JP2004215520A - トマト黄化葉巻ウイルスの診断法 - Google Patents

Abstract

【課題】トマト黄葉巻病の早期診断のために、その病原ウイルスであるトマト黄化葉巻ウイルス（ＴＹＬＣＶ）を高感度に検出させる方法を提供すること。
【解決手段】ＴＹＬＣＶの塩基配列から設計された任意の塩基配列と特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドプライマー、該プライマーを用いた核酸増幅法、核酸増幅の検出によるＴＹＬＣＶ感染の有無及びトマト黄化葉巻病の診断方法、並びに診断用キット。
【選択図】なし

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、トマト黄化葉巻ウイルス（ Ｔｏｍａｔｏ Ｙｅｌｌｏｗ Ｌｅａｆ Ｃｕｒｌ Ｖｉｒｕｓ；以下ＴＹＬＣＶ）の検出方法に関し、さらに詳しくはＴＹＬＣＶ遺伝子の、高感度な遺伝子工学的検出法を利用したトマト黄化葉巻病の診断方法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術と問題点】
トマト黄化葉巻病の病原ウイルスであるＴＹＬＣＶは、トマトの深刻な病態要因として、１９６４年イスラエルで Ｃｏｈｅｎ等によって初めて同定され、１９８８年には Ｃｚｏｓｎｅｋ等により、また、イタリアのサラディニア島でも１９８８年 Ｌｕｉｓｏｎｉ等によって単離された。一方、日本では、１９９６年に長崎、静岡、愛知県において、初めてその侵入が確認されたが、それ以来急速に蔓延し、現在では広範囲において発生が確認されている。また、このウイルスは、環状一本鎖ＤＮＡ遺伝子を有するジュミニウイルス科に属し、シルバーリーフコナジラミ（以下コナジラミ）によってのみ媒介されると言われている（例えば、非特許文献１参照）。
【０００３】
ＴＹＬＣＶに感染すると、その初期症状として、新葉が黄化、退緑しながら下方に巻き込み縮葉となる。さらに症状が進むと、節間が短縮し、株は黄化萎縮を示す。媒介虫であるコナジラミは、幼虫、成虫いずれでもウイルスを獲得でき、またかなり長期間にわたりウイルスを伝搬できるため、一度ＴＹＬＣＶに罹病したトマトは、特に生育初期に感染すると、その高い感染力により病徴が激しい。果実では、発病前に着果した果実は小果ながら、ある程度の生産は可能であるが、生育初期に感染すると生育は停滞し、開花しても不稔になることが多く、収穫は望めない。その結果、大幅な減収を招いたり、また収穫が皆無になる等農家に経済的に大きなダメージを与える。
【０００４】
トマト黄化葉巻病の防除には、冬期に施設トマト栽培を一旦終了させ、保毒植物を無くするとともに、トマト施設内の保毒コナジラミを死滅させて（野外越冬できない）ＴＹＬＣＶを消滅させるのが最良の手段であるが、施設トマトの周年化が進む現状では、非現実的である。したがって、圃場内外のコナジラミの徹底防除と感染トマトの徹底除去を行うことが望まれており、その対策として次のことが挙げられている。
【０００５】
第一に、圃場内及び圃場周辺の環境を整備することが必要である。ＴＹＬＣＶの感染する植物は、ごく一部の例外を除いてほぼトマトに限られるが、コナジラミが、トマトとその周辺の寄生する雑草の間を行き来することがないように、特に、コナジラミが発生してからの除草は、コナジラミを圃場に追い込むという逆効果となるため、早めの除草を心がける。また、廃棄トマトからの再生芽やこぼれ種からの自生トマトは強力な感染源となるため、残渣を搬出し処分する。第二に、コナジラミの侵入できないように、苗場の出入口、側窓、天窓、換気扇に可能な限り細かいネットを張ったり、種々の有効薬剤による防除を行う等である。このようにトマト黄化葉巻病は、その蔓延速度が速いため、罹病早期の診断技術が要求される。
【０００６】
Ｃａｃｉａｇｌｉ Ｐ等は、標記ウイルスの全ゲノム ｄｉｇｏｘｉｇｅｎｉｎ 標識プローブを用いて、ドットブロットハイブリダイゼーションを行い、その標識プローブの検出として、酵素標識抗体と化学発光基質を反応させた後、膜に密着させたＸ線フィルムを感光させ、その感光像の濃さをデンシトメーターによって測定することによって、ＴＹＬＣＶ感染トマト組織およびＴＹＬＣＶ媒介動物抽出物等の試料中のＴＹＬＣＶのＤＮＡ量を測定している（例えば、非特許文献２参照）。
【０００７】
Ｐｉｃｏ Ｂ等は、３抗体サンドイッチイムノアッセイ等の血清学的方法では検出できないような低濃度すなわち、無病徴のトマト葉及び茎の押し潰したものを試料として、ＴＹＬＣＶ−Ｓａｒ（サラディニア株）及び−Ｉｓ（イスラエル株）に共通する塩基配列から設計されたプライマーを使用したＰＣＲ法や、ハイブリダイゼーション法を利用した体内のウイルスの分布を調べている（例えば、非特許文献３参照）。
【０００８】
Ｍａｒｔｉｎｅｚ−Ｃｕｌｅｂｒａｓ Ｐ Ｖ等は、ジェミニウイルス科に属する ｂｅｇｏｍｏｖｉｒｕｓ の広範囲な塩基配列からＴＹＬＣＶに特異的なプライマーを設計し、異種として区分されているＴＹＬＣＶ−ＩｓおよびＴＹＬＣＶ−Ｓａｒを検出し得る２重ＰＣＲ法 に適する各プライマーの組合せを検討し、迅速かつそれらを識別できる方法を確立している（例えば、非特許文献４参照）。
【０００９】
一方、この病原ウイルスの日本侵入は、日も浅いため生産現場での認識は十分ではなく、防除対策は遅れがちであった。そこで、効率的なウイルス病診断技術の確立が早急に望まれた。ジェミニウイルスの検出にはＰＣＲが有効であるとの知見から、長崎及び静岡で発生したＴＹＬＣＶ株が、ＴＹＬＣＶ−Ｉｓ株と９７％以上の相同性を示したため、これらの塩基配列情報を基にＴＹＬＣＶ種特異的プライマーを設計し、併せて感染葉からの簡易核酸抽出法を検討することにより、ＰＣＲを用いたトマト黄化葉巻病の診断法が確立された。さらに、これら２系統間の塩基配列の違いから、ＰＣＲ−ＲＦＬＰによる系統識別する手法をも確立された（例えば、非特許文献５参照）。
【００１０】
一般的に、ウイルスの検定には血清学的な手法が繁用されているが、ジェミニウイルスに対するポリクローナル抗体は一般に力価、特異性ともに低いため、モノクローナル抗体を用いた３抗体サンドイッチ法を利用したＥＬＩＳＡキットが市販されている。ところがこのキットを用いても、ＴＹＬＣＶに近縁なタバコ巻葉ウイルスの分離株によってはＴＹＬＣＶと全く同一の反応を示し、種の識別ができない場合がある。このように市販の検定キットにおいてもなおＴＹＬＣＶの正確な血清学的診断には十分対応できていないのが現状である。
【００１１】
発症後では、ウイルスがどの系統から発生したか等の原因究明がその後の防除対策として必要となるが、もし可能であれば、発症前にウイルスをスクリーニング的に検査し、媒介虫であるコナジラミを駆除することが理想的である。何故ならば、発症後では、他の苗にもコナジラミが移動しウイルスを撒き散らしている可能性が高いからである。そのためにも、発症前でも検出できる高感度分析法が望まれる。
【００１２】
本発明者等は、現在知られている方法、すなわち、ＰＣＲ法、免疫学的測定法より高感度で特異的な検出方法すなわちＬＡＭＰ法を用いることで、本発明の目的を達成できた。なお、一般に、トマト黄化葉巻病の潜伏期間は１０日程度といわれており、この高感度な検出法を利用することで、特別な抽出法や押しつぶす等の物理的な操作も不要で、例えば無病徴を呈する葉・茎を直接緩衝液等に浸漬させ、その緩衝液をそのまま反応に適用することができるスクリーニング検査が期待でき、その結果、ウイルスが定着してても、発症前診断により、早期な苗の除去、薬剤噴霧等の効果的な対策を講ぜられることになる。
【００１３】
【非特許文献１】
加藤公彦「植物防疫」１９９９年、５３巻、８号、ｐ．３０８−３１１
【非特許文献２】
Ｃａｃｉａｇｌｉ Ｐ、ｅｔ ａｌ． 「Ｊ． Ｖｉｌｏｌ． Ｍｅｔｈｏｄｓ」１９９６年、５７巻、１号、ｐ．１９−２９
【非特許文献３】
Ｐｉｃｏ Ｂ、ｅｔ ａｌ．「Ｐｌａｎｔ Ｄｉｓｅａｓｅ」１９９９年、８３巻、１１号、ｐ．１００６−１０１２
【非特許文献４】
Ｍａｒｔｉｎｅｚ−Ｃｕｌｅｂｒａｓ Ｐ Ｖ、ｅｔ．ａｌ．「 Ａｎｎ． Ａｐｐｌ． Ｂｉｏｌ． 」２００１年、１３９巻、２号、ｐ．２５１−２５７
【非特許文献５】
大貫正俊等「九州沖縄農業研究成果情報」２００１年、１６号下巻、ｐ．４２９−４３０
【００１４】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、トマト黄化葉巻病の早期診断のために、その病原ウイルスであるＴＹＬＣＶを高感度に検出させることを目的とする。
【００１５】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究を行った結果、ＴＹＬＣＶに特異的な塩基配列と選択的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドプライマーを作製し、ＬＡＭＰ法によりＴＹＬＣＶに特異的な塩基配列を増幅することで、ＴＹＬＣＶを高感度に検出できることを見出し本発明を完成した。
【００１６】
すなわち、本発明は以下の構成からなる。
（１）配列番号１で示されるトマト黄化葉巻ウイルス（ＴＹＬＣＶ）の４５〜１７９１番又は２３３４〜２５４２番の塩基配列から選ばれた任意の塩基配列、又はそれらと相補的な塩基配列から設計されたオリゴヌクレオチドプライマー。
（２）ＴＹＬＣＶの塩基配列から選ばれた配列番号２〜２５で示される塩基配列、又はそれらと相補的な塩基配列から選ばれた少なくとも連続する１５塩基を含む（１）記載のオリゴヌクレオチドプライマー。
（３）ＴＹＬＣＶの標的核酸上の３’末端側からＦ３ｃ、Ｆ２ｃ、Ｆ１ｃという塩基配列領域を、５’末端側からＲ３、Ｒ２、Ｒ１という塩基配列領域を選択し、それぞれの相補的塩基配列をＦ３、Ｆ２、Ｆ１、そしてＲ３ｃ、Ｒ２ｃ、Ｒ１ｃとしたときに、以下の（ａ）〜（ｄ）から選ばれた塩基配列から成ることを特徴とする（１）〜（２）記載のオリゴヌクレオチドプライマー。
（ａ）標的核酸のＦ２領域を３’末端側に有し、５’末端側に標的核酸のＦ１ｃ領域を有する塩基配列。
（ｂ）標的核酸のＦ３領域を有する塩基配列。
（ｃ）標的核酸のＲ２領域を３’末端側に有し、５’末端側に標的核酸のＲ１ｃ領域を有する塩基配列。
（ｄ）標的核酸のＲ３領域を有する塩基配列。
（４）ＴＹＬＣＶに特異的な塩基配列を増幅でき、５’末端から３’末端に向かい以下の（ｅ）〜（ｌ）から選ばれた塩基配列から成ることを特徴とする（１）〜（３）記載のオリゴヌクレオチプライマー。
（ｅ）５’−（配列番号２の塩基配列に相補的な塩基配列）−（塩基数０〜５０の任意の塩基配列）−（配列番号３の塩基配列）−３’
（ｆ）５’−（配列番号５の塩基配列）−（塩基数０〜５０の任意の塩基配列）−（配列番号６の塩基配列に相補的な塩基配列）−３’
（ｇ）５’−（配列番号８の塩基配列に相補的な塩基配列）−（塩基数０〜５０の任意の塩基配列）−（配列番号９の塩基配列）−３’
（ｈ）５’−（配列番号１１の塩基配列）−（塩基数０〜５０の任意の塩基配列）−（配列番号１２の塩基配列に相補的な塩基配列）−３’
（ｉ）５’−（配列番号１４の塩基配列に相補的な塩基配列）−（塩基数０〜５０の任意の塩基配列）−（配列番号１５の塩基配列）−３’
（ｊ）５’−（配列番号１７の塩基配列）−（塩基数０〜５０の任意の塩基配列）−（配列番号１８の塩基配列に相補的な塩基配列）−３’
（ｋ）５’−（配列番号２０の塩基配列に相補的な塩基配列）−（塩基数０〜５０の任意の塩基配列）−（配列番号２１の塩基配列）−３’
（ｌ）５’−（配列番号２３の塩基配列）−（塩基数０〜５０の任意の塩基配列）−（配列番号２４の塩基配列に相補的な塩基配列）−３’
（５）（１）〜（４）記載のオリゴヌクレオチドプライマーを用いて、ＴＹＬＣＶの標的核酸領域の増幅反応を行うことを特徴とするＴＹＬＣＶの検出方法。
（６）ＴＹＬＣＶの標的核酸領域の増幅反応がＬＡＭＰ法であることを特徴とする（５）記載のＴＹＬＣＶの検出方法。
（７）（１）〜（４）記載のオリゴヌクレオチドプライマーを用いてＴＹＬＣＶの標的核酸領域の増幅を検出することで、ＴＹＬＣＶ感染の有無を診断することを特徴とするトマト黄化葉巻病の診断方法。
（８）トマト黄化葉巻病の診断方法において、請求項１〜４記載のオリゴヌクレオチドプライマーを含むことを特徴とするキット。
以下、本発明を詳細に説明する。
【００１７】
【発明の実施の形態】
本発明において使用される試料としては、植物由来特にトマト検体の葉、枝、果実等を適当な大きさの切片としたものが提供される。そして、この切片試料は、ＴＹＬＣＶの感染有無を問わず、肉眼的に無病徴であっても、あるいは明らかに黄化葉巻病を呈しているものであってもよい。トマト検体から増幅に用いられる核酸は、この切片をそのまま増幅に使用される緩衝液に浸漬されて遊離させるか、あるいは別にトリス緩衝液やリン酸緩衝液等の緩衝液からなる抽出液と共に試料を磨砕等してから、抽出・生成等の公知の技術より精製させることができる。また、ＴＹＬＣＶはコナジラミの媒介によって感染することが判明しており、地域や各圃場の保毒虫率から伝染環境の解明や被害の予測等の目的のために、この媒介虫本体を試料として用いてもよい。
【００１８】
このようにトマト検体あるいは媒介虫から得られたＴＹＬＣＶ由来の核酸を増幅するためには、近年、納富らが開発した、ＰＣＲ法で不可欠とされる温度制御が不要な新しい核酸増幅法：ＬＡＭＰ（ Ｌｏｏｐ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ ＡＭＰｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ＤＮＡ ）法と呼ばれるループ媒介等温増幅法（ＷＯ ００／２８０８２）で達成させられる。この方法は、鋳型となるヌクレオチドに自身の３’末端をアニールさせて相補鎖合成の起点とするとともに、このとき形成されるループにアニールするプライマーを組み合わせることにより、等温での相補鎖合成反応を可能とした核酸増幅法である。また、ＬＡＭＰ法では、プライマーの３’末端が常に試料に由来する領域に対してアニールするために、塩基配列の相補的結合によるチェック機構が繰り返し機能するため、その結果として、高感度にかつ特異性の高い核酸増幅反応を可能としている。
【００１９】
ＬＡＭＰ反応で使用されるオリゴヌクレオチドプライマーは、鋳型核酸の塩基配列の計６領域、すなわち３’末端側からＦ３ｃ、Ｆ２ｃ、Ｆ１ｃという領域と、５’末端側からＲ３、Ｒ２、Ｒ１という領域の塩基配列を認識する少なくとも４種類のプライマーであって、各々インナープライマーＦ及びＲとアウタープライマーＦ及びＲと呼ぶ。また、Ｆ１ｃ、Ｆ２ｃ、Ｆ３ｃの相補配列をそれぞれＦ１、Ｆ２、Ｆ３、またＲ１、Ｒ２、Ｒ３の相補鎖をＲ１ｃ、Ｒ２ｃ、Ｒ３ｃと呼ぶ。インナープライマーとは、標的塩基配列上の「ある特定のヌクレオチド配列領域」を認識し、かつ合成起点を与える塩基配列を３’末端に有し、同時にこのプライマーを起点とする核酸合成反応生成物の任意の領域に対して相補的な塩基配列を５’末端に有するオリゴヌクレオチドである。ここで、「Ｆ２より選ばれた塩基配列」及び「Ｆ１ｃより選ばれた塩基配列」を含むプライマーをインナープライマーＦ（以下ＩＰＦ）、そして「Ｒ２より選ばれた塩基配列」と「Ｒ１ｃより選ばれた塩基配列」を含むプライマーをインナープライマーＲ（以下ＩＰＲ）と呼ぶ。一方、アウタープライマーとは、標的塩基配列上の『「ある特定のヌクレオチド配列領域」の３’末端側に存在するある特定のヌクレオチド配列領域』を認識かつ合成起点を与える塩基配列を有するオリゴヌクレオチドである。ここで、「Ｆ３より選ばれた塩基配列」を含むプライマーをアウタープライマーＦ（以下ＯＰＦ）、「Ｒ３より選ばれた塩基配列」を含むプライマーをアウタープライマーＲ（以下ＯＰＲ）と呼ぶ。ここで、各プライマーにおけるＦとは、標的塩基配列のセンス鎖と相補的に結合し、合成起点を提供するプライマー表示であり、一方Ｒとは、標的塩基配列のアンチセンス鎖と相補的に結合し、合成起点を提供するプライマー表示である。ここで、プライマーとして用いられるオリゴヌクレオチドの長さは、１０塩基以上、好ましくは１５塩基以上で、化学合成あるいは天然のどちらでも良く、各プライマーは単一のオリゴヌクレオチドであってもよく、複数のオリゴヌクレオチドの混合物であってもよい。
【００２０】
本発明者等は、配列番号１で示される塩基配列から、ＴＹＬＣＶの特異的な塩基配列を迅速に増幅できるＬＡＭＰ法のプライマーの塩基配列とその組み合わせを鋭意研究した結果、プライマーセットとして次のＡ〜Ｃの３組と、さらにＴＹＬＣＶ愛知株に特異的な塩基配列を迅速に増幅できるプライマーセットＤを選定した。
（セットＡ）
ＩＰＦ−Ａ：５’−ＧＧＧＧＡＣＣＧＧＧＣＡＴＡＡＡＧＴＴＡ−ＡＴＣＡＴＴＡＡＡＧＣＧＧＣＣＡＴＣＣＧ−３’ （配列番号２６）
ＯＰＦ−Ａ：５’−ＴＧＡＧＴＡＣＣＡＡＡＴＧＧＣＡＴＴＴＴＧ−３’ （配列番号４）
ＩＰＲ−Ａ：５’−ＧＣＡＴＣＣＴＣＡＡＡＣＧＴＴＡＧＡＴＡＡＧ−ＧＣＡＡＧＡＣＡＡＡＡＴＡＣＴＴＧＧＧＧＡＣ−３’ （配列番号２７）
ＯＰＲ−Ａ：５’−ＣＡＴＴＴＡＧＡＡＧＴＧＧＡＴＣＣＣＡＣ−３’ （配列番号２８）
（セットＢ）
ＩＰＦ−Ｂ：５’−ＡＧＴＣＡＣＧＧＧＣＣＣＴＴＡＣＡＡＣＡＧ−ＣＣＣＡＡＴＡＣＡＴＴＧＧＧＣＣＡＣＧ−３’ （配列番号２９）
ＯＰＦ−Ｂ：５’−ＴＧＣＡＧＴＣＣＧＴＴＧＡＧＧＡＡＡＣ−３’ （配列番号１０）
ＩＰＲ−Ｂ：５’−ＣＴＣＧＡＡＧＧＴＴＣＧＣＣＧＡＡＧＧＣ−ＧＡＣＡＡＴＧＧＧＧＡＣＡＧＣＡＧＣ−３’ （配列番号３０）
ＯＰＲ−Ｂ：５’−ＣＣＴＧＴＡＣＧＴＣＣＡＴＧＡＴＣＧＴＣ−３’ （配列番号３１）
（セットＣ）
ＩＰＦ−Ｃ：５’−ＡＣＴＡＣＣＴＣＣＡＣＣＴＣＡＡＣＴＧＣＡＡ−ＧＧＡＧＣＡＧＴＧＡＴＧＡＧＴＴＣＣＣ−３’ （配列番号３２）
ＯＰＦ−Ｃ：５’−ＡＡＣＧＣＣＡＴＴＣＴＣＴＧＣＴＴＧＡ−３’ （配列番号１６）
ＩＰＲ−Ｃ：５’−ＡＴＧＡＧＣＡＧＣＣＡＣＡＧＴＣＴＡＧＧＴ−ＧＧＴＣＣＡＡＣＡＣＡＡＧＡＴＡＧＣＣＡ−３’ （配列番号３３）
ＯＰＲ−Ｃ：５’−ＧＡＧＣＣＡＣＴＧＴＴＣＧＣＡＡＧＴ−３’ （配列番号３４）
（セットＤ）
ＩＰＦ−Ｄ：５’−ＧＡＣＧＧＡＣＧＡＴＣＴＧＣＡＣＧＴＧ−ＧＡＧＴＴＡＡＧＡＧＣＴＧＣＧＧＣＧＴＡ−３’ （配列番号３５）
ＯＰＦ−Ｄ：５’−ＧＡＧＣＣＴＣＴＧＡＣＴＴＡＣＴＧＣＣ−３’ （配列番号２２）
ＩＰＲ−Ｄ：５’−ＧＡＡＡＣＴＣＡＣＣＣＣＡＧＴＣＧＡＣＧＧ−ＡＴＣＣＡＧＴＴＣＡＧＡＣＧＴＣＡＡＧＴ−３’ （配列番号３６）
ＯＰＲ−Ｄ：５’−ＣＡＴＣＣＡＡＡＣＡＴＴＣＡＧＧＧＡＧＣ−３’ （配列番号３７）
【００２１】
核酸合成で使用する酵素は、鎖置換活性を有する鋳型依存性核酸合成酵素であれば特に限定されない。このような酵素としては、Ｂｓｔ ＤＮＡポリメラーゼ（ラージフラグメント）、Ｂｃａ（ｅｘｏ−）ＤＮＡポリメラーゼ、大腸菌ＤＮＡ ポリメラーゼＩのクレノウフラグメント等が挙げられ、好ましくはＢｓｔ ＤＮＡポリメラーゼ（ラージフラグメント）が挙げられる。Ｂｓｔ ＤＮＡポリメラーゼを用いる場合は、その反応至適温度である６５℃付近で反応を行うのが望ましい。
【００２２】
ＬＡＭＰ反応後の核酸増幅産物の検出には公知の技術が適用できる。例えば、増幅された塩基配列を特異的に認識する標識オリゴヌクレオチドや蛍光性インターカレーター法（特開２００１−２４２１６９）を用いたり、あるいは反応終了後の反応液をそのままアガロース電気泳動にかけても容易に検出できる。電気泳動では、ＬＡＭＰ増幅産物が、塩基長の異なる多数のバンドがはしご状に検出される。また、ＬＡＭＰ法では核酸の合成により基質が大量に消費され、副生物であるピロリン酸が、共存するマグネシウムと反応してピロリン酸マグネシウムとなり、反応液が肉眼でも確認できる程に白濁する。したがって、この白濁を、反応終了後あるいは反応中の濁度上昇を経時的に光学的に観察できる測定機器、例えば４００ｎｍの吸光度変化を通常の分光光度計を用いて確認することも可能である（ＷＯ０１／８３８１７）。
【００２３】
【実施例】
以下に実施例を挙げて本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらにより何ら限定されるものではない。
実施例１．検出限界の確認
ＬＡＭＰ法と、代表的な核酸増幅法であるＰＣＲ法との検出感度の比較を行った。
１．試料及び試薬の調製
１）核酸抽出
５０ｍｇのＴＹＬＣＶに罹病したトマト葉を ０．５Ｍ ＮａＯＨ １００μＬ中で磨砕後、その ５０μＬに １００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ ｐＨ８．０ ）４５０μＬを添加したものを１０倍希釈液とし、さらに段階的に１０倍ずつの希釈操作を繰り返し、磨砕後の原液濃度を１として、１０^７倍までの希釈液を作製し、これらを核酸抽出試料とした。
２）ＰＣＲ法に用いる試薬組成及び濃度
ＰＣＲ法で使用するＴＹＬＣＶ検出用プライマーとして、ＴＹＬＣＶゲノムの１８７ｂｐ を増幅する配列番号３８及び３９で示される塩基配列からなる２種類のプライマーを使用し、ＰＣＲ法での最終反応溶液 ２５μＬ中の各試薬濃度が以下になるよう調整した。
・１０ ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ ｐＨ ８．３ ）
・５０ ｍＭ ＫＣｌ
・ １．５ ｍＭ ＭｇＣｌ_２
・ ０．００１ ％ Ｇｅｌａｔｉｎ
・ ０．２ ｍＭ ｅａｃｈ ｄＮＴＰ
・ ２．５ Ｕｎｉｔｓ Ａｍｐｌｉｔａｑ Ｇｏｌｄ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ 社製）
・ ０．２μＭ ＰＣＲプライマー−１及び−２
ＰＣＲプライマー−１：５’−ＧＴＣＴＴＡＴＧＡＧＣＡＡＣＧＣＣＡＴＧ−３’ （配列番号３８）
ＰＣＲプライマー−２：５’−ＧＡＡＣＡＴＧＡＣＣＴＧＡＴＴＡＧＴＧＴＧ−３’ （配列番号３９）
３）ＬＡＭＰ法に用いる試薬組成及び濃度
ＬＡＭＰ法での最終反応溶液 ２５μＬ中の各試薬濃度が下記になるよう調整した。
・２０ ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ ｐＨ ８．８ ）
・１０ ｍＭ （ＮＨ_４）_２ＳＯ_４
・ ４ ｍＭ ＭｇＳＯ_４
・ ０．１ ％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００
・ １．４ｍＭ ｅａｃｈ ｄＮＴＰ
・ １ Ｍ Ｂｅｔａｉｎｅ
・ ８ Ｕｎｉｔｓ Ｂｓｔ ＤＮＡポリメラーゼ（ Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂ社製 ）
プライマー（セットＢ使用）
・ １．６ μＭ ＩＰＦ（配列番号２９）及びＩＰＲ（配列番号３０）
・ ０．２ μＭ ＯＰＦ（配列番号１０）及びＯＰＲ（配列番号３１）
２．核酸増幅法による反応
１）ＰＣＲ法による反応
上記のＰＣＲ用試薬に １〜１０^７まで希釈した各核酸抽出試料 １μＬを入れ、最終反応溶液 ２５μＬとし、０．２ｍＬの専用チューブ内でＰＣＲ反応を行った。ＰＣＲ反応は、熱変性９４℃１分（１サイクル目９分）、アニーリング５０℃１分、ポリメラーゼ伸長反応７２℃２分（最終サイクル１０分）を１サイクルとして計５０サイクル行った。反応装置は ＧｅｎｅＡｍｐ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ ９６００ （ Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ Ｃｅｔｕｓ 社製）を使用し、反応終了後の増幅産物 ５μＬについて ２％アガロースゲルで電気泳動を行った。
２）ＬＡＭＰ法による反応
ＬＡＭＰ用試薬に希釈した各核酸抽出試料 １μＬを入れ、最終反応溶液 ２５μＬとし、０．２ｍＬの専用チューブ内で、６５℃で６０分、さらに８０℃で１０分ＬＡＭＰ反応を行った。１）同様に反応終了後の液 ５μＬ について ２％アガロースゲルで電気泳動を行った。
３．電気泳動法による各増幅反応の検出限界の比較結果
各増幅反応における電気泳動の結果を図１に示す。その結果、ＰＣＲ法、ＬＡＭＰ法とも増幅産物の確認ができた。ＰＣＲ法では、１０^２倍希釈までは明瞭に特定の一本のバンドが認められたが、１０^３倍希釈では薄いバンドとして観察された。これに対しＬＡＭＰ法では、１０^５倍希釈まで増幅を確認することができた。したがって、ＴＹＬＣＶの検出においては、ＬＡＭＰ法は、ＰＣＲ法と比較し １００倍の感度を有すると判断された。このことは、ＴＹＬＣＶに罹病しても発症前である検体、すなわち無病徴検体でもトマト黄化葉巻病を診断できるということを示唆している。
【００２４】
実施例２．ＴＹＬＣＶを保毒させたコナジラミからの検出
１．試料及び試薬の調製
１）核酸抽出
ＴＹＬＣＶに感染したトマトで育成したコナジラミ及びＴＹＬＣＶが感染しないことが判明しているキャベツで育成させたコナジラミをそれぞれ４頭ずつ採取し、各１頭を １００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ ｐＨ８．０ ）１０μＬで磨砕し、この磨砕液を核酸抽出試料とした。
２）ＬＡＭＰ法に用いる試薬組成及び濃度
実施例１．の１．３）と同様に調製した。
２．ＬＡＭＰ法による反応
ＬＡＭＰ用試薬にコナジラミからの核酸抽出試料 １μＬを入れ、最終反応液 ２５μＬとし、０．２ｍＬの専用チューブ内で、６５℃で６０分、さらに８０℃で１０分ＬＡＭＰ反応を行い、チューブ内の反応液の白濁の有無により増幅産物の確認を行った。
３．結果
増幅反応における白濁生成の結果を図２に示す。ＴＹＬＣＶ感染トマトから採集したコナジラミから得られた試料（図中１〜４）に関しては、ＬＡＭＰ反応液の白濁により増幅産物が確認されたが、キャベツから採集したコナジラミから得られた試料（図中５〜８）では、白濁が観察されなかった。したがって、本プライマーセットを用いたＬＡＭＰ法により、コナジラミ１頭分のＴＹＬＣＶが検出できることが確認された。この結果から、コナジラミは特異的にＴＹＬＣＶを伝播するため、圃場内を行動する、又は圃場外から進入するコナジラミを検査することで、ＴＹＬＣＶの感染予防対策ができることを示唆している。
【００２５】
現在日本国内では、九州地方を中心にＴＹＬＣＶ−Ｉｓ（イスラエル系統：前出）由来と推測されている強毒系統（ＴＹＬＣＶ−長崎）と、東海地方を中心にＴＹＬＣＶ−Ｉｓ（イスラエルマイルド系統）由来と推測されている系統（ＴＹＬＣＶ−愛知）の２系統の発生が確認されている。そこで、本発明にあるプライマーに、この系統の鑑別診断が可能かどうか検証した。
【００２６】
実施例３．国内で発生している他の系統との鑑別診断
１．試料及び試薬の調製
１）核酸抽出
長崎系統及び愛知系統それぞれが感染したトマト葉、並びに健全葉の各 ５０ｍｇを０．５Ｍ ＮａＯＨ １００μＬ中で磨砕後、その ５０μＬに １００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ ｐＨ８．０ ）４５０μＬを添加したものを核酸抽出試料とした。
２）ＬＡＭＰ法に用いる試薬組成及び濃度
実施例１．と同様に調製した。プライマーは、セットＢ並びにセットＤを用いた。なお、セットＤは、愛知系統のみのウイルス由来の核酸を増幅できると推測されるプライマーの組み合わせである。
２．ＬＡＭＰ法による反応
ＬＡＭＰ用試薬に各種核酸抽出試料１μを入れ、最終反応液 ２５μＬとし、０．２ｍＬの専用チューブ内で、６５℃で６０分、さらに８０℃で１０分ＬＡＭＰ反応を行い、チューブ内の反応液の白濁の有無により増幅産物の確認を行った。
３．結果
健全葉ではいずれのプライマーセットを用いた場合でも白濁は観察されなかった。また、プライマーセットＢを用いた場合では、長崎系統及び愛知系統それぞれが感染したトマト葉で白濁が観察された。一方、プライマーセットＤを用いた場合では、長崎系統に感染したトマト葉は白濁を示さなかったのに対し、愛知系統に感染したトマト葉では白濁が観察された。この結果から、ＬＡＭＰ用プライマーセットの使い分けにより、国内で発生している両系統のＴＹＬＣＶが判別できることが明らかとなった。このことは、トマト黄化葉巻病の新発生地におけるＴＹＬＣＶの感染経路の発見に重要な役割を担うことを示唆している。
【表１】

【００２７】
【発明の効果】
本発明によれば、ＴＹＬＣＶに特異的な塩基配列と選択的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドプライマーを作製し、ＬＡＭＰ法によりＴＹＬＣＶに特異的な塩基配列を増幅することで、ＴＹＬＣＶを高感度に検出することができる。
【配列表】

【図面の簡単な説明】
【図１】電気泳動法による検出感度の比較を示す。
【図２】コナジラミ由来のＴＹＬＣＶ検出の有無を示す。

Claims (8)

1. 配列番号１で示されるトマト黄化葉巻ウイルス（ＴＹＬＣＶ）の４５〜１７９１番又は２３３４〜２５４２番の塩基配列から選ばれた任意の塩基配列、又はそれらと相補的な塩基配列から設計されたオリゴヌクレオチドプライマー。
2. ＴＹＬＣＶの塩基配列から選ばれた配列番号２〜２５で示される塩基配列又はそれらと相補的な塩基配列から選ばれた、少なくとも連続する１５塩基を含む請求項１記載のオリゴヌクレオチドプライマー。
3. ＴＹＬＣＶの標的核酸上の３’末端側からＦ３ｃ、Ｆ２ｃ、Ｆ１ｃという塩基配列領域を、５’末端側からＲ３、Ｒ２、Ｒ１という塩基配列領域を選択し、それぞれの相補的塩基配列をＦ３、Ｆ２、Ｆ１、そしてＲ３ｃ、Ｒ２ｃ、Ｒ１ｃとしたときに、以下の（ａ）〜（ｄ）から選ばれた塩基配列から成ることを特徴とする請求項１〜２記載のオリゴヌクレオチドプライマー。
   （ａ）標的核酸のＦ２領域を３’末端側に有し、５’末端側に標的核酸のＦ１ｃ領域を有する塩基配列。
   （ｂ）標的核酸のＦ３領域を有する塩基配列。
   （ｃ）標的核酸のＲ２領域を３’末端側に有し、５’末端側に標的核酸のＲ１ｃ領域を有する塩基配列。
   （ｄ）標的核酸のＲ３領域を有する塩基配列。
4. ＴＹＬＣＶに特異的な塩基配列を増幅でき、５’末端から３’末端に向かい以下の（ｅ）〜（ｌ）から選ばれた塩基配列から成ることを特徴とする請求項１〜３記載のオリゴヌクレオチプライマー。
   （ｅ）５’−（配列番号２の塩基配列に相補的な塩基配列）−（塩基数０〜５０の任意の塩基配列）−（配列番号３の塩基配列）−３’
   （ｆ）５’−（配列番号５の塩基配列）−（塩基数０〜５０の任意の塩基配列）−（配列番号６の塩基配列に相補的な塩基配列）−３’
   （ｇ）５’−（配列番号８の塩基配列に相補的な塩基配列）−（塩基数０〜５０の任意の塩基配列）−（配列番号９の塩基配列）−３’
   （ｈ）５’−（配列番号１１の塩基配列）−（塩基数０〜５０の任意の塩基配列）−（配列番号１２の塩基配列に相補的な塩基配列）−３’
   （ｉ）５’−（配列番号１４の塩基配列に相補的な塩基配列）−（塩基数０〜５０の任意の塩基配列）−（配列番号１５の塩基配列）−３’
   （ｊ）５’−（配列番号１７の塩基配列）−（塩基数０〜５０の任意の塩基配列）−（配列番号１８の塩基配列に相補的な塩基配列）−３’
   （ｋ）５’−（配列番号２０の塩基配列に相補的な塩基配列）−（塩基数０〜５０の任意の塩基配列）−（配列番号２１の塩基配列）−３’
   （ｌ）５’−（配列番号２３の塩基配列）−（塩基数０〜５０の任意の塩基配列）−（配列番号２４の塩基配列に相補的な塩基配列）−３’
5. 請求項１〜４記載のオリゴヌクレオチドプライマーを用いて、ＴＹＬＣＶの標的核酸領域の増幅反応を行うことを特徴とするＴＹＬＣＶの検出方法。
6. ＴＹＬＣＶの標的核酸領域の増幅反応がＬＡＭＰ法であることを特徴とする請求項５記載のＴＹＬＣＶの検出方法。
7. 請求項１〜４記載のオリゴヌクレオチドプライマーを用いてＴＹＬＣＶの標的核酸領域の増幅を検出することにより、ＴＹＬＣＶ感染の有無を診断することを特徴とするトマト黄化葉巻病の診断方法。
8. トマト黄化葉巻病の診断方法において、請求項１〜４記載のオリゴヌクレオチドプライマーを含むことを特徴とするキット。

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