JP2004248676A - ヒトβディフェンシン2の検出方法 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】ヒトβディフェンシン2のmRNAに特異的なプライマーを使用することを特徴とする、リアルタイムRT−PCR法によるヒトβディフェンシン2mRNAの定量的検出方法。
【選択図】 図2
Description
これらカチオン性ペプチドには、大まかに区分された2つのファミリー:つまり線状ペプチド(例えば、セクロピン類(cecropins)) 及びシステインに富むペプチドがある。後者には、哺乳動物ディフェンシン、気管抗微生物性ペプチド及びウシバクテネシン類(bovine
bactenecines)等が含まれる。ヒトの抗菌ペプチドとしては、ディフェンシンとよばれる物質が存在し、好中球や小腸粘膜のPaneth細胞の他に体内の様々な組織で、恒常的に又は発達段階に一過性に発現されていることが知られている。
ディフェンシンは好中球のアズール顆粒の主要構成成分であり、これまでにHNP-1 、-2、-3及び-4と呼ばれる4種類のディフェンシンが単離されその構造も明らかにされている。かかるディフェンシンは29〜34個のアミノ酸から成る塩基性ペプチドであり、6個のシステインと1個のグリシンが共通して保存されている遺伝子ファミリー(hBD-1)
を構成している。
又、ヒトPaneth細胞で発現しているディフェンシンファミリー遺伝子の存在も証明された。これらの消化器ディフェンシンはヒトディフェンシン5及び6と呼ばれ、その構造も決定された(特表平7−507213)。
以上のことから、ヒトディフェンシンは正常細胞叢の維持、及び外来細菌からの防御に貢献していることが示唆されている。
、第387巻、第861ページ、1997)。しかしながら、その発現調節機構は未だ明らかとなっていない。
ヒト抗菌ペプチドとしては、従来から知られている各種の物質を対象とすることができる。好適な例として、ヒトβディフェンシン2(hBD-2)を挙げることができる。
本発明の食品抽出物は、各種食品素材を、当業者には公知の如何なる抽出操作を施すことによっても調製することができる。例えば、無機酸、有機酸、塩類、糖質等を含む水又は熱水による抽出、アルコール類による抽出、或いは液化炭酸ガスによる抽出等を挙げることができる。又、該食品組成物は、固形、液体、ゾル、ゲル、粉末、及び顆粒等のあらゆる形態を採ることが可能である。
本発明の食品組成物を摂取することによって、消化器系統に於いてヒトディフェンシン等の抗菌ペプチドの発現が誘導又は増強されて、潜在的な微生物病原体を予防又は除去することが期待される。該食品組成物は,固形、液体、ゾル、ゲル、粉末、及び顆粒等のあらゆる形態を採ることが可能である。製造方法も当該技術分野で公知の如何なる方法も可能である。
本発明の食品組成物における上記因子又は食品抽出物の含有量は、配合目的及び食品組成物の種類・形態等に応じて当業者が適宜選ぶことができる。
本発明の医薬組成物は、かかる予防及び治療に有効な量の上記因子又は該因子を含有する食品抽出物の他に、当業者に公知の薬学的に許容し得る適当なキャリアを含むことができる。
本発明の医薬組成物は、広範な種類の微生物、例えばカビ及び細菌(グラム陽性及び陰性の両者)等に起因する感染症又は消化器系炎症等に有効である。
該医薬組成物中に配合される上記因子又は食品抽出物の量は、他の成分の性状、使用目的、患者の年齢・体重、及び要求される効果の程度等に応じて当業者が適宜選ぶことができる。
又、本発明の医薬組成物を錠剤、顆粒、粉末、ゲル、ゾル等の剤型とする場合には、当業者には公知の種々の賦形剤または他の添加物を使用することができる。更に、上記因子又は食品抽出物及び上記の各種添加物を薬学的に許容し得るリポソームで包摂した製剤形態とすることも可能である。
医薬組成物の形態及び投与対象の性状等に応じて、種々の様式で本発明の医薬組成物を投与することができる。例えば、経口、静脈内、皮下、筋肉内、腹膜内等、鼻咽頭等により施すことができる。
検出方法としては、当業者には公知の各種方法、例えば、定量RT−PCR法、リポータジーンアッセイ、抗菌試験、免疫測定法等を使用することができる。各検出方法における測定条件等は当業者が適宜、実験的に選択することができる。
更に、本発明は、qRThBD2fプライマー(5'-cttccaggtgtttttggtggta-3')及びqRThBD2rプライマー(5'-ggagccatatgtcatccagtc-3')を使用することを特徴とする、リアルタイムRT−PCR法によるヒトβディフェンシン2mRNAの定量的検出方法、特に、タックマン(TaqManTM)プローブとしてhBD2
probe(5'-aggcgatcctgttacctgccttaagag-3')を用いる該方法に係る。
又、本発明は、上記の検出方法を用いてヒトβディフェンシン2mRNAの発現量を測定することにより、食品素材抽出物の、ヒトβディフェンシン2の発現を誘導及び/又は増強する効果を検出する方法にも係る。
更に、焼酎もろみ等、従来は産業廃棄物として処理され、環境汚染の原因とされていた物質を、本発明によれば有用な素材として再利用することが出来る。
10φのディッシュでコンフルエントにまで培養したヒト表皮角化細胞(日水製薬(株))に、オートクレーブ滅菌した大腸菌のPBS懸濁液を大腸菌の終濃度が0、0.2、1、5、25ng/mlとなるように添加し、37℃、5%CO2 雰囲気下で培養した。約16時間後、培地を除きPBSで洗い、スクレパーによって細胞を回収した。回収した細胞からRNeasy(Qiagen 社)を用いて総RNAを抽出した。各総RNA溶液の濃度を、1μg/μlに調整した。抽出した各RNAを鋳型として、RT−PCR法によって目的のmRNAを増幅した。
r プライマー(5'-GGAGCCCTTTCTGAATCCGCA-3')を作製した。GAPDH(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase)
cDNAの配列(Accession No.M33197)を参考にして、GAPDH f プライマー(5'-ACCACAGTCCATGCCATCAC-3') とGAPDH
r プライマー(5'-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3') を作製し、内部標準として用いた。
RT−PCRの反応液はOneStep RNA PCR Kit(Takara酒造(株)製)を用いて、まず1チューブあたり以下の表1に示す組成になるようにマスターミックスを作製し、さらに各総RNAを表2に示す組成になるように混合し、25μlの系で反応を行った。
反応後、反応液10μlを2%アガロースゲル電気泳動により分析した。表3のように、大腸菌溶液の添加によって濃度依存的な傾向でβディフェンシン2mRNAの検出が可能であることがわかった。
大腸菌終濃度が1ng/ml以上の添加量では、βディフェンシン2のmRNAの発現が認められた(表3)。このことからディフェンシン最少誘導濃度を1ng/mlと決定した。限界検出感度として総RNAの量は1μg、増幅サイクル数は25サイクルとした。
各食品素材1gを精製水に懸濁し10mlとした後、オートクレーブ滅菌した。これらを遠心し、上清を食品素材抽出液(食品抽出物)とした。
実施例1の実験系を使い、大腸菌溶液の代わりに実施例2で調製した各食品素材抽出液を終濃度で0.1%となるように添加した。その結果、糠味噌濃縮液及び焼酎もろみを添加した場合に、大腸菌の場合と同様なβディフェンシン2mRNAの誘導効果が認められた。
実施例3で誘導効果が認められなかった食品素材抽出液を実施例1の実験系にさらに加え、大腸菌溶液と共存する状態でβディフェンシン2mRNAの発現を調べたところ、ローストアマランス、ロースト小麦胚芽、ハイチュウ用濃縮ヨーグルトエキス、甘酒について大腸菌溶液単独の場合よりも発現の増強が認められた。
以上の実施例3及び4で得られた結果を表4に示す。
これらの誘導因子はそれ自身で抗菌ペプチドの発現を調節する機能を持ち、一方、増強因子は大腸菌の感染によって抗菌ペプチドの発現のスイッチがオンになった後にそのシグナルをより強くする機能を持つと考えられる。
こうして確認された各種食品素材中の因子の抗菌ペプチドの誘導及び/又は増強効果を、以下の実施例で更に定量的に測定した。
6ウェルマルチプレート(ファルコン社製)でコンフルエントにまで培養したヒト表皮角化細胞(日水製薬(株)製)に、オートクレーブ滅菌した大腸菌のPBS懸濁液を大腸菌の終濃度が0, 0.07, 0.7, 7, 70, 700 ug/mlとなるように添加し、37℃、5%CO2雰囲気下で培養した。約16時間後、培地を除きPBSで洗った。RNeasy(Qiagen社)を用いて、回収した細胞から総RNAを抽出した。抽出した各RNAを鋳型として、定量的RT−PCR法によって目的のmRNAを増幅した。
定量RT−PCRの条件は、まずヒトβディフェンシン2のcDNAの配列 (Accession No.Z71389)をもとに、qRThBD2fプライマー(5'-cttccaggtgtttttggtggta-3')、qRThBD2rプライマー(5'-ggagccatatgtcatccagtc-3')、更に、ABI PRISM TaqManTMプローブとしてhBD2
probe(5'-aggcgatcctgttacctgccttaagag-3')を作製した。
GAPDH(glyceraldehyde-3-phosphate
dehydrogenase)遺伝子のmRNAをTaqManTMGAPDH Control Regents((株)パーキンエルマージャパン製)を用いて同時に測定し、鋳型のmRNA量の内部標準とした。
RT−PCRの反応液はTaqMan EZ RT-PCR Kit((株)パーキンエルマージャパン製)を用いて、まず1チューブあたり以下の表5に示す組成になるようにマスターミックスを作製した。さらに各総RNAを表6に示す組成になるように混合して、サンプルあたり25μlx3本の系で増幅反応をおこない、ABI
PRISM 7700 sequence detecter((株)パーキンエルマージャパン製)によるリアルタイム検出を行った。
RT-PCRは、逆転写反応を60℃
30 min、95℃ 5 min、PCR反応を、94℃ 20 sec、60℃ 1 minの条件で40〜 45サイクル行った。更に付属の解析ソフト(Sequence
Detector v1.6.3)上で閾値を設定し、発現量の計算をおこなった。PBSのみを加えたサンプルを100%として、相対発現量を求めた。
図1の様に、大腸菌溶液の添加によって濃度依存的にβディフェンシン2 mRNAの検出が可能であることがわかった。
大腸菌終濃度が7 ug/ml以上の添加量では、ディフェンシンのmRNAの発現の増加が認められた。(図1)このことからディフェンシン誘導濃度を7 ug/mlと設定した。
実施例5の実験系を使い、実施例2で調整した各食品素材抽出液を終濃度で0.1%となるように添加した。食材のみを加えた場合と大腸菌溶液と同時に加えた場合で比較した。その結果、焼酎もろみ及び甘酒を添加した場合に大腸菌の場合と同様なβディフェンシン2
mRNAの誘導効果が認められた。また、大腸菌溶液と共存する状態では、焼酎もろみ、ローストアマランス、甘酒について大腸菌溶液のみ、あるいは食品抽出液のみの場合よりも発現の増強効果が認められた。得られた結果を図2に示す。
Claims (2)
- qRThBD2fプライマー(5'-cttccaggtgtttttggtggta-3')、qRThBD2rプライマー(5'-ggagccatatgtcatccagtc-3')、及び、タックマン(TaqManTM)プローブとしてhBD2
probe(5'-aggcgatcctgttacctgccttaagag-3')を使用することを特徴とする、リアルタイムRT−PCR法によるヒトβディフェンシン2mRNAの定量的検出方法。 - 請求項1記載の検出方法を用いてヒトβディフェンシン2mRNAの発現量を測定することにより、食品素材抽出物の、ヒトβディフェンシン2の発現を誘導及び/又は増強する効果を検出する方法。
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