定化電極は、電極上に固定化されたアリールハイドロカーボン受容体とリガンドの間の結合を電気化学的シグナルとして検出するものであり、これにより迅速な測定を可能とするものである。
【００４２】
アリールハイドロカーボン受容体は、生体内では通常、細胞質中でシャペロンタンパク質と複合体を形成することにより安定に存在している。リガンドとなる化学物質と結合すると、アリールハイドロカーボン受容体はその立体構造を大きく変化させてシャペロンタンパク質を解離し、細胞核へと輸送される。そしてそこでコアクチベーターであるＡＲＮＴと転写複合体を形成し、これにより標的遺伝子の発現を誘導する。
【００４３】
本発明では、このリガンド誘導的な受容体の構造変化に着目し、これを高感度で電気化学的に検出することに成功した。一般に、受容体とリガンドとの結合には電気化学的な活性が無いため、これを電気化学的に検出するためには何らかの工夫が必要である。本発明においては、測定溶液中に加えておいた電気化学的に活性な分子（酸化還元性マーカー、たとえばフェリシン化イオン，フェロセン，ヘキサアミンルテニウム（ＩＩＩ）錯体など）の、電極表面上に形成されたタンパク質層に対する“透過しやすさ”を指標とすることによって、間接的にタンパク質の性質の変化を捕捉する（図１参照）。即ち、受容体タンパク質にリガンドが結合することにより生ずる受容体タンパク質の構造変化に起因する酸化還元性マーカーの透過性の変化を電気化学的に測定する。一般に電気化学反応は非常に早いため、本発明のアリールハイドロカーボン受容体固定化電極を用いると、受容体タンパク質層の変化をわずか数分で検出することができる。
【００４４】
本発明のアリールハイドロカーボン受容体固定化電極においては、受容体タンパク質はその機能を損なうことなく電極上に固定化されている。固体表面に生体分子の配向を制御した状態で固定化することは、高い選択性を持つセンサを開発する上で非常に重要となる。タンパク質固定化法としては、共有結合、イオン結合及び生化学的親和力などにより固定化する担体結合法、グルタルアルデヒドのような試薬で架橋する架橋法などが一般的である。しかしながらこれらの方法は、固定化に際してタンパク質上のアミノ酸残基が使われるためタンパク質の機能が完全には維持できない問題や、固体表面に対してタンパク質の配向を制御できないなどの問題がある。特に電極上で固定化タンパク質を認識素子として使用する場合、これらの問題は検出機構上、致命的な欠点となる。そこで本発明のアリールハイドロカーボン受容体固定化電極では、機能を保持した状態でタンパク質を固体表面に可逆的に配向させることができるヒスチジンタグ（Ｈｉｓ−Ｔａｇ）法を利用して受容体タンパク質を電極上に固定化し、これによりセンサとしての選択性を高めている。
【００４５】
本発明のアリールハイドロカーボン受容体固定化電極の最大の特徴は、従来公知の電気化学センサと比較して感度が著しく高いことである。これは本発明によればアリールハイドロカーボン受容体を電極上に固定化するための官能性固定化試薬として従来の一官能性固定化試薬の代わりに二官能性固定化試薬を用いることによって達成される。
【００４６】
従来用いられている一官能性固定化試薬は、例えば後述の実施例１で参照する図３の５に示されるようにその分子構造の一端のみに単一の錯体配位子を有する。従って、一官能性固定化試薬を用いた場合には、図２のＡに示されるように導電性基板（電極）上に単一の受容体タンパク質が固定化されるにすぎないと考えられる。
【００４７】
これに対し、本発明のアリールハイドロカーボン受容体固定化電極で用いられる固定化試薬は二官能性固定化試薬であり、２つの官能基、つまり錯体配位子を例えば図３の４に示されるようにその分子構造の両端にそれぞれ有する。従って、二官能性固定化試薬を用いた場合には、図２のＢに示されるように導電性基板（電極）上に２つの受容体タンパク質が互いに近接して固定化されるものと考えられる。
【００４８】
このように二官能性固定化試薬を用いてアリールハイドロカーボン受容体を電極上に固定化することによりセンサの感度が著しく高まる理由はまだ十分明らかになっていないが、二官能性固定化試薬を用いることにより電極上に２つの受容体タンパク質が互いに近接して固定化されるので、固定化の密度が高くなり、受容体タンパク質とリガンドとの結合により誘起されるコンホメーション変化をより的確に検出することができることが考えられる。
【００４９】
次に本発明のアリールハイドロカーボン受容体の固定化電極の製造方法について説明する。
本発明のアリールハイドロカーボン受容体固定化電極の製造方法は以下の（イ）〜（ニ）の工程を含む：
（イ） 以下の（１）〜（４）の要素を準備する：
（１） 導電性基板；
（２） 導電性基板に対する吸着部位とニッケル錯体又はコバルト錯体に 対する２つの錯体配位子とを有する二官能性固定化試薬；
（３） ニッケル錯体又はコバルト錯体；及び
（４） ヒスチジンタグを有するアリールハイドロカーボン受容体；
（ロ） 導電性基板に二官能性固定化試薬を吸着部位を介して固定化させる；
（ハ） 二官能性固定化試薬の２つの錯体配位子にそれぞれニッケル錯体又はコバルト錯体を結合させる；及び
（ニ） ニッケル錯体又はコバルト錯体にアリールハイドロカーボン受容体をヒスチジンタグを介して結合させる。
【００５０】
工程（イ）において準備される４つの要素（１）〜（４）については、本発明のアリールハイドロカーボン受容体固定化電極の説明の部分で詳述しているので、ここでは説明を省略する。
【００５１】
本発明のアリールハイドロカーボン受容体固定化電極の製造方法においては、（ロ）〜（ニ）の各工程が溶液中で行われることが固定化反応又は結合反応の容易性の観点から好ましい。具体的には二官能性固定化試薬の溶液、ニッケル錯体又はコバルト錯体の溶液、及びアリールハイドロカーボン受容体の溶液をそれぞれ調製し、そこに導電性基板を順に浸漬すればよい。各溶液の溶媒は溶質の溶解度や安定性に応じて適宜決定すればよいが、例えば二官能性固定化試薬については水又はクロロホルムを、ニッケル錯体又はコバルト錯体については水を、アリールハイドロカーボン受容体については水を溶媒とすることができる。
【００５２】
次に、本発明の電気化学的分析装置について説明する。本発明の電気化学的分析装置は作用電極としての本発明のアリールハイドロカーボン受容体固定化電極、及び酸化還元性マーカーを含む。酸化還元性マーカーは水溶性でありかつ受容体タンパク質やそのリガンドに悪影響を与えないものであればいかなるものも用いることができるが、例えばＫ４Ｆｅ（ＣＮ）６／Ｋ３Ｆｅ（ＣＮ）６（フェリシン化イオン）、フェロセン又はヘキサアミンルテニウム（ＩＩＩ）錯体であることができる。なお、以下の本明細書中ではＫ４Ｆｅ（ＣＮ）６／Ｋ３Ｆｅ（ＣＮ）６に基づく系を［Ｆｅ（ＣＮ）６」４−／３−と記すことがある。本発明の電気化学的分析装置は上述のアリールハイドロカーボン受容体固定化電極及び酸化還元性マーカーに加えてＡｇ／ＡｇＣｌの如き参照極及びプラチナワイヤの如き対極をさらに含むことができる。また本発明の電気化学的分析装置が行う電気化学的分析は、一般に、サイクリックボルタンメトリー（ＣＶ）、微分パルスボルタンメトリー、又はアンペロメトリーなどの電気化学的測定方法によって電流電位特性を測定することを含むことができる。
【００５３】
本発明の電気化学的分析装置の１つの好ましい具体的実施態様としては、以下のものを含む電気化学的分析装置が挙げられる：酸化還元性マーカー溶液を充填した容器、及び酸化還元性マーカー溶液中に一端を含浸された、作用電極としての本発明のアリールハイドロカーボン受容体固定化電極、参照極並びに対極。かかる電気化学的分析装置は小型化・キット化が容易であり、フィールドで簡便に使用することができる。また、かかる電気化学的分析装置の構成要素は本発明のアリールハイドロカーボン受容体固定化電極を除けば全て汎用品が使用可能であり、コスト的にも有利である。
【００５４】
本発明のアリールハイドロカーボン受容体固定化電極又は本発明の電気化学的分析装置の好ましい用途として、本発明は以下の４つの方法を提供する：
（１）試料溶液中にアリールハイドロカーボン受容体に対するリガンドが存在するか否かを判断する方法；
（２）試料溶液中に存在するアリールハイドロカーボン受容体に対するリガンドの濃度を決定する方法；
（３）化学物質がアリールハイドロカーボン受容体に対する結合活性を有するか否かを判断する方法；及び
（４）アリールハイドロカーボン受容体が前記受容体に対するリガンドと結合したときに誘起される前記受容体の構造変化又は機能変化を解析する方法。
以下、これらの方法について順に説明する。
【００５５】
本発明の試料溶液中にアリールハイドロカーボン受容体に対するリガンドが存在するか否かを判断する方法は以下の工程を含む：
アリールハイドロカーボン受容体に対するリガンドを含有する可能性がある試料溶液を準備する；
本発明のアリールハイドロカーボン受容体固定化電極を作用電極とし、酸化還元性マーカーの存在下に前記試料溶液の電流電位特性を測定するか又は本発明の電気化学的分析装置を用いて前記試料溶液の電流電位特性を測定する；及び
測定された試料溶液の電流電位特性を、アリールハイドロカーボン受容体に対するリガンドを含有しないコントロール溶液の電流電位特性と比較し、両者の間に有意な差があれば前記試料溶液中にアリールハイドロカーボン受容体に対するリガンドが存在すると判断し、一方両者の間に有意な差がなければ前記試料溶液中にアリールハイドロカーボン受容体に対するリガンドが存在しないと判断する。
この方法によれば、ダイオキシン類や多環芳香族炭化水素化合物などの環境汚染物質を短時間でかつ高感度で定性的に検出することができる。
【００５６】
本発明の試料溶液中にアリールハイドロカーボン受容体に対するリガンドが存在するか否かを判断する方法においては、試料溶液として環境から採取された試料から調製された試料溶液を用いることが好ましい。環境中に含まれるアリールハイドロカーボン受容体に対するリガンドは通常極めて微量であるので、試料溶液の調製は濃縮工程を含むことが好ましい。また、本発明の試料溶液中にアリールハイドロカーボン受容体に対するリガンドが存在するか否かを判断する方法においては、存在の有無を判断されるリガンドはダイオキシン、ベンゾ（ａ）ピレン、又はβ−ナフトフラボンであることができる。
また、用いる酸化還元性マーカーは水溶性でありかつ受容体タンパク質やそのリガンドに悪影響を与えないものであればいかなるものも用いることができるが、例えばＫ４Ｆｅ（ＣＮ）６／Ｋ３Ｆｅ（ＣＮ）６（フェリシン化イオン）、フェロセン又はヘキサアミンルテニウム（ＩＩＩ）錯体であることができる。また、電流電位特性の測定は一般に、サイクリックボルタンメトリー、微分パルスボルタンメトリー、又はアンペロメトリーなどの電気化学的測定方法によって行われることができる。
【００５７】
本発明の試料溶液中に存在するアリールハイドロカーボン受容体に対するリガンドの濃度を決定する方法は以下の工程を含む：
アリールハイドロカーボン受容体に対するリガンドを含有する試料溶液を準備する；
本発明のアリールハイドロカーボン受容体固定化電極を作用電極とし、酸化還元性マーカーの存在下に前記試料溶液の電流電位特性を測定するか又は本発明の電気化学的分析装置を用いて前記試料溶液の電流電位特性を測定する；及び
測定された試料溶液の電流電位特性を、アリールハイドロカーボン受容体に対するリガンドを既知の濃度で含有するコントロール溶液の電流電位特性と比較し、それによって前記試料溶液中に存在するアリールハイドロカーボン受容体に対するリガンドの濃度を決定する。
この方法によれば、ダイオキシン類や多環芳香族炭化水素化合物などの環境汚染物質を短時間でかつ高感度で定量的に測定することができる。
【００５８】
本発明の試料溶液中に存在するアリールハイドロカーボン受容体に対するリガンドの濃度を決定する方法においては、試料溶液として環境から採取された試料から調製された試料溶液を用いることが好ましい。環境中に含まれるアリールハイドロカーボン受容体に対するリガンドは通常極めて微量であるので、試料溶液の調製は濃縮工程を含むことが好ましい。また、本発明の試料溶液中に存在するアリールハイドロカーボン受容体に対するリガンドの濃度を決定する方法においては、存在の有無を判断されるリガンドはダイオキシン、ベンゾ（ａ）ピレン、又はβ−ナフトフラボンであることができる。
また、用いる酸化還元性マーカーは水溶性でありかつ受容体タンパク質やそのリガンドに悪影響を与えないものであればいかなるものも用いることができるが、例えばＫ４Ｆｅ（ＣＮ）６／Ｋ３Ｆｅ（ＣＮ）６（フェリシン化イオン）、フェロセン又はヘキサアミンルテニウム（ＩＩＩ）錯体であることができる。また、電流電位特性の測定は一般に、サイクリックボルタンメトリー、微分パルスボルタンメトリー又はアンペロメトリーなどの電気化学的測定方法によって行われることができる。また、アリールハイドロカーボン受容体に対するリガンドを既知の濃度で含有するコントロール溶液の電流電位特性は予め検量線として表しておくことが好ましい。
【００５９】
本発明の化学物質がアリールハイドロカーボン受容体に対する結合活性を有するか否か判断する方法は以下の工程を含む：
化学物質を含有する可試料溶液を準備する；
本発明のアリールハイドロカーボン受容体固定化電極を作用電極とし、酸化還元性マーカーの存在下に前記試料溶液の電流電位特性を測定するか又は本発明の電気化学的分析装置を用いて前記試料溶液の電流電位特性を測定する；
測定された試料溶液の電流電位特性を、アリールハイドロカーボン受容体に対するいかなるリガンドをも含有しないコントロール溶液の電流電位特性と比較する；及び
比較の結果、両者の間に有意な差があれば前記化学物質がアリールハイドロカーボン受容体に対する結合活性を有すると判断し、一方両者の間に有意な差がなければ前記化学物質がアリールハイドロカーボン受容体に対する結合活性を有さないと判断する。
この方法によれば、短時間かつ高感度で化学物質の健康リスクを評価することができる。
【００６０】
本発明の化学物質がアリールハイドロカーボン受容体に対する結合活性を有するか否かを判断する方法において用いる酸化還元性マーカーは水溶性でありかつ受容体タンパク質やそのリガンドに悪影響を与えないものであればいかなるものも用いることができるが、例えばＫ４Ｆｅ（ＣＮ）６／Ｋ３Ｆｅ（ＣＮ）６（フェリシン化イオン）、フェロセン又はヘキサアミンルテニウム（ＩＩＩ）錯体であることができる。また、電流電位特性の測定は一般に、サイクリックボルタンメトリー、微分パルスボルタンメトリー、又はアンペロメトリーなどの電気化学的測定方法によって行われることができる。
【００６１】
本発明のアリールハイドロカーボン受容体が前記受容体に対するリガンドと結合したときに誘起される前記受容体の構造変化又は機能変化を解析する方法は以下の工程を含む：
アリールハイドロカーボン受容体に対するリガンドを含有する試料溶液を準備する；
本発明のアリールハイドロカーボン受容体固定化電極を作用電極とし、酸化還元性マーカーの存在下に前記試料溶液の電流電位特性を測定するか又は本発明の電気化学的分析装置を用いて前記試料溶液の電流電位特性を測定する；及び
測定された試料溶液の電流電位特性を解析する。
この方法によれば、アリールハイドロカーボン受容体がリガンドと結合したときに誘起される受容体の構造変化又は機能変化を好適に解析することができる。
【００６２】
本発明のアリールハイドロカーボン受容体が前記受容体に対するリガンドと結合したときに誘起される前記受容体の構造変化又は機能変化を解析する方法においては、アリールハイドロカーボンに対するリガンドとしてダイオキシン、ベンゾ（ａ）ピレン、又はβ−ナフトフラボンを用いることができる。
また、用いる酸化還元性マーカーは水溶性でありかつ受容体タンパク質やそのリガンドに悪影響を与えないものであればいかなるものも用いることができるが、例えばＫ４Ｆｅ（ＣＮ）６／Ｋ３Ｆｅ（ＣＮ）６（フェリシン化イオン）、フェロセン又はヘキサアミンルテニウム（ＩＩＩ）錯体であることができる。また、電流電位特性の測定は一般に、サイクリックボルタンメトリー、微分パルスボルタンメトリー、又はアンペロメトリーなどの電気化学的測定方法によって行われることができる。
【００６３】
以下、実施例により本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【００６４】
実施例１：アリールハイドロカーボン受容体固定化電極の作製
（１）二官能性固定化試薬の設計及び合成
この実施例で設計・合成した二官能性固定化試薬は、図３の（４）に示す構造式から成り、ジスフィルド基の両端にリンカー部位を介してニトリロトリ酢酸（ＮＴＡ：配位子）が連結されて構成されている。その合成手順は以下の通りである（図３参照）。Ｎα´，Ｎα−ビス（カルボキシルメチル）−Ｌ−リジン水和物（１）１４０ｍｇをジイイソプロピルエチルアミン（ＤＩＥＡ）１０３５ｍｇを含む３ｍｌＤＭＦに溶解した。１０分間窒素置換後、トリメチルシリルクロリド［（ＣＨ３）３ＳｉＣｌ］８７０ｍｇを少量ずつ添加しながら、室温、窒素雰囲気下で２時間反応させ、カルボキシル基の保護を行った。得られた化合物（２）に半当量の３，３´−ジチオジプロピオンサンジ（Ｎ−スクシンイミジル）〔ＤＴＰＳ、（３）〕を溶解したＤＭＦ１．５ｍｌを加え、室温、窒素雰囲気下で２日間撹拌した。反応溶液に７ｍｌの酒石酸水溶液を加えて十分に振とうした後、これにジクロロメタン１５ｍｌを加えて有機相を抽出した。抽出操作は２度行った。溶媒を減圧濃縮後、ジクロロメタン１．５ｍｌに再溶解した。精製はプレパラティブＴＬＣ（薄層クロマトグラフィー）により行い、２５０ＭＨｚ １Ｈ−ＮＭＲを用いて生成物（４）を確認した。
【００６５】
（２）大腸菌を用いたアリールハイドロカーボン受容体の発現
ヒトアリールハイドロカーボン受容体のドメイン構造は図４のようになっている。本実施例ではリガンド結合部位、Ｈｓｐ９０結合部位を含む部分（１０２−４４６ａａ）をヒスチジンタグと融合した組換えヒトアリールハイドロカーボン受容体を設計した。発現ベクター（ｐＧＥＸ−５Ｘ−１ ＡｈＲ１０２）は図５に示したプロトコールにより構築した。各段階において制限酵素処理およびＤＮＡシーケシングにより、その配列を確認した。
発現ベクターとシャペロン分子ＧｒｏＥＬ発現ベクターを宿主菌ＢＬ２１（ＤＥ３）に形質転換し、３０℃で一晩静置培養した。この溶液０．５ｍｌを、抗生物質を含む２×ＹＴ培地５０ｍｌに接種し、ＯＤ６００＝０．５〜０．６になるまで３７℃で振とう培養した。所定の菌密度に達した後、終濃度０．５ｍＭのＩＰＴＧを添加し、２７℃において組換えアリールハイドロカーボン受容体を発現した。０，１，２，３，４，５ｈにおけるサンプル（１ｍｌ）を分取し、遠心分離により上澄みを取り除いた。分取したサンプルに１５０μｌの２×ＳＤＳ−ＰＡＧＥサンプル緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ６．８、２％ＳＤＳ、１０％ グリセロール、０．１％ ＣＢＢ、２％ ２−メルカプトエタノール）を添加し、８％ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った。また、タンパクの溶解性を確認するために３ｈにおけるサンプルに１５０μｌの溶解緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌｐＨ８、２ｍＭ ＥＤＴＡ、１００μｇ／ｍｌ リゾチーム）を添加し、３０℃で１５ｍｉｎインキュベート後、超音波照射してから遠心分離し、上澄み（可溶性タンパク質）と沈殿（不溶性タンパク質）とに分けた。それぞれに１５０μｌの２×ＳＤＳ−ＰＡＧＥサンプル緩衝液を添加し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した。この結果、目的とする分子量約６８ｋＤａ付近に時間の経過とともに増加するバンドが見られ、目的タンパク質の発現を確認することができた（図６）。また、同じサンプルを抗ヒスチジンタグ抗体ＨＲＰコンジュゲートにより免疫染色したところ、期待した位置に目的タンパク質の発現が確認された（図７）。
【００６６】
（３）ヒトアリールハイドロカーボン受容体の精製
ＩＰＴＧによる発現誘導後の菌を遠心分離により回収し、溶解緩衝液（５０ｍＭリン酸緩衝液、ｐＨ８．０、５ｍＭ ＮａＭＢＳ、０．１ｍＭ ＰＭＳＦ、５ｍＭ ２−メルカプトエタノール）１８ｍｌを加えて懸濁させ、−８０℃で凍結した。これを再び融解し、１０ｍｇ／ｍｌリゾチーム溶液を１．８ｍｌ加えて４℃で１５ｍｉｎインキュベート後、プローブ型超音波照射装置を用いて超音波照射を行った。これに終濃度がそれぞれ１μｇ／ｍｌ、５μｇ／ｍｌとなるようにＲＮａｓｅ、ＤＮａｓｅを加えて４℃でインキュベートし、さらに０．１％ ＮＰ−４０ ３００ｍＭ ＮａＣｌをそれぞれ加え、遠心分離により上澄み（可溶性画分）を分離した。Ｎｉキレートカラムに０．１Ｍ ＮｉＳＯ４水溶液を注入し、１０ｍＭ イミダゾール緩衝液（５０ｍＭ リン酸緩衝液，ｐＨ６．０、３００ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＮａＭＢＳ、０．１ｍＭ ＰＭＳＦ、５ｍＭ ２−メルカプトエタノール、１０％グリセロール）でカラムを平衡化した後に、粗タンパク溶液を注入した。８０ｍＭ イミダゾール緩衝液で洗浄後、５００ｍＭ イミダゾール緩衝液で目的タンパク質の溶出を行い、最後にＥＤＴＡ溶液でカラムを洗浄した。各画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析したところ、５００ｍＭ イミダゾール緩衝液による溶出成分（レーン５）に目的とする組換えヒトダイオキシン受容体の精製が確認できた（図８）。得られたタンパク質はシングルバンドであり、分解生成物は全く観察されなかった。
【００６７】
（４）アリールハイドロカーボン受容体固定化電極の作製
金ディスク電極（電極面積０．０８ｃｍ２）をアルミナ研磨剤で十分に研磨した後、さらに０．１ Ｍ Ｈ２ＳＯ４ ／ １０ｍＭ ＫＣｌ水溶液を用いて電解研磨した。（１）で合成した末端チオール化二官能性ニトリロトリ酢酸（ＮＴＡ）誘導体を水に溶解し、研磨した金電極をこの溶液５０μｌに４℃で３時間浸漬した。その後電極を純水で洗浄した後、窒素ガスで乾燥させた。これを再び０．１ＭＮｉＳＯ４水溶液３０μｌに１０分間浸漬し、Ｎｉ（ＩＩ）−ＮＴＡ錯体を形成させた。この電極を（３）で精製した末端に連続（５〜１０個）するヒスチジン残基（Ｈｉｓ−タグ）を遺伝子レベルで融合したヒトアリールハイドロカーボン受容体水溶液に４℃で１０分間浸漬し、洗浄用緩衝液（１００ｍＭ ＫＣｌ，１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ ７．４））で十分に洗浄し、アリールハイドロカーボン受容体固定化電極を作製した。
【００６８】
固定化の各段階における確認をサイクリックボルタンメトリー（ＣＶ測定）（測定溶液；５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ、ｐＨ７．２、５ｍＭ フェロシアン・フェリシアン化カリウム、１００ｍＭ ＫＣｌ、５ｍＭ ＭｇＣｌ２）により行った（図９）。この結果、未修飾（ｂａｒｅ）の状態と比較して、ＮＴＡ固定化後（図中ＮＴＡ−ｍｏｄｉｆｉｅｄ）のＣＶ測定では、マーカーイオン ［Ｆｅ（ＣＮ）６］４−／３− 由来の酸化・還元ピーク電流値の減少が見られた。これはＮＴＡの固定化により金電極表面が負電荷に被覆されたために、静電的反発がおこり、マーカーイオンが電極表面に近づきにくくなったために減少したものと思われる。また、アリールハイドロカーボン受容体固定化後（図中ｒＡｈＲ−ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ）にもピーク電流値の減少が観察された。これは巨大なタンパク質が電極上に固定化されたことによって、立体障害によりマーカーイオンの電極表面への拡散性が低下したことが原因であると思われる。以上の結果から、アリールハイドロカーボン受容体は期待したとおり金電極上に固定化されたものと判断した。
【００６９】
なお、比較のために図３において（５）として示す一官能性固定化試薬を用いてもアリールハイドロカーボン受容体固定化電極を作製した。この一官能性固定化試薬を用いる受容体固定化電極は、図３に示す固定化試薬の合成工程において化合物（２）と（３）とを等量反応させることを除いては、上述の二官能性固定化試薬を用いる場合と同様の工程を経て作製したものである。
【００７０】
実施例２：リガンド分子のセンシング
次に金電極上に固定化した受容体が正常なリガンド結合能を保持しているかを確認するため、アリールハイドロカーボン受容体に対する代表的なリガンド分子であり、なおかつ発癌性物質として知られるベンゾ（ａ）ピレンを電極に作用させ、その時の電気化学的応答をサイクリックボルタンメトリー（ＣＶ）法により観察した。すなわち、実施例１に従い二官能性固定化試薬を用いて作製したヒトアリールハイドロカーボン受容体固定化電極を作用電極とし、これに１０ｎＭから１０μＭのベンゾ（ａ）ピレン含有試料溶液〔１０ｍＭのトリス緩衝液、ｐＨ７．４、［ＫＣｌ］＝１０ｍＭ、［Ｆｅ（ＣＮ）６］４−／３−＝５ｍＭ（酸化還元性マーカー）、２５℃〕を作用させて、サイクリックボルタンメントリー（ＣＶ）により電流電圧特性を測定した。
【００７１】
測定結果を図１０に示す。なお、参考のためにアリールハイドロカーボン受容体を固定化していない未修飾電極について同様に実施したＣＶ測定結果を図１１に、また、比較のために、一官能性固定化試薬を用いて作製したヒトアリールハイドロカーボン受容体固定化電極について同様に実施したＣＶ測定結果を図１２に示す。
【００７２】
図１０に示したように、受容体固定化電極によって観測された還元電流値は、１０ｎＭから１０μＭのベンゾ（ａ）ピレンに対して濃度依存的に減少した。対照的に、アリールハイドロカーボン受容体を固定化していない未修飾電極では、同濃度のベンゾ（ａ）ピレンを加えてもその電気化学応答には全く変化がなかった（図１１）。すなわち図１０において観察された電流値の変化は、金電極上に固定化されたアリールハイドロカーボン受容体による特異的な現象であり、リガンドと受容体との結合を反映した結果である。一方、図１２に示されるように、一官能性固定化試薬から作製されたヒトアリールハイドロカーボン受容体固定化電極の場合、１００ｎＭのベンゾ（ａ）ピレンを添加した際においてもその電極応答は極めてわずかであり、二官能性固定化試薬を用いた場合に応答感度が著しく向上していることが分かる（図１２の右側のピーク電位（還元波）の下がり方を図１０の右側のピーク電位の下がり方と比較されたい。なお、図１２の左側のピーク電位の下がり方は図１０の左側のピーク電位の下がり方と比べてそれほど変化していないが、これはおそらく受容体タンパク質の変化に由来するものではなく、試料溶液中に添加していたジチオスレイトール（タンパク質変性防止剤）に由来するものである）。
【００７３】
次に本発明に従う電極の汎用性を調べるために、アリールハイドロカーボン受容体に特異的なリガンド分子であるβ−ナフトフラボンを作用させたところ、ベンゾ（ａ）ピレンの場合と同様にピーク電流値の減少が観察された（図１３）。また、比較のために、一官能性固定化試薬を用いて作製したヒトアリールハイドロカーボン受容体固定化電極にβ−ナフトフラボンを作用させたところ、１００ｎＭのβ−ナフトフラボンを添加した際においてもその電極応答は極めてわずかであり（図１４）、二官能性固定化試薬を用いた場合の応答感度の向上が改めて確認された。そこで本発明に従う電極のこれらのリガンドに対する応答特性を詳しく調べるために、種々の濃度のリガンド分子を添加したときのピーク電流の減少量（Δｉｐ）との関係をプロットしたところ、本発明に従うアリールハイドロカーボン受容体固定化電極はベンゾ（ａ）ピレン、β−ナフトフラボンに対して濃度依存的な優れた応答特性を示すことが明らかとなった（図１５）。２つのリガンドに対する感度の差は、アリールハイドロカーボン受容体のリガンド親和性の差を示しており、この傾向（β−ナフトフラボン＞ベンゾ（ａ）ピレン）は培養細胞を用いた場合と非常によい相関を示した。つまり本発明のセンシングシステムは、無細胞評価系でありながら生細胞におけるリガンド−受容体間の特異的な結合を非常に良く再現することが可能である。また０．１ｎＭ（１０−１０Ｍ）という検出感度は、放射ラベル化試薬を用いる測定法や酵素反応を利用した検出法に匹敵し、本発明のセンサが高い性能を有することが示された。特筆すべき点は、この検出システムの測定時間がわずか３分以内である点である。先に述べたように、従来法は５時間から１間程度を要しており、本発明のセンサを用いることで極めて短い時間での分析が可能となる。
【００７４】
考察
本発明のセンシングシステムではマーカーイオンの電極表面上に形成されたタンパク質層に対する“透過しやすさ”を検出機構としていることから、リガンド添加時におけるピーク電流値の減少は電極上に固定化されたアリールハイドロカーボン受容体がそのリガンドと結合することによってその物性を変化させ、結果的にタンパク質層全体の性質がマーカーイオン透過性に影響を与えたためであるとするのが妥当であろう。アリールハイドロカーボン受容体はリガンドとの結合によって、その立体構造を変化させコアクチベーターＡＲＮＴとヘテロ二量体を形成することが知られている。本発明者らは以前に、ヒトエストロゲン受容体を固定化した電極において、そのリガンド誘導的なコンホメーション変化に基づくタンパク質表面の荷電状態の変化（負電荷量の増加）がマーカーイオン（［Ｆｅ（ＣＮ）６］４−／３−）の透過性に著しい影響を及ぼすことを明らかにしている。おそらく本発明のアリールハイドロカーボン受容体固定化電極においても同様な理由によってマーカーイオン透過性が減少したものと推察される（図１）。
これらの結果より、実施例１で作製したヒトアリールハイドロカーボン受容体を認識素子とするバイオセンサが、ベンゾ（ａ）ピレン及びβ−ナフトフラボンを代表とするリガンド分子に対して良好な電気化学的応答を示すことが明らかとなった。
【００７５】
【発明の効果】
本発明では電極上にアリールハイドロカーボン受容体を固定化し、リガンドとの結合や複合体の形成など、機能発現に際して誘起されるコンホメーションならびにタンパク質表面物性の変化を電気化学的に捉えることのできる新しいダイオキシン類検出法を開発した。
【００７６】
内分泌攪乱物質、なかでもダイオキシン類は生物の生存に関わる新しい環境問題として近年急速に関心が高まっており、環境中に放出されたおよそ１０万種に及ぶとされる化学物質の科学的なリスクアセスメントが急務となっている。内分泌撹乱物質は生体機構に直接作用することで、生殖、神経、そして免疫系に重篤な損傷を与える可能性が危惧されているが、この作用機構の鍵となるのが、化学物質とその受容体との結合である。従来、生細胞や動物、あるいは放射標識レセプターを使って評価されてきたが、今後１０万種といわれる化学物質を系統的にリスク評価するためには、より高速、高精度な評価システムの開発が不可欠である。特にダイオキシン類等は体内の代謝系によって様々な物質へ変換されてしまうことから、それら代謝物の分析も加味すると測定対象は膨大な種類にのぼる。
【００７７】
受容体タンパク質を認識素子とするこの新しいバイオアフィニティーセンサは、アリールハイドロカーボン受容体の代表的なリガンド分子であるベンゾ（ａ）ピレン及びβ−ナフトフラボンに対して良好な電気化学的応答を示した。その検出感度は現在最も感度の良い方法であるＲＩ標識リガンドを用いたアッセイ法や、抗原抗体反応を利用した手法に匹敵した（検出下限１０−１０Ｍ）。特に注目すべき点は、本検出システムの測定速度である。現在、内分泌撹乱物質のプレスクリーニング試験法として様々なｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイが提案されているが、最も早い方法で５時間、その他培養細胞を用いる系では分析に一週間程度を要している。これらのアッセイ系に対して、本リスク評価システムでは測定物質の添加からシグナル検出まで３分という極めて短時間でアリールハイドロカーボン受容体に対するリガンド活性の評価が可能である。
【００７８】
本システムはマイクロチップ化・小型化が容易なことから、環境モニタリング装置としても有効であり、環境中における内分泌攪乱物質の動態を明らかにすることによって、化学物質の環境コンバートメントの一端を知る手がかりとなるであろう。
【図面の簡単な説明】
【図１】アリールハイドロカーボン受容体固定化電極による電気化学的応答の概念図である。
【図２】本発明のアリールハイドロカーボン受容体固定化電極の構造を模式的に示す図である。
【図３】本発明において用いられる二官能性固定化試薬の好ましい例の合成工程を示す模式図である。
【図４】ヒトアリールハイドロカーボン受容体のドメイン構造を示す模式図である。
【図５】発現ベクターの構築プロトコールを示す模式図である。
【図６】ＳＤＳ−ＰＡＧＥによるヒトアリールハイドロカーボン受容体の発現解析を示す。
【図７】ウェスタンブロットによるヒトアリールハイドロカーボン受容体の確認結果を示す。
【図８】アフィニティークロマトグラフィーによるヒトアリールハイドロカーボン受容体の精製結果を示す。
【図９】本発明に従う、二官能性固定化試薬を用いたアリールハイドロカーボン受容体固定化電極の製造の各段階において測定したサイクリックボルタンメトリー応答を示す。
【図１０】本発明に従い、二官能性固定化試薬から作製されたアリールハイドロカーボン受容体固定化電極を用いて測定したベンゾ（ａ）ピレンに対するサイクリックボルタンメトリー応答を示す。
【図１１】参考のために、アリールハイドロカーボン受容体を固定化していない未修飾電極を用いて測定したベンゾ（ａ）ピレンに対するサイクリックボルタンメトリー応答を示す。
【図１２】比較のために、一官能性固定化試薬から作製されたアリールハイドロカーボン受容体固定化電極を用いて測定したベンゾ（ａ）ピレンに対するサイクリックボルタンメトリー応答を示す。
【図１３】本発明に従い、二官能性固定化試薬から作製されたアリールハイドロカーボン受容体固定化電極を用いて測定したβ−ナフトフラボンに対するサイクリックボルタンメトリー応答を示す。
【図１４】比較のために、一官能性固定化試薬から作製されたアリールハイドロカーボン受容体固定化電極を用いて測定したβ−ナフトフラボンに対するサイクリックボルタンメトリー応答を示す。
【図１５】本発明に従うアリールハイドロカーボン受容体固定化電極を用いて行ったベンゾ（ａ）ピレン及びβ−ナフトフラボンに対するサイクリックボルタンメトリー応答を示す。[0001]
TECHNICAL FIELD OF THE INVENTION
The present invention relates to an electrochemical sensor (receptor-immobilized electrode) for detecting a binding between a receptor and a ligand as an electrochemical signal. In particular, the present invention relates to an electrochemical sensor for detecting environmental pollutants such as dioxins and polycyclic aromatic hydrocarbon compounds. The present invention also relates to a method for manufacturing such an electrochemical sensor, an electrochemical analyzer including such an electrochemical sensor, and an application of such an electrochemical sensor.
[0002]
[Prior art]
Some chemicals bind to receptors instead of hormones and disrupt the endocrine system. For example, it is known that DDT, bisphenol A, and the like bind to estrogen (female hormone) receptors and cause estrogen (female hormone) action regardless of the necessity of the living body.
[0003]
Hormones are substances having various physiological actions such as the development, differentiation, growth, and maintenance of homeostasis in the body. In order for hormones to exert their effects, they need to bind to receptors. That is, the hormone synthesized in the cells of the endocrine organ reaches the target organ via the blood, where it binds to the receptor to form a complex. Next, this complex is transported to the cell nucleus to induce the expression of a target gene, whereby a target protein having a physiological effect is produced to cause various effects.
[0004]
Aryl hydrocarbon receptor (commonly called dioxin receptor, AhR) is an important transcription factor involved in human metabolic system. The aryl hydrocarbon receptor is a kind of so-called orphan receptor, and its proper ligand (that is, the hormone to be bound) has not been elucidated yet. However, it is known that environmental pollutants such as dioxins and polycyclic aromatic hydrocarbon compounds bind to aryl hydrocarbon receptors and cause serious injury to the human body. That is, when environmental pollutants such as dioxins and polycyclic aromatic hydrocarbon compounds bind to aryl hydrocarbon receptors, they induce cytochrome P450 enzymes in liver microsomes, alter metabolism of various substances, It causes abnormalities such as action, anti-female hormone action, hypothyroid hormone function, immune abnormality, abnormal allergic reaction, and cleft palate. Therefore, in order to confirm the safety of the environment, there is a need to develop a technology for detecting or measuring the above-mentioned environmental pollutants in the environment.
[0005]
In addition to the above-mentioned dioxins and polycyclic aromatic hydrocarbon compounds, there are a large number of currently distributed chemical substances of 100,000 which bind to aryl hydrocarbon receptors and exhibit similar toxicity. Is believed to be. Therefore, in order to confirm the safety of these chemical substances, there is a need to develop a technology for evaluating the health risks of these chemical substances.
[0006]
In addition, it is important to know what kind of structural or functional change is induced when a receptor involved in a physiological action binds to a ligand in developing a drug or a method for treating a disease. The details of the structural or functional changes of the receptor induced when the carbon receptor binds to the ligand have not been elucidated yet.
[0007]
At present, two main methods of measuring environmental pollutants are known: an instrument analysis method using a large instrument, and a bioassay method using cultured cells or antibodies. The former is a method of fragmenting a compound by laser irradiation and analyzing its mass. Although this method is excellent as a method for measuring a substance having a known toxicity, it cannot be used for evaluating the toxicity of a chemical substance (evaluating the binding activity to an aryl hydrocarbon receptor). Another drawback is that the equipment used is large and very expensive. On the other hand, the latter bioassay method is capable of evaluating the toxicity of a substance to be measured, but requires a long time for the measurement (from a minimum of 5 hours to about a week), and requires complicated experimental operations over several steps. Also, in the assay method using cultured cells, there is a serious problem that the quantitativeness of the measurement is impaired due to the permeability of the measurement substance to the cell membrane.
[0008]
In view of the drawbacks of these methods, the present inventors have immobilized a nickel complex or a cobalt complex on a conductive substrate such as a gold electrode via a monofunctional immobilizing reagent, and further attached a histidine tag bonded to the complex. A receptor-immobilized electrode (electrochemical sensor) constituted by immobilizing a receptor via the same and a method for detecting an endocrine disrupting substance using such an electrochemical sensor have been proposed (Non-Patent Document 1). Since this electrochemical sensor detects the binding between the receptor and the ligand as an electrochemical signal, it has the advantage that it can detect endocrine disrupting substances in a short time. However, this electrochemical sensor had insufficient response sensitivity and was not practically usable.
[0009]
[Non-patent document 1]
Proceedings of the 79th Chemical Society of Japan (2001), lecture numbers 3F404 and 3F407, etc.
[0010]
[Problems to be solved by the invention]
A first object of the present invention is to provide an aryl hydrocarbon receptor-immobilized electrode capable of detecting a bond between an aryl hydrocarbon receptor and a ligand as an electrochemical signal in a short time and with high sensitivity. It is.
[0011]
A second object of the present invention is to provide a method for producing such an arylhydrocarbon receptor-immobilized electrode.
[0012]
A third object of the present invention is to provide an electrochemical analyzer including such an electrode on which an aryl hydrocarbon receptor is immobilized.
[0013]
A fourth object of the present invention is to provide a method for qualitatively detecting environmental pollutants in a short time and with high sensitivity.
[0014]
A fifth object of the present invention is to provide a method for quantitatively measuring environmental pollutants in a short time and with high sensitivity.
[0015]
A sixth object of the present invention is to provide a method for evaluating a health risk of a chemical substance in a short time and with high sensitivity.
[0016]
A seventh object of the present invention is to provide a method for analyzing the structural change or functional change of a receptor induced when an aryl hydrocarbon receptor binds to a ligand.
[0017]
[Means for Solving the Problems]
The present inventors have conducted intensive studies on a method for immobilizing an aryl hydrocarbon receptor on an electrode in order to solve the above-mentioned problems. As a result, a monofunctional immobilizing reagent in a component of the previously proposed receptor-immobilized electrode was used. The substitution of the bifunctional immobilization reagent significantly increases the sensitivity of the arylhydrocarbon receptor-immobilized electrode. Using such an arylhydrocarbon receptor-immobilized electrode, qualitative detection or quantitative measurement of environmental pollutants Or that the health risk of a chemical substance can be evaluated in a short time and with high sensitivity, and when such an aryl hydrocarbon receptor-immobilized electrode is used, it is induced when the aryl hydrocarbon receptor binds to a ligand It has been found that changes in the structure or function of the receptor can be analyzed, and the present invention has finally been reached. .
[0018]
According to a first aspect of the present invention, there is provided an aryl hydrocarbon receptor-immobilized electrode comprising the following elements (1) to (4):
(1) a conductive substrate;
(2) A bifunctional immobilizing reagent having an adsorption site on a conductive substrate and two complex ligands for a nickel complex or a cobalt complex, the bifunctional immobilization reagent being immobilized on the conductive substrate via the adsorption site. Functional immobilization reagent;
(3) a nickel complex or a cobalt complex respectively bonded to the two complex ligands of the bifunctional immobilizing reagent; and
(4) An aryl hydrocarbon receptor having a histidine tag, wherein the aryl hydrocarbon receptor is bound to a nickel complex or a cobalt complex via the histidine tag.
[0019]
In a preferred embodiment of the aryl hydrocarbon receptor-immobilized electrode of the present invention, the conductive substrate is a gold electrode, the adsorption site is a sulfur-containing group such as a disulfide group, and the complex ligand is nitrile triacetic acid or imino diamine. Acetic acid.
[0020]
In a preferred embodiment of the aryl hydrocarbon receptor-immobilized electrode of the present invention, a linker site is provided between the complex ligand of the bifunctional immobilization reagent and the adsorption site, and the bifunctional immobilization reagent is provided. Has a complex ligand at each end of its molecular structure, and has an adsorption site at the center of its molecular structure.
[0021]
In a preferred embodiment of the aryl hydrocarbon receptor-immobilized electrode of the present invention, the aryl hydrocarbon receptor is a human-derived recombinant aryl hydrocarbon receptor, and the recombinant aryl hydrocarbon receptor has a ligand binding site and It contains at least the Hsp90 binding site.
[0022]
According to a second aspect of the present invention, there is provided a method for producing an arylhydrocarbon receptor-immobilized electrode, comprising the following steps (a) to (d):
(B) Prepare the following elements (1) to (4):
(1) a conductive substrate;
(2) a bifunctional immobilizing reagent having an adsorption site for a conductive substrate and two complex ligands for a nickel complex or a cobalt complex;
(3) a nickel complex or a cobalt complex; and
(4) an aryl hydrocarbon receptor having a histidine tag;
(B) immobilizing a bifunctional immobilizing reagent on a conductive substrate via an adsorption site;
(C) binding a nickel complex or a cobalt complex to each of the two complex ligands of the bifunctional immobilizing reagent; and
(D) An aryl hydrocarbon receptor is bound to a nickel complex or a cobalt complex via a histidine tag.
[0023]
In a preferred embodiment of the method for producing an aryl hydrocarbon receptor-immobilized electrode of the present invention, each of the above steps (ii) to (ii) is performed in a solution.
[0024]
According to a third aspect of the present invention, there is provided an electrochemical analyzer comprising such an aryl hydrocarbon receptor-immobilized electrode as a working electrode, and a redox marker.
[0025]
In a preferred embodiment of the electrochemical analyzer of the present invention, the redox marker is K4Fe (CN)6/ K3Fe (CN)6, Ferrocene, or hexaamine ruthenium (III) complex, the electrochemical analyzer further includes a reference electrode and a counter electrode, and the electrochemical analysis determines the current-potential characteristics by cyclic voltammetry, differential pulse voltammetry, or amperometry. Including measuring.
[0026]
According to a fourth aspect of the present invention, there is provided a method for determining whether or not a ligand for an aryl hydrocarbon receptor is present in a sample solution, comprising the following steps:
Providing a sample solution that may contain a ligand for an aryl hydrocarbon receptor;
The arylhydrocarbon receptor-immobilized electrode of the present invention is used as a working electrode, and the current-potential characteristics of the sample solution are measured in the presence of a redox marker, or the sample solution is measured using the electrochemical analyzer of the present invention. Measuring the current-potential characteristics of
The measured current-potential characteristics of the sample solution were compared with the current-potential characteristics of a control solution containing no ligand for the arylhydrocarbon receptor. If there was a significant difference between the two, the arylhydrocarbon receptor was included in the sample solution. It is determined that there is a ligand for the body, while if there is no significant difference between the two, it is determined that there is no ligand for the aryl hydrocarbon receptor in the sample solution.
[0027]
In a preferred embodiment of the method of the present invention for determining whether a ligand for an aryl hydrocarbon receptor is present in a sample solution, the sample solution is prepared from a sample collected from the environment, and the ligand is Dioxin, benzo (a) pyrene or β-naphthoflavon, and the redox marker is K4Fe (CN)6/ K3Fe (CN)6, Ferrocene, or hexaamine ruthenium (III) complex, and the current-potential characteristics are measured by cyclic voltammetry, differential pulse voltammetry, or amperometry.
[0028]
According to a fifth aspect of the present invention, there is provided a method for determining the concentration of a ligand for an aryl hydrocarbon receptor present in a sample solution, comprising the steps of:
Providing a sample solution containing a ligand for an aryl hydrocarbon receptor;
The arylhydrocarbon receptor-immobilized electrode of the present invention is used as a working electrode, and the current-potential characteristics of the sample solution are measured in the presence of a redox marker, or the sample solution is measured using the electrochemical analyzer of the present invention. Measuring the current-potential characteristics of
The measured current-potential characteristics of the sample solution are compared with the current-potential characteristics of a control solution containing a ligand for the aryl hydrocarbon receptor at a known concentration, whereby the potential of the aryl hydrocarbon receptor present in the sample solution is determined. Determine the concentration of the ligand.
[0029]
In a preferred embodiment of the method of the present invention for determining the concentration of a ligand for an aryl hydrocarbon receptor present in a sample solution, the sample solution is prepared from a sample collected from the environment, wherein the ligand is dioxin, Benzo (a) pyrene or β-naphthoflavone, and the redox marker is K4Fe (CN)6/ K3Fe (CN)6, Ferrocene, or hexaamine ruthenium (III) complex, the current-potential characteristics being measured by cyclic voltammetry, differential pulse voltammetry, or amperometry, and a control solution containing a known concentration of a ligand for an aryl hydrocarbon receptor. Are shown as a calibration curve.
[0030]
According to a sixth aspect of the present invention, there is provided a method for determining whether a chemical substance has binding activity to an aryl hydrocarbon receptor, comprising the following steps:
Providing a sampleable solution containing the chemical;
The arylhydrocarbon receptor-immobilized electrode of the present invention is used as a working electrode, and the current-potential characteristics of the sample solution are measured in the presence of a redox marker, or the sample solution is measured using the electrochemical analyzer of the present invention. Measuring the current-potential characteristics of
Comparing the measured current-potential characteristics of the sample solution to those of a control solution that does not contain any ligand for the aryl hydrocarbon receptor; and
As a result of the comparison, if there is a significant difference between the two, it is determined that the chemical substance has binding activity to the aryl hydrocarbon receptor, while if there is no significant difference between the two, the chemical substance is the aryl hydrocarbon It is judged that it has no binding activity to the receptor.
[0031]
According to a preferred embodiment of the method for determining whether a chemical substance of the present invention has binding activity for an aryl hydrocarbon receptor, the redox marker is K4Fe (CN)6/ K3Fe (CN)6, Ferrocene, or hexaamine ruthenium (III) complex, and the current-potential characteristics are measured by cyclic voltammetry, differential pulse voltammetry, or amperometry.
[0032]
According to a seventh aspect of the present invention, a structural change or functional change of the receptor induced when an aryl hydrocarbon receptor binds to a ligand for the receptor, comprising the following steps: A way to analyze is provided:
Providing a sample solution containing a ligand for an aryl hydrocarbon receptor;
The arylhydrocarbon receptor-immobilized electrode of the present invention is used as a working electrode, and the current-potential characteristic of the sample solution is measured in the presence of an oxidation-reduction marker, or the sample solution is measured using the electrochemical analyzer of the present invention. Measuring the current-potential characteristics of
The current-potential characteristics of the measured sample solution are analyzed.
[0033]
According to a preferred embodiment of the method of the present invention for analyzing a structural change or a functional change of an aryl hydrocarbon receptor induced by binding of the receptor to the ligand, the ligand is dioxin, benzo (a). ) Pyrene or β-naphthoflavone and the redox marker is K4Fe (CN)6/ K3Fe (CN)6, Ferrocene, or hexaamine ruthenium (III) complex, and the current-potential characteristics are measured by cyclic voltammetry, differential pulse voltammetry, or amperometry.
[0034]
BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION
The arylhydrocarbon receptor-immobilized electrode of the present invention comprises: (1) a conductive substrate; (2) a bifunctional immobilizing reagent having an adsorption site for a conductive substrate and two complex ligands for a nickel complex or a cobalt complex. (3) a nickel complex or a cobalt complex; and (4) an aryl hydrocarbon receptor having a histidine tag. In the aryl hydrocarbon receptor-immobilized electrode of the present invention, the bifunctional immobilizing reagent is immobilized on the conductive substrate via the adsorption site, and the nickel complex or the cobalt complex is the two complexes of the bifunctional immobilizing reagent. The aryl hydrocarbon receptor is respectively bound to a ligand, and is configured to be bound to a nickel complex or a cobalt complex via a histidine tag.
[0035]
The conductive substrate used in the aryl hydrocarbon receptor-immobilized electrode of the present invention has a role as a working electrode for an electrochemical reaction and a role as a support for immobilizing the aryl hydrocarbon receptor. The conductive substrate can be made of any material as long as it has the two roles described above, but is preferably made of gold from the viewpoint of stability.
[0036]
The bifunctional immobilizing reagent used in the aryl hydrocarbon receptor-immobilized electrode of the present invention has a role of immobilizing the aryl hydrocarbon receptor on a conductive substrate. The bifunctional immobilizing reagent has an adsorption site for a conductive substrate and two complex ligands for a nickel complex or a cobalt complex, and is immobilized on the conductive substrate via the adsorption site. The adsorption site may be appropriately selected according to the material of the conductive substrate. For example, when a gold electrode is used as the conductive substrate, a sulfur-containing group such as a disulfide group may be used as the adsorption site. The complex ligand for the nickel complex or the cobalt complex is not particularly limited, and for example, nitrilotriacetic acid (NTA) or iminodiacetic acid (IDA) commonly used in this field can be used.
[0037]
The bifunctional immobilization reagent used in the aryl hydrocarbon receptor-immobilized electrode of the present invention preferably has a linker moiety provided between the complex ligand and the adsorption moiety. The positions of the two functional groups (complex ligands) and the adsorption sites in the bifunctional immobilization reagent are not particularly limited, but the complex ligands are located at both ends of the molecular structure of the bifunctional immobilization reagent, It is preferable that the adsorption site is located at the center of the molecular structure in order to improve the sensitivity of the electrode.
[0038]
The nickel complex or the cobalt complex used in the aryl hydrocarbon receptor-immobilized electrode of the present invention has a role of binding the bifunctional immobilizing reagent with the aryl hydrocarbon receptor. The aryl hydrocarbon receptor used in the electrode for immobilizing the aryl hydrocarbon receptor of the present invention is provided with a histidine tag. A histidine tag is a short amino acid sequence containing a small number (usually 5 to 10) of histidine residues, and has a property of strongly binding to a nickel complex or a cobalt complex due to the presence of an imidazole group in the histidine residue. Therefore, by using a combination of a histidine tag and a nickel complex or a cobalt complex, an aryl hydrocarbon receptor can be bound to a bifunctional immobilizing reagent, and as a result, can be suitably immobilized on a conductive electrode. .
[0039]
The aryl hydrocarbon receptor used in the aryl hydrocarbon receptor-immobilized electrode of the present invention has a role of determining the specificity of the detection target of the sensor of the present invention by binding only to a specific chemical substance. That is, since the aryl hydrocarbon receptor specifically binds to environmental pollutants such as dioxins and polycyclic aromatic hydrocarbon compounds, the sensor of the present invention in which the aryl hydrocarbon receptor is immobilized on the electrode has a dioxin type. And environmental pollutants such as polycyclic aromatic hydrocarbon compounds.
[0040]
The structure of the aryl hydrocarbon receptor varies from species to species, and the susceptibility of organisms to environmental pollutants varies from species to species. Therefore, when the sensor of the present invention is used to confirm environmental safety for humans or to evaluate the health risk of chemical substances, the aryl hydrocarbon receptor is preferably derived from humans. Although a natural aryl hydrocarbon receptor can be used, from the viewpoint of the yield and purity of the obtained aryl hydrocarbon receptor, the aryl hydrocarbon receptor may be a recombinant aryl hydrocarbon receptor. preferable. The recombinant aryl hydrocarbon receptor does not need to contain the entire amino acid sequence of the natural aryl hydrocarbon receptor, and can exhibit its function as long as it contains at least a ligand binding site and an Hsp90 binding site. Such a recombinant aryl hydrocarbon receptor can be easily prepared by a gene recombination technique well known in the art.
[0041]
The aryl hydrocarbon receptor-immobilized electrode of the present invention detects the binding between the aryl hydrocarbon receptor and the ligand immobilized on the electrode as an electrochemical signal, thereby enabling quick measurement. It is assumed that.
[0042]
The aryl hydrocarbon receptor usually exists stably in vivo by forming a complex with the chaperone protein in the cytoplasm. When bound to a chemical substance that acts as a ligand, the aryl hydrocarbon receptor significantly changes its steric structure, dissociates the chaperone protein, and is transported to the cell nucleus. Then, a transcription complex is formed therewith with the coactivator ARNT, thereby inducing the expression of the target gene.
[0043]
In the present invention, attention has been paid to this ligand-induced change in the structure of the receptor, and this has been successfully detected electrochemically with high sensitivity. In general, the binding between a receptor and a ligand has no electrochemical activity, and therefore, some measure is required to detect it electrochemically. In the present invention, an electrochemically active molecule (eg, a redox marker such as a ferricinated ion, ferrocene, or hexaamine ruthenium (III) complex) added to the measurement solution is formed on the electrode surface. By using the "permeability" of the protein layer as an index, changes in the properties of the protein are indirectly captured (see FIG. 1). That is, a change in the permeability of a redox marker caused by a change in the structure of the receptor protein caused by the binding of the ligand to the receptor protein is electrochemically measured. In general, the electrochemical reaction is very fast, and therefore, when the aryl hydrocarbon receptor-immobilized electrode of the present invention is used, a change in the receptor protein layer can be detected in only a few minutes.
[0044]
In the aryl hydrocarbon receptor-immobilized electrode of the present invention, the receptor protein is immobilized on the electrode without impairing its function. Immobilization of a biomolecule on a solid surface in a controlled state is very important in developing a sensor with high selectivity. As a protein immobilization method, a carrier binding method in which immobilization is performed by covalent bonding, ionic bonding, biochemical affinity, or the like, a crosslinking method in which crosslinking is performed with a reagent such as glutaraldehyde, and the like are generally used. However, these methods have problems such as the inability to completely maintain the function of the protein due to the use of amino acid residues on the protein during immobilization, and the inability to control the orientation of the protein relative to the solid surface. In particular, when an immobilized protein is used as a recognition element on an electrode, these problems are fatal in terms of a detection mechanism. Therefore, in the aryl hydrocarbon receptor-immobilized electrode of the present invention, the receptor protein is electroded using the histidine tag (His-Tag) method, which allows the protein to be reversibly oriented on the solid surface while maintaining the function. On top, thereby increasing the selectivity of the sensor.
[0045]
The greatest feature of the arylhydrocarbon receptor-immobilized electrode of the present invention is that the sensitivity is significantly higher than that of a conventionally known electrochemical sensor. This is achieved according to the invention by using a bifunctional immobilizing reagent instead of a conventional monofunctional immobilizing reagent as a functional immobilizing reagent for immobilizing an aryl hydrocarbon receptor on an electrode. You.
[0046]
A conventionally used monofunctional immobilizing reagent has a single complex ligand at only one end of its molecular structure as shown in, for example, FIG. Therefore, when a monofunctional immobilization reagent is used, it is considered that only a single receptor protein is immobilized on a conductive substrate (electrode) as shown in FIG. 2A.
[0047]
On the other hand, the immobilization reagent used in the aryl hydrocarbon receptor-immobilized electrode of the present invention is a bifunctional immobilization reagent, and two functional groups, that is, a complex ligand are shown in FIG. So that it has at both ends of its molecular structure. Therefore, when the bifunctional immobilization reagent is used, it is considered that the two receptor proteins are immobilized on the conductive substrate (electrode) close to each other as shown in FIG. 2B. .
[0048]
The reason why the sensitivity of the sensor is remarkably increased by immobilizing the aryl hydrocarbon receptor on the electrode using the bifunctional immobilizing reagent as described above has not yet been sufficiently clarified. By using this, the two receptor proteins are immobilized on the electrode in close proximity to each other, so that the immobilization density is increased and the conformational change induced by the binding between the receptor protein and the ligand can be more accurately performed. It is thought that it can be detected.
[0049]
Next, a method for producing the arylhydrocarbon receptor-immobilized electrode of the present invention will be described.
The method for producing the arylhydrocarbon receptor-immobilized electrode of the present invention includes the following steps (a) to (d):
(B) Prepare the following elements (1) to (4):
(1) a conductive substrate;
(2) a bifunctional immobilizing reagent having an adsorption site on a conductive substrate and two complex ligands for a nickel complex or a cobalt complex;
(3) a nickel complex or a cobalt complex; and
(4) an aryl hydrocarbon receptor having a histidine tag;
(B) immobilizing a bifunctional immobilizing reagent on a conductive substrate via an adsorption site;
(C) binding a nickel complex or a cobalt complex to each of the two complex ligands of the bifunctional immobilizing reagent; and
(D) An aryl hydrocarbon receptor is bound to a nickel complex or a cobalt complex via a histidine tag.
[0050]
Since the four elements (1) to (4) prepared in the step (a) are described in detail in the description of the aryl hydrocarbon receptor-immobilized electrode of the present invention, the description is omitted here. .
[0051]
In the method of producing an aryl hydrocarbon receptor-immobilized electrode of the present invention, it is preferable that the steps (b) to (d) be performed in a solution from the viewpoint of easiness of the immobilization reaction or the binding reaction. Specifically, a solution of a bifunctional immobilization reagent, a solution of a nickel complex or a cobalt complex, and a solution of an aryl hydrocarbon receptor may be prepared, and the conductive substrate may be immersed in that order. The solvent of each solution may be appropriately determined depending on the solubility and stability of the solute.For example, water or chloroform for a bifunctional immobilizing reagent, water for a nickel complex or a cobalt complex, an aryl hydrocarbon receptor Can use water as a solvent.
[0052]
Next, the electrochemical analyzer of the present invention will be described. The electrochemical analyzer of the present invention includes the aryl hydrocarbon receptor-immobilized electrode of the present invention as a working electrode, and a redox marker. Any redox marker can be used as long as it is water-soluble and does not adversely affect the receptor protein or its ligand.4Fe (CN)6/ K3Fe (CN)6(Ferricinated ion), ferrocene or hexaamine ruthenium (III) complex. In the following description, K4Fe (CN)6/ K3Fe (CN)6[Fe (CN)6"4- / 3-It may be written. The electrochemical analyzer of the present invention may further include a reference electrode such as Ag / AgCl and a counter electrode such as a platinum wire, in addition to the above-described aryl hydrocarbon receptor-immobilized electrode and the redox marker. In addition, the electrochemical analysis performed by the electrochemical analyzer of the present invention generally involves measuring current-potential characteristics by an electrochemical measurement method such as cyclic voltammetry (CV), differential pulse voltammetry, or amperometry. Can be included.
[0053]
One preferred specific embodiment of the electrochemical analyzer of the present invention includes an electrochemical analyzer comprising: a container filled with a redox marker solution, and a redox marker solution. , One end of which is impregnated with the arylhydrocarbon receptor-immobilized electrode of the present invention as a working electrode, a reference electrode and a counter electrode. Such an electrochemical analyzer can be easily miniaturized and made into a kit, and can be easily used in the field. In addition, all the components of the electrochemical analyzer except for the aryl hydrocarbon receptor-immobilized electrode of the present invention can be used as general-purpose products, which is advantageous in cost.
[0054]
As preferred applications of the aryl hydrocarbon receptor-immobilized electrode of the present invention or the electrochemical analyzer of the present invention, the present invention provides the following four methods:
(1) a method for determining whether or not a ligand for an aryl hydrocarbon receptor is present in a sample solution;
(2) a method for determining the concentration of a ligand for an aryl hydrocarbon receptor present in a sample solution;
(3) a method for determining whether a chemical substance has binding activity to an aryl hydrocarbon receptor; and
(4) A method for analyzing a structural change or a functional change of the aryl hydrocarbon receptor induced when the receptor binds to a ligand for the receptor.
Hereinafter, these methods will be described in order.
[0055]
The method for determining whether a ligand for an aryl hydrocarbon receptor is present in a sample solution of the present invention includes the following steps:
Providing a sample solution that may contain a ligand for an aryl hydrocarbon receptor;
The arylhydrocarbon receptor-immobilized electrode of the present invention is used as a working electrode, and the current-potential characteristics of the sample solution are measured in the presence of a redox marker, or the sample solution is measured using the electrochemical analyzer of the present invention. Measuring the current-potential characteristics of
The measured current-potential characteristics of the sample solution were compared with the current-potential characteristics of a control solution containing no ligand for the arylhydrocarbon receptor. If there was a significant difference between the two, the arylhydrocarbon receptor was included in the sample solution. It is determined that there is a ligand for the body, while if there is no significant difference between the two, it is determined that there is no ligand for the aryl hydrocarbon receptor in the sample solution.
According to this method, environmental pollutants such as dioxins and polycyclic aromatic hydrocarbon compounds can be qualitatively detected in a short time with high sensitivity.
[0056]
In the method of the present invention for determining whether a ligand for an aryl hydrocarbon receptor is present in a sample solution, it is preferable to use a sample solution prepared from a sample collected from the environment as the sample solution. Since the ligand for the aryl hydrocarbon receptor contained in the environment is usually extremely small, the preparation of the sample solution preferably includes a concentration step. In the method of the present invention for determining whether or not a ligand for an aryl hydrocarbon receptor is present in a sample solution, the ligand for which the presence or absence is determined is dioxin, benzo (a) pyrene, or β-naphtho. Could be flavone.
Any redox marker can be used as long as it is water-soluble and does not adversely affect the receptor protein or its ligand.4Fe (CN)6/ K3Fe (CN)6(Ferricinated ion), ferrocene or hexaamine ruthenium (III) complex. Further, the measurement of the current-potential characteristic can be generally performed by an electrochemical measurement method such as cyclic voltammetry, differential pulse voltammetry, or amperometry.
[0057]
The method for determining the concentration of a ligand for an aryl hydrocarbon receptor present in a sample solution according to the present invention includes the following steps:
Providing a sample solution containing a ligand for an aryl hydrocarbon receptor;
The arylhydrocarbon receptor-immobilized electrode of the present invention is used as a working electrode, and the current-potential characteristics of the sample solution are measured in the presence of a redox marker, or the sample solution is measured using the electrochemical analyzer of the present invention. Measuring the current-potential characteristics of
The measured current-potential characteristics of the sample solution are compared with the current-potential characteristics of a control solution containing a ligand for the aryl hydrocarbon receptor at a known concentration, whereby the potential of the aryl hydrocarbon receptor present in the sample solution is determined. Determine the concentration of the ligand.
According to this method, environmental pollutants such as dioxins and polycyclic aromatic hydrocarbon compounds can be quantitatively measured in a short time with high sensitivity.
[0058]
In the method of the present invention for determining the concentration of a ligand for an aryl hydrocarbon receptor present in a sample solution, it is preferable to use a sample solution prepared from a sample collected from the environment as the sample solution. Since the ligand for the aryl hydrocarbon receptor contained in the environment is usually extremely small, the preparation of the sample solution preferably includes a concentration step. In the method of the present invention for determining the concentration of a ligand for an aryl hydrocarbon receptor present in a sample solution, the ligand for which the presence or absence is determined is dioxin, benzo (a) pyrene, or β-naphthoflavone. There can be.
Any redox marker can be used as long as it is water-soluble and does not adversely affect the receptor protein or its ligand.4Fe (CN)6/ K3Fe (CN)6(Ferricinated ion), ferrocene or hexaamine ruthenium (III) complex. Further, the measurement of the current-potential characteristic can be generally performed by an electrochemical measurement method such as cyclic voltammetry, differential pulse voltammetry, or amperometry. The current-potential characteristics of the control solution containing the ligand for the aryl hydrocarbon receptor at a known concentration are preferably represented in advance as a calibration curve.
[0059]
A method for determining whether a chemical of the present invention has binding activity for an aryl hydrocarbon receptor comprises the following steps:
Providing a sampleable solution containing the chemical;
The arylhydrocarbon receptor-immobilized electrode of the present invention is used as a working electrode, and the current-potential characteristics of the sample solution are measured in the presence of a redox marker, or the sample solution is measured using the electrochemical analyzer of the present invention. Measuring the current-potential characteristics of
Comparing the measured current-potential characteristics of the sample solution to those of a control solution that does not contain any ligand for the aryl hydrocarbon receptor; and
As a result of the comparison, if there is a significant difference between the two, it is determined that the chemical substance has binding activity to the aryl hydrocarbon receptor, while if there is no significant difference between the two, the chemical substance is the aryl hydrocarbon It is judged that it has no binding activity to the receptor.
According to this method, the health risk of a chemical substance can be evaluated in a short time and with high sensitivity.
[0060]
The redox marker used in the method for determining whether the chemical substance of the present invention has binding activity to an aryl hydrocarbon receptor is water-soluble and does not adversely affect the receptor protein or its ligand. Any one can be used, for example, K4Fe (CN)6/ K3Fe (CN)6(Ferricinated ion), ferrocene or hexaamine ruthenium (III) complex. Further, the measurement of the current-potential characteristic can be generally performed by an electrochemical measurement method such as cyclic voltammetry, differential pulse voltammetry, or amperometry.
[0061]
The method for analyzing a structural change or a functional change of the receptor induced when an aryl hydrocarbon receptor of the present invention binds to a ligand for the receptor includes the following steps:
Providing a sample solution containing a ligand for an aryl hydrocarbon receptor;
The arylhydrocarbon receptor-immobilized electrode of the present invention is used as a working electrode, and the current-potential characteristics of the sample solution are measured in the presence of a redox marker, or the sample solution is measured using the electrochemical analyzer of the present invention. Measuring the current-potential characteristics of
The current-potential characteristics of the measured sample solution are analyzed.
According to this method, structural changes or functional changes of the receptor induced when the aryl hydrocarbon receptor binds to the ligand can be suitably analyzed.
[0062]
In the method of analyzing a structural change or a functional change of an aryl hydrocarbon receptor induced by binding of the aryl hydrocarbon receptor to a ligand of the receptor according to the present invention, dioxin, benzo (a) may be used as the aryl hydrocarbon ligand. Pyrene or β-naphthoflavone can be used.
Any redox marker can be used as long as it is water-soluble and does not adversely affect the receptor protein or its ligand.4Fe (CN)6/ K3Fe (CN)6(Ferricinated ion), ferrocene or hexaamine ruthenium (III) complex. Further, the measurement of the current-potential characteristic can be generally performed by an electrochemical measurement method such as cyclic voltammetry, differential pulse voltammetry, or amperometry.
[0063]
Hereinafter, the present invention will be described specifically with reference to Examples, but the present invention is not limited to these Examples.
[0064]
Example 1 Preparation of Electrode Immobilized on Aryl Hydrocarbon Receptor
(1) Design and synthesis of bifunctional immobilization reagent
The bifunctional immobilizing reagent designed and synthesized in this example has the structural formula shown in FIG. 3 (4), and nitrilotriacetic acid (NTA: ligand) is linked to both ends of the disulfide group via linker sites. It is configured. The synthesis procedure is as follows (see FIG. 3). 140 mg of Nα ′, Nα-bis (carboxylmethyl) -L-lysine hydrate (1) was dissolved in 3 ml of DMF containing 1035 mg of diisopropylethylamine (DIEA). After purging with nitrogen for 10 minutes, trimethylsilyl chloride [(CH3)3While adding 870 mg of [SiCl] little by little, the mixture was reacted at room temperature under a nitrogen atmosphere for 2 hours to protect the carboxyl group. To the obtained compound (2), 1.5 ml of DMF in which half equivalent of 3,3′-dithiodipropionsandi (N-succinimidyl) [DTPS, (3)] is dissolved is added, and the mixture is stirred at room temperature under a nitrogen atmosphere for 2 days. did. After adding 7 ml of an aqueous tartaric acid solution to the reaction solution and sufficiently shaking, 15 ml of dichloromethane was added thereto to extract an organic phase. The extraction operation was performed twice. After the solvent was concentrated under reduced pressure, it was redissolved in 1.5 ml of dichloromethane. Purification is performed by preparative TLC (thin layer chromatography), and 250 MHz1The product (4) was confirmed using 1 H-NMR.
[0065]
(2) Expression of aryl hydrocarbon receptor using Escherichia coli
FIG. 4 shows the domain structure of the human aryl hydrocarbon receptor. In this example, a recombinant human aryl hydrocarbon receptor was designed in which a portion (102-446aa) containing a ligand binding site and an Hsp90 binding site was fused with a histidine tag. An expression vector (pGEX-5X-1 AhR102) was constructed according to the protocol shown in FIG. At each stage, the sequence was confirmed by restriction enzyme treatment and DNA sequencing.
The expression vector and the chaperone molecule GroEL expression vector were transformed into the host strain BL21 (DE3), and cultured at 30 ° C. overnight. 0.5 ml of this solution was inoculated into 50 ml of 2 × YT medium containing antibiotics and OD600= 0.5-0.6 with shaking at 37 ° C. After reaching a predetermined bacterial density, IPTG was added at a final concentration of 0.5 mM, and the recombinant aryl hydrocarbon receptor was expressed at 27 ° C. Samples (1 ml) at 0, 1, 2, 3, 4, and 5 h were collected and the supernatant was removed by centrifugation. 150 μl of 2 × SDS-PAGE sample buffer (50 mM Tris-HCl pH 6.8, 2% SDS, 10% glycerol, 0.1% CBB, 2% 2-mercaptoethanol) was added to the collected sample, and 8 % SDS-PAGE was performed. To confirm the solubility of the protein, 150 μl of a lysis buffer (50 mM Tris-HCl pH 8, 2 mM EDTA, 100 μg / ml lysozyme) was added to the sample at 3 h, and the mixture was incubated at 30 ° C. for 15 minutes and irradiated with ultrasonic waves. And separated into a supernatant (soluble protein) and a precipitate (insoluble protein). To each, 150 μl of 2 × SDS-PAGE sample buffer was added and analyzed by SDS-PAGE. As a result, a band increasing with time was observed around the target molecular weight of about 68 kDa, and the expression of the target protein could be confirmed (FIG. 6). When the same sample was immunostained with an anti-histidine tag antibody HRP conjugate, the expression of the target protein was confirmed at the expected position (FIG. 7).
[0066]
(3) Purification of human aryl hydrocarbon receptor
The bacteria after expression induction by IPTG were collected by centrifugation, and suspended by adding 18 ml of a lysis buffer (50 mM phosphate buffer, pH 8.0, 5 mM NaMBS, 0.1 mM PMSF, 5 mM 2-mercaptoethanol). Frozen at -80 ° C. This was melted again, 1.8 ml of a 10 mg / ml lysozyme solution was added, and the mixture was incubated at 4 ° C. for 15 minutes, and then subjected to ultrasonic irradiation using a probe-type ultrasonic irradiation apparatus. To this, RNase and DNase were added so that the final concentrations would be 1 μg / ml and 5 μg / ml, respectively, and the mixture was incubated at 4 ° C. Further, 0.1% NP-40 and 300 mM NaCl were added, and the supernatant was obtained by centrifugation. Min). 0.1M NiSO on Ni chelate column4After injecting the aqueous solution and equilibrating the column with 10 mM imidazole buffer (50 mM phosphate buffer, pH 6.0, 300 mM NaCl, 5 mM NaMBS, 0.1 mM PMSF, 5 mM 2-mercaptoethanol, 10% glycerol), the crude was equilibrated. The protein solution was injected. After washing with an 80 mM imidazole buffer, the target protein was eluted with a 500 mM imidazole buffer, and finally, the column was washed with an EDTA solution. When each fraction was analyzed by SDS-PAGE, it was confirmed that the target recombinant human dioxin receptor was purified from the eluted component (lane 5) with a 500 mM imidazole buffer (FIG. 8). The resulting protein was a single band and no degradation products were observed.
[0067]
(4) Preparation of aryl hydrocarbon receptor-immobilized electrode
Gold disk electrode (electrode area 0.08cm2) Is sufficiently polished with an alumina abrasive, and then further 0.1 MH2SO4  Electropolishing was performed using a / 10 mM KCl aqueous solution. The terminally thiolated bifunctional nitrilotriacetic acid (NTA) derivative synthesized in (1) was dissolved in water, and the polished gold electrode was immersed in 50 μl of this solution at 4 ° C. for 3 hours. Thereafter, the electrode was washed with pure water and dried with nitrogen gas. This is again 0.1M NiSO4It was immersed in 30 μl of an aqueous solution for 10 minutes to form a Ni (II) -NTA complex. This electrode was immersed in a human aryl hydrocarbon receptor aqueous solution in which a histidine residue (His-tag) continuous (5 to 10) at the end purified at (3) was fused at the gene level at 4 ° C. for 10 minutes, and washed. After sufficiently washing with a buffer solution for use (100 mM KCl, 10 mM Tris-HCl (pH 7.4)), an aryl hydrocarbon receptor-immobilized electrode was prepared.
[0068]
Confirmation at each stage of immobilization was performed by cyclic voltammetry (CV measurement) (measurement solution: 50 mM HEPES-KOH, pH 7.2, 5 mM potassium ferrocyanide / ferricyanide, 100 mM KCl, 5 mM MgCl).2) (FIG. 9). As a result, in the CV measurement after NTA immobilization (NTA-modified in the figure), as compared with the unmodified (bare) state, the marker ion [Fe (CN)6]4- / 3-  There was a decrease in the peak oxidation / reduction current value. This is considered to be because the surface of the gold electrode was covered with the negative charge by the immobilization of NTA, so that the electrostatic repulsion occurred, and the marker ions became difficult to approach the electrode surface, so that the decrease was considered. Also, a decrease in the peak current value was observed after immobilization of the aryl hydrocarbon receptor (rAhR-immobilized in the figure). This is considered to be due to the fact that a large protein was immobilized on the electrode, and the steric hindrance reduced the diffusibility of marker ions to the electrode surface. From the above results, it was determined that the aryl hydrocarbon receptor was immobilized on the gold electrode as expected.
[0069]
For comparison, an aryl hydrocarbon receptor-immobilized electrode was also prepared using the monofunctional immobilizing reagent shown as (5) in FIG. The receptor-immobilized electrode using this monofunctional immobilization reagent is the same as the above-described electrode except that the compounds (2) and (3) are reacted in an equal amount in the synthesis step of the immobilization reagent shown in FIG. It was prepared through the same steps as in the case of using a functional immobilization reagent.
[0070]
Example 2: Ligand molecule sensing
Next, in order to confirm whether the receptor immobilized on the gold electrode has a normal ligand binding ability, benzo (a typical ligand molecule for the aryl hydrocarbon receptor and also known as a carcinogen) a) Pyrene was allowed to act on the electrode, and the electrochemical response at that time was observed by cyclic voltammetry (CV). That is, a human aryl hydrocarbon receptor-immobilized electrode prepared using a bifunctional immobilizing reagent according to Example 1 was used as a working electrode, and a 10 nM to 10 μM benzo (a) pyrene-containing sample solution [10 mM Tris buffer was used. Solution, pH 7.4, [KCl] = 10 mM, [Fe (CN)6]4- / 3-= 5 mM (redox marker), 25 ° C], and the current-voltage characteristics were measured by cyclic voltammentary (CV).
[0071]
FIG. 10 shows the measurement results. In addition, the CV measurement result similarly performed about the unmodified electrode in which the aryl hydrocarbon receptor was not immobilized was shown in FIG. 11 for reference, and was prepared using a monofunctional immobilization reagent for comparison. FIG. 12 shows the results of CV measurement similarly performed on the human aryl hydrocarbon receptor-immobilized electrode.
[0072]
As shown in FIG. 10, the reduction current value observed by the receptor-immobilized electrode decreased in a concentration-dependent manner for benzo (a) pyrene from 10 nM to 10 μM. In contrast, for the unmodified electrode on which the aryl hydrocarbon receptor was not immobilized, the same concentration of benzo (a) pyrene did not change its electrochemical response at all (FIG. 11). That is, the change in the current value observed in FIG. 10 is a specific phenomenon caused by the aryl hydrocarbon receptor immobilized on the gold electrode, and is a result reflecting the binding between the ligand and the receptor. On the other hand, as shown in FIG. 12, in the case of a human aryl hydrocarbon receptor-immobilized electrode prepared from a monofunctional immobilizing reagent, the electrode response was extremely high even when 100 nM benzo (a) pyrene was added. It can be seen that the response sensitivity was remarkably improved when the bifunctional immobilized reagent was used (the decrease in the peak potential (reduction wave) on the right side of FIG. It should be noted that the decrease in the peak potential on the left side of Fig. 12 has not changed much compared to the decrease in the peak potential on the left side of Fig. 10, but this is probably due to a change in the receptor protein. But it is derived from dithiothreitol (a protein denaturation inhibitor) added to the sample solution).
[0073]
Next, in order to investigate the versatility of the electrode according to the present invention, when β-naphthoflavone, which is a ligand molecule specific to the aryl hydrocarbon receptor, was acted on, the peak current value was the same as in the case of benzo (a) pyrene. Was observed (FIG. 13). Further, for comparison, when β-naphthoflavone was allowed to act on a human aryl hydrocarbon receptor-immobilized electrode prepared using a monofunctional immobilizing reagent, it was found that 100 nM β-naphthoflavone was added. The electrode response was extremely slight (FIG. 14), and the improvement of the response sensitivity when the bifunctional immobilized reagent was used was confirmed again. Therefore, in order to investigate the response characteristics of the electrode according to the present invention to these ligands in detail, the relationship between the peak current decrease (Δip) when various concentrations of ligand molecules were added was plotted. It was revealed that the carbon receptor-immobilized electrode exhibited excellent concentration-dependent response characteristics to benzo (a) pyrene and β-naphthoflavone (FIG. 15). The difference in sensitivity for the two ligands indicates the difference in ligand affinity of the aryl hydrocarbon receptor, and this tendency (β-naphthoflavon> benzo (a) pyrene) is very good as compared to the case using cultured cells. The correlation was shown. That is, the sensing system of the present invention can very well reproduce the specific binding between the ligand and the receptor in living cells, even though it is a cell-free evaluation system. 0.1 nM (10-10The detection sensitivity of M) was comparable to a measurement method using a radiolabeling reagent or a detection method using an enzymatic reaction, indicating that the sensor of the present invention has high performance. Notably, the measurement time of this detection system is less than 3 minutes. As described above, the conventional method requires about 5 hours to 1 hour, and the use of the sensor of the present invention enables analysis in an extremely short time.
[0074]
Consideration
In the sensing system of the present invention, since the detection mechanism is based on the “easiness of permeation” of the marker ion to the protein layer formed on the electrode surface, the decrease in the peak current value upon addition of the ligand was immobilized on the electrode. It may be reasonable to say that the aryl hydrocarbon receptor changes its properties by binding to its ligand, and consequently the properties of the entire protein layer affected marker ion permeability. It is known that the aryl hydrocarbon receptor changes its steric structure by binding to a ligand to form a heterodimer with the coactivator ARNT. The present inventors have previously shown that in an electrode on which a human estrogen receptor is immobilized, a change in the charge state of the protein surface (increase in the amount of negative charge) based on a ligand-induced conformational change is caused by a marker ion ([Fe (CN)6]4- / 3-) Significantly affects the permeability. Possibly, the aryl hydrocarbon receptor-immobilized electrode of the present invention has decreased marker ion permeability for the same reason (FIG. 1).
From these results, the biosensor using the human aryl hydrocarbon receptor as a recognition element prepared in Example 1 showed good electrochemical performance on ligand molecules represented by benzo (a) pyrene and β-naphthoflavone. It was found to show a response.
[0075]
【The invention's effect】
In the present invention, an aryl hydrocarbon receptor is immobilized on an electrode, and conformation and changes in protein surface properties induced upon expression of functions, such as binding to a ligand and formation of a complex, can be electrochemically captured. A new method for detecting dioxins has been developed.
[0076]
Endocrine disrupters, especially dioxins, are rapidly gaining attention as a new environmental problem related to the survival of living organisms, and a scientific risk assessment of about 100,000 chemical substances released into the environment has been made. Is urgently needed. Endocrine disruptors are feared to act directly on biological mechanisms, potentially causing serious damage to the reproductive, nervous, and immune systems, but the key to this mechanism is chemicals and their Binding to the receptor. Conventionally, evaluations have been performed using living cells, animals, or radiolabeled receptors. In order to systematically evaluate the risk of 100,000 chemicals in the future, a faster and more accurate evaluation system must be developed. It is essential. In particular, since dioxins and the like are converted into various substances by the metabolic system in the body, the number of measurement targets is enormous in consideration of the analysis of those metabolites.
[0077]
This new bioaffinity sensor using a receptor protein as a recognition element showed good electrochemical response to benzo (a) pyrene and β-naphthoflavone, typical ligand molecules of aryl hydrocarbon receptor. . The detection sensitivity is comparable to an assay using an RI-labeled ligand, which is currently the most sensitive method, and a method using an antigen-antibody reaction (detection lower limit: 10).-10M). Of particular note is the measurement speed of the present detection system. At present, various in vitro assays have been proposed as prescreening test methods for endocrine disrupting substances, but analysis requires about 5 hours by the earliest method and about one week by other systems using cultured cells. With respect to these assay systems, the present risk evaluation system can evaluate the ligand activity for the aryl hydrocarbon receptor in an extremely short time of 3 minutes from the addition of the measurement substance to the detection of the signal.
[0078]
Since this system can be easily made into a microchip and miniaturized, it is also effective as an environmental monitoring device, and by clarifying the dynamics of endocrine disruptors in the environment, it is possible to know a part of the environmental conversion of chemical substances. It will be.
[Brief description of the drawings]
FIG. 1 is a conceptual diagram of an electrochemical response by an aryl hydrocarbon receptor-immobilized electrode.
FIG. 2 is a diagram schematically showing the structure of an arylhydrocarbon receptor-immobilized electrode of the present invention.
FIG. 3 is a schematic view showing a synthesis step of a preferred example of a bifunctional immobilization reagent used in the present invention.
FIG. 4 is a schematic diagram showing a domain structure of a human aryl hydrocarbon receptor.
FIG. 5 is a schematic diagram showing a protocol for constructing an expression vector.
FIG. 6 shows the expression analysis of human aryl hydrocarbon receptor by SDS-PAGE.
FIG. 7 shows the results of confirming the human aryl hydrocarbon receptor by Western blot.
FIG. 8 shows the results of purification of the human aryl hydrocarbon receptor by affinity chromatography.
FIG. 9 shows the cyclic voltammetric response measured at each stage of the manufacture of an aryl hydrocarbon receptor-immobilized electrode using a bifunctional immobilization reagent according to the present invention.
FIG. 10 shows cyclic voltammetric response to benzo (a) pyrene measured with an aryl hydrocarbon receptor immobilized electrode made from a bifunctional immobilized reagent according to the present invention.
FIG. 11 shows, for reference, a cyclic voltammetric response to benzo (a) pyrene measured using an unmodified electrode on which the aryl hydrocarbon receptor is not immobilized.
FIG. 12 shows, for comparison, the cyclic voltammetric response to benzo (a) pyrene measured using an aryl hydrocarbon receptor immobilized electrode made from a monofunctional immobilized reagent.
FIG. 13 shows cyclic voltammetric response to β-naphthoflavones measured using an aryl hydrocarbon receptor immobilized electrode made from a bifunctional immobilized reagent according to the present invention.
FIG. 14 shows, for comparison, the cyclic voltammetric response to β-naphthoflavones measured using an aryl hydrocarbon receptor immobilized electrode made from a monofunctional immobilized reagent.
FIG. 15 shows cyclic voltammetric responses to benzo (a) pyrene and β-naphthoflavones performed using an aryl hydrocarbon receptor-immobilized electrode according to the present invention.

Claims (41)

以下の（１）〜（４）の要素を含むことを特徴とするアリールハイドロカーボン受容体固定化電極：
（１） 導電性基板；
（２） 導電性基板に対する吸着部位とニッケル錯体又はコバルト錯体に対する２つの錯体配位子とを有する二官能性固定化試薬であって、吸着部位を介して導電性基板に固定化されている二官能性固定化試薬；
（３） 二官能性固定化試薬の２つの錯体配位子にそれぞれ結合されているニッケル錯体又はコバルト錯体；及び
（４） ヒスチジンタグを有するアリールハイドロカーボン受容体であって、ヒスチジンタグを介してニッケル錯体又はコバルト錯体に結合されているアリールハイドロカーボン受容体。An aryl hydrocarbon receptor-immobilized electrode comprising the following elements (1) to (4):
(1) a conductive substrate;
(2) A bifunctional immobilizing reagent having an adsorption site on a conductive substrate and two complex ligands for a nickel complex or a cobalt complex, the bifunctional immobilization reagent being immobilized on the conductive substrate via the adsorption site. Functional immobilization reagent;
(3) a nickel complex or a cobalt complex respectively bonded to two complex ligands of the bifunctional immobilizing reagent; and (4) an aryl hydrocarbon acceptor having a histidine tag, wherein the aryl hydrocarbon acceptor has a histidine tag. Aryl hydrocarbon acceptors bound to nickel or cobalt complexes. 導電性基板が金電極であり、吸着部位がイオウ含有基であることを特徴とする請求項１記載のアリールハイドロカーボン受容体固定化電極。2. The aryl hydrocarbon receptor-immobilized electrode according to claim 1, wherein the conductive substrate is a gold electrode, and the adsorption site is a sulfur-containing group. 吸着部位がジスルフィド基であることを特徴とする請求項２記載のアリールハイドロカーボン受容体固定化電極。3. The electrode according to claim 2, wherein the adsorption site is a disulfide group. 錯体配位子がニトリルトリ酢酸又はイミノ二酢酸であることを特徴とする請求項１〜３のいずれか一項記載のアリールハイドロカーボン受容体固定化電極。The aryl hydrocarbon receptor-immobilized electrode according to any one of claims 1 to 3, wherein the complex ligand is nitrile triacetic acid or iminodiacetic acid. 二官能性固定化試薬の錯体配位子と吸着部位との間にリンカー部位が設けられていることを特徴とする請求項１〜４のいずれか一項記載のアリールハイドロカーボン固定化電極。The arylhydrocarbon-immobilized electrode according to any one of claims 1 to 4, wherein a linker site is provided between the complex ligand of the bifunctional immobilization reagent and the adsorption site. 二官能性固定化試薬がその分子構造の両端にそれぞれ錯体配位子を有し、その分子構造の中央に吸着部位を有することを特徴とする請求項１〜５のいずれか一項記載のアリールハイドロカーボン受容体固定化電極。The aryl according to any one of claims 1 to 5, wherein the bifunctional immobilizing reagent has a complex ligand at each end of its molecular structure, and has an adsorption site at the center of the molecular structure. Hydrocarbon receptor immobilized electrode. アリールハイドロカーボン受容体がヒト由来であることを特徴とする請求項１〜６のいずれか一項記載のアリールハイドロカーボン受容体固定化電極。The aryl hydrocarbon receptor-immobilized electrode according to any one of claims 1 to 6, wherein the aryl hydrocarbon receptor is derived from a human. アリールハイドロカーボン受容体が組換えアリールハイドロカーボン受容体であることを特徴とする請求項７記載のアリールハイドロカーボン受容体固定化電極。The aryl hydrocarbon receptor-immobilized electrode according to claim 7, wherein the aryl hydrocarbon receptor is a recombinant aryl hydrocarbon receptor. 組換えアリールハイドロカーボン受容体がリガンド結合部位及びＨｓｐ９０結合部位を少なくとも含むことを特徴とする請求項８記載のアリールハイドロカーボン受容体固定化電極。The aryl hydrocarbon receptor-immobilized electrode according to claim 8, wherein the recombinant aryl hydrocarbon receptor comprises at least a ligand binding site and an Hsp90 binding site. 以下の（イ）〜（ニ）の工程を含むことを特徴とするアリールハイドロカーボン受容体固定化電極の製造方法：
（イ） 以下の（１）〜（４）の要素を準備する：
（１） 導電性基板；
（２） 導電性基板に対する吸着部位とニッケル錯体又はコバルト錯体に対する２つの錯体配位子とを有する二官能性固定化試薬；
（３） ニッケル錯体又はコバルト錯体；及び
（４） ヒスチジンタグを有するアリールハイドロカーボン受容体；
（ロ） 導電性基板に二官能性固定化試薬を吸着部位を介して固定化させる；
（ハ） 二官能性固定化試薬の２の錯体配位子にそれぞれニッケル錯体又はコバルト錯体を結合させる；及び
（ニ） ニッケル錯体又はコバルト錯体にアリールハイドロカーボン受容体をヒスチジンタグを介して結合させる。A process for producing an aryl hydrocarbon receptor-immobilized electrode, comprising the following steps (a) to (d):
(B) Prepare the following elements (1) to (4):
(1) a conductive substrate;
(2) a bifunctional immobilizing reagent having an adsorption site for a conductive substrate and two complex ligands for a nickel complex or a cobalt complex;
(3) a nickel complex or a cobalt complex; and (4) an aryl hydrocarbon receptor having a histidine tag;
(B) immobilizing a bifunctional immobilizing reagent on a conductive substrate via an adsorption site;
(C) binding a nickel complex or a cobalt complex to each of the two complex ligands of the bifunctional immobilizing reagent; and (d) binding an aryl hydrocarbon receptor to the nickel complex or the cobalt complex via a histidine tag. . 導電性基板が金電極であり、吸着部位がイオウ含有基であることを特徴とする請求項１０記載のアリールハイドロカーボン受容体固定化電極の製造方法。The method for producing an arylhydrocarbon receptor-immobilized electrode according to claim 10, wherein the conductive substrate is a gold electrode, and the adsorption site is a sulfur-containing group. 吸着部位がジスルフィド基であることを特徴とする請求項１１記載のアリールハイドロカーボン受容体固定化電極の製造方法。The method for producing an arylhydrocarbon receptor-immobilized electrode according to claim 11, wherein the adsorption site is a disulfide group. 錯体配位子がニトリルトリ酢酸又はイミノ二酢酸であることを特徴とする請求項１０〜１２のいずれか一項記載のアリールハイドロカーボン受容体固定化電極の製造方法。The method for producing an arylhydrocarbon receptor-immobilized electrode according to any one of claims 10 to 12, wherein the complex ligand is nitrile triacetic acid or iminodiacetic acid. 二官能性固定化試薬の錯体配位子と吸着部位との間にリンカー部位が設けられていることを特徴とする請求項１０〜１３のいずれか一項記載のアリールハイドロカーボン固定化電極の製造方法。The production of an aryl hydrocarbon-immobilized electrode according to any one of claims 10 to 13, wherein a linker site is provided between the complex ligand of the bifunctional immobilization reagent and the adsorption site. Method. 二官能性固定化試薬がその分子構造の両端にそれぞれ錯体配位子を有し、その分子構造の中央に吸着部位を有することを特徴とする請求項１０〜１４のいずれか一項記載のアリールハイドロカーボン受容体固定化電極の製造方法。The aryl according to any one of claims 10 to 14, wherein the bifunctional immobilizing reagent has a complex ligand at each end of its molecular structure, and has an adsorption site at the center of its molecular structure. A method for producing a hydrocarbon receptor-immobilized electrode. アリールハイドロカーボン受容体がヒト由来であることを特徴とする請求項１０〜１５のいずれか一項記載のアリールハイドロカーボン受容体固定化電極の製造方法。The method for producing an aryl hydrocarbon receptor-immobilized electrode according to any one of claims 10 to 15, wherein the aryl hydrocarbon receptor is derived from a human. アリールハイドロカーボン受容体が組換えアリールハイドロカーボン受容体であることを特徴とする請求項１６記載のアリールハイドロカーボン受容体固定化電極の製造方法。17. The method according to claim 16, wherein the aryl hydrocarbon receptor is a recombinant aryl hydrocarbon receptor. 組換えアリールハイドロカーボン受容体がリガンド結合部位及びＨｓｐ９０結合部位を少なくとも含むことを特徴とする請求項１７記載のアリールハイドロカーボン受容体固定化電極の製造方法。The method for producing an aryl hydrocarbon receptor-immobilized electrode according to claim 17, wherein the recombinant aryl hydrocarbon receptor includes at least a ligand binding site and an Hsp90 binding site. （ロ）〜（ニ）の各工程が溶液中で行われることを特徴とする請求項１０〜１８のいずれか一項記載のアリールハイドロカーボン受容体固定化電極の製造方法。The method for producing an aryl hydrocarbon receptor-immobilized electrode according to any one of claims 10 to 18, wherein the steps (b) to (d) are performed in a solution. 作用電極としての請求項１〜９のいずれか一項記載のアリールハイドロカーボン受容体固定化電極、及び酸化還元性マーカーを含むことを特徴とする電気化学的分析装置。An electrochemical analyzer comprising an aryl hydrocarbon receptor-immobilized electrode according to any one of claims 1 to 9 as a working electrode, and a redox marker. 酸化還元性マーカーがＫ４Ｆｅ（ＣＮ）６／Ｋ３Ｆｅ（ＣＮ）６、フェロセン、又はヘキサアミンルテニウム（ＩＩＩ）錯体であることを特徴とする請求項２０記載の電気化学的分析装置。Redox marker K 4 Fe (CN) 6 / K 3 Fe (CN) 6, ferrocene, or electrochemical analyzer according to claim 20, wherein the hexa-amine ruthenium (III) complexes. 参照極及び対極をさらに含むことを特徴とする請求項２０又は２１記載の電気化学的分析装置。22. The electrochemical analyzer according to claim 20, further comprising a reference electrode and a counter electrode. 電気化学的分析がサイクリックボルタンメトリー、微分パルスボルタンメトリー、又はアンペロメトリーによって電流電位特性を測定することを含むことを特徴とする請求項２０〜２２のいずれか一項記載の電気化学的分析装置。The electrochemical analyzer according to any one of claims 20 to 22, wherein the electrochemical analysis includes measuring current-potential characteristics by cyclic voltammetry, differential pulse voltammetry, or amperometry. 以下の工程を含むことを特徴とする、試料溶液中にアリールハイドロカーボン受容体に対するリガンドが存在するか否かを判断する方法：
アリールハイドロカーボン受容体に対するリガンドを含有する可能性がある試料溶液を準備する；
請求項１〜９のいずれか一項記載のアリールハイドロカーボン受容体固定化電極を作用電極とし、酸化還元性マーカーの存在下に前記試料溶液の電流電位特性を測定するか又は請求項２０〜２３のいずれか一項記載の電気化学的分析装置を用いて前記試料溶液の電流電位特性を測定する；及び
測定された試料溶液の電流電位特性を、アリールハイドロカーボン受容体に対するリガンドを含有しないコントロール溶液の電流電位特性と比較し、両者の間に有意な差があれば前記試料溶液中にアリールハイドロカーボン受容体に対するリガンドが存在すると判断し、一方両者の間に有意な差がなければ前記試料溶液中にアリールハイドロカーボン受容体に対するリガンドが存在しないと判断する。A method for determining whether or not a ligand for an aryl hydrocarbon receptor is present in a sample solution, comprising the following steps:
Providing a sample solution that may contain a ligand for an aryl hydrocarbon receptor;
The current / potential characteristic of the sample solution is measured in the presence of an oxidation-reduction marker, using the arylhydrocarbon receptor-immobilized electrode according to any one of claims 1 to 9 as a working electrode, or a method of measuring the current-potential characteristic of the sample solution in the presence of an oxidation-reduction marker, or Measuring the current-potential characteristics of the sample solution using the electrochemical analyzer according to any one of the above; and measuring the measured current-potential characteristics of the sample solution as a control solution containing no ligand for the aryl hydrocarbon receptor. Compared with the current-potential characteristics of the above, if there is a significant difference between the two, it is determined that the ligand for the aryl hydrocarbon receptor is present in the sample solution, while if there is no significant difference between the two, the sample solution It is determined that there is no ligand for the aryl hydrocarbon receptor. 試料溶液が環境から採取された試料から調製されたものであることを特徴とする請求項２４記載の方法。25. The method of claim 24, wherein the sample solution is prepared from a sample taken from the environment. リガンドがダイオキシン、ベンゾ（ａ）ピレン、又はβ−ナフトフラボンであることを特徴とする請求項２４または２５記載の方法。The method according to claim 24 or 25, wherein the ligand is dioxin, benzo (a) pyrene, or β-naphthoflavone. 酸化還元性マーカーがＫ４Ｆｅ（ＣＮ）６／Ｋ３Ｆｅ（ＣＮ）６、フェロセン、又はヘキサアミンルテニウム（ＩＩＩ）錯体であることを特徴とする請求項２４〜２６のいずれか一項記載の方法。Redox marker K 4 Fe (CN) 6 / K 3 Fe (CN) 6, ferrocene, or hexamine ruthenium (III) of any one of claims 24 to 26, characterized in that the complex Method. 電流電位特性がサイクリックボルタンメトリー、微分パルスボルタンメトリー、又はアンペロメトリーによって測定されることを特徴とする請求項２４〜２７のいずれか一項記載の方法。The method according to any one of claims 24 to 27, wherein the current-potential characteristic is measured by cyclic voltammetry, differential pulse voltammetry, or amperometry. 以下の工程を含むことを特徴とする、試料溶液中に存在するアリールハイドロカーボン受容体に対するリガンドの濃度を決定する方法：
アリールハイドロカーボン受容体に対するリガンドを含有する試料溶液を準備する；
請求項１〜９のいずれか一項記載のアリールハイドロカーボン受容体固定化電極を作用電極とし、酸化還元性マーカーの存在下に前記試料溶液の電流電位特性を測定するか又は請求項２０〜２３のいずれか一項記載の電気化学的分析装置を用いて前記試料溶液の電流電位特性を測定する；及び
測定された試料溶液の電流電位特性を、アリールハイドロカーボン受容体に対するリガンドを既知の濃度で含有するコントロール溶液の電流電位特性と比較し、それによって前記試料溶液中に存在するアリールハイドロカーボン受容体に対するリガンドの濃度を決定する。A method for determining the concentration of a ligand for an aryl hydrocarbon receptor present in a sample solution, comprising the following steps:
Providing a sample solution containing a ligand for an aryl hydrocarbon receptor;
The current / potential characteristic of the sample solution is measured in the presence of an oxidation-reduction marker, using the arylhydrocarbon receptor-immobilized electrode according to any one of claims 1 to 9 as a working electrode, or a method of measuring the current-potential characteristic of the sample solution in the presence of an oxidation-reduction marker, or The current-potential characteristics of the sample solution are measured using the electrochemical analyzer according to any one of claims 1 to 4, and the measured current-potential characteristics of the sample solution are measured at a known concentration of a ligand for an aryl hydrocarbon receptor. The concentration of the ligand for the aryl hydrocarbon receptor present in the sample solution is determined by comparison with the current-potential characteristics of the contained control solution. 試料溶液が環境から採取された試料から調製されたものであることを特徴とする請求項２９記載の方法。30. The method according to claim 29, wherein the sample solution is prepared from a sample taken from the environment. リガンドがダイオキシン、ベンゾ（ａ）ピレン、又はβ−ナフトフラボンであることを特徴とする請求項２９または３０記載の方法。31. The method according to claim 29, wherein the ligand is dioxin, benzo (a) pyrene, or [beta] -naphthoflavone. 酸化還元性マーカーがＫ４Ｆｅ（ＣＮ）６／Ｋ３Ｆｅ（ＣＮ）６、フェロセン、又はヘキサアミンルテニウム（ＩＩＩ）錯体であることを特徴とする請求項２９〜３１のいずれか一項記載の方法。Redox marker K 4 Fe (CN) 6 / K 3 Fe (CN) 6, ferrocene, or hexamine ruthenium (III) of any one of claims 29 to 31, characterized in that the complex Method. 電流電位特性がサイクリックボルタンメトリー、微分パルスボルタンメトリー、又はアンペロメトリーによって測定されることを特徴とする請求項２９〜３２のいずれか一項記載の方法。The method according to any one of claims 29 to 32, wherein the current-potential characteristic is measured by cyclic voltammetry, differential pulse voltammetry, or amperometry. アリールハイドロカーボン受容体に対するリガンドを既知の濃度で含有するコントロール溶液の電流電位特性が、検量線として表されていることを特徴とする請求項２９〜３３のいずれか一項記載の方法。The method according to any one of claims 29 to 33, wherein the current-potential characteristics of a control solution containing a ligand for the aryl hydrocarbon receptor at a known concentration are represented as a calibration curve. 以下の工程を含むことを特徴とする、化学物質がアリールハイドロカーボン受容体に対する結合活性を有するか否かを判断する方法：
化学物質を含有する試料溶液を準備する；
請求項１〜９のいずれか一項記載のアリールハイドロカーボン受容体固定化電極を作用電極とし、酸化還元性マーカーの存在下に前記試料溶液の電流電位特性を測定するか又は請求項２０〜２３のいずれか一項記載の電気化学的分析装置を用いて前記試料溶液の電流電位特性を測定する；
測定された試料溶液の電流電位特性を、アリールハイドロカーボン受容体に対するいかなるリガンドをも含有しないコントロール溶液の電流電位特性と比較する；及び
比較の結果、両者の間に有意な差があれば前記化学物質がアリールハイドロカーボン受容体に対する結合活性を有すると判断し、一方両者の間に有意な差がなければ前記化学物質がアリールハイドロカーボン受容体に対する結合活性を有さないと判断する。A method for determining whether a chemical has binding activity to an aryl hydrocarbon receptor, comprising the following steps:
Prepare a sample solution containing the chemical;
The current / potential characteristic of the sample solution is measured in the presence of an oxidation-reduction marker, using the arylhydrocarbon receptor-immobilized electrode according to any one of claims 1 to 9 as a working electrode, or a method of measuring the current-potential characteristic of the sample solution in the presence of an oxidation-reduction marker, or Measuring a current-potential characteristic of the sample solution using the electrochemical analyzer according to any one of the above;
The measured current-potential characteristics of the sample solution are compared with the current-potential characteristics of a control solution that does not contain any ligand for the aryl hydrocarbon receptor; and if there is a significant difference between the two, the chemical It is determined that the substance has binding activity for the aryl hydrocarbon receptor, while if there is no significant difference between the two, it is determined that the chemical has no binding activity for the aryl hydrocarbon receptor. 酸化還元性マーカーがＫ４Ｆｅ（ＣＮ）６／Ｋ３Ｆｅ（ＣＮ）６、フェロセン、又はヘキサアミンルテニウム（ＩＩＩ）錯体であることを特徴とする請求項３５記載の方法。The method of claim 35, wherein the redox marker is K 4 Fe (CN) 6 / K 3 Fe (CN) 6, ferrocene, or hexamine ruthenium (III) complexes. 電流電位特性がサイクリックボルタンメトリー、微分パルスボルタンメトリー、又はアンペロメトリーによって測定されることを特徴とする請求項３５または３６記載の方法。The method according to claim 35 or 36, wherein the current-potential characteristics are measured by cyclic voltammetry, differential pulse voltammetry, or amperometry. 以下の工程を含むことを特徴とする、アリールハイドロカーボン受容体が前記受容体に対するリガンドと結合したときに誘起される前記受容体の構造変化又は機能変化を解析する方法：
アリールハイドロカーボン受容体に対するリガンドを含有する試料溶液を準備する；
請求項１〜９のいずれか一項記載のアリールハイドロカーボン受容体固定化電極を作用電極とし、酸化還元性マーカーの存在下に前記試料溶液の電流電位特性を測定するか又は請求項２０〜２３のいずれか一項記載の電気化学的分析装置を用いて前記試料溶液の電流電位特性を測定する；及び
測定された試料溶液の電流電位特性を解析する。A method for analyzing a structural change or a functional change of the receptor, which is induced when an aryl hydrocarbon receptor binds to a ligand for the receptor, comprising the steps of:
Providing a sample solution containing a ligand for an aryl hydrocarbon receptor;
The current / potential characteristic of the sample solution is measured in the presence of an oxidation-reduction marker, using the arylhydrocarbon receptor-immobilized electrode according to any one of claims 1 to 9 as a working electrode, or a method of measuring the current-potential characteristic of the sample solution in the presence of an oxidation-reduction marker, or The current-potential characteristics of the sample solution are measured using the electrochemical analyzer according to any one of the above, and the current-potential characteristics of the measured sample solution are analyzed. リガンドがダイオキシン、ベンゾ（ａ）ピレン、又はβ−ナフトフラボンであることを特徴とする請求項３８記載の方法。The method according to claim 38, wherein the ligand is dioxin, benzo (a) pyrene, or β-naphthoflavone. 酸化還元性マーカーがＫ４Ｆｅ（ＣＮ）６／Ｋ３Ｆｅ（ＣＮ）６、フェロセン、又はヘキサアミンルテニウム（ＩＩＩ）錯体であることを特徴とする請求項３８又は３９記載の方法。Claim 38 or 39 method wherein a redox marker is K 4 Fe (CN) 6 / K 3 Fe (CN) 6, ferrocene, or hexamine ruthenium (III) complexes. 電流電位特性がサイクリックボルタンメトリー、微分パルスボルタンメトリー、又はアンペロメトリーによって測定されることを特徴とする請求項３８〜４０のいずれか一項記載の方法。41. The method according to any one of claims 38 to 40, wherein the current-potential characteristics are measured by cyclic voltammetry, differential pulse voltammetry, or amperometry.
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