JP2004261595A - Indoor sterilization method - Google Patents
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Abstract
Description
本発明はフェオフォーバイドa（Ｐｈｄｅ ａ）若しくはフェオフォーバイドｂ（Ｐｈｄｅ ｂ）又は両者の混合物の水溶液を用いた殺菌方法に関する。 The present invention relates to a sterilization method using an aqueous solution of pheophorbide a (Phde a) or pheophorbide b (Phde b) or a mixture of both.
フェオフォーバイドａ及びｂは、植物色素クロロフィル由来の感光性物質として知られ、癌等の悪性腫瘍の光化学療法に用いることができる。フェオフォーバイドａ及びｂは可視光、特に６００〜７００ｎｍの波長を有する赤色光を効率よく吸収して、ＤＮＡの光切断等の光励起化学反応を引き起こすことが報告されている（非特許文献１、非特許文献２）。 Pheophorbides a and b are known as photosensitive substances derived from the plant pigment chlorophyll and can be used for photochemotherapy of malignant tumors such as cancer. It has been reported that pheophorbides a and b efficiently absorb visible light, particularly red light having a wavelength of 600 to 700 nm, and cause a photoexcited chemical reaction such as photocleavage of DNA (Non-Patent Document 1, Non-patent document 2).
高等植物及び藻類のうちの緑藻類にはクロロフィルａとｂの２種類のクロロフィルが存在（但し、藍藻類にはクロロフィルａのみが存在）するが、いずれも長い疎水性の側鎖（フィチル基、−Ｃ20Ｈ39）が存在するために水に対して不溶性である（非特許文献１）。そのため、クロロフィルa又はｂを強酸処理によって側鎖を脱離して得られるフェオフォーバイドa若しくはｂ又は両者の混合物を光化学療法に用いることが検討されている。近年、単離されたフェオフォーバイドａとフェオフォーバイドｂの細胞への取り込みについて、異なった挙動を示すことが示唆されている。つまり、フェオフォーバイドａは細胞膜を通過し、核に取り込まれるのに対して、フェオフォーバイドｂは細胞膜を通過せず、細胞膜に対する親和性を有することが知られている。それらの使用に当たり、それらの水に対する溶解度が極めて低いため、そのままでは人体への適用は困難と考えられていた。 Among the higher plants and algae, green algae has two types of chlorophylls, chlorophyll a and b (although only chlorophyll a is present in cyanobacteria), both of which have long hydrophobic side chains (phytyl group,- insoluble in water to C 20 H 39) is present (non-patent document 1). Therefore, the use of pheophorbide a or b obtained by elimination of the side chain of chlorophyll a or b by a strong acid treatment or a mixture of both is being studied for photochemotherapy. Recently, it has been suggested that the uptake of isolated pheophorbide a and pheophobide b into cells is different. That is, it is known that pheophorbide a passes through the cell membrane and is taken into the nucleus, whereas pheophorbide b does not pass through the cell membrane and has an affinity for the cell membrane. Upon their use, their solubility in water was extremely low, so it was considered difficult to apply them to the human body as they were.
そこで本発明者の一人は先に、フェオフォーバイドａが溶媒と反応して分子変性を生じることなく水溶性のＮａ塩とするためには、水酸化ナトリウムをｎ−プロピルアルコール若しくはイソプロピルアルコール又はそれらの混合液中に溶解して水酸化ナトリウム溶液を調製し、この溶液に相溶性のある溶媒中にフェオフォーバイドａを溶解してフェオフォーバイドａ溶液を調製し、該溶液と前記水酸化ナトリウム溶液とを混合・溶解させることにより、安定な形でフェオフォーバイドａの水溶性塩を形成することに成功した（特許文献１）。 Therefore, one of the present inventors first described that in order for pheophorbide a to react with a solvent to form a water-soluble Na salt without causing molecular denaturation, sodium hydroxide was converted to n-propyl alcohol or isopropyl alcohol or a mixture thereof. To prepare a sodium hydroxide solution, and pheophorbide a was dissolved in a solvent compatible with the solution to prepare a pheophorbide a solution. By mixing and dissolving with a solution, a water-soluble salt of pheophorbide a was successfully formed in a stable form (Patent Document 1).
現在までに開発された光感受性物質には種々のものがあり、現在治療に使われているものにヘマトポルフィリン系光感受性腫瘍親和性物質の全身投与とエキシマーレーザー癌治療装置との組合せ等が知られているが、副作用や光過敏症予防の必要性から長期の暗室内での生活を余儀なくされるため症例数は伸びていないのが実情である。また、従来のようなレーザーを使用した光線力学療法（Photo Dynamic Therapy，ＰＤＴ）の応用では、正常組織に対する温熱効果の影響も考えられ、従来のＰＤＴ効果の面で問題となっていた。 There are various types of photosensitizers that have been developed to date, and the ones currently used in treatment include the combination of systemic administration of hematoporphyrin-based photosensitizing tumor-affinity substances and an excimer laser cancer treatment device. However, the number of cases has not increased because of the necessity of side effects and the need to prevent photosensitivity, which necessitates long-term living in a dark room. In addition, in the application of photodynamic therapy (PDT) using a laser as in the conventional case, the effect of a thermal effect on normal tissues is also considered, and this has been a problem in the conventional PDT effect.
近年、病院や特別養護老人ホーム等の各種医療機関や老人福祉施設、その他宿泊施設等においては、バクテリアやウィルスに起因する院内・室内感染が多発している。また、食品工場などの工業分野では、衛生管理上、微生物の制御による防菌・防黴体制の確立が大きな課題となっている。 In recent years, hospitals and indoor infections caused by bacteria and viruses have frequently occurred in various medical institutions such as hospitals and nursing homes, nursing homes for the elderly, and other accommodation facilities. In the industrial field such as food factories, establishment of a germicidal / antifungal system by controlling microorganisms has become a major issue in hygiene management.
これらの問題を未然に防止するため、従来、病室、調理室、宿泊室、食品工場等の備品等を消毒液を含ませた布等を用いて拭く；空気浄化装置を設置する；消毒液を簡易なスプレー器具を用いて噴霧する等の手法が用いられている。 Conventionally, in order to prevent these problems, equipment such as hospital rooms, cooking rooms, accommodation rooms, food factories, etc. are wiped with a cloth or the like soaked in a disinfectant; an air purifier is installed; Techniques such as spraying using a simple spray device are used.
例えば病室の床、壁、機器類、カーテン、ベッド、布団等には種々の病原菌が付着しており、これらの病原菌が院内感染の一因になると考えられ、病室は消毒して清浄にしておく必要がある。一般には、密閉した病室にホルマリン水や０．５％グルタールアルデヒド水溶液等の消毒液を噴霧又は清拭して殺菌・消毒を行う方法が行われている。この方法は、病室内に一定量の消毒液を一定時間滞留させ所定時間放置した後、中和液を室内に噴霧して、滞留している消毒液を中和除去するというものである。しかしこの方法は、消毒剤のもつ化学反応作用による殺菌消毒のため、その後の中和処理による中和生成物が病室内の設備に悪影響を与えるという問題があった。そこで通常は、病室内を消毒した後、病室の窓や扉を開放して自然換気を行っているが、防毒マスクを装着した作業員が病室内に入らなければならないという煩雑さや危険が伴っていた。 For example, various pathogens are attached to the floor, walls, equipment, curtains, beds, futons, etc. of the hospital room, and it is considered that these pathogens contribute to hospital-acquired infection. There is a need. Generally, a method is used in which sterilization and disinfection is performed by spraying or wiping a disinfectant such as formalin water or a 0.5% glutaraldehyde aqueous solution into a closed hospital room. According to this method, a certain amount of disinfecting solution is kept in a hospital room for a certain time and left for a predetermined time, and then a neutralizing solution is sprayed into the room to neutralize and remove the staying disinfecting solution. However, this method has a problem that a neutralization product obtained by a subsequent neutralization treatment has an adverse effect on equipment in a hospital room because of sterilization and disinfection by the chemical reaction of the disinfectant. Therefore, usually, after disinfecting the sickroom, the windows and doors of the sickroom are opened and natural ventilation is performed, but this involves the complexity and danger that a worker wearing a gas mask must enter the sickroom. Was.
特に最近、従来の抗生物質が効かない、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌（ＭＲＳＡ）等の抗生物質耐性菌が出現してきており、院内感染の問題が大きく取り上げられてきている。 In particular, recently, antibiotic-resistant bacteria such as methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA), for which conventional antibiotics do not work, have emerged, and the problem of hospital-acquired infection has been taken up greatly.
このようなＭＲＳＡ等の抗生物質耐性菌に対しては、従来の消毒剤や消毒技術では十分に室内を殺菌消毒することは困難であった。そのため、抗生物質耐性菌に対しても十分に有効な、室内衛生確保のための対応が急務になっているというのが現状である。 For such antibiotic-resistant bacteria such as MRSA, it has been difficult to sufficiently sterilize and disinfect the room with conventional disinfectants and disinfecting techniques. Therefore, there is an urgent need for measures to ensure indoor hygiene that are sufficiently effective against antibiotic-resistant bacteria.
また、病室、調理室、宿泊室、食品工場等の生活空間においては、殺菌消毒がされた環境が好ましいといっても、ヒトが滞在・活動している最中に殺菌消毒が行われていることは、薬品の持つ臭気やその化学反応作用等、健康管理上却って好ましくない場合もある。そこでより殺菌性が高く、簡易で人体に対しても安全性が高い殺菌消毒が行われることが好ましい。 Further, in living spaces such as hospital rooms, cooking rooms, accommodation rooms, food factories, etc., sterilization is performed while humans are staying and working, even though a sterilized environment is preferable. This may be undesirable in health care due to the odor of the drug and its chemical reaction. Therefore, it is preferable to perform sterilization and disinfection with higher sterility, simpler and safer for the human body.
本発明者らは、人体に対して安全で副作用のないフェオフォーバイドa若しくはｂ又は両者の混合物のナトリウム塩の水溶液と、可視光を効率よく吸収して光励起化学反応を引き起こし、細菌の殺細胞効果を可能にする特異な特性とを利用して、一定量の光の存在下でフェオフォーバイドa若しくはｂ又は両者の混合物の水溶液を室内に噴霧又は散布して殺菌・消毒を行うことにより、ＭＲＳＡ等の抗生物質耐性菌に対しても十分な室内消毒が可能となることを見出し、本発明を完成するに至った。
即ち、本発明は以下の通りである。
（１）室内にフェオフォーバイドa若しくはｂ又は両者の混合物のナトリウム塩を含む水溶液を噴霧、散布又は清拭し、室内に光を照射することからなる室内の消毒方法。
（２）前記光は可視光である上記（１）記載の方法。
（３）前記光は６００〜７００ｎｍの波長を含む光である上記（２）記載の方法。
（４）前記光はハロゲン光又はレーザー光である上記（３）記載の方法。
（５）前記水溶液中のフェオフォーバイドa若しくはｂ又は両者の混合物のナトリウム塩の濃度が１ｘ１０-6〜１ｘ１０-4Ｍであり、光照射時間が２０分〜３０分である上記（４）記載の方法。
（６）前記フェオフォーバイドa若しくはｂ又は両者の混合物のナトリウム塩は、水酸化ナトリウムをｎ−プロピルアルコール若しくはイソプロピルアルコール又はそれらの混合液中に溶解して水酸化ナトリウム溶液を調製し、該溶液に相溶性のある溶媒中にフェオフォーバイドa若しくはｂ又は両者の混合物を溶解してフェオフォーバイドa若しくはｂ又は両者の混合物の溶液を調製し、該溶液と前記水酸化ナトリウム溶液とを混合溶解させることにより製造されたものである、上記（１）〜（５）のいずれかに記載の方法。
（７）フェオフォーバイドa若しくはｂ又は両者の混合物のナトリウム塩を含む水溶液からなる消毒用薬剤。
（８）前記フェオフォーバイドa若しくはｂ又は両者の混合物のナトリウム塩は、水酸化ナトリウムをｎ−プロピルアルコール若しくはイソプロピルアルコール又はそれらの混合液中に溶解して水酸化ナトリウム溶液を調製し、該溶液に相溶性のある溶媒中にフェオフォーバイドa若しくはｂ又は両者の混合物を溶解してフェオフォーバイドa若しくはｂ又は両者の混合物の溶液を調製し、該フェオフォーバイドa若しくはｂ又は両者の混合物の溶液と前記水酸化ナトリウム溶液とを混合溶解させることにより製造されたものである、上記（７）に記載の薬剤。
The present inventors have proposed an aqueous solution of sodium salt of pheophorbide a or b or a mixture of both, which is safe and has no side effects on the human body, and efficiently absorbs visible light to cause a photoexcited chemical reaction, thereby killing bacteria. Utilizing the unique properties that enable the effect, by spraying or spraying an aqueous solution of pheophorbide a or b or a mixture of both in the room in the presence of a certain amount of light to perform sterilization and disinfection, It has been found that sufficient indoor disinfection is possible even for antibiotic-resistant bacteria such as MRSA, and the present invention has been completed.
That is, the present invention is as follows.
(1) An indoor disinfection method comprising spraying, spraying, or wiping an aqueous solution containing sodium salt of pheophorbide a or b or a mixture of the two and irradiating the room with light.
(2) The method according to the above (1), wherein the light is visible light.
(3) The method according to the above (2), wherein the light is light having a wavelength of 600 to 700 nm.
(4) The method according to (3), wherein the light is halogen light or laser light.
(5) The above (4), wherein the concentration of sodium salt of pheophorbide a or b or a mixture of both in the aqueous solution is 1 × 10 −6 to 1 × 10 −4 M, and the light irradiation time is 20 to 30 minutes. the method of.
(6) The sodium salt of pheophorbide a or b or a mixture of both is prepared by dissolving sodium hydroxide in n-propyl alcohol or isopropyl alcohol or a mixture thereof to prepare a sodium hydroxide solution. A solution of pheophorbide a or b or a mixture of both is prepared by dissolving pheophorbide a or b or a mixture of both in a solvent compatible with, and the solution and the sodium hydroxide solution are mixed and dissolved. The method according to any one of the above (1) to (5), which is produced by causing
(7) A disinfecting agent comprising an aqueous solution containing sodium salt of pheophorbide a or b or a mixture of both.
(8) The sodium salt of pheophorbide a or b or a mixture of both is prepared by dissolving sodium hydroxide in n-propyl alcohol or isopropyl alcohol or a mixture thereof to prepare a sodium hydroxide solution; Dissolve pheophorbide a or b or a mixture of both in a solvent compatible with to prepare a solution of pheophorbide a or b or a mixture of both, and prepare a solution of pheophorbide a or b or a mixture of both. The drug according to the above (7), which is produced by mixing and dissolving a solution and the sodium hydroxide solution.
フェオフォーバイドa若しくはｂ又は両者の混合物はそれ自体は無害であり、また脱色されるため非常に使用しやすい物質である。また、組織透過性のよい長波長側の比較的弱い光で容易に励起されるので、可視光領域での光励起が可能であり、光感受性物質として扱いやすい。更に、フェオフォーバイドa若しくはｂ又は両者の混合物は体内の正常組織からの代謝が非常に早いため、接触、吸引されたとしても副作用が少ない。従って、安全かつ容易に室内の殺菌消毒が可能である。 Pheophorbide a or b or a mixture of both are harmless per se and are very easy to use because they are decolorized. Further, since it is easily excited by relatively weak light on the long wavelength side having good tissue permeability, light excitation in the visible light region is possible, and it is easy to handle as a photosensitive substance. Furthermore, since pheophorbide a or b or a mixture of both is very rapidly metabolized from normal tissues in the body, there are few side effects even if contacted or inhaled. Therefore, indoor sterilization can be performed safely and easily.
以下本発明を更に具体的に説明する。
フェオフォーバイドａではそのテトラピロール環の一つにＣＨ３基が結合しているが、フェオフォーバイドｂではそれがＣＨＯ基に置き換わっているだけなので、両者は分子構造上類似している。
フェオフォーバイドa若しくはｂ又は両者の混合物、及びそれらのナトリウム塩は特許第２９６３１７８号公報（特許文献１）に記載された方法により製造することができる。
フェオフォーバイドａ（Ｃ32Ｈ32Ｎ4Ｏ（ＣＯＯＨ）ＣＯＯＣＨ3）又はフェオフォーバイドｂ（Ｃ32Ｈ30Ｎ4Ｏ2（ＣＯＯＨ）ＣＯＯＣＨ3）をナトリウム塩にするには、フェオフォーバイドa若しくはｂ又は両者の混合物を溶解する溶媒と水酸化ナトリウムを溶解する溶媒とが混合しあうことが必要不可欠である。また生成したフェオフォーバイドa若しくはｂ又は両者の混合物のナトリウム塩が、その混合された溶媒系では不溶であり、沈澱を生成して分離が可能でなければならない。この条件を満足するフェオフォーバイドa若しくはｂ又は両者の混合物の溶媒としては、エーテル、アセトン、クロロホルム等が挙げられる。
Hereinafter, the present invention will be described more specifically.
In pheophorbide a, a CH 3 group is bonded to one of its tetrapyrrole rings, but in pheophorbide b, they are only replaced by CHO groups, so that both are similar in molecular structure.
Pheophorbide a or b or a mixture of both, and their sodium salts can be produced by the method described in Japanese Patent No. 2963178 (Patent Document 1).
To convert pheophorbide a (C 32 H 32 N 4 O (COOH) COOCH 3 ) or pheophorbide b (C 32 H 30 N 4 O 2 (COOH) COOCH 3 ) to a sodium salt, use pheophorbide a Alternatively, it is essential that a solvent dissolving b or a mixture of both and a solvent dissolving sodium hydroxide be mixed with each other. Also, the sodium salt of the formed pheophorbide a or b or a mixture of both must be insoluble in the mixed solvent system and form a precipitate which can be separated. Examples of the solvent for pheophorbide a or b or a mixture of both that satisfy this condition include ether, acetone, and chloroform.
一方、フェオフォーバイドa若しくはｂ又は両者の混合物は水酸化ナトリウムのようなアルカリの存在下では、メタノールやエタノールに接触すると激しく分子変性を起こし酸化が促進されることが知られている。従ってフェオフォーバイドa若しくはｂ又は両者の混合物をナトリウム塩とする場合は、酸化反応を促進しない溶媒を選択することが最も重要である。そこで、本発明においては、水酸化ナトリウムの溶媒として、ｎ−プロピルアルコール、イソプロピルアルコール又はその混合液を用いる。これにより、フェオフォーバイドａ又はｂの分子変性を全く起こすことなく、そのナトリウム塩を生成することができる。更に本発明においては、フェオフォーバイドa若しくはｂ又は両者の混合物の水溶化に際し、溶解補助剤を用いることなく、しかも特殊な溶解技法を用いることなく、極めて容易にフェオフォーバイドa若しくはｂ又は両者の混合物のナトリウム塩の水溶液を調製することができる。 On the other hand, it is known that pheophorbide a or b, or a mixture of both, violently undergoes molecular denaturation when exposed to methanol or ethanol in the presence of an alkali such as sodium hydroxide to promote oxidation. Therefore, when pheophorbide a or b or a mixture of both is sodium salt, it is most important to select a solvent that does not promote the oxidation reaction. Therefore, in the present invention, n-propyl alcohol, isopropyl alcohol or a mixture thereof is used as a solvent for sodium hydroxide. Thereby, the sodium salt can be produced without causing any molecular denaturation of pheophorbide a or b. Further, in the present invention, when solubilizing pheophorbide a or b or a mixture of both, without using a solubilizing agent, and without using a special dissolution technique, pheophorbide a or b or both can be extremely easily. An aqueous solution of the sodium salt of a mixture of the above can be prepared.
本発明においては、室内にフェオフォーバイドa若しくはｂ又は両者の混合物のナトリウム塩を含む水溶液を噴霧、散布又は清拭してから、室内に光を照射する。上記水溶液を噴霧、散布又は清拭は、従来公知のいかなる噴霧機（装置）又は散布機（装置）を用いても実施可能であるが、上記水溶液の容器は遮光されていることが好ましい。室内に上記水溶液を均一に又は十分に噴霧又は散布できるのであれば、特別の機械や装置を使用する必要はないであろう。なお、フェオフォーバイドa若しくはｂ又は両者の混合物のナトリウム塩を含む水溶液の適用形態は噴霧、散布又は清拭等に限らず、必要に応じて塗布、浸漬、他の湿潤手段であってもよい。 In the present invention, the room is irradiated with light after spraying, spraying or wiping an aqueous solution containing sodium salt of pheophorbide a or b or a mixture of both. Spraying, spraying, or wiping the aqueous solution can be performed using any conventionally known sprayer (apparatus) or sprayer (apparatus), but the container for the aqueous solution is preferably shielded from light. As long as the aqueous solution can be sprayed or sprayed uniformly or sufficiently in the room, it will not be necessary to use special machines and devices. The application form of the aqueous solution containing the sodium salt of pheophorbide a or b or a mixture of both is not limited to spraying, spraying or wiping, but may be application, dipping, or other wetting means as necessary. .
フェオフォーバイドa若しくはｂ又は両者の混合物は６００〜７００ｎｍに大きなＱ吸収帯（ｍａｘ６６７ｎｍ）を有するので、可視光、特に細胞透過性の高い赤色光が利用できる。ヘマトポルフィリン誘導体のＱ帯の波長におけるレーザー光に対する吸光度係数と比較すると、フェオフォーバイドａはヘマトポルフィリン誘導体の約３３８倍も大きいことがわかっている。 Since pheophorbide a or b or a mixture of both has a large Q absorption band (max 667 nm) at 600 to 700 nm, visible light, particularly red light having high cell permeability, can be used. It is known that pheophorbide a is about 338 times as large as that of the hematoporphyrin derivative when compared with the absorption coefficient of the hematoporphyrin derivative to the laser beam at the wavelength of the Q band.
本発明において使用される光は、可視光、６００〜７００ｎｍの波長を含む光、赤色光のほか、ハロゲン光、レーザー光、特に６７０ｎｍの半導体レーザー、太陽光、蛍光灯の光（白色光）でもよいが、ハロゲン光又は６７０ｎｍの半導体レーザーが好ましい。 The light used in the present invention is not only visible light, light having a wavelength of 600 to 700 nm, red light, but also halogen light, laser light, especially light of a 670 nm semiconductor laser, sunlight, and fluorescent lamps (white light). Preferably, halogen light or a 670 nm semiconductor laser is preferred.
フェオフォーバイドa若しくはｂ又は両者の混合物のナトリウム塩を含む水溶液の濃度は１ｘ１０-6〜１ｘ１０-4Ｍであることが好ましい。ハロゲン光又はレーザー光を使用する場合、光照射時間が２０分〜３０分であることが好ましい。 The concentration of the aqueous solution containing the sodium salt of pheophorbide a or b or a mixture of both is preferably 1 × 10 −6 to 1 × 10 −4 M. When using halogen light or laser light, the light irradiation time is preferably 20 minutes to 30 minutes.
本発明において、フェオフォーバイドa若しくはｂ又は両者の混合物のナトリウム塩は、水酸化ナトリウムをｎ−プロピルアルコール若しくはイソプロピルアルコール又はそれらの混合液中に溶解して水酸化ナトリウム溶液を調製し、該溶液に相溶性のある溶媒中にフェオフォーバイドa若しくはｂ又は両者の混合物を溶解してフェオフォーバイドa若しくはｂ又は両者の混合物の溶液を調製し、該溶液と前記水酸化ナトリウム溶液とを混合・溶解させることにより製造されたものであることが好ましい。 In the present invention, the sodium salt of pheophorbide a or b or a mixture of both is prepared by dissolving sodium hydroxide in n-propyl alcohol or isopropyl alcohol or a mixture thereof to prepare a sodium hydroxide solution. A solution of pheophorbide a or b or a mixture of both is prepared by dissolving pheophorbide a or b or a mixture of both in a solvent compatible with, and mixing the solution with the sodium hydroxide solution. It is preferably produced by dissolving.
以下、フェオフォーバイドa若しくはｂ又は両者の混合物のナトリウム塩の合成、フェオフォーバイドa若しくはｂ又は両者の混合物のナトリウム塩の水溶液の調製、及びフェオフォーバイドa若しくはｂ又は両者の混合物のナトリウム塩のＨＰＬＣ（高機能性液体クロマトグラフィー）分析及び紫外−可視吸収スペクトルによる同定の一例について説明する。 Hereinafter, synthesis of sodium salt of pheophorbide a or b or a mixture of both, preparation of an aqueous solution of sodium salt of pheophorbide a or b or a mixture of both, and sodium salt of pheophorbide a or b or a mixture of both An example of identification by HPLC (high-performance liquid chromatography) analysis and ultraviolet-visible absorption spectrum will be described.
（１）フェオフォーバイドa若しくはｂ又は両者の混合物のナトリウム塩の合成
既知の製法（クロロフィルａ又はｂをエーテル中、濃塩酸により脱マグネシウム、及び加水分解による脱フィトール化する方法）により得られたフェオフォーバイドa若しくはｂ又は両者の混合物 ５００ｍｇを３００ｍｌのエーテルに溶解する。一方、水酸化ナトリウム１００ｍｇを３０ｍｌのｎ−プロピルアルコール又はイソプロピルアルコールに溶解する。次いでフェオフォーバイドa若しくはｂ又は両者の混合物のエーテル溶液中に水酸化ナトリウムのｎ−又はイソプロピルアルコール溶液を攪拌しながら滴下する。この際、反応の進行状態は、濾紙上に溶液を一滴落とすことにより沈澱の生成を観察するという方法で確認し、その終点は沈澱の周囲に広がる溶液の色が無色となった時とする。
(1) Synthesis of sodium salt of pheophorbide a or b or a mixture of both pheophorbide Obtained by a known production method (method of removing chlorophyll a or b in ether, using concentrated hydrochloric acid to remove magnesium and hydrolysis to remove phytol). Dissolve 500 mg of pheophorbide a or b or a mixture of both in 300 ml of ether. On the other hand, 100 mg of sodium hydroxide is dissolved in 30 ml of n-propyl alcohol or isopropyl alcohol. Then, an n- or isopropyl alcohol solution of sodium hydroxide is added dropwise to an ether solution of pheophorbide a or b or a mixture of both while stirring. At this time, the progress of the reaction was confirmed by observing the formation of a precipitate by dropping a drop of the solution on filter paper, and the end point was when the color of the solution spread around the precipitate became colorless.
次に上記沈澱（フェオフォーバイドa若しくはｂ又は両者の混合物のナトリウム塩）を含有する溶液を遠心管に入れ遠心分離（２５００ｒｐｍ、２分間）することにより沈澱部分を分離することができる。上澄みを捨て、遠心管底部に残る固形分を真空乾燥機にて乾燥することにより粉末状フェオフォーバイドa若しくはｂ又は両者の混合物のナトリウム塩を得ることができる。 Next, the solution containing the precipitate (the sodium salt of pheophorbide a or b or a mixture of both) is placed in a centrifuge tube and centrifuged (2500 rpm, 2 minutes) to separate the precipitated portion. The supernatant is discarded, and the solid content remaining at the bottom of the centrifuge tube is dried with a vacuum drier to obtain a sodium salt of powdery pheophorbide a or b or a mixture of both.
（２）フェオフォーバイドa若しくはｂ又は両者の混合物のナトリウム塩の水溶液の調製
フェオフォーバイドa若しくはｂ又は両者の混合物のナトリウム塩約１０ｍｇに２ｍｌの蒸留水を入れ軽く振るとフェオフォーバイドa若しくはｂ又は両者の混合物のナトリウム塩は溶解し、透明な溶液が形成される。その溶液のｐＨは約９．２〜９．５を示すため、燐酸緩衝液（ｐＨ７．４又は７．８）を用い、適宜適当な濃度に希釈し使用される。
(2) Preparation of an aqueous solution of sodium salt of pheophorbide a or b or a mixture of both When 2 ml of distilled water is added to about 10 mg of sodium salt of pheophorbide a or b or a mixture of both, and shaken gently, pheophorbide a or b The sodium salt of b or a mixture of both dissolves and a clear solution is formed. Since the pH of the solution is about 9.2 to 9.5, it is appropriately diluted with a phosphate buffer (pH 7.4 or 7.8) and used.
（３）フェオフォーバイドa若しくはｂ又は両者の混合物のナトリウム塩のＨＰＬＣ（高機能性液体クロマトグラフィー）分析及び紫外−可視吸収スペクトルによる同定
フェオフォーバイドa若しくはｂ又は両者の混合物のナトリウム塩を希塩酸により脱ナトリウム化し、そのエーテル溶液を得る。次いでこの溶液と既知のフェオフォーバイドa若しくはｂ又は両者の混合物との両サンプルのＨＰＬＣ分析及び吸収スペクトルの測定を行い、比較検討する。ＨＰＬＣ分析に関しては、既知のフェオフォーバイドa若しくはｂ又は両者の混合物のチャートと上記エーテル溶液のチャートから保持時間を比較したところ、両チャートが一致することが判り、これをもってフェオフォーバイドa若しくはｂ又は両者の混合物の存在を確認することができる。ただし、上記ＨＰＬＣ分析の分離条件は次の通りである。
(3) HPLC (high-performance liquid chromatography) analysis of sodium salt of pheophorbide a or b or a mixture of both and identification by ultraviolet-visible absorption spectrum The sodium salt of pheophorbide a or b or a mixture of both was diluted with dilute hydrochloric acid. To give an ether solution. Next, HPLC analysis and absorption spectrum measurement of both samples of this solution and a known pheophorbide a or b or a mixture of both are performed, and the results are compared and studied. Regarding the HPLC analysis, when the retention times were compared from the chart of the known pheophorbide a or b or the mixture of the two and the chart of the above ether solution, it was found that both charts were in agreement, and this indicated that the pheophorbide a or b Alternatively, the presence of a mixture of both can be confirmed. However, the separation conditions of the above HPLC analysis are as follows.
カラム・・・ＯＤＳ ＳＳＣｐａｃｋ ４×２５０ｍｍ
溶離液・・・アセトニトリル：０．１％リン酸溶液：テトラヒドロフラン＝８８：１０：２
流量・・・１．０ｍｌ／分、波長・・・４１０ｎｍ、チャート速度・・・０．５ｃｍ／分、温度・・・１２℃
吸収スペクトルの吸収波長についても、上記エーテル溶液と既知のフェオフォーバイドａ若しくはｂ又は両者の混合物の溶液とがほぼ完全に一致し、これによってもフェオフォーバイドａ若しくはｂ又は両者の混合物の存在を確認できる。
Column ・ ・ ・ ODS SSCpack 4 × 250mm
Eluent: acetonitrile: 0.1% phosphoric acid solution: tetrahydrofuran = 88: 10: 2
Flow rate: 1.0 ml / min, wavelength: 410 nm, chart speed: 0.5 cm / min, temperature: 12 ° C
Regarding the absorption wavelength of the absorption spectrum, the solution of the ether solution and the solution of the known pheophorbide a or b or a mixture of the two almost completely coincide with each other, which also confirms the presence of the pheophorbide a or b or the mixture of both. You can check.
以下本発明を実施例により更に詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例により何ら制限されるものではない。特に、以下の実施例はフェオフォーバイドａについてのものではあるが、フェオフォーバイドａとｂとの類似性は上述の通りであるので、以下の実施例における方法論、結果、及び考察がフェオフォーバイドb及びフェオフォーバイドａとｂとの混合物についても当てはまることは当業者であれば容易に理解できるはずである。
例１
ＭＲＳＡ菌株として臨床材料分離株を使用し、濁度計を用いてＭｃＦａｒｌａｎｄ Ｎｏ．１（１０8ＣＦＵ／ｍｌ）相当のＭＲＳＡ菌液を調製した。
光感受性物質として、滅菌フェオフォーバイドａナトリウム（Ｎａ−ｐｈｄｅ ａ）（（有）クロロフィル研究所より提供）を滅菌生理食塩水に溶解し、６．８ｘ１０-5Ｍ（＝６８μｍｏｌ／ｌ）のＮａ−ｐｈｄｅ ａ溶液を調製した。
Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to examples, but the present invention is not limited to these examples. In particular, although the following examples are for pheophorbide a, the similarity between pheophorbides a and b is as described above, so the methodology, results, and considerations in the following examples are It will be readily understood by those skilled in the art that the same applies to the binder b and the mixture of pheophorbide a and b.
Example 1
A clinical material isolate was used as the MRSA strain, and McFarland No. An MRSA bacterial solution equivalent to 1 (10 8 CFU / ml) was prepared.
As a photosensitizer, sterile pheophorbide a sodium (Na-phdea) (provided by Chlorophyll Laboratories) was dissolved in sterile physiological saline, and 6.8 × 10 −5 M (= 68 μmol / l) Na was dissolved. A -phdea solution was prepared.
それぞれの液体を滅菌噴霧器に充填した。
病室の床をアルコール消毒しておき、菌液の噴霧前にあらかじめ菌のチェックを行った（図１（１）又は図２（１））。菌のチェックには培地として、ぺたんチェック（登録商標）２５ＭＲＳＡ寒天培地（栄研器材株式会社）を用いた。次に、床にＭＲＳＡ菌液を３回噴霧し、５分後に菌のチェックを行った（図１（２）又は図２（２））。次に、Ｎａ−ｐｈｄｅ ａ溶液を５回噴霧し、５分後に菌のチェックを行った（図１（３）又は図２（３））。ＭＲＳＡにＮａ−ｐｈｄｅ ａを作用させておいてから、ハロゲン電球（東京メタル工業株式会社製白熱灯照明器具型式ＨＬＣ−１１０Ｐ、定格：使用電圧ＡＣ１００Ｖ、適合ランプＪＤＲ１１０Ｖ７５Ｗ、径５０口金Ｅ１１、有害光線及び熱の影響を排除すべく水及びガラスを透過させた）（図１（４））又は半導体レーザー（株式会社ジュンテック製可視光半導体レーザー（理化学用）、連続パワー出力：４００ｍＷ、波長：６７０ｎｍ、ビーム拡散核＜０．１５Ｎ．Ａ、スペクトル幅＜３ｎｍ、導光ファイバー：石英ファイバー（コア径６００μｍ）（図２（４））を床に３０分間照射し、最後に菌のチェックを行った。
Each liquid was filled into a sterile sprayer.
The floor of the sickroom was disinfected with alcohol, and the bacteria were checked before spraying the bacterial solution (FIG. 1 (1) or FIG. 2 (1)). For checking the bacteria, Petan Check (registered trademark) 25 MRSA agar medium (Eiken Kiki Co., Ltd.) was used as a medium. Next, the bed was sprayed with the MRSA bacteria solution three times, and after 5 minutes, the bacteria were checked (FIG. 1 (2) or FIG. 2 (2)). Next, the Na-phdea solution was sprayed 5 times, and after 5 minutes, the bacteria were checked (FIG. 1 (3) or FIG. 2 (3)). After Na-phdea is allowed to act on the MRSA, a halogen bulb (Incandescent lamp type HLC-110P manufactured by Tokyo Metal Industries Co., Ltd., rating: working voltage AC100V, compatible lamp JDR110V75W, diameter 50 base E11, harmful light and Water and glass were allowed to pass to eliminate the influence of heat (FIG. 1 (4)) or a semiconductor laser (visible laser diode (for physics and chemistry) manufactured by Juntec Co., Ltd.), continuous power output: 400 mW, wavelength: 670 nm, The floor was irradiated with a beam diffusion nucleus <0.15 NA, spectrum width <3 nm, and a light-guiding fiber: quartz fiber (core diameter 600 μm) (FIG. 2 (4)) for 30 minutes, and finally the bacteria were checked.
それぞれの培地をインキュベータに入れ、３５〜３７℃で２４時間培養を行った。
ハロゲンランプ照射の実験結果とレーザー照射の実験結果をそれぞれまとめて図１と図２に示す。ハロゲンランプ照射、レーザー照射ともに、光照射後はＭＲＳＡの増殖は見られず、顕著な殺菌効果が得られた。
Each medium was placed in an incubator and cultured at 35 to 37 ° C. for 24 hours.
The experimental results of the halogen lamp irradiation and the laser irradiation are shown in FIGS. 1 and 2, respectively. In both the halogen lamp irradiation and the laser irradiation, no MRSA proliferation was observed after light irradiation, and a remarkable bactericidal effect was obtained.
例２
光線力学療法（photodynamic therapy，ＰＤＴ）を応用したインビトロでのＭＲＳＡ殺菌実験を行った。
（実験材料）
例１と同様にＮａ−ｐｈｄｅ ａ溶液及びＭＲＳＡ菌液を調製し、同様の光照射装置を用いた。培養は血液寒天培地を用い３５〜３７℃で２４時間行った。
菌の発育状況は、集落の観察と集落数を計測することにより行った。
発育状況は以下のように判定した。
＋＋＋ ： 集落が完全に融合している。
＋＋ ： 集落が一部融合しているが、集落の計数は不可能。
＋ ： 集落が孤立し、計数可能。
− ： 発育が認められない。
Example 2
In vitro MRSA sterilization experiments using photodynamic therapy (PDT) were performed.
(Experimental materials)
A Na-phdea solution and an MRSA bacterial solution were prepared in the same manner as in Example 1, and the same light irradiation device was used. The culture was performed at 35 to 37 ° C. for 24 hours using a blood agar medium.
The growth status of the fungus was determined by observing the colonies and counting the number of colonies.
The development status was determined as follows.
++: The village is completely fused.
++: Some settlements are fused, but settlements cannot be counted.
+: The village is isolated and can be counted.
-: No growth is observed.
（実験方法）
Ｍｉｌｅｓ＆Ｍｉｓｒａ法に準じて実験を行った。ＭｃＦａｒｌａｎｄ Ｎｏ．１（１０8ＣＦＵ／ｍｌ）相当のＭＲＳＡ菌液を１０6倍まで希釈し、１０8〜１０2ＣＦＵ／ｍｌ相当の希釈系列を作成した。
それぞれの菌液にＮａ−ｐｈｄｅ ａ溶液を適用し、暗室で６０分間作用させた。なお、コントロール群、ハロゲン光群、及びレーザー光群のいずれにも同量の生理食塩水を添加した。以下のようにＮａ−ｐｈｄｅ ａ溶液の適用と光照射を行った後、菌液を培地に滴下して培養した。
(experimental method)
The experiment was performed according to the Miles & Misra method. McFarland No. 1 (10 8 CFU / ml) equivalent of MRSA bacterial suspension was diluted to 10 6 fold and create a 10 8 ~10 2 CFU / ml equivalent dilution series.
A Na-phdea solution was applied to each bacterial solution and allowed to act in a dark room for 60 minutes. The same amount of physiological saline was added to each of the control group, the halogen light group, and the laser light group. After the application of the Na-phdea solution and the light irradiation as described below, the bacterial solution was dropped on the medium and cultured.
（結果）
ハロゲンランプ照射の実験結果とレーザー照射の実験結果をそれぞれまとめて図３と図４に示す。レーザー群、ハロゲン群、及びＮａ−ｐｈｄｅ ａ群ではコントロール群と比較しても殺菌効果は見られなかったが、Ｎａ−ｐｈｄｅ ａ ＋レーザー群及びＮａ−ｐｈｄｅ ａ ＋ハロゲン群では完全な殺菌効果が見られた。
(result)
The experimental results of the halogen lamp irradiation and the laser irradiation are summarized in FIGS. 3 and 4, respectively. No bactericidal effect was observed in the laser group, the halogen group, and the Na-phdea group as compared with the control group, but the complete bactericidal effect was observed in the Na-phdea + laser group and the Na-phdea + halogen group. Was seen.
本発明の消毒用薬剤及び消毒方法を用いることにより、ＭＲＳＡ等の抗生物質耐性菌に対しても安全かつ容易に、医療機関、福祉施設、宿泊施設、食品工場等の室内消毒を行うことができ、産業上極めて有用である。 By using the disinfectant and disinfecting method of the present invention, indoor disinfection of medical institutions, welfare facilities, accommodation facilities, food factories, etc. can be performed safely and easily against antibiotic resistant bacteria such as MRSA. Very useful in industry.
Claims (8)
The sodium salt of the pheophorbide a or b or a mixture of both is prepared by dissolving sodium hydroxide in n-propyl alcohol or isopropyl alcohol or a mixture thereof to prepare a sodium hydroxide solution, which is compatible with the solution. A solution of pheophorbide a or b or a mixture of both is prepared by dissolving pheophorbide a or b or a mixture of both in a certain solvent, and a solution of the pheophorbide a or b or a mixture of both is mixed with the above solution. The drug according to claim 7, which is produced by mixing and dissolving with a sodium hydroxide solution.
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