JP2004254593A

JP2004254593A - Heat-resistant aminopeptidase

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Publication number: JP2004254593A
Application number: JP2003048763A
Authority: JP
Inventors: Kazuhiko Ishikawa; 一彦石川; Kazushige Mori; 一茂森
Original assignee: National Institute of Advanced Industrial Science and Technology AIST
Current assignee: National Institute of Advanced Industrial Science and Technology AIST
Priority date: 2003-02-26
Filing date: 2003-02-26
Publication date: 2004-09-16

Abstract

<P>PROBLEM TO BE SOLVED: To provide aminopeptidases higher in molecular activity than ever and capable of splitting both of peptides or proteins with the N-terminals acylated and nonacylated respectively. <P>SOLUTION: The heat-resistant aminopeptidases are expressed products respectively from two genes encoding the aminopeptidases respectively that are isolated from a Pyrococcus horikoshii JCM 9974 strain. Each of These expressed products has such an aminopeptidase activity as to be ≥200/s in molecular activity on Ala-Ala-Ala at 85°C and pH 7.5, also having the activity of splitting the peptide or protein with the N-terminal acylated. There remain 95% and 90% activities in these enzymes respectively when subjected to heat treatment at 98°C for one hour. <P>COPYRIGHT: (C)2004,JPO&NCIPI

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ペプチド又はタンパク質のＮ−末端分析、ペプチド又はタンパク質の分解によるアミノ酸の製造などに用いられるアミノペプチダーゼ、それをコードするポリヌクレオチド等に関する。
【０００２】
【従来の技術】
従来、ペプチド又はタンパク質のＮ−末端分析には、これらのアミノ酸をＮ−末端から順次遊離するアミノペプチダーゼを用いたエドマン分解法が利用されている。また、アミノペプチダーゼは、ペプチド又はタンパク質の分解によるアミノ酸の製造にも利用されている。
【０００３】
ここで、生体内のポリペプチド又はタンパク質は、プロテアーゼによる分解から自身を保護するためにＮ−末端のアミノ基がアシル化されているものが多い。従って、アシル化されたポリペプチド又はタンパク質の分析やこれらを原料とするアミノ酸の製造には、アシルペプチド加水分解酵素が使用される。
【０００４】
従来は哺乳動物由来の易熱性のアシルペプチド加水分解酵素が用いられている。しかし、耐熱性のアシルペプチド加水分解酵素を用いて、アシルペプチドの加水分解反応を高温で行うことができれば、その分高濃度の基質溶液を用いることができ反応効率がよく、また混入微生物又は夾雑酵素による影響を抑えることができる。
【０００５】
このような耐熱性のアシルペプチド加水分解酵素として、本発明者は、特許文献１において、パイロコッカスホリコシ（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓｈｏｒｉｋｏｓｈｉｉ）から単離されたアミノペプチダーゼであって、Ｎ−ブロックペプチド及びＮ−ブロックされていないペプチドのＮ末端から順次アミノ酸を遊離する反応及び遮断基自身を分解する反応の双方を触媒する耐熱性アミノペプチダーゼを開示している。この酵素は、９０℃で数時間処理しても活性が殆ど低下せず、至適温度はｐＨ７．５で約９５℃である。しかし、この酵素は、アミノペプチダーゼの分子活性が１０（１／秒間）と比較的低い。
【０００６】
また、特許文献２は、パイロコッカスホリコシから単離されたアシルペプチド加水分解酵素であって、ｐＨ７．５の下での至適温度が９０〜９５℃であり、９５℃で３時間加熱しても活性を失わない耐熱性アシルペプチド加水分解酵素を開示している。しかし、この酵素は、Ｎ−末端がアシル化されたペプチド又はタンパク質からアシルアミノ酸を遊離する反応のみを触媒するものであり、基質特異性が低い。
【０００７】
【特許文献１】
特開２０００−２４５４８０号（段落００１１、００１２など）
【０００８】
【特許文献２】
特開平１０−２１０９７７号（段落０００８、０００９、００２３など）
【０００９】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、Ｎ−末端がアシル化されたペプチド又はタンパク質及びＮ−末端がアシル化されていないペプチド又はタンパク質の双方を分解できる耐熱性アミノペプチダーゼであって、従来より分子活性の高い耐熱性アミノペプチダーゼを提供することを主目的とする。
【００１０】
【課題を解決するための手段】
前記目的を達成するために本発明者は、９０〜１００℃の環境下で生育する超好熱性始原菌に着目し、ＰｙｒｏｃｏｃｃｕｓｈｏｒｉｋｏｓｈｉｉＪＣＭ９９７４株（理化学研究所微生物系統保存施設（ＪＣＭ）番号９９７４）からアシルアミノペプチダーゼ遺伝子をクローニングし、そのアシルアミノペプチダーゼが、８５℃、ｐＨ７．５の環境中で、Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｌａに対する分子活性が２００（１／秒間）以上であるアミノペプチダーゼ活性を有するとともに、Ｎ−末端がアシル化されたペプチド又はタンパク質、及び、Ｎ−末端がアシル化されていないペプチド又はタンパク質の双方を分解できる耐熱性アミノペプチダーゼであることを見出した。また、この酵素が、９８℃で１時間の熱処理によっても９０％以上のアミノペプチダーゼ活性が残存する極めて耐熱性の高い酵素であることを見出した。
【００１１】
本発明は前記知見に基づき完成されたものであり、以下の耐熱性アミノペプチダーゼ等を提供する。
【００１２】
項１．以下の（ａ）及び（ｂ）の性質を有する耐熱性アミノペプチダーゼ。
（ａ）８５℃、ｐＨ７．５の環境中で、Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｌａに対する分子活性（１秒間に１分子の酵素が作用する基質の分子数）が２００（１／秒間）以上であるアミノペプチダーゼ活性を有する。
（ｂ）Ｎ−末端がアシル化されたペプチド又はタンパク質を分解する活性も有する。
【００１３】
項２．以下の（ｃ）及び（ｄ）の性質を備える項１に記載の耐熱性アミノペプチダーゼ。
（ｃ）９８℃で１時間の熱処理により９０％以上のアミノペプチダーゼ活性が残存する。
（ｄ）ｐＨ７．５の下で、アミノペプチダーゼ活性の至適温度が１００℃以上である。
【００１４】
項３．パイロコッカスホリコシ（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓｈｏｒｉｋｏｓｈｉｉ）由来の酵素である項１又は２に記載の耐熱性アミノペプチダーゼ。
【００１５】
項４．以下の（１）又は（２）のポリペプチド。
（１）配列番号２に示すアミノ酸配列からなるポリペプチド。
（２）配列番号２において、１又は２以上のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、８５ ℃、ｐＨ７．５の環境中でＡｌａ−Ａｌａ−Ａｌａに対する分子活性が２００（１／秒間）以上であるアミノペプチダーゼ活性を有し、Ｎ−末端がアシル化されたペプチド又はタンパク質を分解する活性も有するポリペプチド。
【００１６】
項５．以下の（３）、（４）又は（５）のポリヌクレオチド。
（３）配列番号１に示す塩基配列からなるポリヌクレオチド。
（４）配列番号１に示す塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、８５℃、ｐＨ７．５の環境中でＡｌａ−Ａｌａ−Ａｌａに対する分子活性が２００（１／秒間）以上であるアミノペプチダーゼ活性を有し、Ｎ−末端がアシル化されたペプチド又はタンパク質を分解する活性も有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
（５）項４に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
【００１７】
項６．以下の（６）又は（７）のポリペプチド。
（６）配列番号４に示すアミノ酸配列からなるポリペプチド。
（７）配列番号４において、１又は２以上のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、８５℃、ｐＨ７．５の環境中でＡｌａ−Ａｌａ−Ａｌａに対する分子活性が２００（１／秒間）以上であるアミノペプチダーゼ活性を有し、Ｎ−末端がアシル化されたペプチド又はタンパク質を分解する活性も有するポリペプチド。
【００１８】
項７．以下の（８）、（９）又は（１０）のポリヌクレオチド。
（８）配列番号３に示す塩基配列からなるポリヌクレオチド。
（９）配列番号３に示す塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、８５℃、ｐＨ７．５の環境中でＡｌａ−Ａｌａ−Ａｌａに対する分子活性が２００（１／秒間）以上であるアミノペプチダーゼ活性を有し、Ｎ−末端がアシル化されたペプチド又はタンパク質を分解する活性も有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
（１０）項６に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
【００１９】
項８．項５又は７に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
【００２０】
項９．項８に記載のベクターを保持する形質転換体。
【００２１】
項１０．項９に記載の形質転換体を培養し、その形質転換体から耐熱性アミノペプチダーゼを回収する方法。
【００２２】
【発明の実施の形態】
以下、本発明を詳細に説明する。
（１）耐熱性アミノペプチダーゼ
本発明の耐熱性アミノペプチダーゼは、８５℃、ｐＨ７．５の環境中でＡｌａ−Ａｌａ−Ａｌａに対する分子活性が２００（１／秒間）以上であるアミノペプチダーゼ活性を有するとともに、Ｎ−末端がアシル化されたペプチド又はタンパク質を分解する活性も有する酵素である。
活性
本発明において、分子活性とは、１秒間に１分子の酵素が作用する基質の分子数をいう。本発明のアミノペプチダーゼは、８５℃、ｐＨ７．５の環境中でＡｌａ−Ａｌａ−Ａｌａに対する分子活性が２００（１／秒間）以上のアミノペプチダーゼ活性を有する酵素である。同様の環境中でＡｌａ−Ａｌａ−Ａｌａに対する分子活性が２２０（１／秒間）以上のアミノペプチダーゼ活性を有する酵素であることが好ましい。
【００２３】
本発明においてアミノペプチダーゼ活性は実施例に記載の方法により測定した値である。すなわち、Ｎ−末端がアシル化されていないＡｌａ−Ａｌａ−Ａｌａを基質として用いて測定した値である。
基質特異性
本発明のアミノペプチダーゼは、Ｎ−末端がアシル化されていないペプチド又はタンパク質のＮ−末端からアミノ酸を順次加水分解により遊離する活性を有する。但し、プロリン及びプロリンの１残基手前に存在するアミノ酸は遊離しない。また、Ｎ−末端がアシル化されたペプチド又はタンパク質についても同様に、Ｎ−末端からアミノ酸を順次加水分解により遊離する活性を有する。但し同様に、プロリン及びプロリンの１残基手前に存在するアミノ酸は遊離しない。いずれの場合もペプチド又はタンパク質のアミノ酸数は問わない。
【００２４】
また本発明のアミノペプチダーゼは、Ｎ−末端のアシル基がアセチル基であるペプチド又はタンパク質、すなわちＮ−アセチル化ペプチド又はタンパク質を分解することができる。
【００２５】
さらに、Ｒが炭素数１〜２０の脂肪族炭化水素又は芳香族炭化水素であるようなＲＣＯ−基がＮ−末端アミノ基に導入されたＮ−アシルペプチド又はタンパク質であれば分解できるものであることが好ましい。また、アシル基自体を分解できる酵素であることがより好ましい。
【００２６】
また本発明のアミノペプチダーゼは、その他に、Ｄ型のアミノ酸等がＮ−末端に導入されたペプチド又はタンパク質を分解できるものであることがより好ましい。この場合も保護基自体を分解できる酵素であることがより好ましい。
耐熱性
本発明のアミノペプチダーゼは非常に耐熱性に優れる酵素であり、９８℃で１時間熱処理した場合に９０％以上のアミノペプチダーゼ活性が残存する酵素である。特に、９８℃で１時間熱処理した場合に９５％以上のアミノペプチダーゼ活性が残存する酵素であることが好ましい。
【００２７】
また本発明のアミノペプチダーゼは、９８℃で２時間熱処理した場合に７５％以上、特に８５％以上のアミノペプチダーゼ活性が残存する酵素であることが好ましい。
【００２８】
また本発明のアミノペプチダーゼは、酵素反応を行う緩衝液の種類によっても異なるが、酵素反応の初速度を測定した場合の至適温度がｐＨ７．５の環境中で１００℃以上、特に１０５℃以上の酵素であることが好ましい。
常温での安定性
本発明のアミノペプチダーゼは常温下での安定性にも勿論優れており、常温２５℃で３０日間以上放置しても実質的に活性が低下しないことが好ましい。実質的に活性が低下しないとは、通常９０％以上の活性が残存することをいう。
有機溶媒耐性
本発明のアミノペプチダーゼは、有機溶媒に耐性である。例えば、エタノール、ブタノール、テトラヒドロフラン、酢酸エチル等の有機溶媒を２０容量％以上含む緩衝液中で活性を示す酵素であることが好ましい。本発明のアミノペプチダーゼが酵素活性を示し得る、緩衝液中の有機溶媒の容量比率の上限は、酵素蛋白が沈殿しない範囲である。
生産細菌
本発明のアミノペプチダーゼの由来は特に限定されないが、好熱性細菌、例えばパイロコッカス（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ）属、アエロパイラム（Ａｅｒｏｐｙｒｕｍ）属、サーモコッカス（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ）属、スフォロバス（Ｓｕｆｏｌｏｂｕｓ）属、サーモプラズマ（Ｔｈｅｒｍｏｐｌａｓｍａ）属、サーモプロテウス（Ｔｈｅｒｍｏｐｒｏｔｅｕｓ）属、マスティゴクラダス（Ｍａｓｔｉｇｏｃｌａｄｕｓ）属、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属、シネココッカス（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ）属又はサーマス（Ｔｈｅｒｍｕｓ）属等の細菌により生産されたものが挙げられる。特に、超好熱性古細菌パイロコッカスホリコシにより生産されたものが好ましい。
アミノ酸配列
また、本発明のアミノペプチダーゼとしては、例えば以下の（１）又は（２）のアミノ酸配列を有するポリペプチド（第１のポリペプチド）が挙げられる。
（１）配列番号２に示すアミノ酸配列からなるポリペプチド。
（２）配列番号２において、１又は２以上のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｌａに対する分子活性が２００（１／秒間）以上のアミノペプチダーゼ活性を有し、Ｎ−末端がアシル化されたペプチド又はタンパク質を分解する活性も有するポリペプチド。
【００２９】
また、本発明のアミノペプチダーゼとしては、例えば以下の（６）又は（７）のアミノ酸配列を有するポリペプチド（第２のポリペプチド）も挙げられる。
（６）配列番号４に示すアミノ酸配列からなるポリペプチド。
（７）配列番号４において、１又は２以上のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｌａに対する分子活性が２００（１／秒間）以上のアミノペプチダーゼ活性を有し、Ｎ−末端がアシル化されたペプチド又はタンパク質を分解する活性も有するポリペプチド。
【００３０】
（２）のポリペプチドは、配列番号２のアミノ酸配列において、１￣１２０個程度、特に１￣５０個程度のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチドであることが好ましいが、Ｎ−末端がアシル化されたペプチド又はタンパク質を分解する活性も有するアミノペプチダーゼ間で保存されていない領域であれば、配列番号２のアミノ酸配列を、全アミノ酸数の３０％以下の範囲で改変したものであってよい。
【００３１】
同様に（７）のポリペプチドは、配列番号４のアミノ酸配列において、１￣１２０個程度、特に１￣５０個程度のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチドであることが好ましいが、Ｎ−末端がアシル化されたペプチド又はタンパク質を分解する活性も有するアミノペプチダーゼ間で保存されていない領域であれば、配列番号４のアミノ酸配列を、全アミノ酸数の３０％以下の範囲で改変したものであってよい。
【００３２】
具体的には、例えばアミノ酸の置換の場合には、タンパク質の構造保持の観点から、極性、電荷、可溶性、親水性／疎水性等の点で、置換前のアミノ酸と類似した性質を有するアミノ酸に置換することができる。例えば、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリンは非極性アミノ酸に分類され；セリン、トレオニン、システイン、メチオニン、アスパラギン、グルタミンは極性アミノ酸に分類され；フェニルアラニン、チロシン、トリプトファンは芳香族側鎖を有するアミノ酸に分類され；リジン、アルギニン、ヒスチジンは塩基性アミノ酸に分類され；アスパラギン酸、グルタミン酸は酸性アミノ酸に分類される。従って、同じ群のアミノ酸から選択して置換することができる。
【００３３】
また、アミノ酸の置換により側鎖が小さくなる場合は、ポリペプチドの３次元構造が変化し難く、それにより活性が変化し難いため、配列番号２又は４のアミノ酸配列についてこのような置換を行うことにより（２）又は（７）のポリペプチドを得ることができる。
【００３４】
本発明のアミノペプチダーゼは、例えば、この酵素を生産する細菌を培養し、菌体破砕液から回収又はさらに精製することにより得られる。また、配列番号２又は４のアミノ酸配列を基に化学的に合成することによっても得ることができる。また、後述する本発明方法によっても得ることができる。
（２）ポリヌクレオチド
本発明の第１のポリヌクレオチドは以下の（３）、（４）又は（５）のポリヌクレオチドである。（３）の配列番号１の塩基配列からなるポリヌクレオチドは、（１）の配列番号２のポリペプチドをコードするものである。
（３）配列番号１に示す塩基配列からなるポリヌクレオチド。
（４）配列番号１に示す塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｌａに対する分子活性が２００（１／秒間）以上のアミノペプチダーゼ活性を有し、Ｎ−末端がアシル化されたペプチド又はタンパク質を分解する活性も有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
（５）上記（１）又は（２）のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
【００３５】
また、本発明の第２のポリヌクレオチドは以下の（８）、（９）又は（１０）のポリヌクレオチドである。（８）の配列番号３の塩基配列からなるポリヌクレオチドは、（６）の配列番号４のポリペプチドをコードするものである。
（８）配列番号３に示す塩基配列からなるポリヌクレオチド。
（９）配列番号３に示す塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｌａに対する分子活性が２００（１／秒間）以上のアミノペプチダーゼ活性を有し、Ｎ−末端がアシル化されたペプチド又はタンパク質を分解する活性も有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
（１０）上記（６）又は（７）のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
【００３６】
（３）のポリヌクレオチドは、配列番号２のアミノ酸配列において１〜１２０個程度、特に１〜５０個程度のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドであることが好ましい。しかし、Ｎ−末端がアシル化されたペプチド又はタンパク質を分解する活性も有するアミノペプチダーゼ間で保存されていない領域であればであれば、配列番号２のアミノ酸配列を全アミノ酸数の４０％以下の範囲で改変したポリペプチドをコードするポリヌクレオチドであってよい。
【００３７】
同様に（８）のＤＮＡは、配列番号４のアミノ酸配列において１〜１２０個程度、特に１〜５０個程度のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドであることが好ましい。しかし、Ｎ−末端がアシル化されたペプチド又はタンパク質を分解する活性も有するアミノペプチダーゼ間で保存されていない領域であればであれば、配列番号４のアミノ酸配列を全アミノ酸数の４０％以下の範囲で改変したポリペプチドをコードするポリヌクレオチドであってよい。
【００３８】
本発明のポリヌクレオチドには、特に言及しない限り、その塩基配列を有するポリヌクレオチドの他、それに相補的なポリヌクレオチドが含まれる。また、本発明のポリヌクレオチドにはＤＮＡ及びＲＮＡの双方が含まれる。また、本発明の目的を達成できる範囲であれば修飾されたＤＮＡ（例えばホスホロチオエートＤＮＡ、Ｈ−ホスホネートＤＮＡなど）及び修飾されたＲＮＡも含まれる。さらに、１本鎖ポリヌクレオチド、２本鎖ポリヌクレオチドの双方が含まれ、２本鎖ポリヌクレオチドには、ＤＮＡ・ＲＮＡハイブリッドも含まれる。
【００３９】
本発明において、「ストリンジェントな条件」とは、例えば、通常のハイブリダイゼーション溶液中であれば６８℃で行う条件が挙げられ、５０％フォルムアミドを含むハイブリダイゼーション溶液中であれば４２℃で行う条件が挙げられる。詳しくは、ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ第２版第２巻に記載のサザンハイブリダイゼーションに用いられる条件が挙げられる。
【００４０】
本発明のポリヌクレオチドは、例えばパイロコッカス属、アエロパイラム属、スフォロバス属、サーモプラズマ属、サーモプロテウス属、マスティゴクラダス属、バチルス属、シネココッカス属、サーマス属等の好熱性細菌の染色体ＤＮＡのライブラリーから、配列番号１又は３に基づき設計したプローブを用いてハイブリダイゼーションにより単離することができる。また、配列番号１又は３の塩基配列を基に設計したプライマーを用いて、例えば上記好熱性細菌の染色体ＤＮＡライブラリーを鋳型にしてＰＣＲ法により増幅することもできる。また、化学合成によっても取得できる。
【００４１】
また、（４）又は（９）の変異したポリヌクレオチドは、化学合成法、遺伝子工学的手法、突然変異誘発法などの公知の方法で作成することができる。遺伝子工学的手法としては、（３）又は（８）のＤＮＡリガーゼ遺伝子に対して、エキソヌクレアーゼを用いたヌクレオチド欠失導入、リンカー導入、位置指定突然変異導入、変異プライマーを用いたＰＣＲ法による塩基配列の改変などを行う方法が挙げられる。
（３）ベクター
本発明のベクターは、上記説明した本発明の第１のポリヌクレオチド（ここではＤＮＡ）又は第２のポリヌクレオチド（ここではＤＮＡ）を含有する組換えベクターである。本発明のＤＮＡが組み込まれるベクターは公知のものを広く利用でき、細菌用ベクターの他、酵母用ベクター、動物細胞用ベクター等も利用できる。酵素の生産効率の点から、通常は細菌用ベクターを用いればよい。公知のベクターとしては、大腸菌ベクターのｐＢＲ３２２、ｐＵＣ１９、ｐＫＫ２３３−２等、バチルス属細菌ベクターのｐＵＢ１１０、ｐＣ１９４、ｐＥ１９４、ｐＴＨＴ１５、ｐＢＤ１６等、酵母用ベクターＹｉｐ５、Ｙｒｐ１７、Ｙｅｐ２４等、動物細胞用ベクターｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９、Ｍ１３ｍｐ１８等を例示できる。
（４）形質転換体
また、本発明の形質転換体は、上記説明した本発明の組換えベクターを保持する形質転換体である。宿主としては、ベクターに応じて細菌、酵母、動物細胞等を利用できる。宿主としては、バチルスズブティリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓ）、バチルスブレビス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｂｒｅｖｉｓ）、酵母、カビ等が、大量に目的タンパク質を生産できる点で好ましい。形質転換は、リン酸カルシウム法、プロトプラスト法、エレクトロポレーション法、スフェロプラスト法、酢酸リチウム法、リポフェクション法、マイクロインジェクション法等の公知の方法で行うことができる。これらの公知の方法の中から、宿主の種類に応じて選択すればよい。
（５）アミノペプチダーゼの製造方法
本発明のアミノペプチダーゼの製造方法は、本発明の形質転換体を培養し、この形質転換体からアミノペプチダーゼを回収する方法である。
【００４２】
培養条件は、特に限定されず、宿主の生育が可能な培地、温度等の条件下で培養すればよい。培養時間は、その他の培養条件により異なるが、通常１２〜２４時間程度とすればよい。温度シフト型やＩＰＴＧ（Ｉｓｏｐｒｏｐｙｌ−ｂ−Ｄ−ｔｈｉｏｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ）誘導型等の誘導型の発現ベクターを用いる場合は、誘導時間は２〜１２時間程度とすればよい。
【００４３】
目的とするアミノペプチダーゼが宿主細胞内又はペリプラズム内に生産される場合は、超音波処理や界面活性剤処理などの公知の細胞破壊方法により細胞を破壊してアミノペプチダーゼを回収すればよい。宿主がアミノペプチダーゼを分泌する場合は、培地中に分泌されたアミノペプチダーゼを回収すればよい。
【００４４】
回収されたアミノペプチダーゼをさらに精製する場合は、遠心分離、塩析、溶媒沈殿法、透析法、限外ろ過法、ゲルろ過法、イオン交換クロマトグラフィー法、アフィニティクロマトグラフィー法、逆相高速液体クロマトグラフィー法等の公知のタンパク質精製方法を組み合わせて精製することができる。
【００４５】
本発明の耐熱性アミノペプチダーゼを精製する場合、精製ステップの一つとして、熱処理を行うことが好ましい。熱処理は、宿主の生育限界温度より通常１０℃以上、特に１５℃以上高い温度で、かつ、当該熱処理により本発明のアミノペプチダーゼの活性が６０〜８０％程度残存する温度である６０〜１００℃程度の温度で、１０〜６０分間程度行うことが効率的である。これにより、目的とするアミノペプチダーゼを殆ど失活させることなく、宿主が生産する夾雑タンパク質を変性により失活させることができる。この加熱処理後に、被精製酵素溶液を、特に限定されないが、例えば１５０００ｒｐｍ程度で２０分間程度遠心することにより変性した夾雑タンパク質を沈殿させることができる。この加熱処理工程は、精製のいずれの段階で行ってもよい。これにより耐熱性アミノペプチダーゼの精製度を飛躍的に向上させることができる。
【００４６】
【実施例】
以下、本発明を実施例を示してより詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されない。
実施例１（ＰｙｒｏｃｏｃｃｕｓｈｏｒｉｋｏｓｈｉｉＪＣＭ９９７４株のアミノペプチダーゼ遺伝子のクローニング）
ｉ）細菌の培養
１３．５ｇの食塩、４ｇのＮａ_２ＳＯ_４、０．７ｇのＫＣｌ、０．２ｇのＮａＨＣＯ_３、０．１ｇのＫＢｒ、３０ｍｇのＨ_３ＢＯ_３、１０ｇのＭｇＣｌ_２・６Ｈ_２Ｏ、１．５ｇのＣａＣｌ_２、２５ｍｇのＳｒＣｌ_２、１．０ｍｌのレザスリン溶液（０．２ｇ／Ｌ）、１．０ｇの酵母エキス、５ｇのバクトペプトンを１Ｌの水に溶かした液体培地を調製し、この溶液のｐＨを６．８に調整した後、加圧殺菌した。次いで、乾熱滅菌した元素硫黄を０．２重量％となるように加え、この培地をアルゴンで飽和して嫌気性とした。培地が嫌気性となっったことは、培地にＮａ_２Ｓ溶液を加えて、Ｎａ_２Ｓによるレザスリン溶液のピンク色が着色しないことにより確認した。
【００４７】
嫌気性となった培地に、ＰｙｒｏｃｏｃｃｕｓｈｏｒｉｋｏｓｈｉｉＪＣＭ９９７４株を植菌し、９５℃で２〜４日間培養し、培養液を５，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離することにより集菌した。
ｉｉ）染色体ＤＮＡの調製
菌体を１０ｍＭトリス（ｐＨ７．５）−１ｍＭＥＤＴＡ溶液で２回洗浄後インサートアガロース（ＩｎＣｅｒｔＡｇａｒｏｓｅ、ＦＭＣ社製）ブロック中に封入した。このブロックを１％Ｎ−ラウロイルザルコシン−１ｍｇ／ｍｌプロテアーゼＫ溶液中で処理することにより、染色体ＤＮＡがアガロースブロック中に分離調製された。インサートアガロースブロックを用いた染色体ＤＮＡの分離条件は、アガロースブロックの添付マニュアルに従った。
ｉｉｉ）アミノペプチダーゼ遺伝子の増幅
＜第１のアミノペプチダーゼ遺伝子＞
ＰｙｒｏｃｏｃｃｕｓｈｏｒｉｋｏｓｈｉｉＪＣＭ９９７４株の染色体ＤＮＡ中の、配列番号１の塩基配列を含むＤＮＡをＰＣＲ法により増幅した。ＰＣＲ条件は、ＰＣＲキットの添付マニュアルに従った。５’末端側に対応するプライマーとしては、配列番号１の塩基配列の５’末端より上流域に対応するプライマーであって制限酵素ＮｄｅＩサイトを付与したＤＮＡプライマーを合成した（ＧＡＡＡＴＣＣＡＴＡＴＧＧＡＧＧＴＧＡＧＧＡＡＴＡＴＧ；配列番号５）。また、３’末端側に対応するプライマーとしては、配列番号１の塩基配列の３’末端より下流域に対応するプライマーであって制限酵素ＢａｍＨＩサイトを構築する目的でＤＮＡプライマーを合成した（ＡＡＧＧＡＴＣＣＣＧＣＣＴＣＴＴＴＴＧＧＴＣＣＴＴＡＣＴＡＧＣ；配列番号６）。ＰＣＲ反応後、増幅したＤＮＡを制限酵素ＮｄｅＩ及びＢａｍＨＩにより３７℃で３時間完全分解した。次いで、第１のアミノペプチダーゼ遺伝子を含むＤＮＡ断片を精製カラムキットを用いて精製した。
＜第２のアミノペプチダーゼ遺伝子＞
ＰｙｒｏｃｏｃｃｕｓｈｏｒｉｋｏｓｈｉｉＪＣＭ９９７４株の染色体ＤＮＡ中の、配列番号３の塩基配列を含むＤＮＡをＰＣＲ法により増幅した。ＰＣＲ条件は、ＰＣＲキットの添付マニュアルに従った。５’末端側に対応するプライマーとしては、配列番号３の塩基配列の５’末端より上流域に対応するプライマーであって制限酵素ＮｃｏＩサイトを付与したＤＮＡプライマーを合成した（ＣＴＴＡＧＣＣＡＴＧＧＡＴＴＴＡＡＡＡＧＧＧＧＧＴＧＡＡＡＧ；配列番号７）。また、３’末端側に対応するプライマーとしては、配列番号３の塩基配列の３’末端より下流域に対応するプライマーであって制限酵素ＢａｍＨＩサイトを構築する目的でＤＮＡプライマーを合成した（ＡＡＧＧＡＴＣＣＴＴＣＣＣＡＴＣＡＣＧＧＡＧＴＧＡＡＧＴＣＣ；配列番号８）。ＰＣＲ反応後、増幅したＤＮＡを制限酵素ＮｃｏＩ及びＢａｍＨＩにより３７℃で３時間完全分解した。次いで、第２のアミノペプチダーゼ遺伝子を含むＤＮＡ断片を精製カラムキットを用いて精製した。
ｉｉｉ）アミノペプチダーゼ遺伝子を含有するベクターの構築
＜第１のアミノペプチダーゼ遺伝子＞
ベクターのｐＥＴ−１１ａ（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）を制限酵素ＮｄｅＩ及びＢａｍＨＩで切断し、精製した。次いで、ＮｄｅＩ及びＢａｍＨＩで切断されたプラスミドｐＥＴ−１１ａとＮｄｅＩ及びＢａｍＨＩで切断された第１のアミノペプチダーゼ遺伝子を含むＤＮＡ断片とをＴ４リガーゼを用いて１６℃で、３時間反応させることにより連結した。連結したＤＮＡを用いて、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＸＬ２−ＢｌｕｅＭＲＦ’株（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社製）のコンピテントセルを形質転換した。形質転換体は、５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ寒天プレート上でのコロニー形成を指標に選択した。形質転換体から第１のアミノペプチダーゼ遺伝子含有プラスミドをアルカリ法で抽出した。
＜第２のアミノペプチダーゼ遺伝子＞
ベクターのｐＥＴ−２１ｄ（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）を制限酵素ＮｃｏＩ及びＢａｍＨＩで切断し、精製した。次いで、ＮｃｏＩ及びＢａｍＨＩで切断されたプラスミドｐＥＴ−２１ｄとＮｃｏＩ及びＢａｍＨＩで切断された第２のアミノペプチダーゼ遺伝子を含むＤＮＡ断片とをＴ４リガーゼを用いて１６℃で、３時間反応させることにより連結した。連結したＤＮＡを用いて、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＸＬ２−ＢｌｕｅＭＲＦ’株（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社製）のコンピテントセルを形質転換した。形質転換体は、５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ寒天プレート上でのコロニー形成を指標に選択した。形質転換体から第２のアミノペプチダーゼ遺伝子含有プラスミドをアルカリ法で抽出した。
実施例２（組み換えアミノペプチダーゼの発現）
ｉ）アミノペプチダーゼ遺伝子を含有する形質転換体の作製
１．５ｍｌ容チューブ内に、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ株（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）のコンピテントセル０．０４ｍｌ（２×１０^６ｃｆｕ）と、上記調製した第１のアミノペプチダーゼ遺伝子含有プラスミドＤＮＡ溶液又は第２のアミノペプチダーゼ遺伝子含有プラスミドＤＮＡ溶液０．００３ｍｌ（プラスミドＤＮＡ１００ｎｇ）を加え氷中に３０分間放置した後、４２℃で３０秒間ヒートショックを与えた。次いで、チューブ内にＳＯＣｍｅｄｉｕｍを０．２５ｍｌ加え、３７℃で１時間振とう培養した。次いで、アンピシリン及びクロラムフェニコールを含むＬＢ寒天プレートに塗布し、３７℃で一晩培養することにより形質転換体を得た。
ｉｉ）アミノペプチダーゼの精製
第１のアミノペプチダーゼ遺伝子を保持する形質転換体及び第２のアミノペプチダーゼ遺伝子を保持する形質転換体を、それぞれクロラムフェニコール及びアンピシリンを含むＬＢ培地に接種し、６００ｎｍにおける吸光度が０．６に達するまで、３７℃で培養した後、プラスミドの発現量を高めるためにＩＰＴＧを加えさらに４時間培養した。培養液を７，０００ｒｐｍで２０ｍｉｎ遠心分離することにより集菌した。
【００４８】
集菌した菌体５ｇに、５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）４０ｍｌを加え、菌体を６０Ｗの出力で３分間超音波破砕した。破砕した菌液を１８，０００ｒｐｍで２０分間遠心分離し、上清を採取した。
【００４９】
夾雑蛋白を沈殿させて除去する目的で、この上清を８５℃で３０分間加熱した後、１８，０００ｒｐｍで２０分間遠心分離し、上清を採取した。上清を、５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．５）中で透析し、同緩衝液で平衡化した陰イオン交換樹脂のＨｉｔｒａｐＱ（ファルマシア社製）カラムを用いてイオン交換クロマトグラフィーを行った。
【００５０】
さらに、活性画分を、１５０ｍＭＮａＣｌを含む５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．５）中で透析し、同緩衝液で平衡化したゲル濾過材のＳｅｐｈａｃｒｙｌＳ−１００（ファルマシア社製）カラムを用いてゲル濾過クロマトグラフィーを行った。活性画分には、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動により単一バンドを与える均一標品が含まれていた。
【００５１】
また、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動の結果、第１のアミノペプチダーゼ遺伝子発現産物である第１のアミノペプチダーゼの分子量は約４２ｋＤａであり、第２のアミノペプチダーゼ遺伝子の発現産物である第２のアミノペプチダーゼの分子量は約４１ｋＤａであった。
実施例３（超好熱性古細菌ＰｙｒｏｃｏｃｃｕｓｈｏｒｉｋｏｓｈｉｉＪＣＭ９９７４株のアミノペプチダーゼ遺伝子の同定）
実施例１で得られた超好熱性古細菌ＰｙｒｏｃｏｃｃｕｓｈｏｒｉｋｏｓｈｉｉＪＣＭ９９７４株の染色体ＤＮＡ中の第１及び第２のアミノペプチダーゼ遺伝子のＤＮＡ配列を配列番号１及び３に示す。第１のアミノペプチダーゼ遺伝子は、独立行政法人製品評価技術基盤機構においてＩＤ番号ＰＨ１５２７として登録されているものであり、第２のアミノペプチダーゼ遺伝子は、独立行政法人製品評価技術基盤機構においてＩＤ番号ＰＨ１８２１として登録されているものである。
【００５２】
また、実施例２で得られたＰｙｒｏｃｏｃｃｕｓｈｏｒｉｋｏｓｈｉｉＪＣＭ９９７４株の第１及び第２のアミノペプチダーゼのアミノ酸配列を配列番号２及び４に示す。
実施例４（耐熱性アミノペプチダーゼの諸性質）
前記の方法で得られたＰｙｒｏｃｏｃｃｕｓｈｏｒｉｋｏｓｈｉｉＪＣＭ９９７４株由来のアミノペプチダーゼの諸特性を評価した。アミノペプチダーゼ活性は以下に示すニンヒドリン反応により測定した。
＜ニンヒドリン反応＞
０．１ＭＮａＣｌ、０．５ｍＭＣｏＣｌ_２を含む５０ｍＭ（Ｎ−エチルモルフォリン（Ｎ−ｅｔｈｙｌｍｏｒｐｈｏｌｉｎｅ；ＮＥＭ）緩衝液（ｐＨ７．５）を用いて２ｍＭＡｌａ−Ａｌａ−Ａｌａ溶液を調製した。この基質溶液０．５ｍｌに精製した第１のアミノペプチダーゼについては、溶液中濃度が０．０５μｇ／ｍｌになるように添加し、精製した第２のアミノペプチダーゼについては、溶液中濃度が０．１μｇ／ｍｌになるように添加した。酵素反応溶液を８５℃下で１０分間加熱した後、氷中に放置した。酵素反応溶液１２０μｌに１重量％のニンヒドリン水溶液を８８０μｌ添加したニンヒドリン反応溶液を８５℃下で５分間放置した後、５０５ｎｍにおける吸光度を測定した。
【００５３】
さらに、以下の１〜３の手順に従い、アミノペプチダーゼ分子活性を算出した。
＜２ｍＭＡｌａ−Ａｌａ−Ａｌａを基質とした分子活性を算出する方法＞
１．Ａｌａを用いてニンヒドリン反応の検量線を上記方法で作成する。
２．２ｍＭＡｌａ−Ａｌａ−Ａｌａを基質とした場合に測定された値を検量線を用いて、遊離されたＡｌａ量（生成物の濃度（ｍＭ））に換算する。ここで、Ａｌａ−Ａｌａ及びＡｌａ−Ａｌａ−Ａｌａの値はＡｌａに比べて格段に小さいので無視する。
３．分子活性（１／秒間）
＝生成物の濃度（ｍＭ）／〔酵素の濃度（ｍＭ）×反応時間（秒間）〕
の式により分子活性を算出する。
ｉ）至適温度
ニンヒドリン反応により、６０〜１１０℃の温度下で、第１及び第２の各アミノペプチダーゼの活性を測定した。反応液温度を１００℃以上にする場合は、加圧することにより当該温度に設定した。酵素活性の相対値を図１（Ａ）及び（Ｂ）に示す。（Ａ）は第１のアミノペプチダーゼの結果を示し、（Ｂ）は第２のアミノペプチダーゼの結果を示す。
【００５４】
図１（Ａ）から分かるように、ｐＨ７．５のＮＥＭバッファー中での第１のアミノペプチダーゼの至適温度は１０５℃であった。また、第１のアミノペプチダーゼの１０５℃下での分子活性は、７００（１／秒間）以上であった。
【００５５】
図２（Ｂ）から分かるように、ｐＨ７．５のＮＥＭバッファー中での第２のアミノペプチダーゼの至適温度は１００〜１０５℃であった。また、第２のアミノペプチダーゼの１００℃下での分子活性は、３５０（１／秒間）以上であった。
ｉｉ）耐熱性
第１のアミノペプチダーゼについては、反応液（０．１ＭＮａＣｌ、０．５ｍＭＣｏＣｌ_２を含む５０ｍＭ（Ｎ−エチルモルフォリン（Ｎ−ｅｔｈｙｌｍｏｒｐｈｏｌｉｎｅ；ＮＥＭ）緩衝液（ｐＨ７．５））中に第１のアミノペプチダーゼを５μｇ／ｍｌになるように添加した酵素溶液を調製した。この酵素溶液を９８℃でインキュベートして経時的に残存活性を測定した。第２のアミノペプチダーゼについても、５μｇ／ｍｌの酵素溶液を用いて同様の操作を行った。
【００５６】
結果を図２に示す。図２の（Ａ）は第１のアミノペプチダーゼの結果を示し、（Ｂ）は第２のアミノペプチダーゼの結果を示す。図（Ａ）から分かるように第１のアミノペプチダーゼは、９８℃で熱処理した場合に１時間後に９５％の活性が残存し、２時間後にも８５％の活性が残存した。図（Ｂ）から分かるように第２のアミノペプチダーゼは、９８℃で熱処理した場合に１時間後に９０％の活性が残存し、２時間後にも７５％の活性が残存した。
ｉｉｉ）アシルペプチドの分解活性
精製した第１及び第２の各アミノペプチダーゼの、ａｃｅｔｙｌ−Ａｌａ− Ａｌａ− Ａｌａ−ＯＨに対する分解活性を測定した。詳述すれば、上記説明したニンヒドリン法によるアミノペプチダーゼ活性測定方法において、基質としてＡｌａ−Ａｌａ−Ａｌａに代えてａｃｅｔｙｌ−Ａｌａ− Ａｌａ− Ａｌａ−ＯＨを用いた他は、上記と同様の条件で、８５℃下で、アミノペプチダーゼ活性を測定した。
【００５７】
この結果、第１のアミノペプチダーゼの分子活性は０．２（１／秒間）であり、この値はＡｌａ−Ａｌａ−Ａｌａに対する分子活性を１とした場合に７．４×１０^−４であった。また第２のアミノペプチダーゼの分子活性は０．０２（１／秒間）であり、この値はＡｌａ−Ａｌａ−Ａｌａに対する分子活性を１とした場合に８．７×１０^−５であった。
【００５８】
【発明の効果】
本発明によれば、Ｎ−末端がアシル化されたペプチド又はタンパク質及びＮ−末端がアシル化されていないペプチド又はタンパク質の双方を分解できるアミノペプチダーゼであって、従来より分子活性の高いアミノペプチダーゼが提供された。
【００５９】
さらにいえば、本発明のアミノペプチダーゼは、Ｎ−末端がアシル化されたペプチド又はタンパク質及びＮ−末端がアシル化されていないペプチド又はタンパク質の双方を分解できる基質特異性の広いものであることから、生体内に多く見出されるアシルペプチドをＮ−末端から順次加水分解できる。これにより、アシルペプチドのＮ−末端分析やアシルペプチドの加水分解によるアミノ酸の製造を行うことができる。
【００６０】
また本発明のアミノペプチダーゼは、極めて高い耐熱性を有することから、アシルペプチドのＮ−末端分析やアミノ酸の製造を従来より格段に高温下で行うことができる。これにより、高濃度の基質溶液に対して効率よく反応を行うことができる。ペプチドは構成アミノ酸の種類によっても異なるが、一般に長くなるほど水への溶解度が低下する。本発明のアミノペプチダーゼを用いれば、水難溶性のペプチドであっても高温下で調製した高濃度のペプチド溶液に対して効率よく加水分解反応を行える。また、高温下で加水分解できることから、夾雑酵素や混入した微生物等による影響を抑えることができる。
【００６１】
また本発明のアミノペプチダーゼは分子構造が安定であることから有機溶媒に対しても安定である。従って、水に溶解し難いが有機溶媒には溶解し易いペプチド又はタンパク質についても、有機溶媒を用いて高濃度のペプチド又はタンパク質溶液を調製することができ、その分加水分解反応を効率よく行うことができるとともに、対象ペプチドの範囲が広がる。
【００６２】
また本発明のアミノペプチダーゼは、常温下でも安定であることから、長期保存に耐えることができる。
【００６３】
また本発明のアミノペプチダーゼは、従来の耐熱性アミノペプチダーゼには見られない極めて高い分子活性を有することから、極めて効率よくアシルペプチド加水分解反応を行える。
【００６４】
【配列表】

【図面の簡単な説明】
【図１】（Ａ）は、パイロコッカスホリコシＪＣＭ９９７４株由来の第１のアミノペプチダーゼの至適温度を示すグラフであり、（Ｂ）は、同株由来の第２のアミノペプチダーゼの至適温度を示すグラフである。
【図２】（Ａ）は、パイロコッカスホリコシＪＣＭ９９７４株由来の第１のアミノペプチダーゼを熱処理した場合の残存活性を示すグラフであり、（Ｂ）は、同株由来の第２のアミノペプチダーゼを熱処理した場合の残存活性を示すグラフである。[0001]
TECHNICAL FIELD OF THE INVENTION
The present invention relates to an aminopeptidase used for N-terminal analysis of a peptide or protein, production of an amino acid by decomposing a peptide or protein, a polynucleotide encoding the same, and the like.
[0002]
[Prior art]
Conventionally, for the N-terminal analysis of a peptide or protein, the Edman degradation method using aminopeptidase which sequentially releases these amino acids from the N-terminal is used. Aminopeptidase is also used for producing amino acids by decomposing peptides or proteins.
[0003]
Here, in many cases, the polypeptide or protein in the living body has an acylated N-terminal amino group in order to protect itself from degradation by a protease. Therefore, acyl peptide hydrolase is used for analysis of acylated polypeptides or proteins and production of amino acids using them as raw materials.
[0004]
Conventionally, heat-labile acyl peptide hydrolases derived from mammals have been used. However, if the hydrolysis reaction of the acyl peptide can be performed at a high temperature using a heat-resistant acyl peptide hydrolase, a higher concentration of the substrate solution can be used and the reaction efficiency is good, and the contaminating microorganisms or contaminants can be used. The effects of enzymes can be suppressed.
[0005]
As such a thermostable acyl peptide hydrolase, the present inventor disclosed in Patent Document 1 an aminopeptidase isolated from Pyrococcus horikoshii, which is an N-block peptide and an N-block. Disclosed is a thermostable aminopeptidase that catalyzes both a reaction of sequentially releasing amino acids from the N-terminus of a non-peptide and a reaction of decomposing a blocking group itself. The activity of this enzyme hardly decreases even after treatment at 90 ° C. for several hours, and the optimum temperature is about 95 ° C. at pH 7.5. However, this enzyme has a relatively low aminopeptidase molecular activity of 10 (1 / sec).
[0006]
Patent Document 2 discloses an acylpeptide hydrolase isolated from Pyrococcus sorghum, which has an optimum temperature of 90 to 95 ° C under pH 7.5, and is heated at 95 ° C for 3 hours. Discloses a thermostable acyl peptide hydrolase that does not lose its activity. However, this enzyme catalyzes only a reaction for releasing an acyl amino acid from a peptide or protein having an N-terminal acylated, and has low substrate specificity.
[0007]
[Patent Document 1]
JP-A-2000-245480 (paragraphs 0011, 0012, etc.)
[0008]
[Patent Document 2]
JP-A-10-210977 (paragraphs 0008, 0009, 0023, etc.)
[0009]
[Problems to be solved by the invention]
The present invention relates to a thermostable aminopeptidase capable of decomposing both an N-terminally acylated peptide or protein and an N-terminally non-acylated peptide or protein, and which has a higher molecular activity than a thermostable amino acid. The main purpose is to provide a peptidase.
[0010]
[Means for Solving the Problems]
In order to achieve the above object, the present inventors focused on hyperthermophilic protozoa that grow in an environment at 90 to 100 ° C., and examined Pyrococcus horikoshii strain JCM9974 (RIKEN Microorganism Strain Preservation Facility (JCM) No. 9974). An acylaminopeptidase gene is cloned, and the acylaminopeptidase has an aminopeptidase activity having a molecular activity of 200 (1 / second) or more for Ala-Ala-Ala in an environment of 85 ° C. and pH 7.5, It has been found that the peptide or protein has a thermostable aminopeptidase that can degrade both N-terminally acylated peptides and proteins and non-N-terminally acylated peptides and proteins. It has also been found that this enzyme is an extremely thermostable enzyme that retains 90% or more aminopeptidase activity even after heat treatment at 98 ° C. for 1 hour.
[0011]
The present invention has been completed based on the above findings, and provides the following thermostable aminopeptidase and the like.
[0012]
Item 1. A thermostable aminopeptidase having the following properties (a) and (b):
(A) An aminopeptide having a molecular activity for Ala-Ala-Ala (the number of molecules of a substrate on which one molecule of enzyme acts per second) is 200 (1 / sec) or more in an environment of 85 ° C. and pH 7.5. Has enzyme activity.
(B) It also has the activity of degrading peptides or proteins whose N-terminal is acylated.
[0013]
Item 2. Item 2. The thermostable aminopeptidase according to item 1, which has the following properties (c) and (d).
(C) A heat treatment at 98 ° C. for 1 hour leaves 90% or more aminopeptidase activity.
(D) The optimal temperature of aminopeptidase activity is 100 ° C. or more at pH 7.5.
[0014]
Item 3. Item 3. The thermostable aminopeptidase according to Item 1 or 2, which is an enzyme derived from Pyrococcus horikoshii.
[0015]
Item 4. The following polypeptide (1) or (2):
(1) A polypeptide consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2.
(2) SEQ ID NO: 2 consists of an amino acid sequence in which one or more amino acids have been deleted, substituted or added, and has a molecular activity against Ala-Ala-Ala of 200 in an environment of 85 ° C. and pH 7.5. A polypeptide having an aminopeptidase activity of (1 / sec) or more and also having an activity of degrading a peptide or protein having an acylated N-terminal.
[0016]
Item 5. The polynucleotide of the following (3), (4) or (5).
(3) a polynucleotide consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1;
(4) It hybridizes with a polynucleotide consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 under stringent conditions, and has a molecular activity of 200 (1/1) for Ala-Ala-Ala in an environment of 85 ° C. and pH 7.5. A polynucleotide that encodes a polypeptide having an aminopeptidase activity of at least 2 seconds) and also having the activity of degrading an N-terminally acylated peptide or protein.
(5) A polynucleotide encoding the polypeptide according to item 4.
[0017]
Item 6. The polypeptide of the following (6) or (7).
(6) a polypeptide consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4;
(7) SEQ ID NO: 4 consists of an amino acid sequence in which one or more amino acids have been deleted, substituted, or added, and has a molecular activity against Ala-Ala-Ala of 200 in an environment of 85 ° C. and pH 7.5. A polypeptide having an aminopeptidase activity of (1 / sec) or more and also having an activity of degrading a peptide or protein having an acylated N-terminal.
[0018]
Item 7. The polynucleotide of the following (8), (9) or (10).
(8) A polynucleotide consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 3.
(9) It hybridizes with a polynucleotide consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 3 under stringent conditions, and has a molecular activity of 200 (1/1) for Ala-Ala-Ala in an environment of 85 ° C. and pH 7.5. A polynucleotide that encodes a polypeptide having an aminopeptidase activity of at least 2 seconds) and also having the activity of degrading an N-terminally acylated peptide or protein.
(10) A polynucleotide encoding the polypeptide of (6).
[0019]
Item 8. Item 8. A vector comprising the polynucleotide according to item 5 or 7.
[0020]
Item 9. Item 10. A transformant carrying the vector according to item 8.
[0021]
Item 10. Item 10. A method for culturing the transformant according to Item 9, and recovering a thermostable aminopeptidase from the transformant.
[0022]
BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION
Hereinafter, the present invention will be described in detail.
(1) Thermostable aminopeptidase
The thermostable aminopeptidase of the present invention has an aminopeptidase activity having a molecular activity of 200 (1 / sec) or more for Ala-Ala-Ala in an environment of 85 ° C. and pH 7.5, and has N-terminal acylation. It is an enzyme that also has the activity of degrading a peptide or protein.
Activity
In the present invention, the molecular activity refers to the number of substrate molecules on which one molecule of enzyme acts per second. The aminopeptidase of the present invention is an enzyme having an aminopeptidase activity having a molecular activity of 200 (1 / second) or more for Ala-Ala-Ala in an environment of 85 ° C. and pH 7.5. Preferably, the enzyme has an aminopeptidase activity having a molecular activity of Ala-Ala-Ala of 220 (1 / sec) or more in a similar environment.
[0023]
In the present invention, the aminopeptidase activity is a value measured by the method described in Examples. That is, it is a value measured using Ala-Ala-Ala whose N-terminal is not acylated as a substrate.
Substrate specificity
The aminopeptidase of the present invention has an activity of sequentially releasing amino acids from the N-terminal of a peptide or protein whose N-terminal is not acylated by hydrolysis. However, proline and amino acids existing one residue before proline are not released. Similarly, a peptide or protein having an acylated N-terminus also has the activity of sequentially releasing amino acids from the N-terminus by hydrolysis. However, similarly, proline and the amino acid existing one residue before the proline are not released. In any case, the number of amino acids in the peptide or protein does not matter.
[0024]
Further, the aminopeptidase of the present invention can degrade a peptide or protein in which the N-terminal acyl group is an acetyl group, that is, an N-acetylated peptide or protein.
[0025]
Furthermore, it can be decomposed as long as R is an N-acyl peptide or protein in which an RCO-group such as an aliphatic hydrocarbon or an aromatic hydrocarbon having 1 to 20 carbon atoms is introduced into an N-terminal amino group. Is preferred. It is more preferable that the enzyme be capable of decomposing the acyl group itself.
[0026]
In addition, the aminopeptidase of the present invention is more preferably one that can degrade a peptide or protein having a D-type amino acid introduced at the N-terminus. In this case, it is more preferable that the enzyme be capable of decomposing the protecting group itself.
Heat-resistant
The aminopeptidase of the present invention is an enzyme having extremely excellent thermostability, and has an aminopeptidase activity of 90% or more when heat-treated at 98 ° C. for 1 hour. In particular, it is preferable that the enzyme be one that retains 95% or more aminopeptidase activity when heat-treated at 98 ° C. for 1 hour.
[0027]
The aminopeptidase of the present invention is preferably an enzyme that retains 75% or more, particularly 85% or more aminopeptidase activity when heat-treated at 98 ° C for 2 hours.
[0028]
Although the aminopeptidase of the present invention varies depending on the type of the buffer for performing the enzymatic reaction, the optimum temperature when measuring the initial rate of the enzymatic reaction is 100 ° C. or higher, particularly 105 ° C. or higher in an environment of pH 7.5. Preferably, the enzyme is
Stability at room temperature
The aminopeptidase of the present invention is, of course, also excellent in stability at normal temperature, and it is preferable that the activity does not substantially decrease even if left at normal temperature of 25 ° C. for 30 days or more. That the activity is not substantially reduced means that 90% or more of the activity usually remains.
Organic solvent resistance
The aminopeptidase of the present invention is resistant to organic solvents. For example, it is preferable that the enzyme be an enzyme that exhibits activity in a buffer containing 20% by volume or more of an organic solvent such as ethanol, butanol, tetrahydrofuran, and ethyl acetate. The upper limit of the volume ratio of the organic solvent in the buffer in which the aminopeptidase of the present invention can exhibit enzymatic activity is within a range where the enzyme protein does not precipitate.
Producing bacteria
Although the origin of the aminopeptidase of the present invention is not particularly limited, thermophilic bacteria, for example, genus Pyrococcus, genus Aeropyrum, genus Thermococcus, genus Sforolobus, genus Thermoplasma And those produced by bacteria such as Thermoproteus, Mastigocladas, Bacillus, Synechococcus, or Thermus. In particular, those produced by the hyperthermophilic archaeon Pyrococcus horikoshi are preferred.
Amino acid sequence
The aminopeptidase of the present invention includes, for example, a polypeptide (first polypeptide) having the following amino acid sequence (1) or (2).
(1) A polypeptide consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2.
(2) an aminopeptidase activity having an amino acid sequence in which one or more amino acids are deleted, substituted or added in SEQ ID NO: 2 and having a molecular activity of 200 (1 / sec) or more for Ala-Ala-Ala And a polypeptide having an activity of degrading a peptide or protein having an acylated N-terminus.
[0029]
In addition, examples of the aminopeptidase of the present invention also include a polypeptide (second polypeptide) having the following amino acid sequence of (6) or (7).
(6) a polypeptide consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4;
(7) aminopeptidase activity having an amino acid sequence in which one or more amino acids are deleted, substituted or added in SEQ ID NO: 4, and having a molecular activity of 200 (1 / sec) or more for Ala-Ala-Ala And a polypeptide having an activity of degrading a peptide or protein having an acylated N-terminus.
[0030]
The polypeptide of (2) is preferably a polypeptide comprising an amino acid sequence in which about 1 to 120, particularly about 1 to 50 amino acids have been deleted, substituted or added in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2. Is a region that is not conserved between aminopeptidases that also have the activity of degrading peptides or proteins whose N-terminus is acylated, the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 can be used in a range of 30% or less of the total number of amino acids. It may be modified.
[0031]
Similarly, the polypeptide of (7) is a polypeptide having an amino acid sequence of SEQ ID NO: 4 in which about 1 to 120 amino acids, particularly about 1 to 50 amino acids have been deleted, substituted or added. However, if the N-terminus is a region not conserved between aminopeptidases that also have the activity of degrading an acylated peptide or protein, the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4 can be replaced with 30% or less of the total number of amino acids. It may be modified within the scope.
[0032]
Specifically, for example, in the case of amino acid substitution, from the viewpoint of protein structure retention, an amino acid having properties similar to the amino acid before substitution in terms of polarity, charge, solubility, hydrophilicity / hydrophobicity, etc. Can be replaced. For example, glycine, alanine, valine, leucine, isoleucine, proline are classified as non-polar amino acids; serine, threonine, cysteine, methionine, asparagine, glutamine are classified as polar amino acids; phenylalanine, tyrosine, tryptophan have aromatic side chains. Lysine, arginine and histidine are classified as basic amino acids; aspartic acid and glutamic acid are classified as acidic amino acids. Therefore, it can be selected and substituted from the same group of amino acids.
[0033]
Further, when the side chain is reduced by the amino acid substitution, the three-dimensional structure of the polypeptide is hardly changed, whereby the activity is hardly changed. Therefore, such a substitution should be performed on the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 or 4. Thus, the polypeptide of (2) or (7) can be obtained.
[0034]
The aminopeptidase of the present invention can be obtained, for example, by culturing a bacterium that produces this enzyme, and recovering or further purifying the bacterium from a cell homogenate. It can also be obtained by chemically synthesizing based on the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 or 4. Further, it can also be obtained by the method of the present invention described below.
(2) Polynucleotide
The first polynucleotide of the present invention is the following polynucleotide (3), (4) or (5). The polynucleotide consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 in (3) encodes the polypeptide of SEQ ID NO: 2 in (1).
(3) a polynucleotide consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1;
(4) It hybridizes with a polynucleotide consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 under stringent conditions, and has an aminopeptidase activity having a molecular activity of 200 (1 / sec) or more for Ala-Ala-Ala. , A polynucleotide encoding a polypeptide having an activity of degrading a peptide or protein having an acylated N-terminus.
(5) A polynucleotide encoding the polypeptide of (1) or (2).
[0035]
The second polynucleotide of the present invention is the following polynucleotide (8), (9) or (10). The polynucleotide consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 3 in (8) encodes the polypeptide of SEQ ID NO: 4 in (6).
(8) A polynucleotide consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 3.
(9) It hybridizes with a polynucleotide consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 3 under stringent conditions, and has an aminopeptidase activity having a molecular activity of 200 (1 / sec) or more for Ala-Ala-Ala. , A polynucleotide encoding a polypeptide having an activity of degrading a peptide or protein having an acylated N-terminus.
(10) A polynucleotide encoding the polypeptide of (6) or (7).
[0036]
The polynucleotide (3) is a polynucleotide encoding a polypeptide consisting of an amino acid sequence in which about 1 to 120, particularly about 1 to 50 amino acids have been deleted, substituted or added in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2. Preferably, there is. However, if the N-terminus is a region that is not conserved between aminopeptidases that also have the activity of degrading an acylated peptide or protein, the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 can be reduced to 40% or less of the total amino acids. It may be a polynucleotide that encodes a polypeptide that has been modified in a range.
[0037]
Similarly, the DNA of (8) is a polynucleotide encoding a polypeptide comprising an amino acid sequence in which about 1 to 120, particularly about 1 to 50 amino acids have been deleted, substituted or added in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4. It is preferable that However, if the N-terminus is a region that is not conserved between aminopeptidases that also have the activity of degrading an acylated peptide or protein, the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4 can be replaced with 40% or less of the total amino acids. It may be a polynucleotide that encodes a polypeptide that has been modified in a range.
[0038]
Unless otherwise specified, the polynucleotide of the present invention includes not only a polynucleotide having the base sequence but also a polynucleotide complementary thereto. The polynucleotide of the present invention includes both DNA and RNA. In addition, modified DNA (for example, phosphorothioate DNA, H-phosphonate DNA, etc.) and modified RNA are also included as long as the object of the present invention can be achieved. Further, both a single-stranded polynucleotide and a double-stranded polynucleotide are included, and the double-stranded polynucleotide also includes a DNA / RNA hybrid.
[0039]
In the present invention, “stringent conditions” include, for example, conditions at 68 ° C. in a normal hybridization solution, and at 42 ° C. in a hybridization solution containing 50% formamide. Conditions. Specifically, the conditions used for Southern hybridization described in Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd edition, volume 2 can be mentioned.
[0040]
The polynucleotide of the present invention is a live chromosomal DNA of thermophilic bacteria such as Pyrococcus, Aeropyram, Sphorobas, Thermoplasma, Thermoproteus, Mastigocladas, Bacillus, Synechococcus, and Thermos. Rally can be isolated by hybridization using a probe designed based on SEQ ID NO: 1 or 3. Alternatively, the primers can be amplified by PCR using, for example, a chromosomal DNA library of the thermophilic bacterium as a template, using a primer designed based on the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 or 3. It can also be obtained by chemical synthesis.
[0041]
Further, the mutated polynucleotide of (4) or (9) can be prepared by a known method such as a chemical synthesis method, a genetic engineering method, and a mutagenesis method. As a genetic engineering technique, a nucleotide ligase gene of (3) or (8) is introduced into the DNA ligase gene by nucleotide deletion using exonuclease, linker introduction, site-directed mutagenesis, or PCR using a mutation primer. Examples include a method for modifying the sequence.
(3) Vector
The vector of the present invention is a recombinant vector containing the above-described first polynucleotide (here, DNA) or second polynucleotide (here, DNA) of the present invention. Known vectors can be widely used as vectors into which the DNA of the present invention is incorporated. In addition to bacterial vectors, yeast vectors, animal cell vectors, and the like can also be used. In general, a bacterial vector may be used from the viewpoint of enzyme production efficiency. Known vectors include Escherichia coli vectors pBR322, pUC19, pKK233-2, etc .; Bacillus bacteria vectors pUB110, pC194, pE194, pTHT15, pBD16, etc .; yeast vectors Yip5, Yrp17, Yep24, etc., and animal cell vectors pUC18, Examples include pUC19, M13mp18, and the like.
(4) Transformant
Further, the transformant of the present invention is a transformant carrying the above-described recombinant vector of the present invention. As the host, bacteria, yeast, animal cells, and the like can be used depending on the vector. As the host, Bacillus subtilis, Bacillus brevis, yeast, mold and the like are preferable in that the target protein can be produced in a large amount. Transformation can be performed by a known method such as a calcium phosphate method, a protoplast method, an electroporation method, a spheroplast method, a lithium acetate method, a lipofection method, and a microinjection method. Any of these known methods may be selected according to the type of host.
(5) Method for producing aminopeptidase
The method for producing the aminopeptidase of the present invention is a method of culturing the transformant of the present invention and recovering the aminopeptidase from the transformant.
[0042]
The culture conditions are not particularly limited, and the culture may be performed under conditions such as a medium and a temperature at which the host can grow. The culturing time varies depending on other culturing conditions, but may be usually about 12 to 24 hours. In the case of using an inducible expression vector such as a temperature shift type or IPTG (Isopropyl-b-D-thiogalactopyranoside) -inducible type, the induction time may be about 2 to 12 hours.
[0043]
When the desired aminopeptidase is produced in the host cell or in the periplasm, the cell may be disrupted by a known cell disruption method such as ultrasonic treatment or surfactant treatment to recover the aminopeptidase. When the host secretes aminopeptidase, the aminopeptidase secreted into the medium may be recovered.
[0044]
For further purification of the recovered aminopeptidase, centrifugation, salting out, solvent precipitation, dialysis, ultrafiltration, gel filtration, ion exchange chromatography, affinity chromatography, reverse-phase high-performance liquid chromatography Purification can be performed by a combination of known protein purification methods such as a chromatography method.
[0045]
When purifying the thermostable aminopeptidase of the present invention, heat treatment is preferably performed as one of the purification steps. The heat treatment is usually carried out at a temperature higher than the growth limit temperature of the host by at least 10 ° C., especially at least 15 ° C., and at a temperature at which the activity of the aminopeptidase of the present invention remains by about 60 to 80% by the heat treatment. It is efficient to carry out at a temperature of about 10 to 60 minutes. Thereby, the contaminant protein produced by the host can be inactivated by denaturation without almost inactivating the target aminopeptidase. After this heat treatment, denatured contaminating proteins can be precipitated by centrifuging the enzyme solution to be purified, for example, but not limited to, for example, at about 15,000 rpm for about 20 minutes. This heat treatment step may be performed at any stage of the purification. Thereby, the purification degree of the thermostable aminopeptidase can be dramatically improved.
[0046]
【Example】
Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to Examples, but the present invention is not limited to these Examples.
Example 1 ( Pyrococcus horikoshii JCM9974 Cloning of aminopeptidase gene of strain)
i ) Bacterial culture
13.5 g salt, 4 g Na₂SO₄0.7 g KCl, 0.2 g NaHCO₃ 0.1 g KBr, 30 mg H₃BO₃, 10 g of MgCl₂・ 6H₂O, 1.5 g CaCl₂ , 25 mg SrCl₂, 1.0 ml of a resasurin solution (0.2 g / L), 1.0 g of yeast extract, and 5 g of bactopeptone in 1 L of water to prepare a liquid medium, and the pH of this solution was adjusted to 6.8. Then, it was autoclaved. Next, dry heat sterilized elemental sulfur was added to a concentration of 0.2% by weight, and the medium was saturated with argon to make it anaerobic. The fact that the medium became anaerobic indicates that Na was added to the medium.₂S solution and add Na₂It was confirmed that the pink color of the resasurin solution due to S was not colored.
[0047]
Pyrococcus horikoshii JCM9974 strain was inoculated into the anaerobic medium, cultured at 95 ° C. for 2 to 4 days, and the culture was collected by centrifugation at 5,000 rpm for 10 minutes.
ii ) Chromosome DNA Preparation of
The cells were washed twice with 10 mM Tris (pH 7.5) -1 mM EDTA solution, and then sealed in an insert agarose (InCert Agarose, FMC) block. By treating this block in 1% N-lauroyl sarcosine-1 mg / ml protease K solution, chromosomal DNA was separated and prepared in an agarose block. The conditions for separating chromosomal DNA using the insert agarose block were in accordance with the manual attached to the agarose block.
iii) Amplification of the aminopeptidase gene
<First aminopeptidase gene>
The DNA containing the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 in the chromosomal DNA of Pyrococcus horikoshii JCM9974 was amplified by PCR. PCR conditions followed the attached manual of the PCR kit. As the primer corresponding to the 5 ′ end, a DNA primer to which a restriction enzyme NdeI site was added, which was a primer corresponding to the upstream region from the 5 ′ end of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1, was synthesized (GAAATCCATATGGAGGTGAGGAATATG; SEQ ID NO: 5). . In addition, as a primer corresponding to the 3 ′ end, a DNA primer was synthesized for the purpose of constructing a restriction enzyme BamHI site, which is a primer corresponding to a downstream region from the 3 ′ end of the base sequence of SEQ ID NO: 1 (AAGGATCCCCGCCCTTTTTGGTCCTTTACTAGC; SEQ ID NO: 6). After the PCR reaction, the amplified DNA was completely digested with restriction enzymes NdeI and BamHI at 37 ° C. for 3 hours. Next, the DNA fragment containing the first aminopeptidase gene was purified using a purification column kit.
<Second aminopeptidase gene>
The DNA containing the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 3 in the chromosomal DNA of Pyrococcus horikoshii JCM9974 was amplified by PCR. PCR conditions followed the attached manual of the PCR kit. As the primer corresponding to the 5 'end, a DNA primer to which a restriction enzyme NcoI site was added, which was a primer corresponding to the upstream region from the 5' end of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 3, was synthesized (CTTAGCCATGGATTTAAAAGGGGGTGGAAAG; SEQ ID NO: 7). . As a primer corresponding to the 3 ′ end, a DNA primer was synthesized for the purpose of constructing a restriction enzyme BamHI site, which is a primer corresponding to a downstream region from the 3 ′ end of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 3 (AAGGATCCTTCCCATCACGAGGTGAAGTCC; SEQ ID NO: 8). After the PCR reaction, the amplified DNA was completely digested with restriction enzymes NcoI and BamHI at 37 ° C. for 3 hours. Next, the DNA fragment containing the second aminopeptidase gene was purified using a purification column kit.
iii) Construction of vector containing aminopeptidase gene
<First aminopeptidase gene>
The vector pET-11a (Novagen) was cut with restriction enzymes NdeI and BamHI and purified. Next, the plasmid pET-11a cut with NdeI and BamHI and the DNA fragment containing the first aminopeptidase gene cut with NdeI and BamHI were ligated by reacting at 16 ° C. for 3 hours using T4 ligase. . Using the ligated DNA, competent cells of E. coli XL2-Blue MRF '(manufactured by STRATAGENE) were transformed. Transformants were selected using colony formation on LB agar plates containing 50 μg / ml ampicillin as an indicator. The first aminopeptidase gene-containing plasmid was extracted from the transformant by an alkaline method.
<Second aminopeptidase gene>
The vector pET-21d (Novagen) was cut with restriction enzymes NcoI and BamHI and purified. Next, the plasmid pET-21d cut with NcoI and BamHI and the DNA fragment containing the second aminopeptidase gene cut with NcoI and BamHI were ligated by reacting at 16 ° C. for 3 hours using T4 ligase. . Using the ligated DNA, competent cells of E. coli XL2-Blue MRF '(manufactured by STRATAGENE) were transformed. Transformants were selected using colony formation on LB agar plates containing 50 μg / ml ampicillin as an indicator. The second aminopeptidase gene-containing plasmid was extracted from the transformant by an alkaline method.
Example 2 (Expression of recombinant aminopeptidase)
i) Preparation of transformant containing aminopeptidase gene
In a 1.5-ml tube, 0.04 ml of competent cells of E. coli (E. coli) BL21 (DE3) pLysS strain (manufactured by Novagen) (2 × 10⁶cfu) and 0.003 ml of the above-prepared plasmid DNA solution containing the first aminopeptidase gene or the above-mentioned plasmid DNA solution containing the second aminopeptidase gene (100 ng of plasmid DNA), and left in ice for 30 minutes. For 30 seconds. Next, 0.25 ml of SOCmedium was added to the tube, followed by shaking culture at 37 ° C. for 1 hour. Then, the transformant was obtained by applying the mixture to an LB agar plate containing ampicillin and chloramphenicol and culturing at 37 ° C. overnight.
ii) Purification of aminopeptidase
A transformant carrying the first aminopeptidase gene and a transformant carrying the second aminopeptidase gene were inoculated into LB medium containing chloramphenicol and ampicillin, respectively, and the absorbance at 600 nm was reduced to 0.6. After culturing at 37 ° C until the temperature reached, IPTG was added to increase the expression level of the plasmid, and the cells were further cultured for 4 hours. The culture was harvested by centrifugation at 7,000 rpm for 20 minutes.
[0048]
To 5 g of the collected cells, 40 ml of 50 mM Tris-HCl buffer (pH 8.0) was added, and the cells were sonicated for 3 minutes at an output of 60 W. The disrupted bacterial solution was centrifuged at 18,000 rpm for 20 minutes, and the supernatant was collected.
[0049]
In order to precipitate and remove contaminating proteins, the supernatant was heated at 85 ° C. for 30 minutes, then centrifuged at 18,000 rpm for 20 minutes, and the supernatant was collected. The supernatant was dialyzed in 50 mM Tris-HCl buffer (pH 7.5), and ion exchange chromatography was performed using a column of an anion exchange resin, HitrapQ (Pharmacia) equilibrated with the buffer. Was.
[0050]
Further, the active fraction was dialyzed against a 50 mM sodium phosphate buffer (pH 7.5) containing 150 mM NaCl, and a Sephacryl S-100 (Pharmacia) column of gel filtration material equilibrated with the buffer was used. Was used to perform gel filtration chromatography. The active fraction contained a homogenous sample giving a single band by SDS-polyacrylamide gel electrophoresis.
[0051]
Also, as a result of SDS-polyacrylamide gel electrophoresis, the molecular weight of the first aminopeptidase gene expression product, the first aminopeptidase, was about 42 kDa, and the second aminopeptidase gene expression product, the second aminopeptidase gene, was expressed as a second aminopeptidase gene. The molecular weight of the peptidase was about 41 kDa.
Example 3 (Hyperthermophilic archaea) Pyrococcus horikoshii JCM9974 Identification of aminopeptidase gene of strain
The DNA sequences of the first and second aminopeptidase genes in the chromosomal DNA of the hyperthermophilic archaeon Pyrococcus horikoshii strain JCM9974 obtained in Example 1 are shown in SEQ ID NOS: 1 and 3. The first aminopeptidase gene is registered as ID number PH1527 in the National Institute of Technology and Evaluation, and the second aminopeptidase gene is registered as ID number PH1821 in the National Institute of Technology and Evaluation. It is registered.
[0052]
The amino acid sequences of the first and second aminopeptidases of Pyrococcus horikoshii JCM9974 strain obtained in Example 2 are shown in SEQ ID NOs: 2 and 4.
Example 4 (Properties of thermostable aminopeptidase)
Various properties of the aminopeptidase derived from Pyrococcus horikoshii JCM9974 obtained by the above method were evaluated. Aminopeptidase activity was measured by the ninhydrin reaction shown below.
<Ninhydrin reaction>
0.1 M NaCl, 0.5 mM CoCl₂A 2 mM Ala-Ala-Ala solution was prepared using 50 mM (N-ethylmorpholine (NEM) buffer (pH 7.5)) containing the following. The peptidase was added to a concentration of 0.05 μg / ml in the solution, and the purified second aminopeptidase was added to a concentration of 0.1 μg / ml in the solution. After heating at 85 ° C. for 10 minutes, the mixture was allowed to stand on ice, and a ninhydrin reaction solution obtained by adding 880 μl of a 1% by weight ninhydrin aqueous solution to 120 μl of the enzyme reaction solution was allowed to stand at 85 ° C. for 5 minutes, and the absorbance at 505 nm was measured. did.
[0053]
Furthermore, the aminopeptidase molecular activity was calculated according to the following procedures 1 to 3.
< 2 mM Ala-Ala-Ala Method for calculating molecular activity using as substrate>
1. A calibration curve for the ninhydrin reaction is prepared using Ala by the above method.
2. The value measured when 2 mM Ala-Ala-Ala was used as the substrate was converted to the amount of released Ala (product concentration (mM)) using a calibration curve. Here, the values of Ala-Ala and Ala-Ala-Ala are ignored because they are much smaller than Ala.
3. Molecular activity (1 / sec)
= Product concentration (mM) / [enzyme concentration (mM) x reaction time (sec)]
The molecular activity is calculated by the following equation.
i) Optimal temperature
The activity of each of the first and second aminopeptidases was measured at a temperature of 60 to 110 ° C. by the ninhydrin reaction. When the temperature of the reaction solution was set to 100 ° C. or higher, the temperature was set by pressurization. The relative values of the enzyme activities are shown in FIGS. 1 (A) and (B). (A) shows the result of the first aminopeptidase, and (B) shows the result of the second aminopeptidase.
[0054]
As can be seen from FIG. 1 (A), the optimal temperature of the first aminopeptidase in the NEM buffer at pH 7.5 was 105 ° C. The molecular activity of the first aminopeptidase at 105 ° C. was 700 (1 / sec) or more.
[0055]
As can be seen from FIG. 2 (B), the optimal temperature of the second aminopeptidase in the NEM buffer at pH 7.5 was 100 to 105 ° C. The molecular activity of the second aminopeptidase at 100 ° C. was 350 (1 / sec) or more.
ii) Heat-resistant
For the first aminopeptidase, the reaction solution (0.1 M NaCl, 0.5 mM CoCl₂An enzyme solution was prepared by adding the first aminopeptidase to 50 mM (N-ethylmorpholine (NEM) buffer (pH 7.5)) containing the first aminopeptidase at a concentration of 5 μg / ml. This enzyme solution was incubated at 98 ° C., and the residual activity was measured over time. The same operation was performed for the second aminopeptidase using a 5 μg / ml enzyme solution.
[0056]
FIG. 2 shows the results. FIG. 2A shows the result of the first aminopeptidase, and FIG. 2B shows the result of the second aminopeptidase. As can be seen from FIG. (A), when the first aminopeptidase was heat-treated at 98 ° C., 95% of the activity remained after 1 hour, and 85% of the activity remained after 2 hours. As can be seen from FIG. (B), when the second aminopeptidase was heat-treated at 98 ° C., 90% of the activity remained after 1 hour, and 75% of the activity remained after 2 hours.
iii) Degradation activity of acyl peptides
The decomposition activity of each of the purified first and second aminopeptidases for acetyl-Ala-Ala-Ala-OH was measured. More specifically, in the aminopeptidase activity measurement method according to the ninhydrin method described above, except that acetyl-Ala-Ala-Ala-OH was used instead of Ala-Ala-Ala as a substrate, under the same conditions as above, At 85 ° C., the aminopeptidase activity was measured.
[0057]
As a result, the molecular activity of the first aminopeptidase was 0.2 (1 / sec), which was 7.4 × 10 4 when the molecular activity on Ala-Ala-Ala was set to 1.^-4Met. The molecular activity of the second aminopeptidase is 0.02 (1 / second), which is 8.7 × 10 when the molecular activity on Ala-Ala-Ala is set to 1.^-5Met.
[0058]
【The invention's effect】
According to the present invention, an aminopeptidase capable of degrading both an N-terminally acylated peptide or protein and an N-terminally unacylated peptide or protein, which has a higher molecular activity than before, sponsored.
[0059]
Furthermore, the aminopeptidase of the present invention has broad substrate specificity capable of degrading both N-terminally acylated peptides or proteins and non-N-terminally acylated peptides or proteins. In addition, acyl peptides frequently found in the living body can be sequentially hydrolyzed from the N-terminal. Thereby, N-terminal analysis of the acyl peptide and production of amino acids by hydrolysis of the acyl peptide can be performed.
[0060]
Further, since the aminopeptidase of the present invention has extremely high heat resistance, N-terminal analysis of an acyl peptide and production of an amino acid can be performed at a much higher temperature than before. As a result, a reaction can be efficiently performed on a high-concentration substrate solution. Peptides vary depending on the type of constituent amino acids, but generally, the longer the peptide, the lower the solubility in water. When the aminopeptidase of the present invention is used, even a peptide having poor water solubility can be efficiently hydrolyzed to a high-concentration peptide solution prepared at a high temperature. In addition, since hydrolysis can be performed at a high temperature, the effects of contaminating enzymes, contaminated microorganisms, and the like can be suppressed.
[0061]
The aminopeptidase of the present invention has a stable molecular structure and is therefore stable to organic solvents. Therefore, even for a peptide or protein that is difficult to dissolve in water but easily dissolves in an organic solvent, a high-concentration peptide or protein solution can be prepared using the organic solvent, and the hydrolysis reaction can be efficiently performed accordingly. And the range of the target peptide is expanded.
[0062]
Further, the aminopeptidase of the present invention is stable even at room temperature, and can withstand long-term storage.
[0063]
In addition, the aminopeptidase of the present invention has an extremely high molecular activity not found in conventional thermostable aminopeptidases, and therefore can perform acylpeptide hydrolysis reaction very efficiently.
[0064]
[Sequence list]

[Brief description of the drawings]
FIG. 1 (A) is a graph showing the optimal temperature of a first aminopeptidase derived from Pyrococcus horikoshi JCM9974, and FIG. 1 (B) shows the optimal temperature of a second aminopeptidase derived from the same strain. It is a graph shown.
FIG. 2 (A) is a graph showing the residual activity when a first aminopeptidase derived from Pyrococcus horikoshii JCM9974 was heat-treated. FIG. 2 (B) is a graph showing the heat-treated second aminopeptidase derived from the same strain. 4 is a graph showing the residual activity in the case of performing the above.

Claims

A thermostable aminopeptidase having the following properties (a) and (b):
(A) It has an aminopeptidase activity having a molecular activity of 200 (1 / second) or more for Ala-Ala-Ala in an environment of 85 ° C. and pH 7.5.
(B) It also has the activity of degrading peptides or proteins whose N-terminal is acylated.

The thermostable aminopeptidase according to claim 1, which has the following properties (c) and (d).
(C) Heat treatment at 98 ° C. for 1 hour leaves 90% or more aminopeptidase activity.
(D) The optimal temperature of aminopeptidase activity is 100 ° C. or more at pH 7.5.

The thermostable aminopeptidase according to claim 1 or 2, which is an enzyme derived from Pyrococcus horikoshii.

The following polypeptide (1) or (2):
(1) A polypeptide consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2.
(2) SEQ ID NO: 2 consists of an amino acid sequence in which one or more amino acids have been deleted, substituted or added, and has a molecular activity of 200 against Ala-Ala-Ala at 85 ° C. and pH 7.5. A polypeptide having an aminopeptidase activity of (1 / sec) or more and also having an activity of degrading a peptide or protein having an acylated N-terminal.

The polynucleotide of the following (3), (4) or (5).
(3) a polynucleotide consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1;
(4) It hybridizes with a polynucleotide consisting of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1 under stringent conditions, and has a molecular activity of 200 (1/1) for Ala-Ala-Ala in an environment of 85 ° C. and pH 7.5. A polynucleotide that encodes a polypeptide having an aminopeptidase activity of at least 2 seconds) and also having the activity of degrading an N-terminally acylated peptide or protein.
(5) A polynucleotide encoding the polypeptide according to claim 4.

The polypeptide of the following (6) or (7).
(6) a polypeptide consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4;
(7) SEQ ID NO: 4 comprises an amino acid sequence in which one or more amino acids have been deleted, substituted or added, and has a molecular activity against Ala-Ala-Ala of 200 in an environment of 85 ° C. and pH 7.5. A polypeptide having an aminopeptidase activity of (1 / sec) or more and also having an activity of degrading a peptide or protein having an acylated N-terminal.

The polynucleotide of the following (8), (9) or (10).
(8) A polynucleotide consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 3.
(9) It hybridizes with a polynucleotide consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 3 under stringent conditions, and has a molecular activity of 200 (1/1) for Ala-Ala-Ala in an environment of 85 ° C. and pH 7.5. A polynucleotide that encodes a polypeptide having an aminopeptidase activity of at least 2 seconds) and also having the activity of degrading an N-terminally acylated peptide or protein.
(10) A polynucleotide encoding the polypeptide according to claim 6.

A vector comprising the polynucleotide according to claim 5.

A transformant carrying the vector according to claim 8.

A method for culturing the transformant according to claim 9 and recovering a thermostable aminopeptidase from the transformant.