JP2004248503A - Carrier for immobilizing nucleic acid - Google Patents
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Abstract
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ＤＮＡチップ等の核酸が固定化された担体の作製に有用な、核酸固定化用担体に関する。また、本発明は、該担体への核酸の固定化方法、核酸が固定化された担体、及び当該担体を使用する被検体中の核酸の検出方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
ゲノム解析技術の進展により、各種生物ゲノムの構造が解明されつつある。これと並行して、ゲノムの機能解析のための技術開発がすすめられており、ＤＮＡチップ（ＤＮＡマイクロアレイ）はその中で最も注目されている技術である。ＤＮＡチップは、スライドガラス等の固相担体表面に多数の異なる遺伝子あるいはその断片（ＤＮＡ断片）を整列させて固定化したマイクロアレイであり、遺伝子の発現、変異、多型性等の解析を飛躍的に加速させる技術として、非常に有用である。
【０００３】
ＤＮＡの担体への固定化は、ＤＮＡチップを作製するための基本技術であり、大きく分けて２通りの方法が知られている。一つは、担体上に共有結合したリンカーの先端でＤＮＡを化学合成する方法で、例えば、サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）、第２５１巻、７６７―７７３頁（１９９１）およびヌクレイック・アシッズ・リサーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）、第２０巻、１６７９―１６８４（１９９２）に記載されている。この方法で固定化できるＤＮＡはオリゴヌクレオチドに限られており、また、反応を制御するための特殊な装置を必要とし、必ずしも一般的ではない。
【０００４】
もう一つの方法は、予め合成されたＤＮＡやＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ）で調製されたＤＮＡ（ＰＣＲ増幅産物）を担体に共有結合あるいは非共有結合させる方法で、例えば、サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）、第２７０巻、４６７―４７０頁（１９９５）およびヌクレイック・アシッズ・リサーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）、第２２巻、５４５６―５４６５（１９９４）に記載されている。
非共有結合による固定化方法としては、例えば、ＳＳＣ（塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム）等の塩溶液に溶解したＤＮＡをそのままあるいは変性処理した後、ポリリジンやポリエチレンイミン等の塩基性ポリ陽イオン、あるいはアミノ基を有する塩基性シランカップリング剤等でコートしたスライドガラス（担体）にスポットし、ＵＶ照射により固定化する方法が知られている。この方法によれば、どのようなＤＮＡも固定化することができるはずである。
しかしながら、この方法では、オリゴヌクレオチドや０．３ｋｂ以下の短鎖ＤＮＡは固定化されにくい。また、長鎖ＤＮＡを非共有結合で担体に固定化する場合においても、洗浄や標的核酸とのハイブリダイゼーションの工程で固定化したＤＮＡが剥離し易く、標的核酸の検出感度を低下させる要因となる。
さらには、担体表面に残存する塩基性官能基（陽イオン）と標的核酸との非特異的な結合により、バックグラウンドが高くなり易いという欠点がある。
【０００５】
一方、共有結合による固定化方法では、オリゴヌクレオチドを含むいずれのＤＮＡも固定化することができるが、一般的には、官能基としてアミノ基等の陽イオン基を有する担体を使用するので、前述の如くバックグラウンドが高くなり、検出感度が低下するという欠点があった。
残存するアミノ基をアセチル化等によりブロッキングする方法が知られているが、必ずしも十分な効果を発揮していない。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
核酸としては短鎖核酸、長鎖核酸、一本鎖核酸、二本鎖核酸、ＤＮＡ、ＲＮＡ等の種々の形態があり、各々の形状の核酸の固定化に適し、高感度で目的の核酸の検出に使用することができる核酸固定化担体の開発が求められている。
本発明の主な目的は、（１）高感度核酸固定化担体作製のための新規な核酸固定化用担体、（２）核酸を固定化した担体、（３）核酸を固定化した該担体の製造方法、（４）核酸を固定化した該担体を用いる核酸の検出方法、および（５）核酸の検出のための核酸を固定化した担体の洗浄方法を提供することにある。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、オリゴヌクレオチドを含む全ての核酸に適用でき、目的の核酸の高感度検出を可能にする核酸の固定化方法について研究した結果、ポリアニオン（ｐｏｌｙａｎｉｏｎ）で表面処理し、さらにアルカリ処理を施した担体に核酸を固定化することで、その目的を達成できることを見出し、本発明に到達した。
また、目的の核酸の検出において、より高感度な検出を可能とする核酸固定化担体の洗浄方法を開発し、本発明を完成させた。
【０００８】
本発明を概説すれば、本発明の第１の発明は核酸を固定化するための担体であって、担体の表面にポリアニオンを有し、ポリアニオンによるコーティングの後にアルカリ処理を行って作成されることを特徴とする核酸固定化用担体に関する。
本発明の第１の発明の好ましい態様においてポリアニオンはポリアクリル酸である。また、担体としては非多孔性担体が好適であり、当該非多孔性担体としては特にガラスが好適である。
【０００９】
本発明の第２の発明は核酸を固定化するための担体であって、第一の発明の担体の表面に存在するポリアニオンが活性エステル誘導体に活性化されてなる核酸固定化用担体に関する。
【００１０】
本発明の第３の発明は核酸が固定化された担体であって、核酸が第１または第２の発明の核酸固定化用担体上のあらかじめ定められた位置に固定化されてなる担体に関する。
本発明の第３の発明の好ましい態様において、ポリアニオンはポリアクリル酸である。また、担体としては非多孔性担体が好適であり、当該非多孔性担体としては特にガラスが好適である。
【００１１】
本発明の第４の発明は核酸の担体への固定化方法であって、ポリアニオンで表面処理し、次いでアルカリ処理を施した後に当該ポリアニオンを活性エステル誘導体とした担体を、核酸溶液と接触させる工程を有することを特徴とする核酸の担体への固定化方法に関する。
本発明の第４の発明の好ましい態様において、ポリアニオンはポリアクリル酸であり、担体は非多孔性担体であり、当該非多孔性担体としてはガラスが好適である。
本発明の第４の発明の好ましい態様において、核酸は活性化エステル誘導体と反応性を有する官能基で修飾された核酸であり、当該官能基としてはアミノ基が好適である。
本発明の第４の発明において、ブロッキング工程は必要に応じて行えばよい。
【００１２】
本発明の第５の発明は下記工程を包含することを特徴とする被検体中の核酸の検出方法に関する。
（ａ）本発明の第１の発明の核酸固定化用担体のポリアニオンを活性エステル誘導体とする工程、
（ｂ）上記活性エステル誘導体と、当該誘導体と反応性を有する官能基で修飾された核酸とを反応させる工程、
（ｃ）担体に固定化された核酸と、当該核酸に相補的な被検体中の核酸をハイブリダイズさせる工程、及び
（ｄ）ハイブリダイズした核酸を検出する工程。
本発明の第５の発明において、ブロッキング工程は必要に応じてを行えばよい。
【００１３】
本発明の第６の発明は下記工程を包含することを特徴とする被検体中の核酸の検出方法に関する。
（ａ）本発明の第２の発明の核酸固定化用担体の活性エステル誘導体と、当該誘導体と反応性を有する官能基で修飾された核酸とを反応させる工程、
（ｂ）担体に固定化された核酸と、当該核酸に相補的な被検体中の核酸をハイブリダイズさせる工程、及び
（ｄ）ハイブリダイズした核酸を検出する工程。
本発明において、ブロッキング工程は必要に応じて行えばよい。
【００１４】
本発明の第７の発明は下記工程を包含することを特徴とする被検体中の核酸の検出方法に関する。
（ａ）担体に固定化された核酸と、当該核酸に相補的な被検体中の核酸をハイブリダイズさせる工程、
（ｂ）工程（ａ）で得られた担体をテトラメチルアンモニウムクロライドを含有する洗浄液で洗浄する工程、及び
（ｄ）ハイブリダイズした核酸を検出する工程。
【００１５】
本発明においてポリアニオンとは酸性官能基を２以上有する化合物であり、核酸を結合させるために使用できるものであれば限定はない。
本発明において核酸とは核酸の検出に使用できるものであれば限定はなく、短鎖核酸、長鎖核酸、一本鎖核酸、二本鎖核酸、ＤＮＡ、ＲＮＡ等が例示される。
なお短鎖核酸とは核酸数２〜１００の核酸、長鎖核酸とは核酸数１００超の核酸と定義する。
【００１６】
【発明の実施の形態】
本発明における核酸を固定化する担体は、ＤＮＡチップやバイオセンサー等の担体として使用出来るものであれば特に限定はないが、好ましくは、非多孔性で、表面がなめらかな構造を有する材質、例えば、スライドガラス等のガラスが好適に使用出来る。
【００１７】
また、担体は、予め後述の陰イオン官能基を有する化合物を保持するような表面処理を行うが、これらの官能基は担体自体の表面特性として存在していても良い。また、シランカップリング剤等で処理した担体であっても、該表面処理に不都合が無い限り使用することが出来る。
【００１８】
担体の表面処理に使用するポリアニオンとしては、核酸との非特異的結合を妨げる効果のある、カルボキシル基、リン酸基、硫酸基等の酸性官能基を有するポリマー、例えば、ポリアクリル酸、ポリグルタミン酸、ポリアスパラギン酸、ポリリン酸等が好適に用いられる。
担体を表面処理するには、一般的なコーティング方法を用いることが出来、例えば担体をこれらのポリアニオンの溶液に浸せきした後、洗浄、乾燥すればよい。
【００１９】
上記の、ポリアニオンでコーティングされた担体は、次いでアルカリ処理に付される。該工程により、検出感度および／または核酸の判別能力に優れた核酸固定化物を作成するための核酸固定化用担体が得られる。
上記アルカリ処理に使用されるアルカリ溶液としては、特に限定するものではないが、アルカリ性水溶液が使用され、例えば、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム等の水溶液が例示される。上記のアルカリ水溶液は０．０５〜１Ｍの範囲の濃度で使用することができ、好適には０．１〜０．５Ｍの範囲で使用される。処理の方法にも特に限定はなく、例えば、ポリアニオンでコートされた担体を上記の溶液に浸せきした後、洗浄、乾燥することにより実施される。
これらの表面処理した担体にＤＮＡを固定化するためには、好ましくは、酸性官能基を常法により予め活性化しておく必要がある。例えば、カルボキシル基であればＮ−ヒドロキシサクシニミドエステル（ＮＨＳエステル）、リン酸基であればイミダゾールエステル等の活性化エステル誘導体として使用することができる。表面処理した担体は、さらに官能基を介してスぺーサーや架橋剤を付加してもよい。この場合、それらの核酸に結合する末端は活性化された酸性官能基を有するものとする。
【００２０】
固定化する核酸としては、特に限定はなく、合成オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチドまたはそれらの誘導体のいずれも使用することができる。これらの核酸は一本鎖、二本鎖のいずれであってもよい。該誘導体としては、担体表面への固定化を可能にする修飾であれば特に制限はないが、例えば、ＤＮＡの５’末端がアミノ基、チオール基、リン酸基、アルデヒド基等で修飾された誘導体を例示することができる。また、修飾した５’末端に架橋剤や、スぺーサーとしてのリンカー、例えばアルキルアミン等を付加した誘導体も使用することが出来る。本発明においては、５’末端の修飾はオリゴヌクレオチドのような短鎖ＤＮＡの固定化に特に有効である。
【００２１】
例えば前記ＤＮＡを、０．０１〜２．０ｍｇ／ｍｌ、好ましくは０．１〜１．０ｍｇ／ｍｌとなるように、固定化に好適な溶液、例えば、アミノ基で修飾されたＤＮＡであれば、２０ｍＭ ＭＯＰＳ（３―モルホリノプロパンスルホン酸）緩衝液（ｐＨ７．５）、あるいは５０ｍＭ炭酸緩衝液（ｐＨ９．５）に溶解し、そのままあるいは変性処理した後、表面処理して酸性官能基を活性化した前記担体と接触させることにより、所望のＤＮＡを担体に固定化することができる。すなわち、前記ＤＮＡ溶液をマイクロピペットやＤＮＡチップ作製装置（アレイヤー）等を用いて、前記表面処理して活性化された酸性官能基を有する担体上のあらかじめ定められた位置に一定量ずつスポットする。ついで、保湿器中に３０〜６０分保持した後、０．１〜０．２％ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）、蒸留水の順で洗浄する。さらに、必要とあればＤＮＡを固定化した担体を室温で０．３Ｎ ＮａＯＨに５分間、あるいは沸騰水中に２分間浸せきしてＤＮＡを変性させ、蒸留水、無水エタノールの順で洗浄、乾燥させる。この段階で担体表面の固定化反応（共有結合）に関与しなかった未反応の活性化された酸性官能基は、遊離の酸性基に加水分解される。これらの酸性基は、標的核酸と担体との非特異的な結合を妨げるので、一般的にはブロッキング操作が不要で、しかもハイブリダイゼーションにおけるバックグラウンドを低下させる効果がある。しかしながらバックグラウンドを更に低下させるためのブロッキング処理を行っても良い。
【００２２】
このようにして担体に固定化された核酸量、例えばＤＮＡ量は、蛍光標識したＤＮＡを用いて固定化操作を行い、残存する蛍光シグナルを蛍光スキャナー等で測定することにより求めることができる。本発明の固定化方法は、固定化効率が高く、固定化された核酸、例えばＤＮＡはハイブリダイゼーションの条件下で剥離することはないので、高性能ＤＮＡチップとして、遺伝子の発現、変異、多型性等の高感度測定に利用することが出来る。
【００２３】
本発明の核酸を固定化した担体（例えばＤＮＡチップ）による標的核酸の検出には、一般的なハイブリダイゼーション方法が用いられる。例えば、担体がスライドガラスであれば、蛍光標識した標的核酸を、アルカリ、または熱変性した後、ハイブリダイゼーション溶液に加え、その５〜２０μｌをアレイ表面に滴下し、その上に空気がはいらないようにカバーガラスをのせ、周囲をシールする。これを恒温恒湿器に入れ、適当な温度で適当な時間保持した後カバーガラスをはずし、スライドをストリンジェントな条件で洗浄し、水滴を除いてアレイ用蛍光スキャナー等で蛍光シグナルを検出する。
【００２４】
本発明により提供される核酸を固定化するための担体はポリアニオンの３次構造により、核酸の固定化量が多く、当該核酸はハイブリダイズ可能な形で担体に固定化されており、効率よく核酸を固定化した担体を製造することができる。また核酸が結合していない未反応のポリアニオンの活性エステル誘導体は加水分解によりポリアニオンになり、負荷電の核酸の非特異的吸着を阻止するため、本発明の核酸が固定化された担体は、極めてバックグランドの低い高感度核酸検出用担体として使用することができる。
【００２５】
さらに、本発明は担体に固定化された核酸より、これに非特異的にハイブリダイズした核酸を効果的に除去する方法を提供する。
本発明の洗浄方法は、テトラメチルアンモニウムクロライド（ＴＭＡＣ）を含有する洗浄液を使用することを特徴とする。洗浄液の組成には限定はなく、非特異的な核酸のハイブリダイゼーションを妨げうる濃度のＴＭＡＣが含有されていればよい。使用される核酸の鎖長やＧＣ含量にもよるが、通常、０．５〜４ＭのＴＭＡＣを含有するものが使用される。この他、ｐＨを適正な範囲に保つ緩衝成分やＥＤＴＡ等を含むものであってもよい。洗浄の条件にも特に限定はなく、通常、ハイブリダイゼーションに使用される条件が使用できる。例えば、室温〜６５℃で５分〜２４時間の処理が行われる。使用される核酸やその目的に応じて、所望の結果が得られるように洗浄液の組成、洗浄条件が設定されるのは当然のことである。
【００２６】
本発明の洗浄方法は、非多孔性の担体に固定化された核酸のハイブリダイゼーションやオリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーションにおいて特に有効である。本発明の洗浄方法により、非特異的なハイブリダイゼーションに起因するバックグラウンドが低減された、ＳＮ比の高い解析結果を得ることができる。
【００２７】
【実施例】
以下の実施例により、さらに詳細に本発明を説明するが、本発明は実施例の範囲に限定されるものではない。
【００２８】
実施例１
（１）顕微鏡用スライドガラスを、２Ｍ硝酸、２Ｍ水酸化ナトリウム、純水、およびアセトン中で、それぞれ１０分間ずつ超音波処理することにより洗浄した。終濃度４％となるように３−アミノプロピルトリエトキシシランを９５％エタノールに溶解し、先に洗浄したスライドガラスをこの溶液に２分間浸した後、１００℃のオーブンで１０分間処理することにより、スライドガラス表面をアミノプロピルシラン化した。次に、５ｍｇ／ｍｌとなるようにポリアクリル酸をジメチルホルムアミドに溶解し、さらに、４．０ｇ／１００ｍｌとなるように１−［３−（ジメチルアミノ）プロピル］―３―エチルカルボジイミド塩酸塩｛１−［（３−ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏ）ｐｒｏｐｙｌ］−３−ｅｔｈｙｌｃａｒｂｏｄｉｉｍｉｄｅ ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ｝（以下ＥＤＣと略す）を加えた。上記スライドガラスをこの溶液に一晩浸し、ジメチルホルムアミド、メタノール、純水、およびアセトンでリンス後、減圧下で乾燥した。このスライドグラスをアルカリ（−）グラスとして以下の実験に使用した。
【００２９】
（２）上記（１）と同様にＥＤＣ溶液に浸せきまでの処理を行ったスライドグラスをジメチルホルムアミド、メタノールでリンスした。このスライドグラスを０．３Ｍ水酸化ナトリウムに２分間浸し、純水、およびアセトンでリンス後、減圧下で乾燥した。このスライドグラスをアルカリ（＋）グラスとして以下の実験に使用した。
【００３０】
（３）１．８ｇのペンタフルオロフェノール、２．０ｇのＥＤＣ、および１３ｍｇのジメチルアミノピリジンを５０ｍｌのジメチルホルムアミドに溶解した。上記（１）、（２）で作製された２種のスライドグラスを、この溶液に浸し室温で５時間処理した後、ジメチルホルムアミドおよび塩化メチレンでリンス後、減圧下で乾燥し、デシケーター中で保存した。
【００３１】
実施例２
（１）５’末端にアルキレン鎖が６のアルキルアミノリンカー（ＰＥバイオシステムズ社製）を結合させた２４塩基もしくは２５塩基長の２０種のオリゴヌクレオチドプローブ、ＮＨ２−１１〜ＮＨ２−１５、ＮＨ２−２１〜ＮＨ２−２５、ＮＨ２−３１〜ＮＨ２−３５、ＮＨ２−４１〜ＮＨ２−４５をそれぞれＤＮＡ合成機を用いて合成した。これらのプローブの塩基配列をそれぞれ配列表の配列番号１〜２０に示す。
【００３２】
上記のプローブを２０ｍＭ ＭＯＰＳ緩衝液（ｐＨ７．５）に、１００μＭの濃度となるようにそれぞれ溶解し、実施例１記載のアルカリ（−）グラス、アルカリ（＋）グラスのそれぞれにスポット後、３７℃、湿度９０％の恒温恒湿器（アイラＫＣＬ１０００型）中に３０分間保持した。次いで室温の０．２％ＳＤＳに５分間浸潤させて余分な塩等を洗浄し、次いで蒸留水で十分洗浄した。
固定化処理後のスライドグラスは以下に示す操作でブロッキング処理に付した。すなわち、１．５ｇの無水コハク酸を８９．５ｍｌのＮ−メチル−２−ピロリドンに溶解後、９ｍｌの１Ｍほう酸緩衝液（ｐＨ８．０）を混和し、ブロッキング溶液を調製した。すぐさま、上記のスライドガラスをブロッキング溶液に浸し、室温で２０分間ブロッキング処理した。このように処理したスライドガラスを、蒸留水で十分洗浄した後、沸騰水浴中で３分間煮沸し、次いで氷浴上の冷エタノールにさらした。このスライドグラスを低速遠心分離に付してエタノールを除去後、風乾し、デシケーター中に保存した。
【００３３】
（２）標識オリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーション
配列番号２１に示した配列を有し、５’末端にＣｙ３を結合させたオリゴヌクレオチドであるＣｙ３−Ｐ１オリゴ、ならびに配列番号２２に示した配列を有し、５’末端にＣｙ３を結合させたオリゴヌクレオチドであるＣｙ３−Ｐ２オリゴをＤＮＡ合成機を用いて合成した。
【００３４】
実施例２−（１）で作製した２種のプローブ固定化スライドグラスに、Ｃｙ３−Ｐ１オリゴとＣｙ３−Ｐ２オリゴの混合液を添加してハイブリダイゼーションを行い、そのシグナルを観察した。すなわち、１μＭのＣｙ３−Ｐ１オリゴおよびＣｙ３−Ｐ２オリゴ、０．２％ＳＤＳ、および４×ＳＳＣからなるハイブリダイゼーション溶液約１０μｌを上記のプローブ固定化スライドグラスのプローブが固定されている領域にそれぞれ滴下し、泡が入らないようにカバーグラスで覆った後、保湿箱に入れて３７℃で２時間保温した。室温の５×ＳＳＣ中でカバーグラスを外し、４℃の５×ＳＳＣ中で３０分間の洗浄を２回行い、３Ｍ テトラメチルアンモニウムクロライド、５０ｍＭ トリス塩酸、２ｍＭ ＥＤＴＡ、および０．１％ ＳＤＳ（ｐＨ８．０）からなる洗浄液に５５℃で１６時間保温した。室温の２×ＳＳＣ中で５分間洗浄し、室温の０．２×ＳＳＣ中で５分間洗浄し、１，０００ｒｐｍ程度の低速遠心分離により水分を除去後、風乾した。ハイブリダイゼーション後のプローブ固定化スライドグラスをアフィメトリックス４１８アレイスキャナー（アフィメトリックス社製）を用いて、励起波長：５３２ｎｍ、測定波長：５７０ｎｍで測定し、得られたシグナルの強度を画像解析ソフトＩｍａＧｅｎｅを用いて解析した。その結果を表１にまとめて示した。
【００３５】
表１中、ＮＨ２−１１〜ＮＨ２−１５、ＮＨ２−２１〜ＮＨ２−２５、ＮＨ２−３１〜ＮＨ２−３５、ＮＨ２−４１〜ＮＨ２−４５の中でＣｙ３−Ｐ１オリゴと完全に相補性があるのは、それぞれＮＨ２−１１、ＮＨ２―２１、およびＮＨ２−３４で、またＣｙ３−Ｐ２オリゴと完全に相補性があるのは、ＮＨ２−４２であり、他のプローブはそれぞれ１塩基のミスマッチを持っている。また、表中のシグナル強度は上記の解析ソフトでのシグナル読み取り値を、シグナル比は上記ミスマッチを有するプローブでのシグナル読み取り値の平均値に対する、完全な相補性を有するプローブでのシグナル読み取り値の比をそれぞれ表している。
【００３６】
【表１】
表１から明らかなように、アルカリ（＋）グラスを用いた場合には、アルカリ（−）グラスに比べて全般的に高いシグナルを示した。また、完全に相補性があるプローブのシグナルと、他のプローブのシグナルとの差は、アルカリ（＋）グラスの方が大きい。このことから、１塩基置換の検出において、アルカリ処理を行ったポリアクリル酸コートスライドグラスの使用が有効であることが示された。
【００３８】
実施例３
（１）５’末端にアルキレン鎖が６のアルキルアミノリンカー（ＰＥバイオシステムズ社製）を結合させた２４塩基もしくは２５塩基長の４０種のオリゴヌクレオチドプローブ、ＮＨ−Ａ−１〜ＮＨ−Ａ−５、ＮＨ−Ｂ−１〜ＮＨ−Ｂ−５、ＮＨ−Ｃ−１〜ＮＨ−Ｃ−５、ＮＨ−Ｄ−１〜ＮＨ−Ｄ−５、ＮＨ−Ｅ−１〜ＮＨ−Ｅ−５、ＮＨ−Ｆ−１〜ＮＨ−Ｆ−５、ＮＨ−Ｇ−１〜ＮＨ−Ｇ−５、ＮＨ−Ｈ−１〜ＮＨ−Ｈ−５（以下、ＮＨ−ＦＸオリゴと称す）をそれぞれＤＮＡ合成機を用いて合成した。これらのプローブの塩基配列をそれぞれ配列表の配列番号２３〜６２に示す。これらのプローブをそれぞれ１ｍＭの濃度となるように５０ｍＭ 炭酸緩衝液（５０ｍＭ炭酸ナトリウム（ナカライテスク社製）および５０ｍＭ炭酸水素ナトリウム（ナカライテスク社製）の溶液を混合してｐＨ９．５に調製）に溶解した。さらに、配列番号６３に示した配列を有し、５’末端にＣｙ３を結合させたオリゴヌクレオチド（以下、Ｃｙ３−ＲＸオリゴと称す）をＤＮＡ合成機を用いて合成した。
【００３９】
（２）アミノアルキルシラン処理した市販スライドガラス（Ｓｉｌａｎｅ−Ｐｒｅｐ Ｓｌｉｄｅｓ、シグマ社製）を２．５％ グルタルアルデヒド水溶液に１時間浸積した後、蒸留水で３回洗浄し、風乾させた。ＮＨ−ＦＸオリゴをＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ４１７アレイヤー（アフィメトリックス社製）を用いて、このグルタルアルデヒド処理スライドにスポットした。スポット後のスライドガラスは、室温の０．２％ＳＤＳで２分間洗浄後、蒸留水で十分洗浄した。担体のアルデヒド基とＤＮＡのアミノ基との共有結合によるシッフ塩基を安定なアミンに還元するために、洗浄後のスライドをさらに０．２５％の水素化ホウ素ナトリウム（和光純薬社製）を含んだＰＢＳ―１００％エタノール混合（体積比３：１）溶液に５分間浸積する工程を行なった後、上記同様に洗浄乾燥した。
【００４０】
（３）作製したＤＮＡプローブ固定化スライドグラス２枚を、先に合成したＣｙ３−ＲＸオリゴをプローブとしてハイブリダイゼーションさせ、そのシグナルを観察した。すなわち、１μＭのＣｙ３−ＲＸオリゴ、４×ＳＳＣおよび０．２％ＳＤＳからなるハイブリダイゼーション溶液約５μｌをスライドグラス上のＤＮＡが固定されている領域にそれぞれ滴下し、泡が入らないようにカバーガラスで覆った後、保湿箱に入れ３７℃で２時間保温した。一方のＤＮＡプローブ固定化スライドグラスは室温の２×ＳＳＣ中でカバーガラスを外し、室温の２×ＳＳＣおよび０．２％ＳＤＡ中で５分間の洗浄を行った後、室温の０．２×ＳＳＣ中で５分間の洗浄を行い、１，０００ｒｐｍ程度の低速遠心分離により水分を除去後、風乾した（以下、ＴＭＡＣ処理（−）と称す。）。もう一方のスライドグラスは室温の２×ＳＳＣ中でカバーガラスを外し、氷温の５×ＳＳＣ中で３０分間の洗浄を２回行った後、５５℃のＴＭＡＣ洗浄液（３Ｍ テトラメチルアンモニウムクロライド（和光純薬株式会社製）、５０ｍＭ トリス塩酸（ｐＨ８．０、ナカライテスク社製）、０．１％ＳＤＳおよび２ｍＭ ＥＤＴＡ）中で１４時間の洗浄を行い、室温の２×ＳＳＣおよび０．２％ＳＤＳ中で５分間の洗浄を行った後、室温の０．２×ＳＳＣ中で５分間の洗浄を行い、１，０００ｒｐｍ程度の低速遠心分離により水分を除去後、風乾した（以下、ＴＭＡＣ処理（＋）と称す）。
【００４１】
（４）ハイブリダイゼーション後のＤＮＡプローブ固定化スライドグラス上のシグナルをＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ４１８アレイスキャナーを使用し、励起波長：５３２ｎｍ、測定波長：５７０ｎｍで測定した。得られたシグナルの強度を画像解析ソフトＩｍａＧｅｎｅを用いて解析した。その結果を表２及び表３に示した。
【００４２】
表２及び表３中、ＮＨ−Ａ群、ＮＨ−Ｂ群、ＮＨ−Ｃ群、ＮＨ−Ｄ群、ＮＨ−Ｅ群、ＮＨ−Ｆ群、ＮＨ−Ｇ群、ＮＨ−Ｈ群の中でＣｙ３−ＲＸオリゴと完全に相補性があるのは、それぞれＮＨ−Ａ−３、ＮＨ−Ｂ−４、ＮＨ−Ｃ−２、ＮＨ−Ｄ−４、ＮＨ−Ｅ−２、ＮＨ−Ｆ−３、ＮＨ−Ｇ−４およびＮＨ−Ｈ−２で、他のプローブはそれぞれ１塩基のミスマッチを持っている。また、表中、シグナル強度は上記の解析ソフトでのシグナル読み取り値を、シグナル比は上記ミスマッチを有するプローブでのシグナル読み取り値の平均値に対する、完全な相補性を有するプローブでのシグナル読み取り値の比をそれぞれ表している。
【００４３】
【表２】
【表３】
表２及び表３から明らかなように、ＴＭＡＣ洗浄液で洗浄を行った場合には、行わない場合に比べて全般的にシグナルが低くなるが、完全に相補性があるプローブのシグナルと、他のプローブのシグナルとの差は大きくなる。このことから、１塩基置換の検出において、ＴＭＡＣ洗浄液で洗浄を行った場合が有効であることが示された。
【００４６】
【発明の効果】
本発明によれば、ハイブリダイゼーションにおけるシグナル強度に優れたＤＮＡ固定化担体が提供される。当該ＤＮＡ固定化担体は、一塩基の差に基づくハイブリダイゼーションシグナルの差が明確となり、例えば、一塩基置換（ｓｉｎｇｌｅ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ、ＳＮＰ）の検出に有効である。
【００４７】
【配列表】
TECHNICAL FIELD OF THE INVENTION
The present invention relates to a carrier for immobilizing nucleic acids, which is useful for producing a carrier on which a nucleic acid such as a DNA chip is immobilized. The present invention also relates to a method for immobilizing a nucleic acid on the carrier, a carrier on which the nucleic acid is immobilized, and a method for detecting a nucleic acid in a subject using the carrier.
[0002]
[Prior art]
Advances in genome analysis technology are elucidating the structure of the genomes of various organisms. In parallel with this, technology development for functional analysis of genome is being promoted, and a DNA chip (DNA microarray) is the most noticeable technology among them. A DNA chip is a microarray in which a large number of different genes or their fragments (DNA fragments) are aligned and immobilized on the surface of a solid support such as a slide glass, and the analysis of gene expression, mutation, polymorphism, etc. is drastic. It is very useful as a technology to accelerate
[0003]
Immobilization of DNA on a carrier is a basic technique for producing a DNA chip, and roughly divided into two methods. One is a method of chemically synthesizing DNA at the tip of a linker covalently bonded to a carrier, for example, Science, Vol. 251, pp. 767-773 (1991) and Nucleic Acids Research. ), Vol. 20, 1679-1684 (1992). DNA that can be immobilized by this method is limited to oligonucleotides and requires a special device for controlling the reaction, which is not always common.
[0004]
The other method is a method of covalently or non-covalently binding DNA synthesized in advance or DNA (PCR amplification product) prepared by PCR (Polymerase Chain Reaction) to a carrier, for example, Science, 270th. Vol. 467-470 (1995) and Nucleic Acids Research, Vol. 22, 5456-5465 (1994).
Non-covalent immobilization methods include, for example, DNA dissolved in a salt solution such as SSC (sodium chloride / sodium citrate) as it is or after denaturation, and then a basic polycation such as polylysine or polyethyleneimine, or There is known a method of spotting on a slide glass (carrier) coated with a basic silane coupling agent having an amino group and immobilizing the same by UV irradiation. According to this method, any DNA should be able to be immobilized.
However, in this method, oligonucleotides and short-chain DNAs of 0.3 kb or less are not easily immobilized. In addition, even when long-chain DNA is immobilized on a carrier by non-covalent bonding, the DNA immobilized in the steps of washing and hybridization with the target nucleic acid is easily peeled off, which is a factor that lowers the detection sensitivity of the target nucleic acid. .
Further, there is a disadvantage that the background tends to increase due to non-specific binding between the basic functional group (cation) remaining on the carrier surface and the target nucleic acid.
[0005]
On the other hand, in the immobilization method using a covalent bond, any DNA including an oligonucleotide can be immobilized, but generally, a carrier having a cation group such as an amino group as a functional group is used. As described above, the background is high, and the detection sensitivity is low.
A method of blocking the remaining amino group by acetylation or the like is known, but does not necessarily exert a sufficient effect.
[0006]
[Problems to be solved by the invention]
There are various forms of nucleic acids, such as short-chain nucleic acids, long-chain nucleic acids, single-stranded nucleic acids, double-stranded nucleic acids, DNA, and RNA. There is a need for the development of a nucleic acid-immobilized carrier that can be used for detection.
The main objects of the present invention are (1) a novel carrier for immobilizing a nucleic acid for preparing a carrier for immobilizing a highly sensitive nucleic acid, (2) a carrier on which a nucleic acid is immobilized, and (3) a carrier for the nucleic acid. It is an object of the present invention to provide a production method, (4) a method for detecting a nucleic acid using the carrier on which the nucleic acid is immobilized, and (5) a method for washing the carrier on which the nucleic acid is immobilized for detecting the nucleic acid.
[0007]
[Means for Solving the Problems]
The present inventors have studied a nucleic acid immobilization method which can be applied to all nucleic acids including oligonucleotides and enables highly sensitive detection of a target nucleic acid. As a result, the surface treatment with a polyanion, and the alkali treatment are further performed. It has been found that the object can be achieved by immobilizing a nucleic acid on a carrier subjected to the above, and the present invention has been achieved.
In addition, a method for washing a nucleic acid-immobilized carrier that enables more sensitive detection in the detection of a target nucleic acid has been developed, and the present invention has been completed.
[0008]
In summary, the first invention of the present invention is a carrier for immobilizing nucleic acids, which has a polyanion on the surface of the carrier, and is prepared by performing an alkali treatment after coating with a polyanion. And a carrier for immobilizing nucleic acids.
In a preferred embodiment of the first invention of the present invention, the polyanion is polyacrylic acid. A non-porous carrier is suitable as the carrier, and glass is particularly suitable as the non-porous carrier.
[0009]
The second invention of the present invention relates to a carrier for immobilizing a nucleic acid, wherein the polyanion present on the surface of the carrier according to the first invention is activated by an active ester derivative.
[0010]
The third invention of the present invention relates to a carrier on which a nucleic acid is immobilized, wherein the nucleic acid is immobilized at a predetermined position on the nucleic acid immobilizing carrier of the first or second invention.
In a preferred embodiment of the third aspect of the invention, the polyanion is polyacrylic acid. A non-porous carrier is suitable as the carrier, and glass is particularly suitable as the non-porous carrier.
[0011]
The fourth invention of the present invention is a method for immobilizing a nucleic acid on a carrier, comprising a step of subjecting a carrier having the polyanion to an active ester derivative to a surface treatment with a polyanion, followed by an alkali treatment, and contacting the carrier with a nucleic acid solution. The present invention relates to a method for immobilizing a nucleic acid on a carrier, characterized by having the following.
In a preferred embodiment of the fourth invention of the present invention, the polyanion is polyacrylic acid, the carrier is a non-porous carrier, and glass is suitable as the non-porous carrier.
In a preferred embodiment of the fourth aspect of the present invention, the nucleic acid is a nucleic acid modified with a functional group reactive with the activated ester derivative, and the functional group is preferably an amino group.
In the fourth aspect of the present invention, the blocking step may be performed as needed.
[0012]
The fifth invention of the present invention relates to a method for detecting a nucleic acid in a specimen, which comprises the following steps.
(A) converting the polyanion of the carrier for immobilizing nucleic acids of the first invention of the present invention into an active ester derivative;
(B) reacting the active ester derivative with a nucleic acid modified with a functional group reactive with the derivative;
(C) a step of hybridizing the nucleic acid immobilized on the carrier and the nucleic acid in the subject complementary to the nucleic acid, and
(D) a step of detecting the hybridized nucleic acid.
In the fifth aspect of the present invention, the blocking step may be performed as needed.
[0013]
A sixth invention of the present invention relates to a method for detecting a nucleic acid in a specimen, which comprises the following steps.
(A) reacting the active ester derivative of the carrier for immobilizing nucleic acids of the second invention of the present invention with a nucleic acid modified with a functional group having reactivity with the derivative;
(B) a step of hybridizing the nucleic acid immobilized on the carrier and the nucleic acid in the subject complementary to the nucleic acid, and
(D) a step of detecting the hybridized nucleic acid.
In the present invention, the blocking step may be performed as needed.
[0014]
A seventh invention of the present invention relates to a method for detecting a nucleic acid in a subject, which comprises the following steps.
(A) a step of hybridizing a nucleic acid immobilized on a carrier with a nucleic acid in a subject complementary to the nucleic acid,
(B) washing the carrier obtained in step (a) with a washing solution containing tetramethylammonium chloride, and
(D) a step of detecting the hybridized nucleic acid.
[0015]
In the present invention, a polyanion is a compound having two or more acidic functional groups, and is not limited as long as it can be used for binding a nucleic acid.
In the present invention, the nucleic acid is not limited as long as it can be used for detecting a nucleic acid, and examples thereof include a short-chain nucleic acid, a long-chain nucleic acid, a single-stranded nucleic acid, a double-stranded nucleic acid, DNA, and RNA.
Note that a short-chain nucleic acid is defined as a nucleic acid having 2 to 100 nucleic acids, and a long-chain nucleic acid is defined as a nucleic acid having more than 100 nucleic acids.
[0016]
BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION
The carrier for immobilizing the nucleic acid in the present invention is not particularly limited as long as it can be used as a carrier for a DNA chip or a biosensor, but is preferably a non-porous material having a smooth surface structure, for example, And glass such as a slide glass can be suitably used.
[0017]
In addition, the carrier is subjected to a surface treatment for retaining a compound having an anionic functional group described later in advance, and these functional groups may be present as surface characteristics of the carrier itself. Further, a carrier treated with a silane coupling agent or the like can be used as long as there is no inconvenience in the surface treatment.
[0018]
Examples of the polyanion used for the surface treatment of the carrier include a polymer having an acidic functional group such as a carboxyl group, a phosphate group, or a sulfate group, which has an effect of preventing nonspecific binding to a nucleic acid, such as polyacrylic acid and polyglutamic acid. , Polyaspartic acid, polyphosphoric acid and the like are preferably used.
For the surface treatment of the carrier, a general coating method can be used. For example, the carrier may be immersed in a solution of these polyanions, then washed and dried.
[0019]
The carrier coated with the polyanion described above is then subjected to an alkali treatment. By this step, a carrier for immobilizing a nucleic acid for preparing an immobilized nucleic acid having excellent detection sensitivity and / or nucleic acid discriminating ability can be obtained.
The alkali solution used for the alkali treatment is not particularly limited, but an alkaline aqueous solution is used, and examples thereof include an aqueous solution of sodium hydroxide, potassium hydroxide and the like. The above alkaline aqueous solution can be used at a concentration in the range of 0.05 to 1M, and is preferably used in the range of 0.1 to 0.5M. The treatment method is not particularly limited. For example, the treatment is carried out by immersing the carrier coated with the polyanion in the above solution, followed by washing and drying.
In order to immobilize DNA on these surface-treated carriers, it is preferable to activate the acidic functional group in advance by a conventional method. For example, a carboxyl group can be used as an activated ester derivative such as an N-hydroxysuccinimide ester (NHS ester), and a phosphate group can be used as an activated ester derivative such as an imidazole ester. The surface-treated carrier may be further added with a spacer or a crosslinking agent via a functional group. In this case, the ends bound to those nucleic acids have an activated acidic functional group.
[0020]
The nucleic acid to be immobilized is not particularly limited, and any of synthetic oligonucleotides, polynucleotides and derivatives thereof can be used. These nucleic acids may be single-stranded or double-stranded. The derivative is not particularly limited as long as it is a modification that enables immobilization on the carrier surface. For example, the 5 ′ end of DNA is modified with an amino group, a thiol group, a phosphate group, an aldehyde group, or the like. Derivatives can be exemplified. In addition, a derivative in which a cross-linking agent or a linker as a spacer, for example, an alkylamine or the like is added to the modified 5 ′ end can also be used. In the present invention, modification at the 5 'end is particularly effective for immobilizing short-chain DNA such as an oligonucleotide.
[0021]
For example, a solution suitable for immobilization such that the DNA is 0.01 to 2.0 mg / ml, preferably 0.1 to 1.0 mg / ml, for example, a DNA modified with an amino group Activated by dissolving in 20 mM MOPS (3-morpholinopropanesulfonic acid) buffer (pH 7.5) or 50 mM carbonate buffer (pH 9.5) as it is or after denaturation, and then surface treatment to activate acidic functional groups The desired DNA can be immobilized on the carrier by contact with the carrier. That is, the DNA solution is spotted by a predetermined amount on a predetermined position on a carrier having an acidic functional group activated by the surface treatment using a micropipette, a DNA chip manufacturing apparatus (arrayer) or the like. Then, after keeping in a humidifier for 30 to 60 minutes, it is washed in order of 0.1-0.2% SDS (sodium dodecyl sulfate) and distilled water. If necessary, the carrier on which the DNA is immobilized is immersed in 0.3 N NaOH for 5 minutes or in boiling water for 2 minutes at room temperature to denature the DNA, and then washed and dried in the order of distilled water and absolute ethanol. At this stage, the unreacted activated acidic functional groups that did not participate in the immobilization reaction (covalent bond) on the carrier surface are hydrolyzed to free acidic groups. These acidic groups prevent non-specific binding between the target nucleic acid and the carrier, and therefore generally do not require a blocking operation and have the effect of reducing the background in hybridization. However, a blocking process for further reducing the background may be performed.
[0022]
The amount of nucleic acid, for example, DNA, immobilized on the carrier in this manner can be determined by performing an immobilization operation using fluorescently labeled DNA, and measuring the remaining fluorescent signal with a fluorescent scanner or the like. The immobilization method of the present invention has a high immobilization efficiency and does not exfoliate immobilized nucleic acids, for example, DNA, under hybridization conditions. It can be used for high-sensitivity measurement of properties.
[0023]
A general hybridization method is used for detecting a target nucleic acid using a carrier (eg, a DNA chip) on which the nucleic acid of the present invention is immobilized. For example, if the carrier is a slide glass, the fluorescence-labeled target nucleic acid is alkali- or heat-denatured, then added to the hybridization solution, and 5 to 20 μl of the nucleic acid is dropped on the array surface so that air does not enter. Put a cover glass on and seal around. This is placed in a thermo-hygrostat, kept at a suitable temperature for a suitable time, then the cover glass is removed, the slide is washed under stringent conditions, and water droplets are removed, and a fluorescent signal is detected by an array fluorescent scanner or the like.
[0024]
The carrier for immobilizing the nucleic acid provided by the present invention has a large amount of immobilized nucleic acid due to the tertiary structure of the polyanion, and the nucleic acid is immobilized on the carrier in a hybridizable form. Can be produced. In addition, the unreacted active ester derivative of the unreacted polyanion to which the nucleic acid is not bound is converted into a polyanion by hydrolysis, and non-specific adsorption of the negatively charged nucleic acid is prevented. It can be used as a carrier for high-sensitivity nucleic acid detection with a low background.
[0025]
Further, the present invention provides a method for effectively removing a nucleic acid non-specifically hybridized to a nucleic acid immobilized on a carrier.
The cleaning method of the present invention is characterized by using a cleaning solution containing tetramethylammonium chloride (TMAC). There is no limitation on the composition of the washing solution, as long as it contains TMAC at a concentration that can prevent nonspecific nucleic acid hybridization. Although it depends on the chain length and GC content of the nucleic acid to be used, usually, a nucleic acid containing 0.5 to 4 M of TMAC is used. In addition, it may contain a buffer component for maintaining the pH within an appropriate range, EDTA, or the like. The conditions for washing are not particularly limited, and conditions usually used for hybridization can be used. For example, the treatment is performed at room temperature to 65 ° C. for 5 minutes to 24 hours. It is natural that the composition of the washing solution and the washing conditions are set so as to obtain a desired result depending on the nucleic acid used and its purpose.
[0026]
The washing method of the present invention is particularly effective for hybridization of a nucleic acid immobilized on a nonporous carrier and hybridization with an oligonucleotide. By the washing method of the present invention, it is possible to obtain an analysis result with a high SN ratio, in which the background caused by non-specific hybridization is reduced.
[0027]
【Example】
The present invention will be described in more detail with reference to the following examples, but the present invention is not limited to the scope of the examples.
[0028]
Example 1
(1) The microscope slide glass was washed by ultrasonic treatment in 2 M nitric acid, 2 M sodium hydroxide, pure water, and acetone for 10 minutes each. 3-aminopropyltriethoxysilane was dissolved in 95% ethanol to a final concentration of 4%, and the previously washed slide glass was immersed in this solution for 2 minutes and then treated in an oven at 100 ° C for 10 minutes. Then, the surface of the slide glass was aminopropylsilanized. Next, polyacrylic acid is dissolved in dimethylformamide so as to have a concentration of 5 mg / ml, and 1- [3- (dimethylamino) propyl] -3-ethylcarbodiimide hydrochloride is further dissolved so as to have a concentration of 4.0 g / 100 ml. 1-[(3-dimethylamino) propyl] -3-ethylcarbodiimide hydrochloride (hereinafter abbreviated as EDC) was added. The slide glass was immersed in this solution overnight, rinsed with dimethylformamide, methanol, pure water, and acetone, and then dried under reduced pressure. This slide glass was used as an alkali (-) glass in the following experiments.
[0029]
(2) The slide glass, which had been treated until immersion in the EDC solution in the same manner as (1), was rinsed with dimethylformamide and methanol. The slide glass was immersed in 0.3 M sodium hydroxide for 2 minutes, rinsed with pure water and acetone, and dried under reduced pressure. This slide glass was used as an alkali (+) glass in the following experiments.
[0030]
(3) 1.8 g of pentafluorophenol, 2.0 g of EDC, and 13 mg of dimethylaminopyridine were dissolved in 50 ml of dimethylformamide. The two kinds of slide glasses prepared in the above (1) and (2) are immersed in this solution, treated at room temperature for 5 hours, rinsed with dimethylformamide and methylene chloride, dried under reduced pressure, and stored in a desiccator. did.
[0031]
Example 2
(1) 20 kinds of oligonucleotide probes having a length of 24 or 25 bases to which an alkylamino linker having an alkylene chain of 6 (manufactured by PE Biosystems) is bonded to the 5 'end, NH2-11 to NH2-15, NH2- 21 to NH2-25, NH2-31 to NH2-35, and NH2-41 to NH2-45 were each synthesized using a DNA synthesizer. The nucleotide sequences of these probes are shown in SEQ ID NOs: 1 to 20 in the sequence listing, respectively.
[0032]
The above probe was dissolved in a 20 mM MOPS buffer (pH 7.5) so as to have a concentration of 100 μM, and spotted on each of the alkali (−) glass and the alkali (+) glass described in Example 1; And kept in a thermo-hygrostat (Ira KCL1000) of 90% humidity for 30 minutes. Then, it was immersed in 0.2% SDS at room temperature for 5 minutes to wash excess salts and the like, and then sufficiently washed with distilled water.
The slide glass after the immobilization treatment was subjected to a blocking treatment by the following operation. That is, after dissolving 1.5 g of succinic anhydride in 89.5 ml of N-methyl-2-pyrrolidone, 9 ml of 1M borate buffer (pH 8.0) was mixed to prepare a blocking solution. Immediately, the above slide glass was immersed in a blocking solution and subjected to a blocking treatment at room temperature for 20 minutes. The slide glass thus treated was thoroughly washed with distilled water, boiled in a boiling water bath for 3 minutes, and then exposed to cold ethanol on an ice bath. After the slide glass was subjected to low-speed centrifugation to remove ethanol, it was air-dried and stored in a desiccator.
[0033]
(2) Hybridization with labeled oligonucleotide
Cy3-P1 oligo, which is an oligonucleotide having the sequence shown in SEQ ID NO: 21 and having Cy3 bound at the 5 ′ end, and Cy3 having the sequence shown in SEQ ID NO: 22 having Cy3 bound at the 5 ′ end Cy3-P2 oligo which was an oligonucleotide was synthesized using a DNA synthesizer.
[0034]
A mixed solution of Cy3-P1 oligo and Cy3-P2 oligo was added to the two kinds of probe-immobilized slide glasses prepared in Example 2- (1), hybridization was performed, and the signals were observed. That is, about 10 μl of a hybridization solution consisting of 1 μM Cy3-P1 oligo and Cy3-P2 oligo, 0.2% SDS, and 4 × SSC was dropped on the probe-immobilized slide glass in the region where the probe was immobilized, respectively. Then, after covering with a cover glass to prevent bubbles from entering, the mixture was placed in a moist box and kept at 37 ° C. for 2 hours. The cover glass is removed in 5 × SSC at room temperature, washed twice in 5 × SSC at 4 ° C. for 30 minutes, and 3M tetramethylammonium chloride, 50 mM Tris-HCl, 2 mM EDTA, and 0.1% SDS (pH 8) 0.0) was kept at 55 ° C. for 16 hours. The plate was washed in 2 × SSC at room temperature for 5 minutes, washed in 0.2 × SSC at room temperature for 5 minutes, centrifuged at a low speed of about 1,000 rpm to remove water, and then air-dried. The probe-immobilized slide glass after hybridization is measured using an Affymetrix 418 array scanner (manufactured by Affymetrix) at an excitation wavelength of 532 nm and a measurement wavelength of 570 nm, and the intensity of the obtained signal is measured using image analysis software ImaGene. And analyzed. The results are summarized in Table 1.
[0035]
In Table 1, among NH2-11 to NH2-15, NH2-21 to NH2-25, NH2-31 to NH2-35, and NH2-41 to NH2-45, there is complete complementarity with the Cy3-P1 oligo. Are NH2-11, NH2-21, and NH2-34, respectively, and completely complementary to Cy3-P2 oligo is NH2-42, and the other probes each have a mismatch of one base. I have. In addition, the signal intensity in the table is the signal reading value in the above analysis software, the signal ratio is the signal reading value of the probe having perfect complementarity to the average value of the signal reading value of the probe having the mismatch. The respective ratios are shown.
[0036]
[Table 1]
As is clear from Table 1, when the alkali (+) glass was used, the signal was generally higher than that of the alkali (-) glass. Further, the difference between the signal of a completely complementary probe and the signal of another probe is larger in the alkali (+) glass. This indicates that the use of alkali-treated polyacrylic acid-coated slide glasses is effective in detecting single base substitution.
[0038]
Example 3
(1) Forty-four kinds of oligonucleotide probes of 24 or 25 bases having an alkylamino linker (manufactured by PE Biosystems) having an alkylene chain of 6 attached to the 5 'end, NH-A-1 to NH-A- 5, NH-B-1 to NH-B-5, NH-C-1 to NH-C-5, NH-D-1 to NH-D-5, NH-E-1 to NH-E-5, NH-F-1 to NH-F-5, NH-G-1 to NH-G-5, and NH-H-1 to NH-H-5 (hereinafter, referred to as NH-FX oligo) are DNA synthesizers, respectively. Was synthesized using The nucleotide sequences of these probes are shown in SEQ ID NOs: 23 to 62 in the sequence listing, respectively. These probes were added to a 50 mM carbonate buffer (mixed with a solution of 50 mM sodium carbonate (manufactured by Nacalai Tesque) and a solution of 50 mM sodium bicarbonate (manufactured by Nacalai Tesque) to adjust the pH to 9.5) so that the concentration of each probe was 1 mM. Dissolved. Further, an oligonucleotide having the sequence shown in SEQ ID NO: 63 and having Cy3 bonded to the 5 'end (hereinafter referred to as Cy3-RX oligo) was synthesized using a DNA synthesizer.
[0039]
(2) A commercial slide glass (Silan-Prep Slides, manufactured by Sigma) treated with aminoalkylsilane was immersed in a 2.5% glutaraldehyde aqueous solution for 1 hour, washed three times with distilled water, and air-dried. The NH-FX oligo was spotted on the glutaraldehyde-treated slide using an Affymetrix 417 arrayer (Affymetrix). The slide glass after the spot was washed with 0.2% SDS at room temperature for 2 minutes, and then sufficiently washed with distilled water. In order to reduce the Schiff base by the covalent bond between the aldehyde group of the carrier and the amino group of DNA to a stable amine, the washed slide further contains 0.25% sodium borohydride (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.). After performing a step of immersing in a PBS-100% ethanol mixed solution (volume ratio: 3: 1) for 5 minutes, the plate was washed and dried in the same manner as described above.
[0040]
(3) The two slide glasses on which the DNA probe was immobilized were hybridized using the previously synthesized Cy3-RX oligo as a probe, and the signal was observed. That is, about 5 μl of a hybridization solution consisting of 1 μM Cy3-RX oligo, 4 × SSC and 0.2% SDS was dropped onto the region where the DNA was fixed on the slide glass, and a cover glass was used to prevent bubbles from entering. , And placed in a moist box to keep the temperature at 37 ° C for 2 hours. One DNA probe-immobilized slide glass was removed from the cover glass in 2 × SSC at room temperature, washed for 5 minutes in 2 × SSC and 0.2% SDA at room temperature, and then washed with 0.2 × SSC at room temperature. After washing in water for 5 minutes, water was removed by low-speed centrifugation at about 1,000 rpm, and air-dried (hereinafter, referred to as TMAC treatment (-)). The other slide glass was removed from the cover glass in 2 × SSC at room temperature, washed twice in 5 × SSC at ice temperature for 30 minutes, and then washed with a TMAC washing solution (3 M tetramethylammonium chloride (3M) at 55 ° C.). Washed in 50 mM Tris-HCl (pH 8.0, Nacalai Tesque), 0.1% SDS and 2 mM EDTA) for 14 hours, and washed with 2 × SSC and 0.2% SDS at room temperature. After washing in water for 5 minutes, washing was performed in 0.2 × SSC at room temperature for 5 minutes, moisture was removed by low-speed centrifugation at about 1,000 rpm, and air-dried (hereinafter, TMAC treatment (+ )).
[0041]
(4) The signal on the DNA probe-immobilized slide glass after hybridization was measured using an Affymetrix 418 array scanner at an excitation wavelength of 532 nm and a measurement wavelength of 570 nm. The intensity of the obtained signal was analyzed using image analysis software ImaGene. The results are shown in Tables 2 and 3.
[0042]
In Table 2 and Table 3, Cy3 in the NH-A group, the NH-B group, the NH-C group, the NH-D group, the NH-E group, the NH-F group, the NH-G group, and the NH-H group. -Completely complementary to the RX oligo are NH-A-3, NH-B-4, NH-C-2, NH-D-4, NH-E-2, NH-F-3, In NH-G-4 and NH-H-2, each of the other probes has a single base mismatch. Also, in the table, the signal intensity is the signal read value with the above analysis software, the signal ratio is the average of the signal read values with the mismatched probe, the signal read value of the probe with perfect complementarity. The respective ratios are shown.
[0043]
[Table 2]
[Table 3]
As is clear from Tables 2 and 3, when the washing was performed with the TMAC washing solution, the signal was generally lower than in the case where the washing was not performed. The difference from the signal of the probe is large. From this, it was shown that in the detection of single base substitution, the case where washing was performed with a TMAC washing solution was effective.
[0046]
【The invention's effect】
According to the present invention, a DNA-immobilized carrier having excellent signal strength in hybridization is provided. The DNA-immobilized carrier has a distinct hybridization signal difference based on a single-base difference, and is effective for detecting, for example, single-nucleotide polymorphism (SNP).
[0047]
[Sequence list]
Claims (21)
（ａ）請求項１〜５いずれか記載の核酸固定化用担体のポリアニオンを活性エステル誘導体とする工程、
（ｂ）上記活性エステル誘導体と、当該誘導体と反応性を有する官能基で修飾された核酸とを反応させる工程、
（ｃ）担体に固定化された核酸と、当該核酸に相補的な被検体中の核酸をハイブリダイズさせる工程、及び
（ｄ）ハイブリダイズした核酸を検出する工程。A method for detecting a nucleic acid in a subject, comprising the following steps.
(A) converting the polyanion of the carrier for immobilizing nucleic acid according to any one of claims 1 to 5 into an active ester derivative;
(B) reacting the active ester derivative with a nucleic acid modified with a functional group reactive with the derivative;
(C) a step of hybridizing the nucleic acid immobilized on the carrier with a nucleic acid in a subject complementary to the nucleic acid, and (d) a step of detecting the hybridized nucleic acid.
（ａ）請求項６記載の核酸固定化用担体の活性エステル誘導体と、当該誘導体と反応性を有する官能基で修飾された核酸とを反応させる工程、
（ｂ）担体に固定化された核酸と、当該核酸に相補的な被検体中の核酸をハイブリダイズさせる工程、及び
（ｄ）ハイブリダイズした核酸を検出する工程。A method for detecting a nucleic acid in a subject, comprising the following steps.
(A) reacting an active ester derivative of the carrier for immobilizing nucleic acid according to claim 6 with a nucleic acid modified with a functional group reactive with the derivative;
(B) a step of hybridizing the nucleic acid immobilized on the carrier with a nucleic acid in a subject complementary to the nucleic acid, and (d) a step of detecting the hybridized nucleic acid.
（ａ）担体に固定化された核酸と、当該核酸に相補的な被検体中の核酸をハイブリダイズさせる工程、
（ｂ）工程（ａ）で得られた担体をテトラメチルアンモニウムクロライドを含有する洗浄液で洗浄する工程、及び
（ｄ）ハイブリダイズした核酸を検出する工程。A method for detecting a nucleic acid in a subject, comprising the following steps.
(A) a step of hybridizing a nucleic acid immobilized on a carrier with a nucleic acid in a subject complementary to the nucleic acid,
(B) a step of washing the carrier obtained in the step (a) with a washing solution containing tetramethylammonium chloride, and (d) a step of detecting a hybridized nucleic acid.
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