【０００１】
【発明が属する技術分野】この発明は胚性幹細胞（ＥＳ細胞）の胚様体（ＥＢ）形成のために使用される培養容器及び培養方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】胚性幹細胞（以下ＥＳ細胞という）を培養して胚様体（以下ＥＢという）を形成する際には、従来、「ハンギングドロップ法」と呼ばれる培養法が用いられてきた。
通常ハンギングドロップ法は、図６に示すように、例えば９６ｗｅｌｌのポリスチレン製マルチウエルプレート（ディッシュ）２１を用い、以下のような手順で行われる。マルチウエルプレート２１の各ｗｅｌｌ２２には緩衝液２３を約１３０μｌとミネラルオイル２４とを約２００μｌを満たす。各ｗｅｌｌ２２に対応する位置の蓋２５側に、ＥＳ細胞（１０００個）を含む培地２６を約５０μ１を液滴となるようにたらす。この液滴が表面張力で蓋に張り付くことを利用して、マルチウエルプレート２１に上記蓋２５をかぶせて、静かに培養を行っている。
しかしながら以上の操作は煩雑な上に、９６個の各ｗｅｌｌ２２の条件が一定にならないという問題点がある。このため、得ようとするＥＢ２７の形成率が低く、また形成されるＥＢ２７の質も不安定である。
【０００３】
【特許文献】参考になるものは特になし。
【０００４】
【非特許文献】参考になるものは特になし。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】上述のように、ＥＳ細胞からＥＢを形成させるための培養法であるハンギングドロップ法は、操作が煩雑な上にＥＢの形成率が低いという問題点がある。また、形成されたＥＢの質も不安定である。このため、その後のＥＢの分化の程度が不均一になりやすい。本発明は、ＥＳ細胞から質的に安定したＥＢを簡便に、かつ効率よく形成することが可能な胚性幹細胞（ＥＳ細胞）の胚様体（ＥＢ）形成のための培養容器及び培養方法を提供しようとするものである。
【０００６】
【課題を解決するための手段】すなわちこの発明の胚性幹細胞（ＥＳ細胞）の胚様体（ＥＢ）形成のための培養容器は、容器の材質をポリプロピレンとして培養中にＥＳ細胞が容器に付着することを避けるとともに、容器の形状を細胞が一か所に集合させやすいように容器の径が下にいくほど小さくなるコニカル型（円錐形）としてその底部には丸みを持たせ、ＥＳ細胞を容器内で細胞集塊が形成された状態で培養可能とすることにより、効率よくＥＢを形成させることができるようにしたことを特徴とするものである。
【０００７】また、この発明の胚性幹細胞（ＥＳ細胞）の胚様体（ＥＢ）形成のための培養方法は、材質がポリプロピレン製で、かつ形状が細胞を一か所に集合させやすいように容器の径が下にいくほど小さくなるコニカル型（円錐形）であり、その底部には丸みを持たせた容器を用い、ＥＳ細胞が容器内に付着することを避けながら、ＥＳ細胞を容器内で細胞集塊が形成された状態で培養することにより、効率よくＥＢを形成させることができるようにしたことをも特徴とするものである。
【０００８】ＥＳ細胞によるＥＢの形成は酸素供給条件により影響を受けやすいため、一般的に細胞培養で用いられる酸素分圧（２０％）下であっても、酸素供給が過剰となり、ＥＢが形成されないことがある。このことが上記ハンギングドロップ法におけるＥＢ形成率低下の一因になっていると思われる。
【０００９】一方、この発明における培養容器は、ポリプロピレンを材質とするコニカル型の形状をしている。すなわち、上記容器の材質をとしてポリプロピレンを用いることにより培養中にＥＳ細胞が容器に付着することを避けることができ、また容器の形状を細胞が一か所に集合させやすいように容器の径が下にいくほど小さくなるコニカル型（円錐形）とし、その底部には丸みを持たせてあるので、ＥＳ細胞を容器内で細胞集塊が形成された状態で培養可能であり、非常に効率よくＥＢを形成させることができる。
【００１０】
【発明の実施の形態】以下この発明の胚性幹細胞（ＥＳ細胞）の胚様体（ＥＢ）形成のための培養容器及び培養方法の実施の形態を図面に基いて詳細に説明する。
図１はこの発明の胚性幹細胞（ＥＳ細胞）の胚様体（ＥＢ）形成のための培養容器の要部を説明するための説明図、図２はその全体の概要を示す斜視図、図３はその概略断面図である。
【００１１】図１ないし図３はこの発明の胚性幹細胞（ＥＳ細胞）の胚様体（ＥＢ）形成のための培養容器を示すものである。
＜培養容器の材質＞
ＥＳ細胞を培養してＥＢを形成させるには、培養中にＥＳ細胞が培養容器に付着することを避けなければならない。このため、培養容器の材質をポリプロピレンとしている。
＜培養容器の形状＞
培養容器の形状は、図１に示すようにスクリュー式の蓋１２を有する丸底（Ｒ＝２ｍ）１３の底部構造のコニカル型の円筒状チューブ（全容量は約１．５ｍｌ 以下コニカルチューブという）１１を各単位ｗｅｌｌとすることができる。また培養容器の全体図は、図２及び図３のように、例えば９６ｗｅｌｌのマルチウエルプレート１０である。
【００１２】そして、この９６ｗｅｌｌのマルチウエルプレート１０におけるコニカルチューブ１１からなる各ｗｅｌｌは、一度に多くの試料を扱う際の操作を簡便化するために、蓋の部分を上記スクリュー式ではなく、図３のように単に突起物１５を所定の間隔に配置した蓋１４によって各ｗｅｌｌの開口部１６を塞ぐ形式としてもよい。
【００１３】ただし、開口部１６を完全に塞ぐと全く通気が遮断されて酸素が細胞に供給されなくなるので、突起物１５の径は図３のように開口部１６よりも僅かに小さく設計されている。この突起物１５により、過剰な酸素供給を抑えることができる。他方、スクリュー式の蓋１２を有するコニカルチューブ１１では、通気口を確保するためにネジ一周分ほど蓋１２を緩めて培養する。この操作により、適量の酸素が細胞に供給される。
【００１４】より具体的に培養容器の形状について説明すると、ＥＳ細胞がＥＢとなるには、細胞集塊が形成されなければならない。すなわち、細胞が一所に集合して集塊を形成しやすいように、培養容器の形状をコニカル型の円筒状チューブ、すなわちコニカルチューブ１１とし（全容量は約１．５ｍｌ）、その開口部１６にはスクリュー式の蓋１２を取り付けている（図１参照）。１８は自立スタンドである。また開口部１６の直径は１０ｍｍ、底部はＲ＝２ｍｍの丸底１３で、深さは３０〜４０ｍｍであることが望ましい。コニカルな形状を有している部分は、培養容器の底部から１５〜２０ｍｍの範囲である。すなわち、培養容器の上半分は容器径が１０ｍｍの円筒となっている。これにより、細胞同士の接触度合いが高まり、細胞集塊が形成されやすくなる。
【００１５】また、培養容器が多数のサンプルを取扱う場合には、コニカルチューブ１１をラック１９に収納して用いる（図２参照）。このとき、個々のコニカルチューブ１１にスクリュー式の蓋１２が取り付けられていると取り扱いにくいので、シーリングマット１７の片面に所定の間隔に突起物１５を配置した蓋１４を用意し、一括して蓋１４の着脱が可能なようにしてある。上記シーリングマット１７の材質としてはシリコンゴム製が望ましく、その厚さは約０．５ｍｍであればよい。
【００１６】
＜酸素供給の制御＞
ＥＳ細胞は、一般的に細胞培養で用いられる通常の酸素分圧（２０％）を与えても酸素供給が過剰となり、ＥＢが形成されないことがある。したがって、培養容器がスクリュー式の蓋１２を有する場合は、蓋１２の緩め具合を調節することにより、細胞に適量の酸素を供給することができる。シリコンゴム製のシーリングマット１７の片面に所定の間隔に突起物１５を配置した蓋１４においては、シリコンゴムが酸素透過性を有しているので、これで完全に開口部１６をシールしても適度な酸素供給が期待できる。
【００１７】この発明における培養容器は、ポリプロピレンを材質とし、蓋１２もしくは１４を有する丸底（Ｒ＝２ｍｍ）のコニカルチューブ１１である。この培養容器を使用してＥＳ細胞を培養するに当たっては、コニカルチューブ１１内に濃度（２×１０４ｃｅｌｌｓ／ｍｌ）で懸濁したＥＳ細胞を１ｍｌ入れる。ＥＳ細胞に適量の酸素が供給されるよう、スクリュ−式の蓋１２を完全に閉め切らずネジ１周分ほど緩め、炭酸ガスインキュベーター（温度３７℃）内で培養する。炭酸ガスインキュベーターの庫内のガス組成は、一般的に用いられている細胞の培養条件である、２０％酸素−５％炭酸ガスとする。そしてそのまま、５日間培養するとＥＢが形成される。
【００１８】
【実施例】
マウスＥＳ細胞を培養してその胚様体（ＥＢ）を形成させる方法について述べる。
１．培地の調製
Ｉｓｃｏｖｅ’ｓ ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ ｍｅｄｉｕｍ ７６ｍｌに対して、非働化牛胎児血清２０ｍｌ，ＭＥＭ ｓｏｄｉｕｍ ｐｙｒｕｖａｔｅ ｓｏｌｕｔｉｏｎ １ｍｌ，ＭＥＭ ｎｏｎ ｅｓｓｅｎｔｉａｌ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ｓｏｌｕｔｉｏｎ １ｍｌ，β−Ｍｅｒｃａｐｔｏｅｔｈａｎｏｌ ０．８μｌ，Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ− Ｓｔｒｅｐｔｍｙｃｉｎ ０．５ｍｌを加え、総量１００ｍｌのＥＢ形成用培地を作製する。
２．ＥＳ細胞懸濁液
ＳＴＯ（繊維芽）細胞をフィーダーとしてシャーレ面に敷き、このフィーダー上にて定法に従い培養したマウスＥＳ細胞を酵素処理（０．１％ Ｔｒｙｐｓｉｎ）で剥がし、所定個数を回収した後、遠心分離によって酵素溶液を除去する。ここに、ＥＳ細胞の濃度（密度）が２×１０４ｃｅｌｌｓ／ｍｌとなるようにＥＢ形成用培地を加え、良く懸濁する。
そしてこの懸濁液をＥＢ形成用の培養容器に播種して培養するのである。
３．ＥＢ形成培養の条件
スクリュー式の蓋１２を有する丸底（Ｒ＝２ｍｍ）１３のコニカルチューブ１１に、上述のＥＳ細胞の懸濁液１ｍｌを播種し、２０％酸素−５％炭酸ガス雰囲気下、３７℃で５日間静置培養する。通気口を確保するためにスクリュー式の蓋１２をネジ一周分ほど緩めておく。
５日後、図４（ａ），（ｂ）に示したようなＥＢが形成される。形成されたＥＢを、分化を促す条件に移して培養すると、速やかに図５に示す心筋などに分化するのが認められた。
【００１９】
【比較例】ＥＢ形成のための一般的な培養法であるハンギングドロップ法と本発明の培養法を表１に基いて比較する。
【表１】
【００２０】
【発明の効果】
ＥＢ形成のための一般的な培養法であるハンギングドロップ法とこの発明の培養法を比較すると、ハンギングドロップ法ではポリスチレンの９６ ｗｅｌｌマルチウエルプレートが用いられることによって、ＥＳ細胞が容器に付着するのを防ぐため、各ｗｅｌｌに緩衝液１３０μｌとミネラルオイル２００μｌをあらかじめ入れておき、ここに細胞懸濁液を播種する必要があった。
しかしながら、この方法は、図６に示したように極めて煩雑で、操作に熟練を要する。なおハンギングドロップ法でのＥＢ形成率は約８０％であり、ＥＢ形成に要する培養日数は７日間である。
【００２１】他方、この発明の培養法では、容器がポリプロピレン製であるために細胞接着が弱く、オイルを用いなくても細胞が容器に付着することがないので細胞懸濁液を直接培養容器に播種することができる。またこの発明の培養法のＥＢ形成率は９９％、必要培養日数は５日間である。すなわち、短期間でＥＢを高効率で形成することが可能となった。
【００２２】その他、この発明の培養法に特徴的なことは、ＥＢ形成可能な細胞数の範囲が広いことである。すなわち、この発明の培養法では容器（ｗｅｌｌ）当たり、２×１０４〜２×１０５個の細胞を培養してＥＢを形成させることができるのに対し、ハンギングドロップ法では各ｗｅｌｌ当たりの培養可能な細胞数は１０３個である。すなわち、この発明の培養法ではより多くの細胞が集塊することによりＥＢが形成されるので、より大きなサイズのＥＢが形成できる。このことは、その後ＥＢを分化させて、特定の組織を形成させる際に極めて有利に作用する。
【図面の簡単な説明】
【図１】この発明の胚性幹細胞（ＥＳ細胞）の胚様体（ＥＢ）形成のための培養容器の要部を説明するための説明図である。
【図２】その全体の概要を示す斜視図である。
【図３】その概略断面図である。
【図４】（ａ），（ｂ）は形成されたＥＢを示す。
【図５】形成されたＥＢを、分化を促す条件に移して培養して得た心筋を示す。
【図６】ＥＳ細胞を培養してＥＢを形成する際に用いられてきた、従来の「ハンギングドロップ法による培養法の説明図である。
【符号の説明】
１０ マルチウエルプレート
１１ コニカルチューブ
１２ スクリュー式の蓋
１３ 丸底
１４ 蓋
１５ 突起物
１６ 開口部
１７ シーリングマット
１８ 自立スタンド
１９ ラック[0001]
The present invention relates to a culture vessel and a culture method used for forming embryoid bodies (EBs) of embryonic stem cells (ES cells).
[0002]
2. Description of the Related Art In culturing embryonic stem cells (hereinafter referred to as ES cells) to form embryoid bodies (hereinafter referred to as EBs), a culture method called "hanging drop method" has conventionally been used.
As shown in FIG. 6, the hanging drop method is usually performed using a 96-well polystyrene multi-well plate (dish) 21 in the following procedure. Each well 22 of the multi-well plate 21 is filled with about 130 μl of the buffer 23 and about 200 μl of the mineral oil 24. About 50 μl of a medium 26 containing ES cells (1000 cells) is dropped on the lid 25 side at a position corresponding to each well 22 so as to form droplets. Utilizing the fact that the droplet adheres to the lid with surface tension, the multiwell plate 21 is covered with the lid 25, and the culture is performed gently.
However, the above operation is complicated, and the conditions of the 96 wells 22 are not constant. For this reason, the formation rate of EB27 to be obtained is low, and the quality of EB27 formed is also unstable.
[0003]
[Patent Literature] Nothing particularly helpful.
[0004]
[Non-patent literature] There is no particular reference.
[0005]
As described above, the hanging drop method, which is a culture method for forming EBs from ES cells, has problems that the operation is complicated and the EB formation rate is low. The quality of the formed EB is also unstable. For this reason, the degree of subsequent EB differentiation tends to be uneven. The present invention provides a culture container and a culture method for embryoid body (EB) formation of embryonic stem cells (ES cells), which can easily and efficiently form qualitatively stable EBs from ES cells. It is what we are going to offer.
[0006]
In other words, a culture vessel for forming embryoid bodies (EBs) of embryonic stem cells (ES cells) according to the present invention is made of polypropylene as a material of the vessel, and the ES cells adhere to the vessel during culture. The shape of the container is conical (conical), the diameter of which decreases as the container goes down, so that the cells can be easily gathered in one place. The present invention is characterized in that EBs can be efficiently formed by enabling culturing in a state where cell clumps are formed in a container.
[0007] Further, the culture method of the present invention for forming embryoid bodies (EBs) of embryonic stem cells (ES cells) is made of a material made of polypropylene so that the cells can be easily aggregated in one place. The conical shape (conical shape) in which the diameter of the container becomes smaller as it goes down, uses a rounded container at the bottom, and keeps the ES cells inside the container while avoiding the ES cells from adhering to the inside of the container. The method is also characterized in that EBs can be formed efficiently by culturing in a state where cell clumps have been formed.
[0008] Since the formation of EBs by ES cells is easily affected by the oxygen supply conditions, even under the oxygen partial pressure (20%) generally used in cell culture, oxygen supply becomes excessive and EB formation occurs. May not be done. This seems to be one of the causes of the decrease in the EB formation rate in the hanging drop method.
On the other hand, the culture vessel of the present invention has a conical shape made of polypropylene. In other words, by using polypropylene as the material of the container, it is possible to avoid ES cells from adhering to the container during culture, and to adjust the shape of the container so that the cells are easily collected in one place. The conical shape (conical shape), which becomes smaller as it goes down, is rounded at the bottom, so that ES cells can be cultured in a state where cell clumps are formed in the container, and very efficiently An EB can be formed.
[0010]
BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION Hereinafter, embodiments of a culture vessel and a culture method for forming embryoid bodies (EBs) of embryonic stem cells (ES cells) of the present invention will be described in detail with reference to the drawings.
FIG. 1 is an explanatory view for explaining a main part of a culture vessel for forming embryoid bodies (EBs) of embryonic stem cells (ES cells) of the present invention, and FIG. 2 is a perspective view showing an outline of the whole. 3 is a schematic sectional view thereof.
FIGS. 1 to 3 show a culture vessel for forming embryoid bodies (EBs) of embryonic stem cells (ES cells) of the present invention.
<Material of culture vessel>
In order to form EBs by culturing the ES cells, it is necessary to prevent the ES cells from attaching to the culture vessel during the culture. For this reason, the material of the culture vessel is made of polypropylene.
<Shape of culture vessel>
The shape of the culture vessel is a conical cylindrical tube having a round bottom (R = 2 m) 13 having a screw-type lid 12 as shown in FIG. 1 (total volume is about 1.5 ml or less, referred to as a conical tube). 11 can be each unit well. The overall view of the culture vessel is, for example, a 96-well multi-well plate 10 as shown in FIGS.
Each well composed of the conical tubes 11 in the 96-well multi-well plate 10 has a lid not of the above-mentioned screw type but of the above-mentioned type in order to simplify the operation when handling many samples at once. As shown in FIG. 3, the opening 16 of each well may be simply closed with the lid 14 in which the projections 15 are arranged at predetermined intervals.
However, when the opening 16 is completely closed, the ventilation is completely shut off and oxygen is not supplied to the cells. Therefore, the diameter of the projection 15 is designed to be slightly smaller than that of the opening 16 as shown in FIG. I have. The projections 15 can suppress an excessive supply of oxygen. On the other hand, in the conical tube 11 having the screw-type lid 12, the lid 12 is loosened by one turn of the screw to perform the culture in order to secure the vent. By this operation, an appropriate amount of oxygen is supplied to the cells.
More specifically, the shape of the culture vessel will be described. In order for ES cells to become EBs, cell clumps must be formed. In other words, the shape of the culture vessel is a conical cylindrical tube, that is, a conical tube 11 (total volume is about 1.5 ml) so that the cells are easily aggregated at one place to form an agglomerate. Has a screw-type lid 12 attached thereto (see FIG. 1). Reference numeral 18 denotes an independent stand. It is desirable that the diameter of the opening 16 is 10 mm, the bottom is a round bottom 13 with R = 2 mm, and the depth is 30 to 40 mm. The portion having a conical shape is in a range of 15 to 20 mm from the bottom of the culture vessel. That is, the upper half of the culture vessel is a cylinder having a vessel diameter of 10 mm. Thereby, the degree of contact between cells is increased, and cell clumps are easily formed.
When the culture vessel handles a large number of samples, the conical tube 11 is housed in a rack 19 for use (see FIG. 2). At this time, if the screw-type lids 12 are attached to the individual conical tubes 11, it is difficult to handle. Therefore, the lids 14 having the projections 15 arranged at predetermined intervals on one surface of the sealing mat 17 are prepared, and the 14 can be attached and detached. The material of the sealing mat 17 is desirably made of silicone rubber, and its thickness may be about 0.5 mm.
[0016]
<Control of oxygen supply>
Even when ES cells are supplied with a normal oxygen partial pressure (20%) generally used in cell culture, oxygen supply becomes excessive and EBs may not be formed. Therefore, when the culture vessel has the screw-type lid 12, an appropriate amount of oxygen can be supplied to the cells by adjusting the degree of loosening of the lid 12. In the lid 14 in which the projections 15 are arranged at predetermined intervals on one surface of a silicone rubber sealing mat 17, since the silicon rubber has oxygen permeability, the opening 16 can be completely sealed with this. An appropriate supply of oxygen can be expected.
The culture vessel in the present invention is a conical tube 11 made of polypropylene and having a round bottom (R = 2 mm) having a lid 12 or 14. When culturing ES cells using this culture vessel, 1 ml of ES cells suspended at a concentration (2 × 10 4 cells / ml) in the conical tube 11 is added. In order to supply an appropriate amount of oxygen to the ES cells, the screw-type lid 12 is not completely closed, but is loosened by one turn, and the cells are cultured in a carbon dioxide gas incubator (temperature: 37 ° C.). The gas composition in the chamber of the carbon dioxide incubator is 20% oxygen-5% carbon dioxide, which is a commonly used cell culture condition. Then, when the cells are cultured for 5 days, EBs are formed.
[0018]
【Example】
A method for culturing mouse ES cells to form embryoid bodies (EBs) will be described.
1. Preparation of culture medium For 76 ml of Iscove's modified Dulbecco's medium, 20 ml of inactivated fetal bovine serum, 1 ml of MEM sodium pyruvate solution, 1 ml of MEM non-essential amino acid solution. To prepare an EB formation medium having a total volume of 100 ml.
2. ES cell suspension STO (fibroblast) cells were spread on a petri dish as a feeder, and mouse ES cells cultured on this feeder according to a standard method were peeled off by enzyme treatment (0.1% Trypsin), and a predetermined number was collected. Remove the enzyme solution by centrifugation. Here, a medium for EB formation is added so that the concentration (density) of the ES cells becomes 2 × 10 4 cells / ml, and the cells are well suspended.
Then, the suspension is seeded in a culture vessel for EB formation and cultured.
3. Conditions for EB Forming Culture 1 ml of the above-mentioned ES cell suspension was inoculated into a conical tube 11 having a round bottom (R = 2 mm) 13 having a screw-type lid 12, and under a 20% oxygen-5% carbon dioxide gas atmosphere. Incubate at 37 ° C for 5 days. In order to secure the ventilation hole, the screw-type lid 12 is loosened by one turn of the screw.
After 5 days, EBs as shown in FIGS. 4A and 4B are formed. When the formed EBs were transferred to conditions for promoting differentiation and cultured, it was recognized that the EBs rapidly differentiated into the myocardium and the like shown in FIG.
[0019]
Comparative Example The hanging drop method, which is a general culture method for EB formation, and the culture method of the present invention are compared based on Table 1.
[Table 1]
[0020]
【The invention's effect】
When the hanging drop method, which is a general culture method for forming EBs, is compared with the culture method of the present invention, the hanging drop method uses a polystyrene 96-well multiwell plate, so that ES cells adhere to the container. To prevent this, 130 μl of buffer solution and 200 μl of mineral oil were previously added to each well, and it was necessary to inoculate the cell suspension therewith.
However, this method is extremely complicated as shown in FIG. 6 and requires skill in operation. The EB formation rate by the hanging drop method is about 80%, and the number of culture days required for EB formation is 7 days.
On the other hand, in the culture method of the present invention, the cell adhesion is weak because the container is made of polypropylene, and the cells do not adhere to the container without using oil. Can be sown. The EB formation rate of the culture method of the present invention is 99%, and the required number of culture days is 5 days. That is, EB can be formed with high efficiency in a short period of time.
Another characteristic of the culture method of the present invention is that the range of the number of cells capable of forming EBs is wide. That is, in the culture method of the present invention, EBs can be formed by culturing 2 × 10 4 to 2 × 10 5 cells per container (well), whereas in the hanging drop method, culturing per well is performed. possible number of cells is 10 3. That is, in the culture method of the present invention, EBs are formed by aggregating more cells, so that EBs having a larger size can be formed. This has a very advantageous effect on the subsequent differentiation of the EB to form a specific tissue.
[Brief description of the drawings]
FIG. 1 is an explanatory diagram for explaining a main part of a culture container for forming embryoid bodies (EBs) of embryonic stem cells (ES cells) of the present invention.
FIG. 2 is a perspective view showing an outline of the whole.
FIG. 3 is a schematic sectional view thereof.
FIGS. 4A and 4B show EBs formed.
FIG. 5 shows a myocardium obtained by transferring the formed EBs to conditions that promote differentiation and culturing them.
FIG. 6 is an explanatory diagram of a conventional “hanging drop culture method” that has been used when culturing ES cells to form EBs.
[Explanation of symbols]
Reference Signs List 10 Multiwell plate 11 Conical tube 12 Screw-type lid 13 Round bottom 14 Lid 15 Projection 16 Opening 17 Sealing mat 18 Self-standing stand 19 Rack
