JP2004231556A - Apoptosis inducer - Google Patents

Abstract

<P>PROBLEM TO BE SOLVED: To obtain an apoptosis inducer useful for preventing and/or treating disorders caused by apoptosis inhibition. <P>SOLUTION: The Akt inhibitor comprises a compound represented by formula (I) (R is a 4-30C straight-chain or branched-chain acyl group which may be substituted). <P>COPYRIGHT: (C)2004,JPO&NCIPI

Description

〔式中、Ｒは、炭素数４〜３０の直鎖状又は分枝状の置換されていてもよいアシル基である〕
で表される化合物を含む、Ａｋｔ阻害剤。
（２）Ｒが、３位にオキソ基を有する炭素数４〜３０の直鎖状又は分枝状のアシル基である、（１）に記載のＡｋｔ阻害剤。
（３）（１）又は（２）に記載のＡｋｔ阻害剤を含む、アポトーシス誘導剤。
（４）式Ｉ：
【化４】

〔式中、Ｒは、（１）と同義である〕
で表される化合物を用いて、細胞におけるアポトーシスを誘導する方法。
【００１３】
【発明の実施の形態】
本発明における、式Ｉ：
【化５】

で表される化合物をアシル化ホモセリンラクトン類と称する。
【００１４】
式Ｉにおける、Ｒは、炭素数４〜３０、好ましくは８〜２０、より好ましくは１０〜１４の直鎖状又は分枝状の置換されていてもよいアシル基であり、置換基としては、ヒドロキシル基、オキソ基、メチル基等が挙げられる。非置換の飽和脂肪族アシル基、及び３位にオキソ基を有する飽和脂肪族アシル基が好ましい。また、直鎖状であることが好ましい。
【００１５】
Ｒの具体例としては、特に限定されないが、例えば、ブチリル基、３−オキソブチリル基、３−ヒドロキシブチリル基、イソブチリル基、バレリル基、３−オキソバレリル基、イソバレリル基、３−オキソイソバレリル基、ピバロイル基、ヘキサノイル基、３−オキソヘキサノイル基、ヘプタノイル基、３−オキソヘプタノイル基、オクタノイル基、３−オキソオクタノイル基、ノナノイル基、３−オキソノナノイル基、デカノイル基、３−オキソデカノイル基、ウンデカノイル基、３−オキソウンデカノイル基、ラウロイル基、３−オキソドデカノイル基、トリデカノイル基、３−オキソトリデカノイル基、テトラデカノイル基、３−オキソテトラデカノイル基、ペンタデカノイル基、３−オキソペンタデカノイル基、パルミトイル基、３−オキソパルミトイル基、ヘプタデカノイル基、３−オキソヘプタデカノイル基、ステアロイル基、３−オキソステアロイル基、ノナデカノイル基、３−オキソノナデカノイル基、イコサノイル基、３−オキソイコサノイル基、トリアコンタノイル基、３−オキソトリアコンタノイル基、ミリストイル基、３−オキソミリストイル基及びピルボイル基等が挙げられる。
【００１６】
式Ｉで表されるアシル化ホモセリンラクトン類の具体例としては、特に限定されないが、例えば、Ｎ−ブチリル−Ｌ−ホモセリンラクトン、Ｎ−（３−オキソブチリル）−Ｌ−ホモセリンラクトン、Ｎ−（３−ヒドロキシブチリル）−Ｌ−ホモセリンラクトン、Ｎ−イソブチリル−Ｌ−ホモセリンラクトン、Ｎ−バレリル−Ｌ−ホモセリンラクトン、Ｎ−（３−オキソバレリル）−Ｌ−ホモセリンラクトン、Ｎ−イソバレリル−Ｌ−ホモセリンラクトン、Ｎ−（３−オキソイソバレリル）−Ｌ−ホモセリンラクトン、Ｎ−ピバロイル−Ｌ−ホモセリンラクトン、Ｎ−ヘキサノイル−Ｌ−ホモセリンラクトン、Ｎ−（３−オキソヘキサノイル）−Ｌ−ホモセリンラクトン、Ｎ−ヘプタノイル−Ｌ−ホモセリンラクトン、Ｎ−（３−オキソヘプタノイル）−Ｌ−ホモセリンラクトン、Ｎ−オクタノイル−Ｌ−ホモセリンラクトン、Ｎ−（３−オキソオクタノイル）−Ｌ−ホモセリンラクトン、Ｎ−ノナノイル−Ｌ−ホモセリンラクトン、Ｎ−（３−オキソノナノイル）−Ｌ−ホモセリンラクトン、Ｎ−デカノイル−Ｌ−ホモセリンラクトン、Ｎ−（３−オキソデカノイル）−Ｌ−ホモセリンラクトン、Ｎ−ウンデカノイル−Ｌ−ホモセリンラクトン、Ｎ−（３−オキソウンデカノイル）−Ｌ−ホモセリンラクトン、Ｎ−ラウロイル−Ｌ−ホモセリンラクトン、Ｎ−（３−オキソドデカノイル）−Ｌ−ホモセリンラクトン、Ｎ−トリデカノイル−Ｌ−ホモセリンラクトン、Ｎ−（３−オキソトリデカノイル）−Ｌ−ホモセリンラクトン、Ｎ−テトラデカノイル−Ｌ−ホモセリンラクトン、Ｎ−（３−オキソテトラデカノイル）−Ｌ−ホモセリンラクトン、Ｎ−ペンタデカノイル−Ｌ−ホモセリンラクトン、Ｎ−（３−オキソペンタデカノイル）−Ｌ−ホモセリンラクトン、Ｎ−パルミトイル−Ｌ−ホモセリンラクトン、Ｎ−（３−オキソパルミトイル）−Ｌ−ホモセリンラクトン、Ｎ−ヘプタデカノイル−Ｌ−ホモセリンラクトン、Ｎ−（３−オキソヘプタデカノイル）−Ｌ−ホモセリンラクトン、Ｎ−ステアロイル−Ｌ−ホモセリンラクトン、Ｎ−（３−オキソステアロイル）−Ｌ−ホモセリンラクトン、Ｎ−ノナデカノイル−Ｌ−ホモセリンラクトン、Ｎ−（３−オキソノナデカノイル）−Ｌ−ホモセリンラクトン、Ｎ−イコサノイル−Ｌ−ホモセリンラクトン、Ｎ−（３−オキソイコサノイル）−Ｌ−ホモセリンラクトン、Ｎ−トリアコンタノイル−Ｌ−ホモセリンラクトン、Ｎ−（３−オキソトリアコンタノイル）−Ｌ−ホモセリンラクトン、Ｎ−ミリストイル−Ｌ−ホモセリンラクトン、Ｎ−（３−オキソミリストイル）−Ｌ−ホモセリンラクトン及びＮ−ピルボイル−Ｌ−ホモセリンラクトン等が挙げられる。
【００１７】
特に、Ｎ−（３−オキソデカノイル）−Ｌ−ホモセリンラクトン、Ｎ−（３−オキソウンデカノイル）−Ｌ−ホモセリンラクトン、Ｎ−（３−オキソドデカノイル）−Ｌ−ホモセリンラクトン、Ｎ−（３−オキソトリデカノイル）−Ｌ−ホモセリンラクトン及びＮ−（３−オキソテトラデカノイル）−Ｌ−ホモセリンラクトンが好ましい。
【００１８】
本発明のアシル化ホモセリンラクトン類は、例えば、脂肪族カルボン酸又はそのエステルと環状アミノ酸との間にアミド結合を形成させることによって合成することができる。また、アシル化ホモセリンラクトン類は、例えば、Ｃｈｈａｂｒａ， Ｓ． Ｒ．， Ｐ． Ｓｔｅａｄ， Ｎ． Ｊ． Ｂａｉｎｔｏｎ， Ｇ． Ｐ． Ｃ． Ｓａｌｍｏｎｄ， Ｇ． Ｓ． Ａ． Ｂ． Ｓｔｅｗａｒｔ， Ｐ．Ｗｉｌｌｉａｍｓ， ａｎｄ Ｂ． Ｗ． Ｂｙｃｒｏｆｔ， Ｊ． Ａｎｔｉｂｉｏｔ．， ４６， ４４１−４５４， １９９３、Ｚｈａｎｇ， Ｌ．， Ｐ． Ｊ． Ｍｕｒｐｈｙ，Ａ． Ｋｅｒｒ， ａｎｄ Ｍ． Ｅ． Ｔａｔｅ， Ｎａｔｕｒｅ， ３６２， ４４６−４４８， １９９３、Ｓｃｈａｅｆｅｒ Ａ．Ｌ．， Ｂ． Ｌ． Ｈａｎｚｅｌｋａ， Ａ． Ｅｂｅｒｈａｒｄ， ａｎｄ Ｅ． Ｐ． Ｇｒｅｅｎｂｅｒｇ， Ｊ． Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．， １７８， ２８９７−２９０１， １９９６、Ｇａｏ， Ｊ． Ｇ． ａｎｄ Ｅ． Ａ． Ｍｅｉｇｈｅｎ． Ｊ． Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．， １７５， ３８５６−３８６２， １９９３などに記載された方法によって合成できる。
【００１９】
また、本発明のアシル化ホモセリンラクトン類は微生物によって生合成されるため、微生物を培養した培養物から当技術分野において通常用いられる方法によって分離精製することもできる。
【００２０】
本発明者らは、アシル化ホモセリンラクトン類と各種動物細胞を反応させ、ウェスタンブロッティング法によって、該細胞におけるＡｋｔ活性を測定したところ、特定のアシル化ホモセリンラクトン類が、Ａｋｔのリン酸化活性を効果的に阻害することを見出した。
【００２１】
本発明において、Ａｋｔは、ＰＩ３Ｋ（ホスファチジルイノシチド３−ＯＨキナーゼ）の下流で活性化するセリン／トレオニンキナーゼであり、ＰＩ３Ｋ−Ａｋｔ経路は、生存シグナル伝達経路の１つとして知られている。また、Ａｋｔが、細胞におけるアポトーシスを阻害する活性を有することも報告されている（特表２００２−５２８３９０）。
【００２２】
本発明において、アポトーシスとは当技術分野で通常用いられる意味を有し、すなわち、生理的条件下で細胞自らが積極的に引き起こす細胞死を意味する。アポトーシスの形態は、細胞核の染色体凝集、細胞核の断片化、細胞表層微絨毛の消失、クロマチンの凝縮を特徴とする。細胞は萎縮し、細胞の内容物が細胞外に放出されずにマクロファージなどの周囲の細胞にすみやかに取り込まれるので、炎症が引き起こされず、周囲の細胞に影響を与えない。一方、環境の悪化から引き起こされるネクローシス（壊死）は、細胞の内容物が放出される点で大きく異なる。
【００２３】
上記のような特徴から、細胞におけるアポトーシスは、様々な方法で検出することができる。アポトーシスの検出法としては、特に限定されないが、例えば、ＤＮＡ結合性蛍光色素アミノベンズイミド（ヘキスト３３３４２、３３５８２及び３３３２５８など）などによる染色後に蛍光顕微鏡でクロマチン凝縮を観察する方法、断片化したＤＮＡを遠心などにより抽出分離して比色法などによって定量する方法、断片化したＤＮＡをアガロースゲル電気泳動で「ラダー」として検出する方法、断片化したＤＮＡを組織化学的に検出するＴＵＮＥＬ（ｔｅｒｍｉｎａｌ ｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｙｌ ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ｄＵＴＰ−ｂｉｏｔｉｎ ｎｉｃｋ ｅｎｄ ｌａｂｅｌｉｎｇ）法などが挙げられる。
【００２４】
本発明のアポトーシス誘導剤によって、アポトーシスを誘導できる細胞は、特に限定されないが、植物細胞及び動物細胞が挙げられ、動物細胞のアポトーシスを特に効果的に誘導できる。
【００２５】
本発明により、アシル化ホモセリンラクトン類が、癌細胞に対して効果的にＡｋｔの活性を阻害することが明らかとなったことから、アシル化ホモセリンラクトン類を癌細胞におけるＡｋｔ阻害剤として使用できる。さらに、癌細胞にアシル化ホモセリンラクトン類を作用させることによって、癌細胞の細胞生存率の低下及びクロマチンの凝集等が観察されたことから、本発明のアシル化ホモセリンラクトン類が、癌細胞に対し効果的にアポトーシスを誘導することも明らかとなった。従って、本発明のアシル化ホモセリンラクトン類を、抗癌剤における有効成分として使用できる。
【００２６】
本発明において、Ａｋｔ阻害剤とは、Ａｋｔの活性化、すなわちリン酸化を阻害する薬剤及び活性化Ａｋｔを不活性化する薬剤を意味し、例えば、動物細胞におけるＡｋｔの活性化を阻害する薬剤、Ａｋｔの細胞内における正常な局在化を阻害する薬剤、Ａｋｔを活性化する物質の作用を阻害する薬剤、Ａｋｔ活性化物質を分解する薬剤などが含まれる。
【００２７】
さらに、式Ｉで表されるアシル化ホモセリンラクトン類は、Ｒ基の種類によってＡｋｔ阻害活性が異なることから、Ｒ基を変更及び改変することによって、そのアポトーシス誘導効果を調節することができる。また、異なるＲ基を有する複数種のアシル化ホモセリンラクトン類を組み合わせて使用することにより、Ａｋｔ活性の変化を制御し、薬理効果を調節することも可能であると考えられる。
【００２８】
本発明のアシル化ホモセリンラクトン類を有効成分とするアポトーシス誘導剤によって治療できる疾患としては、特に限定されないが、例えば、卵巣、乳房、膵臓、皮膚、肺、脳、腎臓、肝臓、鼻咽頭腔、中枢神経系、前立腺、大腸、結腸、直腸、子宮頸部及び子宮内膜からなる群より選択される組織中に存在する癌、並びに増殖性皮膚疾患、慢性関節リウマチ、ＨＩＶ感染、肝炎、腎疾患等のアポトーシスの抑制に起因する疾患が挙げられる。特に、大腸癌などの消化器系の癌、皮膚癌の治療において好適に使用される。
【００２９】
本発明のアポトーシス誘導剤において、アシル化ホモセリンラクトン類は、水和物であってもよい。さらに、本発明にかかるアシル化ホモセリンラクトン類は遊離した形態であってもよく、又はその薬理学的に許容される塩であってもよい。塩を形成する場合は、具体的にはアルカリ金属の付加塩、アルカリ土類金属の付加塩、アンモニウム塩、アミンの付加塩等を挙げることができるが、遊離した状態がより好ましい。
【００３０】
次に本発明のアシル化ホモセリンラクトン類の投与剤型としては、例えば散剤、細粒剤、顆粒剤、錠剤、被覆錠剤、カプセル剤などの経口製剤、軟膏、貼付剤等の外用剤、坐剤及び注射用製剤等が挙げられる。製剤化の際には、通常の製剤担体を用いて常法により製造することができる。
【００３１】
すなわち経口製剤を製造するにあたっては、アシル化ホモセリンラクトン類と賦形剤、さらに必要に応じて酸化防止剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、着色剤、矯味矯臭剤などを加えた後、常法により散剤、細粒剤、顆粒剤、錠剤、被覆錠剤、カプセル剤等とする。
【００３２】
賦形剤としては、例えば乳糖、コーンスターチ、白糖、ブドウ糖、マンニトール、ソルビット、結晶セルロース、二酸化ケイ素などが、結合剤としては、例えばポリビニルアルコール、ポリビニルエーテル、メチルセルロース、エチルセルロース、アラビアゴム、トラガント、ゼラチン、シェラック、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ポリビニルピロリドン、ポリプロピレングリコール・ポリオキシエチレン・ブロックポリマー、メグルミンなどが、崩壊剤としては、例えば澱粉、寒天、ゼラチン末、結晶セルロース、炭酸カルシウム、炭酸水素ナトリウム、クエン酸カルシウム、デキストリン、ペクチン、カルボキシメチルセルロース・カルシウム等が、滑沢剤としては、例えばタルク、ポリエチレングリコール、シリカ、硬化植物油等が、着色剤としては医薬品に添加することが許可されているものが、矯味矯臭剤としては、ココア末、ハッカ脳、芳香散、ハッカ油、竜脳、桂皮末等が用いられる。これらの錠剤・顆粒剤は、糖衣してもよく、その他必要により適宜コーティングしてもよい。
【００３３】
また注射用製剤を製造する際には、アシル化ホモセリンラクトン類にｐＨ調整剤、溶解剤、等張化剤などと、必要に応じて溶解補助剤、安定化剤、酸化防止剤などを加えて、常法により製剤化する。
【００３４】
外用剤を製造する際の方法は限定されず、常法により製造することができる。すなわち製剤化にあたり使用する基剤原料としては、医薬品、医薬部外品、化粧品等に通常使用される各種原料を用いることが可能である。
【００３５】
使用する基剤原料として具体的には、例えば動植物油、鉱物油、エステル油、ワックス類、高級アルコール類、脂肪酸類、シリコン油、界面活性剤類、アルコール類、多価アルコール類、水溶性高分子類、粘土鉱物類、精製水などの原料が挙げられ、さらに必要に応じ、ｐＨ調整剤、酸化防止剤、キレート剤、防腐防黴剤、着色料、香料などを添加することができるが、本発明にかかる外用剤の基剤原料はこれらに限定されない。また必要に応じて血流促進剤、殺菌剤、消炎剤、細胞賦活剤、ビタミン類、アミノ酸、保湿剤、角質溶解剤等の成分を配合することもできる。なお上記基剤原料の添加量は、通常外用剤の製造にあたり設定される濃度になる量である。
【００３６】
本発明におけるアポトーシス誘導剤の有効成分であるアシル化ホモセリンラクトン類の臨床投与量は、投与の対象となる動物、症状、重症度、年齢、体重、合併症などによって異なり、また塩の種類・投与経路などによっても異なるが、通常、成人１日あたり１μｇ〜１ｇであり、好ましくは１０μｇ〜２００ｍｇであり、さらに好ましくは２０μｇ〜２０ｍｇである。
【００３７】
本発明のアポトーシス誘導剤の投与対象としては、動物であれば特に限定されないが、哺乳動物、例えば、ウマ、犬、マウス、モルモット、ラット等が挙げられる。特に、ヒトに対して好適に使用される。
【００３８】
【実施例】
以下の実施例において実験材料は、特に他に記載がない限り、以下に記載のものを使用した。
【００３９】
細胞培養に用いたダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）、ウシ胎児血清（ＦＣＳ）、非必須アミノ酸（ＮＥＡＡ）、ペニシリン／ストレプトマイシン（Ｐ／Ｓ）はＳＩＧＭＡ社から購入した。Ｎ−アシル−Ｌ−ホモセリンラクトン（ＡＨＬ）の溶媒として用いたジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）は和光純薬工業株式会社のものを使用した。キナーゼ阻害剤であるＰＤ９８０５９、ＳＢ２０３５８０はＣＡＬＢＩＯＣＨＥＭ社から購入した。タンパク質の定量には、ＰＩＥＲＣＥ社のＢＣＡ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙ Ｒｅａｇｅｎｔを使用した。抗体については以下の会社のものを使用した。抗−リン酸化−Ａｋｔ（Ｓｅｒ４７３） 抗体、抗−Ｃｌｅａｖｅｄ型ｃａｓｐａｓｅ−３ 抗体、抗−Ｃｌｅａｖｅｄ型ｃａｓｐａｓｅ−９（Ｄ３３０）抗体、抗−Ｃｌｅａｖｅｄ型ＰＡＲＰ（Ｄ２１４）抗体、ＨＲＰ標識抗−ウサギＩｇＧ抗体はＣｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ社。ＨＲＰ標識抗−マウスＩｇＧ抗体はＳＡＮＴＡ ＣＲＵＺ ＢＩＯＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ社。抗−α−チューブリン抗体（Ａｂ−１）はＣＡＬＢＩＯＣＨＥＭ社。
【００４０】
実施例１ Ａｋｔ 活性のウェスタンブロットによる解析
（１）ＣａＣｏ−２細胞におけるアシル化ホモセリンラクトン刺激によるＡｋｔ活性の変化
ヒト大腸癌カルチノーマ細胞株ＣａＣｏ−２はＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）より購入し、１０％ ＦＣＳ、１％ ＮＥＡＡ、１％ Ｐ／Ｓ（１００ ｕｎｉｔｓ／ｍｌ ペニシリン、１００μｇ／ｍｌ ストレプトマイシン）を含むＤＭＥＭ培地を用いて３７℃、５％ ＣＯ_２存在下で培養した。
【００４１】
６ｃｍ ディッシュ（ＮＵＮＣ社）を用いて、１ ディッシュ当たりＣａＣｏ−２細胞を６×１０^５個まき、リン酸緩衝化食塩水（ＰＢＳ）（−）で２回洗浄後、１％ ＮＥＡＡを含む無血清ＤＭＥＭ培地で２４時間培養した。その後、終濃度１００μＭでホモセリンラクトン塩酸塩、Ｎ−ブチリル−Ｌ−ホモセリンラクトン、Ｎ−（３−オキソヘキサノイル）−Ｌ−ホモセリンラクトン、Ｎ−（３−オキソドデカノイル）−Ｌ−ホモセリンラクトンをそれぞれ添加し、１０分間反応させた。なお、精製されたアシル化ホモセリンラクトンは、目的とする終濃度の４００倍になるようＤＭＳＯに溶解し、フィルター滅菌（φ０．２２μｍ）を行ったものを使用した。対照として終濃度０．２５ ％のＤＭＳＯを使用した。また、内部標準としてα−チューブリンを用いた。
【００４２】
反応後、冷ＰＢＳ（−）で２回洗浄し、−８０℃で凍結させた。氷上で細胞を融解し、溶解バッファー（５０ ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．５、５０ ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１．５ ｍＭ ＭｇＣｌ_２、１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、１０％ グリセリン、１０ ｍＭ ピロリン酸ナトリウム、１ｍＭ Ｎａ_３ＶＯ_４、１００ ｍＭ ＮａＦ、１ｍＭ ＰＭＳＦ、１０μｇ／ｍｌ アプロチニン、１０μｇ／ｍｌ ロイペプチン）を２００μｌ加え、スクレーパーで細胞を剥ぎ取った。これを氷上で２０分間静置し、その後１４０００ ｒｐｍ、４℃で１５分間遠心分離し、上清を回収した。回収したタンパク質の濃度を測定し、５０μｇ相当をＳＤＳ−ＰＡＧＥに供した。泳動後ＰＶＤＦメンブレンにブロットした。リン酸化Ａｋｔを測定する場合は、０．１％ Ｔｗｅｅｎ ２０（ＴＢＳ−Ｔ）を含む５％ スキムミルク／Ｔｒｉｓ緩衝化食塩水でブロッキングを行い、１次抗体にそれぞれ、抗−リン酸化−Ａｋｔ （Ｓｅｒ４３７） 抗体を、２次抗体にはＨＲＰ標識抗−ウサギＩｇＧ抗体を用いた。内部標準として使用したα−チューブリンは、ブロッキングを５％ ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）／ＴＢＳ−Ｔで行い、１次抗体は抗−α−チューブリン（Ａｂ−１）、２次抗体にはＨＲＰ標識抗−マウスＩｇＧ抗体を用いた。バンドの検出にはＲｅｎａｉｓｓａｎｃｅ^ＴＭ ＷｅｓｔｅｒｎＢｌｏｔ Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ ２５５８６１ Ｒｅａｇｅｎｔ Ｐｌｕｓ（ＮＥＮ社）又は、Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｂｌｏｔｔｉｎｇ Ｌｕｍｉｎｏｌ Ｒｅａｇｅｎｔ（ＳＡＮＴＡ ＣＲＵＺ ＢＩＯＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ社）を使用した。結果を図１に示す。なお以下で言及する図中において、ＨＳＬはホモセリンラクトン塩酸塩を、Ｃ４−ＨＳＬはＮ−ブチリル−Ｌ−ホモセリンラクトンを、３−ｏｘｏ−Ｃ６−ＨＳＬはＮ−（３−オキソヘキサノイル）−Ｌ−ホモセリンラクトンを、３−ｏｘｏ−Ｃ１２−ＨＳＬはＮ−（３−オキソドデカノイル）−Ｌ−ホモセリンラクトンを意味する。
【００４３】
ＣａＣｏ−２細胞においてＡｋｔは通常リン酸化（活性化）された状態にあるが、Ｎ−（３−オキソドデカノイル）−Ｌ−ホモセリンラクトンを添加した場合のみ、Ａｋｔのリン酸化レベルが著しく低下した。すなわち、Ｎ−（３−オキソドデカノイル）−Ｌ−ホモセリンラクトンがＡｋｔの活性化を阻害することが明らかとなった。
【００４４】
（２）ＣａＣｏ−２細胞におけるＮ−（３−オキソドデカノイル）−Ｌ−ホモセリンラクトン濃度依存的なＡｋｔ活性の変化
細胞培養後、終濃度０μＭ（０．２５％ ＤＭＳＯ）、１μＭ、１０μＭ、３０μＭ、１００μＭのＮ−（３−オキソ−ドデカノイル）−Ｌ−ホモセリンラクトンをそれぞれ添加して、１０分間反応させること以外は、（１）と同様にして、Ａｋｔ活性をウェスタンブロットにより解析した（図２）。
【００４５】
図２のバンドの強度をＬＡＳ−１０００により定量、数値化した結果を図３に示す。１０μＭ以上の濃度でＡｋｔのリン酸化レベルが有意に減少した。１０μＭ、３０μＭ、１００μＭではそれぞれ無刺激時の７９％、３１％、１４％にまで活性が低下した。
【００４６】
以上から、ＣａＣｏ−２細胞では、アシル化ホモセリンラクトン１０μＭ以上で、Ａｋｔの活性が有意に阻害されることが明らかとなった。
【００４７】
（３）ＣａＣｏ−２細胞におけるＮ−（３−オキソドデカノイル）−Ｌ−ホモセリンラクトン刺激によるＡｋｔ活性の経時変化
細胞培養後、終濃度３０μＭ及び１００μＭのＮ−（３−オキソドデカノイル）−Ｌ−ホモセリンラクトンを添加し、それぞれアシル化ホモセリンラクトンによる刺激時間を０、５、１０、３０、６０分の短いタイムコース（図４）、０、１０分、６０分、２時間、４時間、６時間、８時間、１０時間の長いタイムコース（図５）で行った他は、（１）と同様にして、ウェスタンブロットによりＡｋｔ活性を測定した。３０μＭ刺激時のＡｋｔの活性阻害は５分をピークに６０分まで持続し、２時間で基底レベルに戻った。一方、１００μＭ刺激時のＡｋｔ活性阻害は５分をピークにして６時間まで持続した。
【００４８】
（４）ブタ血管内皮細胞におけるＮ−（３−オキソドデカノイル）−Ｌ−ホモセリンラクトン刺激によるＡｋｔ活性の変化
ブタ血管内皮細胞株（ＰＥＣ）を、１０％ ＦＣＳ、１％ ＮＥＡＡ、１％ Ｐ／Ｓ（１００ ｕｎｉｔｓ／ｍｌ ペニシリン、１００μｇ／ｍｌ ストレプトマイシン）を含むＤＭＥＭ培地を用いて３７℃、５％ ＣＯ_２存在下で培養した。
【００４９】
６ｃｍ ディッシュ（ＮＵＮＣ社）を用いて、１ ディッシュ当たりＰＥＣ細胞を６×１０^５ 個まき、リン酸緩衝化食塩水（ＰＢＳ）（−）で２回洗浄後、１％ ＮＥＡＡを含む無血清ＤＭＥＭ培地で２４時間培養した。その後、終濃度１００μＭでホモセリンラクトン塩酸塩、Ｎ−ブチリル−Ｌ−ホモセリンラクトン、Ｎ−（３−オキソヘキサノイル）−Ｌ−ホモセリンラクトン、Ｎ−（３−オキソドデカノイル）−Ｌ−ホモセリンラクトンをそれぞれ添加し、１０分間反応させた。（１）と同様に、ウェスタンブロッティングにより、アシル化ホモセリンラクトン類がＰＥＣ細胞におけるＡｋｔの活性に与える影響を調べた。結果を図６に示す。
【００５０】
ウェスタンブロッティングの結果から、Ｎ−（３−オキソドデカノイル）−Ｌ−ホモセリンラクトンが、有意に、ＰＥＣ細胞におけるＡｋｔの活性を低減させることが明らかとなった。
【００５１】
以上の結果は、特定のアシル化ホモセリンラクトン類が、ＰＥＣ細胞におけるアポトーシスを誘導することを示している。
【００５２】
実施例２ Ｔｒｙｐａｎ ｂｌｕｅ 染色による生存率の評価
３．５ｃｍ ディッシュ（ＮＵＮＣ社）に、ＣａＣｏ−２細胞を２×１０^５ 個まき、ＰＢＳ（−）で２回洗浄後、１％ ＮＥＡＡを含む無血清ＤＭＥＭ培地で２４時間培養した。各種薬剤 ［終濃度１〜１００μＭのＮ−（３−オキソドデカノイル）−Ｌ−ホモセリンラクトンを添加し、１２時間培養した。対照として０．２５％ ＤＭＳＯを使用した。その後、上清及びトリプシン−ＥＤＴＡ（ＴＥ）でディッシュから剥がした細胞を、室温、８００ ｒｐｍで５分間遠心後、上清を取り除き、２００μｌのＤＭＥＭにて希釈した。うち５０μｌをエッペンチューブにとり、等量のＴｒｙｐａｎ ｂｌｕｅ染色液を加え、細胞数を血球計測盤にて測定した。このとき、測定対象とする死細胞数と生細胞数の合計を２００個以上とした。
【００５３】
Ｎ−（３−オキソドデカノイル）−Ｌ−ホモセリンラクトン濃度依存的に生存率の有意な低下が認められた。１０μＭ、３０μＭ、１００μＭのＮ−（３−オキソドデカノイル）−Ｌ−ホモセリンラクトンにより、生存率がそれぞれ９０％、５５％、５１％にまで低下した（図７）。この３０μＭ以上の濃度において有意に生存率を低下させるという結果は、ウェスタンブロット解析においてＡｋｔ活性阻害が３０μＭ前後で顕著に見られたこととも一致する。また対照及び０．２５％ ＤＭＳＯ添加時の生存率はともに９４％であり、１μＭ Ｎ−（３−オキソドデカノイル）−Ｌ−ホモセリンラクトン刺激時の生存率が９４ ％であることからＤＭＳＯの生存率への影響は無視できるものと考えられる。
【００５４】
実施例３ Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２ 染色によるクロマチン凝縮の観察とアポトーシスの判定実施例２で観察されたＣａＣｏ−２の細胞死がアポトーシス又はネクローシスであるかを判定すべく、クロマチン染色の蛍光色素Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２を用いて形態学的に評価した。
【００５５】
８ウェル培養スライド（Ｃｏｌｌａｇｅｎ Ｉ ｃｅｌｌ ｗａｒｅ ｂｉｏｃｏａｔ Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｓｏｎ）に、ＣａＣｏ−２細胞を２×１０^４個まき、ＰＢＳ（−）で２回洗浄後、１％ ＮＥＡＡを含む無血清ＤＭＥＭ培地で２４時間培養した。３−オキソ−ドデカノイルホモセリンラクトンを各濃度（１〜１００μＭ）にて添加し１２時間培養後、細胞を４％ パラホルムアルデヒド−３％ スクロース／ＰＢＳにて固定し、蛍光色素ヘキスト３３３４２を用いてクロマチン染色を行い、蛍光顕微鏡下で観察した。倍率４００倍にて５視野をランダムに選び、アポトーシス細胞と正常細胞を計数、アポトーシス細胞の割合を算出し、これをｎ＝１として３回以上試行した。
【００５６】
Ｎ−（３−オキソドデカノイル）−Ｌ−ホモセリンラクトン１０μＭ以上の濃度で、クロマチン凝縮を起こしたアポトーシス細胞が観察された。しかし０．２５％ ＤＭＳＯ、１μＭ Ｎ−（３−オキソドデカノイル）−Ｌ−ホモセリンラクトンでは正常細胞のみが観察された（図８）。クロマチン凝縮が観察されたアポトーシス細胞の計数によりアポトーシスの定量を行った結果を図９に示す。全細胞数に対するアポトーシス細胞の割合は、１０μＭ、３０μＭ、１００μＭのＮ−（３−オキソドデカノイル）−Ｌ−ホモセリンラクトンでそれぞれ１５％、３９％、５０％であった。この値は生存低下率とも一致する。したがって、Ｎ−（３−オキソドデカノイル）−Ｌ−ホモセリンラクトンによるＣａＣｏ−２の細胞死はアポトーシスによるものと判定された。
【００５７】
実施例４ ＤＮＡ 断片化によるアポトーシスの評価
実施例２で観察されたＣａＣｏ−２の細胞死がアポトーシス又はネクローシスであるかを判定するための別法として、ＤＮＡの断片化を評価した。
【００５８】
ＣａＣｏ−２細胞を５×１０^６個／１５ ｃｍ ディッシュ（ＮＵＮＣ社）にまき、ＰＢＳ（−）で２回洗浄後、１％ ＮＥＡＡを含む無血清ＤＭＥＭ培地で２４時間培養し、Ｎ−（３−オキソドデカノイル）−Ｌ−ホモセリンラクトンを１μＭ〜１００μＭの各濃度で添加後１２時間培養した。その後、上清及びＴＥでディッシュから剥がした細胞を、室温、８００ ｒｐｍで５分間遠心し、上清を取り除いた。細胞を３００ μｌのＰＢＳ（−）で懸濁し再度４℃、２５００ ｒｐｍで５分間遠心して上清を取り除いた。細胞を細胞溶解バッファー ［１０ ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ （ｐＨ ７．４）、１０ ｍＭ ＥＤＴＡ （ｐＨ ８．０）、０．５％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００］ ３００μｌを加えて細胞溶解させ、氷上に１０分置いてＤＮＡ断片を抽出した。これを４℃、１４０００ｒｐｍで、１０分間遠心し、上清にＲＮａｓｅ Ａを加え、３７℃で１時間温置した。さらにプロテイナーゼＫを加え、５０℃で３０分間温置した。ＤＮＡ断片抽出液をエタノール沈澱によって濃縮し、２％アガロースゲルで電気泳動を行った。ゲルをエチジウムブロミドで染色後、ＵＶトランスイルミネーター下でＤＮＡ断片化を検出した。
【００５９】
それぞれ０μＭ、１μＭ、１０μＭ、３０μＭ、１００μＭのＮ−（３−オキソドデカノイル）−Ｌ−ホモセリンラクトン存在下で１２時間培養したＣａＣｏ−２細胞において、ＤＮＡラダーを検出したところ、３０μＭ以上の濃度にてラダーが確認された（図１０）。
【００６０】
実施例５ ｃａｓｐａｓｅ 活性の測定
ｃａｓｐａｓｅ（ｃａｓｐａｓｅ−３、ｃａｓｐａｓｅ−９）、ＰＡＲＰ（ｐｏｌｙ−ＡＤＰ ｒｉｂｏｓｅ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ）の活性を、ウェスタンブロット解析により抗−活性型（Ｃｌａｖｅｄ型）ｃａｓｐａｓｅ抗体すなわち、抗−Ｃｌｅａｖｅｄ型ｃａｓｐａｓｅ−３抗体、抗−Ｃｌｅａｖｅｄ型ｃａｓｐａｓｅ−９抗体（Ｄ３３０）、抗−Ｃｌｅａｖｅｄ型ＰＡＲＰ 抗体 （Ｄ２１４）をそれぞれ用いて、実施例１と同様に測定した。
【００６１】
培養したＣａＣｏ−２細胞に、終濃度３０μＭ、１００μＭのＮ−（３−オキソドデカノイル）−Ｌ−ホモセリンラクトンをそれぞれ添加し、経時的に０時間、１時間、２時間、４時間、６時間、８時間、１０時間培養後のｃａｓｐａｓｅ−３、ｃａｓｐａｓｅ−９、ＰＡＲＰ活性をウェスタンブロットにより解析した。結果を図１１に示す。３０μＭでは活性型ｃａｓｐａｓｅ−３は刺激１時間後から検出され、その活性が４時間まで持続したのに対し、１００μＭでは活性が刺激６時間後をピークにして１０時間まで持続した。各メンブレンをリプローブしてＣｌｅａｖｅｄ型ｃａｓｐａｓｅ−９、Ｃｌｅａｖｅｄ型ＰＡＲＰを検出した。ｃａｓｐａｓｅ−９活性は３０μＭ刺激では１、２、４時間で活性が強く、微弱な活性が８時間まで持続したのに対し、１００μＭ刺激では強い活性が８時間まで持続した。Ｃｌｅａｖｅｄ型ＰＡＲＰに関してもＣｌｅａｖｅｄ型ｃａｓｐａｓｅ−９と同様の挙動を示した。
【００６２】
次に、Ｎ−（３−オキソドデカノイル）−Ｌ−ホモセリンラクトンとの３時間の反応を、０、１、１０、３０、１００μＭの各濃度にて行い、ｃａｓｐａｓｅ、ＰＡＲＰ活性を測定した。図１２に示すように、３０μＭ、１００μＭの濃度においてのみＣｌｅａｖｅｄ型ｃａｓｐａｓｅ、Ｃｌｅａｖｅｄ型ＰＡＲＰが検出された。この結果はウェスタンブロット解析によるＡｋｔ活性阻害、生存率低下やアポトーシス細胞出現が３０μＭ以上で顕著に起こったこととも一致した。
【００６３】
【発明の効果】
本発明により、細胞におけるアポトーシスを効果的に誘導することができ、アポトーシス抑制に起因する障害の予防及び／又は治療に対する有用な手段が提供される。
【図面の簡単な説明】
【図１】ＣａＣｏ−２細胞におけるＤＭＳＯ、ホモセリンラクトン塩酸塩、Ｎ−ブチリル−Ｌ−ホモセリンラクトン、Ｎ−（３−オキソヘキサノイル）−Ｌ−ホモセリンラクトン及びＮ−（３−オキソドデカノイル）−Ｌ−ホモセリンラクトン刺激によるＡｋｔ活性の変化を表す図である。
【図２】ＣａＣｏ−２細胞におけるＮ−（３−オキソドデカノイル）−Ｌ−ホモセリンラクトン濃度依存的なＡｋｔ活性の変化を表す図である。
【図３】図２のリン酸化Ａｋｔのバンドの強度をＬＡＳ−１０００により定量、数値化した結果を表す図である。
【図４】ＣａＣｏ−２細胞におけるＮ−（３−オキソドデカノイル）−Ｌ−ホモセリンラクトン刺激によるＡｋｔ活性の経時変化を表す図である。
【図５】ＣａＣｏ−２細胞におけるＮ−（３−オキソドデカノイル）−Ｌ−ホモセリンラクトン刺激によるＡｋｔ活性の経時変化を表す図である。
【図６】ブタ血管内皮細胞におけるＤＭＳＯ、ホモセリンラクトン塩酸塩、Ｎ−ブチリル−Ｌ−ホモセリンラクトン、Ｎ−（３−オキソヘキサノイル）−Ｌ−ホモセリンラクトン及びＮ−（３−オキソドデカノイル）−Ｌ−ホモセリンラクトン刺激によるＡｋｔ活性の変化を表す図である。
【図７】アシル化ホモセリンラクトン存在下における細胞生存率をＴｒｙｐａｎ ｂｌｕｅ染色によって評価した結果である。
【図８】アシル化ホモセリンラクトン存在下における細胞のアポトーシスをＨｏｅｃｈｓｔ ３３３４２染色によるクロマチン凝縮で判定した結果である。
【図９】クロマチン凝縮が観察されたアポトーシス細胞の計数によりアポトーシスの定量を行った結果である。
【図１０】ＣａＣｏ−２の細胞死がアポトーシス又はネクローシスであるかを判定するために、ＤＮＡの断片化を評価した結果である。
【図１１】アシル化ホモセリンラクトン存在下におけるｃａｓｐａｓｅ活性の培養時間依存性を、ウェスタンブロットによって測定した結果である。
【図１２】ｃａｓｐａｓｅ活性のアシル化ホモセリンラクトン濃度依存性を、ウェスタンブロットによって測定した結果である。[0001]
TECHNICAL FIELD OF THE INVENTION
The present invention relates to a compound that inhibits one of kinases, Akt, and an apoptosis inducer containing the compound.
[0002]
[Prior art]
Apoptosis is a physiological process or mode of cell death proposed by Kerr and Wyllie et al. (See Non-Patent Documents 1 and 2). Active cell death is programmed into cell genes. Apoptosis plays an important role not only in body formation during development, but also in adult individuals to control cell society, such as normal cell replacement, maintenance of the nervous system, and establishment of the immune system (Non-Patent Document) 3 and 4). Apoptosis is clearly related not only to basic life phenomena but also to the development of various diseases such as cancer, autoimmune diseases, viral infections such as AIDS, and neurodegenerative diseases such as Alzheimer's disease. (See Non-Patent Document 5).
[0003]
Apoptosis is triggered by various apoptosis-inducing factors under physiological and pathological conditions, and is defined by morphological and biochemical changes characteristic of apoptotic cells. Apoptosis is distinguished from necrosis (necrosis), a passive decay process in which normal cells undergo severe damage such as burns and bruises and die.
[0004]
Induction of apoptosis includes biological factors such as elimination of signals and growth factors by hormones and cytokines, physical factors such as radiation and heat, and chemical factors such as drugs. Cell death occurs through a variety of processes that ultimately center on DNA fragmentation.
[0005]
Apoptosis is a physiological cell death indispensable for normal development and differentiation, and occurs in individual cells during cell rotation of normal living tissues. Therefore, excessive suppression of apoptosis causes many functional disorders.
[0006]
Specifically, these disorders caused by inhibition of apoptosis include cancer, proliferative skin disease, rheumatoid arthritis, HIV infection, hepatitis, renal disease and the like, but none of them have effective therapeutic agents yet. At present, therapeutic and ameliorating drugs with high clinical utility have been demanded.
[0007]
On the other hand, in recent years, as one of various recognition and response functions of microorganisms, a mechanism called quorum sensing, which senses and responds to the number of surrounding cells, is known. There is a substance called auto-inducer in this signal transduction mechanism, and information is transmitted between microorganisms through this auto-inducer, promoting gene transcription activity, expressing pathogenicity, producing antibiotics, etc. There is a wide range of regulation of biochemical and physiological functions. This quorum sensing has been found in many Gram-negative bacteria, and acylated homoserine lactones have been reported as typical autoinducers. And it is clear that acylated homoserine lactones are involved in various activities of microorganisms. These activities include the production of extracellular enzymes in the plant pathogens Erwinia carotovora and the causative agent of cystic fibrosis Pseudomonas aeruginosa, and Agrobacterium tumefaciens (Agrobacterium tumefaciens) and the introduction of a Ti plasmid into a plant are known.
[0008]
However, there is very little knowledge about the effects of acylated homoserine lactones on the activity and the like of animal cells, and further, it was not known at all that the effects on the apoptosis of cells.
[0009]
[Non-patent document 1]
Br. J. Cancer 26, 239-257, 1972
[Non-patent document 2]
J. Pathol. 111, 85-94, 1973
[Non-Patent Document 3]
Science 154, 605-612, 1966
[Non-patent document 4]
Rev .. Cell. Biol. 7, 663-698, 1991
[Non-Patent Document 5]
Lancet 341, 1251-1254, 1993
[0010]
[Problems to be solved by the invention]
An object of the present invention is to provide an apoptosis-inducing agent useful for preventing and / or treating a disorder caused by suppression of apoptosis.
[0011]
[Means for Solving the Problems]
The present inventors have conducted intensive studies to achieve the above object, and found that acylated homoserine lactones inhibit the activity of Akt, an enzyme essential for cell survival, and effectively induce apoptosis. And completed the present invention.
[0012]
That is, the present invention includes the following inventions.
(1) Formula I:
Embedded image

[Wherein, R is a linear or branched optionally substituted acyl group having 4 to 30 carbon atoms]
An Akt inhibitor comprising a compound represented by the formula:
(2) The Akt inhibitor according to (1), wherein R is a linear or branched acyl group having 4 to 30 carbon atoms and having an oxo group at the 3-position.
(3) An apoptosis-inducing agent comprising the Akt inhibitor according to (1) or (2).
(4) Formula I:
Embedded image

[Wherein, R has the same meaning as (1)]
A method for inducing apoptosis in cells using the compound represented by the formula:
[0013]
BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION
In the present invention, formula I:
Embedded image

Are referred to as acylated homoserine lactones.
[0014]
In the formula I, R is a linear or branched optionally substituted acyl group having 4 to 30, preferably 8 to 20, and more preferably 10 to 14 carbon atoms. Examples include a hydroxyl group, an oxo group, and a methyl group. An unsubstituted saturated aliphatic acyl group and a saturated aliphatic acyl group having an oxo group at the 3-position are preferred. Moreover, it is preferable that it is linear.
[0015]
Specific examples of R are not particularly limited, and include, for example, a butyryl group, a 3-oxobutyryl group, a 3-hydroxybutyryl group, an isobutyryl group, a valeryl group, a 3-oxovaleryl group, an isovaleryl group, and a 3-oxoisovaleryl group. Pivaloyl group, hexanoyl group, 3-oxohexanoyl group, heptanoyl group, 3-oxoheptanoyl group, octanoyl group, 3-oxooctanoyl group, nonanoyl group, 3-oxononanoyl group, decanoyl group, 3-oxodecanoyl group, Undecanoyl group, 3-oxoundecanoyl group, lauroyl group, 3-oxododecanoyl group, tridecanoyl group, 3-oxotridecanoyl group, tetradecanoyl group, 3-oxotetradecanoyl group, pentadecanoyl group, 3-oxopentadecanoyl group, palmitoyl group, 3 Oxopalmitoyl group, heptadecanoyl group, 3-oxoheptadecanoyl group, stearoyl group, 3-oxostearoyl group, nonadecanoyl group, 3-oxononadecanoyl group, icosanoyl group, 3-oxoicosanoyl group, triacontanoyl group , 3-oxotricontanoyl, myristoyl, 3-oxomyristoyl, pyruvoyl and the like.
[0016]
Specific examples of the acylated homoserine lactone represented by the formula I include, but are not particularly limited to, for example, N-butyryl-L-homoserine lactone, N- (3-oxobutyryl) -L-homoserine lactone, N- (3 -Hydroxybutyryl) -L-homoserine lactone, N-isobutyryl-L-homoserine lactone, N-valeryl-L-homoserine lactone, N- (3-oxovaleryl) -L-homoserine lactone, N-isovaleryl-L-homoserine lactone , N- (3-oxoisovaleryl) -L-homoserine lactone, N-pivaloyl-L-homoserine lactone, N-hexanoyl-L-homoserine lactone, N- (3-oxohexanoyl) -L-homoserine lactone, N-heptanoyl-L-homoserine lactone, N- (3-oxohepta Yl) -L-homoserine lactone, N-octanoyl-L-homoserine lactone, N- (3-oxooctanoyl) -L-homoserine lactone, N-nonanoyl-L-homoserine lactone, N- (3-oxononanoyl) -L -Homoserine lactone, N-decanoyl-L-homoserine lactone, N- (3-oxodecanoyl) -L-homoserine lactone, N-undecanoyl-L-homoserine lactone, N- (3-oxoundecanoyl) -L-homoserine lactone , N-lauroyl-L-homoserine lactone, N- (3-oxododecanoyl) -L-homoserine lactone, N-tridecanoyl-L-homoserine lactone, N- (3-oxotridecanoyl) -L-homoserine lactone, N-tetradecanoyl-L-homoserine lactone, -(3-oxotetradecanoyl) -L-homoserine lactone, N-pentadecanoyl-L-homoserine lactone, N- (3-oxopentadecanoyl) -L-homoserine lactone, N-palmitoyl-L-homoserine lactone N- (3-oxopalmitoyl) -L-homoserine lactone, N-heptadecanoyl-L-homoserine lactone, N- (3-oxoheptadecanoyl) -L-homoserine lactone, N-stearoyl-L-homoserine lactone, N -(3-oxostearoyl) -L-homoserine lactone, N-nonadecanoyl-L-homoserine lactone, N- (3-oxononanodecanoyl) -L-homoserine lactone, N-icosanoyl-L-homoserine lactone, N- ( 3-oxoicosanoyl) -L-homoserine lactone, N-triacontanoyl-L-homoserine lactone, N- (3-oxotriacontanoyl) -L-homoserine lactone, N-myristoyl-L-homoserine lactone, N- (3-oxomyristoyl) -L-homoserine lactone and N-pyruvoyl-L-homoserine lactone and the like.
[0017]
Particularly, N- (3-oxodecanoyl) -L-homoserine lactone, N- (3-oxoundecanoyl) -L-homoserine lactone, N- (3-oxododecanoyl) -L-homoserine lactone, N- (3 -Oxotridecanoyl) -L-homoserine lactone and N- (3-oxotetradecanoyl) -L-homoserine lactone are preferred.
[0018]
The acylated homoserine lactone of the present invention can be synthesized, for example, by forming an amide bond between an aliphatic carboxylic acid or an ester thereof and a cyclic amino acid. Acylated homoserine lactones are described in, for example, Chhabra, S .; R. , P .; Stead, N.W. J. Bainton, G .; P. C. Salmond, G .; S. A. B. Stewart, P .; Williams, and B.W. W. Bycroft, J. et al. Antibiot. , 46, 441-454, 1993; Zhang, L .; , P .; J. Murphy, A .; Kerr, and M.S. E. FIG. Tate, Nature, 362, 446-448, 1993; L. , B. L. Hanzelka, A .; Eberhard, and E.H. P. Greenberg, J .; Bacteriol. 178, 2897-2901, 1996; Gao, J .; G. FIG. and E. A. Meighen. J. Bacteriol. , 175, 3856-3862, 1993 and the like.
[0019]
Further, since the acylated homoserine lactone of the present invention is biosynthesized by a microorganism, it can be separated and purified from a culture obtained by culturing the microorganism by a method generally used in the art.
[0020]
The present inventors reacted acylated homoserine lactones with various animal cells, and measured Akt activity in the cells by Western blotting. As a result, the specific acylated homoserine lactones showed an effect on the phosphorylation activity of Akt. It was found that it inhibits.
[0021]
In the present invention, Akt is a serine / threonine kinase that is activated downstream of PI3K (phosphatidylinositide 3-OH kinase), and the PI3K-Akt pathway is known as one of survival signaling pathways. It has also been reported that Akt has an activity of inhibiting apoptosis in cells (Table 2002-528390).
[0022]
In the present invention, apoptosis has the meaning commonly used in the art, that is, cell death actively caused by cells themselves under physiological conditions. The form of apoptosis is characterized by nuclear chromosome aggregation, nuclear fragmentation, loss of cell surface microvilli, and chromatin condensation. The cells atrophy, and the contents of the cells are not released outside the cells but are immediately taken up by surrounding cells such as macrophages, so that no inflammation is caused and the surrounding cells are not affected. On the other hand, necrosis (necrosis) caused by deterioration of the environment differs greatly in that the contents of cells are released.
[0023]
From the above characteristics, apoptosis in cells can be detected by various methods. The method for detecting apoptosis is not particularly limited. For example, a method of observing chromatin condensation with a fluorescence microscope after staining with a DNA-binding fluorescent dye such as aminobenzimide (Hoechst 33342, 33582, and 333258), a method of observing fragmented DNA, A method of extracting and separating by centrifugation and quantifying by colorimetry, a method of detecting fragmented DNA as a "ladder" by agarose gel electrophoresis, and a TUNEL (terminal deoxynucleotidyl transferase) for histochemically detecting the fragmented DNA. -Mediated dUTP-biotin nickel and labeling).
[0024]
Cells capable of inducing apoptosis by the apoptosis-inducing agent of the present invention are not particularly limited, but include plant cells and animal cells, and can specifically effectively induce apoptosis of animal cells.
[0025]
According to the present invention, it has been found that acylated homoserine lactones effectively inhibit the activity of Akt on cancer cells. Therefore, acylated homoserine lactones can be used as an Akt inhibitor in cancer cells. Furthermore, by allowing the acylated homoserine lactones to act on the cancer cells, a decrease in the cell viability of the cancer cells and aggregation of chromatin were observed. It was also found that it effectively induced apoptosis. Therefore, the acylated homoserine lactone of the present invention can be used as an active ingredient in an anticancer agent.
[0026]
In the present invention, an Akt inhibitor refers to an agent that inhibits Akt activation, ie, phosphorylation, and an agent that inactivates activated Akt. For example, an agent that inhibits Akt activation in animal cells, Examples of the agent include an agent that inhibits the normal localization of Akt in cells, an agent that inhibits the action of a substance that activates Akt, and an agent that degrades an Akt activator.
[0027]
Furthermore, since the acylated homoserine lactones represented by the formula I have different Akt inhibitory activities depending on the type of R group, the apoptosis-inducing effect can be regulated by changing and modifying the R group. It is also considered that by using a plurality of types of acylated homoserine lactones having different R groups in combination, it is possible to control the change in Akt activity and regulate the pharmacological effect.
[0028]
Diseases that can be treated by the apoptosis-inducing agent containing the acylated homoserine lactone of the present invention as an active ingredient are not particularly limited, and include, for example, ovaries, breast, pancreas, skin, lung, brain, kidney, liver, nasopharyngeal cavity, Cancer present in tissues selected from the group consisting of central nervous system, prostate, colon, colon, rectum, cervix and endometrium, and proliferative skin disease, rheumatoid arthritis, HIV infection, hepatitis, kidney disease And other diseases caused by suppression of apoptosis. In particular, it is suitably used in the treatment of gastrointestinal cancer such as colon cancer and skin cancer.
[0029]
In the apoptosis-inducing agent of the present invention, the acylated homoserine lactone may be a hydrate. Further, the acylated homoserine lactone according to the present invention may be in a free form or a pharmacologically acceptable salt thereof. When a salt is formed, specific examples thereof include an addition salt of an alkali metal, an addition salt of an alkaline earth metal, an ammonium salt, an addition salt of an amine, and the like.
[0030]
Next, the dosage form of the acylated homoserine lactone of the present invention includes, for example, oral preparations such as powders, fine granules, granules, tablets, coated tablets and capsules, external preparations such as ointments and patches, and suppositories. And injectable preparations. At the time of formulation, it can be produced by a conventional method using a usual formulation carrier.
[0031]
That is, in manufacturing an oral preparation, after adding an acylated homoserine lactone and an excipient, and further, if necessary, an antioxidant, a binder, a disintegrant, a lubricant, a coloring agent, a flavoring agent, and the like, Powders, fine granules, granules, tablets, coated tablets, capsules and the like are prepared by a conventional method.
[0032]
As an excipient, for example, lactose, corn starch, sucrose, glucose, mannitol, sorbitol, crystalline cellulose, silicon dioxide, etc., as a binder, for example, polyvinyl alcohol, polyvinyl ether, methyl cellulose, ethyl cellulose, gum arabic, tragacanth, gelatin, Shellac, hydroxypropylmethylcellulose, hydroxypropylcellulose, polyvinylpyrrolidone, polypropylene glycol polyoxyethylene block polymer, meglumine, etc., as disintegrants, for example, starch, agar, gelatin powder, crystalline cellulose, calcium carbonate, sodium hydrogen carbonate, Calcium citrate, dextrin, pectin, carboxymethylcellulose / calcium and the like, as lubricants, for example, talc, polyethylene Glycols, silicas, hydrogenated vegetable oils, etc. are permitted to be added to pharmaceuticals as coloring agents, but as flavoring agents, cocoa powder, peppermint brain, aromatic powder, peppermint oil, dragon brain, cinnamon powder, etc. Used. These tablets and granules may be sugar-coated, or may be appropriately coated as necessary.
[0033]
When preparing an injectable preparation, a pH adjuster, a solubilizer, an isotonic agent and the like, and if necessary, a solubilizer, a stabilizer, an antioxidant, etc. are added to the acylated homoserine lactone. It is formulated by an ordinary method.
[0034]
The method for producing the external preparation is not limited, and it can be produced by a conventional method. That is, as a base material used for formulation, various raw materials usually used for pharmaceuticals, quasi-drugs, cosmetics, and the like can be used.
[0035]
Specific examples of the base material used include animal and vegetable oils, mineral oils, ester oils, waxes, higher alcohols, fatty acids, silicone oils, surfactants, alcohols, polyhydric alcohols, and highly water-soluble. Raw materials such as molecules, clay minerals, and purified water can be mentioned, and if necessary, a pH adjuster, an antioxidant, a chelating agent, a preservative and fungicide, a coloring agent, a fragrance, and the like can be added. The base material of the external preparation according to the present invention is not limited to these. If necessary, components such as a blood flow promoting agent, a bactericide, an anti-inflammatory agent, a cell activator, vitamins, amino acids, a humectant, a keratolytic agent, and the like can be added. The amount of the base material to be added is an amount that usually gives a concentration set in the production of an external preparation.
[0036]
The clinical dose of the acylated homoserine lactone, which is the active ingredient of the apoptosis-inducing agent in the present invention, varies depending on the animal to be administered, symptoms, severity, age, body weight, complications, etc., and the type and administration of salt Although it varies depending on the route and the like, it is usually 1 μg to 1 g, preferably 10 μg to 200 mg, more preferably 20 μg to 20 mg per adult day.
[0037]
The administration target of the apoptosis-inducing agent of the present invention is not particularly limited as long as it is an animal, and includes mammals, for example, horses, dogs, mice, guinea pigs, rats, and the like. In particular, it is suitably used for humans.
[0038]
【Example】
In the following Examples, the experimental materials described below were used unless otherwise specified.
[0039]
Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM), fetal calf serum (FCS), non-essential amino acids (NEAA), and penicillin / streptomycin (P / S) used for cell culture were purchased from SIGMA. Dimethyl sulfoxide (DMSO) used as a solvent for N-acyl-L-homoserine lactone (AHL) was obtained from Wako Pure Chemical Industries, Ltd. The kinase inhibitors PD98059 and SB203580 were purchased from CALBIOCHEM. For protein quantification, PICA BCA Protein Assay Reagent was used. Antibodies from the following companies were used. Anti-phosphorylated-Akt (Ser473) antibody, anti-cleared caspase-3 antibody, anti-cleared caspase-9 (D330) antibody, anti-Cleared PARP (D214) antibody, HRP-labeled anti-rabbit IgG antibody Cell Signaling. HRP-labeled anti-mouse IgG antibody was from SANTA CRUZ BIOTECHNOLOGY. Anti-α-tubulin antibody (Ab-1) was from CALBIOCHEM.
[0040]
Example 1 Akt Analysis of activity by Western blot
(1) Change in Akt activity in CaCo-2 cells stimulated by acylated homoserine lactone
The human colon cancer carcinoma cell line CaCo-2 was purchased from American Type Culture Collection (ATCC) and contained 10% FCS, 1% NEAA, 1% P / S (100 units / ml penicillin, 100 μg / ml streptomycin) in DMEM medium. At 37 ° C, 5% CO₂Cultured in the presence.
[0041]
Using a 6 cm dish (NUNC), 6 × 10 CaCo-2 cells per dish⁵After seeding and washing twice with phosphate buffered saline (PBS) (-), the cells were cultured in a serum-free DMEM medium containing 1% NEAA for 24 hours. Thereafter, homoserine lactone hydrochloride, N-butyryl-L-homoserine lactone, N- (3-oxohexanoyl) -L-homoserine lactone, N- (3-oxododecanyl) -L-homoserine lactone were added at a final concentration of 100 μM. Each was added and allowed to react for 10 minutes. The purified acylated homoserine lactone was dissolved in DMSO so as to be 400 times the desired final concentration and used after filter sterilization (φ0.22 μm). DMSO at a final concentration of 0.25% was used as a control. Also, α-tubulin was used as an internal standard.
[0042]
After the reaction, the plate was washed twice with cold PBS (-) and frozen at -80 ° C. Thaw cells on ice and add lysis buffer (50 mM HEPES, pH 7.5, 50 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1.5 mM MgCl₂1% Triton X-100, 10% glycerin, 10 mM sodium pyrophosphate, 1 mM Na₃VO₄, 100 mM NaF, 1 mM PMSF, 10 μg / ml aprotinin, 10 μg / ml leupeptin), and the cells were scraped off with a scraper. This was allowed to stand on ice for 20 minutes, and then centrifuged at 14000 rpm at 4 ° C. for 15 minutes to collect the supernatant. The concentration of the recovered protein was measured, and the equivalent of 50 μg was subjected to SDS-PAGE. After the electrophoresis, blotting was performed on a PVDF membrane. When measuring phosphorylated Akt, blocking was performed with 5% skim milk / Tris buffered saline containing 0.1% Tween 20 (TBS-T), and anti-phosphorylated-Akt (Ser437) was applied to each of the primary antibodies. HRP-labeled anti-rabbit IgG antibody was used as the secondary antibody. Α-tubulin used as an internal standard was blocked with 5% bovine serum albumin (BSA) / TBS-T, and the primary antibody was anti-α-tubulin (Ab-1) and the secondary antibody was HRP. A labeled anti-mouse IgG antibody was used. Renaissance for band detection^TM  WesternBlot Chemiluminescence 2555861 Reagent Plus (NEN) or Western Blotting Luminol Reagent (Santa Cruz Biotechnology) was used. The results are shown in FIG. In the figures referred to below, HSL represents homoserine lactone hydrochloride, C4-HSL represents N-butyryl-L-homoserine lactone, and 3-oxo-C6-HSL represents N- (3-oxohexanoyl) -L. -Homoserine lactone, 3-oxo-C12-HSL means N- (3-oxododecanyl) -L-homoserine lactone.
[0043]
Akt is normally phosphorylated (activated) in CaCo-2 cells, but only when N- (3-oxododecanoyl) -L-homoserine lactone is added, the phosphorylation level of Akt is significantly reduced. . That is, it became clear that N- (3-oxododecanoyl) -L-homoserine lactone inhibited Akt activation.
[0044]
(2) N- (3-oxododecanoyl) -L-homoserine lactone concentration-dependent change in Akt activity in CaCo-2 cells
After the cell culture, N- (3-oxo-dodecanoyl) -L-homoserine lactone at a final concentration of 0 μM (0.25% DMSO), 1 μM, 10 μM, 30 μM, and 100 μM was added and reacted for 10 minutes. Akt activity was analyzed by Western blot in the same manner as in (1) (FIG. 2).
[0045]
FIG. 3 shows the results of quantifying the intensity of the band in FIG. 2 by LAS-1000 and quantifying the intensity. At a concentration of 10 μM or more, the phosphorylation level of Akt was significantly reduced. At 10 μM, 30 μM, and 100 μM, the activity decreased to 79%, 31%, and 14%, respectively, at the time of no stimulation.
[0046]
From the above, it was revealed that in CaCo-2 cells, the activity of Akt was significantly inhibited at 10 μM or more of acylated homoserine lactone.
[0047]
(3) Time course of Akt activity in CaCo-2 cells stimulated by N- (3-oxododecanoyl) -L-homoserine lactone
After cell culture, N- (3-oxododecanoyl) -L-homoserine lactone at a final concentration of 30 μM and 100 μM was added, and the stimulation time with the acylated homoserine lactone was shortened by 0, 5, 10, 30, and 60 minutes, respectively. Course (Fig. 4), 0, 10 minutes, 60 minutes, 2 hours, 4 hours, 6 hours, 8 hours, 10 hours Long time course (Fig. 5) Akt activity was measured by Western blot. The inhibition of Akt activity upon stimulation at 30 μM peaked at 5 minutes, lasted up to 60 minutes, and returned to basal levels in 2 hours. On the other hand, Akt activity inhibition at the time of 100 μM stimulation peaked at 5 minutes and continued until 6 hours.
[0048]
(4) Changes in Akt activity of N- (3-oxododecanyl) -L-homoserine lactone in porcine vascular endothelial cells
The porcine vascular endothelial cell line (PEC) was grown at 37 ° C., 5% CO 2 using DMEM medium containing 10% FCS, 1% NEAA, 1% P / S (100 units / ml penicillin, 100 μg / ml streptomycin).₂Cultured in the presence.
[0049]
Using a 6 cm dish (NUNC), 6 × 10 5 PEC cells per dish⁵  After seeding and washing twice with phosphate buffered saline (PBS) (-), the cells were cultured in a serum-free DMEM medium containing 1% NEAA for 24 hours. Thereafter, homoserine lactone hydrochloride, N-butyryl-L-homoserine lactone, N- (3-oxohexanoyl) -L-homoserine lactone, N- (3-oxododecanyl) -L-homoserine lactone were added at a final concentration of 100 μM. Each was added and allowed to react for 10 minutes. As in (1), the effect of acylated homoserine lactones on the activity of Akt in PEC cells was examined by Western blotting. FIG. 6 shows the results.
[0050]
The results of Western blotting revealed that N- (3-oxododecanoyl) -L-homoserine lactone significantly reduced Akt activity in PEC cells.
[0051]
The above results indicate that certain acylated homoserine lactones induce apoptosis in PEC cells.
[0052]
Example 2 Trypan blue Evaluation of survival rate by staining
CaCo-2 cells were placed in a 3.5 cm dish (NUNC) at 2 × 10⁵  After seeding and washing twice with PBS (-), the cells were cultured in a serum-free DMEM medium containing 1% NEAA for 24 hours. Various drugs [N- (3-oxododecanoyl) -L-homoserine lactone having a final concentration of 1 to 100 µM was added and cultured for 12 hours. 0.25% DMSO was used as a control. Thereafter, the supernatant and cells detached from the dish with trypsin-EDTA (TE) were centrifuged at room temperature for 5 minutes at 800 rpm, the supernatant was removed, and diluted with 200 μl of DMEM. 50 μl of the solution was placed in an Eppendorf tube, an equal volume of Trypan blue stain was added, and the number of cells was measured using a hemocytometer. At this time, the total number of dead cells and living cells to be measured was 200 or more.
[0053]
A significant decrease in the survival rate was observed depending on the concentration of N- (3-oxododecanyl) -L-homoserine lactone. 10 μM, 30 μM, and 100 μM of N- (3-oxododecanoyl) -L-homoserine lactone reduced the viability to 90%, 55%, and 51%, respectively (FIG. 7). The result that the survival rate is significantly reduced at a concentration of 30 μM or more is also consistent with the fact that Akt activity inhibition was remarkably observed at around 30 μM in Western blot analysis. In addition, the survival rate of both control and 0.25% DMSO was 94%, and the survival rate of 1% M- (3-oxododecanoyl) -L-homoserine lactone was 94%. The impact on rates is considered negligible.
[0054]
Example 3 Hoechst33342 Observation of chromatin condensation by staining and judgment of apoptosisIn order to determine whether the CaCo-2 cell death observed in Example 2 was apoptosis or necrosis, it was morphologically evaluated using the chromatin-stained fluorescent dye Hoechst 33342.
[0055]
CaCo-2 cells were placed on 8-well culture slides (Collagen I cellware biocoat Becton Dickson) at 2 × 10⁴After seeding and washing twice with PBS (-), the cells were cultured in a serum-free DMEM medium containing 1% NEAA for 24 hours. After adding 3-oxo-dodecanoyl homoserine lactone at each concentration (1 to 100 μM) and culturing for 12 hours, the cells were fixed with 4% paraformaldehyde-3% sucrose / PBS and chromatin using the fluorescent dye Hoechst 33342. The cells were stained and observed under a fluorescence microscope. Five fields of view were randomly selected at a magnification of 400 ×, apoptotic cells and normal cells were counted, the ratio of apoptotic cells was calculated, and this was repeated three or more times with n = 1.
[0056]
At a concentration of N- (3-oxododecanoyl) -L-homoserine lactone of 10 μM or more, apoptotic cells that caused chromatin condensation were observed. However, only normal cells were observed with 0.25% DMSO and 1 μM N- (3-oxododecanoyl) -L-homoserine lactone (FIG. 8). FIG. 9 shows the results of quantifying apoptosis by counting apoptotic cells in which chromatin condensation was observed. The ratio of apoptotic cells to the total number of cells was 15%, 39%, and 50% with N- (3-oxododecanyl) -L-homoserine lactone at 10 μM, 30 μM, and 100 μM, respectively. This value is consistent with the survival rate. Therefore, cell death of CaCo-2 by N- (3-oxododecanoyl) -L-homoserine lactone was determined to be due to apoptosis.
[0057]
Example 4 DNA Evaluation of apoptosis by fragmentation
As an alternative to determine whether the CaCo-2 cell death observed in Example 2 was apoptosis or necrosis, DNA fragmentation was evaluated.
[0058]
5 × 10 CaCo-2 cells⁶Seeds / 15 cm dish (NUNC), washed twice with PBS (-), cultured in a serum-free DMEM medium containing 1% NEAA for 24 hours, and N- (3-oxododecanoyl) -L-homoserine After adding lactone at each concentration of 1 μM to 100 μM, the cells were cultured for 12 hours. Thereafter, the supernatant and the cells detached from the dish with TE were centrifuged at room temperature at 800 rpm for 5 minutes to remove the supernatant. The cells were suspended in 300 μl of PBS (−) and centrifuged again at 4 ° C. and 2500 rpm for 5 minutes to remove the supernatant. The cells are lysed by adding 300 μl of a cell lysis buffer [10 mM Tris-HCl (pH 7.4), 10 mM EDTA (pH 8.0), 0.5% Triton X-100], and placed on ice for 10 minutes. To extract a DNA fragment. This was centrifuged at 14000 rpm at 4 ° C. for 10 minutes, RNase A was added to the supernatant, and the mixture was incubated at 37 ° C. for 1 hour. Further, proteinase K was added and incubated at 50 ° C. for 30 minutes. The DNA fragment extract was concentrated by ethanol precipitation, and electrophoresed on a 2% agarose gel. After staining the gel with ethidium bromide, DNA fragmentation was detected under a UV transilluminator.
[0059]
DNA ladder was detected in CaCo-2 cells cultured for 12 hours in the presence of 0 μM, 1 μM, 10 μM, 30 μM, and 100 μM N- (3-oxododecanoyl) -L-homoserine lactone. As a result, a ladder was confirmed (FIG. 10).
[0060]
Example 5 caspase Activity measurement
The activity of caspase (caspase-3, caspase-9) and PARP (poly-ADP ribose polymerase) was determined by Western blot analysis using an anti-active caspase-3 antibody, that is, an anti-Clasped caspase-3 antibody, an anti-caspase-3 antibody, and an anti-caspase-3 antibody. The measurement was carried out in the same manner as in Example 1 using a cleaved caspase-9 antibody (D330) and an anti-Cleaved PARP antibody (D214), respectively.
[0061]
N- (3-oxododecanoyl) -L-homoserine lactone having a final concentration of 30 μM and 100 μM was added to the cultured CaCo-2 cells, and the mixture was sequentially added for 0 hour, 1 hour, 2 hours, 4 hours, and 6 hours. After 8 hours and 10 hours of culture, caspase-3, caspase-9 and PARP activities were analyzed by Western blot. The results are shown in FIG. At 30 μM, activated caspase-3 was detected 1 hour after stimulation, and its activity lasted up to 4 hours, whereas at 100 μM, activity peaked at 6 hours after stimulation and lasted up to 10 hours. Each membrane was reprobed to detect Cleared-type caspase-9 and Cleared-type PARP. The caspase-9 activity was strong at 1, 2, and 4 hours with 30 μM stimulation, and weak activity lasted up to 8 hours, whereas strong activity lasted up to 8 hours with 100 μM stimulation. The behavior of the cleaned-type PARP was the same as that of the cleared-type caspase-9.
[0062]
Next, a 3-hour reaction with N- (3-oxododecanyl) -L-homoserine lactone was carried out at concentrations of 0, 1, 10, 30, and 100 μM, respectively, and the caspase and PARP activities were measured. As shown in FIG. 12, Cleaved caspase and Cleaved PARP were detected only at the concentrations of 30 μM and 100 μM. This result was consistent with the fact that the inhibition of Akt activity, the decrease in viability, and the appearance of apoptotic cells by Western blot analysis significantly occurred at 30 μM or more.
[0063]
【The invention's effect】
According to the present invention, it is possible to effectively induce apoptosis in cells, and to provide a useful means for preventing and / or treating a disorder caused by suppression of apoptosis.
[Brief description of the drawings]
FIG. 1 shows DMSO, homoserine lactone hydrochloride, N-butyryl-L-homoserine lactone, N- (3-oxohexanoyl) -L-homoserine lactone and N- (3-oxododecanyl)-in CaCo-2 cells. It is a figure showing the change of Akt activity by L-homoserine lactone stimulation.
FIG. 2 is a graph showing a change in Akt activity depending on the concentration of N- (3-oxododecanoyl) -L-homoserine lactone in CaCo-2 cells.
FIG. 3 is a diagram showing the results of quantifying and digitizing the intensity of the phosphorylated Akt band in FIG. 2 using LAS-1000.
FIG. 4 is a diagram showing a time-dependent change in Akt activity in CaCo-2 cells stimulated by N- (3-oxododecanyl) -L-homoserine lactone.
FIG. 5 is a graph showing the time course of Akt activity in CaCo-2 cells stimulated with N- (3-oxododecanyl) -L-homoserine lactone.
FIG. 6 shows DMSO, homoserine lactone hydrochloride, N-butyryl-L-homoserine lactone, N- (3-oxohexanoyl) -L-homoserine lactone and N- (3-oxododecanyl)-in porcine vascular endothelial cells. It is a figure showing the change of Akt activity by L-homoserine lactone stimulation.
FIG. 7 shows the results of evaluating cell viability in the presence of acylated homoserine lactone by Trypan blue staining.
FIG. 8 shows the results of determining apoptosis of cells in the presence of acylated homoserine lactone by chromatin condensation using Hoechst 33342 staining.
FIG. 9 shows the results of quantification of apoptosis by counting apoptotic cells in which chromatin condensation was observed.
FIG. 10 shows the results of evaluating DNA fragmentation to determine whether cell death of CaCo-2 is apoptosis or necrosis.
FIG. 11 shows the results of a measurement of the culture time dependence of caspase activity in the presence of acylated homoserine lactone, as measured by Western blot.
FIG. 12 shows the results obtained by measuring the dependence of the activity of acylamine on the concentration of acylated homoserine lactone by Western blot.

Claims (4)

Formula I:

[Wherein, R is a linear or branched optionally substituted acyl group having 4 to 30 carbon atoms]
An Akt inhibitor comprising a compound represented by the formula: The Akt inhibitor according to claim 1, wherein R is a linear or branched acyl group having 4 to 30 carbon atoms having an oxo group at the 3-position. An apoptosis-inducing agent comprising the Akt inhibitor according to claim 1. Formula I:

[Wherein, R is as defined in claim 1]
A method for inducing apoptosis in cells using the compound represented by the formula:

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