JP2011126791A - Substances for inhibiting expression of genes for sensitivity to allergic disorders - Google Patents

Substances for inhibiting expression of genes for sensitivity to allergic disorders Download PDF

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裕行 福井
Hiroyuki Mizuguchi
博之 水口
Yoshihisa Takaishi
喜久 高石
Yoshiki Kashiwada
良樹 柏田
Hisao Nemoto
尚夫 根本
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Abstract

<P>PROBLEM TO BE SOLVED: To provide a substance for inhibiting the expression of genes for sensitivity to allergic disorders, targeting the expression mechanism of genes for sensitivity to allergic disorders. <P>SOLUTION: The substance for inhibiting the expression of genes for sensitivity to allergic disorders is represented by general formula (I) (wherein, R is hydrogen, or a saturated or unsaturated aliphatic hydrocarbon group having a straight chain or a branched structure, or an optionally substituted cycloalkyl group, aryl group, aralkyl group, alkyloxy group, alkenyloxy group, alkynyloxy group, aryloxy group, or aralkyloxy group, or a residue of sugar). <P>COPYRIGHT: (C)2011,JPO&INPIT

Description

本発明は、アレルギー疾患の新規治療薬の開発に際し、アレルギー疾患感受性遺伝子の発現機構を標的としたアレルギー疾患感受性遺伝子発現抑制物質に関する。さらには、当該アレルギー疾患感受性遺伝子発現抑制物質の新規合成方法に関する。   The present invention relates to an allergic disease susceptibility gene expression inhibitor that targets an allergic disease susceptibility gene expression mechanism in the development of a novel therapeutic agent for allergic diseases. Further, the present invention relates to a novel method for synthesizing the allergic disease susceptibility gene expression-suppressing substance.

免疫システムは、抗原を排除して体を守るために働く生体の機能であるが、この免疫反応が過度に、又は不適当な形で起こる場合があり、このような場合には組織障害、即ちアレルギー疾患を発症することがある。アレルギー疾患は、以下の機構により生ずる。アレルゲンが生体内に侵入すると、マクロファージ及びＴリンパ球を介して刺激されたＢリンパ球により、アレルゲン特異的ＩｇＥ抗体が産生される。この抗体がマスト細胞（肥満細胞）に付着すると、マスト細胞は感作された状態となり、この状態の中に、再度アレルゲンが侵入すると、この感作されたマスト細胞表面上の高親和性IgEレセプター（FCεRI）とアレルゲンが反応する。その結果、マスト細胞から多様な生理活性を有するヒスタミンやロイコトリエンなどのメディエーターが遊離し、平滑筋の収縮や血管透過性亢進が惹起され炎症が生じる。   The immune system is a biological function that works to eliminate antigens and protect the body, but this immune response may occur excessively or inappropriately, in which case tissue damage, i.e. May develop allergic diseases. Allergic diseases are caused by the following mechanisms. When allergens enter the body, allergen-specific IgE antibodies are produced by B lymphocytes stimulated via macrophages and T lymphocytes. When this antibody adheres to mast cells (mast cells), the mast cells become sensitized, and when allergen enters again in this state, the high affinity IgE receptor on the surface of the sensitized mast cells. (FCεRI) reacts with allergen. As a result, mediators such as histamine and leukotriene having various physiological activities are released from mast cells, causing smooth muscle contraction and increased vascular permeability, resulting in inflammation.

例えばヒスタミンは、上述の如くアレルギー疾患の主要メディエーターであり、標的細胞のヒスタミンH1受容体（以下、単に「H1R」という場合もある。）を解して主要な症状が発現される。抗ヒスタミン薬はH1Rを介するシグナルの遮断を利用したアレルギー疾患治療薬である。一方、アレルギー疾患は代表的な多因子疾患である。アレルギー疾患において発現異常が引き起こされている疾患関連遺伝子として、H1R遺伝子などが見出されている。これらのアレルギー疾患感受性遺伝子を標的とするアレルギー疾患治療薬の意義について、本発明者により報告されている（非特許文献１）。 For example, histamine is a major mediator of allergic diseases as described above, and major symptoms are expressed through the histamine H 1 receptor (hereinafter sometimes simply referred to as “H 1 R”) of target cells. Antihistamines are therapeutic agents for allergic diseases using blocking of signals through H 1 R. On the other hand, allergic diseases are typical multifactorial diseases. H 1 R genes and the like have been found as disease-related genes that cause abnormal expression in allergic diseases. The significance of therapeutic agents for allergic diseases that target these allergic disease susceptibility genes has been reported by the present inventor (Non-patent Document 1).

インターロイキン4（以下、単に「IL-4」という。）は、代表的なTh2サイトカインで、活性化されたＴ細胞や肥満細胞などから放出され、Ｂ細胞を活性化するほか、免疫学的にコンピテントな細胞の増殖及び分化に対して重要な効果を有するサイトカインであるため、IL-4遺伝子はアレルギー疾患感受性遺伝子と考えられる。   Interleukin 4 (hereinafter simply referred to as “IL-4”) is a representative Th2 cytokine that is released from activated T cells and mast cells to activate B cells and immunologically. Since it is a cytokine having an important effect on the proliferation and differentiation of competent cells, the IL-4 gene is considered to be an allergic disease susceptibility gene.

マーキアイン(Maackiain)は、フラボノイドの一種でありプテロカルパン誘導体に分類される天然物由来化合物であり、苦参やその他の植物からも単離されることが確認されている。マーキアインは、制癌剤（特許文献１、２）やNa+／グルコトランスポーター阻害剤（特許文献３）として報告されている。しかしながら、マーキアインの抗アレルギー作用に関する報告はない。   Maackiain is a kind of flavonoid and is a natural product-derived compound classified as a pterocarpan derivative, and it has been confirmed to be isolated from bitterns and other plants. Markiain has been reported as an anticancer agent (Patent Documents 1 and 2) and a Na + / gluco transporter inhibitor (Patent Document 3). However, there is no report on the antiallergic action of Markiain.

さらに、マーキアインは合成することができるが、その際に水銀化合物を用いて合成することが報告されている（非特許文献２）。しかしながら、マーキアインを有効成分として含む医薬組成物として使用する場合は、水銀化合物を用いないでマーキアインを合成することができれば、生体に対しても安全で好ましいと考えられるが、そのような合成方法については、特に開示されていない。   Furthermore, marquiain can be synthesized, but it has been reported that mercury is used at that time (Non-patent Document 2). However, when used as a pharmaceutical composition containing marquiaine as an active ingredient, it would be safe and preferable for living organisms to be able to synthesize marquiain without using a mercury compound. Is not specifically disclosed.

特開昭60-178815号公報Japanese Unexamined Patent Publication No. 60-178815 特開平3-67045号公報Japanese Unexamined Patent Publication No. 3-67045 特開2009-222622号公報JP 2009-222622 A

YAKUGAKU ZASSHI, Vol.127 (1), 15-25 (2007)YAKUGAKU ZASSHI, Vol.127 (1), 15-25 (2007) J. Chem. Soc. Perkin trans I, 04-1809 (1980)J. Chem. Soc. Perkin trans I, 04-1809 (1980)

本発明は、アレルギー疾患感受性遺伝子の発現機構を標的としたアレルギー疾患感受性遺伝子発現抑制物質を提供することを課題とする。さらには、当該アレルギー疾患感受性遺伝子発現抑制物質の新規合成方法を提供することを課題とする。   An object of the present invention is to provide an allergic disease susceptibility gene expression inhibitor that targets the expression mechanism of an allergic disease susceptibility gene. Furthermore, it aims at providing the novel synthesis | combining method of the said allergic disease susceptibility gene expression suppression substance.

本発明者らは上記課題を解決するために、苦参抽出物について、IL-4遺伝子を抑制しうる化合物をスクリーニングし、鋭意研究を重ねた結果、フラボノイドの一種でありプテロカルパン誘導体に分類されるマーキアインがアレルギー疾患感受性遺伝子発現抑制作用を有することを見出し、本発明を完成した。   In order to solve the above-mentioned problems, the present inventors screened compounds that can suppress the IL-4 gene from bitter extract, and as a result of intensive research, they are classified as pterocarpan derivatives that are a kind of flavonoids. It was found that marquiaine has an allergy disease susceptibility gene expression inhibitory action, and the present invention was completed.

即ち本発明は、以下よりなる。
１．以下の一般式(I)で表されるアレルギー疾患感受性遺伝子発現抑制物質。
（式中、Rは水素原子又は直鎖状若しくは分岐状の飽和若しくは不飽和脂肪族炭化水素基、置換基を有していてもよいシクロアルキル基、アリール基、アラルキル基、アルキルオキシ基、アルケニルオキシ基、アルキニルオキシ基、アリールオキシ基若しくはアラルキルオキシ基、あるいは糖の残基を表す。）
２．以下の式(II)で表される、前項１に記載のアレルギー疾患感受性遺伝子発現抑制物質。
３．アレルギー疾患感受性遺伝子が、IL-4遺伝子、IL-5遺伝子及び／又はヒスタミンH1受容体遺伝子である、前項１又は２に記載のアレルギー疾患感受性遺伝子発現抑制物質。
４．前項１〜３のいずれか１に記載のアレルギー疾患感受性遺伝子発現抑制物質を有効成分として含む抗アレルギー剤。
５．前項１〜３のいずれか１に記載のアレルギー疾患感受性遺伝子発現抑制物質の合成工程において、中間産物である7-ベンジルオキシ-2H-1-ベンゾピラン(7-benzyloxy-2H-1-benzopyran)とセサモールとのカップリング工程が、水銀化合物を用いない工程によることを特徴とする、請求項１〜３のいずれか１に記載のアレルギー疾患感受性遺伝子発現抑制物質の製造方法。
６．水銀化合物を用いない工程が、臭素化合物を用いる工程により合成する前項５に記載の製造方法。 That is, this invention consists of the following.
1. An allergic disease susceptibility gene expression inhibitor represented by the following general formula (I):
(In the formula, R is a hydrogen atom, a linear or branched saturated or unsaturated aliphatic hydrocarbon group, an optionally substituted cycloalkyl group, aryl group, aralkyl group, alkyloxy group, alkenyl. Represents an oxy group, an alkynyloxy group, an aryloxy group or an aralkyloxy group, or a sugar residue.)
2. 2. The allergic disease susceptibility gene expression-suppressing substance according to item 1, represented by the following formula (II):
3. 3. The allergic disease susceptibility gene expression inhibitor according to item 1 or 2, wherein the allergic disease susceptibility gene is an IL-4 gene, an IL-5 gene and / or a histamine H1 receptor gene.
4). An antiallergic agent comprising as an active ingredient the allergic disease susceptibility gene expression-suppressing substance according to any one of items 1 to 3.
5. 7-benzyloxy-2H-1-benzopyran, which is an intermediate product, and sesamol in the synthesis process of the allergic disease susceptibility gene expression-suppressing substance according to any one of 1 to 3 above The method for producing an allergic disease susceptibility gene expression-suppressing substance according to any one of claims 1 to 3, wherein the coupling step is a step not using a mercury compound.
6). 6. The production method according to item 5 above, wherein the step of using no mercury compound is synthesized by the step of using a bromine compound.

一般式(I)で表されるフラボノイドの一種であるプテロカルパン誘導体に分類される本発明の化合物は、アレルギー疾患感受性遺伝子であるIL-4遺伝子、IL-5遺伝子及びH1R遺伝子の発現を抑制する。このことから、一般式(I)で表される化合物、即ち本発明のアレルギー疾患感受性遺伝子発現抑制物質は、アレルギー疾患感受性遺伝子発現抑制物質として効果を示す。さらに、本発明のアレルギー疾患感受性遺伝子発現抑制物質は、アレルギー疾患感受性遺伝子発現を抑制することによる抗アレルギー作用が期待され、新規な抗アレルギー剤の開発に有用である。 The compounds of the present invention classified as pterocarpan derivatives, which are a type of flavonoid represented by the general formula (I), suppress the expression of IL-4 gene, IL-5 gene and H 1 R gene, which are allergic disease susceptibility genes To do. From this, the compound represented by the general formula (I), that is, the allergic disease susceptibility gene expression inhibitory substance of the present invention is effective as an allergic disease susceptibility gene expression inhibitory substance. Further, the allergic disease susceptibility gene expression-suppressing substance of the present invention is expected to have an antiallergic action by suppressing the allergic disease susceptibility gene expression, and is useful for the development of a novel antiallergic agent.

なお、本発明のアレルギー疾患感受性遺伝子発現抑制物質は、抗酸化作用や、JNK阻害作用が低いことが確認されたため、抗酸化作用や、JNK阻害作用によるものではなく、新規な分子機序に基づく遺伝子発現抑制作用であることが示唆された。これにより、本発明の化合物は、他の多くのフラボノイドとは異なる作用機序により抗アレルギー作用を示すものと考えられる。   The allergic disease susceptibility gene expression-suppressing substance of the present invention was confirmed to have a low antioxidant action and JNK inhibitory action, and therefore is not based on an antioxidant action or JNK inhibitory action, but based on a novel molecular mechanism. It was suggested that this is a gene expression inhibitory effect. Thus, the compound of the present invention is considered to exhibit an antiallergic action by an action mechanism different from that of many other flavonoids.

マーキアイン全合成のスキームを示す図である。水銀化合物を用いて合成する従来法に係る合成スキームである。（実施例２）It is a figure which shows the scheme of marquiaine total synthesis. It is the synthetic scheme which concerns on the conventional method synthesize | combined using a mercury compound. (Example 2) セサモールの臭素化合物を用いたマーキアインの合成スキームを示す図である。（実施例２）It is a figure which shows the synthetic scheme of marquiaine using the bromine compound of sesamol. (Example 2) RBL-2H3細胞におけるIL-4遺伝子発現に及ぼす苦参熱水抽出物の効果を示す図である。（実施例１）It is a figure which shows the effect of the bitter heat extract on IL-4 gene expression in RBL-2H3 cells. Example 1 RBL-2H3細胞におけるIL-4遺伝子発現に及ぼす酸性画分（苦参熱水抽出液からのpHによる分画）の効果を示す図である。（実施例１）It is a figure which shows the effect of the acidic fraction (fraction by the pH from the bitter hot water extract) on IL-4 gene expression in RBL-2H3 cells. Example 1 RBL-2H3細胞におけるIL-4遺伝子発現に及ぼす塩基性画分（苦参熱水抽出液からのpHによる分画）の効果を示す図である。（実施例１）It is a figure which shows the effect of the basic fraction (fraction by the pH from the bitter hot water extract) on IL-4 gene expression in RBL-2H3 cells. Example 1 RBL-2H3細胞におけるIL-4遺伝子発現に及ぼす中性画分（苦参熱水抽出液からのpHによる分画）の効果を示す図である。（実施例１）It is a figure which shows the effect of the neutral fraction (Fraction by pH from bittern hot water extract) on IL-4 gene expression in RBL-2H3 cells. Example 1 RBL-2H3細胞におけるIL-4遺伝子発現に及ぼすCh1画分及びCh2画分（オープンカラムクロマトグラフィーによる分画）の効果を示す図である。（実施例１）It is a figure which shows the effect of Ch1 fraction and Ch2 fraction (fractionation by an open column chromatography) on IL-4 gene expression in RBL-2H3 cells. Example 1 RBL-2H3細胞におけるIL-4遺伝子発現に及ぼす各種マーキアインの効果を示す図である。（実験例１）It is a figure which shows the effect of various marquiain on the IL-4 gene expression in RBL-2H3 cell. (Experimental example 1) RBL-2H3細胞におけるIL-5遺伝子発現に及ぼす精製マーキアインの効果を示す図である。（実験例２）It is a figure which shows the effect of the purified marquiain on the IL-5 gene expression in RBL-2H3 cell. (Experimental example 2) RBL-2H3細胞におけるH1R遺伝子発現に及ぼす各種マーキアインの効果を示す図である。（実験例３）It shows the effect of various Makiain on H 1 R gene expression in RBL-2H3 cells. (Experimental example 3) 精製マーキアイン（200μM）は、殆ど抗酸化作用を有さないことを示す図である。（参考例１）It is a figure which shows that a purified marquiaine (200 micromol) has almost no antioxidant action. (Reference Example 1) 精製マーキアイン（300μM）は、jun N-terminal kinase (JNK)活性には殆ど影響を及ぼさないことを示す図である。（参考例２）It is a figure which shows that a purified marquiaine (300 micromol) has little influence on jun N-terminal kinase (JNK) activity. (Reference Example 2)

本発明は、新規なアレルギー疾患感受性遺伝子発現抑制物質に関する。本発明においてアレルギー疾患感受性遺伝子とは、一般的にアレルギー疾患感受性遺伝子といわれる遺伝子であればよく、特に限定されないが、例えばIL-4遺伝子、IL-5遺伝子、ＩｇＥ受容体遺伝子、MHCクラスII遺伝子、ヒスタミンH1受容体（H1R）遺伝子、ヒスチジン脱炭素酵素遺伝子等が挙げられる。本発明のアレルギー疾患感受性遺伝子としては、好適にはIL-4遺伝子、IL-5遺伝子、H1R遺伝子が挙げられ、特に好適にはIL-4遺伝子である。 The present invention relates to a novel allergic disease susceptibility gene expression inhibitor. In the present invention, the allergic disease susceptibility gene is not particularly limited as long as it is a gene generally referred to as an allergic disease susceptibility gene. For example, IL-4 gene, IL-5 gene, IgE receptor gene, MHC class II gene Histamine H 1 receptor (H 1 R) gene, histidine decarbonase gene and the like. The allergic disease susceptibility gene of the present invention preferably includes IL-4 gene, IL-5 gene, and H 1 R gene, and particularly preferably IL-4 gene.

本発明のアレルギー疾患感受性遺伝子発現抑制物質は、以下の一般式(I)で表される化合物であり、フラボノイドの一種であるプテロカルパン誘導体に分類される。
（式中、Rは水素原子又は直鎖状若しくは分岐状の飽和若しくは不飽和脂肪族炭化水素基、置換基を有していてもよいシクロアルキル基、アリール基、アラルキル基、アルキルオキシ基、アルケニルオキシ基、アルキニルオキシ基、アリールオキシ基若しくはアラルキルオキシ基、あるいは糖の残基を表す。）
上記において、糖の反応残基とは糖とマーキアイン誘導体との反応により糖分子から一個の水酸基が脱離した構造の糖をいう。糖としては、単糖類や二糖類が挙げられ、具体的にはグルコース、フラクトース、ガラクトースなどの単糖類や、マルトース、スクロース、ラクトース、トレハロースなどの二糖類が好ましい。 The allergic disease susceptibility gene expression-suppressing substance of the present invention is a compound represented by the following general formula (I), and is classified as a pterocarpan derivative which is a kind of flavonoid.
(In the formula, R is a hydrogen atom, a linear or branched saturated or unsaturated aliphatic hydrocarbon group, an optionally substituted cycloalkyl group, aryl group, aralkyl group, alkyloxy group, alkenyl. Represents an oxy group, an alkynyloxy group, an aryloxy group or an aralkyloxy group, or a sugar residue.)
In the above, the sugar reaction residue means a sugar having a structure in which one hydroxyl group is eliminated from the sugar molecule by the reaction between the sugar and the marquiaine derivative. Examples of the sugar include monosaccharides and disaccharides. Specifically, monosaccharides such as glucose, fructose, and galactose, and disaccharides such as maltose, sucrose, lactose, and trehalose are preferable.

本発明のアレルギー疾患感受性遺伝子発現抑制物質は、特に好適には以下の式(II)で表される化合物であり、マーキアインとも称する。
The allergic disease susceptibility gene expression-suppressing substance of the present invention is particularly preferably a compound represented by the following formula (II), which is also called marquiain.

本発明のアレルギー疾患感受性遺伝子発現抑制物質は、天然物より抽出することもできるし、合成により得ることもできる。天然物としては、一般式(I)に示すプテロカルパン誘導体が抽出可能な天然物であればよく、特に限定されないが、例えば、苦参、槐（エンジュ）、群雀 (ムレスズメ)、ムラサキナツフジ、アカクローバー等が挙げられる。天然物より抽出する方法は、特に限定されないが、自体公知の方法によることができる。また、本発明のアレルギー疾患感受性遺伝子発現抑制物質は、合成により生成することもできる。天然物より抽出した場合は、以下の一般式(IV)に示す化合物を容易に得ることができる。また、合成により生成する場合は、以下の一般式(III)及び一般式(IV)に示す化合物が混合するラセミ体の場合が多い。本発明においては、天然物より抽出した化合物と同等の化合物、即ち一般式(IV)に示す化合物が最も好適である。   The allergic disease susceptibility gene expression-suppressing substance of the present invention can be extracted from a natural product or can be obtained by synthesis. The natural product may be any natural product from which the pterocarpan derivative represented by the general formula (I) can be extracted, and is not particularly limited, and examples thereof include bitter, Enju, swarm, Murasaki Kinafuji, Akasaka. Clover and the like. A method for extracting from a natural product is not particularly limited, but may be a method known per se. Moreover, the allergic disease susceptibility gene expression inhibitory substance of this invention can also be produced | generated synthetically. When extracted from a natural product, a compound represented by the following general formula (IV) can be easily obtained. Moreover, when it produces | generates by a synthesis | combination, in many cases, the racemic body which the compound shown in the following general formula (III) and general formula (IV) mixes is mixed. In the present invention, a compound equivalent to a compound extracted from a natural product, that is, a compound represented by the general formula (IV) is most preferable.

（式中、Rは水素原子又は直鎖状若しくは分岐状の飽和若しくは不飽和脂肪族炭化水素基、置換基を有していてもよいシクロアルキル基、アリール基、アラルキル基、アルキルオキシ基、アルケニルオキシ基、アルキニルオキシ基、アリールオキシ基若しくはアラルキルオキシ基、あるいは糖の残基を表す。）
上記において、Rは特に好適には水素原子である。 (In the formula, R is a hydrogen atom, a linear or branched saturated or unsaturated aliphatic hydrocarbon group, an optionally substituted cycloalkyl group, aryl group, aralkyl group, alkyloxy group, alkenyl. Represents an oxy group, an alkynyloxy group, an aryloxy group or an aralkyloxy group, or a sugar residue.)
In the above, R is particularly preferably a hydrogen atom.

（式中、Rは水素原子又は直鎖状若しくは分岐状の飽和若しくは不飽和脂肪族炭化水素基、置換基を有していてもよいシクロアルキル基、アリール基、アラルキル基、アルキルオキシ基、アルケニルオキシ基、アルキニルオキシ基、アリールオキシ基若しくはアラルキルオキシ基、あるいは糖の残基を表す。）
上記において、Rは特に好適には水素原子である。 (In the formula, R is a hydrogen atom, a linear or branched saturated or unsaturated aliphatic hydrocarbon group, an optionally substituted cycloalkyl group, aryl group, aralkyl group, alkyloxy group, alkenyl. Represents an oxy group, an alkynyloxy group, an aryloxy group or an aralkyloxy group, or a sugar residue.)
In the above, R is particularly preferably a hydrogen atom.

本発明において一般式(I)又は式(II)で表される化合物は、さらに、薬学的に許容される塩であってもよい。   In the present invention, the compound represented by the general formula (I) or the formula (II) may further be a pharmaceutically acceptable salt.

本発明において、薬学的に許容される塩とは、薬理学的及び製剤学的に許容される一般的な塩が挙げられる。そのような塩として、具体的には以下が例示される。塩基性付加塩としては、例えばナトリウム塩、カリウム塩等のアルカリ金属塩；例えばカルシウム塩、マグネシウム塩等のアルカリ土類金属塩；例えばアンモニウム塩；例えばトリメチルアミン塩、トリエチルアミン塩；ジシクロヘキシルアミン塩、エタノールアミン塩、ジエタノールアミン塩、トリエタノールアミン塩、ブロカイン塩等の脂肪族アミン塩；たとえばＮ，Ｎ−ジベンジルエチレンジアミン等のアラルキルアミン塩；例えばピリジン塩、ピコリン塩、キノリン塩、イソキノリン塩等の複素環芳香族アミン塩；例えばテトラメチルアンモニウム塩、テトラエチルアモニウム塩、ベンジルトリメチルアンモニウム塩、ベンジルトリエチルアンモニウム塩、ベンジルトリブチルアンモニウム塩、メチルトリオクチルアンモニウム塩、テトラブチルアンモニウム塩等の第４級アンモニウム塩；アルギニン塩；リジン塩等の塩基性アミノ酸塩等が挙げられる。   In the present invention, the pharmaceutically acceptable salt includes general pharmacologically and pharmaceutically acceptable salts. Specific examples of such salts are as follows. Examples of basic addition salts include alkali metal salts such as sodium salts and potassium salts; alkaline earth metal salts such as calcium salts and magnesium salts; ammonium salts; trimethylamine salts and triethylamine salts; dicyclohexylamine salts and ethanolamines. Aliphatic amine salts such as salts, diethanolamine salts, triethanolamine salts and brocaine salts; Aralkylamine salts such as N, N-dibenzylethylenediamine; and heterocyclic aromatics such as pyridine salts, picoline salts, quinoline salts and isoquinoline salts For example, tetramethylammonium salt, tetraethylammonium salt, benzyltrimethylammonium salt, benzyltriethylammonium salt, benzyltributylammonium salt, methyltrioctylammonium salt, Quaternary ammonium salts such as tiger butyl ammonium salt; arginine; basic amino acid salts such as lysine salts.

酸付加塩としては、例えば塩酸塩、硫酸塩、硝酸塩、リン酸塩、炭酸塩、炭酸水素塩、過塩素酸塩等の無機酸塩；例えば酢酸塩、プロピオン酸塩、乳酸塩、マレイン酸塩、フマール酸塩、酒石酸塩、リンゴ酸塩、クエン酸塩、アスコルビン酸塩等の有機酸塩；例えばメタンスルホン酸塩、イセチオン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、ｐ−トルエンスルホン酸塩等のスルホン酸塩；例えばアスパラギン酸塩、グルタミン酸塩等の酸性アミノ酸等を挙げることができる。   Examples of the acid addition salt include inorganic acid salts such as hydrochloride, sulfate, nitrate, phosphate, carbonate, hydrogen carbonate, perchlorate; for example, acetate, propionate, lactate, maleate , Organic acid salts such as fumarate, tartrate, malate, citrate and ascorbate; sulfonic acids such as methanesulfonate, isethionate, benzenesulfonate, p-toluenesulfonate Salts; for example, acidic amino acids such as aspartate and glutamate.

本発明のアレルギー疾患感受性遺伝子発現抑制物質、即ち上記一般式(I)に示すプテロカルパン誘導体、特に好適には式(II)に示すマーキアインは、例えば非特許文献２（J. Chem. Soc. Perkin trans I, 04-1809 (1980)）に記載の合成方法を参照して合成することができる。しかしながら、非特許文献２に記載の方法では、マーキアイン合成の工程において、中間産物である2-クロロマーキュリオ-4,5-メチレンジオキシフェノール(2-chlormercurio-4,5-methylenedioxyphenol)の合成工程では水銀化合物を用いた方法が開示されている（図１参照）。本発明のアレルギー疾患感受性遺伝子発現抑制物質を有効成分とする医薬品等の場合は、当該アレルギー疾患感受性遺伝子発現抑制物質を水銀化合物を用いないで合成するのが、安全であり、合成廃棄物の処理の観点からも優れている。   The allergic disease susceptibility gene expression-suppressing substance of the present invention, that is, the pterocarpan derivative represented by the above general formula (I), particularly preferably the markiain represented by the formula (II) is, for example, non-patent document 2 (J. Chem. Soc. I, 04-1809 (1980)). However, in the method described in Non-Patent Document 2, in the process of marquiaine synthesis, a process for synthesizing 2-chloromercurio-4,5-methylenedioxyphenol, which is an intermediate product, is performed. Discloses a method using a mercury compound (see FIG. 1). In the case of a pharmaceutical or the like containing the allergic disease susceptibility gene expression-suppressing substance of the present invention as an active ingredient, it is safe to synthesize the allergic disease susceptibility gene expression-suppressing substance without using a mercury compound. It is also excellent from the point of view.

具体的には、非特許文献２（図１）における水銀化合物を用いた2-クロロマーキュリオ-4,5-メチレンジオキシフェノール(2-chlormercurio-4,5-methylenedioxyphenol)の合成工程は、臭素化合物を用いてセサモールから2-ブロモ-4,5-メチレンジオキシフェノールを合成することで代用できる（図２参照）。このように、水銀化合物を用いないでマーキアインを合成する方法は、従来報告されていない。従って、水銀化合物を用いないアレルギー疾患感受性遺伝子発現抑制物質であるマーキアインの合成方法は、本発明の範囲に包含される。   Specifically, the synthesis process of 2-chloromercurio-4,5-methylenedioxyphenol using a mercury compound in Non-Patent Document 2 (FIG. 1) is bromine. It can be substituted by synthesizing 2-bromo-4,5-methylenedioxyphenol from sesamol using the compound (see FIG. 2). Thus, a method for synthesizing marquiaine without using a mercury compound has not been reported so far. Therefore, a method for synthesizing marquiain, which is an allergic disease susceptibility gene expression inhibitor without using a mercury compound, is included in the scope of the present invention.

本発明は、アレルギー疾患感受性遺伝子発現抑制物質を有効成分とする抗アレルギー剤にも及ぶ。本明細書において、抗アレルギー剤とは、いわゆるアレルギー疾患に対して効果を有する医薬品等の薬剤をいう。本発明の抗アレルギー剤は、アレルギー疾患に対して予防的又は治療的に使用することができ、好適には治療的に使用することができる。有効成分としてのアレルギー疾患感受性遺伝子発現抑制物質により、アレルギー疾患感受性遺伝子、即ちIL-4遺伝子、IL-5遺伝子、IgE受容体遺伝子、MHCクラスII遺伝子、ヒスタミンH1受容体（H1R）遺伝子、ヒスチジン脱炭素酵素遺伝子に示すいずれかの遺伝子、好適にはIL-4遺伝子、IL-5遺伝子及び／又はH1R遺伝子、より好適にはIL-4遺伝子の発現を抑制することができ、その結果としてアレルギー疾患を予防又は治療することができる。 The present invention also extends to an antiallergic agent comprising an allergic disease susceptibility gene expression inhibitor as an active ingredient. In the present specification, the antiallergic agent refers to a drug such as a pharmaceutical having an effect on a so-called allergic disease. The antiallergic agent of the present invention can be used prophylactically or therapeutically against allergic diseases, and can be preferably used therapeutically. Allergic disease susceptibility gene expression inhibitor as an active ingredient, allergic disease susceptibility gene, ie IL-4 gene, IL-5 gene, IgE receptor gene, MHC class II gene, histamine H 1 receptor (H 1 R) gene Any of the genes shown in the histidine decarbonase gene, preferably IL-4 gene, IL-5 gene and / or H 1 R gene, more preferably IL-4 gene expression can be suppressed, As a result, allergic diseases can be prevented or treated.

本明細書において、アレルギー疾患とはいわゆるアレルギー性の疾患であればよく、特に限定されないが、例えばI型アレルギー、II型アレルギー又はIV型アレルギーなどが挙げられる。具体的には、例えば花粉症、アレルギー性鼻炎、気管支喘息、アトピー性皮膚炎、植物アレルギー、蕁麻疹、PIE症候群、アナフィラキシーショック等が挙げられる。   In the present specification, the allergic disease is not particularly limited as long as it is a so-called allergic disease, and examples thereof include type I allergy, type II allergy, and type IV allergy. Specific examples include hay fever, allergic rhinitis, bronchial asthma, atopic dermatitis, plant allergy, urticaria, PIE syndrome, anaphylactic shock and the like.

本発明の抗アレルギー剤を予防的若しくは治療的に使用する場合は、経口又は非経口により有効量投与することができる。その投与量は、投与経路や投与方法により適宜決定することができる。例えば、経口投与の場合には有効成分を成人一日あたり0.01〜1000mgの範囲で用いることができる。   When the antiallergic agent of the present invention is used prophylactically or therapeutically, it can be administered in an effective amount orally or parenterally. The dosage can be appropriately determined depending on the administration route and administration method. For example, in the case of oral administration, the active ingredient can be used in the range of 0.01 to 1000 mg per adult day.

経口投与に適する剤形としては、例えば、錠剤、カプセル剤、散剤、細粒剤、顆粒剤、液剤、及びシロップ剤等を挙げることができ、非経口投与に適する剤形としては、例えば、注射剤、点滴剤、坐剤、吸入剤、点眼剤、点鼻剤、軟膏剤、クリーム剤、及び貼付剤等を挙げることができる。   Examples of dosage forms suitable for oral administration include tablets, capsules, powders, fine granules, granules, solutions, and syrups. Examples of dosage forms suitable for parenteral administration include injection. Agents, drops, suppositories, inhalants, eye drops, nasal drops, ointments, creams, patches, and the like.

経口投与のためには、固型製剤又は液体製剤とすることができる。製剤としては、例えば錠剤、丸剤、散剤、顆粒剤、液剤、懸濁液あるいはカプセル剤などが挙げられる。錠剤を調製する際には常法に従ってラクトース、スターチ、炭酸カルシウム、結晶性セルロース、あるいはケイ酸などの賦形剤；カルボキシメチルセルロース、メチルセルロール、リン酸カルシウム、あるいはポリビニルピロリドン等の結合剤；アルギン酸ナトリウム、重ソウ、ラウリル硫酸ナトリウムやステアリン酸モノグリセライド等の崩壊剤；グリセリン等の潤滑剤；カオリン、コロイド状シリカ等の吸収剤；タルク、粒状ホウ酸などの潤滑剤などの添加剤を用いることができる。   For oral administration, it can be a solid formulation or a liquid formulation. Examples of the preparation include tablets, pills, powders, granules, solutions, suspensions or capsules. When preparing tablets, excipients such as lactose, starch, calcium carbonate, crystalline cellulose, or silicic acid according to conventional methods; binders such as carboxymethylcellulose, methylcellulose, calcium phosphate, or polyvinylpyrrolidone; sodium alginate, Additives such as disintegrants such as sodium bicarbonate, sodium lauryl sulfate and monoglyceride stearate; lubricants such as glycerin; absorbents such as kaolin and colloidal silica; lubricants such as talc and granular boric acid can be used.

丸剤、散剤又は顆粒剤についても上記と同様に添加剤を用いて常法に従って製剤化される。液剤及び懸濁剤などの液体製剤も常法に従って製剤化される。担体としては例えばトリカプリリン、トリアセチン、ヨード化ケシ油脂肪酸エステル等のグリセロールエステル類；水；エタノール等のアルコール類；流動パラフィン、ココナッツ油、大豆油、ゴマ油、トウモロコシ油等の油性基剤が用いられる。上記した散剤、顆粒剤、液体製剤等はゼラチン等のカプセルで包むこともできる。   Pills, powders or granules can be formulated according to conventional methods using additives as described above. Liquid preparations such as solutions and suspensions are also formulated according to conventional methods. Examples of carriers include glycerol esters such as tricaprylin, triacetin, iodized poppy oil fatty acid ester; water; alcohols such as ethanol; oily bases such as liquid paraffin, coconut oil, soybean oil, sesame oil, and corn oil. . The above-mentioned powders, granules, liquid preparations and the like can also be wrapped in capsules such as gelatin.

本明細書における薬学的に許容しうる担体には、その他通常必要により用いられる補助剤、芳香剤、等張化剤、pH調節剤、安定化剤、噴射剤、粘着剤や防腐剤等を適宜選択して含むことができる。   The pharmaceutically acceptable carrier in the present specification includes other commonly used adjuvants, fragrances, tonicity agents, pH regulators, stabilizers, propellants, adhesives, preservatives and the like as appropriate. Can be selected and included.

経皮投与用薬剤の剤形としては、軟膏、クリーム、ローション、液剤等が挙げられる。軟膏の基剤としては、例えばヒマシ油、オリーブ油、ゴマ油、サフラワー油などの脂肪油；ラノリン；白色、黄色若しくは親水ワセリン；ロウ；オレイルアルコール、イソステアリルアルコール、オクチルドデカノール、ヘキシルデカノールなどの高級アルコール類；グリセリン、ジグリセリン、エチレングリコール、プロピレングリコール、ソルビトール、1,3-ブタンジオールなどのグリコール類などが挙げられる。また可溶化剤としてエタノール、ジメチルスルホキシド、ポリエチレングリコールなどを用いてもよい。また必要に応じて、パラオキシ安息香酸エステル、安息香酸ナトリウム、サリチル酸、ソルビン酸、ホウ酸などの保存剤；ブチルヒドロキシアニソール、ジブチルヒドロキシトルエンなどの酸化防止剤などを用いてもよい。   Examples of dosage forms for transdermal administration include ointments, creams, lotions, and liquids. Ointment bases include, for example, fatty oils such as castor oil, olive oil, sesame oil, safflower oil; lanolin; white, yellow or hydrophilic petrolatum; wax; higher alcohols such as oleyl alcohol, isostearyl alcohol, octyldodecanol, hexyl decanol Glycols such as glycerin, diglycerin, ethylene glycol, propylene glycol, sorbitol, 1,3-butanediol, and the like. Further, ethanol, dimethyl sulfoxide, polyethylene glycol or the like may be used as a solubilizer. If necessary, a preservative such as paraoxybenzoic acid ester, sodium benzoate, salicylic acid, sorbic acid or boric acid; an antioxidant such as butylhydroxyanisole or dibutylhydroxytoluene may be used.

また、経皮吸収促進を図るため、ジイソプロピルアジペート、ジエチルセバケート、エチルカプロエート、エチルラウレートなどの吸収促進剤を加えてもよい。また、安定化を図るため、本発明化合物はα，β又はγーシクロデキストリンあるいはメチル化シクロデキストリン等と包接化合物を形成せしめて使用することもできる。   In order to promote percutaneous absorption, absorption promoters such as diisopropyl adipate, diethyl sebacate, ethyl caproate, ethyl laurate may be added. For stabilization, the compound of the present invention can also be used after forming an inclusion compound with α, β, γ-cyclodextrin, methylated cyclodextrin or the like.

軟膏は通常の方法によって製造することができる。クリーム剤としては水中油型クリーム剤の形態が本発明化合物の安定化を図るうえで好ましい。またその基剤としては、前述した如き、脂肪油、高級アルコール類、グリコール類などが用いられ、またジエチレングリコール、プロピレングリコール、ソルビタンモノ脂肪酸エステル、ポリソルベート80、ラウリル硫酸ナトリウムなどの乳化剤が用いられる。更に必要に応じて前述した如き保存剤、酸化防止剤などを添加してもよい。また軟膏剤の場合と同様に、シクロデキストリン、メチル化シクトデキストリンの包接化合物として用いることもできる。クリーム剤は通常の方法によって製造することができる。   An ointment can be manufactured by a normal method. As the cream, an oil-in-water cream is preferable in terms of stabilizing the compound of the present invention. As the base, fatty oils, higher alcohols, glycols and the like are used as described above, and emulsifiers such as diethylene glycol, propylene glycol, sorbitan monofatty acid ester, polysorbate 80, and sodium lauryl sulfate are used. Further, a preservative and an antioxidant as described above may be added as necessary. Further, as in the case of an ointment, it can also be used as an inclusion compound for cyclodextrin and methylated cystodextrin. The cream can be produced by a usual method.

ローション剤としては、懸濁型、乳剤型、溶液型ローション剤が挙げられる。懸濁型ローション剤は、アルギン酸ナトリウム、トラガント、カルボキシメチルセルロースナトリウムなどの懸濁化剤を用い、必要に応じて酸化防止剤、保存剤などを加えて得られる。乳化型ローション剤は、ソルビタンモノ脂肪酸エステル、ポリソルベート80、ラウリル硫酸ナトリウムなどの乳化剤を用い、通常の方法で得られる。溶液型ローション剤は、アルコール型ローション剤が好ましくエタノールなどのアルコールを用いて通常の方法で得られる。液剤としては、エタノールなどのアルコール溶液に溶解し、必要に応じて酸化防止剤、保存剤などを添加したものが挙げられる。   Examples of the lotion include suspension type, emulsion type, and solution type lotion. The suspension lotion is obtained by using a suspending agent such as sodium alginate, tragacanth or sodium carboxymethylcellulose, and adding an antioxidant or a preservative as necessary. The emulsification type lotion is obtained by an ordinary method using an emulsifier such as sorbitan monofatty acid ester, polysorbate 80, sodium lauryl sulfate. The solution-type lotion is preferably an alcohol-type lotion and can be obtained by an ordinary method using an alcohol such as ethanol. As a liquid agent, what melt | dissolved in alcohol solutions, such as ethanol, and added antioxidant and a preservative as needed is mentioned.

これらの剤形以外でも、パスタ剤、パップ剤、エアゾル剤等の剤形が挙げられる。かかる製剤は通常の方法によって製造することができる。   In addition to these dosage forms, dosage forms such as pasta agents, cataplasms, and aerosols can be used. Such a preparation can be produced by a usual method.

経鼻による投与の製剤は、液状又は粉末状の組成物として与えられる。液状剤の基剤としては水、食塩水、リン酸緩衝液、酢酸緩衝液等が用いられ、さらに界面活性剤、酸化防止剤、安定剤、保存剤、粘性付与剤を含んでいてもよい。粉末状剤の基剤としては、水吸収性のものが好ましく、例えば、水易溶性のポリアクリル酸ナトリウム、ポリアクリル酸カルシウム、ポリアクリル酸アンモニウムなどのポリアクリル酸塩類、メチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウムなどのセルロース低級アルキルエーテル類、ポリエチレングリコール、ポリビニルピロリドン、アミロース、プルランなどが、また水難溶性の結晶セルロース、α−セルロース、架橋カルボキシメチルセルロースナトリウムなどのセルロース類、ヒドロキシプロピン澱粉、カルボキシメチル澱粉、架橋澱粉、アミロース、アミロペクチン、ペクチンなどの澱粉類、ゼラチン、カゼイン、カゼインナトリウムなどのタンパク類、アラビアガム、トラガントガム、グルコマンナンなどのガム類、ポリビニルポリピロリドン、架橋ポリアクリル酸及びその塩、架橋ポリビニルアルコール、ポリヒドロキシエチルメタアクリレートなどの架橋ビニル重合体類などが挙げられ、これらを混合して用いてもよい。さらに粉末状剤には、酸化防止剤、着色剤、保存剤、防腐剤、矯腐剤等を添加してもよい。かかる液状剤、粉末状剤は例えばスプレー器具等を用いて投与することができる。   Formulations for nasal administration are given as liquid or powdered compositions. As the base of the liquid agent, water, saline, phosphate buffer, acetate buffer and the like are used, and a surfactant, an antioxidant, a stabilizer, a preservative, and a viscosity imparting agent may be further included. The base of the powdery agent is preferably a water-absorbing one. For example, polyacrylic acid salts such as water-soluble sodium polyacrylate, calcium polyacrylate, and ammonium polyacrylate, methylcellulose, hydroxyethylcellulose, hydroxy Cellulose lower alkyl ethers such as propyl cellulose and sodium carboxymethyl cellulose, polyethylene glycol, polyvinyl pyrrolidone, amylose, pullulan and the like, and poorly water soluble crystalline cellulose, α-cellulose, cellulose such as sodium carboxymethyl cellulose, hydroxypropyne starch , Starches such as carboxymethyl starch, cross-linked starch, amylose, amylopectin, pectin, proteins such as gelatin, casein, sodium caseinate, Examples include gums such as rabia gum, tragacanth gum and glucomannan, polyvinylpolypyrrolidone, crosslinked polyacrylic acid and its salts, crosslinked vinyl polymers such as crosslinked polyvinyl alcohol and polyhydroxyethyl methacrylate, etc. May be. Furthermore, you may add antioxidant, a coloring agent, a preservative, an antiseptic | preservative, a corrigent etc. to a powdery agent. Such liquid agents and powder agents can be administered using, for example, a spray device.

注射による投与の製剤は、無菌の水性あるいは非水溶性液剤、懸濁剤、又は乳化剤として与えられる。非水性の溶液又は懸濁剤は、例えばプロピレングリコール、ポリエチレングリコール又はオリーブ油のような植物油、オレイン酸エチル、ヨード化ケシ油脂肪酸エステルのような注射しうる有機エステル類を薬学的に許容しうる担体とする。このような製剤はまた、防腐剤、湿潤剤、乳化剤、分散剤、安定剤のような補助剤を含むことができ、徐放性にしてもよい。これらの溶液剤、懸濁剤及び乳化剤は、例えばバクテリア保留フィルターを通す濾過、殺菌剤の配合、あるいは照射等の処理を適宜行うことによって無菌化できる。また無菌の固形製剤を製造し、使用直前に無菌水又は無菌の注射用溶媒に溶解して使用することができる。   Formulations for administration by injection are given as sterile aqueous or non-aqueous solutions, suspensions, or emulsifiers. Non-aqueous solutions or suspensions are pharmaceutically acceptable carriers such as vegetable oils such as propylene glycol, polyethylene glycol or olive oil, injectable organic esters such as ethyl oleate, iodized poppy oil fatty acid esters And Such formulations may also contain adjuvants such as preservatives, wetting agents, emulsifying agents, dispersing agents, stabilizing agents and may be sustained release. These solutions, suspensions, and emulsifiers can be sterilized by appropriately performing, for example, filtration through a bacteria retaining filter, blending of a bactericidal agent, or irradiation. In addition, a sterile solid preparation can be produced and used by dissolving in sterile water or a sterile solvent for injection immediately before use.

以下、本発明を実施例によりさらに具体的に説明するが、本発明は下記の実施例の範囲に限定されることはない。   Hereinafter, the present invention will be described more specifically with reference to examples. However, the present invention is not limited to the scope of the following examples.

（実施例１）苦参抽出物からのIL-4遺伝子発現抑制物質の分離
１）苦参熱水抽出液の調製
苦参抽出物からIL-4遺伝子発現抑制物質の分離を試みた。苦参（Sophorae Radix, 小島漢方, Osaka）60 g を水1000 mlに入れて９０分熱水抽出を行い、熱時濾過を行なった。これを濃縮し、30 mg/ml となるように調整し、苦参熱水抽出液とした。 Example 1 Separation of IL-4 Gene Expression Suppressing Substance from Bitter Extract 1) Preparation of Bitter Hot Water Extract A separation of IL-4 gene expression suppressing substance from bitter extract was attempted. 60 g of bitter ginseng (Sophorae Radix, Kojima Kampo, Osaka) was placed in 1000 ml of water and subjected to hot water extraction for 90 minutes, followed by hot filtration. This was concentrated and adjusted to 30 mg / ml to obtain a bitter hot water extract.

IL-4遺伝子発現に及ぼす影響は、ラット好塩基球性白血病細胞株（RBL-2H3細胞）に対する抗原抗体刺激によるIL-4遺伝子発現量により確認した。RBL-2H3細胞を35 mmシャーレにて培養し、細胞が70%コンフルーエントになった状態で上述の熱水抽出液を最終濃度1.2〜3.0 mg/mlになるように培地に加え37±0.5℃で２４時間インキュベートした。抗原抗体刺激は、抗原刺激１８時間前に100 ng/mlの抗ジニトロフェニル (DNP) モノクローナル抗体(SPE-7; SIGMA, St. Louis, USA)を加え細胞を培養した後、100 ng/ml DNP-HSA抗原(DNP-HSA, SIGMA, St. Louis, USA)を加えて行った。抗原刺激２時間後、細胞のかきとりを行い、かき取った細胞よりtotal RNAを調製し、逆転写反応にてcDNAとしたものを試料とし、リアルタイムRT-PCR法により、mRNAレベルを測定した(N=3)。IL-4遺伝子発現量は、IL-4のmRNAレベルをハウスキーピング遺伝子であるGAPDHのmRNAレベルとの相対比により確認した。   The effect on IL-4 gene expression was confirmed by the expression level of IL-4 gene by stimulation with antigen-antibody against rat basophilic leukemia cell line (RBL-2H3 cell). RBL-2H3 cells are cultured in a 35 mm dish, and the above hot water extract is added to the medium to a final concentration of 1.2-3.0 mg / ml while the cells are 70% confluent. And incubated for 24 hours. Antigen antibody stimulation was performed by adding 100 ng / ml anti-dinitrophenyl (DNP) monoclonal antibody (SPE-7; SIGMA, St. Louis, USA) 18 hours before antigen stimulation and culturing the cells, followed by 100 ng / ml DNP -HSA antigen (DNP-HSA, SIGMA, St. Louis, USA) was added. After 2 hours of antigen stimulation, the cells were scraped, total RNA was prepared from the scraped cells, and the mRNA level was measured by real-time RT-PCR using cDNA prepared by reverse transcription as a sample (N = 3). The expression level of IL-4 gene was confirmed by the relative ratio of the mRNA level of IL-4 to the mRNA level of GAPDH, which is a housekeeping gene.

その結果、苦参熱水抽出液は、DNP-HSA抗原によるIL-4遺伝子発現の上昇を有意に抑制することが確認された（図３）。以下、同手法によりIL-4遺伝子発現量を確認し、有効成分の抽出・単離を行った。   As a result, it was confirmed that the bitter hot water extract significantly suppressed the increase in IL-4 gene expression by the DNP-HSA antigen (FIG. 3). Thereafter, the expression level of IL-4 gene was confirmed by the same method, and active ingredients were extracted and isolated.

ラットIL-4 mRNA測定用プライマーとして、以下の配列番号１及び２に示す配列、プローブは、配列番号３に示す配列のオリゴヌクレオチドを用いた。ラットGAPDH mRNA測定用プライマー・プローブは、市販のTaqMan(R) Rodent GAPDH Control Reagents (VIC Probe)Cat No. 4308313（アプライドバイオシステムズ）を用いた。
（配列番号１）sense primer: 5'-CAGGGTGCTTCGCAAATTTTAC-3'
（配列番号２）anti-sense primer: 5'-CACCGAGAACCCCAGACTTG-3'
（配列番号３）probe: FAM-CCCACGTGATGTACCTCCGTGCTTG-TAMRA As a primer for measuring rat IL-4 mRNA, an oligonucleotide having the sequence shown in SEQ ID NO: 3 was used as the probe shown in SEQ ID NOs: 1 and 2 below. Rat GAPDH mRNA measurement primer probes, using commercially available TaqMan (R) Rodent GAPDH Control Reagents (VIC Probe) Cat No. 4308313 ( Applied Biosystems).
(SEQ ID NO: 1) sense primer: 5'-CAGGGTGCTTCGCAAATTTTAC-3 '
(SEQ ID NO: 2) anti-sense primer: 5'-CACCGAGAACCCCAGACTTG-3 '
(SEQ ID NO: 3) probe: FAM-CCCACGTGATGTACCTCCGTGCTTG-TAMRA

２）苦参熱水抽出液からのpHによる分画
苦参熱水抽出液(30 mg/ml)から、各種pH条件により分画を行なった。1 Mの塩酸でpH 3に調整し、これを酢酸エチルで３回抽出し、溶媒を除いたものを酸性画分とした。酸性画分を抽出した残液（水層）を、1 M 水酸化ナトリウム水溶液でpH 10に調整し、酢酸エチルで３回抽出した。得られた抽出物の溶媒を除き、塩基性画分とした。当該塩基性画分を抽出した残液（水層）を、10％クエン酸水溶液でpH 7に調整した。当該抽出した残液（水層）の溶媒を凍結乾燥で除き、中性画分とした。それぞれの画分におけるアルカロイド類の分布を調べた。薄層クロマトグラフィにて各分画を展開し、ドラーゲンドルフ試薬を噴霧した。その結果、酸性画分中にアルカロイド類は検出されず、塩基性画分、中性画分においてアルカロイド類の分布が認められた。 2) Fractionation from bitter hot water extract by pH Fractionation from bitter hot water extract (30 mg / ml) was carried out under various pH conditions. The pH was adjusted to 3 with 1 M hydrochloric acid, this was extracted three times with ethyl acetate, and the solvent was removed to obtain an acidic fraction. The residual liquid (aqueous layer) from which the acidic fraction was extracted was adjusted to pH 10 with 1 M aqueous sodium hydroxide solution and extracted three times with ethyl acetate. The solvent of the obtained extract was removed to obtain a basic fraction. The residual liquid (aqueous layer) from which the basic fraction was extracted was adjusted to pH 7 with a 10% aqueous citric acid solution. The solvent of the extracted residual liquid (aqueous layer) was removed by lyophilization to obtain a neutral fraction. The distribution of alkaloids in each fraction was examined. Each fraction was developed by thin layer chromatography and sprayed with Dragendorf reagent. As a result, alkaloids were not detected in the acidic fraction, and distribution of alkaloids was observed in the basic fraction and the neutral fraction.

これらの画分について、それぞれRBL-2H3細胞を用いてIL-4遺伝子発現に及ぼす影響を調べた。IL-4遺伝子発現レベルは、上記１）に記載の方法と同手法により確認した(N=3)。その結果、酸性画分はIL-4遺伝子発現の上昇を有意に抑制した（図４）。一方、塩基性画分、中性画分はIL-4遺伝子発現に対して抑制作用を示さなかった（図５、図６）。   Each of these fractions was examined for effects on IL-4 gene expression using RBL-2H3 cells. IL-4 gene expression level was confirmed by the same method as described in 1) above (N = 3). As a result, the acidic fraction significantly suppressed the increase in IL-4 gene expression (FIG. 4). On the other hand, the basic fraction and neutral fraction showed no inhibitory action on IL-4 gene expression (FIGS. 5 and 6).

３）オープンカラムクロマトグラフィーによる分画
活性のあった酸性画分について、オープンカラムクロマトグラフィーにより、さらに分離・精製を行なった。固定相にシリカゲル(Silica gel 60N)（関東化学, Tokyo）を用い、移動層にクロロホルム：メタノール（９：１）を用いて溶出し、溶出液を50 mLずつ分取し、画分Ch1〜Ch21を得た。その後、カラムを100％メタノールで洗浄し、さらに50 mLずつ分取し、画分M1〜M7を得た。得られた溶出画分及び洗浄画分の各画分について、溶媒を除き、IL-4遺伝子発現に及ぼす影響を調べた。IL-4遺伝子発現量は、上記１）に記載の方法と同手法により確認した(N=3)。これらの画分の内、Ch1ではIL-4遺伝子発現の抑制傾向がみられ、Ch2では有意な抑制作用が確認された（図７）。残りの画分には抑制作用は認められなかった。 3) Fractionation by open column chromatography The active acidic fraction was further separated and purified by open column chromatography. The silica gel (Silica gel 60N) (Kanto Kagaku, Tokyo) is used for the stationary phase, and the mobile phase is eluted with chloroform: methanol (9: 1). Got. Thereafter, the column was washed with 100% methanol, and further 50 mL was collected to obtain fractions M1 to M7. For each of the obtained eluted fraction and washed fraction, the solvent was removed and the influence on IL-4 gene expression was examined. The IL-4 gene expression level was confirmed by the same method as described in 1) above (N = 3). Among these fractions, a tendency to suppress IL-4 gene expression was observed in Ch1, and a significant inhibitory action was confirmed in Ch2 (FIG. 7). No inhibitory action was observed in the remaining fractions.

４）有効成分の単離・同定
薄層クロマトグラフィによって、Ch1画分とCh2画分に共通のスポットがあることを確認した。そのスポットをさらにシリカゲルオープンカラムクロマトグラフィ（移動層；ヘキサン：酢酸エチル（２：１））で精製し、精製画分についてIL-4遺伝子発現に及ぼす影響を調べた。IL-4遺伝子発現量は、上記１）に記載の方法と同手法により確認した(N=3)。また、当該精製により得られた画分について、これを核磁気共鳴スペクトル（NMR）に供し、有効成分が式(II)に示すマーキアインであることを明らかにした。構造の同定は１次元NMR（1H, 13C）及び２次元NMR（HH-COSY, DEPT, HMBC, HSQC）により行った（日本ブルカー, Kanagawa ; ARX-400）。内部標準としてテトラメチルシラン(tetramethylsilane)を用いた。 4) Isolation and identification of active ingredient It was confirmed by thin layer chromatography that a common spot was found in the Ch1 and Ch2 fractions. The spot was further purified by silica gel open column chromatography (mobile bed; hexane: ethyl acetate (2: 1)), and the effect of the purified fraction on IL-4 gene expression was examined. The IL-4 gene expression level was confirmed by the same method as described in 1) above (N = 3). Further, the fraction obtained by the purification was subjected to nuclear magnetic resonance spectrum (NMR), and it was revealed that the active ingredient was marquiaine represented by the formula (II). The structure was identified by one-dimensional NMR (1H, 13C) and two-dimensional NMR (HH-COSY, DEPT, HMBC, HSQC) (Nippon Bruker, Kanagawa; ARX-400). Tetramethylsilane was used as an internal standard.

上記シリカゲルオープンカラムクロマトグラフィにより精製して得た画分について、さらに高速液体クロマトグラフィ(HPLC)を行い、有効成分の精製を行った。HPLCは、カラムとしてMightysil RP18 GP（関東化学, Tokyo）を用い、65％メタノールまたは55％メタノール、流速0.8 mL/minにて行なった。分取した画分をメタノールで再結晶し、精製品とした。   The fraction obtained by the silica gel open column chromatography was further subjected to high performance liquid chromatography (HPLC) to purify the active ingredient. HPLC was performed using Mightysil RP18 GP (Kanto Chemical Co., Tokyo) as a column at 65% methanol or 55% methanol at a flow rate of 0.8 mL / min. The fraction collected was recrystallized from methanol to obtain a purified product.

（実施例２）Heck反応を用いたマーキアインの合成
本発明のマーキアインの合成は、非特許文献２の方法（図１参照）の方法を一部改変して行なった。図１の方法では、水銀化合物を用いているのに対し、本実施例では、化合物(3)（7-ベンジルオキシ-2H-1-ベンゾピラン(7-benzyloxy-2H-1-benzopyran)）と化合物(1)（セサモール(Sesamol: 1,3-Benzodioxol-5-ol)）とのカップリングにおいて、J.S.Yadav (Adv. Synth. Catal. 346: 77-82 (2004))らの方法を一部改変し、水銀化合物を用いず、臭素化合物を用いた（図２参照）。 (Example 2) Synthesis of marquiain using Heck reaction The marquiain of the present invention was synthesized by partially modifying the method of Non-Patent Document 2 (see Fig. 1). While the mercury compound is used in the method of FIG. 1, in this example, the compound (3) (7-benzyloxy-2H-1-benzopyran) and the compound are used. (1) In the coupling with (Sesamol: 1,3-Benzodioxol-5-ol), the method of JSYadav (Adv. Synth. Catal. 346: 77-82 (2004)) was partially modified. A bromine compound was used instead of a mercury compound (see FIG. 2).

化合物(1)(300 mg, 2.17 mmol)を塩化メチレンに溶解し、氷冷しながらn-ブロモスクシンイミド(n-Bromosuccinimide)(464 mg, 2.606 mmol)をゆっくり添加した。炭酸水素ナトリウム水溶液で反応を止め、塩化エチレン層を濃縮した。これをカラムクロマトグラフィー（シリカゲル、ヘキサン−クロロホルム＝１：３）により単離し、化合物(2)（2-ブロモ-4,5-メチレンジオキシフェノール(2-bromo-4,5-methylenedioxyphenol)）(295.9 mg, 1.36 mmol, 62％)を得た。   Compound (1) (300 mg, 2.17 mmol) was dissolved in methylene chloride, and n-bromosuccinimide (464 mg, 2.606 mmol) was slowly added while cooling with ice. The reaction was stopped with an aqueous sodium hydrogen carbonate solution, and the ethylene chloride layer was concentrated. This was isolated by column chromatography (silica gel, hexane-chloroform = 1: 3), and compound (2) (2-bromo-4,5-methylenedioxyphenol) ( 295.9 mg, 1.36 mmol, 62%).

非特許文献２に記載の方法に従い、合成した化合物(3)(14.5 mg, 0.061 mmol)と化合物(2)(13.2 mg, 0.061 mmol)を、アセトニトリル(5 mL)に溶解し、トリシクロヘキシルホスフィン(tricyclohexylphosphine)(30％ in トルエン、20μl, 0.0183 mmol)とPd2(dba)3・CHCl3 (63 mg, 0.0061 mmol)を混ぜたものを60℃。アルゴン雰囲気下で４時間反応させた。その後、反応液を塩化メチレンで３倍に希釈し、フロリジール(R)(150-250μm)を用いてろ過した後、濃縮し、カラムクロマトグラフィー（シリカゲル、ヘキサン−酢酸エチル＝５：１）により目的化合物(4)（マーキアイン）(5.4 mg, 0.0144 mmol, 23.7％)を得た。 According to the method described in Non-Patent Document 2, the synthesized compound (3) (14.5 mg, 0.061 mmol) and compound (2) (13.2 mg, 0.061 mmol) are dissolved in acetonitrile (5 mL), and tricyclohexylphosphine ( tricyclohexylphosphine) (30% in toluene, 20 μl, 0.0183 mmol) and Pd 2 (dba) 3 · CHCl 3 (63 mg, 0.0061 mmol) mixed at 60 ° C. The reaction was carried out for 4 hours under an argon atmosphere. Thereafter, the reaction solution was diluted three-fold with methylene chloride, filtered using Florisil® ( 150-250 μm), concentrated, and purified by column chromatography (silica gel, hexane-ethyl acetate = 5: 1). Compound (4) (merquiaine) (5.4 mg, 0.0144 mmol, 23.7%) was obtained.

（実験例１）天然物由来マーキアイン及び合成マーキアインのIL-4遺伝子発現に及ぼす効果
実施例１で抽出・精製した天然物由来マーキアイン及び実施例２で合成して得た合成マーキアインについて、IL-4遺伝子発現に及ぼす影響を調べた。IL-4遺伝子発現量は、上記１）に記載の方法と同手法により確認した。 (Experimental example 1) Effect of natural product-derived marquiain and synthetic marquiain on IL-4 gene expression The natural product-derived marquiain extracted and purified in Example 1 and the synthetic marquiain obtained in Example 2 were synthesized using IL-4. The effect on gene expression was investigated. The IL-4 gene expression level was confirmed by the same method as described in 1) above.

各マーキアインは、いずれもDNP-HSA抗原によるIL-4遺伝子発現を有意に抑制することを確認した（図８）。また、合成マーキアイン（実施例２）は、天然物由来マーキアイン（実施例１）に比べて、IL-4遺伝子発現抑制効果が半減していることが観察された。このことより、合成マーキアインはラセミ体で、光学活性体のうち、片方のみがIL-4遺伝子発現抑制効果を示すと考えられた。また、実施例１の抽出・精製により得たマーキアイン 0.11 g/100 mL (in chloroform) の旋光度を測定し、比旋光度を算出しところ、[α]16D= -176.4 °であった。過去の文献値との比較により、実施例１で得られた天然物由来マーキアインは(-)マーキアインであると考えられ、有効な光学活性体であると考えられた。   It was confirmed that each Markiain significantly suppressed IL-4 gene expression by DNP-HSA antigen (FIG. 8). In addition, it was observed that the synthetic marquiaine (Example 2) had an IL-4 gene expression inhibitory effect halved compared to the natural product-derived marquiain (Example 1). From these results, it was considered that synthetic marquiaine is a racemate, and only one of the optically active forms exhibits an IL-4 gene expression inhibitory effect. Further, the optical rotation of 0.11 g / 100 mL (in chloroform) of marquiaine obtained by extraction / purification in Example 1 was measured, and the specific rotation was calculated. As a result, [α] 16D = -176.4 °. By comparison with the past literature values, the natural product-derived marquiain obtained in Example 1 was considered to be (−) marquiaine and was considered to be an effective optically active substance.

（実験例２）(-)マーキアインのIL-5遺伝子発現に及ぼす効果
本実験例では、IL-5遺伝子発現に及ぼす(-)マーキアインの効果を確認した。(-)マーキアインは、実施例１で抽出・精製したマーキアインを用いた。 (Experimental example 2) Effect of (-) marquiaine on IL-5 gene expression In this experimental example, the effect of (-) marquiain on IL-5 gene expression was confirmed. The (-) marquiaine used was the marquiaine extracted and purified in Example 1.

IL-5はIL-4と同じくTh2サイトカインに分類され、活性化されたＴリンパ球や肥満細胞などから放出され、好酸球の分化、増殖、遊走などに関わる因子であり、遅発相のアレルギー反応を惹起する因子と考えられている。よって、IL-5遺伝子はアレルギー疾患感受性遺伝子であり、アレルギーの慢性化・難治化させる因子である考えられる。   Like IL-4, IL-5 is classified as a Th2 cytokine, and is released from activated T lymphocytes and mast cells. It is a factor involved in eosinophil differentiation, proliferation, migration, etc. It is considered as a factor that causes allergic reactions. Therefore, the IL-5 gene is an allergic disease susceptibility gene and is considered to be a factor that makes allergy chronic and intractable.

IL-5遺伝子発現量は、ヒト好塩基球白血病細胞KU812F細胞を用いて測定した。細胞を35 mmシャーレで培養し、DMSOに溶解した(-)マーキアインを添加して２４時間後、マイトージェン（PMA (Phorbol 12-myristate 13-acetate) (20 nM) + イオノマイシン (1 μM)）で共刺激を３時間行った。実施例１に記載と同手法により、IL-5のmRNA及びGAPDHのmRNAについて、リアルタイムRT-PCRを行なった。   IL-5 gene expression level was measured using human basophil leukemia cell KU812F cells. Cells were cultured in a 35 mm dish, and (-) marquiain dissolved in DMSO was added, and 24 hours later, mitogen (PMA (Phorbol 12-myristate 13-acetate) (20 nM) + ionomycin (1 μM)) was used together. Stimulation was performed for 3 hours. Real-time RT-PCR was performed on IL-5 mRNA and GAPDH mRNA in the same manner as described in Example 1.

その結果、(-)マーキアインは、マイトージェンによるIL-5遺伝子発現上昇を有意に抑制することが確認された（図９）。   As a result, it was confirmed that (−) marquiain significantly suppressed the increase in IL-5 gene expression by mitogen (FIG. 9).

ヒトIL-5 mRNA測定用プライマーとして、以下の配列番号４及び５に示す配列、プローブは、配列番号６に示す配列のオリゴヌクレオチドを用いた。ヒトGAPDH mRNA測定用プライマー・プローブは、市販のPre Developed TaqMan(R) Assay Reagent Control Kits (Human GAPDH) Cat No. 4310884E（アプライドバイオシステムズ）を用いた。
（配列番号４）sense primer: 5'-CAC TGA AGA AAT CTT TCA GGG AAT-3'
（配列番号５）anti-sense primer: 5'-CAG TAC CCC CTT GCA CAG TT-3'
（配列番号６）probe: FAM-ACA CTG GA-TAMRA As primers for measuring human IL-5 mRNA, oligonucleotides having the sequences shown in SEQ ID NO: 6 and the probes shown in SEQ ID NOs: 4 and 5 below were used. Human GAPDH mRNA measurement primer-probe, using a commercially available Pre Developed TaqMan (R) Assay Reagent Control Kits (Human GAPDH) Cat No. 4310884E ( Applied Biosystems).
(SEQ ID NO: 4) sense primer: 5'-CAC TGA AGA AAT CTT TCA GGG AAT-3 '
(SEQ ID NO: 5) anti-sense primer: 5'-CAG TAC CCC CTT GCA CAG TT-3 '
(SEQ ID NO: 6) probe: FAM-ACA CTG GA-TAMRA

（実験例３）(-)マーキアインのヒスタミンH1受容体（H1R）遺伝子発現に及ぼす効果
本実験例では、H1R遺伝子発現に及ぼす(-)マーキアインの効果を確認した。ヒスタミンは、アレルギー疾患の主要ディエーターであり、標的細胞のH1Rを介して主要症状が発現されることはよく知られている。ここで、H1R遺伝子はアレルギー疾患感受性遺伝子であることが、本発明者により報告されている（非特許文献１）。 (Experimental Example 3) Effect of (−) Marchiain on Histamine H 1 Receptor (H 1 R) Gene Expression In this Experimental Example, the effect of (−) Marchiain on H 1 R gene expression was confirmed. It is well known that histamine is a major eater of allergic diseases, and that major symptoms are expressed through the H 1 R of target cells. Here, it has been reported by the present inventor that the H 1 R gene is an allergic disease susceptibility gene (Non-patent Document 1).

H1R遺伝子発現量は、ヒト子宮頸癌細胞HeLa細胞を用いて測定した。細胞を35 mmシャーレで培養し、２４時間無血清培地で培養することで栄養飢餓(starvation)を行った。無血清培養開始と同時にDMSO溶解の(-)マーキアインを培地に加え、培養細胞を２４時間処置した。その後、100 nM PMAによる刺激を３時間行った。実施例１に記載と同手法により、H1RのmRNA及びGAPDHのmRNAについて、リアルタイムRT-PCRを行なった。 The expression level of H 1 R gene was measured using human cervical cancer cells HeLa cells. The cells were cultured in a 35 mm petri dish and nutrient starvation was performed by culturing in a serum-free medium for 24 hours. Simultaneously with the start of serum-free culture, DMSO-dissolved (−) marquiaine was added to the medium, and the cultured cells were treated for 24 hours. Thereafter, stimulation with 100 nM PMA was performed for 3 hours. Real-time RT-PCR was performed on H 1 R mRNA and GAPDH mRNA in the same manner as described in Example 1.

その結果、(-)マーキアインは、PMAによるH1R遺伝子発現上昇を有意に抑制することが確認された（図１０）。
ヒトH1R mRNA測定用プライマーとして、以下の配列番号７及び８に示す配列、プローブは、配列番号９に示す配列のオリゴヌクレオチドを用いた。ヒトGAPDH mRNA測定用プライマー・プローブは、実験例２と同様に市販のものを用いた。
（配列番号７）sense primer: 5'- CAG AGG ATC AGA TGT TAG GTG ATA GC - 3
（配列番号８）anti-sense primer: 5'- AGC GGA GCC TCT TCC AAG TAA - 3'
（配列番号９）probe: FAM- CTT CTC TCG AAC GGA CTC AGA TAC CAC C- TAMRA As a result, it was confirmed that (−) marquiain significantly suppressed the increase in H 1 R gene expression by PMA (FIG. 10).
As primers for measuring human H 1 R mRNA, oligonucleotides having the sequence shown in SEQ ID NO: 9 were used as the sequences and probes shown in SEQ ID NOs: 7 and 8 below. As a primer / probe for measuring human GAPDH mRNA, a commercially available product was used in the same manner as in Experimental Example 2.
(SEQ ID NO: 7) sense primer: 5'- CAG AGG ATC AGA TGT TAG GTG ATA GC-3
(SEQ ID NO: 8) anti-sense primer: 5'- AGC GGA GCC TCT TCC AAG TAA-3 '
(SEQ ID NO: 9) probe: FAM-CTT CTC TCG AAC GGA CTC AGA TAC CAC C- TAMRA

（参考例１）抗酸化作用
本参考例では、Jung（Arch Pharm Res Vol 28, No5, 534-540, 2005）の方法に基づき、実施例１で抽出・精製した(-)マーキアインの、DPPH(ジフェニル-ｐ-ピクリルヒドラジル)ラジカル消去活性について検討した。 (Reference Example 1) Antioxidant Action In this reference example, DPPH (-) of (-) marquiaine extracted and purified in Example 1 based on the method of Jung (Arch Pharm Res Vol 28, No5, 534-540, 2005). Diphenyl-p-picrylhydrazyl) radical scavenging activity was investigated.

フラボノイドは抗アレルギー作用、抗がん作用など多くの生理活性を有することがこれまでに報告されており、その分子基盤の多くはフラボノイドの持つ抗酸化作用に基づくことが公知である。そのため、マーキアインの遺伝子発現抑制作用も他のフラボノイドと同様に抗酸化作用に由来する可能性が考えられた。従来文献的には、マーキアインの抗酸化作用については、DPPHラジカル消去活性、過酸化水素誘導の細胞間活性酸素種消去活性、ONOO-消去活性を指標に検討されており、それによると、マーキアインは他の抗酸化作用を有する物質と比較して著しく抗酸化作用が弱く、抗酸化作用を有さないことが報告されている（Arch Pharm Res Vol 28, No5, 534-540, 2005）。そこで、本参考例では、DPPHラジカル消去活性を指標にマーキアインの抗酸化作用について検討した。   It has been reported so far that flavonoids have many physiological activities such as antiallergic action and anticancer action, and it is known that most of their molecular basis is based on the antioxidant action of flavonoids. For this reason, it was considered that the suppression of gene expression by marquiain may be derived from the antioxidant activity as well as other flavonoids. Previously, the anti-oxidant action of Marchiain has been studied using DPPH radical scavenging activity, hydrogen peroxide-induced intercellular reactive oxygen species scavenging activity, and ONOO-scavenging activity as an index. It has been reported that the antioxidant activity is remarkably weak compared with other substances having antioxidant activity, and has no antioxidant activity (Arch Pharm Res Vol 28, No5, 534-540, 2005). Therefore, in this reference example, the antioxidant effect of marquiaine was examined using DPPH radical scavenging activity as an index.

ポジティブコントロールとして、アスコルビン酸を使用した。150 μmol/LのDPPH (ジフェニル-ｐ-ピクリルヒドラジル)メタノール溶液 40μL と、最終濃度が50、100、150、200 μmol/Lになるように調整したマーキアインもしくはポジティブコントロールのアスコルビン酸のメタノール溶液を160 μL加え、静かに混和した。室温で３０分間放置した後、安定な有機ラジカルであるDPPHラジカルに由来する520nmの吸光度を測定し、コントロール（マーキアイン及びアスコルビン酸を含まないDPPHのみの溶液）との比を下式により算出し、DPPHラジカル消去活性とした。被験試料溶液ブランクとしては、マーキアインを添加しないメタノール溶液を用い、同様の方法で吸光度を測定した。   Ascorbic acid was used as a positive control. 40 μL of 150 μmol / L DPPH (diphenyl-p-picrylhydrazyl) methanol solution and methanol solution of Markiain or positive control ascorbic acid adjusted to final concentrations of 50, 100, 150, 200 μmol / L Was added and gently mixed. After standing at room temperature for 30 minutes, the absorbance at 520 nm derived from DPPH radical, which is a stable organic radical, was measured, and the ratio with the control (DPPH-only solution containing no marquiaine and ascorbic acid) was calculated by the following equation: DPPH radical scavenging activity. As a test sample solution blank, a methanol solution to which no markiain was added was used, and the absorbance was measured by the same method.

DPPHに対するラジカル消去作用の計算方法は以下の通りである。
DPPHラジカル消去活性（％）＝｛C−（St−Sb）｝/C×100
St: 波長520nmにおける被験試料溶液の吸光度
Sb: 波長520nmにおける被験試料溶液ブランクの吸光度
C: コントロール溶液の波長520nmにおける吸光度 The calculation method of radical scavenging action for DPPH is as follows.
DPPH radical scavenging activity (%) = {C− (St−Sb)} / C × 100
St: Absorbance of the test sample solution at a wavelength of 520 nm
Sb: Absorbance of the test sample solution blank at a wavelength of 520 nm
C: Absorbance of control solution at 520 nm wavelength

上記の結果、(-)マーキアインを200μM反応させた場合でも、抗酸化作用を殆ど有しないことが認められ（図１１）、マーキアインには抗酸化作用がないことを確認した。このことから、マーキアインの遺伝子発現抑制作用は、他のフラボノイドが有する抗酸化作用によるものではなく、新規メカニズムに基づく遺伝子発現抑制作用であることが示唆された。   As a result, it was confirmed that even when (-) marquiaine was reacted at 200 μM, it had almost no antioxidant action (FIG. 11), and it was confirmed that marquiaine had no antioxidant action. From these results, it was suggested that the gene expression inhibitory action of marquiaine was not due to the antioxidant action of other flavonoids, but the gene expression inhibitory action based on a novel mechanism.

（参考例２）(-)マーキアインのjun N-terminal kinase (JNK)活性への影響
本参考例では実施例１で抽出・精製した(-)マーキアインについて、JNKの酵素活性の抑制作用を調べた。JNKは転写因子AP-1を構成するタンパク質の一つであるc-Junをリン酸化しAP-1が関与する遺伝子発現を亢進する。フラボノイドには、JNKの酵素活性を抑制することで、様々な生理活性を示すものが多い。 (Reference Example 2) Effect of (-) marquiaine on jun N-terminal kinase (JNK) activity In this reference example, the inhibitory effect of JNK enzyme activity on (-) marquiain extracted and purified in Example 1 was examined. . JNK phosphorylates c-Jun, one of the proteins constituting transcription factor AP-1, and enhances the expression of genes involving AP-1. Many flavonoids exhibit various physiological activities by inhibiting the enzyme activity of JNK.

そこで、本参考例では、(-)マーキアインのIL-4遺伝子発現抑制作用が、JNKの酵素活性の抑制によるものであるかどうかを検討した。JNKのin vitro キナーゼアッセイは、KinaseSTAR(R) JNK Activity Assay Kit（BioVision）を用い、添付文書に記載の方法に従い行なった。まず、HeLa細胞を70 nMアニソマイシン（Sigma）で３０分処置し、JNKを活性化した。キットに附属のJNK 抽出用緩衝液を用いて細胞を粉砕し、遠心上清にJNK特異抗体を加えた後、同キットに附属のProtein A Sepharose(R)によりJNKを免疫沈降することで、活性化JNKを調製した。活性化したJNKにc-jun及びATPを含む基質溶液を加え、３０℃で１時間反応させ、生じたリン酸化c-junをリン酸化c-jun特異抗体を用いたウエスタンブロットにより検出した。ポジティブコントロールとしてJNKの阻害薬として知られているSP600125（WAKO）を用いた。 Therefore, in this reference example, it was examined whether the IL-4 gene expression inhibitory effect of (-) marquiaine was due to the suppression of JNK enzyme activity. JNK in vitro kinase assay was performed using KinaseSTAR (R) JNK Activity Assay Kit (BioVision) according to the method described in the package insert. First, HeLa cells were treated with 70 nM anisomycin (Sigma) for 30 minutes to activate JNK. By crushing the cells using the JNK extraction buffer attached to the kit, adding JNK-specific antibody to the centrifugation supernatant, and then immunoprecipitating JNK using the Protein A Sepharose (R) attached to the kit. JNK was prepared. A substrate solution containing c-jun and ATP was added to the activated JNK, reacted at 30 ° C. for 1 hour, and the resulting phosphorylated c-jun was detected by Western blot using a phosphorylated c-jun specific antibody. SP600125 (WAKO), known as a JNK inhibitor, was used as a positive control.

上記の結果、(-)マーキアインを300μM反応させた場合でも、JNKによるc-Junのリン酸化を抑制しなかった（図１２）。   As a result, phosphorylation of c-Jun by JNK was not suppressed even when (-) marquiain was reacted at 300 μM (FIG. 12).

以上詳述したように、一般式(I)で表されるフラボノイドの一種であるプテロカルパン誘導体に分類される本発明の化合物は、アレルギー疾患感受性遺伝子であるIL-4遺伝子、IL-5遺伝子及びH1R遺伝子の発現を抑制する。このことから、一般式(I)で表される化合物、即ち本発明のアレルギー疾患感受性遺伝子発現抑制物質は、アレルギー疾患感受性遺伝子発現抑制物質として効果を示す。さらに、本発明のアレルギー疾患感受性遺伝子発現抑制物質は、アレルギー疾患感受性遺伝子発現を抑制することによる抗アレルギー作用が期待され、新規な抗アレルギー剤の開発に有用である。 As described above in detail, the compounds of the present invention classified into pterocarpan derivatives, which are one of the flavonoids represented by the general formula (I), are IL-4 gene, IL-5 gene and H which are allergic disease susceptibility genes. 1 Suppresses R gene expression. From this, the compound represented by the general formula (I), that is, the allergic disease susceptibility gene expression inhibitory substance of the present invention is effective as an allergic disease susceptibility gene expression inhibitory substance. Further, the allergic disease susceptibility gene expression-suppressing substance of the present invention is expected to have an antiallergic action by suppressing the allergic disease susceptibility gene expression, and is useful for the development of a novel antiallergic agent.

なお、本発明のアレルギー疾患感受性遺伝子発現抑制物質は、抗酸化作用や、JNK阻害作用が低いことが確認されたため、抗酸化作用や、JNK阻害作用によるものではなく、新規な分子機序に基づく遺伝子発現抑制作用であることが示唆された。これにより、本発明の化合物は、他の多くのフラボノイドとは異なる作用機序により抗アレルギー作用を示すものと考えられる。   The allergic disease susceptibility gene expression-suppressing substance of the present invention was confirmed to have a low antioxidant action and JNK inhibitory action, and thus is not based on an antioxidant action or JNK inhibitory action, but based on a novel molecular mechanism. It was suggested that this is a gene expression inhibitory effect. Thus, the compound of the present invention is considered to exhibit an antiallergic action by an action mechanism different from that of many other flavonoids.

Claims (6)

以下の一般式(I)で表されるアレルギー疾患感受性遺伝子発現抑制物質。
（式中、Rは水素原子又は直鎖状若しくは分岐状の飽和若しくは不飽和脂肪族炭化水素基、置換基を有していてもよいシクロアルキル基、アリール基、アラルキル基、アルキルオキシ基、アルケニルオキシ基、アルキニルオキシ基、アリールオキシ基若しくはアラルキルオキシ基、あるいは糖の残基を表す。） An allergic disease susceptibility gene expression inhibitor represented by the following general formula (I):
(In the formula, R is a hydrogen atom, a linear or branched saturated or unsaturated aliphatic hydrocarbon group, an optionally substituted cycloalkyl group, aryl group, aralkyl group, alkyloxy group, alkenyl. Represents an oxy group, an alkynyloxy group, an aryloxy group or an aralkyloxy group, or a sugar residue.) 以下の式(II)で表される、請求項１に記載のアレルギー疾患感受性遺伝子発現抑制物質。
The allergic disease susceptibility gene expression-suppressing substance according to claim 1, which is represented by the following formula (II):
アレルギー疾患感受性遺伝子が、IL-4遺伝子、IL-5遺伝子及び／又はヒスタミンH1受容体遺伝子である、請求項１又は２に記載のアレルギー疾患感受性遺伝子発現抑制物質。 The allergic disease susceptibility gene expression inhibitor according to claim 1 or 2, wherein the allergic disease susceptibility gene is an IL-4 gene, an IL-5 gene and / or a histamine H1 receptor gene. 請求項１〜３のいずれか１に記載のアレルギー疾患感受性遺伝子発現抑制物質を有効成分として含む抗アレルギー剤。 The antiallergic agent which contains the allergic disease susceptibility gene expression inhibitory substance of any one of Claims 1-3 as an active ingredient. 請求項１〜３のいずれか１に記載のアレルギー疾患感受性遺伝子発現抑制物質の合成工程において、中間産物である7-ベンジルオキシ-2H-1-ベンゾピラン(7-benzyloxy-2H-1-benzopyran)とセサモールとのカップリング工程が、水銀化合物を用いない工程によることを特徴とする、請求項１〜３のいずれか１に記載のアレルギー疾患感受性遺伝子発現抑制物質の製造方法。 In the process of synthesizing the allergic disease susceptibility gene expression-suppressing substance according to any one of claims 1 to 3, 7-benzyloxy-2H-1-benzopyran which is an intermediate product and 7-benzyloxy-2H-1-benzopyran The method for producing an allergic disease susceptibility gene expression-suppressing substance according to any one of claims 1 to 3, wherein the coupling step with sesamol is based on a step not using a mercury compound. 水銀化合物を用いない工程が、臭素化合物を用いる工程により合成する請求項５に記載の製造方法。 The production method according to claim 5, wherein the step of using no mercury compound is synthesized by the step of using a bromine compound.
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