JP2004250404A - Medicinal composition using pyridinium compound and clinical examination method - Google Patents

Abstract

<P>PROBLEM TO BE SOLVED: To synthesize a Maillard reaction product of glyceraldehyde, and obtain a medicinal composition and to provide a clinical examination method by utilizing the reaction product. <P>SOLUTION: (1) The subject pyridinium compound is represented by formula (I) (wherein R<SP>1</SP>is hydrogen, an amino acid residue, a peptide residue or an alkyl group which may be substituted; R<SP>2</SP>and R<SP>3</SP>are each independently hydroxy group or its esterification group; X<SP>-</SP>is a monovalent anion). (2) The medicinal composition comprises the compound represented by formula (I) described in the item (1). (3) A method for suppressing proliferation of cancer cells comprises using the medicinal composition described in the item (2). (4) The clinical examination method uses the compound described in the item (1) as an index. <P>COPYRIGHT: (C)2004,JPO&NCIPI

Description

（式中、Ｒ^１は水素、アミノ酸残基、ペプチド残基、又は置換されていてもよいアルキル基を表し、Ｒ^２又はＲ^３はそれぞれ独立に、水酸基又はそのエステル化基を表し、Ｘ⁻は１価の陰イオンを表す。）で示される化合物、
（２）（１）に記載された式（Ｉ）で表される化合物を含有する医薬組成物、
（３）（２）に記載された医薬組成物を用いたがん細胞の増殖抑制方法、
（４）（１）に記載された化合物を指標とする臨床検査方法。
【０００９】
以下に上記本発明を説明する。
本発明者らは、グリセルアルデヒドのメイラード反応について種々研究を重ねた結果、グリセルアルデヒドとＮ^α−アセチルリジンの反応生成物から新規なピリジニウム化合物を単離同定した。このピリジニウム化合物は、１−（５−アセチルアミノ−５−カルボキシペンチル）−３−ヒドロキシ−５−ヒドロキシメチルピリジニウムであり、下記にその化学式を示す。
【化３】

【００１０】
この化合物は、１分子のＮ^α−アセチルリジンと２分子のグリセルアルデヒドが反応して生成したと考えられる化学構造を有する。
以下、本化合物をＧＬＡＰ（ＧＬｙｃｅｒＡｌｄｅｈｙｄｅ ｄｅｒｉｖｅｄ Ｐｙｒｉｄｉｎｉｕｍ ｃｏｍｐｏｕｎｄ）と略称する。
本発明は、下記のＧＬＡＰ化合物（Ｉ）の用途を提供するものである。
【化４】

（式中、Ｒ^１は水素、アミノ酸残基、ペプチド残基、又は置換されていてもよいアルキル基を表し、Ｒ^２又はＲ^３はそれぞれ独立に、水酸基又はそのエステル化基を表し、Ｘ⁻は１価の陰イオンを表す。）
【００１１】
例えば、ＧＬＡＰの生理作用について検討した結果、ヒト骨髄性白血病細胞ＨＬ−６０増殖抑制活性を示すことを見出し、この知見に基づいて上記ＧＬＡＰ化合物を含有する医薬組成物を完成させた。
【００１２】
【発明の実施の形態】
式（Ｉ）において、Ｒ^１は水素、アミノ酸残基、ペプチド残基、又は置換されていてもよいアルキル基を表す。残基とは、アミノ酸又はペプチドから水素を１つ除いた基を意味する。アミノ酸としては、化合物として入手可能なアミノ酸であり、天然型アミノ酸又はそのエステル体が好ましく、リジン、Ｎ^α−アセチルリジンなどが例示できる。ペプチドとしては、アミノ酸１〜２０残基であり、１〜１０残基が好ましく、グリシルリジンなどが例示できる。置換されていてもよいアルキル基としては、炭素数（Ｃ）が１〜２０であり、Ｃ１〜１０が好ましく、メチル基、エチル基、イソプロピル基などが例示できる。
Ｒ^２又はＲ^３はそれぞれ独立に、水酸基又はそのエステルを表す。エステルとしては、Ｃ１〜２０のエステルであり、Ｃ１〜６が好ましく、酢酸エステルなどが例示できる。
【００１３】
本発明の式（Ｉ）において、より好ましい置換基の組み合わせは、次の式（ＩＩ）で表される化合物である。
【化５】

（式中、Ｒ^１は水素又はアシル基を表し、Ｒ^２はＯＨ、アルコキシ基又はアミノ基を表し、Ｒ^３は水素又は低級アルキル基を表し、Ｒ^４は水素又は低級アルキル基を表し、Ｘ⁻は薬理学的に許容される１価の陰イオンを表し、ｎは１以上の整数を表す。）
式（ＩＩ）においてＲ^１が表すアシル基は、Ｃ１〜２０であり、Ｃ２〜８が好ましく、アセチル基、エチルカルボニル基、プロピルカルボニル基、ベンゾイル基などが例示できる。
Ｒ^２が表すアルコキシ基は、Ｃ１〜２０であり、Ｃ１〜８が好ましく、メトキシ基、エトキシ基、プロポキシ基、フェノキシ基などが例示できる。Ｒ^２が表すアミノ基としては遊離のアミノ基の他に１置換アミノ基でもよく、メチルアミノ基、アニリノ基が例示できる。
Ｒ^３又はＲ^４の表す低級アルキル基としては、Ｃ１〜６であり、例えばメチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、ブチル基、イソブチル基があげられる。
Ｘ⁻は、薬理学的に許容される１価の陰イオンである。生体内に存在できる１価の陰イオンであればよく、例えば塩化物イオン、臭化物イオンなどが例示できる。
【００１４】
式（ＩＩ）において、置換基及び陰イオンの最も好ましい組み合わせは、Ｒ^１がアセチル基であり、Ｒ^２はヒドロキシ基であり、Ｒ^３およびＲ^４は水素であり、ｎは４であり、Ｘ⁻は塩素イオンである。
また、一連のＧＬＡＰ化合物には不斉炭素が存在するが、本発明においてはそれぞれの光学的に純粋な鏡像異性体及びその混合物も含まれる。
【００１５】
以下に式（ＩＩ）に表される化合物の具体例を示す。
（１）１−（５−アセチルアミノ−５−カルボキシペンチル）−３−ヒドロキシ−５−ヒドロキシメチルピリジニウムクロリド
（２）１−（５−アミノ−５−カルボキシペンチル）−３−ヒドロキシ−５−ヒドロキシメチルピリジニウムクロリド
（３）１−（５−アセチルアミノ−５−カルボキシペンチル）−３−メトキシ−５−ヒドロキシメチルピリジニウムクロリド
（４）１−（５−アミノ−５−カルボキシペンチル）−３−メトキシ−５−ヒドロキシメチルピリジニウムクロリド
（５）１−（５−アセチルアミノ−５−カルボキシプロピル）−３−ヒドロキシ−５−ヒドロキシメチルピリジニウムクロリド
（６）１−（５−アミノ−５−カルボキシプロピル）−３−ヒドロキシ−５−ヒドロキシメチルピリジニウムクロリド
（７）１−（５−アセチルアミノ−５−カルボキシプロピル）−３−メトキシ−５−ヒドロキシメチルピリジニウムクロリド
（８）１−（５−アミノ−５−カルボキシプロピル）−３−メトキシ−５−ヒドロキシメチルピリジニウムクロリド
【００１６】
次に、本発明における式（Ｉ）の好ましい実施の形態である式（ＩＩ）で表される化合物の合成について説明する。
【００１７】
本発明の式（ＩＩ）で表される化合物は、グリセルアルデヒドと適当なアミノ酸をリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．４）に溶解させ、２５℃ないし６０℃、最も好ましくは３７℃にて、１日ないし１４日間、最も好ましくは７日間インキュベートすることにより合成することができる。反応混合物をセルロースアセテートメンブレンフィルターに通し不溶物を除去した後に、水−アセトニトリル系で平衡化した逆相ＨＰＬＣにて容易に精製することができる。こうして単離された本発明の式（ＩＩ）で表される化合物は、定法に従い、質量分析スペクトル、核磁気共鳴スペクトル等によりその化学構造を決定することができる。
【００１８】
また、本発明の式（ＩＩ）で表される化合物は、次に示す反応式にしたがって有機合成的手法により製造することもできる。
（反応式Ａ）
【化６】

（式中、Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^３、Ｒ^４、Ｘ⁻及びｎは前記式（ＩＩ）と同義である。）
すなわち、アミノ酸誘導体（ＩＩＩ）とピリジン誘導体（ＩＶ）を加熱下に反応させることにより化合物（ＩＩ）が得られる。
例えば、アミノ酸誘導体（ＩＩＩ）として２−アセチルアミノ−６−クロロヘキサン酸を用い、ピリジン誘導体（ＩＶ）として３−ヒドロキシ−５−ヒドロキシメチルピリジンを用いることにより、１−（５−アセチルアミノ−５−カルボキシペンチル）−３−ヒドロキシ−５−ヒドロキシメチルピリジニウムクロリド（化合物（１））が得られる。
原料物質として用いるアミノ酸誘導体（ＩＩＩ）は、公知のアミノ酸を出発物質として、例えば次の方法で製造することができる。
【００１９】
（反応式Ｂ）
【化７】

（式中、Ｒ^１、Ｒ^２、Ｘ⁻及びｎは前記式（ＩＩ）と同義である。）
すなわち、塩化チオニルの存在下、アミノ酸（Ｖ）とＲ^２Ｈを縮合し（ＶＩ）を得る。ＤＣＣ（ジシクロヘキシルカルボジイミド）の存在下、（ＶＩ）とＲ^１Ｈを縮合し（ＶＩＩ）を得た後に、末端水酸基をハロゲン化することによりアミノ酸誘導体（ＩＩＩ）を得ることができる。
例えば、アミノ酸（Ｖ）として６−ヒドロキシノルロイシンを用いれば、化合物（１）の原料物質である２−アセチルアミノ−６−クロロヘキサン酸が得られる。
また、ピリジン誘導体（ＩＶ）は、公知の５−ヒドロキシニコチン酸メチルを出発物質として、例えば次の方法で製造することができる。
【００２０】
（反応式Ｃ）
【化８】

（式中、Ｒ^３及びＲ^４は前記式（ＩＩ）と同義である。）
すなわち、５−ヒドロキシニコチン酸メチルのフェノール性水酸基をアルキル化して（ＶＩＩＩ）を得る。（ＶＩＩＩ）のエステル部分を水素化アルミニウムリチウムで還元し（ＩＸ）を得た後に、水酸基をアルキル化することによりピリジン誘導体（ＩＶ）を得ることができる。
例えば、５−ヒドロキシニコチン酸メチルを水素化アルミニウムリチウムで還元することにより、化合物（１）の原料物質である３−ヒドロキシ−５−ヒドロキシメチルピリジンが得られる。
【００２１】
以下に、１−（５−アセチルアミノ−５−カルボキシペンチル）−３−ヒドロキシ−５−ヒドロキシメチルピリジニウムクロリド（化合物（１））の製造について説明する。
（反応式Ａ１）
【化９】

２−アセチルアミノ−６−クロロヘキサン酸（ＩＩＩ）と３−ヒドロキシ−５−ヒドロキシメチルピリジン（ＩＶ）を加熱下に反応させることにより１−（５−アセチルアミノ−５−カルボキシペンチル）−３−ヒドロキシ−５−ヒドロキシメチルピリジニウムクロリド（化合物（１））が得られる。
【００２２】
原料物質である２−アセチルアミノ−６−クロロヘキサン酸（ＩＩＩ）は以下の方法により製造できる。
（反応式Ｂ１）
【化１０】

すなわち、ＤＣＣの存在下、６−ヒドロキシノルロイシンと酢酸を縮合することにより化合物（ＶＩＩ）を得る。化合物（ＶＩＩ）の水酸基を四塩化炭素、トリフェニルホスフィンでクロロ化することにより２−アセチルアミノ−６−クロロヘキサン酸（ＩＩＩ）が得られる。
【００２３】
原料物質であるピリジン誘導体３−ヒドロキシ−５−ヒドロキシメチルピリジン（ＩＶ）は以下の方法により製造できる。
（反応式Ｃ１）
【化１１】

すなわち、５−ヒドロキシニコチン酸メチルを水素化アルミニウムリチウムで還元することにより３−ヒドロキシ−５−ヒドロキシメチルピリジン（ＩＶ）が得られる。
【００２４】
本発明の式（Ｉ）で表される化合物は蛍光性物質（励起：２９８ｎｍ、蛍光：３８８ｎｍ）であるので、蛍光吸収スペクトルを測定することにより容易に検出・定量することができる。また、２９０ｎｍ付近に紫外吸収極大を有するためにＬＣ−ＭＳスペクトルの測定やＨＰＬＣ分析も検出・定量の補助的手段となりうる。
【００２５】
本発明の式（Ｉ）で表される化合物は、製剤化し、医薬組成物として使用することができる。
【００２６】
製剤としては特定のものに限定されず、日本薬局方に規定された製剤の中から治療方針に合うものを選ぶことができ、錠剤、注射剤、顆粒剤などが例示できる（渡邊光夫編、日本薬局方マニュアル、南山堂（１９９８年））。
【００２７】
製剤の保存中の性状および品質の基準を確保し、又はその有用性を高めるために添加剤を加えることができる。添加剤としては、賦形剤、結合剤、崩壊剤などが例示できる（日本医薬品添加剤協会編集、医薬品添加物辞典、薬事日報社（１９９４年））。
【００２８】
本発明のＧＬＡＰ化合物は、がん細胞増殖抑制剤として非経口的に投与することができる。その投与量は、治療すべき疾患の程度により増減されるが、通常１日当り０．０１ないし１０ｍｇ／Ｋｇの範囲内で選ばれる。このものは、細胞毒性による細胞増殖抑制作用を示すため、他の細胞増殖抑制剤よりも少ない量の投与で十分な効果が得られる。また、このものは０．１ないし１０％濃度の水性溶液として製剤化されるが、所望に応じ溶解補助剤、緩衝剤、等張化剤、安定剤、保存剤、無痛化剤など注射剤に慣用されている添加剤を併用することもできる。さらに、必要な場合には他の抗悪性新生物剤と併用することもできる。
【００２９】
本発明のＧＬＡＰ化合物は糖尿病合併症、アルツハイマー病、動脈硬化症の診断の指標として用いることができる。これらの疾患を有する患者の血液、尿あるいは病変組織を採取し、ＧＬＡＰ化合物量を定量することにより病気の進行度を正確に判断することができ、医師は病気の進行度に応じた的確な治療をすることが可能である。また、抗ＧＬＡＰ抗体を作成することにより、免疫学的手法を用いてＧＬＡＰ化合物量を定量することも可能である。
【００３０】
本発明のＧＬＡＰ化合物ががん細胞増殖抑制剤であることを利用すれば、がんの重篤度の段階あるいはレベルおよび薬物、放射線、またはいくつかの他の処置形態へのがんの感応性を決定するための診断評価あるいはキットとして使用することができる。患者由来の細胞を組織培養する。細胞培養物、及び同一あるいは異なる患者からの細胞株、初代細胞、あるいは非新生物細胞でありうるコントロール培養物（陽性及び／あるいは陰性コントロール細胞）に、本発明のＧＬＡＰ化合物を加える。化合物処理培養物及びコントロール培養物を、一定期間、好ましくは１日、より好ましくは１ないし６時間、さらに最も好ましくは１時間未満インキュベートする。培養物を、インキュベーション期間後試験し、細胞分裂、細胞増殖、ＤＮＡ複製、ＤＮＡ、ＲＮＡ、またはタンパク質合成、あるいはサイトカイン、サイトカインレセプター、他の細胞表面分子または他の抗原の発現量を決定する。コントロールと比較して活性への効果が大きくなると、試験されるがんの特定の形態が処置を必要とする見込みが大きくなる。このような評価は、特定の患者のための最善の治療方針の決定における診断ツールとして、および可能な治療的あるいは予防的用途のための新しい化合物のスクリーニングのための診断ツールとしても広く有用であり得る。ガンの重篤度対化学療法の有効性の図あるいは表を作成することが可能となる。このようにして、有効性が大きく、かつ危険性の少ない治療薬を選択することが可能である。
【００３１】
さらに本発明のＧＬＡＰ化合物は近年生体内メイラード反応の関与が予測されている腫瘍破壊因子（ＴＮＦ）やインターロイキン１（ＩＬ−１）等のサイトカイン産生の分子レベルでのメカニズム解明のための研究ツールとして利用が可能である。また、新規ＡＧＥ受容体の発見及びそのｃＤＮＡのクローニングのための研究ツールとしても利用が可能であり、ひいてはいまだに発症メカニズムが未解明で特効薬のない治療薬の研究に応用することが可能である。
【００３２】
（合成例１）
１−（５−アセチルアミノ−５−カルボキシペンチル）−３−ヒドロキシ−５−ヒドロキシメチルピリジニウムの合成、単離及び構造決定を行った。
グリセルアルデヒド（２００ｍＭ）とＮ^α−Ｌ−アセチルリジン（１００ｍＭ）を０．２Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．４）に溶解させ、３７℃にて１週間インキュベートした。反応混合物をセルロースアセテートメンブレンフィルター（０．２０μｍ）に通した後に、逆相ＨＰＬＣ（カラム：Ｐｅｇａｓｉｌ−ＯＤＳ、溶離液：リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）−アセトニトリル系、流量：４ｍｌ／ｍｉｎ、測定波長：２１５ｎｍ）に付した。このときのＨＰＬＣチャートを図１に示した。保持時間２０分前後の画分を分取することにより１−（５−アセチルアミノ−５−カルボキシペンチル）−３−ヒドロキシ−５−ヒドロキシメチルピリジニウム単離した。次にこのものの化学構造を決定するためにＭＳスペクトル及びＮＭＲスペクトルを測定した。
【００３３】
ＭＳスペクトルデータ
ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ ｍ／ｚ：２９７（［Ｍ］^＋）
ＦＡＢ−ＭＳ ｍ／ｚ：２９７（［Ｍ］^＋）
ＨＲ−ＦＡＢ−ＭＳ ｍ／ｚ（［Ｍ］^＋）：計算値Ｃ_１４Ｈ_２１Ｎ_２Ｏ_５：２９７．１４５０ 実測値：２９７．１４２５
ＭＳスペクトルデータよりこのものの分子量は２９７であり、分子式はＣ_１４Ｈ_２１Ｎ_２Ｏ_５であることがわかった。
【００３４】
ＮＭＲスペクトルデータ
^１Ｈ−ＮＭＲスペクトルデータ
^１Ｈ−ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，Ｄ_２Ｏ）δ１．４０ （ｍ，２Ｈ，−ＣＨ_２−），１．９０（，ｍ，２Ｈ，−ＣＨ_２），２．００（，ｍ，２Ｈ，−ＣＨ_２−），２．１０（ｓ，３Ｈ，ＣＨ_３ＣＯ−），４．２０（ｍ，２Ｈ，−Ｎ−ＣＨ_２−），４．５０（ｍ，１Ｈ，−ＣＨ−），７．９４（ｓ，１Ｈ，＝ＣＨ−），８．３４（ｓ，１Ｈ，＝ＣＨ−），８．３８（ｓ，１Ｈ，＝ＣＨ−）．
【００３５】
^１３Ｃ−ＮＭＲスペクトルデータ
^１３Ｃ−ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，Ｄ_２Ｏ）δ２１．７（ＣＨ_３），２１．７（ＣＨ_２），２９．９（ＣＨ_２），３０．１（ＣＨ_２），５３．０（ＣＨ），６０．０（ＣＨ_２），６２．０（ＣＨ_２），１２９．５（ＣＨ），１３１．６（ＣＨ），１３４．０（ＣＨ），１４３．３（Ｃ），１５６．７（Ｃ），１７４．０（Ｃ），１７７．０（Ｃ）
^１Ｈ−ＮＭＲスペクトルデータ、^１３Ｃ−ＮＭＲスペクトルデータより全水素及び炭素の帰属を決定した。また、ＤＥＰＴスペクトル、^１Ｈ−^１ＨＣＯＳＹ、^１Ｈ−^１３ＣＣＯＳＹスペクトルを測定・解析することにより帰属の妥当性を評価した。
【００３６】
【実施例】
次に、本発明を実施例により詳細に説明するが、本発明はそれらの例によってなんら限定されるものではない。
（実施例１）
ヒト白血病細胞ＨＬ−６０に対するＧＬＡＰ類縁化合物の細胞毒性と細胞増殖抑制活性についての実験方法及び結果を以下に示す。
ＨＬ−６０細胞を５００００ｃｅｌｌｓ／ｍｌの濃度になるようにＤＭＥＭ／Ｆ−１２培地で調整し、培養用２４孔プラスチックプレートに１ｍｌずつ分注した。２４時間培養した後、ＧＬＡＰ（１００μｇ／ｍｌ）を添加した。さらに２４時間または９６時間培養し、トリパンブルー色素排除法を用いて生細胞数を計測した。なお、ＧＬＡＰを添加していないものを対照とした。
結果を図２に示す。ＧＬＡＰを添加したプレートの細胞数は対照群に比較して有意に細胞数が少なく、ＧＬＡＰの添加によってＨＬ−６０細胞の増殖が抑制されていることがわかった。
【００３７】
【発明の効果】
本発明におけるＧＬＡＰ化合物は濃度依存的な細胞毒性作用を示すことから、骨髄性白血病等の血液がん及び固形がんのがん細胞増殖を抑制するのに用いることができる。本発明におけるＧＬＡＰ化合物は糖尿病合併症、アルツハイマー病、動脈硬化症等の細胞障害性疾患の進行度合を正確に把握するための臨床検査の判断指標として用いることができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】ＧＬＡＰを単離する際のＨＰＬＣチャートを示す。横軸は保持時間を表し、単位は分である。縦軸は２１５ｎｍにおける吸光度を表す。
【図２】ヒト白血病細胞ＨＬ−６０に対するＧＬＡＰの細胞増殖抑制活性を示したグラフである。[0001]
TECHNICAL FIELD OF THE INVENTION
The present invention relates to a pharmaceutical composition using a pyridinium compound and a clinical test method.
[0002]
[Prior art]
The non-enzymatic reaction of an amino compound such as a protein or amino acid with a reducing sugar is generally called a Maillard reaction, and is known to be widely involved in coloring of food, generation and deterioration of aroma components, etc. 1). In recent years, it has been gradually revealed that the Maillard reaction progresses in vivo, many proteins are saccharified, and are strongly related to lifestyle-related diseases such as diabetes and the causes of aging (Non-Patent Document 2). reference).
[0003]
The Maillard reaction is roughly explained by the following two-stage reaction. That is, the formyl group of the reducing sugar reacts with the N-terminal amino group of the protein or the ε-amino group of lysine to form a Schiff base, and then the first reaction in which an Amadori rearrangement product is generated via 1,2-enaminol, Thereafter, through a complex reaction such as oxidation, dehydration, and condensation, the Maillard reaction gradually becomes brownish, fluorescent, forms intra- and intermolecular cross-links, and is recognized as a ligand by the AGE receptor of macrophages and the like. It can be divided into late reactions that change to advanced glycation end products (AGE).
[0004]
AGE is a general term for a structure in which the intermediate of the Maillard reaction is irreversibly generated through a complex reaction such as oxidation and dehydration, and carboxymethyl lysine, pyralin, pentosidine, crosulin, imidazolone, etc. are known. It is said that many in vivo AGEs have not yet been identified. AGE has been implicated in many cytotoxic diseases such as diabetic complications, Alzheimer's disease, and arteriosclerosis, and is expected to be applied to diagnosis and treatment, but there is no such application at present. . In addition, most of the research examples on the in vivo Maillard reaction use a reducing sugar as a reactant, and there are few research examples using other reactants.
[0005]
In recent years, since lesions of diabetic complications and Alzheimer's disease are stained with anti-glyceraldehyde-modified protein antibodies, it is speculated that the product of the in vivo Maillard reaction by glyceraldehyde is deeply involved in the disease. I have. If the product of the in vivo Maillard reaction of glyceraldehyde can be quantified, it is considered to be an index for estimating the progression of diabetic complications and Alzheimer's disease. Has never been isolated and identified.
[0006]
[Non-patent document 1]
Hayase, Fumitaka, Chemistry and Biology, 31 (9), 592 (1993)
[Non-patent document 2]
Ryuji Nagai, Hiroyuki Sano, Masako Horiuchi, Chemistry and Biology, 36 (2), 83 (1998)
[0007]
[Problem to be solved]
The problem to be solved by the present invention is to synthesize a Maillard reaction product by glyceraldehyde, and to provide a pharmaceutical composition and a clinical test method using the same.
[0008]
[Means for Solving the Problems]
The above object has been achieved by the following means.
(1) Formula (I)
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(Wherein, R ¹ represents hydrogen, an amino acid residue, a peptide residue, or an optionally substituted alkyl group, R ² or R ³ each independently represents a hydroxyl group or an esterified group thereof, and X ⁻ Represents a monovalent anion.)
(2) a pharmaceutical composition comprising a compound represented by the formula (I) described in (1),
(3) a method for suppressing cancer cell growth using the pharmaceutical composition described in (2),
(4) A clinical test method using the compound described in (1) as an index.
[0009]
Hereinafter, the present invention will be described.
The present inventors have, as a result of various studies on the Maillard reaction of glyceraldehyde, glyceraldehyde and N ^alpha - were isolated and identified novel pyridinium compounds from the reaction product of acetyl-lysine. This pyridinium compound is 1- (5-acetylamino-5-carboxypentyl) -3-hydroxy-5-hydroxymethylpyridinium, and its chemical formula is shown below.
Embedded image

[0010]
This compound, N ^alpha of 1 molecule - has a chemical structure glyceraldehyde acetyl lysine and 2 molecules are thought to have formed by the reaction.
Hereinafter, the present compound is abbreviated as GLAP (GLycerAldehyde derived Pyridinium compound).
The present invention provides the use of the following GLAP compound (I).
Embedded image

(Wherein, R ¹ represents hydrogen, an amino acid residue, a peptide residue, or an optionally substituted alkyl group, R ² or R ³ each independently represents a hydroxyl group or an esterified group thereof, and X ⁻ Represents a monovalent anion.)
[0011]
For example, as a result of examining the physiological action of GLAP, it has been found that the GLAP exhibits HL-60 proliferation inhibitory activity on human myeloid leukemia cells, and based on this finding, a pharmaceutical composition containing the GLAP compound was completed.
[0012]
BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION
In the formula (I), R ¹ represents hydrogen, an amino acid residue, a peptide residue, or an optionally substituted alkyl group. The residue means a group obtained by removing one hydrogen from an amino acid or a peptide. The amino acid is an amino acid that can be obtained as a compound, and is preferably a natural amino acid or an ester thereof, and examples thereof include lysine and ^Nα -acetyl lysine. The peptide has 1 to 20 amino acid residues, preferably 1 to 10 residues, and glycyrrhizine can be exemplified. The alkyl group which may be substituted has 1 to 20 carbon atoms (C), preferably C1 to 10, and examples thereof include a methyl group, an ethyl group, and an isopropyl group.
R ^{2 and} R ³ each independently represent a hydroxyl group or an ester thereof. The ester is a C1-20 ester, preferably C1-6, and examples thereof include an acetic ester.
[0013]
In the formula (I) of the present invention, a more preferable combination of substituents is a compound represented by the following formula (II).
Embedded image

(Wherein, R ¹ represents hydrogen or an acyl group, R ² represents OH, an alkoxy group or an amino group, R ³ represents a hydrogen or a lower alkyl group, R ⁴ represents a hydrogen or a lower alkyl group, X ^- represents a monovalent anion that is pharmaceutically acceptable, n represents an integer of 1 or more).
In formula (II), the acyl group represented by R ¹ is C1-20, preferably C2-8, and examples include an acetyl group, an ethylcarbonyl group, a propylcarbonyl group, and a benzoyl group.
Alkoxy group represented by R ² is a C1-20, C1-8 is preferable, a methoxy group, an ethoxy group and a propoxy group, a phenoxy group can be exemplified. The amino group represented by R ² may be a free amino group or a monosubstituted amino group, and examples thereof include a methylamino group and an anilino group.
The lower alkyl group represented by R ³ or R ⁴ is C 1-6 and includes, for example, a methyl group, an ethyl group, a propyl group, an isopropyl group, a butyl group and an isobutyl group.
X ⁻ is a pharmacologically acceptable monovalent anion. Any monovalent anion that can exist in a living body may be used, and examples thereof include chloride ions and bromide ions.
[0014]
In formula (II), the most preferred combination of substituents and anions is that R ¹ is an acetyl group, R ² is a hydroxy group, R ³ and R ⁴ are hydrogen, n is 4, X ^- is a chlorine ion.
Although a series of GLAP compounds have an asymmetric carbon, the present invention also includes each optically pure enantiomer and a mixture thereof.
[0015]
Specific examples of the compound represented by the formula (II) are shown below.
(1) 1- (5-acetylamino-5-carboxypentyl) -3-hydroxy-5-hydroxymethylpyridinium chloride (2) 1- (5-amino-5-carboxypentyl) -3-hydroxy-5-hydroxy Methylpyridinium chloride (3) 1- (5-acetylamino-5-carboxypentyl) -3-methoxy-5-hydroxymethylpyridinium chloride (4) 1- (5-amino-5-carboxypentyl) -3-methoxy- 5-hydroxymethylpyridinium chloride (5) 1- (5-acetylamino-5-carboxypropyl) -3-hydroxy-5-hydroxymethylpyridinium chloride (6) 1- (5-amino-5-carboxypropyl) -3 -Hydroxy-5-hydroxymethylpyridinium chloride (7) 1- 5-acetylamino-5-carboxypropyl) -3-methoxy-5-hydroxymethyl-pyridinium chloride (8) 1- (5-amino-5-carboxypropyl) -3-methoxy-5-hydroxymethyl-pyridinium chloride [0016]
Next, the synthesis of the compound represented by the formula (II), which is a preferred embodiment of the formula (I) in the present invention, will be described.
[0017]
The compound of the formula (II) of the present invention is prepared by dissolving glyceraldehyde and a suitable amino acid in a sodium phosphate buffer (pH 7.4) at 25 ° C to 60 ° C, most preferably at 37 ° C. It can be synthesized by incubating for 1 to 14 days, most preferably 7 days. After the reaction mixture is passed through a cellulose acetate membrane filter to remove insolubles, it can be easily purified by reverse phase HPLC equilibrated with a water-acetonitrile system. The chemical structure of the thus-isolated compound represented by the formula (II) of the present invention can be determined by a mass spectrometry spectrum, a nuclear magnetic resonance spectrum or the like according to a conventional method.
[0018]
Further, the compound represented by the formula (II) of the present invention can also be produced by an organic synthetic method according to the following reaction formula.
(Reaction formula A)
Embedded image

(In the formula, R ¹ , R ² , R ³ , R ⁴ , X ⁻ and n have the same meanings as in the above formula (II).)
That is, the compound (II) is obtained by reacting the amino acid derivative (III) with the pyridine derivative (IV) under heating.
For example, by using 2-acetylamino-6-chlorohexanoic acid as the amino acid derivative (III) and using 3-hydroxy-5-hydroxymethylpyridine as the pyridine derivative (IV), 1- (5-acetylamino-5 -Carboxypentyl) -3-hydroxy-5-hydroxymethylpyridinium chloride (compound (1)) is obtained.
The amino acid derivative (III) used as a starting material can be produced, for example, by a known method using a known amino acid as a starting material.
[0019]
(Reaction formula B)
Embedded image

(In the formula, R ¹ , R ² , X ⁻ and n have the same meaning as in the above formula (II).)
That is, amino acid (V) and R ² H are condensed in the presence of thionyl chloride to obtain (VI). The amino acid derivative (III) can be obtained by condensing (VI) with R ¹ H in the presence of DCC (dicyclohexylcarbodiimide) to obtain (VII), and then halogenating the terminal hydroxyl group.
For example, when 6-hydroxynorleucine is used as the amino acid (V), 2-acetylamino-6-chlorohexanoic acid, which is a raw material of the compound (1), can be obtained.
The pyridine derivative (IV) can be produced, for example, by using the known methyl 5-hydroxynicotinate as a starting material by the following method.
[0020]
(Reaction formula C)
Embedded image

(Wherein, R ³ and R ⁴ have the same meanings as in the above formula (II).)
That is, the phenolic hydroxyl group of methyl 5-hydroxynicotinate is alkylated to give (VIII). The pyridine derivative (IV) can be obtained by reducing the ester moiety of (VIII) with lithium aluminum hydride to obtain (IX) and then alkylating the hydroxyl group.
For example, by reducing methyl 5-hydroxynicotinate with lithium aluminum hydride, 3-hydroxy-5-hydroxymethylpyridine, which is a raw material of compound (1), can be obtained.
[0021]
Hereinafter, the production of 1- (5-acetylamino-5-carboxypentyl) -3-hydroxy-5-hydroxymethylpyridinium chloride (compound (1)) will be described.
(Reaction formula A1)
Embedded image

By reacting 2-acetylamino-6-chlorohexanoic acid (III) and 3-hydroxy-5-hydroxymethylpyridine (IV) under heating, 1- (5-acetylamino-5-carboxypentyl) -3- is obtained. Hydroxy-5-hydroxymethylpyridinium chloride (compound (1)) is obtained.
[0022]
2-acetylamino-6-chlorohexanoic acid (III) as a raw material can be produced by the following method.
(Reaction formula B1)
Embedded image

That is, the compound (VII) is obtained by condensing 6-hydroxynorleucine and acetic acid in the presence of DCC. By chlorinating the hydroxyl group of compound (VII) with carbon tetrachloride and triphenylphosphine, 2-acetylamino-6-chlorohexanoic acid (III) is obtained.
[0023]
The pyridine derivative 3-hydroxy-5-hydroxymethylpyridine (IV) as a raw material can be produced by the following method.
(Reaction formula C1)
Embedded image

That is, 3-hydroxy-5-hydroxymethylpyridine (IV) is obtained by reducing methyl 5-hydroxynicotinate with lithium aluminum hydride.
[0024]
Since the compound represented by the formula (I) of the present invention is a fluorescent substance (excitation: 298 nm, fluorescence: 388 nm), it can be easily detected and quantified by measuring a fluorescence absorption spectrum. Further, due to having an ultraviolet absorption maximum near 290 nm, measurement of a LC-MS spectrum and HPLC analysis can also be an auxiliary means for detection and quantification.
[0025]
The compound represented by the formula (I) of the present invention can be formulated and used as a pharmaceutical composition.
[0026]
The preparation is not limited to a specific one, but can be selected from the preparations prescribed in the Japanese Pharmacopoeia that suit the treatment policy, and examples include tablets, injections, and granules (Mitsuo Watanabe, Japan Pharmacopoeia Manual, Nanzando (1998)).
[0027]
Additives can be added to ensure quality and quality standards during storage of the formulation or to enhance its usefulness. Examples of the additive include an excipient, a binder, a disintegrant and the like (edited by the Japan Pharmaceutical Excipients Association, Dictionary of Pharmaceutical Excipients, Yakuji Nipposha (1994)).
[0028]
The GLAP compound of the present invention can be administered parenterally as a cancer cell growth inhibitor. The dose depends on the degree of the disease to be treated and is usually selected within the range of 0.01 to 10 mg / Kg per day. Since this compound exhibits a cell growth inhibitory action due to cytotoxicity, a sufficient effect can be obtained by administering a smaller amount than other cell growth inhibitors. It is formulated as an aqueous solution having a concentration of 0.1 to 10%, and may be used as an injection, such as a solubilizer, a buffer, an isotonic agent, a stabilizer, a preservative, or a soothing agent, if desired. Conventional additives can be used in combination. Further, if necessary, it can be used in combination with other antineoplastic agents.
[0029]
The GLAP compound of the present invention can be used as an index for diagnosing diabetic complications, Alzheimer's disease, and arteriosclerosis. By collecting blood, urine or diseased tissue of patients with these diseases and quantifying the amount of the GLAP compound, the progress of the disease can be accurately determined, and the doctor can perform an accurate treatment according to the progress of the disease. It is possible to In addition, by preparing an anti-GLAP antibody, the amount of the GLAP compound can be quantified using an immunological technique.
[0030]
Taking advantage of the fact that the GLAP compound of the present invention is a cancer cell growth inhibitor, the sensitivity or sensitivity of the cancer to the stage or level of the severity of the cancer and drugs, radiation, or some other forms of treatment Can be used as a diagnostic evaluation or kit to determine Tissue culture of cells from the patient. The GLAP compound of the invention is added to the cell culture and control cultures (positive and / or negative control cells), which can be cell lines, primary cells or non-neoplastic cells from the same or different patients. The compound-treated and control cultures are incubated for a period of time, preferably one day, more preferably 1 to 6 hours, and most preferably less than 1 hour. Cultures are tested after an incubation period to determine cell division, cell proliferation, DNA replication, DNA, RNA, or protein synthesis, or expression of cytokines, cytokine receptors, other cell surface molecules or other antigens. The greater the effect on activity compared to the control, the greater the likelihood that the particular form of cancer being tested will require treatment. Such an assessment is widely useful as a diagnostic tool in determining the best course of treatment for a particular patient and as a screening tool for new compounds for possible therapeutic or prophylactic uses. obtain. A chart or table of the severity of cancer versus the effectiveness of chemotherapy can be made. In this way, it is possible to select a therapeutic agent with high efficacy and low risk.
[0031]
Further, the GLAP compound of the present invention is a research tool for elucidating the mechanism at the molecular level of the production of cytokines such as tumor destruction factor (TNF) and interleukin 1 (IL-1), for which involvement of the in vivo Maillard reaction is predicted in recent years. It can be used as In addition, it can be used as a research tool for discovering a novel AGE receptor and cloning the cDNA thereof, and thus can be applied to the study of a therapeutic drug whose onset mechanism is still unknown and has no specific drug.
[0032]
(Synthesis example 1)
The synthesis, isolation and structure determination of 1- (5-acetylamino-5-carboxypentyl) -3-hydroxy-5-hydroxymethylpyridinium were performed.
The glyceraldehyde (200 mM) and N ^{alpha-L-acetyl-lysine} (100 mM) was dissolved in 0.2M sodium phosphate buffer (pH 7.4), and incubated for 1 week at 37 ° C.. After the reaction mixture was passed through a cellulose acetate membrane filter (0.20 μm), reverse phase HPLC (column: Pegasil-ODS, eluent: sodium phosphate buffer (pH 7.0) -acetonitrile system, flow rate: 4 ml / min, (Measurement wavelength: 215 nm). The HPLC chart at this time is shown in FIG. The fraction having a retention time of about 20 minutes was separated to isolate 1- (5-acetylamino-5-carboxypentyl) -3-hydroxy-5-hydroxymethylpyridinium. Next, an MS spectrum and an NMR spectrum were measured to determine the chemical structure of the product.
[0033]
MS spectrum data MALDI-TOF-MS m / z: 297 ([M] ⁺ )
FAB-MS m / z: 297 ([M] ⁺ )
HR-FAB-MS m / z ([M] ⁺ ): Calculated C ₁₄ H ₂₁ N ₂ O ₅ : 297.1450 Found: 297.1425
From the MS spectrum data, the molecular weight was found to be 297, and the molecular formula was C ₁₄ H ₂₁ N ₂ O ₅ .
[0034]
NMR spectrum data
¹ H-NMR spectrum data
¹ H-NMR (500 MHz, D ₂ O) δ 1.40 (m, 2H, —CH ₂ —), 1.90 (, m, 2H, —CH ₂ ), 2.00 (, m, 2H, —CH) _{2 -), 2.10 (s,} 3H, CH 3 CO -), 4.20 (m, 2H, -N-CH 2 -), 4.50 (m, 1H, -CH -), 7.94 (S, 1H, = CH-), 8.34 (s, 1H, = CH-), 8.38 (s, 1H, = CH-).
[0035]
¹³ C-NMR spectrum data
¹³ C-NMR (500 MHz, D ₂ O) δ 21.7 (CH ₃ ), 21.7 (CH ₂ ), 29.9 (CH ₂ ), 30.1 (CH ₂ ), 53.0 (CH), _{60.0 (CH 2), 62.0 (} CH 2), 129.5 (CH), 131.6 (CH), 134.0 (CH), 143.3 (C), 156.7 (C) , 174.0 (C), 177.0 (C)
Assignment of all hydrogen and carbon was determined from ¹ H-NMR spectrum data and ¹³ C-NMR spectrum data. In addition, the validity of the assignment was evaluated by measuring and analyzing the DEPT spectrum, ¹ H- ¹ HCOSY, and ¹ H- ¹³ CCOSY spectrum.
[0036]
【Example】
Next, the present invention will be described in detail with reference to examples, but the present invention is not limited to these examples.
(Example 1)
Experimental methods and results on cytotoxicity and cytostatic activity of GLAP analogs on human leukemia cells HL-60 are shown below.
HL-60 cells were adjusted to a concentration of 50,000 cells / ml with a DMEM / F-12 medium, and 1 ml each was dispensed to a 24-well plastic plate for culture. After culturing for 24 hours, GLAP (100 μg / ml) was added. After further culturing for 24 hours or 96 hours, the number of viable cells was counted using the trypan blue dye exclusion method. In addition, what did not add GLAP was made into the control.
FIG. 2 shows the results. The number of cells in the plate to which GLAP was added was significantly smaller than that in the control group, indicating that the addition of GLAP suppressed the growth of HL-60 cells.
[0037]
【The invention's effect】
Since the GLAP compound in the present invention exhibits a concentration-dependent cytotoxic effect, it can be used to suppress cancer cell growth of blood cancers such as myeloid leukemia and solid cancers. The GLAP compound in the present invention can be used as a judgment index of a clinical test for accurately grasping the progress of a cytotoxic disease such as diabetic complications, Alzheimer's disease, and arteriosclerosis.
[Brief description of the drawings]
FIG. 1 shows an HPLC chart when GLAP is isolated. The horizontal axis represents the retention time, and the unit is minutes. The vertical axis represents the absorbance at 215 nm.
FIG. 2 is a graph showing the cell growth inhibitory activity of GLAP on human leukemia cells HL-60.

Claims (4)

Formula (I)

(Wherein, R ¹ represents hydrogen, an amino acid residue, a peptide residue, or an optionally substituted alkyl group, R ² or R ³ each independently represents a hydroxyl group or an esterified group thereof, and X ⁻ Represents a monovalent anion.) A pharmaceutical composition comprising the compound represented by the formula (I) according to claim 1. A method for suppressing the growth of cancer cells using the pharmaceutical composition according to claim 2. A clinical test method using the compound represented by the formula (I) according to claim 1 as an index.

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