JP5626263B2 - RrhJ1I modifying enzyme and gene thereof - Google Patents

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Description

本発明は、遺伝子工学試薬として有用な制限酵素および修飾酵素、該酵素タンパク質をコードする遺伝子、並びに該酵素の製造方法に関する。   The present invention relates to a restriction enzyme and a modification enzyme useful as a genetic engineering reagent, a gene encoding the enzyme protein, and a method for producing the enzyme.

制限酵素は、ある特定のDNA塩基配列を特異的に認識し、切断することのできるエンド型ヌクレアーゼであり、これまでに数多くの制限酵素が見出されている。
分子遺伝学、または生化学等の発展により、DNAが遺伝を司る本体であることが明らかになって以来、制限酵素は遺伝病の解明や、遺伝子操作等において現在幅広く用いられている有用な酵素である。このうち、特にDNA塩基配列を特異的に認識し、特定のDNAを切断するII型制限酵素が重要かつ必要なものとして用いられている。 Restriction enzymes are endo-type nucleases that can specifically recognize and cleave a specific DNA base sequence, and many restriction enzymes have been found so far.
Since the development of molecular genetics or biochemistry has made it clear that DNA is the main body that controls inheritance, restriction enzymes are useful enzymes that are currently widely used in elucidation of genetic diseases and genetic manipulation. It is. Among these, a type II restriction enzyme that specifically recognizes a DNA base sequence and cleaves a specific DNA is used as an important and necessary one.

これまでにII型制限酵素は300種以上が精製されている。それらの中で、GCCGGCを認識する制限酵素としては40種近くのイソチゾマー（isoschizomer）が存在することが知られており、例えば、NaeI（タカラバイオ他）、NgoMIV（New England Biolabs、Promega）、MroNI（SibEnzyme）、PdiI（Fermentas）が市販されている。ここで、イソチゾマーは、認識配列が互いに一致している酵素のペアを意味する。   To date, more than 300 type II restriction enzymes have been purified. Among them, it is known that there are nearly 40 kinds of isochizomers as restriction enzymes that recognize GCCGGC. For example, NaeI (Takara Bio et al.), NgoMIV (New England Biolabs, Promega), MroNI (SibEnzyme) and PdiI (Fermentas) are commercially available. Here, isothizomer means a pair of enzymes whose recognition sequences are identical to each other.

また、特異的なDNA配列をメチル化する修飾酵素が数多く見出されている。
これまでに種々の微生物において制限酵素および修飾酵素の存在が確認されており、これらの酵素は、宿主内で制限・修飾系に関与していることが知られている。 In addition, many modifying enzymes that methylate specific DNA sequences have been found.
Until now, the presence of restriction enzymes and modification enzymes has been confirmed in various microorganisms, and these enzymes are known to be involved in restriction / modification systems in the host.

例えば、NaeI制限酵素および修飾酵素は、Lechevalieria aerocolonigenes ATCC23870（Nocardia aerocolonigenes）に存在することが知られている。しかし、この細菌中に含まれる制限酵素および修飾酵素の含量は少ないため、両酵素を大量に得ることは困難であった。
これまでに、染色体中に組み込まれたMspIメチラーゼ遺伝子を有する大腸菌K802株を用いてNaeI制限酵素の生産を行った結果、この大腸菌は、細胞１μg当たり、野生株（Lechevalieria aerocolonigenes ATCC23870）の50倍の活性（37℃、１時間の反応で１μgのDNAを分解できる酵素量）を有していたことが報告されている（特許文献１）。 For example, NaeI restriction enzymes and modification enzymes are known to be present in Lechevalieria aerocolonigenes ATCC 23870 (Nocardia aerocolonigenes). However, since the contents of restriction enzymes and modifying enzymes contained in the bacteria are small, it has been difficult to obtain both enzymes in large quantities.
So far, as a result of production of NaeI restriction enzyme using E. coli K802 strain having MspI methylase gene integrated in the chromosome, this E. coli is 50 times as much as wild strain (Lechevalieria aerocolonigenes ATCC23870) per 1 μg of cells. It has been reported that it had activity (the amount of enzyme capable of degrading 1 μg of DNA by reaction at 37 ° C. for 1 hour) (Patent Document 1).

ところで、ロドコッカス属（Rhodococcus）に属する細菌において、制限酵素は15例が報告されているに過ぎない。例えば、6塩基配列を認識する制限酵素としてBamHI（GGATCC）、SalI（GTCGAC）、BspHI（TCATGA）、SphI（GCATCG）のイソチゾマーや、4塩基配列を認識する制限酵素としてMboI（GATC）やNlaIV（GGNNCC）のイソチゾマーが見出されている。しかし、GCCGGCを認識する制限酵素および修飾酵素はこれまでに見出されていなかった。   By the way, in bacteria belonging to the genus Rhodococcus, only 15 cases of restriction enzymes have been reported. For example, BamHI (GGATCC), SalI (GTCGAC), BspHI (TCATGA), and SphI (GCATCG) isothizomers as restriction enzymes that recognize 6 base sequences, and MboI (GATC) and NlaIV ( GGNNCC) isothizomer has been found. However, a restriction enzyme and a modification enzyme that recognize GCCGGC have not been found so far.

特開平６−９８７７９号公報JP-A-6-98779

本発明の目的は、遺伝子工学の分野で有用なGCCGGCを認識する制限酵素および修飾酵素、さらには該酵素タンパク質をコードする制限酵素遺伝子および修飾酵素遺伝子を提供することである。また、本発明の目的は、該制限酵素および修飾酵素の製造方法を提供することである。   An object of the present invention is to provide a restriction enzyme and a modification enzyme that recognize GCCGGC useful in the field of genetic engineering, and further a restriction enzyme gene and a modification enzyme gene encoding the enzyme protein. Moreover, the objective of this invention is providing the manufacturing method of this restriction enzyme and modification enzyme.

本発明者は上記課題を解決するために鋭意研究を行った結果、ロドコッカス属に属する細菌において新規の制限酵素および修飾酵素を見出した。詳しくは、本発明者は、ロドコッカス・ロドクロウス（Rhodococcus rhodochrous）J-1株から、制限酵素を精製した。このJ1菌由来の制限酵素のDNA切断パターンはNaeIのものと一致したことから、得られたJ1菌制限酵素はNaeIのイソチゾマーであることが示された。また、ロドコッカス・ロドクロウスJ-1株から修飾酵素を単離した。そして、得られたJ1菌修飾酵素の塩基配列情報から、J1菌制限酵素を単離した。このように、本発明者は、ロドコッカス属に属する細菌における新規の制限酵素および修飾酵素を見出し、本発明を完成した。   As a result of intensive studies to solve the above problems, the present inventor has found novel restriction enzymes and modification enzymes in bacteria belonging to the genus Rhodococcus. Specifically, the present inventors purified a restriction enzyme from Rhodococcus rhodochrous J-1 strain. Since the DNA cleavage pattern of the restriction enzyme derived from J1 was consistent with that of NaeI, it was shown that the obtained restriction enzyme of J1 was an isozyme of NaeI. In addition, a modifying enzyme was isolated from Rhodococcus rhodochrous J-1. Then, J1 bacteria restriction enzyme was isolated from the obtained base sequence information of the J1 bacteria modifying enzyme. Thus, the present inventors have found a novel restriction enzyme and modification enzyme in bacteria belonging to the genus Rhodococcus, and have completed the present invention.

すなわち、本発明は、以下の発明を包含する。
（１）以下の（Ａ）または（Ｂ）のタンパク質。
（Ａ）配列番号２記載のアミノ酸配列を含むタンパク質
（Ｂ）配列番号２記載のアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列を含み、かつRrhJ1I制限酵素活性を有するタンパク質
（２）（１）記載のタンパク質をコードする遺伝子。
（３）以下の（ａ）または（ｂ）のDNAを含む遺伝子。
（ａ）配列番号１記載の塩基配列からなるDNA
（ｂ）配列番号１記載の塩基配列からなるDNAと相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつRrhJ1I制限酵素活性を有するタンパク質をコードするDNA
（４）以下の（Ａ）または（Ｂ）のタンパク質。
（Ａ）配列番号４記載のアミノ酸配列を含むタンパク質
（Ｂ）配列番号４記載のアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列を含み、かつRrhJ1I修飾酵素活性を有するタンパク質
（５）（４）記載のタンパク質をコードする遺伝子。
（６）以下の（ａ）または（ｂ）のDNAを含む遺伝子。
（ａ）配列番号３記載の塩基配列からなるDNA
（ｂ）配列番号３記載の塩基配列からなるDNAと相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつRrhJ1I修飾酵素活性を有するタンパク質をコードするDNA
（７）（２）、（３）、（５）、または（６）のいずれか１項に記載の遺伝子を含む組換えベクター。
（８）（７）記載の組換えベクターを含む形質転換体。
（９）（８）記載の形質転換体の培養物からRrhJ1I制限酵素活性を有するタンパク質を採取することを含む、RrhJ1I制限酵素の製造方法。
（１０）（８）記載の形質転換体の培養物からRrhJ1I修飾酵素活性を有するタンパク質を採取することを含む、RrhJ1I修飾酵素の製造方法。 That is, the present invention includes the following inventions.
(1) The following protein (A) or (B).
(A) a protein comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 (B) an amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 comprising an amino acid sequence in which one or several amino acids have been deleted, substituted or added, and RrhJ1I restriction enzyme activity (2) A gene encoding the protein according to (1).
(3) A gene containing the following DNA (a) or (b):
(A) DNA comprising the base sequence described in SEQ ID NO: 1
(B) a DNA that hybridizes under stringent conditions with a DNA consisting of a base sequence complementary to the DNA consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 1 and which encodes a protein having RrhJ1I restriction enzyme activity
(4) The following protein (A) or (B).
(A) a protein comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4 (B) an amino acid sequence of SEQ ID NO: 4 comprising an amino acid sequence in which one or several amino acids have been deleted, substituted or added, and RrhJ1I modifying enzyme activity (5) A gene encoding the protein according to (4).
(6) A gene comprising the following DNA (a) or (b):
(A) DNA comprising the base sequence described in SEQ ID NO: 3
(B) a DNA that hybridizes under stringent conditions with a DNA consisting of a base sequence complementary to the DNA consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 3 and which encodes a protein having RrhJ1I-modifying enzyme activity
(7) A recombinant vector comprising the gene according to any one of (2), (3), (5), or (6).
(8) A transformant comprising the recombinant vector according to (7).
(9) A method for producing a RrhJ1I restriction enzyme, comprising collecting a protein having RrhJ1I restriction enzyme activity from the culture of the transformant according to (8).
(10) A method for producing an RrhJ1I-modifying enzyme, comprising collecting a protein having RrhJ1I-modifying enzyme activity from the culture of the transformant according to (8).

本発明により、遺伝子工学の分野で有用なGCCGGCを認識する制限酵素および修飾酵素、さらには該酵素タンパク質をコードする制限酵素遺伝子および修飾酵素遺伝子が提供される。また、本発明の遺伝子を用いて、該制限酵素および修飾酵素の製造が可能となるため、該制限酵素および修飾酵素を大量に生産することができる。   According to the present invention, there are provided a restriction enzyme and a modification enzyme that recognize GCCGGC useful in the field of genetic engineering, and a restriction enzyme gene and a modification enzyme gene encoding the enzyme protein. Moreover, since the restriction enzyme and the modification enzyme can be produced using the gene of the present invention, the restriction enzyme and the modification enzyme can be produced in large quantities.

また、本発明の制限酵素および修飾酵素は、制限修飾系を構成しているため、本発明の酵素および本発明の遺伝子は、例えば、制限修飾系の研究試薬として、非常に有用である。   Moreover, since the restriction enzyme and the modification enzyme of the present invention constitute a restriction modification system, the enzyme of the present invention and the gene of the present invention are very useful, for example, as a research reagent for the restriction modification system.

pJRM01の構造を示す模式図である。It is a schematic diagram which shows the structure of pJRM01. 制限・修飾酵素遺伝子の制限酵素地図を示す図である。It is a figure which shows the restriction enzyme map of a restriction | limiting and modification enzyme gene. pTJM01の構築図である。It is a construction figure of pTJM01. 組換え体の超音波破砕上清を、SDS-PAGEした結果を示す図である。It is a figure which shows the result of having carried out SDS-PAGE of the ultrasonic disruption supernatant of a recombinant. pMCLMの構造を示す模式図である。It is a schematic diagram which shows the structure of pMCLM. pGErR10の構造を示す模式図である。FIG. 3 is a schematic diagram showing the structure of pGErR10. 無細胞抽出液を使用した切断結果を示す図である。It is a figure which shows the cutting result using a cell-free extract.

以下、本発明の実施の形態について詳細に説明するが、本実施の形態は、本発明を説明するための例示であり、本発明をこの実施の形態のみに限定させるものではない。   Hereinafter, although an embodiment of the present invention is described in detail, this embodiment is an example for explaining the present invention, and the present invention is not limited only to this embodiment.

本発明は、ロドコッカス・ロドクロウス（Rhodococcus rhodochrous）J-1株（FERM BP-1478）由来の制限酵素（RrhJ1I制限酵素）および修飾酵素（RrhJ1I修飾酵素）に関するものである。ロドコッカス・ロドクロウスJ-1株（以下、「J1菌」ともいう）は、「Rhodococcus rhodochrous J-1」（FERM BP-1478）として独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センター（茨城県つくば市東１丁目１番地１ 中央第６）に寄託されている。   The present invention relates to a restriction enzyme (RrhJ1I restriction enzyme) and a modification enzyme (RrhJ1I modification enzyme) derived from Rhodococcus rhodochrous J-1 strain (FERM BP-1478). Rhodococcus rhodochrous J-1 strain (hereinafter also referred to as “J1 bacterium”) is called “Rhodococcus rhodochrous J-1” (FERM BP-1478). It is deposited at 1-chome, 1-address 1 and center 6).

本発明のRrhJ1I制限酵素およびRrhJ1I修飾酵素は、ロドコッカス属に属する細菌の自己防御系としての制限修飾系を構成していると考えられる。   The RrhJ1I restriction enzyme and the RrhJ1I modification enzyme of the present invention are considered to constitute a restriction modification system as a self-protection system for bacteria belonging to the genus Rhodococcus.

細菌の多くは、制限修飾系によって、外来のDNAから自己のDNAを守っている。つまり、修飾酵素により自己のDNAを修飾（メチル化）することで、自己のDNAを修飾型の異なる外来のDNAと区別している。そして、外来のDNAは、しかるべき位置にメチル基の無いことが制限酵素に認識され、制限酵素により切断される。   Many bacteria protect their DNA from foreign DNA by a restriction modification system. In other words, by modifying (methylating) its own DNA with a modifying enzyme, it distinguishes its own DNA from foreign DNAs of different modified types. The foreign DNA is recognized by the restriction enzyme as having no methyl group at an appropriate position, and is cleaved by the restriction enzyme.

制限修飾系を保持する細菌が安定な増殖を維持するためには、両酵素活性のバランスが適切に保たれる必要がある。すなわち、制限酵素が発現し、機能する前に、修飾酵素によって染色体遺伝子がメチル化され、制限酵素の切断から保護される必要がある。そのため、制限酵素遺伝子と修飾酵素遺伝子の転写および翻訳は、高度に制御されている必要がある。したがって、両遺伝子はゲノム上において近傍に位置することによって、オペロンを形成したり、特異的な転写制御因子による制御を受けられるように進化したと考えられる。このように、制限酵素と対応する修飾酵素とは密接な関係にあるため、両者を同時に提供する本発明は、非常に有用である。   In order for a bacterium carrying a restriction modification system to maintain stable growth, the balance between the activities of both enzymes needs to be maintained appropriately. That is, before the restriction enzyme is expressed and functions, the chromosomal gene must be methylated by the modifying enzyme and protected from restriction enzyme cleavage. Therefore, transcription and translation of restriction enzyme genes and modification enzyme genes must be highly controlled. Therefore, it is considered that both genes have evolved so that they can be controlled by specific transcription control factors by forming operons by being located in the vicinity of the genome. Thus, since the restriction enzyme and the corresponding modification enzyme are closely related, the present invention that provides both of them is very useful.

本明細書において、「制限酵素」は、ある特定の塩基配列を特異的に認識し、特定位置でDNAを切断することのできる酵素を意味する。本発明において、制限酵素は、好ましくは、エンド型ヌクレアーゼ（II型制限酵素）である。   In the present specification, the “restriction enzyme” means an enzyme that can specifically recognize a specific base sequence and cleave DNA at a specific position. In the present invention, the restriction enzyme is preferably an endonuclease (type II restriction enzyme).

本明細書において、「RrhJ1I制限酵素」（「J1菌制限酵素」ともいう）は、ロドコッカス・ロドクロウスJ-1株で発現する制限酵素であり、GCCGGCの6塩基配列を認識し、DNAを切断する活性（「RrhJ1I制限酵素活性」ともいう）を有するタンパク質を意味する。本発明のRrhJ1I制限酵素による認識部位と切断部位とは、同一でもよく、または異なっていてもよい。切断されるDNAは、１本鎖DNAまたは２本鎖DNAのいずれでもよい。また、切断後のDNA末端は、例えば、5'突出末端、3'突出末端または平滑末端のいずれでもよい。   In the present specification, “RrhJ1I restriction enzyme” (also referred to as “J1 bacterial restriction enzyme”) is a restriction enzyme expressed in Rhodococcus rhodochrous strain J-1, recognizes the 6 nucleotide sequence of GCCGGC, and cleaves DNA. It means a protein having activity (also referred to as “RrhJ1I restriction enzyme activity”). The recognition site and cleavage site by the RrhJ1I restriction enzyme of the present invention may be the same or different. The DNA to be cleaved may be either single-stranded DNA or double-stranded DNA. Further, the DNA end after cleavage may be any of 5 ′ protruding end, 3 ′ protruding end or blunt end, for example.

本明細書において、RrhJ1I制限酵素活性は、RrhJ1I制限酵素をDNAと接触させ、接触後のDNAの分子量またはDNA断片数を測定することにより評価することができる。当業者であれば、基質DNA、接触時の酵素量、温度、溶液組成または接触時間などの条件を設定することができる。DNAの分子量は、例えば、アガロース電気泳動によって測定することができる。接触前のDNAの分子量と接触後のDNAの分子量、または接触前のDNAの断片数と接触後DNAの断片数とを比較することで、RrhJ1I制限酵素活性を評価することができる。また、GCCGGCを認識する既知の制限酵素を対照として使用してもよい。   In this specification, the RrhJ1I restriction enzyme activity can be evaluated by contacting the RrhJ1I restriction enzyme with DNA and measuring the molecular weight or the number of DNA fragments after the contact. A person skilled in the art can set conditions such as substrate DNA, enzyme amount at the time of contact, temperature, solution composition or contact time. The molecular weight of DNA can be measured, for example, by agarose electrophoresis. RrhJ1I restriction enzyme activity can be evaluated by comparing the molecular weight of DNA before contact with the molecular weight of DNA after contact, or the number of DNA fragments before contact and the number of DNA fragments after contact. In addition, a known restriction enzyme that recognizes GCCGGC may be used as a control.

本明細書において、「修飾酵素」は、対応する制限酵素による切断からDNAを保護するようにDNAに修飾することのできる酵素を意味する。この場合、対応する修飾酵素および制限酵素は、同一の配列を特異的に認識する。本明細書において、同一の微生物に由来する酵素であって、同一の塩基配列を認識する制限酵素と修飾酵素との関係を、「対応する」と称する場合がある。本発明において、修飾酵素は、好ましくは、DNAをメチル化するメチラーゼである。   As used herein, “modifying enzyme” means an enzyme that can be modified into DNA to protect the DNA from cleavage by the corresponding restriction enzyme. In this case, the corresponding modifying enzyme and restriction enzyme specifically recognize the same sequence. In the present specification, the relationship between a restriction enzyme that is an enzyme derived from the same microorganism and recognizes the same base sequence and the modifying enzyme may be referred to as “corresponding”. In the present invention, the modifying enzyme is preferably a methylase that methylates DNA.

本明細書において、「RrhJ1I修飾酵素」（「J1菌修飾酵素」ともいう）は、ロドコッカス・ロドクロウスJ-1株で発現する修飾酵素であり、RrhJ1I制限酵素による切断からDNAを保護する活性（「RrhJ1I修飾酵素活性」ともいう）を有するタンパク質を意味する。本発明のRrhJ1I修飾酵素による認識部位と修飾部位とは、同一でもよく、または異なっていてもよい。発明のRrhJ1I修飾酵素により修飾される塩基およびその数は特に限定されない。例えば、RrhJ1I修飾酵素は、認識配列中の１〜３個のシトシンをメチル化することができる。   In the present specification, “RrhJ1I-modifying enzyme” (also referred to as “J1 bacterium-modifying enzyme”) is a modifying enzyme expressed in Rhodococcus rhodochrous J-1 strain, and has an activity of protecting DNA from cleavage by RrhJ1I restriction enzyme (“ It also means a protein having “RrhJ1I-modifying enzyme activity”. The recognition site and the modification site by the RrhJ1I modifying enzyme of the present invention may be the same or different. The base modified by the RrhJ1I modifying enzyme of the invention and the number thereof are not particularly limited. For example, RrhJ1I modifying enzyme can methylate 1 to 3 cytosines in the recognition sequence.

本明細書において、RrhJ1I修飾酵素活性は、RrhJ1I修飾酵素を接触させたDNAにRrhJ1I制限酵素またはそのイソチゾマーを接触させ、制限酵素接触後のDNAの分子量またはDNAの断片数を測定することにより評価することができる。当業者であれば、基質DNA、修飾酵素または制限酵素による接触時の酵素量、温度、溶液組成または接触時間などの条件を設定することができる。修飾酵素に接触させた後もしくは制限酵素に接触前のDNAの分子量と制限酵素に接触後のDNAの分子量、または修飾酵素に接触させた後もしくは制限酵素に接触前のDNA断片数と制限酵素に接触後のDNA断片数とを比較することで、RrhJ1I修飾酵素活性を評価することができる。RrhJ1I修飾酵素活性を評価する際、GCCGGCを認識する制限酵素に対応する既知の修飾酵素を対照として使用してもよい。   In this specification, RrhJ1I-modifying enzyme activity is evaluated by contacting RrhJ1I restriction enzyme or its isothizomer with DNA contacted with RrhJ1I-modifying enzyme, and measuring the molecular weight of DNA or the number of DNA fragments after contact with the restriction enzyme. be able to. A person skilled in the art can set conditions such as the amount of enzyme, temperature, solution composition, or contact time when contacting with substrate DNA, a modified enzyme, or a restriction enzyme. The molecular weight of the DNA after contact with the modified enzyme or before contacting the restriction enzyme and the molecular weight of the DNA after contact with the restriction enzyme, or the number of DNA fragments after contacting with the modified enzyme or before contacting the restriction enzyme and the restriction enzyme The RrhJ1I modifying enzyme activity can be evaluated by comparing the number of DNA fragments after contact. In evaluating RrhJ1I modifying enzyme activity, a known modifying enzyme corresponding to a restriction enzyme that recognizes GCCGGC may be used as a control.

（１）RrhJ1I制限・修飾系酵素
本発明のRrhJ1I制限酵素は、例えば、配列番号２に記載のアミノ酸配列を含むものである。配列番号２に記載のアミノ酸配列を含むタンパク質は、例えば、配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質である。 (1) RrhJ1I restriction / modification system enzyme The RrhJ1I restriction enzyme of the present invention comprises, for example, the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 2. The protein containing the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 2 is a protein consisting of the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 2, for example.

また、本発明のRrhJ1I制限酵素は、前記のものに限定されることはなく、配列番号２に記載のアミノ酸配列の全部または一部を含むタンパク質であって、かつRrhJ1I制限酵素活性を有するタンパク質を含むものである。
また、本発明のRrhJ1I制限酵素には、配列番号２記載のアミノ酸配列と約５０％以上、好ましくは約６０％以上、より好ましくは約７０％以上、さらに好ましくは約８０％以上、特に好ましくは約９０％以上、さらに特に好ましくは約９５％以上、最も好ましくは約９８％以上の相同性（同一性）を有するアミノ酸配列を含み、かつRrhJ1I制限酵素活性を有するタンパク質も含まれる。
さらに、配列番号２記載のアミノ酸配列において、１または数個のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列を含み、かつRrhJ1I制限酵素活性を有するタンパク質も本発明のRrhJ1I制限酵素に含まれる。 In addition, the RrhJ1I restriction enzyme of the present invention is not limited to the above, and is a protein containing all or part of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 and having RrhJ1I restriction enzyme activity. Is included.
In addition, the RrhJ1I restriction enzyme of the present invention has about 50% or more, preferably about 60% or more, more preferably about 70% or more, still more preferably about 80% or more, particularly preferably the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2. A protein having an amino acid sequence having a homology (identity) of about 90% or more, more particularly preferably about 95% or more, most preferably about 98% or more, and having RrhJ1I restriction enzyme activity is also included.
Furthermore, the RrhJ1I restriction enzyme of the present invention also includes a protein having an amino acid sequence in which one or several amino acids are deleted, substituted or added in the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 2 and having RrhJ1I restriction enzyme activity.

本発明のRrhJ1I修飾酵素は、例えば、配列番号４に記載のアミノ酸配列を含むものでである。配列番号４に記載のアミノ酸配列を含むタンパク質は、例えば、配列番号４に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質である。
また、本発明のRrhJ1I修飾酵素は、前記のものに限定されることはなく、配列番号４記載のアミノ酸配列の全部または一部を含むタンパク質であって、かつRrhJ1I修飾酵素活性を有するタンパク質を含むものである。
また、本発明のRrhJ1I修飾酵素には、配列番号４記載のアミノ酸配列と約７０％以上、好ましくは約８０％以上、より好ましくは約９０％以上、さらに好ましくは約９５％以上、最も好ましくは約９８％以上の相同性（同一性）を有するアミノ酸配列を含み、かつRrhJ1I修飾酵素活性を有するタンパク質も含まれる。
さらに、配列番号４記載のアミノ酸配列において、１または数個のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列を含み、かつRrhJ1I修飾酵素活性を有するタンパク質も本発明のRrhJ1I修飾酵素に含まれる。 The RrhJ1I modifying enzyme of the present invention includes, for example, the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 4. The protein containing the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 4 is a protein consisting of the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 4, for example.
In addition, the RrhJ1I modifying enzyme of the present invention is not limited to the above, and includes a protein containing all or part of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 4 and having RrhJ1I modifying enzyme activity. It is a waste.
In addition, the RrhJ1I modifying enzyme of the present invention contains about 70% or more, preferably about 80% or more, more preferably about 90% or more, still more preferably about 95% or more, most preferably the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 4. A protein having an amino acid sequence having about 98% homology (identity) and having RrhJ1I modifying enzyme activity is also included.
Furthermore, the RrhJ1I modifying enzyme of the present invention also includes a protein having an amino acid sequence in which one or several amino acids are deleted, substituted or added in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 4 and having RrhJ1I modifying enzyme activity.

前記の配列番号２または４記載のアミノ酸配列において、１または数個のアミノ酸に欠失、置換または付加等の変異が生じたアミノ酸配列としては、例えば（i）配列番号２または４記載のアミノ酸配列において、１〜２０個（例えば１〜１０個、好ましくは１〜５個、さらに好ましくは１〜２個）のアミノ酸が欠失したアミノ酸配列、（ii）配列番号２または４記載のアミノ酸配列の１〜２０個（例えば１〜１０個、好ましくは１〜５個、さらに好ましくは１〜２個）のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されたアミノ酸配列、（iii）配列番号２または４記載のアミノ酸配列に１〜２０個（例えば１〜１０個、好ましくは１〜５個、さらに好ましくは１〜２個）のアミノ酸が付加したアミノ酸配列、（iv）配列番号２または４記載のアミノ酸配列に１〜２０個（例えば１〜１０個、好ましくは１〜５個、さらに好ましくは１〜２個）のアミノ酸が挿入されたアミノ酸配列、（v）上記（i）〜（iv）を組み合わせたアミノ酸配列が挙げられる。   In the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 2 or 4, for example, (i) the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 2 or 4 is an amino acid sequence in which mutation such as deletion, substitution or addition has occurred in one or several amino acids. 1 to 20 (for example, 1 to 10, preferably 1 to 5, more preferably 1 to 2) of amino acid sequence deleted, (ii) the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 or 4 An amino acid sequence in which 1 to 20 (for example, 1 to 10, preferably 1 to 5, more preferably 1 to 2) amino acids are substituted with other amino acids, (iii) the amino acid described in SEQ ID NO: 2 or 4 An amino acid sequence in which 1 to 20 (for example, 1 to 10, preferably 1 to 5, more preferably 1 to 2) amino acids are added to the sequence; (iv) the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 or 4 An amino acid sequence in which 1 to 20 (for example, 1 to 10, preferably 1 to 5, more preferably 1 to 2) amino acids are inserted; (v) an amino acid combining (i) to (iv) above Examples include sequences.

（２）RrhJ1I制限酵素遺伝子およびRrhJ1I修飾酵素遺伝子
本発明のRrhJ1I 制限酵素遺伝子は、本発明のRrhJ1I制限酵素をコードする遺伝子である。本発明のRrhJ1I制限酵素は前述のとおりである。本発明のRrhJ1I制限酵素遺伝子は、例えば、配列番号１に記載の塩基配列からなるDNAを含むものが挙げられるが、これに限定されるものではない。
本発明のRrhJ1I 制限酵素遺伝子には、配列番号１記載の塩基配列と約５０％以上、好ましくは約６０％以上、より好ましくは約７０％以上、さらに好ましくは約８０％以上、特に好ましくは約９０％以上、さらに特に好ましくは約９５％以上、最も好ましくは約９８％以上の相同性（同一性）を有する塩基配列であって、RrhJ1I制限酵素活性を有するタンパク質をコードする塩基配列からなるDNAが含まれる。
また、本発明のRrhJ1I制限酵素遺伝子には、上記のDNAのほか、配列番号１に記載の塩基配列において、１個または数個の塩基に欠失、置換または付加等の変異が生じた塩基配列であって、RrhJ1I制限酵素活性を有するタンパク質をコードする塩基配列からなるDNAが含まれる。
また、本発明のRrhJ1I制限酵素遺伝子には、配列番号１に記載の塩基配列からなるDNAと相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつRrhJ1I 制限酵素活性を有するタンパク質をコードするDNAが含まれる。これらの遺伝子などは本発明のRrhJ1I制限酵素遺伝子に含まれる。ストリンジェントな条件については後述する。 (2) RrhJ1I restriction enzyme gene and RrhJ1I modification enzyme gene The RrhJ1I restriction enzyme gene of the present invention is a gene encoding the RrhJ1I restriction enzyme of the present invention. The RrhJ1I restriction enzyme of the present invention is as described above. Examples of the RrhJ1I restriction enzyme gene of the present invention include, but are not limited to, those containing DNA comprising the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 1.
The RrhJ1I restriction enzyme gene of the present invention contains about 50% or more, preferably about 60% or more, more preferably about 70% or more, more preferably about 80% or more, particularly preferably about 50% or more of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1. DNA comprising a nucleotide sequence having a homology (identity) of 90% or more, more preferably about 95% or more, most preferably about 98% or more, and encoding a protein having RrhJ1I restriction enzyme activity Is included.
In addition to the above DNA, the RrhJ1I restriction enzyme gene of the present invention has a nucleotide sequence in which mutation such as deletion, substitution or addition has occurred in one or several bases in the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 1. In addition, DNA comprising a base sequence encoding a protein having RrhJ1I restriction enzyme activity is included.
Further, the RrhJ1I restriction enzyme gene of the present invention hybridizes under stringent conditions with a DNA consisting of a base sequence complementary to the DNA consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 1, and has RrhJ1I restriction enzyme activity. DNA encoding the protein is included. These genes and the like are included in the RrhJ1I restriction enzyme gene of the present invention. Stringent conditions will be described later.

本発明のRrhJ1I 修飾酵素遺伝子は、本発明のRrhJ1I修飾酵素をコードする遺伝子である。本発明のRrhJ1I修飾酵素は前述のとおりである。本発明のRrhJ1I修飾酵素遺伝子は、例えば、配列番号３に記載の塩基配列からなるDNAを含むものが挙げられるが、これに限定されるものではない。
本発明のRrhJ1I 修飾酵素遺伝子には、配列番号３記載の塩基配列と約７０％以上、好ましくは約８０％以上、より好ましくは約９０％以上、さらに好ましくは約９５％以上、最も好ましくは約９８％以上の相同性（同一性）を有する塩基配列であって、RrhJ1I修飾酵素活性を有するタンパク質をコードする塩基配列からなるDNAが含まれる。
また、本発明のRrhJ1I修飾酵素遺伝子には、上記のDNAのほか、配列番号３に記載の塩基配列において、１個または数個の塩基に欠失、置換または付加等の変異が生じた塩基配列であって、RrhJ1I修飾酵素活性を有するタンパク質をコードする塩基配列からなるDNAが含まれる。
また、本発明のRrhJ1I修飾酵素遺伝子には、配列番号３に記載の塩基配列からなるDNAと相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつRrhJ1I 修飾酵素活性を有するタンパク質をコードするDNAが含まれる。これらの遺伝子も本発明のRrhJ1I修飾酵素遺伝子に含まれる。 The RrhJ1I modifying enzyme gene of the present invention is a gene encoding the RrhJ1I modifying enzyme of the present invention. The RrhJ1I modifying enzyme of the present invention is as described above. Examples of the RrhJ1I-modifying enzyme gene of the present invention include, but are not limited to, those containing DNA comprising the base sequence described in SEQ ID NO: 3.
The RrhJ1I modifying enzyme gene of the present invention contains about 70% or more, preferably about 80% or more, more preferably about 90% or more, more preferably about 95% or more, and most preferably about 70% or more of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 3. DNA having a base sequence having a homology (identity) of 98% or more and encoding a protein having RrhJ1I modifying enzyme activity is included.
In addition to the above DNA, the RrhJ1I modifying enzyme gene of the present invention has a nucleotide sequence in which mutation such as deletion, substitution or addition has occurred in one or several bases in the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 3. Moreover, DNA comprising a base sequence encoding a protein having RrhJ1I modifying enzyme activity is included.
The RrhJ1I modifying enzyme gene of the present invention hybridizes under stringent conditions with a DNA comprising a base sequence complementary to the DNA comprising the base sequence described in SEQ ID NO: 3 and has RrhJ1I modifying enzyme activity. DNA encoding the protein is included. These genes are also included in the RrhJ1I modifying enzyme gene of the present invention.

前記のストリンジェントな条件としては、例えば、DNAを固定したナイロン膜を、６×SSC（１×SSCは塩化ナトリウム8.76g 、クエン酸ナトリウム4.41g を１リットルの水に溶かしたもの）、１％ SDS、100μg／mlサケ精子DNA、0.1％ ウシ血清アルブミン、0.1％ ポリビニルピロリドン、0.1％ フィコールを含む溶液中で６５℃にて２０時間プローブとともに保温してハイブリダイゼーションを行う条件をあげることができるが、これに限定されるわけではない。当業者であれば、このようなバッファーの塩濃度、温度等の条件に加えて、その他のプローブ濃度、プローブの長さ、反応時間等の諸条件を加味し、ハイブリダイゼーションの条件を設定することができる。   Examples of the stringent conditions include, for example, 6 × SSC (1 × SSC is 8.76 g of sodium chloride, 4.41 g of sodium citrate dissolved in 1 liter of water), 1% The conditions for hybridization by incubating with a probe at 65 ° C. for 20 hours in a solution containing SDS, 100 μg / ml salmon sperm DNA, 0.1% bovine serum albumin, 0.1% polyvinylpyrrolidone, 0.1% ficoll can be given. However, it is not limited to this. Those skilled in the art should set hybridization conditions by taking into account various conditions such as probe concentration, probe length, reaction time, etc. in addition to such conditions as buffer salt concentration and temperature. Can do.

ハイブリダイゼーション法の詳細な手順については、Molecular Cloning, A Laboratory Manual 2nd ed.（Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)）等を参照することができる。
以下に、ハイブリダイゼーションによりRrhJ1I制限酵素遺伝子またはRrhJ1I修飾酵素遺伝子を得る方法の一例を示すが、これに限定されるわけではない。 For detailed procedures of the hybridization method, Molecular Cloning, A Laboratory Manual 2nd ed. (Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)) and the like can be referred to.
An example of a method for obtaining an RrhJ1I restriction enzyme gene or an RrhJ1I modification enzyme gene by hybridization is shown below, but is not limited thereto.

まず、適当な遺伝子源から得たDNAを常法に従ってプラスミドやファージベクターに接続してDNAライブラリーを作製する。このライブラリーを適当な宿主に導入して得られる形質転換体をプレート上で培養し、生育したコロニーまたはプラークをニトロセルロースやナイロンの膜に移し取り、変性処理の後にDNAを膜に固定する。この膜をあらかじめ32Ｐ等で標識したプローブを含む上記の組成の溶液中、上記のストリンジェントな条件で保温し、ハイブリダイゼーションを行う。プローブとしては、配列番号２または配列番号４に記載したアミノ酸配列の全部または一部をコードするポリヌクレオチドを含有していればよく、たとえば配列番号１または配列番号３に記載の塩基配列の全部または一部からなるポリヌクレオチドまたはそれを含むポリヌクレオチドを使用することができる。
ハイブリダイゼーションの終了後、非特異的に吸着したプローブを洗い流し、オートラジオグラフィー等によりプローブとハイブリッドを形成したクローンを同定する。この操作をハイブリッド形成クローンを単離できるまで繰り返す。
こうして得られたクローンの中には、目的の酵素活性を有するタンパク質をコードする遺伝子が保持されている。そして、クローンから目的の遺伝子を得るには、アルカリ法などの公知のポリヌクレオチド抽出方法を使用する。 First, a DNA library is prepared by connecting DNA obtained from an appropriate gene source to a plasmid or phage vector according to a conventional method. A transformant obtained by introducing this library into an appropriate host is cultured on a plate, and the grown colonies or plaques are transferred to a nitrocellulose or nylon membrane, and after denaturation treatment, the DNA is immobilized on the membrane. This membrane is incubated in a solution having the above composition containing a probe previously labeled with 32 P or the like under the above stringent conditions to perform hybridization. The probe only needs to contain a polynucleotide encoding all or part of the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 4, for example, the entire nucleotide sequence described in SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 3 or A polynucleotide comprising a part or a polynucleotide containing the same can be used.
After completion of hybridization, the non-specifically adsorbed probe is washed away, and a clone that has hybridized with the probe is identified by autoradiography or the like. This operation is repeated until a hybridizing clone can be isolated.
In the thus obtained clone, a gene encoding a protein having the target enzyme activity is retained. And in order to obtain the target gene from a clone, well-known polynucleotide extraction methods, such as an alkali method, are used.

また、前記の配列番号１または３に記載の塩基配列において１個または数個の塩基に欠失、置換または付加等の変異が生じた塩基配列としては、例えば（i）配列番号１または３に記載の塩基配列において、１〜２０個（例えば１〜１０個、好ましくは１〜５個、さらに好ましくは１〜２個）の塩基が欠失した塩基配列、（ii）配列番号１または３に記載の塩基配列の１〜２０個（例えば１〜１０個、好ましくは１〜５個、さらに好ましくは１〜２個）の塩基が他の塩基で置換された塩基配列、（iii）配列番号１または３に記載の塩基配列に１〜２０個（例えば１〜１０個、好ましくは１〜５個、さらに好ましくは１〜２個）の塩基が付加した塩基配列、（iv）配列番号１または３に記載の塩基配列に１〜２０個（例えば１〜１０個、好ましくは１〜５個、さらに好ましくは１〜２個）の塩基が挿入された塩基配列、（v）上記（i）〜（iv）を組み合わせた塩基配列が挙げられる。   In addition, examples of base sequences in which mutations such as deletion, substitution or addition have occurred in one or several bases in the base sequence described in SEQ ID NO: 1 or 3 include (i) SEQ ID NO: 1 or 3 In the described base sequence, a base sequence from which 1 to 20 (for example, 1 to 10, preferably 1 to 5, more preferably 1 to 2) bases have been deleted, (ii) in SEQ ID NO: 1 or 3 A base sequence in which 1 to 20 bases (for example, 1 to 10, preferably 1 to 5, more preferably 1 to 2) of the described base sequences are substituted with other bases, (iii) SEQ ID NO: 1 Or a base sequence in which 1 to 20 (for example, 1 to 10, preferably 1 to 5, more preferably 1 to 2) bases are added to the base sequence described in 3, (iv) SEQ ID NO: 1 or 3 1 to 20 (for example, 1 to 10 nucleotides, preferably 1-5, more preferably a nucleotide sequence which base is inserted in one to two), and a nucleotide sequence that is a combination of (v) above (i) ~ (iv).

このように種々のDNAが本発明のRrhJ1I制限酵素遺伝子または本発明のRrhJ1I修飾酵素遺伝子の範囲内に含まれるのは、以下の理由によるものである。即ち、遺伝子上でアミノ酸を指定するコドン（３つの塩基の組み合わせ）は、アミノ酸の種類ごとに１〜６種類ずつが存在することが知られている。したがって、あるアミノ酸配列をコードする遺伝子は多数存在することができる。
遺伝子は自然界において決して安定に存在しているものではなく、その塩基配列に変異が起こることはまれではない。遺伝子上に起こった変異によっては、コードされるアミノ酸配列に変化を与えない変異（サイレント変異と呼ばれる）もあり、この場合には同じアミノ酸配列をコードする異なる遺伝子が生じたといえる。したがって、ある特定のアミノ酸配列をコードする遺伝子が単離されても、それを含有する生物が継代されていくうちに同じアミノ酸配列をコードする多種類の遺伝子ができていく可能性は否定できない。 The reason why various DNAs are included within the scope of the RrhJ1I restriction enzyme gene of the present invention or the RrhJ1I modification enzyme gene of the present invention is as follows. That is, it is known that there are 1 to 6 codons (a combination of three bases) for designating amino acids on a gene for each amino acid type. Therefore, there can be many genes encoding a certain amino acid sequence.
Genes never exist stably in nature, and it is not uncommon for mutations to occur in their base sequences. Depending on the mutation that has occurred on the gene, there is also a mutation that does not change the encoded amino acid sequence (called a silent mutation). In this case, it can be said that different genes encoding the same amino acid sequence were generated. Therefore, even if a gene encoding a specific amino acid sequence is isolated, there is no denying the possibility that many kinds of genes encoding the same amino acid sequence will be created as the organism containing it is passaged. .

さらに、同じアミノ酸配列をコードする多種類の遺伝子を人為的に作製することは、種々の遺伝子工学的手法を用いれば困難なことではない。
例えば、遺伝子工学的なタンパク質の生産において、目的のタンパク質をコードする本来の遺伝子上で使用されているコドンが宿主中では使用頻度の低いものであった場合には、タンパク質の発現量が低いことがある。このような場合にはコードされているアミノ酸配列に変化を与えることなく、コドンを宿主で繁用されているものに人為的に変換することにより、目的タンパク質の高発現を図ることが行われている。 Furthermore, it is not difficult to artificially create many kinds of genes that encode the same amino acid sequence using various genetic engineering techniques.
For example, in the production of genetically engineered proteins, if the codons used on the original gene that encodes the target protein are infrequently used in the host, the protein expression level should be low. There is. In such a case, the target protein is highly expressed by artificially converting the codon to that frequently used in the host without changing the encoded amino acid sequence. Yes.

このように、特定のアミノ酸配列をコードする多種類の遺伝子は人為的に作製可能なことは言うまでもなく、自然界においても生成されうるものである。したがって、本発明中に開示された塩基配列と同一の遺伝子ではなくても、RrhJ1I 制限酵素活性または修飾酵素活性を示すタンパク質をコードするDNAである限り、本発明のRrhJ1I制限酵素遺伝子またはRrhJ1I修飾酵素遺伝子に含まれるものである。   Thus, it goes without saying that many kinds of genes encoding specific amino acid sequences can be artificially produced, and can also be generated in nature. Therefore, the RrhJ1I restriction enzyme gene or RrhJ1I modification enzyme of the present invention is not limited to the same gene as the nucleotide sequence disclosed in the present invention, as long as it is a DNA encoding a protein exhibiting RrhJ1I restriction enzyme activity or modification enzyme activity. It is included in the gene.

また、本発明は、RrhJ1I制限酵素遺伝子およびRrhJ1I修飾酵素遺伝子の両方を含む遺伝子も含有する。制限酵素をコードする遺伝子および該制限酵素に対応する修飾酵素をコードする遺伝子は、ゲノム上で互いに近傍に位置することが知られている。
本明細書において、「RrhJ1I 制限・修飾系酵素の遺伝子」には、RrhJ1I 制限酵素をコードする遺伝子およびRrhJ1I 制限酵素による切断よりDNAを保護するRrhJ1I修飾酵素をコードする遺伝子が含まれる。 The present invention also includes genes comprising both the RrhJ1I restriction enzyme gene and the RrhJ1I modification enzyme gene. It is known that a gene encoding a restriction enzyme and a gene encoding a modification enzyme corresponding to the restriction enzyme are located close to each other on the genome.
In the present specification, the “RrhJ1I restriction / modification system enzyme gene” includes a gene encoding an RrhJ1I restriction enzyme and a gene encoding an RrhJ1I modification enzyme that protects DNA from cleavage by the RrhJ1I restriction enzyme.

本発明のRrhJ1I制限酵素遺伝子、RrhJ1I修飾酵素遺伝子およびRrhJ1I 制限・修飾系酵素の遺伝子は、これらの酵素を発現する微生物から単離することができる。例えば、ロドコッカス・ロドクロウスJ-1株由来のゲノムDNAを鋳型として、既知のアミノ酸配列情報から遺伝子の縮重を考慮して設計したプライマーもしくはプローブまたは既知の塩基配列情報に基づいて設計したプライマーもしくはプローブを用いたPCRまたはハイブリダイゼーション法により、遺伝子を単離することができる。単離した遺伝子から、本発明のRrhJ1I制限酵素およびRrhJ1I修飾酵素を製造することができる。   The RrhJ1I restriction enzyme gene, the RrhJ1I modification enzyme gene, and the RrhJ1I restriction / modification system enzyme gene of the present invention can be isolated from microorganisms expressing these enzymes. For example, a primer or probe designed based on known amino acid sequence information based on known amino acid sequence information or a primer or probe designed based on known amino acid sequence information using genomic DNA derived from Rhodococcus rhodochrous J-1 as a template The gene can be isolated by PCR or hybridization method using. From the isolated gene, the RrhJ1I restriction enzyme and the RrhJ1I modifying enzyme of the present invention can be produced.

また、遺伝子に変異を導入することによって、１個または数個のアミノ酸に欠失、置換または付加等の変異を導入することもできる。アミノ酸配列と遺伝子に変異を導入するには、Kunkel法や Gapped duplex法等の公知手法により、部位特異的突然変異誘発法を利用した変異導入用キット、例えばQuikChangeTM Site-Directed Mutagenesis Kit（ストラタジーン社）、GeneTailorTM Site-Directed Mutagenesis System（インビトロジェン社）、TaKaRa Site-Directed Mutagenesis System（Mutan-K、Mutan-Super Express Km等：タカラバイオ社）等を用いることができる。   It is also possible to introduce mutations such as deletion, substitution or addition into one or several amino acids by introducing mutations into the gene. To introduce mutations into amino acid sequences and genes, mutation introduction kits using site-directed mutagenesis methods such as the QuikChangeTM Site-Directed Mutagenesis Kit (Stratagene) ), GeneTailor ™ Site-Directed Mutagenesis System (Invitrogen), TaKaRa Site-Directed Mutagenesis System (Mutan-K, Mutan-Super Express Km, etc .: Takara Bio Inc.) and the like can be used.

本発明において、DNAの塩基配列の確認は、慣用の方法により配列決定することにより行うことができる。例えば、ジデオキシヌクレオチドチェーンターミネーション法（Sanger et al. (1977) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74: 5463）等により行うことができる。また、適当なDNAシークエンサーを利用して配列を解析することも可能である。
塩基配列の決定は、プラスミドベクターを用いて作製された形質転換体の場合、宿主がエシェリヒア・コリであれば試験管等で培養を行い、常法に従ってプラスミドを調製する。得られたプラスミドをそのまま鋳型とするか、あるいは挿入断片を取り出してＭ１３ファージベクター等にサブクローニングした後に、ジデオキシ法により塩基配列を決定する。ファージベクターで作製された形質転換体の場合も基本的に同様な操作により塩基配列を決定することができる。これら培養から塩基配列決定までの基本的な実験法については、例えば、前述のT.ManiatisらのMolecular Cloning, A Laboratory Manual等に記載されている。 In the present invention, the DNA base sequence can be confirmed by sequencing by a conventional method. For example, the dideoxynucleotide chain termination method (Sanger et al. (1977) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74: 5463) can be used. It is also possible to analyze the sequence using an appropriate DNA sequencer.
For the determination of the base sequence, in the case of a transformant prepared using a plasmid vector, if the host is Escherichia coli, culture is performed in a test tube or the like, and a plasmid is prepared according to a conventional method. The obtained plasmid is used as a template as it is, or the inserted fragment is taken out and subcloned into an M13 phage vector or the like, and then the base sequence is determined by the dideoxy method. In the case of a transformant prepared with a phage vector, the base sequence can be determined by basically the same operation. The basic experimental method from culture to determination of the base sequence is described in, for example, the above-mentioned T. Maniatis et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual.

得られた遺伝子が目的のRrhJ1I 制限・修飾系酵素をコードする遺伝子であるかどうかの確認は、決定された塩基配列を配列番号１または配列番号３に記載の塩基配列と比較して行うことができる。あるいは決定された塩基配列より推定されるアミノ酸配列を配列番号２または配列番号４に記載のアミノ酸配列と比較して行うことができる。   Whether the obtained gene is a gene encoding the target RrhJ1I restriction / modification system enzyme can be confirmed by comparing the determined base sequence with the base sequence described in SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 3. it can. Alternatively, the amino acid sequence deduced from the determined base sequence can be compared with the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 4.

（３）本発明のRrhJ1I制限酵素およびRrhJ1I修飾酵素の製造方法
本発明のRrhJ1I 制限酵素を製造するには、まず前記のようなRrhJ1I 制限酵素をコードする遺伝子と、RrhJ1I修飾酵素をコードする遺伝子とを組み込んだ組換えベクターを作製する。そして、この組換えベクターで形質転換された形質転換体を作製し、これを培養して、培養物中よりRrhJ1I 制限酵素活性を有するタンパク質を採取することによりRrhJ1I 制限酵素を製造することができる。
この場合、形質転換体はRrhJ1I 制限酵素をコードする遺伝子を含む組換えベクターと、RrhJ1I 修飾酵素をコードする遺伝子を含む組換えベクターの両方の組換えベクターで形質転換された形質転換体を用いてもよい。
また、RrhJ1I修飾酵素をコードする遺伝子の代わりに、RrhJ1I修飾酵素が修飾する塩基配列と同じ塩基配列を修飾する酵素（例としてはNaeI修飾酵素）をコードする遺伝子を用いてもよい。 (3) Production Method of RrhJ1I Restriction Enzyme and RrhJ1I Modification Enzyme of the Present Invention In order to produce the RrhJ1I restriction enzyme of the present invention, first, a gene encoding RrhJ1I restriction enzyme as described above, a gene encoding RrhJ1I modification enzyme, A recombinant vector incorporating the above is prepared. An RrhJ1I restriction enzyme can be produced by preparing a transformant transformed with the recombinant vector, culturing the transformant, and collecting a protein having RrhJ1I restriction enzyme activity from the culture.
In this case, a transformant is obtained by using a transformant transformed with both a recombinant vector containing a gene encoding the RrhJ1I restriction enzyme and a recombinant vector containing a gene encoding the RrhJ1I modifying enzyme. Also good.
Instead of a gene encoding RrhJ1I modifying enzyme, a gene encoding an enzyme (for example, NaeI modifying enzyme) that modifies the same base sequence as that modified by RrhJ1I modifying enzyme may be used.

また、本発明のRrhJ1I 修飾酵素を製造するには、まず前記のようなRrhJ1I 制限酵素をコードする遺伝子と、RrhJ1I 修飾酵素をコードする遺伝子とを組み込んだ組換えベクターを作製する。そして、この組換えベクターで形質転換された形質転換体を作製し、これを培養して、培養物中よりRrhJ1I 修飾酵素活性を有するタンパク質を採取することによりRrhJ1I 修飾酵素を製造することができる。
この場合、形質転換体はRrhJ1I 制限酵素をコードする遺伝子を含む組換えベクターと、RrhJ1I 修飾酵素をコードする遺伝子を含む組換えベクターの両方の組換えベクターで形質転換された形質転換体を用いてもよい。
あるいは、RrhJ1I 修飾酵素をコードする遺伝子を含む組換えベクターのみで形質転換された形質転換体を用いてもよい。 In order to produce the RrhJ1I modifying enzyme of the present invention, first, a recombinant vector incorporating the gene encoding the RrhJ1I restriction enzyme as described above and the gene encoding the RrhJ1I modifying enzyme is prepared. Then, a transformant transformed with this recombinant vector is prepared, cultured, and a protein having RrhJ1I modifying enzyme activity is collected from the culture, whereby the RrhJ1I modifying enzyme can be produced.
In this case, a transformant is obtained by using a transformant transformed with both a recombinant vector containing a gene encoding the RrhJ1I restriction enzyme and a recombinant vector containing a gene encoding the RrhJ1I modifying enzyme. Also good.
Alternatively, a transformant transformed only with a recombinant vector containing a gene encoding RrhJ1I modifying enzyme may be used.

本発明のRrhJ1I制限酵素遺伝子、本発明のRrhJ1I修飾酵素遺伝子または本発明のRrhJ1I制限・修飾酵素系の遺伝子を含む組換えベクターは、本発明の範囲に含まれる。   Recombinant vectors containing the RrhJ1I restriction enzyme gene of the present invention, the RrhJ1I modification enzyme gene of the present invention, or the gene of the RrhJ1I restriction / modification enzyme system of the present invention are included in the scope of the present invention.

本発明の組換えベクターは、上記酵素をコードする遺伝子の上流に転写プロモーター、場合によっては下流にターミネーターを挿入して発現カセットを構築し、このカセットを発現ベクターに挿入することにより作製することができる。あるいは、発現ベクターに転写プロモーターおよび／またはターミネーターがすでに存在する場合には、発現カセットを構築することなく、ベクター中のプロモーターおよび／またはターミネーターを利用して、その間に当該酵素をコードする遺伝子を挿入すればよい。   The recombinant vector of the present invention can be produced by constructing an expression cassette by inserting a transcription promoter upstream of a gene encoding the above enzyme and optionally a terminator downstream, and inserting this cassette into the expression vector. it can. Alternatively, when a transcription promoter and / or terminator is already present in the expression vector, a gene encoding the enzyme is inserted between the promoter and / or terminator in the vector without constructing an expression cassette. do it.

本明細書において、プロモーターは、例えば、trcプロモーター、lacプロモーターなどをあげることができるが、これに限定されるわけではない。
本明細書において、ターミネーターは、例えば、trpオペロンターミネータをあげることができるが、これに限定されるわけではない。 In the present specification, examples of the promoter include trc promoter and lac promoter, but are not limited thereto.
In this specification, the terminator can be, for example, trp operon terminator, but is not limited thereto.

ベクターに本発明の遺伝子を挿入するには、制限酵素を用いる方法、トポイソメラーゼを用いる方法等を利用することができる。また、挿入の際に必要であれば、適当なリンカーを付加してもよい。また、アミノ酸への翻訳にとって重要な塩基配列として、SD配列やKozak配列などのリボソーム結合配列が知られており、これらの配列を遺伝子の上流に挿入することもできる。挿入にともない、遺伝子がコードするアミノ酸配列の一部を置換してもよい。   In order to insert the gene of the present invention into a vector, a method using a restriction enzyme, a method using topoisomerase, or the like can be used. Further, if necessary at the time of insertion, an appropriate linker may be added. Ribosome binding sequences such as SD and Kozak sequences are known as important nucleotide sequences for translation into amino acids, and these sequences can be inserted upstream of the gene. A part of the amino acid sequence encoded by the gene may be substituted with the insertion.

本発明において使用されるベクターは、本発明の遺伝子を保持するものであれば特に限定されず、それぞれの宿主に適したベクターを用いることができる。ベクターとしては、例えば、プラスミドDNA、バクテリオファージDNA、レトロトランスポゾンDNA、人工染色体DNAなどが挙げられる。例えば、大腸菌を宿主とする場合には、pTrc99A（GEヘルスケアバイオサイエンス）、pACYC184（ニッポンジーン）、pMW118（ニッポンジーン）などを挙げることができる。また、必要に応じて、これらのベクターを改変したものを用いることもできる。   The vector used in the present invention is not particularly limited as long as it retains the gene of the present invention, and a vector suitable for each host can be used. Examples of the vector include plasmid DNA, bacteriophage DNA, retrotransposon DNA, artificial chromosome DNA and the like. For example, when E. coli is used as a host, pTrc99A (GE Healthcare Bioscience), pACYC184 (Nippon Gene), pMW118 (Nippon Gene) and the like can be mentioned. Moreover, what modified these vectors can also be used as needed.

本発明の組換えベクターを宿主に導入することで、本発明の形質転換体を作製することができる。当該形質転換体も本発明の範囲に含まれる。
本発明において使用する宿主は、上記組換えベクターが導入された後、目的の制限酵素または修飾酵素を発現することができる限り、特に限定されるものではない。宿主としては、例えば、大腸菌（エシェリヒア・コリ）、枯草菌（バチルス・ズブチリス（Bacillus subtilis））、ロドコッカス菌（Rhodococcus）、放線菌などの細菌、酵母（サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae））、カビ、動物細胞、植物細胞、昆虫細胞などが挙げられる。本発明において、宿主は好ましくは大腸菌である。
本発明において、大腸菌は、例えば、大腸菌K12株やB株、あるいはそれらの野生株由来の派生株であるJM109株、XL1-Blue株（例えば、XL1-Blue MRF'）、K802株、C600株などを挙げることができる。
宿主への組換えベクターの導入方法としては、宿主に適した方法であれば特に限定されるものではなく、当業者であれば公知技術から適宜選択することができる。このような方法としては、例えば、エレクトロポレーション法、カルシウムイオンを用いる方法、スフェロプラスト法、酢酸リチウム法、リン酸カルシウム法、リポフェクション法等が挙げられる。 The transformant of the present invention can be produced by introducing the recombinant vector of the present invention into a host. Such transformants are also included in the scope of the present invention.
The host used in the present invention is not particularly limited as long as the target restriction enzyme or modification enzyme can be expressed after the introduction of the above recombinant vector. Examples of the host include Escherichia coli (Escherichia coli), Bacillus subtilis (Bacillus subtilis), Rhodococcus, actinomycetes and other bacteria, yeast (Saccharomyces cerevisiae), mold, Examples include animal cells, plant cells, and insect cells. In the present invention, the host is preferably E. coli.
In the present invention, Escherichia coli is, for example, Escherichia coli K12 strain or B strain, or JM109 strain, XL1-Blue strain (for example, XL1-Blue MRF ′), a derivative strain derived from the wild strain, K802 strain, C600 strain, etc. Can be mentioned.
The method of introducing the recombinant vector into the host is not particularly limited as long as it is a method suitable for the host, and those skilled in the art can appropriately select from known techniques. Examples of such a method include an electroporation method, a method using calcium ions, a spheroplast method, a lithium acetate method, a calcium phosphate method, and a lipofection method.

本発明の形質転換体を培養して、培養物からRrhJ1I制限酵素活性を有するタンパク質またはRrhJ1I修飾酵素活性を有するタンパク質を採取することにより、RrhJ1I制限酵素またはRrhJ1I修飾酵素を製造することができる。   RrhJ1I restriction enzyme or RrhJ1I modification enzyme can be produced by culturing the transformant of the present invention and collecting a protein having RrhJ1I restriction enzyme activity or a protein having RrhJ1I modification enzyme activity from the culture.

本発明において「培養物」とは、菌体、培養液、無細胞抽出液、細胞膜などの培養により得られるものを意味する。無細胞抽出液は、培養後の菌体を、例えばリン酸ナトリウム緩衝液を加えてホモジナイザーなどで物理的に破砕した後、遠心（15,000rpm, 10min, 4℃）し、破砕できない菌体（細胞）が存在しないように上清を回収して得ることができる。細胞膜は、上記遠心で得られたペレットとして得ることができ、また、ペレットを溶解バッファーで懸濁することにより得ることもできる。   In the present invention, the “culture” means a product obtained by culturing cells, a culture solution, a cell-free extract, a cell membrane and the like. The cell-free extract is prepared by adding the sodium phosphate buffer solution to the cell-free extract, physically crushing it with a homogenizer, etc., and then centrifuging (15,000 rpm, 10 min, 4 ° C) to crush the cells (cells that cannot be disrupted) ) Can be obtained by collecting the supernatant. The cell membrane can be obtained as a pellet obtained by the above centrifugation, or can be obtained by suspending the pellet in a lysis buffer.

本発明の制限酵素または修飾酵素は、培養物をそのまま用いてもよいし、透析や硫安沈殿などの公知の方法、あるいはゲルろ過、イオン交換、アフィニティー等の各種クロマトグラフィーなどの公知の方法を単独または適宜組み合わせることによって、培養物から濃縮、精製したものを用いてもよい。この場合、酵素活性、分子量、等電点などを指標に濃縮、精製することができる。   For the restriction enzyme or the modified enzyme of the present invention, the culture may be used as it is, or a known method such as dialysis or ammonium sulfate precipitation, or a known method such as gel filtration, ion exchange, affinity chromatography or other various chromatography methods alone. Or you may use what was concentrated and refine | purified from the culture by combining suitably. In this case, the enzyme activity, molecular weight, isoelectric point, etc. can be used for concentration and purification.

また、本発明においては、本発明の遺伝子または本発明のベクターから、本発明の酵素を製造することも可能である。すなわち、本発明においては、いわゆる無細胞タンパク質合成系を採用して、本発明の制限酵素または修飾酵素を産生することが可能である。
無細胞タンパク質合成系とは、細胞抽出液を用いて試験管などの人工容器内でタンパク質を合成する系である。なお、本発明において使用される無細胞タンパク質合成系には、DNAを鋳型としてRNAを合成する無細胞転写系も含まれる。
ここで、上記細胞抽出液は、真核細胞由来または原核細胞由来の抽出液、例えば、小麦胚芽、大腸菌などの抽出液を使用することができる。なお、これらの細胞抽出液は濃縮されたものであっても濃縮されていないものであってもよい。 In the present invention, the enzyme of the present invention can also be produced from the gene of the present invention or the vector of the present invention. That is, in the present invention, a so-called cell-free protein synthesis system can be employed to produce the restriction enzyme or the modified enzyme of the present invention.
The cell-free protein synthesis system is a system that synthesizes proteins in an artificial container such as a test tube using a cell extract. The cell-free protein synthesis system used in the present invention includes a cell-free transcription system that synthesizes RNA using DNA as a template.
Here, eukaryotic cell-derived or prokaryotic cell-derived extract, for example, wheat germ, Escherichia coli extract or the like can be used as the cell extract. Note that these cell extracts may be concentrated or not concentrated.

細胞抽出液は、例えば限外濾過、透析、ポリエチレングリコール（PEG）沈殿等によって得ることができる。さらに本発明において、無細胞タンパク質合成は、市販のキットを用いて行うこともできる。そのようなキットとしては、例えば試薬キットPROTEIOSTM（東洋紡）、TNTTM System（プロメガ）、合成装置のPG-MateTM（東洋紡）、RTS（ロシュ・ダイアグノスティクス）などが挙げられる。
上記のように無細胞タンパク質合成によって得られる本発明の制限酵素および修飾酵素は、前述のように適宜クロマトグラフィーを選択して、濃縮、精製することができる。 The cell extract can be obtained, for example, by ultrafiltration, dialysis, polyethylene glycol (PEG) precipitation, or the like. Furthermore, in the present invention, cell-free protein synthesis can also be performed using a commercially available kit. Examples of such kits include reagent kits PROTEIOSTM (Toyobo), TNTTM System (Promega), synthesizer PG-MateTM (Toyobo), RTS (Roche Diagnostics), and the like.
As described above, the restriction enzyme and the modification enzyme of the present invention obtained by cell-free protein synthesis can be concentrated and purified by appropriately selecting chromatography as described above.

以下に、本発明の具体的な態様として、本発明のRrhJ1I 制限酵素遺伝子および修飾酵素遺伝子をクローニングし、該遺伝子を発現させるための手順を例示する。   Hereinafter, as a specific embodiment of the present invention, a procedure for cloning the RrhJ1I restriction enzyme gene and the modification enzyme gene of the present invention and expressing the gene will be exemplified.

（i）J1菌を培養し、得られる菌体より制限酵素を精製し、制限酵素認識配列を決定する工程
J1菌の制限酵素活性を調べるために、まずJ1株を培養し、培養した菌体を集めて超音波処理にて破砕した後、超遠心分離を行って上清を集め、これを活性測定用の試料とする。この試料の適当量を、基質であるλファージDNA（λ−DNA）とともに３７℃でインキュベートした後、基質DNAの分解をアガロースゲル電気泳動により確認する。
当該方法を用いてJ1菌の制限酵素活性を調べると、酵素活性は、λ−DNAを13Kbの大きさに切断する活性として検出される。 (I) A step of culturing J1 bacteria, purifying a restriction enzyme from the resulting cells, and determining a restriction enzyme recognition sequence
To examine the restriction enzyme activity of J1 bacteria, first culture J1 strain, collect the cultured cells and crush them by ultrasonic treatment, collect the supernatant by ultracentrifugation, and use this for activity measurement This sample. An appropriate amount of this sample is incubated with λ phage DNA (λ-DNA) as a substrate at 37 ° C., and then the decomposition of the substrate DNA is confirmed by agarose gel electrophoresis.
When the restriction enzyme activity of J1 bacteria is examined using this method, the enzyme activity is detected as an activity of cleaving λ-DNA to a size of 13 Kb.

この工程において、種々のプラスミドを基質DNAとして使用してJ1菌制限酵素による切断パターンを解析すると、J1菌制限酵素の認識配列をGCCGGCに決定することができる。   In this step, by analyzing the cleavage pattern by the restriction enzyme J1 using various plasmids as substrate DNA, the recognition sequence of the restriction enzyme J1 can be determined as GCCGGC.

（ii）J1菌制限酵素と同じ配列を切断するイソチゾマーに対応する修飾酵素遺伝子からプライマーを設計し、J1株の染色体DNAを鋳型にPCRを行う工程 (Ii) Designing primers from the modified enzyme gene corresponding to the isothizomer that cleaves the same sequence as the restriction enzyme of J1 bacteria and performing PCR using the chromosomal DNA of J1 as a template

J1菌制限酵素の複数のイソチゾマーに対応する各修飾酵素の間には共通配列部分が存在する場合がある。例えば、GCCGGCを切断するJ1菌制限酵素のイソチゾマーとしてNaeIやNgoMIVがあり、NaeI修飾酵素およびMgoMIV修飾酵素のアミノ酸配列には４９％のホモロジーが認められる。次に、これらのアミノ酸配列から設計したDNAをプライマーに用いると、GCCGGCを切断する制限酵素に対応する修飾酵素の遺伝子をクローニングすることができる。例えば、当該方法を用いてJ1株の染色体DNAにおいて修飾酵素遺伝子をPCRで増幅すると、0.9 Kbの断片が増幅し、そのDNA配列を決定することができる。得られるDNA断片は、NaeI修飾酵素またはMgoMIV修飾酵素とのホモロジーが認められる。   There may be a common sequence portion between each modification enzyme corresponding to a plurality of isothizomers of J1 bacteria restriction enzyme. For example, there are NaeI and NgoMIV as isozymes of J1 bacteria restriction enzymes that cleave GCCGGC, and 49% homology is observed in the amino acid sequences of NaeI and MgoMIV modifying enzymes. Next, when a DNA designed from these amino acid sequences is used as a primer, a gene for a modification enzyme corresponding to a restriction enzyme that cleaves GCCGGC can be cloned. For example, when the modified enzyme gene is amplified by PCR in the chromosomal DNA of the J1 strain using this method, a 0.9 Kb fragment is amplified, and the DNA sequence can be determined. The obtained DNA fragment shows homology with NaeI modifying enzyme or MgoMIV modifying enzyme.

本工程によって、J1菌制限酵素のイソチゾマーに対応する修飾酵素とホモロジーを有する遺伝子断片を得ることができる。   By this step, a gene fragment having homology with the modifying enzyme corresponding to the isozyme of J1 bacteria restriction enzyme can be obtained.

（iii）PCRの増幅産物のDNA配列を確認し、インバースPCR等で修飾酵素遺伝子と制限酵素遺伝子を決定する工程
この工程において、まず、修飾酵素遺伝子および制限酵素遺伝子をクローニングする。クローニングの方法としては、J1菌染色体ライブラリーからのサザンハイブリダイゼーション法やインバースPCR法を用いることができる。得られるDNA断片の塩基配列は通常の方法、たとえばジデオキシ法によって決定することができる。さらに、得られた塩基配列を解析することにより、その塩基配列中のタンパク質をコードしうる領域（オープンリーディングフレーム、ORF）の存在を推定することができる。 (Iii) Step of confirming DNA sequence of PCR amplification product and determining modification enzyme gene and restriction enzyme gene by inverse PCR etc. In this step, first, modification enzyme gene and restriction enzyme gene are cloned. As a cloning method, Southern hybridization method or inverse PCR method from J1 bacterial chromosome library can be used. The base sequence of the obtained DNA fragment can be determined by a usual method, for example, dideoxy method. Furthermore, by analyzing the obtained base sequence, the presence of a region (open reading frame, ORF) that can encode a protein in the base sequence can be estimated.

例えば、修飾酵素遺伝子をクローニングするために工程（ii）で決定したDNA配列を利用し、インバースPCRを行うことができる。先ず、J1菌染色体DNAを制限酵素SacIIで切断し、ライゲーション反応を行って、環状DNAを作製する。次に、工程（ii）で決定したDNA配列の両末端付近のDNA配列をプライマーとしてPCR反応を行い、未知の配列を含むDNA断片を増幅する。最後に、増幅したDNA断片のDNA配列を解析し、修飾酵素遺伝子を決定する。このように得られた配列中には1つのORFが存在する（以下、「ORF１」（修飾酵素）ともいう）。ORF１の塩基配列から推定されるアミノ酸配列を配列番号４に示す。配列番号４のアミノ酸配列のホモロジー検索を行った結果、NaeIメチラーゼのアミノ酸配列に対して67％の相同性が認められる。   For example, inverse PCR can be performed using the DNA sequence determined in step (ii) in order to clone the modifying enzyme gene. First, chromosomal DNA of J1 bacteria is cleaved with a restriction enzyme SacII, and a ligation reaction is performed to produce circular DNA. Next, a PCR reaction is performed using the DNA sequences near both ends of the DNA sequence determined in step (ii) as primers to amplify a DNA fragment containing an unknown sequence. Finally, the DNA sequence of the amplified DNA fragment is analyzed to determine the modified enzyme gene. There is one ORF in the sequence thus obtained (hereinafter also referred to as “ORF1” (modifying enzyme)). The amino acid sequence deduced from the base sequence of ORF1 is shown in SEQ ID NO: 4. As a result of homology search of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4, 67% homology is recognized with respect to the amino acid sequence of NaeI methylase.

通常、制限酵素遺伝子は修飾酵素遺伝子の近傍に存在しており、修飾酵素遺伝子が取得できれば制限酵素遺伝子の取得は可能であると考えられる。具体的には、J1菌染色体DNAを制限酵素SphIで切断し、ライゲーション反応によって環状化したDNAを作製する。次に、修飾酵素遺伝子または修飾酵素遺伝子近傍のDNA配列をプライマーとして環状DNAに対してインバースPCRを行ない、約６KbのDNA断片を増幅する。この断片のDNA配列を解析し、制限酵素遺伝子を決定することができる。このように得られた塩基配列中には２つのORFが存在しており、５'側より順に「ORF２」（HNHエンドヌクレアーゼ）、「ORF３」（制限酵素）とする。ORF３の塩基配列から推定されるアミノ酸配列を配列番号２に、ORF２の塩基配列（配列番号８）から推定されるアミノ酸配列を配列番号９に示す。配列番号２に記載のアミノ酸配列のホモロジー検索を行った結果、II型制限酵素のNaeIと47％の相同性が認められ、配列番号９に記載のアミノ酸配列のホモロジー検索を行った結果、Arthrobacter sp. FB24由来のHNHエンドヌクレアーゼと33％の相同性が認められる。   Usually, a restriction enzyme gene is present in the vicinity of the modification enzyme gene, and it is considered that the restriction enzyme gene can be obtained if the modification enzyme gene can be obtained. Specifically, J1 bacterial chromosomal DNA is cleaved with the restriction enzyme SphI to produce a circularized DNA by a ligation reaction. Next, inverse PCR is performed on the circular DNA using the modifying enzyme gene or the DNA sequence in the vicinity of the modifying enzyme gene as a primer to amplify a DNA fragment of about 6 Kb. The DNA sequence of this fragment can be analyzed to determine the restriction enzyme gene. There are two ORFs in the base sequence obtained in this way, and they are called “ORF2” (HNH endonuclease) and “ORF3” (restriction enzyme) in this order from the 5 ′ side. The amino acid sequence deduced from the base sequence of ORF3 is shown in SEQ ID NO: 2, and the amino acid sequence deduced from the base sequence of ORF2 (SEQ ID NO: 8) is shown in SEQ ID NO: 9. As a result of a homology search of the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 2, 47% homology was found with NaeI of type II restriction enzyme. As a result of a homology search of the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 9, Arthrobacter sp 33% homology with FB24 derived HNH endonuclease.

本工程により、RrhJ1I制限酵素をコードすると推定されるORF（ORF3）、およびRrhJ1I修飾酵素をコードすると推定されるORF（ORF１）を得ることができる。   By this step, ORF (ORF3) presumed to encode RrhJ1I restriction enzyme and ORF (ORF1) presumed to encode RrhJ1I modifying enzyme can be obtained.

（iv）RrhJ1I制限酵素および／またはRrhJ1I制限酵素を発現する形質転換体を作製する工程
本工程では、工程（iii）で得られたORF1および／またはORF3の塩基配列を基に、J1菌染色体DNAからPCRでRrhJ1I修飾酵素遺伝子および／またはRrhJ1I制限酵素遺伝子を含むDNA断片を増幅する。次に、増幅したDNA断片を適当なベクターに結合して大腸菌を形質転換し、RrhJ1I修飾酵素および／またはRrhJ1I制限酵素が発現する形質転換体を作製する。 (Iv) Step of producing a transformant expressing RrhJ1I restriction enzyme and / or RrhJ1I restriction enzyme In this step, J1 bacterial chromosomal DNA based on the base sequence of ORF1 and / or ORF3 obtained in step (iii) To amplify a DNA fragment containing the RrhJ1I modifying enzyme gene and / or the RrhJ1I restriction enzyme gene by PCR. Next, the amplified DNA fragment is bound to an appropriate vector to transform E. coli, and a transformant expressing RrhJ1I modifying enzyme and / or RrhJ1I restriction enzyme is prepared.

J1菌染色体DNAからPCRでRrhJ1I制限・修飾系の遺伝子を増幅する方法は、例えば工程（ii）の方法と同様に行うことができる。
制限酵素および／または修飾酵素を発現する形質転換体を作製するには、まず、得られたRrhJ1I制限・修飾系酵素の遺伝子を適当な宿主細胞、たとえばエシェリヒア・コリ、バチルス・ズブチリス（Bacillus subtilis）、サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）、ロドコッカス菌（Rhodococcus）、放線菌、動物細胞、昆虫細胞、植物細胞等において発現できるような発現ベクターに常法に従い接続する。そして、得られた組換えベクターを宿主細胞に導入し、形質転換体を作製すればよい。 A method for amplifying a gene of RrhJ1I restriction / modification system from the chromosomal DNA of J1 by PCR can be performed, for example, in the same manner as in step (ii).
In order to prepare a transformant expressing a restriction enzyme and / or a modification enzyme, first, the obtained RrhJ1I restriction / modification system gene is transferred to an appropriate host cell such as Escherichia coli, Bacillus subtilis (Bacillus subtilis). According to a conventional method, an expression vector that can be expressed in Saccharomyces cerevisiae, Rhodococcus, actinomycetes, animal cells, insect cells, plant cells, and the like is used. Then, the obtained recombinant vector may be introduced into a host cell to produce a transformant.

本発明に使用する宿主は、メチル化シトシンに関わる制限系遺伝子（mcrA,B,C）、またはメチル化アデニンに関わる制限系遺伝子（mrr）の欠損株を使用するのが好ましい。大腸菌の一例としては、XL1-Blue MRF'、K802などを用いることができる。この形質転換体を培養することにより、本発明のRrhJ1I 制限酵素または本発明のRrhJ1I修飾酵素タンパク質を発現させることができる。   The host used in the present invention is preferably a strain deficient in a restriction gene (mcrA, B, C) related to methylated cytosine or a restriction gene (mrr) related to methylated adenine. As an example of E. coli, XL1-Blue MRF ′, K802 and the like can be used. By culturing this transformant, the RrhJ1I restriction enzyme of the present invention or the RrhJ1I modifying enzyme protein of the present invention can be expressed.

なお、RrhJ1I制限酵素を発現させるための形質転換体は制限・修飾両酵素の遺伝子を保持していることが望ましい。この両遺伝子は同じベクター上に位置した状態で形質転換体に保持されていてもよいし、あるいは別々のベクターに組み込まれた状態で形質転換体に保持されていてもよい。RrhJ1I制限酵素を発現させるための形質転換体としては、例えば、RrhJ1I修飾酵素遺伝子を含むプラスミド（pMCLM、実施例７）およびRrhJ1I制限酵素遺伝子を含むプラスミド（pGErR10、実施例７）を含有する形質転換体XL1-Blue MRF'／pMCLM＋pGErR10（実施例８）を挙げることができる。
一方、RrhJ1I 修飾酵素の発現には上記の形質転換体の他、修飾酵素遺伝子のみを保持する形質転換体を用いることもできる。RrhJ1I修飾酵素を発現させるための形質転換体としては、例えば、RrhJ1I修飾酵素を含むプラスミドpTJM01（実施例６）を含有する形質転換体XL1-Blue MRF'／pTJM01を挙げることができる。 It is desirable that the transformant for expressing the RrhJ1I restriction enzyme holds the genes for both restriction and modification enzymes. Both of these genes may be retained in the transformant while being located on the same vector, or may be retained in the transformant while being incorporated in separate vectors. Examples of transformants for expressing RrhJ1I restriction enzyme include a plasmid containing a RrhJ1I modifying enzyme gene (pMCLM, Example 7) and a plasmid containing a RrhJ1I restriction enzyme gene (pGErR10, Example 7). And XL1-Blue MRF ′ / pMCLM + pGErR10 (Example 8).
On the other hand, for the expression of the RrhJ1I modifying enzyme, in addition to the transformant described above, a transformant retaining only the modifying enzyme gene can also be used. As a transformant for expressing RrhJ1I modifying enzyme, for example, transformant XL1-Blue MRF ′ / pTJM01 containing plasmid pTJM01 (Example 6) containing RrhJ1I modifying enzyme can be mentioned.

形質転換体の培養物のRrhJ1I修飾酵素活性は、RrhJ1I認識配列を含む培養物中のDNAが、RrhJ1I 制限酵素、あるいはそのイソチゾマー（例えば、NaeI制限酵素）によって切断されないことにより確認することができる。本工程で得られる形質転換体は、RrhJ1I 修飾酵素遺伝子を含む約1.2 kbのDNA断片を含むプラスミドを保持している。   The RrhJ1I modifying enzyme activity of the culture of the transformant can be confirmed by the fact that the DNA in the culture containing the RrhJ1I recognition sequence is not cleaved by the RrhJ1I restriction enzyme or its isothizomer (eg, NaeI restriction enzyme). The transformant obtained in this step holds a plasmid containing an approximately 1.2 kb DNA fragment containing the RrhJ1I modifying enzyme gene.

形質転換体の培養物のRrhJ1I制限酵素活性は、以下のようなイン・ビトロの方法により調べることができる。すなわち、試験する形質転換体を培養し、その培養物より菌体を集めて超音波処理にて破砕した後、超遠心分離を行って上清を集め、これを活性測定用の試料とする。この適当量を基質であるλファージDNA（λ−DNA）とともに３７℃でインキュベートした後、基質DNAの分解をアガロースゲル電気泳動により確認することができる。当該方法を用いて大腸菌形質転換体のRrhJ1I 制限酵素活性を調べると、RrhJ1Iによりλ−DNAを切断したときの断片の予想サイズと同じ大きさのフラグメントに切断する活性を検出できる。   The RrhJ1I restriction enzyme activity of the culture of the transformant can be examined by the following in vitro method. That is, the transformant to be tested is cultured, and the cells are collected from the culture and disrupted by ultrasonic treatment, and then subjected to ultracentrifugation to collect the supernatant, which is used as a sample for activity measurement. After an appropriate amount is incubated with λ phage DNA (λ-DNA) as a substrate at 37 ° C., degradation of the substrate DNA can be confirmed by agarose gel electrophoresis. When the RrhJ1I restriction enzyme activity of an E. coli transformant is examined using this method, the activity of cleaving into fragments having the same size as the expected size of the fragment when λ-DNA is cleaved with RrhJ1I can be detected.

（v）工程（iv）で修飾酵素および制限酵素活性が検出された形質転換体を培養し、該培養物からRrhJ1I修飾酵素および制限酵素を採取する工程
本工程では、工程（iv）で得られた形質転換体から制限酵素、または修飾酵素を精製する。 (V) A step of culturing the transformant in which the modified enzyme and the restriction enzyme activity are detected in step (iv), and collecting the RrhJ1I modifying enzyme and the restriction enzyme from the culture. In this step, the step is obtained in step (iv). A restriction enzyme or a modification enzyme is purified from the obtained transformant.

形質転換体の培養物からRrhJ1I 制限酵素および修飾酵素を採取するにあたっては、たとえば培養物より菌体を集菌後、超音波破砕、超遠心分離等により酵素を抽出し、ついで除核酸法、塩析法、アフィニティクロマトグラフィー法、ゲル濾過法、イオン交換クロマトグラフィー法等を組み合わせて精製すればよい。この方法により、RrhJ1I 制限酵素および修飾酵素を大量に得ることができる。   When collecting RrhJ1I restriction enzyme and modified enzyme from the transformant culture, for example, after collecting the cells from the culture, the enzyme is extracted by ultrasonic disruption, ultracentrifugation, etc. Purification may be performed by a combination of an analysis method, an affinity chromatography method, a gel filtration method, an ion exchange chromatography method, and the like. By this method, a large amount of RrhJ1I restriction enzyme and modification enzyme can be obtained.

用いる発現系によっては、形質転換体中で発現された酵素タンパク質が不溶物［封入体（inclusionbody）］として蓄積される場合がある。この場合にはこの不溶物を回収し、穏和な変性条件、たとえば尿素等の変性剤存在下で可溶化した後に変性剤を除くことによって活性型のタンパク質を得ることができる。さらに上記のようなクロマトグラフィー操作を行って目的とする酵素タンパク質を精製することができる。   Depending on the expression system used, the enzyme protein expressed in the transformant may accumulate as an insoluble matter (inclusion body). In this case, the insoluble matter is recovered, solubilized in a mild denaturing condition, for example, in the presence of a denaturing agent such as urea, and then the denaturing agent is removed to obtain an active protein. Furthermore, the target enzyme protein can be purified by performing the chromatography operation as described above.

また、上記で得られた遺伝子をプローブとしてストリンジェントな条件下でハイブリダイゼーションを行えば、得られた遺伝子（配列番号１、配列番号３）と配列は少し異なるが、同様な酵素活性を持つタンパク質をコードする遺伝子を得ることができ、これも本発明の範囲内のものである。
得られた遺伝子が目的の制限・修飾系酵素をコードする領域の全てを含まない場合には、得られた遺伝子の塩基配列をもとにしてプライマーを合成し、これを用いたPCRによって不足する領域を増幅したり、あるいは得られた遺伝子の断片をプローブとしてDNAライブラリーのスクリーニングを繰り返すことにより、全コード領域を得ることができる。 In addition, if hybridization is performed under stringent conditions using the gene obtained above as a probe, the sequence is slightly different from the obtained gene (SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3), but a protein having similar enzyme activity. Can be obtained, and this is also within the scope of the present invention.
If the obtained gene does not contain the entire region encoding the desired restriction / modification enzyme, a primer is synthesized based on the base sequence of the obtained gene, which is insufficient by PCR using this primer. The entire coding region can be obtained by amplifying the region or by repeating DNA library screening using the obtained gene fragment as a probe.

こうして得られたRrhJ1I 制限・修飾系酵素をコードする遺伝子を含有する形質転換体を作製して該遺伝子にコードされる酵素タンパク質を発現させ、さらに発現させた酵素タンパク質を精製することができる。形質転換体の作製、酵素タンパク質の発現および精製はいずれも上記と同様の方法で行うことができる。こうして得られた酵素タンパク質はRrhJ1I 制限酵素活性、あるいはRrhJ1I 修飾酵素活性を保持しており、これらは本発明に含まれる。   A transformant containing the gene encoding the RrhJ1I restriction / modification system enzyme thus obtained can be prepared to express the enzyme protein encoded by the gene, and the expressed enzyme protein can be purified. Production of transformants, expression and purification of enzyme proteins can all be performed by the same method as described above. The enzyme protein thus obtained retains RrhJ1I restriction enzyme activity or RrhJ1I modification enzyme activity, and these are included in the present invention.

実施例
以下、実施例を用いて本発明をより詳細に説明する。以下は本発明の例示であって本発明を限定する趣旨ではない。 EXAMPLES Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to examples. The following are examples of the present invention and are not intended to limit the present invention.

J1菌からの制限酵素精製
J1菌からの制限酵素の精製は以下の方法で行った。
ロドコッカス・ロドクロウス（Rhodococcus rhodochrous）J-1株をMYKG培地（0.5％ポリペプトン、0.3％バクトイーストエキス、0.3％バクトモルトエキス、１％ グルコース、0.2％ K2HPO4、0.2％ KH2PO4、pH7.0）で、30℃にて72時間振盪培養した。
菌体を破砕用緩衝液（10 mM Tris-HCl (pH 8.0)、10 mM 2-mercaptoethanol、1 mM EDTA）に懸濁したのち、4℃で超音波破砕を行った。遠心分離（12,000 rpm、4℃、30 min）で得られた上清を無細胞抽出液とした。次に、核酸を除去するため、ストレプトマイシン硫酸塩を終濃度4%になるように無細胞抽出液に添加して、氷上で30分間静置後、遠心分離によって沈殿を除去した。得られた上清を酵素精製緩衝液（10 mM Potassium phosphate buffer（pH 7.5）、10 mM 2-mercaptoethanol、5% glycerol）で一晩透析を行った後、DEAE-Sepharose（GEヘルスケア バイオサイエンス社）、HiTrap Heparin（GEヘルスケア バイオサイエンス社）、HiTrap Q（GEヘルスケア バイオサイエンス社）、P-cellulose（ワットマン）、HiPrep Sephacryl S-200 HR（GEヘルスケア バイオサイエンス社）を用いて精製を行い、J1菌制限酵素を得た。全ての精製操作は4℃で行った。 Purification of restriction enzymes from J1 bacteria
Purification of restriction enzymes from J1 bacteria was performed by the following method.
Rhodococcus rhodochrous J-1 strain in MYKG medium (0.5% polypeptone, 0.3% bactoeast extract, 0.3% bactomalt extract, 1% glucose, 0.2% K 2 HPO 4 , 0.2% KH 2 PO 4 , pH 7 0.0), and cultured with shaking at 30 ° C. for 72 hours.
The cells were suspended in a crushing buffer (10 mM Tris-HCl (pH 8.0), 10 mM 2-mercaptoethanol, 1 mM EDTA), and then ultrasonically disrupted at 4 ° C. The supernatant obtained by centrifugation (12,000 rpm, 4 ° C., 30 min) was used as a cell-free extract. Next, in order to remove the nucleic acid, streptomycin sulfate was added to the cell-free extract so as to have a final concentration of 4%, left on ice for 30 minutes, and then the precipitate was removed by centrifugation. The resulting supernatant was dialyzed overnight against enzyme purification buffer (10 mM Potassium phosphate buffer (pH 7.5), 10 mM 2-mercaptoethanol, 5% glycerol), and then DEAE-Sepharose (GE Healthcare Biosciences) ), HiTrap Heparin (GE Healthcare Bioscience), HiTrap Q (GE Healthcare Bioscience), P-cellulose (Whatman), HiPrep Sephacryl S-200 HR (GE Healthcare Bioscience) The J1 bacteria restriction enzyme was obtained. All purification operations were performed at 4 ° C.

J1菌から得られた制限酵素の酵素活性の測定は、以下の方法で行った。市販の制限酵素反応用buffer（LまたはH、タカラバイオ）を使用した。λ-DNAを基質DNAとして0.5μg添加した10μlの反応液を用いて、37℃で反応を行った。反応終了後、反応液をアガロースゲル電気泳動に供し、エチジウムブロマイドで染色を行って切断パターンを解析した。λ-DNAを基質とした時、約13kbの大きさに切断されたバンドが確認された。   The enzyme activity of the restriction enzyme obtained from the J1 bacterium was measured by the following method. A commercially available buffer for restriction enzyme reaction (L or H, Takara Bio Inc.) was used. The reaction was performed at 37 ° C. using 10 μl of a reaction solution to which 0.5 μg of λ-DNA was added as a substrate DNA. After completion of the reaction, the reaction solution was subjected to agarose gel electrophoresis and stained with ethidium bromide to analyze the cleavage pattern. When λ-DNA was used as a substrate, a band cut to a size of about 13 kb was confirmed.

このJ1菌制限酵素の認識配列の決定は、以下のように行った。基質DNAとして複合プラスミドpK4を使用した。プラスミドpK4はATCC1267/pK4として独立行政法人産業技術総合研究所特許微生物寄託センターに寄託されている（FERM BP-3731）（特開平5-64589 号および同5-68566 号公報参照）。J1菌制限酵素でpK4を切断した結果、約3.4Kb、約0.7Kb、約0.5Kbの断片が生じた。この切断パターンと、pK4を市販酵素で切断したパターンとを比較すると、NaeI（タカラバイオ）の切断パターンと一致することが認められた。   The recognition sequence of the restriction enzyme J1 was determined as follows. The complex plasmid pK4 was used as the substrate DNA. Plasmid pK4 has been deposited as ATCC1267 / pK4 at the National Institute of Advanced Industrial Science and Technology Patent Microorganism Depositary (FERM BP-3731) (see Japanese Patent Application Laid-Open Nos. 5-64589 and 5-68566). As a result of cleaving pK4 with a restriction enzyme of J1 bacteria, fragments of about 3.4 Kb, about 0.7 Kb, and about 0.5 Kb were generated. When this cleavage pattern was compared with the pattern obtained by cleaving pK4 with a commercially available enzyme, it was confirmed that it coincided with the cleavage pattern of NaeI (Takara Bio).

次に、プラスミドpK4をJ1菌に導入したJ1組換え体（J1/pK4）から回収したpK4を、上記から得られたJ1菌制限酵素とNaeIでそれぞれ切断したところ、いずれの酵素によっても切断されなかった。よって、J1菌の有する制限酵素はGCCGGCを切断するNaeIのイソチゾマーであることがわかり、認識配列はGCCGGCであることが明らかになった。   Next, pK4 recovered from the J1 recombinant (J1 / pK4) in which plasmid pK4 was introduced into J1 was cleaved with the restriction enzyme J1 obtained from the above and NaeI, respectively. There wasn't. Therefore, it was found that the restriction enzyme possessed by J1 was a NaeI isothizomer that cleaves GCCGGC, and the recognition sequence was GCCGGC.

J1菌染色体DNAの調製
ロドコッカス・ロドクロウス（Rhodococcus rhodochrous）J-1株を100mlのMYKG培地中、30℃にて72時間振盪培養した。
培養後、集菌し、集菌された菌体をSaline-EDTA溶液（0.1M EDTA、0.15M NaCl (pH8.0)）4mlに懸濁した。懸濁液にリゾチーム40mgを加えて37℃で1〜2時間振盪した後、-20℃で凍結した。 Preparation of chromosomal DNA of J1 strain Rhodococcus rhodochrous strain J-1 was cultured with shaking in 100 ml of MYKG medium at 30 ° C. for 72 hours.
After culturing, the cells were collected, and the collected cells were suspended in 4 ml of a Saline-EDTA solution (0.1 M EDTA, 0.15 M NaCl (pH 8.0)). 40 mg of lysozyme was added to the suspension, shaken at 37 ° C. for 1 to 2 hours, and then frozen at −20 ° C.

次に、10mlのTris-SDS液（1％SDS、0.1M NaCl、0.1M Tris-HCl (pH9.0)）を穏やかに振盪しながら加え、さらにプロテイナーゼK（メルク社）（10 mg/ml）を10μl加えて37℃で1時間振盪した。
次に、等量のTE （10mM Tris-HCl、1mM EDTA (pH8.0)）飽和フェノールを加え、撹拌後、遠心した。上層を採取し、2倍量のエタノールを加えた後、ガラス棒でDNAを巻きとり、90％、80％、70％のエタノールで順次フェノールを取り除いた。 Next, 10 ml of Tris-SDS solution (1% SDS, 0.1 M NaCl, 0.1 M Tris-HCl (pH 9.0)) was added with gentle shaking, and proteinase K (Merck) (10 mg / ml) was added. 10 μl was added and shaken at 37 ° C. for 1 hour.
Next, an equal amount of TE (10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA (pH 8.0)) saturated phenol was added, and the mixture was stirred and centrifuged. After collecting the upper layer and adding twice the amount of ethanol, the DNA was wound with a glass rod, and phenol was sequentially removed with 90%, 80%, and 70% ethanol.

次に、DNAを3mlのTE緩衝液に溶解させ、リボヌクレアーゼA溶液（100℃、15分間の加熱処理済）を10μg/mlになるよう加え、37℃で30分間振盪した。さらに、プロテイナーゼKを加え37℃で30分間振盪した後、等量のTE飽和フェノールを加えて遠心し、上層と下層に分離させた。
上層についてこの操作を2回繰り返した後、同量のクロロホルム（4％イソアミルアルコール含有）を加え、同様の抽出操作を繰り返した。その後、上層に2倍量のエタノールを加え、ガラス棒でDNAを巻きとり回収し、染色体DNA標品を得た。 Next, DNA was dissolved in 3 ml of TE buffer, ribonuclease A solution (100 ° C., heat-treated for 15 minutes) was added to 10 μg / ml, and shaken at 37 ° C. for 30 minutes. Furthermore, after adding proteinase K and shaking at 37 ° C. for 30 minutes, an equal amount of TE-saturated phenol was added and centrifuged to separate into an upper layer and a lower layer.
After repeating this operation twice for the upper layer, the same amount of chloroform (containing 4% isoamyl alcohol) was added, and the same extraction operation was repeated. Thereafter, twice the amount of ethanol was added to the upper layer, and the DNA was wound and collected with a glass rod to obtain a chromosomal DNA preparation.

修飾酵素遺伝子のPCR
J1菌修飾酵素遺伝子をPCRで増幅するためのプライマーを以下の方法で設計した。
NaeIとNgoMIVはGCCGGCを切断する制限酵素である。先ず、これらの制限酵素に対応する修飾酵素のアミノ酸ホモロジー解析を行った。その結果、両酵素のN末端付近のGCQALGL（配列番号２２）と、C末端付近のGNAFPPP（配列番号２３）が一致していることから、このアミノ酸配列に対応するオリゴヌクレオチドJM-01（配列番号１０）、JM-04（配列番号１１）を合成し、プライマーに用いた。PCRは以下の条件で実施し、約0.9Kbのバンドの増幅が確認された。 PCR of the modified enzyme gene
Primers for amplifying the J1 bacteria modifying enzyme gene by PCR were designed by the following method.
NaeI and NgoMIV are restriction enzymes that cleave GCCGGC. First, amino acid homology analysis of the modification enzymes corresponding to these restriction enzymes was performed. As a result, GCQALGL (SEQ ID NO: 22) near the N-terminus of both enzymes and GNAFPPP (SEQ ID NO: 23) near the C-terminus match, so that the oligonucleotide JM-01 (SEQ ID NO: 10), JM-04 (SEQ ID NO: 11) was synthesized and used as a primer. PCR was performed under the following conditions, and an amplification of a band of about 0.9 Kb was confirmed.

反応液組成
鋳型DNA（J1菌染色体DNA、実施例２） 1μl
10×Ex Buffer（タカラバイオ） 10μl
プライマーJM-01（配列番号１０） 1μl
プライマーJM-04（配列番号１１） 1μl
2.5mM dNTP 8μl
DMSO 10μl
滅菌水 68μl
ExTaq DNAポリメラーゼ（タカラバイオ） 1μl
総量 100μl
温度サイクル：94℃：30秒、65℃：30秒および72℃：1分の反応を30サイクル
プライマー
JM-01：GGN GGN CAR GCN CTN GGN CT（配列番号１０）
JM-04：GGN GGN GGR AAN GCR TTN CC（配列番号１１） Reaction solution composition
Template DNA (J1 chromosomal DNA, Example 2) 1 μl
10 × Ex Buffer (Takara Bio) 10μl
Primer JM-01 (SEQ ID NO: 10) 1 μl
Primer JM-04 (SEQ ID NO: 11) 1 μl
2.5mM dNTP 8μl
DMSO 10μl
Sterile water 68μl
ExTaq DNA polymerase (Takara Bio) 1μl
Total volume 100μl
Temperature cycle: 94 ° C: 30 seconds, 65 ° C: 30 seconds and 72 ° C: 1 minute reaction for 30 cycles primer
JM-01: GGN GGN CAR GCN CTN GGN CT (SEQ ID NO: 10)
JM-04: GGN GGN GGR AAN GCR TTN CC (SEQ ID NO: 11)

次に、増幅された配列のダイレクトシークエンシングをPCRで使用したプライマーを用いて実施した。その結果、配列番号５に示す配列が得られ、ホモロジー検索の結果、NaeIメチラーゼとの相同性が認められた。   Next, direct sequencing of the amplified sequence was performed using the primers used in PCR. As a result, the sequence shown in SEQ ID NO: 5 was obtained. As a result of homology search, homology with NaeI methylase was confirmed.

J1菌修飾酵素遺伝子のクローニング
J1菌修飾酵素遺伝子全長のクローニングは以下の方法で行った。
J1菌ゲノムDNAを制限酵素SacIIで分解し、切断したゲノムDNAをGFX PCR DNA band and GelBand Purification kit（GEヘルスケア バイオサイエンス社）を用いて回収し、DNA Ligation Kit（タカラバイオ）を用いて環化した。次に、環化したゲノムDNAを鋳型に使用し、配列番号１２、１３のオリゴヌクレオチドをプライマーに用いて以下の条件でPCRを行い、約1Kbの断片を増幅した。 Cloning of J1 bacteria modifying enzyme gene
Cloning of the full length J1 bacterium modifying enzyme gene was performed by the following method.
The genomic DNA of J1 bacteria is digested with the restriction enzyme SacII, and the digested genomic DNA is recovered using the GFX PCR DNA band and GelBand Purification kit (GE Healthcare Biosciences) and circularized using the DNA Ligation Kit (Takara Bio). Turned into. Next, PCR was performed using the circularized genomic DNA as a template and the oligonucleotides of SEQ ID NOs: 12 and 13 as primers under the following conditions to amplify a fragment of about 1 Kb.

反応液組成
鋳型DNA（環化J1ゲノムDNA） 1μl
10×Ex Buffer（タカラバイオ） 10μl
プライマーJM-05（配列番号１２） 1μl
プライマーJM-06（配列番号１３） 1μl
2.5mM dNTP 8μl
滅菌水 78μl
ExTaq DNAポリメラーゼ（タカラバイオ） 1μl
総量 100μl
温度サイクル：94℃：30秒、65℃：30秒および72℃：10分の反応を30サイクル
プライマー
JM-05：TTTCCAGACCTAGTGCCTGA（配列番号１２）
JM-06：GGCAGTAGAAGTGGCCGGAC（配列番号１３） Reaction solution composition
Template DNA (cyclized J1 genomic DNA) 1μl
10 × Ex Buffer (Takara Bio) 10μl
Primer JM-05 (SEQ ID NO: 12) 1 μl
Primer JM-06 (SEQ ID NO: 13) 1 μl
2.5mM dNTP 8μl
Sterile water 78μl
ExTaq DNA polymerase (Takara Bio) 1μl
Total volume 100μl
Temperature cycle: 94 ° C: 30 seconds, 65 ° C: 30 seconds and 72 ° C: 10 minutes of reaction for 30 cycles Primer
JM-05: TTTCCAGACCTAGTGCCTGA (SEQ ID NO: 12)
JM-06: GGCAGTAGAAGTGGCCGGAC (SEQ ID NO: 13)

また、プライマーとして、配列番号１４、および１５のオリゴヌクレオチド用いた以外は、上記と同様の条件でPCRを行い、約2Kbの断片を増幅した。
JM-07：ACGTAACCGAACTCGGTCAG（配列番号１４）
JM-08：GTATCGGCAGATCGGCAATG（配列番号１５） Further, PCR was performed under the same conditions as described above except that the oligonucleotides of SEQ ID NOs: 14 and 15 were used as primers, and a fragment of about 2 Kb was amplified.
JM-07: ACGTAACCGAACTCGGTCAG (SEQ ID NO: 14)
JM-08: GTATCGGCAGATCGGCAATG (SEQ ID NO: 15)

PCR産物を確認した後、それぞれの反応液からGFX PCR DNA band and GelBand Purification kit（GEヘルスケア バイオサイエンス社）を使用してPCR産物を回収した。得られたPCR産物は、pGEM-T Easyベクター（プロメガ）に結合して、大腸菌XL1-Blue MRF'（Stratagene）を形質転換した。得られた組換えコロニーからプラスミドを抽出し、DNA配列の確認を行った。DNA配列を解析した結果、配列番号６に示される塩基配列が得られた。配列番号６に示される塩基配列中に、配列番号３に示す1264bpのオープンリーディングフレーム（ORF１）を見出した。このORF１のコードするアミノ酸配列は、NaeI修飾酵素に対して67％の相同性を持っていることから、ORF１は、GCCGGCを認識配列とするJ1菌修飾酵素をコードしていることが推定された。   After confirming the PCR product, the PCR product was recovered from each reaction solution using the GFX PCR DNA band and GelBand Purification kit (GE Healthcare Bioscience). The obtained PCR product was ligated to pGEM-T Easy vector (Promega) and transformed into E. coli XL1-Blue MRF ′ (Stratagene). A plasmid was extracted from the obtained recombinant colony, and the DNA sequence was confirmed. As a result of analyzing the DNA sequence, the base sequence represented by SEQ ID NO: 6 was obtained. In the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 6, the 1264 bp open reading frame (ORF1) shown in SEQ ID NO: 3 was found. Since the amino acid sequence encoded by ORF1 has 67% homology to NaeI-modifying enzyme, it was estimated that ORF1 encodes a J1 fungus-modifying enzyme that uses GCCGGC as a recognition sequence. .

J1菌制限酵素遺伝子のクローニング
J1菌制限酵素遺伝子のクローニングを実施例４と同様の方法で行った。
J1菌ゲノムDNAを制限酵素SphIで分解し、切断したゲノムDNAをGFX PCR DNA band and GelBand Purification kit（GEヘルスケア バイオサイエンス社）を用いて回収し、DNA Ligation Kit（タカラバイオ）を用いて環化した。次に、環化したゲノムDNAを鋳型に使用し、配列番号１６、１７のオリゴヌクレオチドをプライマーに用いて実施例４と同様の条件でPCRを行い、約6Kbの断片を増幅した。
JK-01：CCGGCGCGATCAAACGGGTG（配列番号１６）
JK-02：TGCTGACCATCGGGCACCTG（配列番号１７） Cloning of J1 bacteria restriction enzyme gene
Cloning of the J1 bacteria restriction enzyme gene was performed in the same manner as in Example 4.
The genomic DNA of J1 bacteria is digested with the restriction enzyme SphI, and the digested genomic DNA is recovered using the GFX PCR DNA band and GelBand Purification kit (GE Healthcare Biosciences) and circularized using the DNA Ligation Kit (Takara Bio). Turned into. Next, PCR was performed under the same conditions as in Example 4 using the circularized genomic DNA as a template and the oligonucleotides of SEQ ID NOs: 16 and 17 as primers to amplify a fragment of about 6 Kb.
JK-01: CCGGCGCGATCAAACGGGTG (SEQ ID NO: 16)
JK-02: TGCTGACCATCGGGCACCTG (SEQ ID NO: 17)

PCR産物を確認した後、反応液からPCR産物をGFX PCR DNA band and GelBand Purification kit（GEヘルスケア バイオサイエンス社）で精製した。得られたPCR産物を、pGEM-T Easyベクター（プロメガ）に結合して、得られたベクターで大腸菌XL1-Blue MRF'を形質転換した。得られた組換えコロニーからプラスミドを抽出し、DNA配列の確認を行った。DNA配列を解析した結果、配列番号７に示される塩基配列が得られた。配列番号７に示される塩基配列中には、配列番号２に示されるアミノ酸配列をコードするオープンリーディングフレーム（ORF３：配列番号１）が見出された。得られたORF３のコードするアミノ酸配列は、NaeI制限酵素に対して47％の相同性を持っていることから、ORF3は、GCCGGCを認識配列とするII型のJ1菌制限酵素をコードしていることが推定された。また、HNHエンドヌクレーアゼと33％の相同性を持つアミノ酸をコードするオープンリーディングフレーム（ORF2：配列番号８）も見出された。   After confirming the PCR product, the PCR product was purified from the reaction solution using the GFX PCR DNA band and GelBand Purification kit (GE Healthcare Bioscience). The obtained PCR product was ligated to pGEM-T Easy vector (Promega), and Escherichia coli XL1-Blue MRF ′ was transformed with the obtained vector. A plasmid was extracted from the obtained recombinant colony, and the DNA sequence was confirmed. As a result of analyzing the DNA sequence, the base sequence shown in SEQ ID NO: 7 was obtained. An open reading frame (ORF3: SEQ ID NO: 1) encoding the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 was found in the base sequence shown in SEQ ID NO: 7. Since the obtained amino acid sequence encoded by ORF3 has 47% homology with NaeI restriction enzyme, ORF3 encodes type II J1 restriction enzyme with GCCGGC as a recognition sequence. It was estimated. An open reading frame (ORF2: SEQ ID NO: 8) encoding an amino acid having 33% homology with HNH endonuclease was also found.

最後に、J1菌制限酵素とJ1菌修飾酵素の遺伝子を含む約3.8Kbの断片を、J1菌染色体DNAから配列番号１８、１９のオリゴヌクレオチドをプライマーに用いて実施例３と同様の条件で温度サイクルを：94℃：30秒、65℃：30秒および72℃：3分として30サイクル行いPCR増幅した。得られたPCR産物を、pGEM-T Easyベクター（プロメガ）に結合してpJRM01を作製した。図１はpJRM01を示す模式図であり、約3.8KbのPCR断片にORF１（J1菌修飾酵素遺伝子）、ORF２、ORF３（J1菌制限酵素遺伝子）が含まれている（図２）。   Finally, an approximately 3.8 Kb fragment containing the genes of the restriction enzyme of J1 bacteria and the modification enzyme of J1 bacteria was prepared under the same conditions as in Example 3 using the oligonucleotides of SEQ ID NOS: 18 and 19 as primers from the chromosome DNA of J1 bacteria. PCR amplification was carried out with 30 cycles of: 94 ° C: 30 seconds, 65 ° C: 30 seconds and 72 ° C: 3 minutes. The obtained PCR product was ligated to pGEM-T Easy vector (Promega) to prepare pJRM01. FIG. 1 is a schematic diagram showing pJRM01, and an ORF1 (J1 fungus modifying enzyme gene), ORF2, ORF3 (J1 fungus restriction enzyme gene) is contained in a PCR fragment of about 3.8 Kb (FIG. 2).

JM-32：GGtctagaGTTGGCGATTCCTCATCGCG（配列番号１８）
JM-33：CCaagcttATCGCTCGCGGGGGTGCTCCG（配列番号１９） JM-32: GGtctagaGTTGGCGATTCCTCATCGCG (SEQ ID NO: 18)
JM-33: CCaagcttATCGCTCGCGGGGGTGCTCCG (SEQ ID NO: 19)

大腸菌組換え体によるJ1菌修飾酵素の生産
J1菌修飾酵素を得るために、実施例５で得られたプラスミドpJRM01を鋳型として使用して、以下に示す反応液組成およびプライマーを用いてPCRを行った。この際、修飾酵素をPtrcプロモーター下流のNcoIサイトに結合させるため、J1菌修飾酵素の2番目のアミノ酸をセリン（TCG）からスレオニン（ACG）に置換した。 Production of J1 modified enzyme by E. coli recombinants
In order to obtain the J1 bacteria-modifying enzyme, PCR was performed using the plasmid pJRM01 obtained in Example 5 as a template and the reaction solution composition and primers shown below. At this time, in order to bind the modifying enzyme to the NcoI site downstream of the Ptrc promoter, the second amino acid of the modifying enzyme J1 was replaced from serine (TCG) to threonine (ACG).

反応液組成
鋳型DNA（組換えプラスミドpJRM01） 1μl
10×Ex Buffer（タカラバイオ） 10μl
プライマーJM-18（配列番号２０） 1μl
プライマーJM-11（配列番号２１） 1μl
2.5mM dNTP 8μl
滅菌水 78μl
ExTaq DNAポリメラーゼ（タカラバイオ） 1μl
総量 100μl
温度サイクル：94℃：30秒、65℃：30秒および72℃：1分の反応を30サイクル
プライマー
JM-18：GGGTCATGACGCGGTCCAGCTACGAG（配列番号２０）
JM-11：CTCCctgCAGGCGGCGTGGAAGCCTGG（配列番号２１） Reaction solution composition
Template DNA (recombinant plasmid pJRM01) 1μl
10 × Ex Buffer (Takara Bio) 10μl
Primer JM-18 (SEQ ID NO: 20) 1 μl
Primer JM-11 (SEQ ID NO: 21) 1 μl
2.5mM dNTP 8μl
Sterile water 78μl
ExTaq DNA polymerase (Takara Bio) 1μl
Total volume 100μl
Temperature cycle: 94 ° C: 30 seconds, 65 ° C: 30 seconds and 72 ° C: 1 minute reaction for 30 cycles primer
JM-18: GGGTCATGACGCGGTCCAGCTACGAG (SEQ ID NO: 20)
JM-11: CTCCctgCAGGCGGCGTGGAAGCCTGG (SEQ ID NO: 21)

PCR終了後、反応液5μlを0.7％アガロースゲルにおける電気泳動に供し、約1.3kbのPCR産物の検出を行った。PCR産物を確認した後、反応液からPCR産物をGFX PCR DNA band and GelBand Purification kit（GEヘルスケア バイオサイエンス社）で精製した。得られたPCR産物を、制限酵素PagIとSse8387Iで切断した。制限酵素処理を行ったPCR産物を、0.7％アガロースゲルにおける電気泳動に供し、約1.3Kb付近のバンドを回収した。回収したPCR産物を、Ligation Kit（タカラバイオ）を用いてベクターpTrc99AのNcoI-PstI部位に連結し、プラスミドを作製した。得られたプラスミドを、pTJM01と名付けた。図３は、プラスミドpTJM01の構造を示す模式図である。   After completion of PCR, 5 μl of the reaction solution was subjected to electrophoresis on a 0.7% agarose gel, and a PCR product of about 1.3 kb was detected. After confirming the PCR product, the PCR product was purified from the reaction solution using the GFX PCR DNA band and GelBand Purification kit (GE Healthcare Bioscience). The obtained PCR product was cleaved with restriction enzymes PagI and Sse8387I. The PCR product subjected to the restriction enzyme treatment was subjected to electrophoresis on a 0.7% agarose gel, and a band around 1.3 Kb was recovered. The collected PCR product was ligated to the NcoI-PstI site of the vector pTrc99A using Ligation Kit (Takara Bio) to prepare a plasmid. The resulting plasmid was named pTJM01. FIG. 3 is a schematic diagram showing the structure of plasmid pTJM01.

このプラスミドでXL1-Blue MRF'（Strategene）を形質転換し、得られた組換えコロニーをLB培地（1％トリプトン、0.5％バクトイーストエキス、0.5％ NaCl、100μg/mlアンピシリン、1mM IPTG）で37℃一晩培養した。培養した菌からQIAprep Spin Miniprep kit（キアゲン）を使用してプラスミドを調製し、NaeIで処理した。その結果、NaeIで切断されなかったことから、修飾酵素によってプラスミドが修飾されていることを確認できた。   XL1-Blue MRF '(Strategene) was transformed with this plasmid, and the resulting recombinant colonies were cultured in LB medium (1% tryptone, 0.5% bacto yeast extract, 0.5% NaCl, 100 μg / ml ampicillin, 1 mM IPTG). C. overnight culture. Plasmids were prepared from the cultured bacteria using QIAprep Spin Miniprep kit (Qiagen) and treated with NaeI. As a result, since it was not cleaved with NaeI, it was confirmed that the plasmid was modified with a modifying enzyme.

さらに、培養した大腸菌組換え体（XL1-Blue MRF'／pTJM01）の超音波破砕した上清をSDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動（SDS-PAGE）に供したところ、J1菌修飾酵素の分子量に相当する45KDaにバンドが確認できたことから、J1菌修飾酵素が大量に発現していることが確認された（図４）。図４中、Mは、分子量マーカーを示し、レーン１はXL1-Blue MRF'／pTJM01の超音波破砕液上清のSDS-PAGEの結果を示し、レーン２はXL1-Blue MRF'の超音波破砕液上清のSDS-PAGEの結果を示す。
本実施例により、RrhJ1I修飾酵素遺伝子を含むベクターを含有した本発明の大腸菌組換え体は、大量のRrhJ1I修飾酵素を発現することが明らかになった。 Furthermore, when the supernatant of ultrasonically disrupted cultured E. coli recombinant (XL1-Blue MRF '/ pTJM01) was subjected to SDS-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE), it corresponds to the molecular weight of the J1 bacteria-modifying enzyme. As a result, a band was confirmed at 45 KDa, confirming that a large amount of J1 bacteria-modifying enzyme was expressed (FIG. 4). In FIG. 4, M represents a molecular weight marker, lane 1 represents the result of SDS-PAGE of the supernatant of the ultrasonic disruption solution of XL1-Blue MRF ′ / pTJM01, and lane 2 represents the ultrasonic disruption of XL1-Blue MRF ′. The result of SDS-PAGE of a liquid supernatant is shown.
This example revealed that the E. coli recombinant of the present invention containing a vector containing the RrhJ1I modifying enzyme gene expresses a large amount of RrhJ1I modifying enzyme.

J1菌修飾酵素発現プラスミド、およびJ1菌制限酵素発現プラスミドの構築
（１）J1菌修飾酵素発現プラスミドpMCLMの構築
実施例２で調製したJ1菌染色体DNAを鋳型にして、以下の条件でPCRを行った。
反応液組成
鋳型DNA（J1菌染色体、実施例２） 1μl
10×Ex Buffer（タカラバイオ） 10μl
プライマーJ1-M5（配列番号２４） 1μl
プライマーJ1-M6（配列番号２５） 1μl
2.5mM dNTP 8μl
滅菌水 78μl
ExTaq DNAポリメラーゼ（タカラバイオ） 1μl
総量 100μl
温度サイクル：94℃：30秒、59℃：30秒および72℃：2分の反応を30サイクル
プライマー
J1-M5：GGGAGGTATGATCGATCCGTTC（配列番号２４）
J1-M6：CGGCCAGGCGTGGAAG（配列番号２５） Construction of J1 bacteria modified enzyme expression plasmid and J1 bacteria restriction enzyme expression plasmid (1) Construction of J1 bacteria modified enzyme expression plasmid pMCLM PCR was carried out using the J1 bacterial chromosome DNA prepared in Example 2 as a template under the following conditions. It was.
Reaction solution composition
Template DNA (J1 bacterial chromosome, Example 2) 1 μl
10 × Ex Buffer (Takara Bio) 10μl
Primer J1-M5 (SEQ ID NO: 24) 1 μl
Primer J1-M6 (SEQ ID NO: 25) 1 μl
2.5mM dNTP 8μl
Sterile water 78μl
ExTaq DNA polymerase (Takara Bio) 1μl
Total volume 100μl
Temperature cycle: 94 ° C: 30 seconds, 59 ° C: 30 seconds and 72 ° C: 2 minutes of reaction for 30 cycles Primer
J1-M5: GGGAGGTATGATCGATCCGTTC (SEQ ID NO: 24)
J1-M6: CGGCCAGGCGTGGAAG (SEQ ID NO: 25)

PCR終了後、反応液5μlを0.7％アガロースゲルにおける電気泳動に供し、約1.4kbのPCR産物の検出を行った。PCR産物を確認した後、反応液からPCR産物をGFX PCR DNA band and GelBand Purification kit（GEヘルスケア バイオサイエンス社）で精製した。得られたPCR産物をpGEM-T Easy vector（プロメガ）に連結し、プラスミドを作製した。得られたプラスミドはDNA配列の確認を行い、pGTEM2と名付けた。   After completion of PCR, 5 μl of the reaction solution was subjected to electrophoresis on a 0.7% agarose gel, and a PCR product of about 1.4 kb was detected. After confirming the PCR product, the PCR product was purified from the reaction solution using the GFX PCR DNA band and GelBand Purification kit (GE Healthcare Bioscience). The obtained PCR product was ligated to pGEM-T Easy vector (Promega) to prepare a plasmid. The obtained plasmid was confirmed for DNA sequence and named pGTEM2.

次に、pGTEM2に組み込まれたPCR産物をp15A複製オリジンを持つプラスミドであるpMCL200（Gene 162（1）1995, Pages 157-158）のLacプロモーター下流に挿入した。すなわち、pGTEM2とpMCL200をSpeIとEcoRIで切断して0.7％アガロースゲル電気泳動に供し、GFX PCR DNA band and GelBand Purification kit（GEヘルスケア バイオサイエンス社）を用いてそれぞれ約1.4Kb（pGTEM2から）、約2.5Kb（pMCL200から）の断片を回収した。回収したDNAをLigation Kit（タカラバイオ）を用いて連結し、プラスミドを作製した。得られたプラスミドを、pMCLMと名付けた。図５は、プラスミドpMCLMの構造を示す模式図である。図５中、「rrhJ1IM」は、J1菌修飾酵素遺伝子を示す。   Next, the PCR product incorporated into pGTEM2 was inserted downstream of the Lac promoter of pMCL200 (Gene 162 (1) 1995, Pages 157-158), which is a plasmid having a p15A replication origin. That is, pGTEM2 and pMCL200 were cleaved with SpeI and EcoRI, subjected to 0.7% agarose gel electrophoresis, and each about 1.4 Kb (from pGTEM2) using GFX PCR DNA band and GelBand Purification kit (GE Healthcare Biosciences), A fragment of about 2.5 Kb (from pMCL200) was recovered. The recovered DNA was ligated using Ligation Kit (Takara Bio) to prepare a plasmid. The resulting plasmid was named pMCLM. FIG. 5 is a schematic diagram showing the structure of plasmid pMCLM. In FIG. 5, “rrhJ1IM” indicates a J1 fungus modifying enzyme gene.

プラスミドpMCLMがJ1菌修飾酵素を発現しているか確認するため、以下の実験を行った。pMCLMでXL1-Blue MRF'（Strategene）を形質転換し、得られた組換えコロニーをLB培地（25μg/ml クロラムフェニコール含有）で37℃一晩培養した。培養した菌からQIAprep Spin Miniprep kit（キアゲン）を使用してプラスミドを調製し、NaeIで処理した。その結果、NaeIで切断されなかったことから、修飾酵素によってプラスミドが修飾されていることを確認できた。   In order to confirm whether the plasmid pMCLM expresses the J1 bacteria-modifying enzyme, the following experiment was conducted. XL1-Blue MRF ′ (Strategene) was transformed with pMCLM, and the resulting recombinant colony was cultured overnight at 37 ° C. in LB medium (containing 25 μg / ml chloramphenicol). Plasmids were prepared from the cultured bacteria using QIAprep Spin Miniprep kit (Qiagen) and treated with NaeI. As a result, since it was not cleaved with NaeI, it was confirmed that the plasmid was modified with a modifying enzyme.

（２）J1菌制限酵素発現プラスミドpGErR10の構築
実施例２で調製したJ1菌染色体DNAを鋳型にして、以下の条件でPCRを行った。
反応液組成
鋳型DNA（J1菌染色体、実施例２） 1μl
10×Ex Buffer（タカラバイオ） 10μl
プライマーJ1-R17（配列番号２６） 1μl
プライマーJ1-R18（配列番号２７） 1μl
2.5mM dNTP 8μl
滅菌水 78μl
ExTaq DNAポリメラーゼ（タカラバイオ） 1μl
総量 100μl
温度サイクル：94℃：30秒、66℃：30秒および72℃：1分の反応を30サイクル
プライマー
J1-R17：GATCCACCCGCCCACACCAC（配列番号２６）
J1-R18：GGCTTCCGGCCACCGGGAAAG（配列番号２７） (2) Construction of J1 bacterial restriction enzyme expression plasmid pGErR10 PCR was performed under the following conditions using the J1 bacterial chromosomal DNA prepared in Example 2 as a template.
Reaction solution composition
Template DNA (J1 bacterial chromosome, Example 2) 1 μl
10 × Ex Buffer (Takara Bio) 10μl
Primer J1-R17 (SEQ ID NO: 26) 1 μl
Primer J1-R18 (SEQ ID NO: 27) 1 μl
2.5mM dNTP 8μl
Sterile water 78μl
ExTaq DNA polymerase (Takara Bio) 1μl
Total volume 100μl
Temperature cycle: 94 ° C: 30 seconds, 66 ° C: 30 seconds and 72 ° C: 1 minute reaction for 30 cycles primer
J1-R17: GATCCACCCGCCCACACCAC (SEQ ID NO: 26)
J1-R18: GGCTTCCGGCCACCGGGAAAG (SEQ ID NO: 27)

PCR終了後、反応液5μlを0.7％アガロースゲルにおける電気泳動に供し、約1kbのPCR産物の検出を行った。PCR産物を確認した後、反応液からPCR産物をGFX PCR DNA band and GelBand Purification kit（GEヘルスケア バイオサイエンス社）で精製した。得られたPCR産物をpGEM-T Easy vector（プロメガ）に連結し、（１）で調製したpMCLMと共にXL1-Blue MRF'を形質転換した。得られた形質転換体をLB培地（100μg/ml アンピシリン、25μg/ml クロラムフェニコール含有）で37℃一晩培養し、QIAprep Spin Miniprep kit（キアゲン）を使用してプラスミドを調製した。得られたプラスミドはDNA配列を確認し、pGErR10と名付けた。図６は、プラスミドpGErR10の構造を示す模式図である。図６中、「rrhJ1IR」は、J1菌制限酵素遺伝子を示す。   After completion of PCR, 5 μl of the reaction solution was subjected to electrophoresis on a 0.7% agarose gel, and a PCR product of about 1 kb was detected. After confirming the PCR product, the PCR product was purified from the reaction solution using the GFX PCR DNA band and GelBand Purification kit (GE Healthcare Bioscience). The obtained PCR product was ligated to pGEM-T Easy vector (Promega), and XL1-Blue MRF ′ was transformed together with pMCLM prepared in (1). The obtained transformant was cultured overnight at 37 ° C. in LB medium (containing 100 μg / ml ampicillin and 25 μg / ml chloramphenicol), and a plasmid was prepared using QIAprep Spin Miniprep kit (Qiagen). The resulting plasmid was confirmed for its DNA sequence and named pGErR10. FIG. 6 is a schematic diagram showing the structure of plasmid pGErR10. In FIG. 6, “rrhJ1IR” indicates a J1 bacterial restriction enzyme gene.

大腸菌組換え体によるJ1菌制限酵素の生産
（１）無細胞抽出液の調製
実施例７（２）で作製したJ1菌制限酵素発現ベクターを含む大腸菌組換え体（XL1-Blue MRF'／pMCLM+pGErR10）をLB培地（100μg/ml アンピシリン、25μg/ml クロラムフェニコール含有）で37℃で16時間培養した。培養液を遠心分離によって回収し、破砕用緩衝液に懸濁したのち、4℃で10分間、超音波による破砕を行った。破砕液は遠心分離（12,000 rpm、4℃、30 min）し、得られた上清を無細胞抽出液とした。
また比較例として、以下の実験を行った。J1菌を実施例１の方法で培養し、実施例８（１）と同様の手法で調製したサンプルをJ1菌の無細胞抽出液とした。また、それぞれの無細胞抽出液のタンパク質濃度はBioRad Protein Assay Kit（バイオラド）を用いて定量した。 Production of J1 restriction enzyme by E. coli recombinant (1) Preparation of cell-free extract E. coli recombinant (XL1-Blue MRF ′ / pMCLM +) containing the J1 restriction enzyme expression vector prepared in Example 7 (2) pGErR10) was cultured in LB medium (containing 100 μg / ml ampicillin and 25 μg / ml chloramphenicol) at 37 ° C. for 16 hours. The culture solution was collected by centrifugation, suspended in a disrupting buffer solution, and then disrupted by ultrasonic waves at 4 ° C. for 10 minutes. The disrupted solution was centrifuged (12,000 rpm, 4 ° C., 30 min), and the resulting supernatant was used as a cell-free extract.
Moreover, the following experiment was conducted as a comparative example. J1 bacteria were cultured by the method of Example 1, and a sample prepared by the same method as in Example 8 (1) was used as a cell-free extract of J1 bacteria. Moreover, the protein concentration of each cell-free extract was quantified using BioRad Protein Assay Kit (BioRad).

（２）制限酵素活性の比較
（１）で調製した無細胞抽出液を用いて、RrhJ1I制限酵素活性を調べた。
基質としてλ−DNAをHindIIIで切断したDNA（TOYOBO：λ／HindIII digest）0.5μgを使用し、大腸菌組換え体またはJ1菌の無細胞抽出液（それぞれ40μgタンパク質）を制限酵素用L buffer（タカラバイオ）と共に加え、37℃でサンプリングしながら1時間インキュベートした。サンプリングした反応液はフェノール処理を行って、電気泳動に共した。用いた基質DNAは、RrhJ1I制限酵素で切断されると約3.0Kbのバンドが出現する。 (2) Comparison of restriction enzyme activity Using the cell-free extract prepared in (1), RrhJ1I restriction enzyme activity was examined.
Using 0.5 μg of DNA (TOYOBO: λ / HindIII digest) cleaved from λ-DNA with HindIII as a substrate, cell-free extracts of E. coli recombinants or J1 bacteria (each 40 μg protein) were used as restriction enzyme L buffer (Takara). And incubated for 1 hour while sampling at 37 ° C. The sampled reaction solution was treated with phenol and used for electrophoresis. When the substrate DNA used is cleaved with the RrhJ1I restriction enzyme, a band of about 3.0 Kb appears.

結果を図７に示す。図７中、「M」は分子量マーカーを示し、「PC」は実施例１で調製した精製酵素を用いた切断結果を示し、「NC」は精製酵素を添加しないで行った実験結果を示す。
電気泳動の結果より、大腸菌組換え体の無細胞抽出液（図７「E.coli」）は反応20分で約3kbのバンドが出現したが、J1菌の無細胞抽出液（図７「R.rhodochrous J1」）は反応1時間後でもバンドは出現しなかった。以上の結果より、RrhJ1I制限酵素遺伝子を含むベクターを含有した本発明の大腸菌組換え体は、J1菌より大量の制限酵素を生産していることを確認した。 The results are shown in FIG. In FIG. 7, “M” indicates a molecular weight marker, “PC” indicates a cleavage result using the purified enzyme prepared in Example 1, and “NC” indicates an experimental result performed without adding the purified enzyme.
From the results of electrophoresis, an approximately 3 kb band appeared in the cell-free extract of E. coli recombinant (Fig. 7 "E.coli") after 20 minutes of reaction, but the cell-free extract of J1 bacteria (Fig. 7 "R. .rhodochrous J1 ") showed no band even after 1 hour of reaction. From the above results, it was confirmed that the E. coli recombinant of the present invention containing a vector containing the RrhJ1I restriction enzyme gene produced a larger amount of restriction enzyme than J1 bacteria.

配列番号１：RrhJ1I制限酵素の塩基配列
配列番号２：RrhJ1I制限酵素のアミノ酸配列
配列番号３：RrhJ1I修飾酵素の塩基配列
配列番号４：RrhJ1I修飾酵素のアミノ酸配列
配列番号５：実施例３で得られたDNAの塩基配列
配列番号６：実施例４で得られたDNAの塩基配列
配列番号７：実施例５で得られたDNAの塩基配列
配列番号８：ORF2の塩基配列
配列番号９：配列番号８から推定されるアミノ酸配列
配列番号１０：プライマー
配列番号１１：プライマー
配列番号１２：プライマー
配列番号１３：プライマー
配列番号１４：プライマー
配列番号１５：プライマー
配列番号１６：プライマー
配列番号１７：プライマー
配列番号１８：プライマー
配列番号１９：プライマー
配列番号２０：プライマー
配列番号２１：プライマー
配列番号２２：NaeI対応修飾酵素とNgoMIV対応修飾酵素のN末端相同アミノ酸配列
配列番号２３：NaeI対応修飾酵素とNgoMIV対応修飾酵素のC末端相同アミノ酸配列
配列番号２４：プライマー
配列番号２５：プライマー
配列番号２６：プライマー
配列番号２７：プライマー
配列表中、ｎはａ、ｔ、ｇまたはｃを示す。
配列表中、ｒはｇまたはａを示す。 SEQ ID NO: 1: RrhJ1I restriction enzyme nucleotide sequence SEQ ID NO: 2: RrhJ1I restriction enzyme amino acid sequence SEQ ID NO: 3: RrhJ1I modification enzyme nucleotide sequence SEQ ID NO: 4: RrhJ1I modification enzyme amino acid sequence SEQ ID NO: 5: obtained in Example 3 DNA base sequence SEQ ID NO: 6: DNA base sequence obtained in Example 4 SEQ ID NO: 7: DNA base sequence obtained in Example 5 SEQ ID NO: 8: ORF2 base sequence SEQ ID NO: 9: SEQ ID NO: 8 Amino acid sequence deduced from SEQ ID NO: 10: primer SEQ ID NO: 11: primer SEQ ID NO: 12: primer SEQ ID NO: 13: primer SEQ ID NO: 14: primer SEQ ID NO: 15: primer SEQ ID NO: 16: primer SEQ ID NO: 17: primer SEQ ID NO: 18: Primer sequence number 19: Primer sequence number 20: Primer sequence number 21: Primer sequence number 22: NaeI corresponding modification enzyme and NgoMIV N-terminal homologous amino acid sequence of the modified enzyme SEQ ID NO: 23: NaeI-compatible modified enzyme and NgoMIV-compatible modified enzyme C-terminal homologous amino acid sequence SEQ ID NO: 24: primer SEQ ID NO: 25: primer SEQ ID NO: 26: primer SEQ ID NO: 27: primer sequence table N represents a, t, g or c.
In the sequence listing, r represents g or a.

Claims (6)

以下の（Ａ）、（Ｂ）、または（Ｃ）のタンパク質。
（Ａ）配列番号４記載のアミノ酸配列を含むタンパク質
（Ｂ）配列番号４記載のアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列を含み、かつRrhJ1I修飾酵素活性を有するタンパク質
（Ｃ）配列番号４記載のアミノ酸配列と同一性が９０％以上のアミノ酸配列を含み、かつRrhJ1I修飾酵素活性を有するタンパク質 The following protein (A), (B), or (C).
(A) a protein comprising the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 4 (B) an amino acid sequence described in SEQ ID NO: 4 comprising an amino acid sequence in which one or several amino acids have been deleted, substituted or added, and RrhJ1I modifying enzyme activity (C) a protein having an amino acid sequence having 90% or more identity with the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4 and having RrhJ1I modifying enzyme activity 請求項１記載のタンパク質をコードする遺伝子。   A gene encoding the protein according to claim 1. 以下の（ａ）または（ｂ）のDNAを含む遺伝子。
（ａ）配列番号３記載の塩基配列からなるDNA
（ｂ）配列番号３記載の塩基配列からなるDNAと同一性が９０％以上で、かつRrhJ1I修飾酵素活性を有するタンパク質をコードする塩基配列からなるDNA A gene comprising the following DNA (a) or (b):
(A) DNA comprising the base sequence described in SEQ ID NO: 3
(B) DNA consisting of a base sequence encoding a protein having 90% or more identity with the DNA consisting of the base sequence described in SEQ ID NO: 3 and having RrhJ1I modifying enzyme activity 請求項２または３に記載の遺伝子を含む組換えベクター。   A recombinant vector comprising the gene according to claim 2 or 3. 請求項４記載の組換えベクターを含む形質転換体。   A transformant comprising the recombinant vector according to claim 4. 請求項５記載の形質転換体の培養物からRrhJ1I修飾酵素活性を有するタンパク質を採取することを含む、RrhJ1I修飾酵素の製造方法。   A method for producing an RrhJ1I-modifying enzyme, comprising collecting a protein having RrhJ1I-modifying enzyme activity from the transformant culture according to claim 5.
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