【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、糞便中の潜血成分を測定することによる大腸疾患の検査方法に用いられる。
【０００２】
【従来の技術】
大腸疾患、とりわけ大腸癌の検診に糞便中のヘモグロビンを測定する診断方法が広く行われている。またヘモグロビンに加えてトランスフェリンを合わせて測定する方法も取り入れられている。これはヘモグロビンが、不安定であるため、ヘモグロビン単独では信頼性の高い検査ができない畏れがあるため、安定性のよいトランスフェリンを合わせて測定しようとするものである。一方、カルプロテクチンはファゲルホルらによって見出された分子量３６５００の蛋白質である（特許文献１参照）。糞便中のカルプロテクチンを測定することにより、炎症性腸炎の診断に有用であることから既に糞便中のカルプロテクチン測定キットが海外で製造発売されている（Ｃａｌｐｒｅｓｔ Ｅｕｒｏｓｐｉｔａｌ社製）。また、糞便中のカルプロテクチンとヘモグロビンをそれぞれ測定して、大腸癌の診断マーカーとしての有用性を比較した報告もある（Ｓｃａｎｄ．Ｊ．Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｒｏｌ（１９９６）、３１、１００１−１００５）。この報告では、ヘモグロビンとカルプロテクチンとの間には相関性がなく、カルプロテクチンは大腸癌の診断マーカーとして不向きであると述べられている。そして、この報告では、一つの糞便試料をヘモグロビン測定用及びカルプロテクチン測定用に分けて、それぞれ測定している。
【０００３】
エラスターゼ−１はすい臓の機能を知るマーカーとして有用であり、特に糞便中のエラスターゼ−１を測定することにより、糖尿病の診断が可能になることも既に報告されている（Ｓｃａｎｄ Ｊ Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ． ２００１Ｏｃｔ；３６（１０）：１０５６−１０６１）。しかしながら、カルプロテクチンをヘモグロビン、トランスフェリン及び／又はエラスターゼ−１の測定を同一の試料で測定した例は全くない。
【０００４】
【特許文献１】
特公平７−８４４７
【特許文献２】
ＵＳ５４５５１６０
【特許文献３】
特開平０６−１８６２２７
【特許文献４】
特開平１１−０６４３３１
【非特許文献１】
Ｓｃａｎｄ．Ｊ．Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｒｏｌ（１９９６）、３１、１００１−１００５
【非特許文献２】
Ｓｃａｎｄ Ｊ Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ． ２００１ Ｏｃｔ；３６（１０）：１０５６−１０６１
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の課題は、糞便中の成分を測定することにより疾病の診断を行うにあたり、異なる疾患のマーカーとなりうる成分を同時又は同一の装置内で効率よく測定する方法を提供することである。具体的には糞便中のカルプロテクチン及び／又はエラスターゼ−１の測定を予め水性溶媒に溶解又は分散させた共通の検査試料中に含まれる他の成分と組み合わせて、同一検査試料を用いることにより同時又は同一の装置内で測定する糞便成分の検査方法を提供するものである。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、糞便中のヘモグロビンとトランスフェリンが大腸癌の検診に用いられていること及び糞便中のカルプロテクチンが炎症性腸炎の診断マーカーになり得ること、さらにエラスターゼ−１が膵臓の機能を診る上で有用であることに着目し、糞便を予め溶解或いは懸濁させた同一の試料でこれらの項目を同時又は同一装置内で免疫測定法により測定することにより、同時に異なる疾患の検査診断が可能であることを見出し本発明を完成させた。
【０００７】
本発明は以下の構成からなる。
１、糞便を予め水性溶媒中に溶解又は分散させた検査試料中のカルプロテクチン及び／又はエラスターゼ−１を、該検査試料中に含まれる他の成分とともに少なくとも２種類の項目の組合せ測定を同一の該検査試料を用いて行うことを特徴とする糞便成分の検査方法を提供するものである。
２、糞便を予め水性溶媒中に溶解又は分散させた検査試料中のカルプロテクチンとエラスターゼ−１とを同一の該検査試料を用いて、それぞれを測定することを特徴とする糞便成分の検査方法を提供するものである。
３、免疫測定法により、同時、又は同一装置内で当該検査対象項目を測定する上記１または２に記載の方法。
４、上記１〜３に記載の方法を実施するための試薬キット。
５、上記１〜３に記載の方法実施するための検査装置。
【０００８】
【発明の実施の形態】
本発明は糞便中のカルプロテクチン及び／又はエラスターゼ−１を測定するにあたり、該検査試料中に含まれる他の成分とともに少なくとも２種類の項目の組合せ測定を同一の該検査試料を用いて行うことによる検査方法に関するものであり、さらに、カルプロテクチンとエラスターゼ−１とを同一の該検査試料を用いて、それぞれを測定することを特徴とする糞便成分の検査方法を提供するものである。
【０００９】（糞便試料の調製方法）
糞便試料は市販の便潜血検査用の最便容器、例えば特開平０６−１８６２２７、特開平１１−０６４３３１等に開示されている用具を用いて糞便試料の採取、緩衝液への懸濁等の操作を行うことができる。このような容器は通常、糞便中のヘモグロビン及び又はトランスフェリンを測定（本発明においては、成分を測定すること又は検出することを同義に扱っている。）するために簡単にしかも比較的精度良く採便できるように工夫されているため本発明を実施するためには好適である。
【００１０】（測定装置）
カルプロテクチン及び／又はエラスターゼ−１を検査試料中に含まれる他の成分と同時、又は同一の装置内で測定するための、好適な実施態様としては、免疫クロマト法が挙げられる。カルプロテクチンやエラスターゼ−１に対する抗体、ポリクローナル或いはモノクローナル抗体、を金属コロイド粒子、着色ラテックス粒子等に吸着保持させた粒子標識抗体を調製する。一方カルプロテクチン及びエラスターゼ−１以外の糞便中の測定する他の成分は特に限定されないが、代表的な例としてヘモグロビンやトランスフェリンが挙げられる。これらに特異的な抗体をカルプロテクチン及び／又はエラスターゼの場合と同じ種類の粒子或いは異なる種類の粒子に吸着保持させた標識粒子を調製する。これの標識粒子を粒子保持体に保持させてイムノクロマトに供する。イムノクロマトの展開メンブランの標識粒子捕獲部位にカルプロテクチン及び／又はエラスターゼ−１とヘモグロビン及び／又はトランスフェリンに対する抗体を試料液の展開方向と垂直になるように保持しておく。これらの概念図を図１に示した。
糞便試料懸濁液をイムノクロマト装置の試料添加部位に添加し、展開させることによって、分析対象成分が一定濃度以上存在している場合には、検出部位において反応ラインが出現する。そのラインの有無を観察することにより、分析対象成分の有無を判定する。
【００１１】（他の免疫測定装置）
上記例はイムノクロマト法による本発明の実施態様例を示したが、イムノクロマト法に限定されることなく、例えばカルプロテクチンに対する抗体と、ヘモグロビン等に対する抗体をそれぞれ異なる種類の標識物質で標識した標識抗体を用いて、同一の反応容器内に捕獲されたそれぞれの抗原を測定することも可能である。これの実施態様を可能にする標識物質の組合せとしては、例えばペルオキダ−ゼとアルカリフォスファターゼの異なる酵素の組合せ、ユーロピウムキレートとルテニウムキレートの組合せ、アクリジニウムエステルとエクオリンによる発光測定の組合せ等、公知の標識物質が使用できる。用いる固相は、例えばチューブや、マイクロプレートのように容器に直接抗体を固定化するものでは、それぞれの抗体の混合物を固定化することにより、固相を調製することが可能である。磁性微粒子の様に粒子状固相を用いる場合には、各抗体を別々に吸着固定化した固相を混合して用いるか、或いは抗体の混合物を一種類の粒子に固定化して用いることも可能である。
このようにして調製した、固相に検査試料を反応させ、分析対象成分を固相に捕獲した後、標識抗体を反応させ、固相に捕獲された標識抗体量を測定することにより、分析対象成分の量を測定することが可能である。
【００１２】
さらに、本発明は同一の免疫測定装置を用いる方法に限定されることなく、同一の糞便溶解試料を用いて、カルプロテクチン及び／又はエラスターゼ−１を糞便中に含まれる他の成分を、それぞれ別々に測定する方法にも及ぶ。このような例として、通常のＥＩＡ法やラテックス凝集法等公知の免疫測定法が適用される。
さらには、ビリルビン等の場合には分光学的又は酵素反応を利用して測定する場合もある。
【００１３】
ラテックス凝集反応を用いてその凝集反応を比濁法により、本発明を実施する場合には、カルプロテクチン及び／又はエラスターゼ−１に対する抗体をラテックス粒子に吸着させ、それぞれのラテックス試薬を調製する。さらに、例えばヘモグロビンに対する抗体もラテックス粒子に吸着させ、ラテックス試薬を調製し、同一被検試料を検体としてそれぞれの試薬で測定する。測定は、汎用の分光光度計や自動分析器を用いて測定することが可能である。また、便潜血専用の測定装置を用いることも可能である。
【００１４】
【実施例】
以下、本発明を更に詳しく説明するため実施例を挙げる。
【実施例１】（イムノクロマト装置の調製）
抗カルプロテクチン抗体（マウスモノクローナル抗体クローンＮｏ．１０８、日本医学臨床検査研究所製）を金コロイド粒子に吸着させ金コロイド標識抗カルプロテクチン抗体を調製した。さらに抗エラスターゼ−１抗体（マウスモノクローナル抗体、クローンＮｏ．ＥＬ−１２３ 、日本医学臨床検査研究所製）を金コロイド粒子に吸着させ金コロイド標識抗カルプロテクチン抗体を調製した。次いで、抗ヒトヘモグロビン抗体（マウスモノクローナル抗体クローンＮｏ．Ｂ１１．ＷＧ ケミコン社製）を同様に金コロイド粒子に吸着させて金コロイド標識抗ヒトヘモグロビン抗体を調製した。調製した２種類の金コロイド標識抗体を等量混合して、それをイムノクロマト用コンジュゲートパッドに浸漬保持させた。吸着パッドを乾燥させコンジュゲートパッドとしてイムノクロマト装置に組み込んだ。市販のラテラルフロー用メンブラン（孔径１．２μｍ）上に抗カルプロテクチン抗体（マウスモノクローナル抗体クローンＮｏ．ＣＬ−１９日本医学臨床研究所製）と抗ヒトヘモグロビン抗体（ウサギ）をそれぞれ検出部に保持させた。メンブランはＢＳＡでブロッキング後乾燥させて用いた。
図１に示したような構成でイムノクロマト装置を調製した。
【００１５】
【実施例２】（測定）
実施例１で調製したイムノクロマト装置を用いて、試料の測定を行った。１％（Ｗ／Ｖ）のＢＳＡを含むＰＢＳ緩衝液にカルプロテクチン２００ｎｇ／ｍＬを含む標準液、ヒトヘモグロビン３００ｎｇ／ｍＬを含む標準液をそれぞれ調製して、標準試料とした。
糞便１０ｍｇを２ｍＬの緩衝液に懸濁させる市販の採便容器（栄研化学社製）に採取された糞便試料を用いて測定した。その結果を表１に示した。
【００１６】
【表１】
【００１７】
以上の結果、本発明により、カルプロテクチン、エラスターゼ−１及びヘモグロビンを同時に測定でき、種々の糞便試料で共に陰性、すべてが陽性、どれか一方が陽性示す試料が存在することを同時に判定することが可能となり、その結果から大腸がんと炎症性腸炎の鑑別診断、さらには糖尿病の診断も同時にできることが判った。
【００１８】
【発明の効果】
本発明により、糞便中のカルプロテクチン及び／又はエラスターゼ−１と糞便中の他の成分、例えばヘモグロビン、トランスフェリン等を、糞便を予め水性溶媒に溶解又は懸濁させた共通の試料を用いて測定し、その結果を臨床診断に適用できる。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明のイムノクロマト法の概念図である。
【符号の説明】
１、測定装置本体
２、コンジュゲートパッド
３、抗カルプロテクチン抗体
４、抗エラスターゼー１抗体
５、抗ヒトヘモグロビン抗体
６、吸収パッド[0001]
TECHNICAL FIELD OF THE INVENTION
INDUSTRIAL APPLICABILITY The present invention is used for a method for examining colorectal diseases by measuring occult blood components in feces.
[0002]
[Prior art]
2. Description of the Related Art Diagnosis methods for measuring hemoglobin in feces are widely used for screening for colorectal diseases, particularly for colorectal cancer. A method of measuring transferrin in addition to hemoglobin has also been adopted. In this method, since hemoglobin is unstable, there is a fear that a highly reliable test cannot be performed with hemoglobin alone. Therefore, an attempt is made to measure transferrin with good stability. On the other hand, calprotectin is a protein having a molecular weight of 36,500, which was discovered by Fagerfor et al. (See Patent Document 1). Since measurement of fecal calprotectin is useful for diagnosis of inflammatory bowel disease, a fecal calprotectin measurement kit has already been manufactured and sold overseas (manufactured by Calpress Eurospital). In addition, there is also a report comparing calfectin and hemoglobin in feces, respectively, and comparing the usefulness as a diagnostic marker for colorectal cancer (Scand. J. Gastroentrol (1996) 31, 31, 1001-1005). The report states that there is no correlation between hemoglobin and calprotectin, and states that calprotectin is unsuitable as a diagnostic marker for colorectal cancer. In this report, one stool sample is measured separately for hemoglobin measurement and calprotectin measurement.
[0003]
Elastase-1 is useful as a marker for the function of the pancreas, and it has already been reported that the measurement of elastase-1 in feces makes it possible to diagnose diabetes (Scan J Gastroenterol. 2001 Oct; 36). (10): 1056-1061). However, there is no example of measuring calprotectin for hemoglobin, transferrin and / or elastase-1 in the same sample.
[0004]
[Patent Document 1]
Tokuho 7-8447
[Patent Document 2]
US5455160
[Patent Document 3]
JP-A-06-186227
[Patent Document 4]
JP-A-11-064331
[Non-patent document 1]
Scand. J. Gastroentrol (1996), 31, 1001-1005
[Non-patent document 2]
Scan J Gastroenterol. 2001 Oct; 36 (10): 1056-1061.
[0005]
[Problems to be solved by the invention]
An object of the present invention is to provide a method for efficiently measuring components that can be markers for different diseases simultaneously or in the same device when diagnosing a disease by measuring components in feces. Specifically, the measurement of calprotectin and / or elastase-1 in stool is combined with other components contained in a common test sample previously dissolved or dispersed in an aqueous solvent, and the same test sample is used. An object of the present invention is to provide a method for testing fecal components which are measured simultaneously or in the same device.
[0006]
[Means for Solving the Problems]
The present inventors have confirmed that hemoglobin and transferrin in feces are used for screening for colorectal cancer, that calprotectin in feces can be a diagnostic marker for inflammatory bowel disease, and that elastase-1 functions in pancreas. Focusing on the usefulness in examining stool, testing and diagnosis of different diseases at the same time by measuring these items simultaneously or in the same device using the same sample in which feces are dissolved or suspended in advance The present invention has been completed by finding that the following is possible.
[0007]
The present invention has the following configuration.
1. The combination measurement of at least two types of calprotectin and / or elastase-1 in a test sample in which stool is dissolved or dispersed in an aqueous solvent in advance together with other components contained in the test sample is the same. And a method for testing fecal components characterized by using the test sample described above.
2. A method for testing fecal components, wherein calprotectin and elastase-1 in a test sample in which feces are dissolved or dispersed in an aqueous solvent in advance are measured using the same test sample. Is provided.
3. The method according to 1 or 2 above, wherein the test items are measured simultaneously or in the same device by an immunoassay.
4. A reagent kit for performing the method according to any one of 1 to 3 above.
5. An inspection apparatus for performing the method described in the above 1 to 3.
[0008]
BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION
According to the present invention, when measuring calprotectin and / or elastase-1 in feces, a combination measurement of at least two items is performed using the same test sample together with other components contained in the test sample. The present invention further provides a method for testing fecal components, characterized in that calprotectin and elastase-1 are each measured using the same test sample.
(Method of preparing fecal sample)
The stool sample is collected by using a commercially available most convenient container for fecal occult blood testing, for example, a tool disclosed in JP-A-06-186227, JP-A-11-064431, etc. It can be performed. Such a container is usually simply and relatively accurately measured for measuring hemoglobin and / or transferrin in feces (in the present invention, the term "measuring or detecting a component" is synonymous). Since it is devised so as to be convenient, it is suitable for carrying out the present invention.
(Measurement device)
A preferred embodiment for measuring calprotectin and / or elastase-1 at the same time as the other components contained in the test sample or in the same device includes an immunochromatography method. An antibody against calprotectin or elastase-1, a polyclonal or monoclonal antibody, is adsorbed and held on metal colloid particles, colored latex particles, or the like to prepare a particle-labeled antibody. On the other hand, other components to be measured in feces other than calprotectin and elastase-1 are not particularly limited, but typical examples include hemoglobin and transferrin. Labeled particles are prepared by adsorbing an antibody specific to these on the same type of particles as calprotectin and / or elastase or on different types of particles. The labeled particles are held on a particle holder and subjected to immunochromatography. Antibodies to calprotectin and / or elastase-1 and hemoglobin and / or transferrin are held at the capture site of the labeled particles of the immunochromatographic development membrane so as to be perpendicular to the development direction of the sample solution. These conceptual diagrams are shown in FIG.
By adding the fecal sample suspension to the sample addition site of the immunochromatography apparatus and developing it, a reaction line appears at the detection site when the concentration of the analyte is more than a certain level. By observing the presence or absence of the line, the presence or absence of the component to be analyzed is determined.
(Other immunoassay devices)
Although the above example shows an embodiment of the present invention by the immunochromatography method, the present invention is not limited to the immunochromatography method. Can be used to measure each antigen captured in the same reaction vessel. Examples of combinations of labeling substances that enable this embodiment include known combinations of peroxidase and alkaline phosphatase, combinations of europium chelates and ruthenium chelates, and combinations of luminescence measurements with acridinium esters and aequorin. Can be used. As the solid phase to be used, for example, in the case where an antibody is directly immobilized on a container such as a tube or a microplate, the solid phase can be prepared by immobilizing a mixture of the respective antibodies. When using a particulate solid phase such as magnetic fine particles, it is possible to use a mixture of solid phases in which each antibody is separately adsorbed and immobilized, or to use a mixture of antibodies immobilized on one type of particle. It is.
The test sample is allowed to react with the solid phase prepared in this way, and the analyte is captured on the solid phase.Then, the labeled antibody is reacted, and the amount of the labeled antibody captured on the solid phase is measured. It is possible to determine the amounts of the components.
[0012]
Furthermore, the present invention is not limited to a method using the same immunoassay device, and uses the same stool-dissolved sample to separate other components contained in the stool containing calprotectin and / or elastase-1. It extends to the method of measuring separately. As such an example, a known immunoassay such as a normal EIA method or a latex agglutination method is applied.
Furthermore, in the case of bilirubin or the like, the measurement may be performed using spectroscopic or enzymatic reactions.
[0013]
When the present invention is carried out by using a latex agglutination reaction and the agglutination reaction by a turbidimetric method, an antibody against calprotectin and / or elastase-1 is adsorbed to latex particles to prepare each latex reagent. Further, for example, an antibody against hemoglobin is also adsorbed to the latex particles, a latex reagent is prepared, and the same test sample is measured as a sample with each reagent. The measurement can be performed using a general-purpose spectrophotometer or an automatic analyzer. It is also possible to use a measuring device dedicated to fecal occult blood.
[0014]
【Example】
Hereinafter, examples will be given to explain the present invention in more detail.
Example 1 (Preparation of immunochromatographic apparatus)
An anti-calprotectin antibody (mouse monoclonal antibody clone No. 108, manufactured by Nippon Medical Laboratory) was adsorbed on colloidal gold particles to prepare a colloidal gold-labeled anti-calprotectin antibody. Further, an anti-elastase-1 antibody (mouse monoclonal antibody, clone No. EL-123, manufactured by Japan Medical Clinical Laboratory) was adsorbed on colloidal gold particles to prepare a colloidal gold-labeled anti-calprotectin antibody. Next, an anti-human hemoglobin antibody (mouse monoclonal antibody clone No. B11.WG, manufactured by Chemicon) was similarly adsorbed to colloidal gold particles to prepare a colloidal gold-labeled anti-human hemoglobin antibody. Equal amounts of the two prepared colloidal gold-labeled antibodies were mixed, and the mixture was immersed and held in a conjugate pad for immunochromatography. The adsorption pad was dried and incorporated into an immunochromatography apparatus as a conjugate pad. Anti-calprotectin antibody (mouse monoclonal antibody clone No. CL-19, manufactured by Nippon Medical Research Institute) and anti-human hemoglobin antibody (rabbit) retained on a commercially available lateral flow membrane (pore size 1.2 μm) I let it. The membrane was dried after blocking with BSA.
An immunochromatography apparatus was prepared with the configuration as shown in FIG.
[0015]
Example 2 (Measurement)
The sample was measured using the immunochromatography apparatus prepared in Example 1. A standard solution containing 200 ng / mL of calprotectin and a standard solution containing 300 ng / mL of human hemoglobin in a PBS buffer solution containing 1% (W / V) of BSA were prepared as standard samples.
The measurement was performed using a stool sample collected in a commercially available stool container (manufactured by Eiken Chemical Co., Ltd.) in which 10 mg of stool was suspended in 2 mL of a buffer solution. The results are shown in Table 1.
[0016]
[Table 1]
As a result of the above, according to the present invention, calprotectin, elastase-1 and hemoglobin can be measured at the same time, and both stool samples are negative, all positive, and it is simultaneously determined that there is a sample showing any one positive. The results showed that the diagnosis of colorectal cancer and inflammatory bowel disease could be made simultaneously, and that the diagnosis of diabetes could be made at the same time.
[0018]
【The invention's effect】
According to the present invention, calprotectin and / or elastase-1 in feces and other components in feces, such as hemoglobin and transferrin, are measured using a common sample in which feces are dissolved or suspended in an aqueous solvent in advance. The results can be applied to clinical diagnosis.
[Brief description of the drawings]
FIG. 1 is a conceptual diagram of the immunochromatography method of the present invention.
[Explanation of symbols]
1, measuring device main body 2, conjugate pad 3, anti-calprotectin antibody 4, anti-elastase-1 antibody 5, anti-human hemoglobin antibody 6, absorption pad
