JP2004222657A - Method of producing 2r-monatin - Google Patents

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Abstract

<P>PROBLEM TO BE SOLVED: To provide a method of producing 2R-monatin that is one of monatin isomers having a high degree of sweetness among these isomers expected to be useful as a sweetener. <P>SOLUTION: In this method of producing 2R-monatin, an isomer mixture including both of 2S and 2R monatins is allowed to react in an reaction system containing an enzyme catalyzing the reaction to selectively convert 2S isomer to IHOG whereby the 2S isomer is decomposed and the 2R isomer remaining in the reaction mixture is collected. <P>COPYRIGHT: (C)2004,JPO&NCIPI

Description

【0001】
【発明の属する技術分野】
本発明は特定の酵素反応、好ましくはL−アミノトランスフェラーゼおよびL−アミノ酸オキシダーゼによる反応を利用して、モナティンの異性体混合物から高甘味度異性体である2R−モナティンを製造する方法に関する。
【従来の技術】
【0002】
下記式で示される4−(インドール−3−イルメチル)−4−ヒドロキシ−グルタミン酸(3−(1−アミノ−1,3−ジカルボキシ−3−ヒドロキシ−ブタン−4−イル)−インドール)(以下、「モナティン」と称する。)は、植物シュレロチトン イリシホリアス(Sclerochitom ilicifolius)の根に含有されるアミノ酸の一種であり、ショ糖の数百倍の甘味を有していることから、低カロリー甘味料として期待される化合物である(特開昭64−25757号公報参照)。
【0003】
【化1】

Figure 2004222657
【0004】
上記モナティンは2つの不斉部位(2位、4位)が存在し、天然型の立体異性体は、(2S,4S)体と報告されていた。その他の立体異性体の存在についても、合成的に調製され3種の立体異性体の存在が確認され、何れもショ糖の数十倍から数千倍の甘味強度を有することが確かめられている。
【0005】
【表1】
Figure 2004222657
【0006】
表1に示すように、天然型の(2S,4S)体のみならず、その他の立体異性体の何れもがそれぞれ高倍率の甘味強度を有しているが、2R体は2S体と比較して甘味度が非常に高い。なかでも、最も甘味度が高い異性体である(2R,4R)体は、甘味剤或いは甘味剤成分(甘味料)として期待される化合物である。従って、2R体、望ましくは(2R,4R)体のモナティンを得る方法の開発が望まれる。
【0007】
モナティンの製造方法については、過去に5例の報告が為されている。詳細は下記の先行技術文献のうち、特許文献1及び非特許文献1〜4に記載の通りである。
【0008】
【特許文献1】
米国特許第5994559号明細書
【特許文献2】
欧州特許出願公開第0736604号明細書
【非特許文献1】
テトラヘドロン レターズ(Tetrahedron Letters)、2001年、42巻、39号、6793〜6796頁
【非特許文献2】
オーガニック レターズ(Organic Letters)、2000年、2巻、19号、2967〜2970頁
【非特許文献3】
シンセティック コミュニケーション(Synthetic Communication)、1994年、24巻、22号、3197〜3211頁
【非特許文献4】
シンセティック コミュニケーション(Synthetic Communication)、1993年、23巻、18号、2511〜2526頁
【0009】
しかしながら、何れの方法も多段階の工程を必要とすることから、工業的な実施が難しい上、これら化学合成法により合成されるモナティンは複数の光学異性体を含む異性体混合物である。
【0010】
前述の通り、4種の光学異性体においてそれぞれ甘味度が異なることを既に出願人らは見出しているが、工業化に向けては高甘味度異性体である2R体、望ましくは(2R,4R)体を選択的に生成せしめる製法の開発が、単位重量当たりの甘味度および製造コスト面からみても望ましい。
【0011】
従って、そのようなモナティンを工業的に製造する上で、より簡便かつ高収率な高甘味度異性体である2R−モナティンの製造方法、さらに望ましくは(2R、4R)体の製造方法の開発が求められる。
【0012】
【発明が解決しようとする課題】
本発明が解決しようとする課題は、甘味料等の成分として期待されるモナティンのなかでも甘味度の高い異性体である2R−モナティンの製造方法を提供することにある。さらに、本発明は、モナティンの異性体混合物の甘味度を改善する方法を提供することを目的とする。
【0013】
【課題を解決するための手段】
本発明者等は前記課題を解決すべく鋭意検討した結果、化学合成法などの方法で合成したモナティンの光学異性体の複数の混合物に、特定の酵素反応、好ましくはL−トランスアミナーゼおよび/またはL−アミノ酸オキシダーゼによる反応を利用して、比較的甘味度が低い2S体のモナティンを選択的に脱アミノ化することにより、2R−モナティンを製造する方法を見出し、本発明を完成させるに至った。
【0014】
本発明においては、酵素反応を利用して、モナティンの異性体混合物中における2S体を、下記構造式を有する4−(インドール−3−イルメチル)−4−ヒドロキシ−2−オキソグルタル酸(以下、IHOGと略)に変換させるため、2R体は反応系に未反応のまま残る。モナティンとIHOGとは晶析等の方法により容易に分割可能である。従って、反応系に残存するモナティンを回収することにより、高甘味度異性体である2R体の含有率が高い2R−モナティンを得ることができる。
【0015】
【化2】
Figure 2004222657
【0016】
なお、本願明細書において、「2R体」とは、2位の不斉についてR配置を有するモナティンを意味する。モナティンは2位の他、4位にも不斉を有するので、2R体には(2R、4R)体、(2R、4S)体の2つがある。また、「2S体」とは、2位の不斉についてS配置を有するモナティンを意味し、(2S、4R)体、(2S、4S)体の2つがある。以下、簡便のため、(2R、4R)体、(2R、4S)体、(2S、4R)体、(2S、4S)体を、それぞれRR体、RS体、SR体、SS体と称する場合がある。また、本発明の製造方法により得られる「2R−モナティン」とは、高甘味度異性体である2R体の含有率が高いモナティンを意味する。
【0017】
また、もうひとつの本発明であるモナティンの甘味度改善方法は、酵素反応を利用してモナティンの異性体混合物中の2S体を選択的にIHOGに変換させ、高甘味度異性体である2R体の含有率を向上させることにより、モナティンの甘味度を改善する方法である。
【0018】
即ち、本発明は以下の通りである。
【0019】
〔1〕 2S体および2R体の双方を含むモナティンの異性体混合物を、2S体のモナティンに選択的に作用してIHOGを生成する反応を触媒する酵素を含有する反応系で反応させることにより、2S体を分解させる工程、および
前記反応系から残存するモナティンを回収して2R−モナティンを得る工程
を含むことを特徴とする、2R−モナティンの製造方法。
【0020】
〔2〕 前記酵素は、L−アミノトランスフェラーゼおよび/またはL−アミノ酸オキシダーゼであることを特徴とする、〔1〕記載の2R−モナティンの製造方法。
【0021】
〔3〕 前記L−アミノトランスフェラーゼはL−アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼであることを特徴とする、〔2〕記載の2R−モナティンの製造方法。
【0022】
〔4〕 前記L−アミノトランスフェラーゼは、Aeromonas属、Agrobacterium属、Alcaligenes属、Beijerinckia属、Escherichia属、Proteus属、Morganella属からなる群より選ばれる微生物に由来することを特徴とする、〔2〕または〔3〕記載の2R−モナティンの製造方法。
【0023】
〔5〕 前記微生物は、Aeromonas hydrophila、Agrobacterium tumefaciens、Alcaligenes faecalis、Beijerinckia indica、Escherichia coli、Proteus rettgeri及びMorganella morganiiからなる群より選ばれることを特徴とする、〔4〕記載の2R−モナティンの製造方法。
【0024】
〔6〕 前記L−アミノトランスフェラーゼは、L−アミノトランスフェラーゼ遺伝子を導入した微生物の産生するL−アミノトランスフェラーゼであることを特徴とする、〔2〕または〔3〕記載の2R−モナティンの製造方法。
【0025】
〔7〕 前記L−アミノトランスフェラーゼ遺伝子は、Escherichia coliに由来するL−アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ遺伝子であることを特徴とする、〔6〕記載の2R−モナティンの製造方法。
【0026】
〔8〕 前記反応系にアミノ基受容体として、α−ケト酸を含有することを特徴とする、〔2〕〜〔7〕のいずれか一つに記載の2R−モナティンの製造方法。
【0027】
〔9〕 さらに前記反応系に、前記α−ケト酸から副生するL−アミノ酸に対して作用するL−アミノ酸オキシダーゼを含有することを特徴とする、〔8〕記載の2R−モナティンの製造方法。
【0028】
〔10〕 前記α−ケト酸は、α−ケトグルタル酸であり、かつ、前記L−アミノ酸オキシダーゼは、L−グルタミン酸オキシダーゼであることを特徴とする、〔9〕記載の2R−モナティンの製造方法。
【0029】
〔11〕 前記L−グルタミン酸オキシダーゼは、Streptomyces属またはAzotobacterに由来することを特徴とする、〔10〕記載のモナティンの2R−モナティンの製造方法。
【0030】
〔12〕 前記L−アミノ酸オキシダーゼは、蛇毒由来L−アミノ酸オキシダーゼであることを特徴とする、〔2〕記載の2R−モナティンの製造方法。
【0031】
〔13〕 前記モナティンの異性体混合物は、(2S、4S)体および(2R、4R)体を含み、前記酵素は、Escherichia coli由来L−アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼであることを特徴とする、〔1〕記載の2R−モナティンの製造方法。
【0032】
〔14〕 前記モナティンの異性体混合物は、(2S、4R)体および(2R、4R)体を含み、前記酵素は、蛇毒由来L−アミノ酸オキシダーゼであることを特徴とする、〔1〕記載の2R−モナティンの製造方法。
【0033】
〔15〕 さらに前記反応系に、IHOGから2R体のモナティンを生成する反応を触媒するD−アミノトランスフェラーゼを含有することを特徴とする〔1〕〜〔14〕のいずれか一つに記載の2R−モナティンの製造方法。
【0034】
〔16〕 前記D−アミノトランスフェラーゼは、Bacillus属又はPaenibacillus属に属する微生物に由来することを特徴とする、〔15〕記載の2R−モナティンの製造方法。
【0035】
〔17〕 前記微生物は、Bacillus sphaericus、Bacillus pulvifaciens、Bacillus macerans、Bacillus lentus、Paenibacillus larvae subsp. pulvifaciens及びPaenibacillus maceransからなる群より選ばれることを特徴とする、〔16〕記載の2R−モナティンの製造方法。
【0036】
〔18〕 前記D−アミノトランスフェラーゼは、D−アミノトランスフェラーゼ遺伝子を導入した微生物の産生する酵素であることを特徴とする、〔15〕記載の2R−モナティンの製造方法。
【0037】
〔19〕 前記D−アミノトランスフェラーゼ遺伝子は、Bacillus sphaericus又はBacillus maceransに由来することを特徴とする、〔18〕記載の2R−モナティンの製造方法。
【0038】
〔20〕 (2S、4R)体および(2R、4R)体の双方を含むモナティンの異性体混合物を、(2S、4R)体のモナティンに選択的に作用して4R−IHOGを生成する反応を触媒する酵素、および、4R−IHOGから(2R、4R)体のモナティンを生成する反応を触媒するD−アミノトランスフェラーゼを含有する反応系で反応させることにより、(2S、4R)体を(2R、4R)体に変換する工程、
前記反応系からモナティンを回収して(2R、4R)−モナティンを得る工程
を含むことを特徴とする、(2R、4R)−モナティンの製造方法。
【0039】
〔21〕 2S体および2R体の双方を含むモナティンの異性体混合物を、2S体のモナティンに選択的に作用してIHOGを生成する反応を触媒する酵素を含有する反応系で反応させ、2S体のモナティンの少なくとも一部を分解させることにより、高甘味度異性体である2R体の含有率を向上させることを特徴とするモナティンの甘味度改善方法。
【0040】
【発明の実施の形態】
本発明は、2R体および2S体の双方を含むモナティンの異性体混合物を、2S体のモナティンに選択的に作用してIHOGを生成する反応を触媒する酵素を含有する反応系で反応させ、2S体を分解させることにより、2R−モナティンを製造する方法に関する。
【0041】
本発明の製造方法により得られる「2R−モナティン」とは、高甘味度異性体である2R体の含有率が高いモナティンを意味する。2R体の含有率が高いとは、2R体含有率が60%以上であることを意味する。2R体含有率は、80%以上であることが好ましく、90%以上であることがより好ましく、95%以上であることがさらに好ましく、100%であることが特に好ましい。また、本発明の製造方法により得られる「2R−モナティン」のうち、(2R、4R)体の含有率が高いモナティンを「(2R、4R)−モナティン」と称する場合がある。(2R、4R)体の含有率が高いとは、(2R、4R)体の含有率が60%以上であることを意味する。(2R、4R)体含有率は、80%以上であることが好ましく、90%以上であることがより好ましく、95%以上であることがさらに好ましく、100%であることが特に好ましい。
【0042】
例えば、RR体、RS体、SR体、SS体の4種異性体混合物を用いて2S体を選択的に脱アミノ化させると、下記に示すように、2S体であるSR体、SS体はそれぞれ4R−IHOG、4S−IHOGに変換され、2R体であるRR体、RS体は未反応のまま反応系に残る。従って、反応系に残存するモナティンを回収することにより高甘味度異性体である2R体(RR体、RS体)を高含有率で含む2R−モナティンを得ることができる。
【0043】
RR体 → 回収
RS体 → 回収
SR体 → 4R−IHOG
SS体 → 4S−IHOG
【0044】
以下、本発明について、下記の順に詳細に説明する。
〔I〕酵素
〔II〕モナティンの異性体混合物
〔III〕反応方法
〔IV〕反応の具体例
【0045】
〔I〕酵素
本発明においては、2S体のモナティンに選択的に作用してIHOGを生成する反応を触媒する酵素を用いる。当該酵素反応により、モナティンの異性体混合物中の2S体を分解して、高甘味度異性体である2R−モナティンを製造する。
【0046】
「2S体のモナティンに選択的に作用してIHOGを生成する反応を触媒する酵素」とは、具体的には、2S体:2R体=1:1の異性体混合物を作用させた場合、反応後に残存するモナティンの50%超、好ましくは80%超、より好ましくは90%超が2R体となる酵素を意味する。好ましくは、2S体のみに作用し、2R体には作用しない酵素であることが好ましい。
【0047】
また、当該酵素は、SR体およびSS体の少なくとも一方に作用する酵素であれば足りるが、好ましくはSR体およびSS体の双方に対して作用する酵素であることが好ましい。
【0048】
当該酵素としては、2S体のモナティンを基質として対応するケト酸であるIHOGを生成する反応を触媒する酵素であれば特に制限は無く、L−アミノトランスフェラーゼ、L−アミノ酸オキシダーゼ、L−アミノ酸デヒドロゲナーゼ等を使用できる。これらのなかでも、L−アミノトランスフェラーゼないしL−アミノ酸オキシダーゼを使用することが好ましい。また、これらの酵素を複数種類組み合わせて作用させることもできる。
【0049】
以下、簡便のため、L−アミノトランスフェラーゼを「LAT」、L−アミノ酸オキシダーゼを「LAO」と略記する場合がある。
【0050】
(A)L−アミノトランスフェラーゼ
本発明において2S体のモナティンを脱アミノ化する酵素としてL−アミノトランスフェラーゼ(LAT)を用いる場合について説明する。
【0051】
L−アミノトランスフェラーゼとはL−アミノ酸のアミノ基転移反応を触媒する酵素である。「アミノ基転移反応」とは、アミノ供与体基質であるL−アミノ酸をケトン化合物に転化し、アミノ基受容体であるケトン化合物前駆体をその対応するアミノ化合物に転化する反応である。
【0052】
本発明では、2S体のモナティンがアミノ供与体基質(L−アミノ酸)に相当し、2S体のモナティンのアミノ基をアミノ基受容体へと転移させることによりIHOGを生成する。
【0053】
アミノ基受容体(ケトン化合物前駆体)としては、α−ケト酸の1種又は複数種を用いることが好ましい。α−ケト酸の例としては、α−ケトグルタル酸、オキザロ酢酸、ピルビン酸等を挙げることができる。アミノ基転移反応により、これらのα−ケト酸はアミノ化されると、それぞれ、L−グルタミン酸、L−アスパラギン酸、L−アラニンを副生する。
【0054】
酵素としてLATを用いる場合、下記反応式に示す反応により、2S体のモナティンが脱アミノ化され、IHOGを生成する。また、α−ケト酸として用いたα−ケトグルタル酸(α−KG)は、アミノ化されL−グルタミン酸を生成する。
【0055】
【化3】
Figure 2004222657
【0056】
LATとしては2S体のモナティンを基質としたL−アミノトランスフェラーゼ活性作用を有する酵素であれば特に制限は無いが、特に好ましくはL−アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ(AspAT)を用いることができる。
【0057】
このような酵素は、当該LATを生産する微生物を培養することによっても調製することができる。このような微生物としては、例えばアエロモーナス(Aeromonas)属、アグロバクテリウム(Agrobacterium)属、アルカリゲネシス(Alcaligenes)属、バチルス(Bacillus)属、ベイジェリンキア(Beijerinckia)属、エシェリヒア(Escherichia)属、プロテウス(Proteus)属及びモルガネラ(Morganella)属に属する微生物を挙げることができる。
【0058】
これらの微生物として、具体的には、次のものが例として挙げられる。即ち、2S体のモナティンからIHOGへと変換するL−アミノトランスフェラーゼ生産菌としては下記の例を挙げることができる。
【0059】
アエロモーナス ヒドロフィラ Aeromonas hydrophila IFO3820;
アグロバクテリウム ツメファシエンス Agrobacterium tumefaciens IFO3058;
アルカリゲネス フェカリスAlcaligenes faecalis ATCC8750;
ベイジェリンキア インディカBeijerinckia indica ATCC9037;
エシェリヒア コリ Escherichia coli ATCC 12814;
プロテウス レットゲリ Proteus rettgeri IFO13501;
モルガネラ モルガニイ Morganella morganii IFO3848。
【0060】
これらの微生物は、土壌、植物等自然界より新たに分離された菌株であってもよいし、また更に変異導入薬剤処理や組換DNA技術等により人為的に育種された菌株であってもよい。
【0061】
また、LAT活性を有する微生物として、LAT遺伝子を導入した微生物を使用することができる。このような微生物にはEscherichia coliを使用することができる。
【0062】
当該LAT遺伝子、望ましくはアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ遺伝子(aspC遺伝子)には、Escherichia coli由来のものを使用することができる。
【0063】
酵素としてLATを用いる場合、平衡反応であるアミノ基転移反応を不可逆反応であるL−アミノ酸オキシダーゼによる脱アミノ化反応と組み合わせることにより、2S体のモナティンの脱アミノ化効率を高めることもできる。
【0064】
すなわち、LATによるアミノ基転移反応は一般的に平衡反応であるため、平衡状態に達するとそれ以上脱アミノ化反応は進行しないが、下記反応式に示すように、LAT反応により副生するアミノ化合物を脱アミノ化するL−アミノ酸オキシダーゼ(LAO)を併用することより、平衡状態を脱アミノ化反応側にシフトさせることができる。これにより、2S体のモナティンの脱アミノ化反応効率を上げることができる。
【0065】
【化4】
Figure 2004222657
【0066】
なお、後述の2S体のモナティンを選択的に脱アミノ化するために用いるLAOは、LAT反応により副生するアミノ化合物を脱アミノ化するために用いるLAOとは異なることを明記しておく。2S−モナティンを選択的に脱アミノ化するために用いるLAOと、LAT反応により副生するアミノ化合物を脱アミノ化するために用いるLAOとを区別するために、前者を単に「L−アミノ酸オキシダーゼ(LAO)」、後者を「アミノ化合物除去用L−アミノ酸オキシダーゼ(アミノ化合物除去用LAO)」と称することにする。
【0067】
アミノ化合物除去用LAOとしては、L−アミノトランスフェラーゼ反応により副生するアミノ化合物に対して作用する酵素であればよい。
【0068】
このような2種類の酵素カップリング(LAT+アミノ化合物除去用LAO)の一例を挙げると、L−アミノトランスフェラーゼ反応にアミノ基受容体としてα−ケトグルタル酸を用いた場合には、アミノ化合物としてL−グルタミン酸が副生するので、アミノ化合物除去用LAOとしては、L−グルタミン酸オキシダーゼを併用することが好ましい。この場合、用いるL−グルタミン酸オキシダーゼとしては、L−グルタミン酸を脱アミノ化する活性を有する酵素であれば特に制限はないが、一例を挙げると放線菌由来L−グルタミン酸オキシダーゼを用いることができる。
【0069】
これらアミノ化合物除去用LAOは、LATによる2S−モナティンの脱アミノ化反応開始時に添加してもよいし、LAT反応途中から添加してもよい。
【0070】
前述のアミノ化合物除去用LAOは、当該酵素を生産する微生物を培養することによっても調製することができる。このような微生物としては、例えばストレプトマイセス(Streptomyces)属、アゾトバクター(Azotobacter)属に属する微生物を挙げることができる(特公昭61−26357号公報;アンチバイオチキ イ キミオテラピラ (Antibiotiki i Khimioterapiya)、1998年、43巻4号、7〜13頁;ヨーロピアン ジャーナル オブ バイオケミストリー (European
Journal of Biochemistry)、1989年、182巻2号、327〜332頁)。
【0071】
これらの微生物は、土壌、植物等自然界より新たに分離された菌株であってもよいし、また更に変異導入薬剤処理や組換DNA技術等により人為的に育種された菌株であってもよい。
【0072】
(B)L−アミノ酸オキシダーゼ
次に、2S体のモナティンを脱アミノ化する酵素としてL−アミノ酸オキシダーゼ(LAO)を用いる場合について説明する。
【0073】
L−アミノ酸オキシダーゼとは、Oを酸化剤として、L−アミノ酸を酸化する反応を触媒する酵素である。本発明では、2S体のモナティンがL−アミノ酸に相当し、2S体のモナティンが酸化されることによりIHOGを生成する。
【0074】
本発明において用いるLAOは、2S体のモナティンを酸化してIHOGを生成する反応を触媒する酵素であれば限定はないが、好ましくは蛇毒由来LAOが用いられる。
【0075】
酵素としてLAOを用いる場合、下記反応式に示す反応により、2S体のモナティンは酸化され、IHOGを生成する。
【0076】
【化5】
Figure 2004222657
【0077】
上記反応の際に副生する過酸化水素によって基質(IHOG、モナティン)が分解される場合があるので、これを抑制するため、カタラーゼを反応系に添加して過酸化水素を分解することが好ましい(下記反応式参照)。微生物をL−アミノ酸オキシダーゼ源とする場合、微生物自身のカタラーゼ活性により、過酸化水素を十分に除去できることもあるが、L−アミノ酸オキシダーゼとして精製酵素を用いる場合は過酸化水素の影響を受けるので、カタラーゼを併用することが好ましい。
【0078】
【化6】
Figure 2004222657
【0079】
(C)その他の酵素
本発明においては、2S体のモナティンに選択的に作用してIHOGを生成する反応を触媒する酵素の他、さらに反応系にIHOGからモナティンの2R体を生成する反応を触媒するD−アミノトランスフェラーゼを含有させることも好ましい。D−アミノトランスフェラーゼを用いることにより、酵素反応で副生する4R−IHOG、4S−IHOGをそれぞれRR体、RS体のモナティンとして再生することができ、コスト面からみても本法は望ましい。
【0080】
RR体 → 回収
RS体 → 回収
SR体 → 4R−IHOG → RR体→ 回収
SS体 → 4S−IHOG → RS体→ 回収
【0081】
このようなD−アミノトランスフェラーゼ産生菌としては、例えば、下記の例を挙げることができる。
【0082】
バチルス スフェリカス Bacillus sphaericus ATCC10208
パエニバチルス ラバエ サブスピシーズ プルビファシエンス Paenibacillus larvae subsp. pulvifaciens ATCC 13537
バチルス マセランス Bacillus macerans AJ1617
パエニバチルス マセランス Paenibacillus macerans ATCC 8244
バチルス レンタス Bacillus lentus ATCC 10840
【0083】
尚、バチルス マセランス Bacillus macerans AJ1617については下記の通り寄託されている。
【0084】
Bacillus macerans AJ1617株
(イ)受託番号 FERM BP−8243
(ロ)受託日 2001年12月13日
(ハ)寄託先 独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター(日本国茨城県つくば市東1丁目1番地1中央第6)
【0085】
これらの微生物は、土壌、植物等自然界より新たに分離された菌株であってもよいし、また更に変異導入薬剤処理や組換DNA技術等により人為的に育種された菌株であってもよい。
【0086】
〔II〕モナティンの異性体混合物
本発明において、出発物質として用いるモナティンの異性体混合物は、2R体および2S体の双方を含んでいればよく、その組成比は特に限定されない。
【0087】
したがって、例え異性体混合物であっても、RR体とRS体の混合物のように、2S体を含まない異性体混合物や、SR体とSS体の混合物ように2R体を含まない異性体混合物は、本発明における「モナティンの異性体混合物」には該当しない。
【0088】
出発物質として用いるモナティンの異性体混合物の調製方法は特に限定されず、化学合成法、酵素法等の公知の方法を用いることができるが、一例を挙げれば、下記反応式に示すように、インドール−3−ピルビン酸とピルビン酸(ないしオキサロ酢酸)とのアルドール縮合により前駆体ケト酸(IHOG)を合成し、次いでIHOGの2位をアミノ化する方法等が挙げられる。
【0089】
【化7】
Figure 2004222657
【0090】
化学合成法を用いた場合、モナティンは、RR、RS、SR、SS体の4種異性体混合物として得られる。RR、RS、SR、SS体の4種異性体混合物を用いて、酵素反応により2S体を脱アミノ化させた場合、2S体であるSR体、SS体はそれぞれ4R−IHOG、4S−IHOGに変換され、2R体であるRR体、RS体は未反応のまま反応系に残る。従って、反応系に残存するモナティンを回収することにより高甘味度異性体である2R体(RR体、RS体)を高含有率で含む2R−モナティンを得ることができる。
【0091】
2S体であるSR体、SS体のうち、いずれか一方にのみ作用する酵素を用いる場合、酵素反応で除去できないもう一方の2S体を、晶析法等の手法を用いて予め除去しておくことが好ましい。すなわち、SS体にのみ作用する酵素を用いる場合は、出発物質として、SR体が除去されたモナティンの異性体混合物を用い、SR体にのみ作用する酵素を用いる場合は、SS体が除去されたモナティンの異性体混合物を用いることが好ましい。これにより、2R−モナティン中における2S体の含有率を下げ、単位重量あたりの甘味度の高いモナティンを得ることができる。
【0092】
例えば、化学合成法にて合成したモナティンの4種異性体混合物を、参考例1に示すような条件下において、(SS+RR)のラセミ混合物として晶析・分離することにより、異性体混合物からSR体を除去することができる。このSR体を除去した(SS+RR)のラセミ混合物に、SS体にのみ作用する酵素を作用させることにより、RR体からなる2R−モナティンが得られる。
【0093】
また、参考例2に示すように、モナティンの前駆体である4−ヒドロキシ−4−(3−インドリルメチル)−2−ヒドロキシイミノグルタル酸を4R体と4S体に分割し、4R体のモナティン前駆体から(SR+RR)を合成することにより、SS体を含まない異性体混合物を調製することができる。このSS体を含まない(SR+RR)の異性体混合物に、SR体にのみ作用する酵素を作用させることにより、RR体からなる2R−モナティンが得られる。なお、ここでいう(SR+RR)の異性体混合物とは、主としてSR体とRR体からなるモナティンの異性体混合物を意味し、不純物レベルでRS体、SS体を含んでいても良い。不純物レベルとは、含有量が異性体混合物全体の5%未満、好ましくは3%未満であることを意味する。この際、2R−モナティンの収率を上げるため、SR体から副生する4R−IHOGをD−アミノトランスフェラーゼを用いてRR体のモナティンとして再生させることが好ましい。
【0094】
可能であれば、酵素反応で除去できなかった2S体を、酵素反応後に除去してもよい。酵素反応後に未反応の2S体を除去する方法としては、例えば、4種異性体混合物に対し、SS体にのみ作用する酵素を用いて反応させ、RR、RS、SR体の3種異性体混合物を得た後、晶析により、母液からRR体を析出させることにより、酵素反応で除去できない2S体(この場合、SR体)を除去できる。
【0095】
〔III〕反応方法
本発明において、酵素は、当該酵素活性を発揮できる状態であれば、いかなる形態で反応系に存在させてもよい。すなわち、LATやLAOについては、2S体のモナティンに選択的に作用してIHOGを生成できる状態であればよい。また、LATと併用するアミノ化合物除去用LAO、LAOと併用するカタラーゼ、IHOGを2R体のモナティンに再生させるためのD−アミノトランスフェラーゼについては、それぞれの酵素活性を発揮できる状態であればよい。
【0096】
例えば、酵素を単体で反応系に添加してもよいし、当該酵素活性を有する微生物(酵素産生菌、組み換えDNAによって形質転換された細胞)、該微生物の培養物(液体培養、固体培養等)、培地(培養物から菌体を除去したもの)、該培養物の処理物を反応系に添加してもよい。微生物の培養物を用いる場合は、微生物を培養させながら同時に反応を進行させてもよいし、予め酵素を得るために培養された培養物を用いて反応を行っても良い。また、ここでの「処理」とは、菌体内の酵素を取り出すことを目的として行う処理を意味し、例えば超音波、ガラスビーズ、フレンチプレス、凍結乾燥処理や溶菌酵素、有機溶剤、界面活性剤等による処理等が挙げられる。また、これ等の処理を行った処理物を、定法(液体クロマトグラフィーや硫安分画等)によって調製した粗分画酵素や精製酵素であって、必要とする能力を有するものであれば、これを用いてもよい。
【0097】
更に、上記培養物或いはその処理物の利用の際、これ等をカラギーナンゲルやポリアクリルアミドに包括、或いはポリエーテルスルホンや再生セルロース等の膜に固定化して使用することも可能である。
【0098】
本発明の一つの好ましい様態において、目的とするL−アミノトランスフェラーゼやL−アミノ酸オキシダーゼをコードする遺伝子を微生物細胞中に組み込むこともできる。尚、組み換えDNA技術を利用して酵素、生理活性物質等の有用タンパク質を製造する例は数多く知られており、組み換えDNA技術を用いることで、天然に微量に存在する有用タンパク質を大量生産できる。組み込まれる遺伝子の一例としては、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ(aspC遺伝子)が挙げられる。遺伝子の由来はこれに限定されるものではなく、目的とする2S−モナティンを脱アミノ化するようなL−アミノトランスフェラーゼ活性を有するような酵素をコードする遺伝子であればよい。
【0099】
組み換えDNA技術を用いてタンパク質を大量生産する場合、形質転換される宿主細胞としては、細菌細胞、放線菌細胞、酵母細胞、カビ細胞、植物細胞、動物細胞等を用いることができる。このうち、組換えDNA操作について知見のある微生物としてはBacillus、Pseudonomas、Brevibacterium、Corynebacterium、Streptomyces、及びEscherichia coli等が挙げられる。一般には、大腸菌を用いてタンパク質を大量生産する技術について数多くの知見があるため、大腸菌、好ましくはEscherichia coliが用いられる。
【0100】
これら微生物へは、目的とするL−アミノトランスフェラーゼ遺伝子やL−アミノ酸オキシダーゼ遺伝子を塔載したプラスミド、ファージ等のベクターを用いて導入してもよいし、相同組換えによって該細胞の染色体上に目的遺伝子を組み込んでもよい。好ましくは、いわゆるマルチコピー型のプラスミドベクターが挙げられ、例えばEscherichia coliへのベクターとしてはCol E1由来の複製開始点を有するプラスミド、例えばpUC系のプラスミドやpBR322系のプラスミド、或いはその誘導体が挙げられる。これらベクターには目的とするアミノ基転移酵素遺伝子を発現させるプロモーターとして、通常大腸菌においてタンパク質生産に用いられるプロモーターを使用することができ、例えば、T7プロモーター、trpプロモーター、lacプロモーター、tacプロモーター、PLプロモーター等の強力なプロモーターが挙げられる。また、生産量を増大させるためには、タンパク質遺伝子の下流に転写終結配列であるターミネーターを連結することが好ましい。このターミネーターとしては、T7ターミネーター、fdファージターミネーター、T4ターミネーター、テトラサイクリン耐性遺伝子のターミネーター、大腸菌trpA遺伝子のターミネーター等が挙げられる。また、形質転換体を選別するために、該ベクターはアンピシリン耐性遺伝子等のマーカーを有することが好ましく、このようなプラスミドとして、例えば、pUC系(宝酒造(株)製)、pPROK系(クローンテック製)、pKK233−2(クローンテック製)等のように強力なプロモーターを持つ発現ベクターが市販されている。
【0101】
次に、本発明における微生物の培養方法について説明する。本発明における微生物の培養方法としては、通常この分野において用いられる培地、即ち炭素源、窒素源、無機塩類、微量金属塩類、ビタミン類等を含む培地を用いて行うことができる。また、微生物の種類或いは培養条件によっては、培地中に0.1〜1.0g/dl程度のアミノ酸等のアミノ化合物を添加することによって、アミノ基転移反応活性を促進することもできる。
【0102】
遺伝子組換え細胞を培養する場合は、ベクターの選択マーカーに対応してアンピシリン、カナマイシン、ネオマイシン、クロラムフェニコール等の薬剤を適宜添加することもできる。また、ベクターに塔載されているプロモーターに合わせて、誘導剤を適量添加することによって該組換え遺伝子の発現量を上げることもできる。一例を挙げると、lacプロモーターの下流に目的とする遺伝子を連結してベクターを構築した場合は、イソプロピル1−チオ−β−D−ガラクトピラノシド(IPTG)を終濃度0.1mM〜5mMの範囲で適宜添加することも可能であり、また、この代りとしてガラクトースを終濃度0.1〜5g/dl望ましくは0.5g/dl〜2g/dl適宜添加することもできる。
【0103】
モナティンの菌体内への透過性を高めるために、トライトン X(Triton X)やトゥイーン(Tween)等の界面活性剤やトルエン、キシレン等の有機溶媒を利用することもできる。また、反応促進物質として、ピリドキサール−5−リン酸等の補酵素類を上記培地に添加してもよい。上記培地成分として用いる具体的物質として、例えば、炭素源としては、利用する微生物が利用可能であれば制限は無く、例えばグルコース、シュークロース、フルクトース、グリセロール、酢酸等、又はこれらの混合物を使用することができる。窒素源としては、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、尿素、酵母エキス、肉エキス、コーンスティープリカー、カゼイン加水分解物等、或いはこれらの混合物を使用することができる。具体的な培地組成として、例えばフマル酸 0.5g/dl、酵母エキス 1g/dl、ペプトン 1g/dl、硫安 0.3g/dl、KHPO 0.3g/dl、KHPO 0.1g/dl、FeSO・7HO 1mg/dl、及びMnSO・4HO 1mg/dl(pH7.0)を含む培地等が挙げられる。
【0104】
培養温度は、通常、利用する微生物が生育する範囲内、即ち10〜45℃で行われるが、好ましくは20℃〜40℃、更に好ましくは25〜37℃の範囲である。また、培地のpH値については、好ましくは2〜12、より好ましくは3〜10、更に好ましくは4〜8の範囲で調節される。通気条件については、利用する微生物の生育に適した条件に設定されるが、好気条件が好ましい。培養時間については、通常12〜120時間、好ましくは24〜96時間程度である。
【0105】
反応温度については、通常、利用する酵素が活性を有する範囲内、即ち好ましくは10〜50℃で行われるが、より好ましくは20〜40℃、更に好ましくは25〜37℃の範囲で行われる。反応溶液のpH値については、通常、2〜12、好ましくは6〜11、更に好ましくは7〜9の範囲で調節される。反応時間については、通常1〜120時間程度、好ましくは1〜72時間程度、更に好ましくは1〜24時間程度が選択される。
【0106】
菌体又は菌体処理物の使用量については、所与の反応の場合において目的とする効果を発揮する量(有効量)であればよく、この有効量については当業者であれば簡単な予備実験により容易に求められるが、例えば、洗浄湿潤菌体の場合、反応液100ml当たり1〜40gである。
【0107】
尚、培養液或いは反応液中のモナティンあるいはIHOGを定量する場合、周知の方法を用いて速やかに測定することができる。即ち、簡便にはMerck社製「Silica gel 60F254」等を利用した薄層クロマトグラフィーを利用することができ、より分析精度を高めるには、ジーエルサイエンス社製「Inertsil ODS−80A」やダイセル化学工業(株)製「CROWNPAK CR(+)」等の光学分割カラムを利用した高速液体クロマトグラフィー(HPLC)を用いればよい。
【0108】
このようにして、培養液或いは反応液中に蓄積されたIHOGおよび残存モナティンは、常法により培養液或いは反応液中より採取して用いることができる。培養液或いは反応液中からの採取は、このような場合に当該分野において通常使用されている周知の手段、例えば濾過、遠心分離、真空濃縮、イオン交換クロマトグラフィー、吸着クロマトグラフィー、結晶化等の操作が必要に応じて適宜組み合わせて用いられる。
【0109】
反応系に残存するモナティンを回収する方法に特に限定はなく、公知の手法を用いることができる。目的とする2R−モナティンは遊離体の形で取得することができるが、必要により塩の形態で取得することもできる。塩の形態としては、塩基との塩を挙げることができる。例えば、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化カルシウム等の無機塩基、アンモニア、各種アミン等の有機塩基を挙げることができる。
【0110】
〔IV〕具体例
まず、Escherichia coli由来L−アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼを用いて2R−モナティンを製造する方法について説明する。当該酵素は、2S体のうちSS体にのみ作用するので、RR体、RS体、SR体、SS体の4種異性体混合物に作用させた場合、SS体が脱アミノ化されて4S−IHOGとなり、RR体、RS体、SR体は未反応のまま残る。
【0111】
この際、アミノ基転移反応により副生するアミノ化合物(ここではL−Glu)を脱アミノ化するアミノ化合物除去用LAO(L−Glu oxidase)を併用して、平衡状態を脱アミノ化反応側にシフトさせることが好ましい。アミノ基転移反応は平衡反応であるが、アミノ化合物除去用LAOを用いてアミノ化合物を脱アミノ化することにより、L−アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼによるアミノ基転移反応を100%進行させることができる。
【0112】
【化8】
Figure 2004222657
【0113】
L−アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼを用いた場合、反応系から回収されたモナティンは、SS体が除去された分、単位重量当たりの甘味度が改善される。
【0114】
なお、当該酵素反応によってはSR体は除去できないため、甘味度をより向上させるためには、酵素反応前に予めSR体を除去しておくか、酵素反応後にSR体を除去することが好ましい。
【0115】
酵素反応前にSR体を除去する方法としては、例えば、下記▲1▼のように、晶析法によりSS体とRR体のラセミ混合物(SS+RR)を調製し、当該ラセミ混合物にAspATを作用させて、SS体を4S−IHOGに変換して、RR体を製造する方法がある。また酵素反応後にSR体を除去する方法としては、例えば、下記▲2▼のように、まず4種異性体混合物中のSS体のみを4S−IHOGに変換させた後、晶析によってRR体のみ析出させることにより、RR体を製造できる。これらの方法によれば、最も甘味度の高いRR体が得られるため、単位重量あたりの甘味度が高いモナティンが得ることができ好ましい。
【0116】
【化9】
Figure 2004222657
【0117】
次に、蛇毒由来L−アミノ酸オキシダーゼを用いて、2R−モナティンを製造する場合について説明する。当該酵素は、2S体のうち、SR体にのみ作用するので、RR体、RS体、SR体、SS体の4種異性体混合物に作用させた場合、RR体、RS体、SS体は未反応のまま残る。従って、反応系から回収されたモナティンは、SR体が除去された分、単位重量当たりの甘味度が改善される。
【0118】
蛇毒由来L−アミノ酸オキシダーゼを用いた場合、酵素反応によってSS体を除去することができないため、甘味度をより向上させるためには、SS体を除去することが好ましい。
【0119】
例えば、下記のように、参考例2の方法を用いて、RR体とSR体のモナティンの異性体混合物(RR+SR)を合成し、当該異性体混合物に蛇毒由来LAOを作用させると、SR体を選択的に4R−IHOGに変換して、RR体を製造することができる。
【0120】
蛇毒由来L−アミノ酸オキシダーゼを用いる場合、2R体の収率を上げるため、SR体から副生する4R−IHOGをD−アミノトランスフェラーゼを用いてRR体のモナティンとして再生させることが好ましい。D−アミノトランスフェラーゼによって4R−IHOGをRR体に変換する反応は、蛇毒由来L−アミノ酸オキシダーゼによる反応と同時に行っても良いし、蛇毒由来L−アミノ酸オキシダーゼによる反応と分割して行っても良いが、反応の簡略化の観点からは、前者が好ましい。
【0121】
【化10】
Figure 2004222657
【0122】
また、SS体にのみ作用する酵素と、SR体にのみ作用する酵素を組み合わせて用いることにより、SS体とSR体をIHOGに変換することも好ましい。このような酵素の組み合わせの一例としては、上記Escherichia coli由来LAOと蛇毒由来LAOとの組み合わせ酵素を組み合わせが挙げられる。
【0123】
この場合、最終生産物として得られる2R−モナティンは、RS体とRR体の混合物となる。さらに甘味度を向上させたい場合は、晶析法等の手法を用いて、2R−モナティンからRR体を単離してもよい。
【0124】
【化11】
Figure 2004222657
【0125】
【実施例】
以下に実施例及び参考例を示し本発明を更に具体的に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
【0126】
尚、実施例1で用いたモナティンの(2S、4S)、(2R、4R)体は、後述の参考例1により調製したものであり、実施例2、3で用いたモナティンの(2S、4R)、(2R、4R)体は、後述の参考例2を用いて調整したものである。
【0127】
また、本実施例において、モナティンの定量は、ジーエルサイエンス社製「Inertsil ODS−80A 」(5μm, 6X150mm)を利用した高速液体クロマトグラフィーにより行った。分析条件は、以下に示す通りである。
【0128】
移動相:12%(v/v) アセトニトリル/0.05%(v/v) トリフルオロ酢酸水溶液;
流速:1.5ml/min;
カラム温度:30℃;及び
検出:UV210nm
【0129】
本分析条件により、モナティンの(2S、4S)体及び(2R、4R)体は12.1分に、(2S、4R)体及び(2R、4S)体は9.7分にて分別定量ができる。
【0130】
また、必要に応じて、ダイセル化学工業製光学分割カラム「CROWNPAK CR(+)」(4.6X150mm)を利用した高速液体クロマトグラフィーによる分析も行った。分析条件は以下に示す通りである。
【0131】
移動相:過塩素酸水溶液(pH1.5)/10%(v/v)メタノール;
流速:0.5ml/min;
カラム温度:30℃;及び
検出:UV210nm。
【0132】
本条件によりモナティン光学異性体は(2R、4S)体、(2R、4R)体、(2S、4R)体、及び(2S、4S)体の順に42分、57分、64分、及び125分のリテンションタイムにて分別定量ができる。
【0133】
実施例1 L−アミノトランスフェラーゼを用いたモナティンの(2S、4S)、(2R、4R)体混合物からの(2S、4S)体の選択的脱アミノ化
(1)aspartate aminotransferase (aspC)高発現E. coliの作製
(1−1)trpプロモーター及びrrnBターミネーター搭載プラスミドpTrp4の構築
エシェリヒア コリ(Escherichia coli)W3110染色体DNA上のtrpオペロンのプロモーター領域を表に示すオリゴヌクレオチドをプライマーとしてPCR(表2:▲1▼と▲2▼の組み合わせ)により目的遺伝子領域を増幅し、得られたDNA断片をpGEM−Teasyベクター(プロメガ製)にライゲーションした。このライゲーション溶液でE.coli JM109を形質転換し、アンピシリン耐性株の中からtrpプロモーターの方向がlacプロモーターと反対向きに挿入された目的のプラスミドを有する株を選択した。次にこのプラスミドをEcoO109I/EcoRIにて処理して得られるtrpプロモーターを含むDNA断片と、pUC19(Takara製)のEcoO109I/EcoRI処理物とライゲーションした。このライゲーション溶液でE.coli JM109を形質転換し、アンピシリン耐性株の中から目的のプラスミドを有する株を選択し、プラスミドをpTrp1と命名した。次にpKK223−3(Amersham Pharmacia製)をHindIII/HincIIにて処理し、得られたrrnBターミネーターを含むDNA断片とpTrp1のHindIII/PvuII処理物とライゲーションした。このライゲーション溶液でE.coli JM109を形質転換し、アンピシリン耐性株の中から目的のプラスミドを有する株を選択し、プラスミドをpTrp2と命名した。次にpTrp2を鋳型として表に示すオリゴヌクレオチドをプライマーとしてPCR(表2:▲1▼と▲3▼の組み合わせ)によりtrpプロモーター領域を増幅した。このDNA断片をEcoO109I/NdeIにより処理し、pTrp2のEcoO109I/NdeI処理物とライゲーションした。このライゲーション溶液でE.coliJM109を形質転換し、アンピシリン耐性株の中から目的のプラスミドを有する株を選択し、このプラスミドをpTrp4と命名した。
【0134】
【表2】
Figure 2004222657
【0135】
(1−2)aspC遺伝子発現プラスミドptrpAspCの構築とE.coliでの発現
プライマーaspC−5’Nde (5’−CGC AGT CAT ATG TTT GAG AAC ATT ACC GCC GCT −3’)およびaspC−3’Eco(5’−CGC GAA TTC ATT GTT TTT AAT GCT TAC AGC A−3’)を用いてエシェリヒア コリ(Esherichia coli)W3110染色体DNAより増幅した約1.2kbpの断片をNdeI/EcoRI消化し、pTrp4のNdeI/EcoRIサイトに挿入したプラスミドptrpAspCを構築した。構築した発現プラスミドをE.coli JM109に導入し、形質転換体を50μg/mlアンピシリンを含むLB培地培地50mlに接種し、37℃、16時間振盪培養した。培養終了後、集菌し、20mM Tris−HCl(pH7.6)に懸濁して洗浄を行い、再度集菌して洗浄菌体を得た。
【0136】
(2)AspC高発現E.coliを用いたモナティンの(2S、4S)、 (2R、4R)体混合物からの(2S、4S)−モナティンの選択的脱アミノ化
100mM Tris−HCl(pH8.0)、50mM (2S、4S)体モナティン、50mM (2R、4R)体モナティン、1mM PLP、1% (w/v)AspC高発現E.coli洗浄菌体からなる反応液に、アミノ基受容体として200 mM 2−ケトグルタル酸ないし200 mM オキザロ酢酸をそれぞれ添加した反応区を設定した。反応液1mlを試験管に入れ、33℃で16時間振とう反応させた。その結果、2−ケトグルタル酸区において30mM相当の(2S、4S)体が、オキザロ酢酸区において26mM相当の(2S、4S)体がそれぞれIHOGへと変換された。なお、いずれの実験区においても(2R、4R)体のモナティンはほぼ分解を受けずに反応系に残存した。
【0137】
(3)AspC高発現E.coliとL−グルタミン酸オキシダーゼの組み合わせによる(2S、4S)、(2R、4R)体混合物からの(2S、4S)体の選択的脱アミノ化
100mM Tris−HCl(pH8.0)、50mM (2S、4S)体モナティン、50mM (2R、4R)体モナティン、200mM 2−ケトグルタル酸、1mM PLP、1% (w/v) AspC高発現E.coli洗浄菌体からなる反応液1mlを試験管に入れた。2つの実験区を設定し、一方には反応開始1時間後に 2U/mlのStreptomyces sp.由来L−グルタミン酸オキシダーゼ(Sigma社製)および2000U/ml カタラーゼ(Sigma社製)を添加して反応を実施した。30℃で16時間振とう反応を実施した結果、L−グルタミン酸オキシダーゼ無添加区においては30mM相当の(2S、4S)体モナティンがIHOGへと変換されたのに対して、L−グルタミン酸オキシダーゼ添加区においては(2S、4S)体モナティンの全量がIHOGへと変換された。なお、いずれの実験区においても(2R、4R)体はほぼ分解を受けずに反応系に残存した。この結果より、L−アミノ酸オキシダーゼとL−グルタミン酸オキシダーゼをカップリングさせることにより(2S、4S)、(2R、4R)体混合物より(2S、4S)体を選択的に完全に脱アミノ化せしめ、(2R、4R)体のモナティンを採取せしめることができた。
【0138】
実施例2 L−アミノ酸オキシダーゼを用いたモナティンの(2S、4R)、(2R、4R)体混合物からの(2S、4R)体の選択的脱アミノ化
100mM Tris−HCl(pH8.0)、1U/ml 蛇毒由来L−アミノ酸オキシダーゼ(L−amino acid oxidase from Crotalus adamanteus)(Sigma社製)、3000U/ml カタラーゼ(Sigma社製)、0.26 g/dl (2S、4R)体のモナティン、1.74 g/dl (2R、4R)体のモナティンからなる反応液1mlを試験管に入れ、30℃で16時間振とうさせた。反応終了後のモナティン量をHPLCにて測定したところ、(2S、4R)体は完全に4R−IHOGへと脱アミノ化されている一方で、(2R、4R) 体は分解を受けずに反応液中に残存し、(2S、4R)、(2R、4R)体混合物から (2S、4R)体を選択的に脱アミノ化し4R−IHOGへと変換せしめた。
【0139】
実施例3 L−アミノ酸オキシダーゼを用いたモナティンの(2S、4R)、(2R、4R)体混合物からの(2S、4R)体の4R−IHOGへの選択的脱アミノ化およびD−アミノトランスフェラーゼ発現E.coliによる4R−IHOGの(2R、4R)体モナティンへの変換
(1)Bacillus macerans AJ1617株由来D−アミノトランスフェラーゼ遺伝子(bmdat)のクローニング
(1−1)染色体DNAの調製
Bacillus macerans AJ1617株を50mlのブイヨン培地を用いて30℃で一晩培養した(前培養)。この培養液5mlを種菌として、50mlのブイヨン培地を用いて本培養を行った。対数増殖後期まで培養した後、培養液50mlを遠心分離操作(12000×g、4℃、15分間)に供し、集菌した。この菌体を用いて定法に従って染色体DNAを調製した。
【0140】
(1−2)遺伝子ライブラリからのbmdat遺伝子の単離
まず、Bacillus macerans AJ1617株の染色体DNA30μgに制限酵素EcoRIを1U添加し、37℃にて3時間反応させて部分消化した。次にこのDNAからアガロースゲル電気泳動にて3〜6kbpの断片を回収した。これをプラスミドpUC118のEcoRI切断物(BAP処理済み・宝酒造製)1μgとライゲーションさせ、E. coli JM109を形質転換して遺伝子ライブラリを作製した。これをアンピシリンを含むLB培地培地(トリプトン1%、酵母エキス0.5%、塩化ナトリウム1%、寒天2%、pH7.0)にプレーティングして、コロニーを形成させた。出現したコロニーをアンピシリンとイソブチル−1−チオ−β−D−アミノトランスフェラーゼ−ガラクトピラノシド(IPTG)を0.1mM含むLB培地液体培地にて37℃で一晩培養後、遠心・集菌して菌体を得た。得られた菌体を、100mM Tris−HCl (pH8.0)、50mM ピルビン酸ナトリウム、100 mM D−グルタミン酸、1 mM ピリドキサール−5´−リン酸、1% (v/v)トルエンからなる反応液に接種し、30℃で30分間反応させた。反応終了後、反応液を遠心分離した上清5μlを200μlのピルビン酸定量反応液(100 mM Tris−HCl (pH 7.6)、1.5 mM NADH、5 mM MgCl、16 U/ml Lactate dehydrogenase(オリエンタル酵母製))を含む96ウェルプレートに加え、30℃で10分間反応させた後に340nmの吸光度をプレートリーダー(SPECTRA MAX190、Molecular Device社製)を用いて測定した。同様の反応を終濃度0.2mM〜1mMのピルビン酸ナトリウムを添加して実施し、これをスタンダードとしてピルビン酸の減少量を定量し、D−アミノトランスフェラーゼ活性を検出した。
【0141】
上記スクリーニングにより、D−アミノトランスフェラーゼ活性を示すクローンを採取した。これら形質転換体よりD−アミノトランスフェラーゼ遺伝子を含むプラスミドを調製し、pUCBMDATと命名した。プラスミドpUCBMDATをEcoRI処理してアガロースゲル電気泳動に供したところ、挿入断片の長さは約3.3kbpと見積もられた。
【0142】
(1−3)挿入断片の塩基配列
プラスミドpUCBMDATの挿入断片の塩基配列をジデオキシ法によって決定したところ、配列表配列番号6に示す配列のうち、630番から1481番に対応する約850bpからなるORFを見出した。本ORFについて既知配列との相同性検索を行ったところ、Bacillus sphaericus ATCC10208株由来のD−アミノトランスフェラーゼ遺伝子とアミノ酸配列において91%の相同性を、Bacillus sp. YM−1株由来のD−アミノトランスフェラーゼ遺伝子とアミノ酸配列において66%の相同性を、Bacillus licheniformis ATCC10716株由来のD−アミノトランスフェラーゼ遺伝子とアミノ酸配列において42%の相同性を示した。この結果より、本ORFはD−アミノトランスフェラーゼ伝子をコードしていることが明らかとなった。なお、ここでの相同性は、遺伝子解析ソフト「genetyx ver.6」(GENETYX社)を用い、各種パラメータは初期設定の通りとして算出した値である。
【0143】
(2)L−アミノ酸オキシダーゼを用いたモナティンの(2S、4R)、(2R、4R)体混合物からの(2S、4R)体の4R−IHOGへの選択的脱アミノ化およびBacillus macerans由来D−アミノトランスフェラーゼ(BMDAT)発現E.coliを用いたIHOGからの2R体モナティンの生産の組み合わせ反応
(2−1)BMDAT発現E.coliの調製
pUCBMDATを持つE.coli 形質転換体0.1mg/ml アンピシリンを含むLB培地培地(バクトトリプトン 1g/dl、酵母エキス 0.5g/dl、及びNaCl 1g/dl)で37℃、16時間シード培養した。LB培地培地50mlを張り込んだ500ml容坂口フラスコにこのシード培養液を1ml添加し、37℃にて本培養を行った。培養開始2.5時間後に、終濃度1mMとなるようにイソプロピル1−チオ−β−D−ガラクトピラノシド(IPTG)を添加し、更に4時間培養を行った。得られた培養液より集菌、洗浄し、BMDAT発現E.coliを調製した。
【0144】
(2−2)L−アミノ酸オキシダーゼおよびD−アミノトランスフェラーゼの組み合わせ反応
100 mM Tris−HCl (pH 8.0)、1 U/蛇毒由来L−アミノ酸オキシダーゼ(L−amino acid oxidase from Crotalus adamanteus)(Sigma社製)、2000 U/ml カタラーゼ (Sigma社製)、13.4 mM (2S、4R)体モナティン、81.4 mM (2R、4R)体モナティン、1mM ピリドキサール−5´−リン酸、100 mM D−Alaからなる反応液1mlを試験管に入れた。2つの実験区を設定し、一方には上記で作製したD−アミノトランスフェラーゼ発現E.coliの洗浄菌体を湿菌体重量で約1%(w/v)となるように添加した。これら反応液を、30℃で16時間振とうさせ反応を実施した。その結果、D−アミノトランスフェラーゼ無添加区においては(2S、 4R)体のモナティンが完全に4R−IHOGへと変換された。さらにD−アミノトランスフェラーゼ添加区においては(2S、4R)体のモナティンが完全に変換された上に、(2R、4R)体モナティン量が81.4mM から87.6mMへと増加した。即ち、L−アミノ酸オキシダーゼとD−アミノトランスフェラーゼを組み合わせることによりモナティンの(2S、4R)、(2R、4R)体混合物から (2S、4R)体を4R−IHOGへと選択的に脱アミノ化し、さらに4R−IHOGから(2R、4R)体のモナティンを生成せしめることができた。
【0145】
参考例1 モナティンの(2S、4S)、(2R、4R)体混合物の調製
(1)モナティンの4種立体異性体混合物の合成
(1−1)4−ヒドロキシ−4−(3−インドリルメチル)−2−ヒドロキシイミノグルタル酸の合成
水50mlに水酸化カリウム(純度85%)13.8gを溶解した後、インドール−3−ピルビン酸5.0g(24.6mmol)及びオキサロ酢酸9.8g(73.8mmol)を加えて室温にて72時間反応を行った。反応液に対してヒドロキシルアミン塩酸塩6.8g(98.4mmol)を加えた。その際、4規定水酸化ナトリウム水溶液にて反応液のpH値を7.5に調節した。そのまま室温にて24時間攪拌した後に、6規定塩酸にて反応液のpH値を2.6に調節した。酢酸エチルを用いて抽出した後に、有機層を飽和食塩水にて洗浄、無水硫酸マグネシウムにて乾燥し、濃縮乾固した。得られた残渣を14%アンモニア水10mlに溶解し、エタノール70mlを徐々に滴下して室温にて3時間攪拌した。得られたスラリーを濾過し、取得した結晶を乾燥することで、4−ヒドロキシ−4−(3−インドリルメチル)−2−ヒドロキシイミノグルタル酸2.7g(7.9mmol)をアンモニウム塩として得た。
【0146】
(NMR測定)
H NMR(DMSO−d)δ:2.66(s, 2H), 2.89(d, J= 14.4 Hz, 1H), 3.04(d, J= 14.4 Hz, 1H), 6.89−6.94(m, 1H), 6.97−7.03(m, 1H), 7.11(d, J= 2.8 Hz, 1H), 7.27(d, J= 7.8 Hz, 1H), 7.53(d, J= 7.8 Hz, 1H), 10.71(br s, 1H)
【0147】
(分子量測定)
ESI−MS 計算値C1414=306.28, 分析値305.17(MH
【0148】
(1−2)4−ヒドロキシ−4−(3−インドリルメチル)−2−アミノグルタル酸(モナティン)の合成
4−ヒドロキシ−4−(3−インドリルメチル)−2−ヒドロキシイミノグルタル酸アンモニウム塩0.13g(0.38mmol)を28%アンモニア水5mlに溶解し、5%ロジウム炭素0.09gを加えて室温にて7.5気圧の水素圧にて反応させた。14時間後に触媒を濾過し、反応液を濃縮乾固することで(2S、4S)/(2R、4R)−4−ヒドロキシ−4−(3−インドリルメチル)−2−アミノグルタル酸(モナティン)のアンモニウム塩0.075g(0.23mmol)及び(2S、4R)/(2R、4S)−4−ヒドロキシ−4−(3−インドリルメチル)−2−アミノグルタル酸(モナティン)のアンモニウム塩0.036g(0.11mmol)を混合物として得た。
【0149】
(NMR測定)
H NMR (DO) δ:2.05(dd, J=12.2, 15.1Hz, 0.67H), 2.21 (dd, J= 9.9, 15.6 Hz, 0.33H) , 2.48 (dd, J= 3.2, 15.6 Hz, 0.33H) , 2.68 (dd, J= 2.2, 15.1 Hz, 0.67H) , 3.08 (d, J= 14.4 Hz, 0.67H) , 3.17 − 3.25 (m, 0.66H) , 3.28 (d, J= 14.4 Hz, 0.67H) , 3.63 (dd, J= 2.2, 12.2 Hz, 0.67H) , 3.98(dd, J=3.2, 9.9Hz, 0.33H) , 7.12 − 7.18 (m, 1H) , 7.19 − 7.26 (m, 2H), 7.45 − 7.51 (m, 1H) , 7.70 − 7.76 (m, 1H)。
【0150】
(分子量測定)
ESI−MS 計算値 C1416 = 292.29, 分析値 291.28 (MH)。
【0151】
(2)モナティン4種立体異性体混合物のアンモニウム塩の(2S、4S)体と(2R、4R)体とのラセミ体結晶及び(2S、4R)体と(2R、4S)体とのラセミ体結晶への分割
(1)に記載の方法を利用して別途合成したモナティンの光学異性体混合物(モナティン[(2S、4S)+(2R、4R)]体:モナティン[(2S、4R)+(2R、4S)]体=6:4;H NMR (DO)での積分値での比により算出)のアンモニウム塩10.00g(32.33mmol)を、2.5%アンモニア水100mlに溶解し、溶液を20mlになるまで濃縮した。新たに5%アンモニア水3mlを加え均一にした後、室温にて30分静置した。結晶析出後、5%アンモニア水/エタノール=25/75の水溶液80mlを加えて均一にし、モナティン[(2S、4S)+(2R、4R)]体アンモニウム塩の結晶を濾取した。得られた結晶を再び2.5%アンモニア水30mlに溶解し濃縮した後、5%アンモニア水0.5mlとエタノール30mlにて再結晶し、モナティン[(2S、4S)+(2R、4R)]体アンモニウム塩結晶 4.80g(15.52mmol、HPLC純度98.0%)を得た。
【0152】
H NMR(DO)δ:1.95−2.02(m,1H),2.58−2.62(m,1H),3.01−3.05(m,1H),3.21−3.24(m,1H),3.55−3.58(m,1H),7.07−7.11(m,1H),7.14−7.18(m,2H),7.42−7.44(d,1H),7.66−7.68(d,1H)
【0153】
ESI−MS 291.39(M−H)
【0154】
融点 182〜186℃
【0155】
前述の操作で得た濾液(モナティン[(2S、4S)+(2R、4R)]体:モナティン[(2S、4R)+(2R、4S)]体=3:10)を5mlになるまで濃縮した。新たに5%アンモニア水3mlを加えて均一にした後、室温にて10分静置した。結晶析出後、エタノール80mlを加えて均一にし、モナティン[(2S、4R)+(2R、4S)]アンモニウム塩の結晶を濾取した。得られた結晶を再び2.5%アンモニア水30mlに溶解し濃縮した後、5%アンモニア水0.5mlとエタノール30mlによる再結晶を3回おこない、モナティン[(2S、4R)+(2R、4S)]体アンモニウム塩結晶 3.10g(10.02mmol、HPLC純度98.2%)を得た。総回収率は79.0%であった。
【0156】
H NMR(DO)δ:2.11−2.17(m,1H),2.38−2.43(m,1H),3.16(s,2H),3.90−3.93(m,1H),7.06−7.10(m,1H),7.13−7.17(m,2H),7.41−7.43(d,1H),7.66−7.68(d,1H)
【0157】
ESI−MS 291.19(M−H)
【0158】
融点 167.2〜168.4℃
【0159】
参考例2 モナティンの(2S、4R)、(2R、4R)体混合物の調製
参考例中、光学純度測定は下記条件でHPLCにて行った。
<光学異性体分離用カラム> (株)住化分析センター製 SUMICHIRAL OA−7100
<溶離液> 20mM燐酸緩衝液(pH=2.8):アセトニトリル=7:3
<カラム温度> 10℃
<流速> 0.6ml/min
【0160】
(1)4−ヒドロキシ−4−(3−インドリルメチル)−2−ヒドロキシイミノグルタル酸の製造
1.6wt%水酸化ナトリウム水溶液917gに、インドール−3−ピルビン酸73.8g(352mmol)を加えて溶解した。反応溶液を35℃とし、30%水酸化ナトリウム水溶液を用いてpH値を11.1に保ちながら、50%ピルビン酸水溶液310.2g(1761mmol)を2時間かけて滴下した。更に4.5時間反応させて、4−ヒドロキシ−4−(3−インドリルメチル)−2−ケトグルタル酸を含有する反応溶液を得た。これに、30%水酸化ナトリウム水溶液にてpH値を7に保ちながら、40%ヒドロキシルアミン塩酸塩水溶液367.2g(2114mmol)を加え、5℃にて17.5時間攪拌した。濃塩酸を用いて反応液のpH値を2にし、有機物を酢酸エチルで抽出した。有機層を飽和食塩水で洗浄し、濃縮して残渣を得た。残渣に28%アンモニア水60mlと2−プロパノール1350mlから再結晶を行い、4−ヒドロキシ−4−(3−インドリルメチル)−2−ヒドロキシイミノグルタル酸の2アンモニウム塩43.4g(142mmol:収率40% 対インドール−3−ピルビン酸)を結晶として得た。
【0161】
(2)(4S)−4−ヒドロキシ−4−(3−インドリルメチル)−2−ヒドロキシイミノグルタル酸の(R)−(+)−1−フェニルエチルアミン塩の製造
4−ヒドロキシ−4−(3−インドリルメチル)−2−ヒドロキシイミノグルタル酸のアンモニウム塩44.7g(0.131モル)を25℃で水500mlに溶解後、36%塩酸25.5gにてその水溶液のpHを2にした。酸性溶液を酢酸エチル1300mlで抽出し、その酢酸エチル溶液を飽和食塩水200mlで洗浄した。得られた酢酸エチル溶液に炭酸ナトリウム水溶液500ml(炭酸ナトリウム 13.9g 0.131モル)を加え攪拌し、アルカリ水溶液と酢酸エチルを分離した。得られたアルカリ水溶液に36%塩酸23.1gを添加し液のpHを2にした。この酸性水溶液に(R)−(+)−1−フェニルエチルアミン6.99g(57.6mmol)を滴下し25℃にて1時間攪拌する。得られた結晶をろ過し、減圧乾燥して(4S)−4−ヒドロキシ−4−(3−インドリルメチル)−2−ヒドロキシイミノグルタル酸の(R)−(+)−1−フェニルエチルアミン塩21.8g(47.8mmol)を得た。(収率72.7% 光学純度87.4%)
【0162】
H−NMR(400MHz, DMSO−d)σ:1.48 (d, 3H, J = 6.8 Hz), 2.63(d, 1H, J =14.0 Hz), 2.70(d, 1H, J= 14.0 Hz), 2.90 (d, 1H, J = 14.1 Hz), 3.06 (d, 1H, J = 14.1 Hz), 4.40 (q, 1H, J = 6.8 Hz), 6.91−7.54 (m, 10H).
【0163】
(3)(4R)−4−ヒドロキシ−4−(3−インドリルメチル)−2−ヒドロキシイミノグルタル酸の(S)−(−)−1−フェニルエチルアミン塩の製造
(1)で得られた結晶ろ過液に、更に(S)−(−)−1−フェニルエチルアミン7.12g(58.7mmol)を滴下し25℃にて1時間攪拌した。得られた結晶をろ過し、減圧乾燥して(4R)−4−ヒドロキシ−4−(3−インドリルメチル)−2−ヒドロキシイミノグルタル酸の(S)−(−)−1−フェニルエチルアミン塩23.8g(53.3mol)を得た。(収率81.1% 光学純度92.1%)
【0164】
(4)(4S)−4−ヒドロキシ−4−(3−インドリルメチル)−2−ヒドロキシイミノグルタル酸のアンモニウム塩の製造
25℃にて、(4S)−4−ヒドロキシ−4−(3−インドリルメチル)−2−ヒドロキシイミノグルタル酸の(R)−(+)−1−フェニルエチルアミン塩21.8g(51.0mmol)に水200ml及び28%アンモニア水18.5gを加えて溶解させた後、さらにトルエン200mlを加えて攪拌した。分層して得られた水層を60℃に加温し、その水溶液に2−プロパノール900mlを2時間かけて滴下した。この2−プロパノール水溶液を10℃まで5時間かけて冷却した後、10℃で10時間攪拌した。得られた結晶をろ過し、減圧乾燥して(4S)−4−ヒドロキシ−4−(3−インドリルメチル)−2−ヒドロキシイミノグルタル酸のアンモニウム塩14.75gを得た。(収率85.1% 光学純度99.0%)
融点;205℃(分解)
比旋光度 [α]20 +13.4(c=1.00, HO)
【0165】
(5)(4R)−4−ヒドロキシ−4−(3−インドリルメチル)−2−ヒドロキシイミノグルタル酸のアンモニウム塩の製造
上記実施例と同様に、(4R)−4−ヒドロキシ−4−(3−インドリルメチル)−2−ヒドロキシイミノグルタル酸の(R)−(+)−1−フェニルエチルアミン塩23.8g(53.3mmol)から(4R)−4−ヒドロキシ−4−(3−インドリルメチル)−2−ヒドロキシイミノグルタル酸のアンモニウム塩16.2gを得た。(収率89.3% 光学純度99.9%)
比旋光度 [α]20 −13.6(c=1.00, HO)
【0166】
(6)(2R、4R)及び(2S、4R)モナティンのアンモニウム塩の製造
(4R)−4−ヒドロキシ−4−(3−インドリルメチル)−2−ヒドロキシイミノグルタル酸のアミン塩10.0g(光学純度94.4%、22.4mmol)を28%アンモニア水120mlに溶解し、5%ロジウム炭素(50%含水品)7.4gを加えて室温にて1MPaの水素圧で反応を行った。24時間後に触媒をろ過し、反応液にトルエン50mlを添加した。トルエン層と水層を分離し、得られた水層を濃縮した。濃縮物に90%エタノール水50mlを加え25℃で10時間攪拌した。析出した粗結晶をろ過し、減圧乾燥することにより(2R、4R)及び(2S、4R)モナティンのアンモニウム塩2.8gを得た(収率42%)
【0167】
(2R、4R):(2S、4R):(2S、4S):(2R、4S)=82.4:12.3:3:2.3(HPLCエリア比)
【0168】
【発明の効果】
本発明の2R−モナティンの製造方法により、モナティン異性体混合物から甘味度の高い異性体である2R−モナティンを製造することができる。さらに晶析法等を組み合わせることにより最も甘味度の高い(2R、4R)−モナティンを製造することができるので、本発明は工業上、特に食品の分野において極めて有用である。
【0169】
【配列表】
Figure 2004222657
Figure 2004222657
Figure 2004222657
Figure 2004222657
Figure 2004222657
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Figure 2004222657
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[0001]
TECHNICAL FIELD OF THE INVENTION
The present invention relates to a method for producing 2R-monatin, a high-sweetness isomer, from a mixture of isomers of monatin using a specific enzymatic reaction, preferably a reaction with L-aminotransferase and L-amino acid oxidase.
[Prior art]
[0002]
4- (Indol-3-ylmethyl) -4-hydroxy-glutamic acid (3- (1-amino-1,3-dicarboxy-3-hydroxy-butan-4-yl) -indole) represented by the following formula , Referred to as "monatin") is a kind of amino acid contained in the root of the plant Sclerochitom ilicifolius, and has a sweetness several hundred times that of sucrose, so it is used as a low-calorie sweetener. It is a promising compound (see JP-A-64-25557).
[0003]
Embedded image
Figure 2004222657
[0004]
The monatin has two asymmetric sites (positions 2 and 4), and the natural stereoisomer has been reported as a (2S, 4S) form. Regarding the presence of other stereoisomers, the existence of three types of stereoisomers prepared synthetically has been confirmed, and it has been confirmed that each of them has a sweetness intensity several tens to several thousand times that of sucrose. .
[0005]
[Table 1]
Figure 2004222657
[0006]
As shown in Table 1, not only the natural (2S, 4S) form but also each of the other stereoisomers has a high-magnification sweetness intensity, but the 2R form has a higher sweetness intensity than the 2S form. Very sweet. Among them, the (2R, 4R) isomer having the highest degree of sweetness is a compound expected as a sweetener or a sweetener component (sweetener). Therefore, it is desired to develop a method for obtaining 2R-form, preferably (2R, 4R) -form monatin.
[0007]
Five cases of monatin production have been reported in the past. Details are as described in Patent Document 1 and Non-Patent Documents 1 to 4 among the following prior art documents.
[0008]
[Patent Document 1]
U.S. Pat. No. 5,994,559
[Patent Document 2]
EP-A-0736604
[Non-patent document 1]
Tetrahedron Letters, 2001, 42, 39, 6793-6796.
[Non-patent document 2]
Organic Letters, 2000, Vol. 2, No. 19, pp. 2967-2970.
[Non-Patent Document 3]
Synthetic Communication, 1994, Vol. 24, No. 22, pp. 3197-3211.
[Non-patent document 4]
Synthetic Communication, 1993, 23, 18, 2511-2526.
[0009]
However, each method requires a multi-step process, which makes industrial implementation difficult, and monatin synthesized by these chemical synthesis methods is an isomer mixture containing a plurality of optical isomers.
[0010]
As described above, the applicants have already found that the four optical isomers have different degrees of sweetness, but for industrialization, the 2R isomer, which is a high sweetness isomer, preferably (2R, 4R) It is desirable to develop a process for selectively producing the body from the viewpoint of sweetness per unit weight and production cost.
[0011]
Therefore, in industrially producing such monatin, a method for producing 2R-monatin, which is a simpler and high-yield isomer having high sweetness, and more desirably, a method for producing (2R, 4R) isomers. Is required.
[0012]
[Problems to be solved by the invention]
The problem to be solved by the present invention is to provide a method for producing 2R-monatin, which is an isomer having a high degree of sweetness among monatin expected as a component of a sweetener or the like. It is a further object of the present invention to provide a method for improving the sweetness of a mixture of isomers of monatin.
[0013]
[Means for Solving the Problems]
The present inventors have conducted intensive studies in order to solve the above-mentioned problems. As a result, a specific enzyme reaction, preferably L-transaminase and / or L-transaminase, was added to a plurality of mixtures of monatin optical isomers synthesized by a method such as a chemical synthesis method. -A method for producing 2R-monatin by selectively deaminating 2S-form monatin having relatively low sweetness by utilizing the reaction with amino acid oxidase was found, and completed the present invention.
[0014]
In the present invention, the 2S form in a mixture of isomers of monatin is converted into 4- (indol-3-ylmethyl) -4-hydroxy-2-oxoglutarate (hereinafter referred to as IHOG) having the following structural formula by utilizing an enzymatic reaction. 2R) remains unreacted in the reaction system. Monatin and IHOG can be easily separated by a method such as crystallization. Therefore, by collecting monatin remaining in the reaction system, 2R-monatin having a high content of the 2R-isomer, which is a high-sweetness isomer, can be obtained.
[0015]
Embedded image
Figure 2004222657
[0016]
In the specification of the present application, the “2R-isomer” means monatin having an R configuration with respect to the asymmetry at the 2-position. Since monatin has asymmetry at the 4-position in addition to the 2-position, there are two (2R, 4R) and (2R, 4S) forms in the 2R form. Further, the “2S form” means monatin having an S configuration with respect to the asymmetry at the 2-position, and there are two forms, (2S, 4R) form and (2S, 4S) form. Hereinafter, for convenience, the (2R, 4R) body, (2R, 4S) body, (2S, 4R) body, and (2S, 4S) body will be referred to as RR body, RS body, SR body, and SS body, respectively. There is. In addition, “2R-monatin” obtained by the production method of the present invention means monatin having a high content of the 2R-isomer having high sweetness.
[0017]
Another method of improving the sweetness of monatin according to the present invention is to selectively convert 2S-form in a mixture of isomers of monatin into IHOG using an enzymatic reaction to obtain 2R-form which is a high-sweetness isomer. Is a method for improving the degree of sweetness of monatin by improving the content ratio of monatin.
[0018]
That is, the present invention is as follows.
[0019]
[1] By reacting an isomer mixture of monatin containing both 2S-form and 2R-form in a reaction system containing an enzyme which selectively acts on 2S-form monatin and catalyzes a reaction for producing IHOG, A step of decomposing the 2S body, and
Recovering monatin from the reaction system to obtain 2R-monatin
A method for producing 2R-monatin, comprising:
[0020]
[2] The method for producing 2R-monatin according to [1], wherein the enzyme is L-aminotransferase and / or L-amino acid oxidase.
[0021]
[3] The method for producing 2R-monatin according to [2], wherein the L-aminotransferase is L-aspartate aminotransferase.
[0022]
[4] the L-aminotransferase is derived from a microorganism selected from the group consisting of Aeromonas, Agrobacterium, Alcaligenes, Beijerinckia, Escherichia, Proteus, and Morganella, [2] or [3] The method for producing 2R-monatin according to [3].
[0023]
[5] The microorganism is selected from the group consisting of Aeromonas hydrophila, Agrobacterium tumefaciens, Alcaligenes faecalis, Beijerinckia indica, Escherichia coli, and a microorganism from the group consisting of the following: .
[0024]
[6] The method for producing 2R-monatin according to [2] or [3], wherein the L-aminotransferase is an L-aminotransferase produced by a microorganism into which an L-aminotransferase gene has been introduced.
[0025]
[7] The method for producing 2R-monatin according to [6], wherein the L-aminotransferase gene is an L-aspartate aminotransferase gene derived from Escherichia coli.
[0026]
[8] The method for producing 2R-monatin according to any one of [2] to [7], wherein the reaction system contains α-keto acid as an amino group acceptor.
[0027]
[9] The method for producing 2R-monatin according to [8], wherein the reaction system further contains an L-amino acid oxidase acting on an L-amino acid by-produced from the α-keto acid. .
[0028]
[10] The method for producing 2R-monatin according to [9], wherein the α-keto acid is α-ketoglutarate, and the L-amino acid oxidase is L-glutamate oxidase.
[0029]
[11] The L-glutamate oxidase is a genus of Streptomyces or Azotobacter.Genus[10] The method for producing 2R-monatin of monatin according to [10], which is derived from
[0030]
[12] The method for producing 2R-monatin according to [2], wherein the L-amino acid oxidase is a snake venom-derived L-amino acid oxidase.
[0031]
[13] The isomer mixture of monatin includes (2S, 4S) form and (2R, 4R) form, and the enzyme is L-aspartate aminotransferase derived from Escherichia coli. ] The method for producing 2R-monatin according to the above.
[0032]
[14] The method according to [1], wherein the isomer mixture of monatin includes a (2S, 4R) form and a (2R, 4R) form, and the enzyme is a snake venom-derived L-amino acid oxidase. A method for producing 2R-monatin.
[0033]
[15] The 2R according to any one of [1] to [14], wherein the reaction system further comprises a D-aminotransferase that catalyzes a reaction for producing 2R monatin from IHOG. -A method for producing monatin.
[0034]
[16] The method for producing 2R-monatin according to [15], wherein the D-aminotransferase is derived from a microorganism belonging to the genus Bacillus or Paenibacillus.
[0035]
[17] The microorganism is Bacillus sphaericus, Bacillus pulvifaciens, Bacillus macerans, Bacillus lentus, Paenibacillus larvae subsp. [16] The method for producing 2R-monatin according to [16], wherein the method is selected from the group consisting of Pulvifaiens and Paenibacillus macerans.
[0036]
[18] The method for producing 2R-monatin according to [15], wherein the D-aminotransferase is an enzyme produced by a microorganism into which a D-aminotransferase gene has been introduced.
[0037]
[19] The method for producing 2R-monatin according to [18], wherein the D-aminotransferase gene is derived from Bacillus sphaericus or Bacillus macerans.
[0038]
[20] A reaction for generating a 4R-IHOG by selectively reacting a mixture of isomers of monatin containing both (2S, 4R) form and (2R, 4R) form with (2S, 4R) form monatin. By reacting the (2S, 4R) form with the (2R, 4R) form by reacting with a reaction system containing an enzyme that catalyzes and D-aminotransferase that catalyzes a reaction for producing a (2R, 4R) form of monatin from 4R-IHOG. 4R) converting into a body,
Step of recovering monatin from the reaction system to obtain (2R, 4R) -monatin
A method for producing (2R, 4R) -monatin, comprising:
[0039]
[21] A mixture of isomers of monatin containing both the 2S-form and the 2R-form is reacted in a reaction system containing an enzyme that selectively acts on the 2S-form monatin to catalyze the reaction for generating IHOG. A method for improving the sweetness of monatin, characterized in that the content of the 2R isomer having high sweetness is improved by decomposing at least a part of the monatin.
[0040]
BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION
The present invention provides an isomer mixture of monatin containing both 2R-form and 2S-form in a reaction system containing an enzyme which catalyzes a reaction for producing IHOG by selectively acting on 2S-form monatin. The present invention relates to a method for producing 2R-monatin by decomposing a body.
[0041]
“2R-monatin” obtained by the production method of the present invention means monatin having a high content of the 2R-isomer, which is a high-sweetness isomer. High 2R-form content means that the 2R-form content is 60% or more. The 2R-form content is preferably 80% or more, more preferably 90% or more, further preferably 95% or more, and particularly preferably 100%. Further, among "2R-monatin" obtained by the production method of the present invention, monatin having a high content of the (2R, 4R) form may be referred to as "(2R, 4R) -monatin". A high content of the (2R, 4R) form means that the content of the (2R, 4R) form is 60% or more. The (2R, 4R) body content is preferably 80% or more, more preferably 90% or more, further preferably 95% or more, and particularly preferably 100%.
[0042]
For example, when the 2S form is selectively deaminated using a mixture of four isomers of the RR form, the RS form, the SR form, and the SS form, as shown below, the 2S form, the SR form and the SS form, They are converted into 4R-IHOG and 4S-IHOG, respectively, and the 2R-form RR-form and RS-form remain in the reaction system without being reacted. Therefore, by collecting monatin remaining in the reaction system, 2R-monatin containing a high content of 2R-form (RR-form, RS-form) which is a high-sweetness isomer can be obtained.
[0043]
RR body → recovery
RS body → recovery
SR body → 4R-IHOG
SS body → 4S-IHOG
[0044]
Hereinafter, the present invention will be described in detail in the following order.
[I] Enzyme
[II] A mixture of isomers of monatin
[III] Reaction method
[IV] Specific examples of the reaction
[0045]
[I] Enzyme
In the present invention, an enzyme which selectively acts on 2S-form monatin to catalyze a reaction for generating IHOG is used. By the enzyme reaction, the 2S-isomer in the isomer mixture of monatin is decomposed to produce 2R-monatin, which is a high-sweetness isomer.
[0046]
The term "enzyme which catalyzes a reaction for generating IHOG by selectively acting on 2S-form monatin" means, specifically, when an isomer mixture of 2S-form: 2R-form = 1: 1 is reacted, More than 50%, preferably more than 80%, more preferably more than 90% of the monatin remaining thereafter is an enzyme which is a 2R form. Preferably, the enzyme acts only on the 2S form and does not act on the 2R form.
[0047]
In addition, the enzyme may be any enzyme that acts on at least one of the SR form and the SS form, but is preferably an enzyme that acts on both the SR form and the SS form.
[0048]
The enzyme is not particularly limited as long as it is an enzyme that catalyzes a reaction for producing a corresponding keto acid, IHOG, using 2S monatin as a substrate, and examples thereof include L-aminotransferase, L-amino acid oxidase, and L-amino acid dehydrogenase. Can be used. Among them, L-aminotransferase or L-amino acid oxidase is preferably used. In addition, these enzymes can be used in combination of two or more kinds.
[0049]
Hereinafter, for convenience, L-aminotransferase may be abbreviated as “LAT” and L-amino acid oxidase may be abbreviated as “LAO”.
[0050]
(A) L-aminotransferase
In the present invention, a case where L-aminotransferase (LAT) is used as an enzyme for deaminating 2S-form monatin will be described.
[0051]
L-aminotransferase is an enzyme that catalyzes a transamination reaction of L-amino acids. The “transamination reaction” is a reaction in which an L-amino acid as an amino donor substrate is converted into a ketone compound, and a ketone compound precursor as an amino group acceptor is converted into the corresponding amino compound.
[0052]
In the present invention, 2S-form monatin corresponds to an amino donor substrate (L-amino acid), and IHOG is generated by transferring the amino group of 2S-form monatin to an amino group acceptor.
[0053]
As the amino group acceptor (ketone compound precursor), one or more kinds of α-keto acids are preferably used. Examples of α-keto acids include α-ketoglutaric acid, oxaloacetic acid, pyruvic acid and the like. When these α-keto acids are aminated by a transamination reaction, they respectively produce L-glutamic acid, L-aspartic acid, and L-alanine as by-products.
[0054]
When LAT is used as an enzyme, 2S monatin is deaminated by the reaction shown in the following reaction formula to produce IHOG. Α-Ketoglutaric acid (α-KG) used as α-keto acid is aminated to produce L-glutamic acid.
[0055]
Embedded image
Figure 2004222657
[0056]
The LAT is not particularly limited as long as it is an enzyme having an L-aminotransferase activity using 2S monatin as a substrate, but L-aspartate aminotransferase (AspAT) can be particularly preferably used.
[0057]
Such an enzyme can also be prepared by culturing a microorganism that produces the LAT. Examples of such microorganisms include the genus Aeromonas, the genus Agrobacterium, the genus Alcaligenes, the genus Bacillus, the genus Beijerinckia, and the genus Escherichiaia. Microorganisms belonging to the genus (Proteus) and the genus Morganella can be mentioned.
[0058]
Specific examples of these microorganisms include the following. That is, the following examples can be given as examples of L-aminotransferase-producing bacteria that convert 2S monatin into IHOG.
[0059]
Aeromonas hydrophila IFO3820;
Agrobacterium tumefaciens Agrobacterium tumefaciens IFO3058;
Alcaligenes faecalis ATCC 8750;
Beijerinkia indica ATCC9037;
Escherichia coli ATCC 12814;
Proteus rettgeri Proteus rettgeri IFO13501;
Morganella morganii IMO3848.
[0060]
These microorganisms may be strains newly isolated from the natural world such as soil and plants, or may be strains artificially bred by treatment with a mutagenic agent, recombinant DNA technology, or the like.
[0061]
Further, as the microorganism having LAT activity, a microorganism into which a LAT gene has been introduced can be used. Escherichia coli can be used for such a microorganism.
[0062]
As the LAT gene, desirably, the aspartate aminotransferase gene (aspC gene), a gene derived from Escherichia coli can be used.
[0063]
When LAT is used as the enzyme, the efficiency of deamination of 2S monatin can be increased by combining the transamination reaction, which is an equilibrium reaction, with the deamination reaction using L-amino acid oxidase, which is an irreversible reaction.
[0064]
That is, since the transamination reaction by LAT is generally an equilibrium reaction, when the equilibrium state is reached, the deamination reaction does not proceed any further, but as shown in the following reaction formula, the amino compound by-produced by the LAT reaction The use of an L-amino acid oxidase (LAO) for deaminating the compound can shift the equilibrium state toward the deamination reaction. As a result, the efficiency of the deamination reaction of 2S-form monatin can be increased.
[0065]
Embedded image
Figure 2004222657
[0066]
It should be noted that LAO used for selectively deaminating the 2S-form monatin described later is different from LAO used for deaminating an amino compound by-produced by the LAT reaction. In order to distinguish between LAO used for selectively deaminating 2S-monatin and LAO used for deaminating an amino compound by-produced by the LAT reaction, the former is simply referred to as "L-amino acid oxidase ( LAO) "and the latter" L-amino acid oxidase for amino compound removal (LAO for amino compound removal) ".
[0067]
The LAO for removing an amino compound may be any enzyme that acts on an amino compound by-produced by an L-aminotransferase reaction.
[0068]
As an example of such two types of enzyme coupling (LAT + LAO for removing an amino compound), when α-ketoglutaric acid is used as an amino group acceptor in an L-aminotransferase reaction, L-aminotransferase is used as an amino compound. Since glutamic acid is by-produced, it is preferable to use L-glutamic acid oxidase in combination as the LAO for removing an amino compound. In this case, the L-glutamic acid oxidase to be used is not particularly limited as long as it is an enzyme having an activity of deaminating L-glutamic acid. For example, actinomycete-derived L-glutamic acid oxidase can be used.
[0069]
The LAO for removing an amino compound may be added at the start of the deamination reaction of 2S-monatin by LAT, or may be added during the LAT reaction.
[0070]
The above-mentioned amino compound-removing LAO can also be prepared by culturing a microorganism that produces the enzyme. Examples of such microorganisms include microorganisms belonging to the genus Streptomyces and the genus Azotobacter (Japanese Patent Publication No. 61-26357; Antibiotic iKhimioterapiya, 1998). Year, Vol. 43, No. 4, pp. 7-13; European Journal of Biochemistry (European
Journal of Biochemistry), 1989, 182: 2, 327-332).
[0071]
These microorganisms may be strains newly isolated from the natural world such as soil and plants, or may be strains artificially bred by treatment with a mutagenic agent, recombinant DNA technology, or the like.
[0072]
(B) L-amino acid oxidase
Next, a case where L-amino acid oxidase (LAO) is used as an enzyme for deaminating 2S monatin will be described.
[0073]
L-amino acid oxidase is2Is an enzyme that catalyzes a reaction of oxidizing an L-amino acid using as an oxidizing agent. In the present invention, 2S-form monatin corresponds to an L-amino acid, and IHOG is generated by oxidizing 2S-form monatin.
[0074]
The LAO used in the present invention is not limited as long as it is an enzyme that catalyzes a reaction of oxidizing 2S-form monatin to generate IHOG, but LAO from snake venom is preferably used.
[0075]
When LAO is used as an enzyme, the 2S-form monatin is oxidized to produce IHOG by the reaction shown in the following reaction formula.
[0076]
Embedded image
Figure 2004222657
[0077]
Since the substrate (IHOG, monatin) may be decomposed by hydrogen peroxide produced as a by-product during the above reaction, in order to suppress this, it is preferable to add catalase to the reaction system to decompose the hydrogen peroxide. (See the following reaction formula). When a microorganism is used as an L-amino acid oxidase source, hydrogen peroxide may be sufficiently removed by the catalase activity of the microorganism itself.However, when a purified enzyme is used as L-amino acid oxidase, it is affected by hydrogen peroxide. It is preferable to use catalase in combination.
[0078]
Embedded image
Figure 2004222657
[0079]
(C) Other enzymes
In the present invention, in addition to an enzyme that catalyzes a reaction for generating IHOG by selectively acting on 2S-form monatin, a D-aminotransferase that catalyzes a reaction for generating a 2R-form of monatin from IHOG is further added to the reaction system. It is also preferable to include them. By using D-aminotransferase, 4R-IHOG and 4S-IHOG by-produced by the enzymatic reaction can be regenerated as RR-form and RS-form monatin, respectively, and this method is desirable from the viewpoint of cost.
[0080]
RR body → recovery
RS body → recovery
SR body → 4R-IHOG → RR body → Recovery
SS body → 4S-IHOG → RS body → Recovery
[0081]
Examples of such D-aminotransferase-producing bacteria include, for example, the following examples.
[0082]
Bacillus sphaericus ATCC10208
Paenibacillus labae subspices Pluvifaciens Paenibacillus larvae subsp. pulvifaiens ATCC 13537
Bacillus macerans AJ1617
Paenibacillus macerans ATCC 8244
Bacillus lentus ATCC 10840
[0083]
Bacillus macerans AJ1617 has been deposited as follows.
[0084]
Bacillus macerans AJ1617 strain
(B) Accession number FERM BP-8243
(B) Contract date December 13, 2001
(C) Depository: National Institute of Advanced Industrial Science and Technology (AIST) Patent Organism Depositary Center
[0085]
These microorganisms may be strains newly isolated from the natural world such as soil and plants, or may be strains artificially bred by treatment with a mutagenic agent, recombinant DNA technology, or the like.
[0086]
[II] A mixture of isomers of monatin
In the present invention, the isomer mixture of monatin used as a starting material may contain both the 2R form and the 2S form, and the composition ratio is not particularly limited.
[0087]
Therefore, even if it is a mixture of isomers, an isomer mixture containing no 2S isomer, such as a mixture of RR and RS isomers, or an isomer mixture not containing 2R isomer, such as a mixture of SR isomer and SS isomer, It does not fall under the “monatin isomer mixture” in the present invention.
[0088]
The method for preparing the isomer mixture of monatin used as a starting material is not particularly limited, and known methods such as a chemical synthesis method and an enzymatic method can be used.In one example, as shown in the following reaction formula, indole A method of synthesizing a precursor keto acid (IHOG) by aldol condensation of -3-pyruvic acid and pyruvic acid (or oxaloacetic acid), and then aminating the 2-position of IHOG is exemplified.
[0089]
Embedded image
Figure 2004222657
[0090]
When a chemical synthesis method is used, monatin is obtained as a mixture of four isomers of RR, RS, SR, and SS. When the 2S form is deaminated by enzymatic reaction using a mixture of four isomers of RR, RS, SR, and SS forms, the 2S form of the SR form and the SS form are converted to 4R-IHOG and 4S-IHOG, respectively. The RR isomer is converted and the 2R isomer is left unreacted in the reaction system. Therefore, by collecting monatin remaining in the reaction system, 2R-monatin containing a high content of 2R-form (RR-form, RS-form) which is a high-sweetness isomer can be obtained.
[0091]
When using an enzyme that acts on only one of the 2S-form SR and SS-forms, the other 2S-form that cannot be removed by the enzymatic reaction is removed in advance using a technique such as crystallization. Is preferred. That is, when an enzyme acting only on the SS form is used, a mixture of isomers of monatin from which the SR form is removed is used as a starting material, and when an enzyme acting only on the SR form is used, the SS form is removed. It is preferred to use a mixture of isomers of monatin. As a result, the content of the 2S-form in 2R-monatin can be reduced, and monatin having a high degree of sweetness per unit weight can be obtained.
[0092]
For example, a mixture of four isomers of monatin synthesized by a chemical synthesis method is crystallized and separated as a racemic mixture of (SS + RR) under the conditions shown in Reference Example 1 to obtain an SR isomer from the isomer mixture. Can be removed. By reacting an enzyme acting only on the SS form with the racemic mixture of (SS + RR) from which the SR form is removed, 2R-monatin composed of the RR form is obtained.
[0093]
Further, as shown in Reference Example 2, 4-hydroxy-4- (3-indolylmethyl) -2-hydroxyiminoglutaric acid, a precursor of monatin, was divided into 4R-form and 4S-form, and 4R-form monatin was obtained. By synthesizing (SR + RR) from the precursor, an isomer mixture containing no SS isomer can be prepared. By causing an enzyme acting only on the SR form to act on the (SR + RR) isomer mixture not containing the SS form, 2R-monatin consisting of the RR form is obtained. Here, the (SR + RR) isomer mixture means a monatin isomer mixture mainly composed of SR and RR isomers, and may include RS isomers and SS isomers at an impurity level. By impurity level is meant that the content is less than 5%, preferably less than 3%, of the total isomer mixture. At this time, in order to increase the yield of 2R-monatin, it is preferable to regenerate 4R-IHOG by-produced from the SR form as RR form monatin using D-aminotransferase.
[0094]
If possible, the 2S form that could not be removed by the enzymatic reaction may be removed after the enzymatic reaction. As a method for removing the unreacted 2S isomer after the enzymatic reaction, for example, a mixture of four isomers is reacted using an enzyme acting only on the SS isomer, and a mixture of three isomers of RR, RS and SR isomers is used. After obtaining the RR form from the mother liquor by crystallization, the 2S form (in this case, SR form) that cannot be removed by the enzymatic reaction can be removed.
[0095]
[III] Reaction method
In the present invention, the enzyme may be present in the reaction system in any form as long as the enzyme can exhibit the enzyme activity. That is, the LAT or LAO may be in a state in which IHOG can be generated by selectively acting on 2S monatin. In addition, LAO for removing an amino compound used in combination with LAT, catalase used in combination with LAO, and D-aminotransferase for regenerating IHOG into 2R-form monatin may be in a state where each enzyme activity can be exhibited.
[0096]
For example, the enzyme may be added alone to the reaction system, or a microorganism having the enzyme activity (enzyme-producing bacterium, a cell transformed with recombinant DNA), a culture of the microorganism (liquid culture, solid culture, etc.) , A culture medium (a culture obtained by removing cells from the culture), and a processed product of the culture may be added to the reaction system. When a culture of a microorganism is used, the reaction may be allowed to proceed simultaneously while culturing the microorganism, or the reaction may be performed using a culture that has been cultured in advance to obtain the enzyme. The term “treatment” as used herein means a treatment performed for the purpose of removing enzymes from cells, such as ultrasonic waves, glass beads, French press, freeze-drying treatment, lytic enzymes, organic solvents, and surfactants. And the like. In addition, if the treated product obtained by these treatments is a crude fractionated enzyme or a purified enzyme prepared by a conventional method (liquid chromatography, ammonium sulfate fractionation, etc.) and has the required ability, May be used.
[0097]
Furthermore, when using the above-mentioned culture or its processed product, it is also possible to use them after enclosing them in carrageenan gel or polyacrylamide, or immobilizing them on a membrane such as polyethersulfone or regenerated cellulose.
[0098]
In one preferred embodiment of the present invention, a gene encoding a desired L-aminotransferase or L-amino acid oxidase can be incorporated into a microbial cell. In addition, there are many known examples of producing useful proteins such as enzymes and physiologically active substances using the recombinant DNA technology. Use of the recombinant DNA technology makes it possible to mass-produce useful proteins that exist in trace amounts in nature. An example of a gene to be integrated is aspartate aminotransferase (aspC gene). The origin of the gene is not limited to this, and any gene may be used as long as it encodes an enzyme having an L-aminotransferase activity such as deamination of the desired 2S-monatin.
[0099]
When a large amount of protein is produced using recombinant DNA technology, bacterial cells, actinomycete cells, yeast cells, mold cells, plant cells, animal cells, and the like can be used as transformed host cells. Among them, Bacillus, Pseudonomas, Brevibacterium, Corynebacterium, Streptomyces, Escherichia coli and the like can be mentioned as microorganisms having knowledge of recombinant DNA manipulation. In general, Escherichia coli, preferably Escherichia coli, is used because there is a great deal of knowledge about techniques for mass-producing proteins using Escherichia coli.
[0100]
These microorganisms may be introduced using a vector such as a plasmid or a phage carrying the target L-aminotransferase gene or L-amino acid oxidase gene, or may be introduced into the chromosome of the cell by homologous recombination. Genes may be incorporated. Preferably, a so-called multi-copy type plasmid vector is mentioned. For example, as a vector for Escherichia coli, a plasmid having a replication origin derived from Col E1, such as a pUC-based plasmid or a pBR322-based plasmid, or a derivative thereof is exemplified. . In these vectors, as a promoter for expressing an aminotransferase gene of interest, a promoter usually used for protein production in Escherichia coli can be used. For example, T7 promoter, trp promoter, lac promoter, tac promoter, PL promoter And other strong promoters. In order to increase the production amount, it is preferable to connect a terminator which is a transcription termination sequence downstream of the protein gene. Examples of the terminator include a T7 terminator, an fd phage terminator, a T4 terminator, a terminator for a tetracycline resistance gene, and a terminator for an Escherichia coli trpA gene. In addition, in order to select a transformant, the vector preferably has a marker such as an ampicillin resistance gene. Examples of such a plasmid include a pUC system (manufactured by Takara Shuzo) and a pPROK system (manufactured by Clontech). ), PKK233-2 (manufactured by Clontech), and other expression vectors having a strong promoter are commercially available.
[0101]
Next, the method for culturing microorganisms according to the present invention will be described. The method for culturing microorganisms in the present invention can be performed using a medium usually used in this field, that is, a medium containing a carbon source, a nitrogen source, inorganic salts, trace metal salts, vitamins, and the like. Depending on the type of the microorganism or the culture conditions, the transamination reaction activity can be promoted by adding an amino compound such as an amino acid of about 0.1 to 1.0 g / dl to the medium.
[0102]
When culturing the transgenic cells, drugs such as ampicillin, kanamycin, neomycin, chloramphenicol and the like can be appropriately added in accordance with the selection marker of the vector. In addition, the expression level of the recombinant gene can be increased by adding an appropriate amount of an inducer in accordance with the promoter contained in the vector. As an example, when a vector of interest is ligated downstream of the lac promoter to construct a vector, isopropyl 1-thio-β-D-galactopyranoside (IPTG) is added at a final concentration of 0.1 mM to 5 mM. Galactose may be appropriately added within the range, and galactose may be optionally added to the final concentration of 0.1 to 5 g / dl, preferably 0.5 g / dl to 2 g / dl.
[0103]
In order to increase the permeability of monatin into cells, a surfactant such as Triton X or Tween or an organic solvent such as toluene or xylene can be used. Further, a coenzyme such as pyridoxal-5-phosphate may be added to the medium as a reaction promoting substance. As a specific substance used as the medium component, for example, the carbon source is not limited as long as the microorganism to be used is available, and for example, glucose, sucrose, fructose, glycerol, acetic acid, or the like, or a mixture thereof is used. be able to. As the nitrogen source, ammonium sulfate, ammonium chloride, urea, yeast extract, meat extract, corn steep liquor, casein hydrolyzate, or a mixture thereof can be used. As a specific medium composition, for example, fumaric acid 0.5 g / dl, yeast extract 1 g / dl, peptone 1 g / dl, ammonium sulfate 0.3 g / dl, K2HPO4  0.3g / dl, KH2PO4  0.1 g / dl, FeSO4・ 7H2O 1 mg / dl and MnSO4・ 4H2A medium containing 1 mg / dl (pH 7.0) of O.
[0104]
The cultivation temperature is usually in the range in which the microorganism to be used grows, that is, 10 to 45 ° C, preferably 20 to 40 ° C, and more preferably 25 to 37 ° C. Further, the pH value of the medium is adjusted preferably in the range of 2 to 12, more preferably 3 to 10, and still more preferably 4 to 8. The aeration conditions are set to conditions suitable for the growth of the microorganism to be used, but aerobic conditions are preferred. The culturing time is usually about 12 to 120 hours, preferably about 24 to 96 hours.
[0105]
The reaction temperature is usually within the range in which the enzyme to be used has activity, that is, preferably at 10 to 50 ° C, more preferably at 20 to 40 ° C, and still more preferably at 25 to 37 ° C. The pH value of the reaction solution is usually adjusted in the range of 2 to 12, preferably 6 to 11, and more preferably 7 to 9. The reaction time is generally selected to be about 1 to 120 hours, preferably about 1 to 72 hours, and more preferably about 1 to 24 hours.
[0106]
The amount of the cells or the processed product of the cells may be an amount (effective amount) that exhibits the intended effect in the case of a given reaction. Although it is easily obtained by an experiment, for example, in the case of washed wet cells, the weight is 1 to 40 g per 100 ml of the reaction solution.
[0107]
When monatin or IHOG in the culture solution or the reaction solution is quantified, it can be measured quickly using a known method. That is, thin layer chromatography using “Silica gel 60F254” manufactured by Merck or the like can be used simply, and “Inertsil ODS-80A” manufactured by GL Science or Daicel Chemical Industries, Ltd. High performance liquid chromatography (HPLC) using an optical resolution column such as “CROWNPAK CR (+)” manufactured by K.K.
[0108]
In this manner, IHOG and residual monatin accumulated in the culture solution or the reaction solution can be collected and used from the culture solution or the reaction solution by an ordinary method. Collection from the culture solution or the reaction solution is performed in such a case using well-known means commonly used in the art, such as filtration, centrifugation, vacuum concentration, ion exchange chromatography, adsorption chromatography, and crystallization. Operations are used in combination as needed.
[0109]
The method for recovering monatin remaining in the reaction system is not particularly limited, and a known method can be used. The desired 2R-monatin can be obtained in a free form or, if necessary, in a salt form. Examples of the salt form include a salt with a base. Examples include inorganic bases such as sodium hydroxide, potassium hydroxide and calcium hydroxide, and organic bases such as ammonia and various amines.
[0110]
[IV] Specific examples
First, a method for producing 2R-monatin using L-aspartate aminotransferase derived from Escherichia coli will be described. Since the enzyme acts only on the SS form of the 2S form, when it acts on a mixture of four isomers of the RR form, the RS form, the SR form, and the SS form, the SS form is deaminated to form 4S-IHOG. And the RR, RS and SR bodies remain unreacted.
[0111]
At this time, an equilibrium state is brought to the deamination reaction side together with an amino compound removal LAO (L-Glu oxidase) for deaminating an amino compound (here, L-Glu) by-produced by the transamination reaction. It is preferable to shift. Although the transamination reaction is an equilibrium reaction, the transamination reaction by L-aspartate aminotransferase can proceed 100% by deaminating the amino compound using LAO for removing the amino compound.
[0112]
Embedded image
Figure 2004222657
[0113]
When L-aspartate aminotransferase is used, the degree of sweetness per unit weight of monatin recovered from the reaction system is improved by the removal of the SS form.
[0114]
Note that since the SR form cannot be removed by the enzyme reaction, it is preferable to remove the SR form before the enzyme reaction or to remove the SR form after the enzyme reaction in order to further improve the sweetness.
[0115]
As a method for removing the SR form before the enzymatic reaction, for example, a racemic mixture of the SS form and the RR form (SS + RR) is prepared by a crystallization method and the AspAT is allowed to act on the racemic mixture as shown in the following (1). Then, there is a method of converting the SS form into 4S-IHOG to produce an RR form. As a method for removing the SR form after the enzymatic reaction, for example, as shown in the following (2), first, only the SS form in the four isomer mixture is converted to 4S-IHOG, and then only the RR form is obtained by crystallization. By precipitating, an RR body can be produced. According to these methods, the RR form having the highest degree of sweetness can be obtained, and thus monatin having a high degree of sweetness per unit weight can be obtained, which is preferable.
[0116]
Embedded image
Figure 2004222657
[0117]
Next, the case where 2R-monatin is produced using L-amino acid oxidase derived from snake venom will be described. Since the enzyme acts only on the SR form of the 2S form, the RR form, the RS form, and the SS form are unaffected when acted on a mixture of four isomers of the RR form, the RS form, the SR form and the SS form. The reaction remains. Therefore, the degree of sweetness per unit weight of the monatin recovered from the reaction system is improved by the removal of the SR form.
[0118]
When L-amino acid oxidase derived from snake venom is used, the SS body cannot be removed by an enzymatic reaction. Therefore, in order to further improve the sweetness, it is preferable to remove the SS body.
[0119]
For example, as described below, using the method of Reference Example 2, an isomer mixture (RR + SR) of monatin of the RR form and the SR form is synthesized, and when the LAO derived from snake venom acts on the mixture of the isomers, the SR form is obtained. It can be selectively converted to 4R-IHOG to produce an RR form.
[0120]
When L-amino acid oxidase derived from snake venom is used, it is preferable to regenerate 4R-IHOG by-produced from SR form as RR form monatin using D-aminotransferase in order to increase the yield of 2R form. The reaction of converting 4R-IHOG to an RR form by D-aminotransferase may be performed simultaneously with the reaction with L-amino acid oxidase derived from snake venom, or may be performed separately from the reaction with L-amino acid oxidase derived from snake venom. From the viewpoint of simplifying the reaction, the former is preferred.
[0121]
Embedded image
Figure 2004222657
[0122]
It is also preferable to convert the SS form and the SR form into IHOG by using a combination of an enzyme acting only on the SS form and an enzyme acting only on the SR form. An example of such a combination of enzymes is a combination of a combination enzyme of LAO derived from Escherichia coli and LAO derived from snake venom.
[0123]
In this case, 2R-monatin obtained as a final product is a mixture of RS and RR forms. When it is desired to further improve the sweetness, the RR form may be isolated from 2R-monatin using a technique such as crystallization.
[0124]
Embedded image
Figure 2004222657
[0125]
【Example】
Hereinafter, the present invention will be described more specifically with reference to Examples and Reference Examples, but the present invention is not limited to these Examples.
[0126]
The (2S, 4S) and (2R, 4R) forms of monatin used in Example 1 were prepared according to Reference Example 1 described below, and the (2S, 4R) monatin used in Examples 2 and 3 were used. ) And (2R, 4R) bodies were prepared using Reference Example 2 described below.
[0127]
In this example, monatin was quantified by high performance liquid chromatography using “Inertsil ODS-80A” (5 μm, 6 × 150 mm) manufactured by GL Sciences Inc. The analysis conditions are as shown below.
[0128]
Mobile phase: 12% (v / v) acetonitrile / 0.05% (v / v) aqueous trifluoroacetic acid;
Flow rate: 1.5 ml / min;
Column temperature: 30 ° C .;
Detection: UV 210 nm
[0129]
According to the analysis conditions, the (2S, 4S) and (2R, 4R) forms of monatin were separated and quantified in 12.1 minutes, and the (2S, 4R) and (2R, 4S) forms were separated and quantified in 9.7 minutes. it can.
[0130]
In addition, analysis by high-performance liquid chromatography using an optical resolution column “CROWNPAK CR (+)” (4.6 × 150 mm) manufactured by Daicel Chemical Industries, Ltd. was also performed as necessary. The analysis conditions are as shown below.
[0131]
Mobile phase: aqueous solution of perchloric acid (pH 1.5) / 10% (v / v) methanol;
Flow rate: 0.5 ml / min;
Column temperature: 30 ° C .;
Detection: UV 210 nm.
[0132]
Under these conditions, the monatin optical isomers were (2R, 4S), (2R, 4R), (2S, 4R) and (2S, 4S) in the order of 42 minutes, 57 minutes, 64 minutes, and 125 minutes. Separation and quantification can be performed with the retention time of
[0133]
Example 1 Selective deamination of (2S, 4S) form of monatin from a mixture of (2S, 4S) and (2R, 4R) forms using L-aminotransferase
(1) Aspartate aminotransferase (aspC) high expression Production of E. coli
(1-1) Construction of plasmid pTrp4 carrying trp promoter and rrnB terminator
The target gene region was amplified by PCR (Table 2: Combination of (1) and (2)) using the oligonucleotides shown in the table to indicate the promoter region of the trp operon on the Escherichia coli W3110 chromosomal DNA and obtained. The DNA fragment was ligated to a pGEM-Teasy vector (promega). In this ligation solution, E. coli was used. E. coli JM109 was transformed, and a strain having the target plasmid in which the trp promoter was inserted in the opposite direction to the lac promoter was selected from ampicillin-resistant strains. Next, a DNA fragment containing a trp promoter obtained by treating this plasmid with EcoO109I / EcoRI was ligated with a pUC19 (Takara) -treated EcoO109I / EcoRI product. In this ligation solution, E. coli was used. E. coli JM109 was transformed, a strain having the desired plasmid was selected from ampicillin-resistant strains, and the plasmid was named pTrp1. Next, pKK223-3 (manufactured by Amersham Pharmacia) was treated with HindIII / HincII, and the obtained DNA fragment containing the rrnB terminator was ligated to pTrp1 treated with HindIII / PvuII. In this ligation solution, E. coli was used. E. coli JM109 was transformed, a strain having the desired plasmid was selected from ampicillin-resistant strains, and the plasmid was named pTrp2. Next, the trp promoter region was amplified by PCR (Table 2: combination of (1) and (3)) using pTrp2 as a template and oligonucleotides shown in the table as primers. This DNA fragment was treated with EcoO109I / NdeI, and ligated with pTrp2 treated with EcoO109I / NdeI. In this ligation solution, E. coli was used. E. coli JM109 was transformed, a strain having the desired plasmid was selected from ampicillin-resistant strains, and this plasmid was named pTrp4.
[0134]
[Table 2]
Figure 2004222657
[0135]
(1-2) Construction of aspC Gene Expression Plasmid ptrpAspC and E. coli expression in E. coli
Primers aspC-5'Nde (5'-CGC AGT CAT ATG TTT GAG AAC ATT ACC GCC GCT-3 ') and aspC-3'Eco (5'-CGC GAA TTC ATT GTT TTT AAT GCT TAC AGCA Was digested with NdeI / EcoRI to construct a plasmid ptrpAspC in which the fragment was inserted into the NdeI / EcoRI site of pTrp4, using a 1.2-kbp fragment amplified from Escherichia coli W3110 chromosomal DNA. The constructed expression plasmid was used for E. coli. E. coli JM109, the transformant was inoculated into 50 ml of LB medium containing 50 μg / ml ampicillin, and cultured with shaking at 37 ° C. for 16 hours. After completion of the culture, the cells were collected, suspended in 20 mM Tris-HCl (pH 7.6), washed, and collected again to obtain washed cells.
[0136]
(2) High expression of AspC. Selective deamination of (2S, 4S) -monatin from (2S, 4S), (2R, 4R) mixture of monatin using E. coli
100 mM Tris-HCl (pH 8.0), 50 mM (2S, 4S) monatin, 50 mM (2R, 4R) monatin, 1 mM PLP, 1% (w / v) AspC high expression Reaction groups were prepared by adding 200 mM 2-ketoglutaric acid to 200 mM oxaloacetic acid as amino group receptors to the reaction solution containing the washed E. coli cells. 1 ml of the reaction solution was placed in a test tube and shaken at 33 ° C. for 16 hours. As a result, in the 2-ketoglutaric acid group, the (2S, 4S) form corresponding to 30 mM was converted to IHOG, and in the oxaloacetic acid group, the (2S, 4S) form corresponding to 26 mM were converted to IHOG. In each of the experimental plots, the (2R, 4R) monatin remained in the reaction system without being substantially decomposed.
[0137]
(3) High expression of AspC. Deamination of (2S, 4S) form from (2S, 4S) and (2R, 4R) form mixture by combination of E. coli and L-glutamate oxidase
100 mM Tris-HCl (pH 8.0), 50 mM (2S, 4S) monatin, 50 mM (2R, 4R) monatin, 200 mM 2-ketoglutaric acid, 1 mM PLP, 1% (w / v) AspC high expression 1 ml of a reaction solution containing E. coli washed cells was placed in a test tube. Two experimental plots were set up. One hour after the start of the reaction, 2 U / ml of Streptomyces sp. The reaction was carried out by adding derived L-glutamate oxidase (manufactured by Sigma) and 2000 U / ml catalase (manufactured by Sigma). A shaking reaction was carried out at 30 ° C. for 16 hours. As a result, 30 mM equivalent (2S, 4S) -form monatin was converted to IHOG in the L-glutamate oxidase-free group, whereas the L-glutamate oxidase-added group was not converted. In, the entire amount of (2S, 4S) -form monatin was converted to IHOG. In each of the experimental groups, the (2R, 4R) form remained in the reaction system without undergoing any substantial decomposition. From these results, by coupling L-amino acid oxidase and L-glutamic acid oxidase, the (2S, 4S) form was selectively and completely deaminated from the (2S, 4S) form mixture, (2R, 4R) monatin could be collected.
[0138]
Example 2 Selective deamination of (2S, 4R) form from a mixture of (2S, 4R) and (2R, 4R) forms of monatin using L-amino acid oxidase
100 mM Tris-HCl (pH 8.0), 1 U / ml L-amino acid oxidase from Crotalus adamanteus (manufactured by Sigma), 3000 U / ml catalase (manufactured by Sigma), 0.26 g / 1 ml of a reaction solution composed of dl (2S, 4R) monatin and 1.74 g / dl (2R, 4R) monatin was placed in a test tube and shaken at 30 ° C. for 16 hours. When the amount of monatin after completion of the reaction was measured by HPLC, the (2S, 4R) form was completely deaminated to 4R-IHOG, while the (2R, 4R) form was reacted without being decomposed. The compound (2S, 4R) remained in the liquid, and the (2S, 4R) form was selectively deaminated from the mixture of the (2S, 4R) and (2R, 4R) forms to be converted to 4R-IHOG.
[0139]
Example 3 Selective deamination of (2S, 4R) form of 4N-IHOG from a mixture of (2S, 4R) and (2R, 4R) forms of monatin using L-amino acid oxidase and expression of D-aminotransferase E. FIG. of 4R-IHOG into (2R, 4R) monatin by E. coli
(1) Cloning of D-aminotransferase gene (bmdat) derived from Bacillus macerans AJ1617 strain
(1-1) Preparation of chromosomal DNA
Bacillus macerans AJ1617 strain was cultured overnight at 30 ° C. using 50 ml of bouillon medium (preculture). Using 5 ml of this culture as a seed bacterium, main culture was performed using 50 ml of bouillon medium. After culturing until the late stage of logarithmic growth, 50 ml of the culture was subjected to a centrifugation operation (12000 × g, 4 ° C., 15 minutes) to collect the cells. Using these cells, chromosomal DNA was prepared according to a standard method.
[0140]
(1-2) Isolation of bmdat gene from gene library
First, 1 U of restriction enzyme EcoRI was added to 30 μg of chromosomal DNA of Bacillus macerans AJ1617 strain, and the mixture was reacted at 37 ° C. for 3 hours to perform partial digestion. Next, a fragment of 3 to 6 kbp was recovered from the DNA by agarose gel electrophoresis. This was ligated with 1 μg of the EcoRI digest of plasmid pUC118 (BAP-treated, manufactured by Takara Shuzo), and coli JM109 was transformed to prepare a gene library. This was plated on an LB medium containing ampicillin (1% tryptone, 0.5% yeast extract, 1% sodium chloride, 2% agar, pH 7.0) to form colonies. The resulting colonies were cultured overnight at 37 ° C. in an LB medium liquid medium containing 0.1 mM of ampicillin and isobutyl-1-thio-β-D-aminotransferase-galactopyranoside (IPTG), and then centrifuged and collected. To obtain cells. A reaction solution comprising 100 mM Tris-HCl (pH 8.0), 50 mM sodium pyruvate, 100 mM D-glutamic acid, 1 mM pyridoxal-5'-phosphate, 1% (v / v) toluene And allowed to react at 30 ° C. for 30 minutes. After completion of the reaction, 5 μl of the supernatant obtained by centrifuging the reaction solution was subjected to 200 μl of a pyruvate quantitative reaction solution (100 mM Tris-HCl (pH 7.6), 1.5 mM NADH, 5 mM MgCl 2).2, 16 U / ml Lactate dehydrogenase (manufactured by Oriental Yeast)), and allowed to react at 30 ° C. for 10 minutes. Then, the absorbance at 340 nm was measured using a plate reader (SPECTRA MAX190, manufactured by Molecular Device). . A similar reaction was carried out with the addition of sodium pyruvate having a final concentration of 0.2 mM to 1 mM. Using this as a standard, the amount of decrease in pyruvate was quantified to detect D-aminotransferase activity.
[0141]
By the above screening, a clone showing D-aminotransferase activity was collected. A plasmid containing the D-aminotransferase gene was prepared from these transformants and named pUCBMDAT. When plasmid pUCBMDAT was treated with EcoRI and subjected to agarose gel electrophoresis, the length of the inserted fragment was estimated to be about 3.3 kbp.
[0142]
(1-3) Base sequence of inserted fragment
The base sequence of the inserted fragment of the plasmid pUCBMDAT was determined by the dideoxy method. As a result, an ORF consisting of about 850 bp corresponding to the 630th to 1481th of the sequence shown in SEQ ID NO: 6 was found. When a homology search was performed on the ORF with known sequences, a 91% homology in amino acid sequence with the D-aminotransferase gene derived from Bacillus sphaericus ATCC10208 strain was determined to be Bacillus sp. The amino acid sequence showed 66% homology with the D-aminotransferase gene derived from the YM-1 strain, and the amino acid sequence showed 42% homology with the D-aminotransferase gene derived from Bacillus licheniformis ATCC10716. From this result, it was clarified that the present ORF encodes a D-aminotransferase gene. Note that the homology here is a value calculated using the gene analysis software “genetyx ver. 6” (GENETYX) and various parameters as initial settings.
[0143]
(2) Selective deamination of (2S, 4R) form of (2S, 4R) form from a mixture of (2S, 4R) and (2S, 4R) forms of monatin to 4R-IHOG using L-amino acid oxidase, and D-derived from Bacillus maceraans Aminotransferase (BMDAT) expression reaction for production of 2R monatin from IHOG using E. coli
(2-1) BMDAT expression Preparation of E. coli
E. with pUCBMDAT. Seed culture was carried out at 37 ° C. for 16 hours in an LB medium (0.1 g / dl bactotryptone, 0.5 g / dl yeast extract, and 1 g / dl NaCl) containing 0.1 mg / ml ampicillin. 1 ml of this seed culture was added to a 500 ml Sakaguchi flask into which 50 ml of LB medium was filled, and main culture was performed at 37 ° C. 2.5 hours after the start of the culture, isopropyl 1-thio-β-D-galactopyranoside (IPTG) was added to a final concentration of 1 mM, and the cells were further cultured for 4 hours. Bacteria were collected from the obtained culture, washed, and expressed with BMDAT expression. E. coli was prepared.
[0144]
(2-2) Combination reaction of L-amino acid oxidase and D-aminotransferase
12. 100 mM Tris-HCl (pH 8.0), 1 U / L-amino acid oxidase from Crotalus adamanteus (manufactured by Sigma), 2000 U / ml catalase (manufactured by Sigma), 13. 1 ml of a reaction solution containing 4 mM (2S, 4R) monatin, 81.4 mM (2R, 4R) monatin, 1 mM pyridoxal-5'-phosphate, and 100 mM D-Ala was placed in a test tube. Two experimental plots were set up, one of which was D. aminotransferase expressing E. coli. E. coli washed cells were added so that the wet cell weight was about 1% (w / v). These reaction solutions were shaken at 30 ° C. for 16 hours to carry out the reaction. As a result, (2S, 4R) monatin was completely converted to 4R-IHOG in the D-aminotransferase-free group. Further, in the D-aminotransferase-added group, the (2S, 4R) -form monatin was completely converted, and the amount of the (2R, 4R) -form monatin increased from 81.4 mM to 87.6 mM. That is, by combining L-amino acid oxidase and D-aminotransferase, the (2S, 4R) form of monatin is selectively deaminated from the (2S, 4R), (2R, 4R) form mixture to 4R-IHOG, Further, (2R, 4R) monatin could be produced from 4R-IHOG.
[0145]
Reference Example 1 Preparation of a mixture of (2S, 4S) and (2R, 4R) forms of monatin
(1) Synthesis of a mixture of four stereoisomers of monatin
(1-1) Synthesis of 4-hydroxy-4- (3-indolylmethyl) -2-hydroxyiminoglutaric acid
After dissolving 13.8 g of potassium hydroxide (85% purity) in 50 ml of water, 5.0 g (24.6 mmol) of indole-3-pyruvic acid and 9.8 g (73.8 mmol) of oxaloacetic acid were added, and the mixture was added at room temperature. The reaction was performed for 72 hours. 6.8 g (98.4 mmol) of hydroxylamine hydrochloride was added to the reaction solution. At that time, the pH value of the reaction solution was adjusted to 7.5 with a 4N aqueous sodium hydroxide solution. After stirring at room temperature for 24 hours, the pH value of the reaction solution was adjusted to 2.6 with 6N hydrochloric acid. After extraction using ethyl acetate, the organic layer was washed with saturated saline, dried over anhydrous magnesium sulfate, and concentrated to dryness. The obtained residue was dissolved in 10% of 14% aqueous ammonia, 70 ml of ethanol was gradually added dropwise, and the mixture was stirred at room temperature for 3 hours. The obtained slurry was filtered, and the obtained crystals were dried to obtain 2.7 g (7.9 mmol) of 4-hydroxy-4- (3-indolylmethyl) -2-hydroxyiminoglutaric acid as an ammonium salt. Was.
[0146]
(NMR measurement)
11 H NMR (DMSO-d6) Δ: 2.66 (s, 2H), 2.89 (d, J = 14.4 Hz, 1H), 3.04 (d, J = 14.4 Hz, 1H), 6.89-6. 94 (m, 1H), 6.97-7.03 (m, 1H), 7.11 (d, J = 2.8 Hz, 1H), 7.27 (d, J = 7.8 Hz, 1H) ), 7.53 (d, J = 7.8 Hz, 1H), 10.71 (brs, 1H)
[0147]
(Molecular weight measurement)
ESI-MS calculated value C14H14N2O6= 306.28, analysis value 305.17 (MH)
[0148]
(1-2) Synthesis of 4-hydroxy-4- (3-indolylmethyl) -2-aminoglutaric acid (monatin)
0.13 g (0.38 mmol) of ammonium 4-hydroxy-4- (3-indolylmethyl) -2-hydroxyiminoglutarate is dissolved in 5 ml of 28% aqueous ammonia, and 0.09 g of 5% rhodium carbon is added. The reaction was carried out at room temperature under a hydrogen pressure of 7.5 atm. After 14 hours, the catalyst was filtered off, and the reaction solution was concentrated to dryness to give (2S, 4S) / (2R, 4R) -4-hydroxy-4- (3-indolylmethyl) -2-aminoglutaric acid (monatin). )) And ammonium salt of (2S, 4R) / (2R, 4S) -4-hydroxy-4- (3-indolylmethyl) -2-aminoglutaric acid (monatin) 0.036 g (0.11 mmol) was obtained as a mixture.
[0149]
(NMR measurement)
1H NMR (D2O) δ: 2.05 (dd, J = 12.2, 15.1 Hz, 0.67H), 2.21 (dd, J = 9.9, 15.6 Hz, 0.33H), 2.48 (Dd, J = 3.2, 15.6 Hz, 0.33H), 2.68 (dd, J = 2.2, 15.1 Hz, 0.67H), 3.08 (d, J = 14 .4 Hz, 0.67H), 3.17-3.25 (m, 0.66H), 3.28 (d, J = 14.4 Hz, 0.67H), 3.63 (dd, J = 2.2, 12.2 Hz, 0.67H), 3.98 (dd, J = 3.2, 9.9 Hz, 0.33H), 7.12-7.18 (m, 1H), 7. 19-7.26 (m, 2H), 7.45-7.51 (m, 1 ), 7.70 - 7.76 (m, 1H).
[0150]
(Molecular weight measurement)
ESI-MS calculated value C14H16N2O5  = 292.29, analytical value 291.28 (MH).
[0151]
(2) Racemic crystal of (2S, 4S) form and (2R, 4R) form and racemic form of (2S, 4R) form and (2R, 4S) form of ammonium salt of a mixture of four kinds of monatin stereoisomers Split into crystals
An optical isomer mixture of monatin (monatin [(2S, 4S) + (2R, 4R)]) separately synthesized using the method described in (1): monatin [(2S, 4R) + (2R, 4S) ] Body = 6: 4;1H NMR (D210.00 g (32.33 mmol) of the ammonium salt (calculated by the ratio of the integrated value in O) was dissolved in 100 ml of 2.5% aqueous ammonia, and the solution was concentrated to 20 ml. After 3 ml of 5% aqueous ammonia was newly added to make the mixture uniform, the mixture was allowed to stand at room temperature for 30 minutes. After crystal precipitation, 80 ml of an aqueous solution of 5% aqueous ammonia / ethanol = 25/75 was added to make the mixture uniform, and crystals of monatin [(2S, 4S) + (2R, 4R)] ammonium salt were collected by filtration. The obtained crystals are again dissolved in 30 ml of 2.5% aqueous ammonia and concentrated, and then recrystallized with 0.5 ml of 5% aqueous ammonia and 30 ml of ethanol to obtain monatin [(2S, 4S) + (2R, 4R)]. 4.80 g (15.52 mmol, HPLC purity 98.0%) of the body ammonium salt crystals were obtained.
[0152]
1H NMR (D2O) δ: 1.95-2.02 (m, 1H), 2.58-2.62 (m, 1H), 3.01-3.05 (m, 1H), 3.21-3.24. (M, 1H), 3.55-3.58 (m, 1H), 7.07-7.11 (m, 1H), 7.14-7.18 (m, 2H), 7.42-7 .44 (d, 1H), 7.66-7.68 (d, 1H)
[0153]
ESI-MS 291.39 (MH)
[0154]
182-186 ° C
[0155]
The filtrate (monatin [(2S, 4S) + (2R, 4R)] body: monatin [(2S, 4R) + (2R, 4S)] body = 3: 10) obtained by the above-described operation is concentrated to 5 ml. did. After 3 ml of 5% ammonia water was newly added to make the mixture uniform, the mixture was allowed to stand at room temperature for 10 minutes. After crystal precipitation, 80 ml of ethanol was added to make the mixture uniform, and the crystals of monatin [(2S, 4R) + (2R, 4S)] ammonium salt were collected by filtration. The obtained crystals were again dissolved in 30 ml of 2.5% aqueous ammonia and concentrated, and then recrystallized three times using 0.5 ml of 5% aqueous ammonia and 30 ml of ethanol to obtain monatin [(2S, 4R) + (2R, 4S). )] Form ammonium salt crystal 3.10 g (10.02 mmol, HPLC purity 98.2%) was obtained. Total recovery was 79.0%.
[0156]
1H NMR (D2O) δ: 2.11 to 2.17 (m, 1H), 2.38 to 2.43 (m, 1H), 3.16 (s, 2H), 3.90 to 3.93 (m, 1H) ), 7.06-7.10 (m, 1H), 7.13-7.17 (m, 2H), 7.41-7.43 (d, 1H), 7.66-7.68 (d , 1H)
[0157]
ESI-MS 291.19 (MH)
[0158]
167.2-168.4 ° C
[0159]
Reference Example 2 Preparation of a mixture of (2S, 4R) and (2R, 4R) forms of monatin
In the reference examples, the optical purity was measured by HPLC under the following conditions.
<Column for separating optical isomers> SUMICHIRAL OA-7100 manufactured by Sumika Chemical Analysis Service, Ltd.
<Eluent> 20 mM phosphate buffer (pH = 2.8): acetonitrile = 7: 3
<Column temperature> 10 ° C
<Flow rate> 0.6 ml / min
[0160]
(1) Production of 4-hydroxy-4- (3-indolylmethyl) -2-hydroxyiminoglutaric acid
To 917 g of a 1.6 wt% aqueous sodium hydroxide solution, 73.8 g (352 mmol) of indole-3-pyruvic acid was added and dissolved. While maintaining the reaction solution at 35 ° C. and maintaining the pH value at 11.1 using a 30% aqueous sodium hydroxide solution, 310.2 g (1761 mmol) of a 50% aqueous pyruvic acid solution was added dropwise over 2 hours. The reaction was further performed for 4.5 hours to obtain a reaction solution containing 4-hydroxy-4- (3-indolylmethyl) -2-ketoglutaric acid. To this, 367.2 g (2114 mmol) of a 40% aqueous solution of hydroxylamine hydrochloride was added while maintaining the pH value at 7 with a 30% aqueous sodium hydroxide solution, and the mixture was stirred at 5 ° C. for 17.5 hours. The pH value of the reaction solution was adjusted to 2 using concentrated hydrochloric acid, and the organic matter was extracted with ethyl acetate. The organic layer was washed with saturated saline and concentrated to obtain a residue. The residue was recrystallized from 60% of 28% aqueous ammonia and 1350 ml of 2-propanol, and 43.4 g of diammonium 4-hydroxy-4- (3-indolylmethyl) -2-hydroxyiminoglutarate (142 mmol: yield) 40% vs. indole-3-pyruvate) were obtained as crystals.
[0161]
(2) Production of (R)-(+)-1-phenylethylamine salt of (4S) -4-hydroxy-4- (3-indolylmethyl) -2-hydroxyiminoglutaric acid
After dissolving 44.7 g (0.131 mol) of ammonium salt of 4-hydroxy-4- (3-indolylmethyl) -2-hydroxyiminoglutaric acid in 500 ml of water at 25 ° C., 25.5 g of 36% hydrochloric acid was added. The pH of the aqueous solution was adjusted to 2. The acidic solution was extracted with 1300 ml of ethyl acetate, and the ethyl acetate solution was washed with 200 ml of saturated saline. To the obtained ethyl acetate solution was added 500 ml of an aqueous sodium carbonate solution (13.9 g of sodium carbonate, 0.131 mol), and the mixture was stirred to separate an aqueous alkaline solution and ethyl acetate. 23.1 g of 36% hydrochloric acid was added to the obtained aqueous alkali solution to adjust the pH of the solution to 2. 6.99 g (57.6 mmol) of (R)-(+)-1-phenylethylamine is dropped into this acidic aqueous solution, and the mixture is stirred at 25 ° C. for 1 hour. The obtained crystals are filtered and dried under reduced pressure, and the (R)-(+)-1-phenylethylamine salt of (4S) -4-hydroxy-4- (3-indolylmethyl) -2-hydroxyiminoglutaric acid is obtained. 21.8 g (47.8 mmol) were obtained. (Yield: 72.7%, optical purity: 87.4%)
[0162]
1H-NMR (400 MHz, DMSO-d6) Σ: 1.48 (d, 3H, J = 6.8 Hz), 2.63 (d, 1H, J = 14.0 Hz), 2.70 (d, 1H, J = 14.0 Hz) , 2.90 (d, 1H, J = 14.1 Hz), 3.06 (d, 1H, J = 14.1 Hz), 4.40 (q, 1H, J = 6.8 Hz), 6 .91-7.54 (m, 10H).
[0163]
(3) Production of (S)-(-)-1-phenylethylamine salt of (4R) -4-hydroxy-4- (3-indolylmethyl) -2-hydroxyiminoglutaric acid
Further, 7.12 g (58.7 mmol) of (S)-(−)-1-phenylethylamine was added dropwise to the crystal filtrate obtained in (1), and the mixture was stirred at 25 ° C. for 1 hour. The obtained crystals were filtered and dried under reduced pressure to give (S)-(-)-1-phenylethylamine salt of (4R) -4-hydroxy-4- (3-indolylmethyl) -2-hydroxyiminoglutaric acid. 23.8 g (53.3 mol) were obtained. (Yield 81.1%, optical purity 92.1%)
[0164]
(4) Production of ammonium salt of (4S) -4-hydroxy-4- (3-indolylmethyl) -2-hydroxyiminoglutaric acid
At 25 ° C., 21.8 g (51.0 mmol) of (R)-(+)-1-phenylethylamine salt of (4S) -4-hydroxy-4- (3-indolylmethyl) -2-hydroxyiminoglutaric acid ) Was dissolved by adding 200 ml of water and 18.5 g of 28% ammonia water, and then 200 ml of toluene was further added and stirred. The aqueous layer obtained by layer separation was heated to 60 ° C., and 900 ml of 2-propanol was added dropwise to the aqueous solution over 2 hours. This 2-propanol aqueous solution was cooled to 10 ° C over 5 hours, and then stirred at 10 ° C for 10 hours. The obtained crystals were filtered and dried under reduced pressure to obtain 14.75 g of ammonium salt of (4S) -4-hydroxy-4- (3-indolylmethyl) -2-hydroxyiminoglutaric acid. (Yield: 85.1%, optical purity: 99.0%)
Melting point: 205 ° C (decomposition)
Specific rotation [α]20  D  +13.4 (c = 1.00, H2O)
[0165]
(5) Production of ammonium salt of (4R) -4-hydroxy-4- (3-indolylmethyl) -2-hydroxyiminoglutaric acid
As in the above example, 23.8 g of (4R) -4-hydroxy-4- (3-indolylmethyl) -2-hydroxyiminoglutaric acid salt of (R)-(+)-1-phenylethylamine (53) From 0.3 mmol), 16.2 g of ammonium salt of (4R) -4-hydroxy-4- (3-indolylmethyl) -2-hydroxyiminoglutaric acid was obtained. (89.3% yield, 99.9% optical purity)
Specific rotation [α]20  D  -13.6 (c = 1.00, H2O)
[0166]
(6) Production of ammonium salts of (2R, 4R) and (2S, 4R) monatin
Dissolve 10.0 g (optical purity 94.4%, 22.4 mmol) of amine salt of (4R) -4-hydroxy-4- (3-indolylmethyl) -2-hydroxyiminoglutaric acid in 120 ml of 28% aqueous ammonia. Then, 7.4 g of 5% rhodium carbon (50% water-containing product) was added, and the reaction was carried out at room temperature under a hydrogen pressure of 1 MPa. After 24 hours, the catalyst was filtered, and 50 ml of toluene was added to the reaction solution. The toluene layer and the aqueous layer were separated, and the obtained aqueous layer was concentrated. 50 ml of 90% ethanol water was added to the concentrate, followed by stirring at 25 ° C. for 10 hours. The precipitated crude crystals were filtered and dried under reduced pressure to obtain 2.8 g of ammonium salt of (2R, 4R) and (2S, 4R) monatin (42% yield).
[0167]
(2R, 4R): (2S, 4R): (2S, 4S): (2R, 4S) = 82.4: 12.3: 3: 2.3 (HPLC area ratio)
[0168]
【The invention's effect】
According to the method for producing 2R-monatin of the present invention, 2R-monatin which is an isomer having a high degree of sweetness can be produced from a monatin isomer mixture. The present invention is extremely useful industrially, particularly in the field of food, because (2R, 4R) -monatin having the highest sweetness can be produced by combining crystallization and the like.
[0169]
[Sequence list]
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Claims (21)

2S体および2R体の双方を含むモナティンの異性体混合物を、2S体のモナティンに選択的に作用してIHOGを生成する反応を触媒する酵素を含有する反応系で反応させることにより、2S体を分解させる工程、および
前記反応系から残存するモナティンを回収して2R−モナティンを得る工程
を含むことを特徴とする、2R−モナティンの製造方法。
An isomer mixture of monatin containing both the 2S-form and the 2R-form is reacted in a reaction system containing an enzyme which selectively acts on the 2S-form monatin to catalyze a reaction for producing IHOG, thereby converting the 2S-form. A method for producing 2R-monatin, comprising a step of decomposing and a step of collecting remaining monatin from the reaction system to obtain 2R-monatin.
前記酵素は、L−アミノトランスフェラーゼおよび/またはL−アミノ酸オキシダーゼであることを特徴とする、請求項1記載の2R−モナティンの製造方法。The method for producing 2R-monatin according to claim 1, wherein the enzyme is L-aminotransferase and / or L-amino acid oxidase. 前記L−アミノトランスフェラーゼはL−アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼであることを特徴とする、請求項2記載の2R−モナティンの製造方法。The method for producing 2R-monatin according to claim 2, wherein the L-aminotransferase is L-aspartate aminotransferase. 前記L−アミノトランスフェラーゼは、Aeromonas属、Agrobacterium属、Alcaligenes属、Beijerinckia属、Escherichia属、Proteus属、Morganella属からなる群より選ばれる微生物に由来することを特徴とする、請求項2または3記載の2R−モナティンの製造方法。The L-aminotransferase according to claim 2 or 3, wherein the L-aminotransferase is derived from a microorganism selected from the group consisting of Aeromonas, Agrobacterium, Alcaligenes, Beijerinckia, Escherichia, Proteus, and Morganella. A method for producing 2R-monatin. 前記微生物は、Aeromonas hydrophila、Agrobacterium tumefaciens、Alcaligenes faecalis、Beijerinckia indica、Escherichia coli、Proteus rettgeri及びMorganella morganiiからなる群より選ばれることを特徴とする、請求項4記載の2R−モナティンの製造方法。The microorganism may be from the group consisting of Aeromonas hydrophila, Agrobacterium tumefaciens, Alcaligenes faecalis, Beijerinckia indica, Escherichia coli, a Proteus rettgeri from the group of the methods described in the Proteus rettgeri, and a Rotegania from the group consisting of: 前記L−アミノトランスフェラーゼは、L−アミノトランスフェラーゼ遺伝子を導入した微生物の産生するL−アミノトランスフェラーゼであることを特徴とする、請求項2または3記載の2R−モナティンの製造方法。The method for producing 2R-monatin according to claim 2 or 3, wherein the L-aminotransferase is an L-aminotransferase produced by a microorganism into which an L-aminotransferase gene has been introduced. 前記L−アミノトランスフェラーゼ遺伝子は、Escherichia coliに由来するL−アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ遺伝子であることを特徴とする、請求項6記載の2R−モナティンの製造方法。The method for producing 2R-monatin according to claim 6, wherein the L-aminotransferase gene is an L-aspartate aminotransferase gene derived from Escherichia coli. 前記反応系にアミノ基受容体として、α−ケト酸を含有することを特徴とする、請求項2〜7のいずれか一つに記載の2R−モナティンの製造方法。The method for producing 2R-monatin according to any one of claims 2 to 7, wherein the reaction system contains α-keto acid as an amino group acceptor. さらに前記反応系に、前記α−ケト酸から副生するL−アミノ酸に対して作用するL−アミノ酸オキシダーゼを含有することを特徴とする、請求項8記載の2R−モナティンの製造方法。The method for producing 2R-monatin according to claim 8, further comprising an L-amino acid oxidase acting on an L-amino acid by-produced from the α-keto acid in the reaction system. 前記α−ケト酸は、α−ケトグルタル酸であり、かつ、前記L−アミノ酸オキシダーゼは、L−グルタミン酸オキシダーゼであることを特徴とする、請求項9記載の2R−モナティンの製造方法。The method for producing 2R-monatin according to claim 9, wherein the α-keto acid is α-ketoglutarate, and the L-amino acid oxidase is L-glutamate oxidase. 前記L−グルタミン酸オキシダーゼは、Streptomyces属またはAzotobacter属に由来することを特徴とする、請求項10記載のモナティンの2R−モナティンの製造方法。The method for producing 2R-monatin monatin according to claim 10, wherein the L-glutamate oxidase is derived from the genus Streptomyces or the genus Azotobacter. 前記L−アミノ酸オキシダーゼは、蛇毒由来L−アミノ酸オキシダーゼであることを特徴とする、請求項2記載の2R−モナティンの製造方法。The method for producing 2R-monatin according to claim 2, wherein the L-amino acid oxidase is a snake venom-derived L-amino acid oxidase. 前記モナティンの異性体混合物は、(2S、4S)体および(2R、4R)体を含み、前記酵素は、Escherichia coli由来L−アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼであることを特徴とする、請求項1記載の2R−モナティンの製造方法。2. The method according to claim 1, wherein the isomer mixture of monatin includes (2S, 4S) form and (2R, 4R) form, and the enzyme is L-aspartate aminotransferase derived from Escherichia coli. 3. A method for producing 2R-monatin. 前記モナティンの異性体混合物は、(2S、4R)体および(2R、4R)体を含み、前記酵素は、蛇毒由来L−アミノ酸オキシダーゼであることを特徴とする、請求項1記載の2R−モナティンの製造方法。The 2R-monatin according to claim 1, wherein the isomer mixture of monatin includes a (2S, 4R) form and a (2R, 4R) form, and the enzyme is L-amino acid oxidase derived from snake venom. Manufacturing method. さらに前記反応系に、IHOGから2R体のモナティンを生成する反応を触媒するD−アミノトランスフェラーゼを含有することを特徴とする請求項1〜14のいずれか一つに記載の2R−モナティンの製造方法。The method for producing 2R-monatin according to any one of claims 1 to 14, wherein the reaction system further comprises a D-aminotransferase that catalyzes a reaction for producing 2R-form monatin from IHOG. . 前記D−アミノトランスフェラーゼは、Bacillus属又はPaenibacillus属に属する微生物に由来することを特徴とする、請求項15記載の2R−モナティンの製造方法。The method for producing 2R-monatin according to claim 15, wherein the D-aminotransferase is derived from a microorganism belonging to the genus Bacillus or Paenibacillus. 前記微生物は、Bacillus sphaericus、Bacillus pulvifaciens、Bacillus macerans、Bacillus lentus、Paenibacillus larvae subsp. pulvifaciens及びPaenibacillus maceransからなる群より選ばれることを特徴とする、請求項16記載の2R−モナティンの製造方法。The microorganisms include Bacillus sphaericus, Bacillus pulvifaciens, Bacillus macerans, Bacillus lentus, Paenibacillus larvae subsp. The method for producing 2R-monatin according to claim 16, wherein the method is selected from the group consisting of Pulvifaiens and Paenibacillus macerans. 前記D−アミノトランスフェラーゼは、D−アミノトランスフェラーゼ遺伝子を導入した微生物の産生する酵素であることを特徴とする、請求項15記載の2R−モナティンの製造方法。The method for producing 2R-monatin according to claim 15, wherein the D-aminotransferase is an enzyme produced by a microorganism into which a D-aminotransferase gene has been introduced. 前記D−アミノトランスフェラーゼ遺伝子は、Bacillus sphaericus又はBacillus maceransに由来することを特徴とする、請求項18記載の2R−モナティンの製造方法。The method for producing 2R-monatin according to claim 18, wherein the D-aminotransferase gene is derived from Bacillus sphaericus or Bacillus macerans. (2S、4R)体および(2R、4R)体の双方を含むモナティンの異性体混合物を、(2S、4R)体のモナティンに選択的に作用して4R−IHOGを生成する反応を触媒する酵素、および、4R−IHOGから(2R、4R)体のモナティンを生成する反応を触媒するD−アミノトランスフェラーゼを含有する反応系で反応させることにより、(2S、4R)体を(2R、4R)体に変換する工程、
前記反応系からモナティンを回収して(2R、4R)−モナティンを得る工程
を含むことを特徴とする、(2R、4R)−モナティンの製造方法。
Enzyme that catalyzes a reaction that produces a 4R-IHOG by selectively reacting a mixture of isomers of monatin containing both (2S, 4R) form and (2R, 4R) form with (2S, 4R) form of monatin. , And a reaction system containing D-aminotransferase that catalyzes a reaction for producing a (2R, 4R) form of monatin from 4R-IHOG, thereby converting the (2S, 4R) form into the (2R, 4R) form. The process of converting to
A method for producing (2R, 4R) -monatin, comprising a step of collecting monatin from the reaction system to obtain (2R, 4R) -monatin.
2S体および2R体の双方を含むモナティンの異性体混合物を、2S体のモナティンに選択的に作用してIHOGを生成する反応を触媒する酵素を含有する反応系で反応させ、2S体のモナティンの少なくとも一部を分解させることにより、高甘味度異性体である2R体の含有率を向上させることを特徴とするモナティンの甘味度改善方法。A mixture of isomers of monatin containing both 2S-form and 2R-form is reacted in a reaction system containing an enzyme which selectively acts on 2S-form monatin and catalyzes a reaction for producing IHOG, and reacts the mixture with 2S-form monatin. A method for improving the sweetness of monatin, characterized in that the content of the high-sweetness isomer 2R is improved by decomposing at least a part thereof.
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