【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、例えば、医薬品、食品、農薬、遺伝子工学等の分野における化学物質の合成や分離抽出、分析、検査などの反応を同時に取り扱うための、複数の反応場を備えたマイクロウェルプレートの製造方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
医薬品、食品、農薬、遺伝子工学等の分野における化学物質の合成においては、ベースとなる化学物質を他の様々な化学物質で修飾して新規化学物質を合成していき、その有効性や安全性、副作用等を評価して実用化の可否を判断する。これらの過程における化学物質の組み合わせは何十万通りになることもあり、その合成には膨大な人員と時間を必要とする。
【０００３】
一方、遺伝子ＤＮＡ（デオキシリボ核酸）の塩基配列の解析、遺伝子組み換え技術および遺伝子組み換え食品等の分野における評価や検査においても、その実行には上記と同様に膨大な組み合わせを評価、検査する必要があり、やはり多くの人員と時間が必要とされている。
【０００４】
このため、上記分野においては、多種類の候補化学物質を短時間で精度良く合成する技術であるコンビナトリアルケミストリーや、大規模なスクリーニングであるハイスループット・スクリーニングを可能とする自動合成・評価システムを構築する必要がある。
【０００５】
このようなコンビナトリアルケミストリーや、ハイスループット・スクリーニングにおいては、図３に示すようなマイクロウェルプレートが従来より用いられている。
【０００６】
このマイクロウェルプレート６０は、基板６１上に反応場（反応容器）となるウェル６２がマトリックス状に複数配置されており、このマイクロウェルプレート６０は、例えば、ウェル６２内に試料溶液を注入するための図示しないディスペンサーや、ディスペンサーを所定の位置に移動させるための制御装置、及び分析、検査装置等と共に使用される。
【０００７】
このようなマイクロウェルプレート６０においては、一つのプレート上におけるウェル６２の配置数増加と、１つあたりのウェル６２の容量低減が要求されている。また、隣接するウェル６２でのクロスコンタミネーションを防止するため、ウェル６２同士の境界における撥水性も要求されている。
【０００８】
このようなマイクロウェルプレートの従来技術として、例えば、小出らは、８６ｍｍ×１２８ｍｍの基板上に９６ヶの凹部を配置し、凹部の直径を約１０ｍｍ、深さを約３ｍｍとしたマイクロウェルプレートを開示している（非特許文献１参照）。
【０００９】
また、Ｌｅｍｍｏらは、材質としてポリプロビレンを使用し、モールド成形で多数のウェルを有するマイクロウェルプレートを作製し、５インチ×１１インチ（１２７ｍｍ×２８０ｍｍ）の基板上に４８×４８個のウェルを配置したマイクロウェルプレートを開示している（非特許文献２参照）。
【００１０】
更に、特開平１１−９９０００号公報には、図４に示すような反応場アレー７０が開示されている。この反応場アレー７０は、基板７１上の液媒体に対して親和性を有する表面７４に、凸部７２により互いに隔離され、その底面に基板７１の表面７４が部分的に露出した凹部７３からなる反応場の所定の配列を有し、凸部７２表面が液媒体に対して非親和性であるマトリクスパターンが設けられている。
【００１１】
【非特許文献１】
小出， 三宅， 他： 電気学会論文誌Ｅ，１２１巻，９号，平成１３年
【非特許文献２】
Ｌｅｍｍｏ，他：Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．，６９，５４３−５５１，１９９７
【特許文献１】
特開平１１−９９０００号公報
【００１２】
【発明が解決しようとする課題】
上記の従来技術のうち、小出ら、Ｌｅｍｍｏらのマイクロウェルプレートにおいては、基板及びウェルのサイズが大きく、ウェルの高密度化・低容量化が不充分であるという問題があった。
【００１３】
また、Ｌｅｍｍｏらのマイクロウェルプレートにおいては、材料がポリプロピレン であるので、マイクロウェルプレート全体が撥水性となり、水系の溶液を微小なウェルに供給する際に溶液を弾きやすくなり、試料溶液をウェル内に安定に保持できないという問題があった。
【００１４】
一方、特開平１１−９９０００号公報の反応場アレーにおいては、ウェルの高密度化、低容量化は可能である。しかし、凸状マトリックスパターンの形成にフォトリソグラフィー法を用いているため、加工に高価な装置設備が必要であり、製造工程も煩雑であった。また、凸部７２には非親和性の材料を選択しているが、その撥水性としては不充分であった。
【００１５】
本発明は、以上の問題点を鑑みなされたもので、小容量のウェルを高密度で配置でき、隣接するウェル間に充分な撥水性を備えるマイクロウェルプレートを、高効率、低コストで生産できるマイクロウェルプレートの製造方法を提供することを目的とする。
【００１６】
【課題を解決するための手段】
上記課題を解決するために、本発明のマイクロウェルプレートの製造方法は、基板上に複数のマイクロウェルを形成してなるマイクロウェルプレートの製造方法において、前記基板上に重なるように形成された薄板に複数の貫通孔を形成し、この薄板の表裏面及び前記貫通孔の内周面に、前記基板に対して加熱接着可能な撥水性の被膜を形成した後、前記薄板を前記基板上に設置して加熱することにより、前記薄板を、前記被膜を介して前記基板表面に接合することを特徴とする。
【００１７】
本発明の製造方法によれば、薄板に複数の貫通孔を形成した後、薄板と基板とを、撥水性の被膜を接合材として加熱によって接合一体化したので、小容量のウェルを高密度で配置でき、しかも、高効率、低コストで生産できる。また、撥水性の被膜を接合材とするので、薄板と基板の材料選択に自由度がある。
【００１８】
更に、隣接するウェル間は充分な撥水性を備えるので、クロスコンタミネーションや、ゴミ、異物等の付着と汚れ等を防止できる一方、ウェルの底部を形成する基板表面は親水性となるので、ウェル内に供給された液体類を安定的に保持することが可能となる。
【００１９】
本発明の方法においては、前記撥水性の被膜を、ふっ素系樹脂を主として含有する溶液を塗布して形成することが好ましい。これによれば、薄板表面と貫通孔内周面とに充分な撥水性を付与できる。また、ふっ素系樹脂は耐薬品性に優れて安定であるので、試料溶液との化学的反応やコンタミネーション等を有効に防止できる。
【００２０】
また、本発明の方法においては、前記基板と前記薄板との接合後に、前記貫通孔によって形成されたマイクロウェルの底面を親水化処理することが好ましい。これによれば、ウェル側面は撥水性を維持しつつ、ウェル底部をより親水化することができるので、ウェル内に供給された液体類をより安定的に保持することができる。
【００２１】
更に、本発明においては、前記基板が、ガラス、シリコンウエハ、金属より選ばれた１種であり、前記薄板が、ガラス、シリコンウエハ、金属、樹脂より選ばれた１種であることが好ましい。これによれば、ガラス、シリコンウエハ、金属は無機物で安定であり、撥水性の被膜との接着性に優れるので、特に本発明のマイクロウェルプレートに好適に用いることができる。また、薄板として樹脂を用いた場合には、貫通孔の加工性が向上し、エッチング法以外にパンチング法等によっても貫通孔の加工が可能となる。
【００２２】
【発明の実施の形態】
以下、本発明を更に詳細に説明する。図１、２には、本発明のマイクロウェルプレートの一実施形態が示されている。図１は本発明のマイクロウェルプレートの一実施形態を示す分解斜視図、図２は図１の基板と薄板の接合後におけるＡ−Ａ’矢示線に沿った断面図である。
【００２３】
図１に示すように、このマイクロウェルプレート１０は、ガラス、シリコンウエハ、金属等からなる基板２０と、ガラス、シリコンウエハ、金属、樹脂等からなる薄板３０とから主に構成されている。以下、マイクロウェルプレート１０の製造工程に沿って順に説明する。
【００２４】
まず、薄板３０へ複数の貫通孔３１を形成する。薄板３０としては特に限定されないが、貫通孔が容易に形成可能であり、また、基板２０と接合する際には２００℃前後まで加熱される場合があるため耐熱性を備えている材料が好ましい。また、試料溶液に対する耐薬品性、耐溶剤性を備えている材料であることが好ましい。
【００２５】
このような薄板３０の材質としては、ガラス、シリコンウエハ、金属、樹脂が好ましく挙げられる。金属としては、特にステンレスが好ましく用いられる。また、樹脂としては、ポリスチレン樹脂、ポリエチレン樹脂、ポリイミド樹脂、アクリル樹脂、ポリウレタン樹脂、ポリテトラフルオロエチレン等のふっ素樹脂等が挙げられる。
【００２６】
上記の薄板３０は、市販のステンレス板や樹脂フィルム等をそのまま用いることができる。なお、薄板３０の厚さは特に限定されないが、１０〜１５０μｍであることが好ましい。
【００２７】
薄板３０に形成する貫通孔３１の形成方法は特に限定されないが、薄板３０が、ガラス、シリコンウエハ、ステンレス等の場合には、湿式エッチング、プラズマエッチング、サンドブラスト等によって形成することができる。
【００２８】
一方、薄板３０が樹脂の場合には、上記のような湿式エッチング等によって形成することも可能であるが、微小径のダイスでパンチングによって形成することが経済的であり好ましい。
【００２９】
貫通孔３１の大きさとしては特に限定されないが、円に換算した場合の直径で、３０〜３００μｍであることが好ましい。なお、貫通孔３１の外径の形状は必ずしも円形でなくてもよく、例えば楕円や角形であってもよい。また、貫通孔３１は、薄板３０の表裏面における径が異なっていてもよく、例えば薄板３０の厚さ方向に沿った断面形状がテーパー状に形成されていてもよい。
【００３０】
貫通孔３１の配置密度としては特に限定されないが、５００〜１００００個／ｃｍ２であることが好ましい。また、隣合う貫通孔３１同士の間隔は５０〜３５０μｍであることが好ましい。
【００３１】
次に、薄板３０の表裏面及び貫通孔３１の内周面に撥水性の被膜４０を形成する。本発明における被膜４０としては、撥水性を有し、かつ、基板２０と加熱によって接合可能であればよく、このような被膜４０としては、ふっ素系樹脂を主として含有する溶液を塗布して形成することが好ましく挙げられる。
【００３２】
ここで、ふっ素系樹脂としては特に限定されず、例えば、ポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）、テトラフルオロエチレン・パーフルオロアルキルビニルエーテル共重合体（ＰＦＡ）、テトラフルオロエチレン・ヘキサフルオロプロピレン共重合体（ＦＥＰ）、テトラフルオロエチレン・エチレン共重合体（ＥＴＦＥ）、ポリビニリデンフルオライド（ＰＶＤＦ）、ポリクロロトリフルオロエチレン（ＰＣＴＦＥ）等の各種ふっ素系樹脂が使用可能であるが、なかでも、ポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）、テトラフルオロエチレン・パーフルオロアルキルビニルエーテル共重合体（ＰＦＡ）、テトラフルオロエチレン・ヘキサフルオロプロピレン共重合体（ＦＥＰ）ポリテトラフルオロエチレン等のパーフルオロ基を有するふっ素系樹脂が好ましい。また、変性等によって結晶化度が調整されていてもよい。
【００３３】
また、ふっ素系樹脂を主として含有する溶液には、上記のふっ素系樹脂以外に、プライマー成分が含有されていることが好ましい。このようなプライマーとしては、シランカップリング剤が例示できる。これにより、シランカップリング剤のシラノール基と、ガラスやシリコン基板表面の水酸基とが結合してシロキサン結合を形成するので、基板と薄板との接合力を向上させることができる。
【００３４】
シランカップリング剤としては、例えば、メトキシ基及びエトキシ基よりなる群から選択される少なくとも１種のアルコキシ基と、アミノ基、ビニル基、アクリル基、メタクリル基、エポキシ基、メルカプト基、ハロゲン原子、イソシアネート基よりなる群から選択される少なくとも一種の反応性官能基を有するシランカップリング剤等が例示でき、特に限定されない。
【００３５】
上記のようなふっ素系樹脂を主として含有する溶液としては、例えば、市販のふっ素樹脂系撥水コーティング剤を用いることができ、旭硝子株式会社製の商品名サイトップ等が例示できる。なお、上記のふっ素系樹脂を主として含有する溶液は、例えば、低沸点ふっ素化合物系の分散溶媒等を用いて希釈することにより粘度を低下させて塗布形成することができる。
【００３６】
上記のふっ素系樹脂を主として含有する溶液を薄板３０の表裏面及び貫通孔３１の内周面に形成する方法としては、例えば、浸漬、スピンコート、ハケ塗り、スポンジ塗布等の、従来公知のコーディング方法が適用可能であり、特に限定されない。
【００３７】
なお、本発明においては、上記のような方法以外にも、例えばふっ素樹脂をターゲットとして、蒸着やスパッタリング等の物理的手法で撥水性の被膜４０を形成することも可能ではあるが、この方法では貫通孔３１の内周面に均一な膜を形成させることが困難であり， かつ薄板３０自体を加熱する必要がある点から、上記のように溶液の状態で被膜４０を形成することが好ましい。
【００３８】
また、本発明においては、あらかじめ、薄板３０の表裏面及び貫通孔３１の内周面が、プライマー処理されていてもよい。これにより、被膜４０と薄板３０との接合力を、更に向上させることができる。プライマーとしてはシランカップリング剤等が例示でき、具体的なシランカップリング剤としては、上記のふっ素系樹脂を主として含有する溶液に用いられるシランカップリング剤と同様の、メトキシ基及びエトキシ基よりなる群から選択される少なくとも１種のアルコキシ基と、アミノ基、ビニル基、アクリル基、メタクリル基、エポキシ基、メルカプト基、ハロゲン原子、イソシアネート基よりなる群から選択される少なくとも一種の反応性官能基を有するシランカップリング剤等が例示でき、特に限定されない。
【００３９】
次に、図１、２に示すように、この基板２０と薄板３０とを密着させ、加熱処理によって被膜４０を硬化させ、これによって基板２０と薄板３０とを接合する。これにより、図２に示すように、薄板３０の貫通孔３１の内周面５２と、基板２０の表面の底面５１とで構成されるウェル５０が形成される。
【００４０】
加熱条件としては、例えば被膜４０がふっ素系樹脂の場合には、８０〜１２０℃で０．５〜１時間の予備加熱後、１５０〜２００℃で１．５〜３時間処理することが好ましい。更に、上記の加熱処理は加圧状態で行なうことが好ましい。加圧条件としては、例えば被膜４０がふっ素系樹脂層の場合には、１０〜５０ｇ／ｃｍ２であることが好ましい。
【００４１】
また、硬化後の被膜４０の厚みとしては、０．１〜３．０μｍであることが好ましい。０．１μｍ未満では、基板と薄板の表面平滑性が厳密に要求されるので好ましくなく、３．０μｍを越えると、膜の均質性が悪化して接合強度が低下しやすくなるので好ましくない。なお、本発明における、被膜４０の厚みとは、熱処理、硬化後の接合状態における膜厚を意味する。
【００４２】
このようにして得られたマイクロウェルプレート１０は、薄板３０の表面及び貫通孔３１の内周面５２においては、水に対する接触角が９５〜１１０度となり、充分な撥水性が得られ、試料溶液のクロスコンタミネーションを有効に防止できる。
【００４３】
また、基板２０と薄板３０とは充分な接合強度を有している。この場合、基板２０と薄板３０との接合強度としては、引っ張り試験による剥離強さで０．３ｋｇ／ｍｍ２以上であることが好ましい。
【００４４】
なお、上記の基板２０と薄板３０との接合時の加熱によって、ウェル５０の底面５１となる、基板２０の表面上には弱い酸化膜が形成される。したがって、底面５１における親水性は接合前に比べてやや低下している。
【００４５】
したがって、本発明においては、更に貫通孔３１によって形成されたマイクロウェル５０の底面５１を親水化処理することが好ましい。これによって、ウェル５０の内周面５２は撥水性を維持しつつ、ウェル５０の底部５１のみをより親水化することができるので、ウェル５０内に供給された液体類をより安定的に保持することができる。
【００４６】
ウェル５０の底部５１を親水化処理する方法としては、アルカリ溶液を充填して洗浄することが好ましく行なわれる。
【００４７】
アルカリ溶液としては、ｐＨが８〜１４の溶液を用いることが好ましい。具体的には、水酸化ナトリウム溶液等や、市販のアルカリ洗浄液が好適に用いられる。
【００４８】
洗浄時間は、溶液のｐＨや基板２０の材質によっても異なるが、撥水性の被膜４０が侵されないように２時間以下であることが好ましい。
【００４９】
上記の親水化処理によって、例えば基板２０がガラス又はシリコンウエハである場合、洗浄時間１時間で、ウェル５０の底部５１の親水性は、水に対する接触角で、洗浄前の２０〜３０度から１０度程度まで低下する。また、基板２０がステンレスの場合には、洗浄前の接触角は５０〜６０度であるが、アルカリ処理によって２０度前後まで低下する。
【００５０】
一方、撥水性の被膜４０はアルカリ処理によって侵されないため、上記のように、薄板３０の表面及び貫通孔３１の内周面５２の接触角は９５〜１１０度であり、充分な撥水性を維持できる。
【００５１】
以上の方法によって製造された、本発明のマイクロウェルプレート１０は、低容量のウェル５０を高密度に容易に配置可能であるとともに、薄板３０の表面とウェル５０の内周面５２には撥水性を付与でき、一方、ウェル５０の底面５１となる基板２０の表面には親水性を付与できる。これにより、ウェル５０に液体類を注入するときのクロスコンタミネ−ションを防止でき、かつ、ウェル５０内で液体類を安定に保持できる。
【００５２】
また、基板２０と薄板３０とを低温で接合できるので、接合に際して静電接合装置のような大型設備が不要であり、マイクロウェルプレートを低コストで大量に生産することができる。更に、接合材として低温で接合可能な被膜を設けたので、基板と薄板の材料選択に自由度があり、例えば薄板３０として樹脂フィルムを用いることができる。
【００５３】
【実施例】
以下、実施例を挙げて、本発明を更に具体的に説明する。
実施例１
以下の工程により、図１、２に示すようなマイクロウェルプレート１０を製造した。
【００５４】
＜薄板への貫通孔の形成＞
薄板３０として、大きさ５５×５５ｍｍ、厚さ２０μｍのステンレス（ＳＵＳ３０４）を用い、王水系のエッチング液を用いて湿式エッチング加工し、この薄板３０に、貫通孔３１同士の間隔が２００μｍとなるように、直径が２００μｍの貫通孔３１を格子状に形成した。
【００５５】
＜薄板への撥水性の被膜の形成＞
ふっ素樹脂を含むコーティング剤（旭硝子株式会社製、商品名：サイトップＣＴＬ−８０９ＭＤ）を、低沸点ふっ素化合物系の分散溶媒（旭硝子株式会社製、商品名：ＣＴ−ＳＯＬＶ１８２０）を用いて１．５質量％となるように希釈した。
【００５６】
この希釈されたコーティング剤中に、上記の薄板３０を４５秒間浸漬した後に引き上げて、薄板３０の表裏面及び貫通孔３１の内周面に、厚さ１．２μｍの撥水性の被膜４０を形成した。
【００５７】
＜薄板と基板との接合＞
基板２０として、大きさ５５×５５ｍｍ、厚さ５００μｍのステンレス（ＳＵＳ３０４）を用い、上記の被膜４０を形成した基板２０と薄板３０を重ね合わせ、５０ｇ／ｃｍ２の重しを載せ、恒温槽で８５℃×２時間のプリベークを行った後、１８５℃×１時間の条件で熱処理し、基板２０と薄板３０とを撥水性の被膜４０を介して接合一体化した。
【００５８】
＜ウェル内の親水化処理＞
形成されたウェル５０内に、ｐＨ１２のアルカリ洗浄液（メルクジャパン株式会社製、商品名：エキストラン）を注入して１時間保持した後、純水とエタノールで洗浄し、更に温風乾燥して、実施例１のマイクロウェルプレート１０を製造した。
【００５９】
上記の実施例１によれば、ウェル５０の容積は６２８ｐｌとなり、その配置密度が６００個／ｃｍ２であるマイクロウェルプレートが得られた。
【００６０】
また、薄板３０上の撥水性を測定したところ、水に対する接触角は１０３度であり、撥水性が充分なレベルであることが確認できた。また、ウェル５０の底面５１におけるステンレス上の、水に対する接触角は１９度であり、充分な親水性が得られていた。更に、各々のウェル５０に水を充填して接合界面のリーク有無を調べたところ、とくに欠陥は認められなかった。
【００６１】
実施例２
基板２０として厚さ５００μｍの硼珪酸ガラスを用い、薄板３０として厚さ１０μｍのステンレス（ＳＵＳ３０４）を用い、貫通孔３１の直径を８０μｍ、貫通孔３１同士の間隔を１００μｍとした以外は実施例１と同様な条件とし、実施例２のマイクロウェルプレート１０を製造した。
【００６２】
その結果、ウェル５０の容積は５０ｐｌとなり、その配置密度が３０００個／ｃｍ２であるマイクロウェルプレートが得られた。
【００６３】
また、ウェル５０の底面５１における硼珪酸ガラス上の、水に対する接触角は８度であり、充分な親水性が得られていた。更に、各々のウェル５０に水を充填して接合界面のリーク有無を調べたところ、とくに欠陥は認められなかった。
【００６４】
実施例３
基板２０として厚さ５５０μｍのシリコンウエハを用い、薄板３０として厚さ５０μｍのポリイミドフィルムを用い、貫通孔３１の直径を１００μｍ、貫通孔３１同士の間隔を２００μｍとしてパンチ打ち抜き法で加工した以外は実施例１と同様な条件とし、実施例３のマイクロウェルプレート１０を製造した。
【００６５】
その結果、ウェル５０の容積は３９０ｐｌとなり、その配置密度が１１００個／ｃｍ２であるマイクロウェルプレートが得られた。
【００６６】
また、薄板３０上の撥水性を測定したところ、水に対する接触角は１１０度であり、撥水性が充分なレベルであることが確認できた。また、ウェル５０の底面５１におけるシリコンウエハ上の、水に対する接触角は１０度であり、充分な親水性が得られていた。更に、各々のウェル５０に水を充填して接合界面のリーク有無を調べたところ、とくに欠陥は認められなかった。
【００６７】
【発明の効果】
以上説明したように、本発明によれば、貫通孔を設けた薄板に撥水性の被膜を形成した後、基板と重ね合わせて加熱によって接合一体化したので、薄板表面とウェルの内周面には撥水性を付与でき、ウェルの底面の基板表面には親水性を付与できる。これにより、ウェルに液体類を注入するときのクロスコンタミネ−ションを防止でき、かつ、ウェル内で液体類を安定に保持できる。また、低容量のウェルを高密度に容易に配置可能であり、マイクロウェルプレートを低コストで形成できる。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明のマイクロウェルプレートの一実施形態を示す分解斜視図である。
【図２】図１の基板と薄板との接合後におけるＡ−Ａ’矢示線に沿った断面図である。
【図３】従来のマイクロウェルプレートの一例を示す斜視図である。
【図４】従来のマイクロウェルプレートの他の例を示す、（ａ）平面図、（ｂ）Ｂ−Ｂ’矢示線に沿った断面図である。
【符号の説明】
１０：マイクロウェルプレート
２０：基板
３０：薄板
３１：貫通孔
４０：被膜
５０：ウェル
５１：底面
５２：内周面[0001]
TECHNICAL FIELD OF THE INVENTION
The present invention provides, for example, the production of a microwell plate having a plurality of reaction fields for simultaneously handling reactions such as synthesis, separation and extraction, analysis, and inspection of chemical substances in the fields of pharmaceuticals, foods, agricultural chemicals, genetic engineering, and the like. About the method.
[0002]
[Prior art]
In the synthesis of chemicals in the fields of pharmaceuticals, foods, agricultural chemicals, genetic engineering, etc., the base chemicals are modified with various other chemicals to synthesize new chemicals, and their effectiveness and safety , Side effects, etc., to judge the feasibility of practical use. The chemical combinations in these processes can be in the hundreds of thousands, and their synthesis requires enormous manpower and time.
[0003]
On the other hand, in the analysis of the base sequence of gene DNA (deoxyribonucleic acid), and the evaluation and inspection in the fields of genetic recombination technology and genetically modified foods, it is necessary to evaluate and test a huge number of combinations as described above in order to perform the same. Again, a lot of people and time are needed.
[0004]
For this reason, in the above fields, we have developed combinatorial chemistry, a technology for synthesizing many types of candidate chemical substances with high accuracy in a short time, and automated synthesis / evaluation systems that enable high-throughput screening, which is a large-scale screening. There is a need to.
[0005]
In such combinatorial chemistry and high-throughput screening, a microwell plate as shown in FIG. 3 has been conventionally used.
[0006]
In the microwell plate 60, a plurality of wells 62 serving as reaction fields (reaction vessels) are arranged in a matrix on a substrate 61. The microwell plate 60 is used, for example, for injecting a sample solution into the well 62. , A control device for moving the dispenser to a predetermined position, and an analysis and inspection device.
[0007]
In such a microwell plate 60, it is required that the number of wells 62 arranged on one plate be increased and the capacity of each well 62 be reduced. Further, in order to prevent cross contamination in the adjacent wells 62, water repellency at boundaries between the wells 62 is also required.
[0008]
As a conventional technique of such a microwell plate, for example, Koide et al. Disposes 96 depressions on a substrate of 86 mm × 128 mm, and has a depression having a diameter of about 10 mm and a depth of about 3 mm. (See Non-Patent Document 1).
[0009]
Further, Lemmo et al. Used a polypropylene as a material, fabricated a microwell plate having a large number of wells by molding, and arranged 48 × 48 wells on a 5 inch × 11 inch (127 mm × 280 mm) substrate. (See Non-Patent Document 2).
[0010]
Further, JP-A-11-99000 discloses a reaction field array 70 as shown in FIG. The reaction field array 70 is composed of a concave portion 73 in which a surface 74 having an affinity for a liquid medium on the substrate 71 is separated from each other by a convex portion 72 and the bottom surface of the substrate 74 is partially exposed. A matrix pattern having a predetermined arrangement of reaction fields and having a surface of the convex portion 72 that is incompatible with the liquid medium is provided.
[0011]
[Non-patent document 1]
Koide, Miyake, et al .: Transactions of the Institute of Electrical Engineers of Japan, Vol. 121, No. 9, 2001 [Non-Patent Document 2]
Lemmo, et al .: Anal. Chem. , 69, 543-551, 1997.
[Patent Document 1]
JP-A-11-99000
[Problems to be solved by the invention]
Among the above-mentioned conventional techniques, the microwell plate of Koide et al. And Lemmo et al. Has a problem that the size of the substrate and the well is large, and the density and capacity of the well are insufficient.
[0013]
Further, in the microwell plate of Lemmo et al., Since the material is polypropylene, the entire microwell plate becomes water-repellent, so that the aqueous solution can be easily flipped when the aqueous solution is supplied to the minute well, and the sample solution is stored in the well. There was a problem that it could not be held stably.
[0014]
On the other hand, in the reaction field array disclosed in JP-A-11-99000, it is possible to increase the density and the capacity of the well. However, since the photolithography method is used to form the convex matrix pattern, expensive equipment is required for processing, and the manufacturing process is complicated. Further, a material having incompatibility was selected for the convex portion 72, but the water repellency was insufficient.
[0015]
The present invention has been made in view of the above problems, and a microwell plate having a small volume of wells arranged at a high density and having sufficient water repellency between adjacent wells can be produced with high efficiency and low cost. An object of the present invention is to provide a method for manufacturing a microwell plate.
[0016]
[Means for Solving the Problems]
In order to solve the above problems, a method of manufacturing a microwell plate according to the present invention is directed to a method of manufacturing a microwell plate in which a plurality of microwells are formed on a substrate, wherein the thin plate formed so as to overlap the substrate is provided. After forming a water-repellent coating that can be heated and adhered to the substrate on the front and back surfaces of the thin plate and on the inner peripheral surface of the through hole, the thin plate is placed on the substrate. Then, the thin plate is bonded to the substrate surface via the coating by heating.
[0017]
According to the manufacturing method of the present invention, after forming a plurality of through holes in a thin plate, the thin plate and the substrate are joined and integrated by heating using a water-repellent coating as a joining material, so that a small-capacity well can be formed at a high density. It can be arranged, and can be produced with high efficiency and low cost. In addition, since a water-repellent coating is used as a bonding material, there is a high degree of freedom in selecting a material for a thin plate and a substrate.
[0018]
Furthermore, since there is sufficient water repellency between adjacent wells, cross-contamination, adhesion of dirt, foreign matter, and contamination can be prevented, while the surface of the substrate forming the bottom of the well becomes hydrophilic. It is possible to stably hold the liquids supplied to the inside.
[0019]
In the method of the present invention, it is preferable that the water-repellent coating is formed by applying a solution mainly containing a fluororesin. According to this, sufficient water repellency can be imparted to the surface of the thin plate and the inner peripheral surface of the through hole. In addition, since the fluororesin is excellent in chemical resistance and stable, it can effectively prevent a chemical reaction with the sample solution, contamination, and the like.
[0020]
Further, in the method of the present invention, it is preferable that after bonding the substrate and the thin plate, the bottom surface of the microwell formed by the through hole is subjected to a hydrophilic treatment. According to this, since the well side surface can maintain the water repellency and make the bottom of the well more hydrophilic, the liquids supplied into the well can be held more stably.
[0021]
Further, in the present invention, it is preferable that the substrate is one type selected from glass, a silicon wafer, and a metal, and the thin plate is one type selected from a glass, a silicon wafer, a metal, and a resin. According to this, glass, silicon wafers, and metals are inorganic and stable, and have excellent adhesion to a water-repellent coating, and thus can be suitably used particularly for the microwell plate of the present invention. Further, when resin is used as the thin plate, the processability of the through hole is improved, and the through hole can be processed by a punching method or the like other than the etching method.
[0022]
BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION
Hereinafter, the present invention will be described in more detail. 1 and 2 show an embodiment of the microwell plate of the present invention. FIG. 1 is an exploded perspective view showing one embodiment of the microwell plate of the present invention, and FIG. 2 is a cross-sectional view taken along the line AA ′ after the bonding of the substrate and the thin plate of FIG.
[0023]
As shown in FIG. 1, the microwell plate 10 mainly includes a substrate 20 made of glass, silicon wafer, metal, or the like, and a thin plate 30 made of glass, silicon wafer, metal, resin, or the like. Hereinafter, description will be made sequentially along the manufacturing process of the microwell plate 10.
[0024]
First, a plurality of through holes 31 are formed in the thin plate 30. The thin plate 30 is not particularly limited, but a material having heat resistance is preferable because a through hole can be easily formed, and when the thin plate 30 is bonded to the substrate 20, it may be heated up to about 200 ° C. Further, it is preferable that the material has chemical resistance and solvent resistance to the sample solution.
[0025]
Preferred examples of the material of the thin plate 30 include glass, silicon wafer, metal, and resin. Stainless steel is particularly preferably used as the metal. Examples of the resin include a polystyrene resin, a polyethylene resin, a polyimide resin, an acrylic resin, a polyurethane resin, and a fluororesin such as polytetrafluoroethylene.
[0026]
As the thin plate 30, a commercially available stainless steel plate, resin film, or the like can be used as it is. The thickness of the thin plate 30 is not particularly limited, but is preferably 10 to 150 μm.
[0027]
The method of forming the through-holes 31 formed in the thin plate 30 is not particularly limited. However, when the thin plate 30 is made of glass, silicon wafer, stainless steel, or the like, it can be formed by wet etching, plasma etching, sandblasting, or the like.
[0028]
On the other hand, when the thin plate 30 is made of resin, it can be formed by wet etching as described above, but it is economically preferable to form the thin plate 30 by punching with a small-diameter die.
[0029]
The size of the through-hole 31 is not particularly limited, but is preferably 30 to 300 μm in terms of a diameter converted into a circle. The shape of the outer diameter of the through hole 31 is not necessarily circular, but may be, for example, elliptical or square. Further, the diameter of the through hole 31 on the front and back surfaces of the thin plate 30 may be different, and for example, the cross-sectional shape along the thickness direction of the thin plate 30 may be formed in a tapered shape.
[0030]
The arrangement density of the through holes 31 is not particularly limited, but is preferably 500 to 10000 / cm 2 . Further, the interval between the adjacent through holes 31 is preferably 50 to 350 μm.
[0031]
Next, a water-repellent coating 40 is formed on the front and back surfaces of the thin plate 30 and the inner peripheral surface of the through hole 31. The coating 40 in the present invention only needs to have water repellency and be bondable to the substrate 20 by heating. Such a coating 40 is formed by applying a solution mainly containing a fluororesin. Is preferably mentioned.
[0032]
Here, the fluororesin is not particularly limited, and for example, polytetrafluoroethylene (PTFE), tetrafluoroethylene / perfluoroalkylvinylether copolymer (PFA), tetrafluoroethylene / hexafluoropropylene copolymer (FEP) ), Various fluororesins such as tetrafluoroethylene / ethylene copolymer (ETFE), polyvinylidene fluoride (PVDF) and polychlorotrifluoroethylene (PCTFE), among which polytetrafluoroethylene (PTFE), tetrafluoroethylene / perfluoroalkyl vinyl ether copolymer (PFA), tetrafluoroethylene / hexafluoropropylene copolymer (FEP), etc. System resins are preferable. The degree of crystallinity may be adjusted by modification or the like.
[0033]
Further, it is preferable that the solution mainly containing the fluororesin contains a primer component in addition to the above-mentioned fluororesin. Examples of such a primer include a silane coupling agent. Thereby, since the silanol group of the silane coupling agent and the hydroxyl group on the surface of the glass or silicon substrate are bonded to form a siloxane bond, the bonding strength between the substrate and the thin plate can be improved.
[0034]
Examples of the silane coupling agent include, for example, at least one alkoxy group selected from the group consisting of a methoxy group and an ethoxy group, and an amino group, a vinyl group, an acryl group, a methacryl group, an epoxy group, a mercapto group, a halogen atom, Examples include, but are not particularly limited to, silane coupling agents having at least one type of reactive functional group selected from the group consisting of isocyanate groups.
[0035]
As the solution mainly containing the above-mentioned fluororesin, for example, a commercially available fluororesin-based water-repellent coating agent can be used, and examples thereof include Cytop (trade name, manufactured by Asahi Glass Co., Ltd.). The solution mainly containing the above-mentioned fluororesin can be formed by diluting, for example, with a low-boiling-point fluorocompound-based dispersing solvent or the like to lower the viscosity, thereby forming a coating.
[0036]
As a method of forming a solution mainly containing the above-mentioned fluororesin on the front and back surfaces of the thin plate 30 and the inner peripheral surface of the through-hole 31, for example, a conventionally known coding method such as dipping, spin coating, brush coating, or sponge coating is used. The method is applicable and is not particularly limited.
[0037]
Note that, in the present invention, in addition to the above-described method, for example, it is possible to form the water-repellent coating 40 by a physical method such as evaporation or sputtering using a fluororesin as a target. Since it is difficult to form a uniform film on the inner peripheral surface of the through hole 31 and it is necessary to heat the thin plate 30 itself, it is preferable to form the coating 40 in a solution state as described above.
[0038]
Further, in the present invention, the front and back surfaces of the thin plate 30 and the inner peripheral surface of the through hole 31 may be subjected to a primer treatment in advance. Thereby, the bonding force between the coating 40 and the thin plate 30 can be further improved. Examples of the primer include a silane coupling agent and the like. Specific examples of the silane coupling agent include a methoxy group and an ethoxy group, similar to the silane coupling agent used in the solution mainly containing the above-described fluororesin. At least one alkoxy group selected from the group and at least one reactive functional group selected from the group consisting of an amino group, a vinyl group, an acryl group, a methacryl group, an epoxy group, a mercapto group, a halogen atom, and an isocyanate group And the like, and are not particularly limited.
[0039]
Next, as shown in FIGS. 1 and 2, the substrate 20 and the thin plate 30 are brought into close contact with each other, and the coating 40 is cured by a heat treatment, thereby joining the substrate 20 and the thin plate 30. As a result, as shown in FIG. 2, a well 50 formed by the inner peripheral surface 52 of the through hole 31 of the thin plate 30 and the bottom surface 51 of the surface of the substrate 20 is formed.
[0040]
As the heating conditions, for example, when the coating 40 is a fluororesin, it is preferable to perform preheating at 80 to 120 ° C. for 0.5 to 1 hour and then perform treatment at 150 to 200 ° C. for 1.5 to 3 hours. Further, the above heat treatment is preferably performed in a pressurized state. The pressure condition is preferably, for example, 10 to 50 g / cm 2 when the coating 40 is a fluororesin layer.
[0041]
The thickness of the cured coating 40 is preferably 0.1 to 3.0 μm. When the thickness is less than 0.1 μm, the surface smoothness of the substrate and the thin plate is strictly required. Thus, when it exceeds 3.0 μm, the uniformity of the film is deteriorated, and the bonding strength is liable to decrease. In the present invention, the thickness of the coating 40 means the thickness in a bonded state after heat treatment and curing.
[0042]
The microwell plate 10 thus obtained has a contact angle with water of 95 to 110 degrees on the surface of the thin plate 30 and the inner peripheral surface 52 of the through-hole 31, thereby obtaining sufficient water repellency, and Cross contamination can be effectively prevented.
[0043]
The substrate 20 and the thin plate 30 have sufficient bonding strength. In this case, the bonding strength between the substrate 20 and the thin plate 30 is preferably 0.3 kg / mm 2 or more as a peel strength by a tensile test.
[0044]
It should be noted that a weak oxide film is formed on the surface of the substrate 20, which becomes the bottom surface 51 of the well 50, by the heating during the bonding between the substrate 20 and the thin plate 30. Therefore, the hydrophilicity at the bottom surface 51 is slightly lower than before the bonding.
[0045]
Therefore, in the present invention, it is preferable that the bottom surface 51 of the microwell 50 formed by the through hole 31 is subjected to a hydrophilic treatment. Accordingly, only the bottom portion 51 of the well 50 can be made more hydrophilic while the inner peripheral surface 52 of the well 50 maintains water repellency, so that the liquids supplied into the well 50 are more stably held. be able to.
[0046]
As a method of hydrophilizing the bottom portion 51 of the well 50, it is preferable to wash it by filling it with an alkaline solution.
[0047]
It is preferable to use a solution having a pH of 8 to 14 as the alkaline solution. Specifically, a sodium hydroxide solution or the like, or a commercially available alkaline cleaning liquid is suitably used.
[0048]
The cleaning time varies depending on the pH of the solution and the material of the substrate 20, but is preferably 2 hours or less so that the water-repellent coating 40 is not affected.
[0049]
By the above-mentioned hydrophilic treatment, for example, when the substrate 20 is a glass or silicon wafer, the hydrophilicity of the bottom portion 51 of the well 50 is changed from 20 to 30 degrees before cleaning by a contact angle with water in one hour after cleaning. Temperature. When the substrate 20 is made of stainless steel, the contact angle before cleaning is 50 to 60 degrees, but is reduced to around 20 degrees by the alkali treatment.
[0050]
On the other hand, since the water-repellent film 40 is not attacked by the alkali treatment, the contact angle between the surface of the thin plate 30 and the inner peripheral surface 52 of the through hole 31 is 95 to 110 degrees as described above, and sufficient water repellency is maintained. it can.
[0051]
The microwell plate 10 of the present invention manufactured by the above-described method allows the low-volume wells 50 to be easily arranged at high density, and the surface of the thin plate 30 and the inner peripheral surface 52 of the well 50 have water repellency. On the other hand, hydrophilicity can be imparted to the surface of the substrate 20, which is the bottom surface 51 of the well 50. Thereby, cross contamination when liquids are injected into the well 50 can be prevented, and the liquids can be stably held in the well 50.
[0052]
Further, since the substrate 20 and the thin plate 30 can be joined at a low temperature, large equipment such as an electrostatic joining device is not required at the time of joining, and micro-well plates can be mass-produced at low cost. Further, since a coating that can be bonded at a low temperature is provided as a bonding material, there is a degree of freedom in selecting materials for the substrate and the thin plate. For example, a resin film can be used as the thin plate 30.
[0053]
【Example】
Hereinafter, the present invention will be described more specifically with reference to examples.
Example 1
A microwell plate 10 as shown in FIGS. 1 and 2 was manufactured by the following steps.
[0054]
<Formation of through hole in thin plate>
The thin plate 30 is made of stainless steel (SUS304) having a size of 55 × 55 mm and a thickness of 20 μm, and is wet-etched with an aqua regia-based etchant so that the distance between the through holes 31 in the thin plate 30 is 200 μm. Then, through holes 31 having a diameter of 200 μm were formed in a lattice shape.
[0055]
<Formation of water-repellent coating on thin plate>
A coating agent containing a fluororesin (trade name: CYTOP CTL-809MD, manufactured by Asahi Glass Co., Ltd.) is mixed with a low-boiling fluorine compound-based dispersion solvent (trade name: CT-SOLV1820, manufactured by Asahi Glass Co., Ltd.) for 1.5 hours. It diluted so that it might become the mass%.
[0056]
The thin plate 30 is immersed in the diluted coating agent for 45 seconds and then pulled up to form a 1.2 μm-thick water-repellent coating 40 on the front and back surfaces of the thin plate 30 and the inner peripheral surface of the through hole 31. did.
[0057]
<Joint of thin plate and substrate>
As the substrate 20, stainless steel (SUS304) having a size of 55 × 55 mm and a thickness of 500 μm is used. The substrate 20 on which the coating 40 is formed and the thin plate 30 are overlapped, and a weight of 50 g / cm 2 is placed thereon. After pre-baking at 85 ° C. × 2 hours, heat treatment was performed at 185 ° C. × 1 hour, and the substrate 20 and the thin plate 30 were joined and integrated via the water-repellent coating 40.
[0058]
<Hydrophilic treatment in well>
An alkaline cleaning solution having a pH of 12 (manufactured by Merck Japan Co., Ltd., trade name: Extran) was injected into the formed well 50 and held for 1 hour, followed by washing with pure water and ethanol, and further drying with warm air. The microwell plate 10 of Example 1 was manufactured.
[0059]
According to Example 1 described above, the volume of the well 50 was 628 pl, and a microwell plate having an arrangement density of 600 cells / cm 2 was obtained.
[0060]
Further, when the water repellency on the thin plate 30 was measured, the contact angle with water was 103 degrees, and it was confirmed that the water repellency was at a sufficient level. In addition, the contact angle of water on the stainless steel at the bottom surface 51 of the well 50 was 19 degrees, and sufficient hydrophilicity was obtained. Furthermore, when each well 50 was filled with water and the presence or absence of leakage at the bonding interface was examined, no defect was found.
[0061]
Example 2
Example 1 Example 1 except that borosilicate glass having a thickness of 500 μm was used as the substrate 20, stainless steel (SUS304) having a thickness of 10 μm was used as the thin plate 30, the diameter of the through holes 31 was 80 μm, and the distance between the through holes 31 was 100 μm. Under the same conditions as described above, the microwell plate 10 of Example 2 was manufactured.
[0062]
As a result, the volume of the well 50 became 50 pl, and a microwell plate having an arrangement density of 3000 cells / cm 2 was obtained.
[0063]
The contact angle with water on the borosilicate glass on the bottom surface 51 of the well 50 was 8 degrees, and sufficient hydrophilicity was obtained. Furthermore, when each well 50 was filled with water and the presence or absence of leakage at the bonding interface was examined, no defect was found.
[0064]
Example 3
A silicon wafer having a thickness of 550 μm was used as the substrate 20, a polyimide film having a thickness of 50 μm was used as the thin plate 30, the diameter of the through holes 31 was 100 μm, and the interval between the through holes 31 was 200 μm. Under the same conditions as in Example 1, the microwell plate 10 of Example 3 was manufactured.
[0065]
As a result, the volume of the well 50 was 390 pl, and a microwell plate having an arrangement density of 1100 cells / cm 2 was obtained.
[0066]
Further, when the water repellency on the thin plate 30 was measured, the contact angle with water was 110 degrees, confirming that the water repellency was at a sufficient level. In addition, the contact angle of the bottom surface 51 of the well 50 with water on the silicon wafer was 10 degrees, and sufficient hydrophilicity was obtained. Furthermore, when each well 50 was filled with water and the presence or absence of leakage at the bonding interface was examined, no defect was found.
[0067]
【The invention's effect】
As described above, according to the present invention, after forming a water-repellent coating on a thin plate provided with a through-hole, it is superposed on the substrate and joined by heating, so that the thin plate surface and the inner peripheral surface of the well are formed. Can impart water repellency, and can impart hydrophilicity to the substrate surface at the bottom of the well. As a result, it is possible to prevent cross-contamination when injecting liquids into the well, and to stably hold liquids in the well. Further, low-capacity wells can be easily arranged at high density, and a microwell plate can be formed at low cost.
[Brief description of the drawings]
FIG. 1 is an exploded perspective view showing one embodiment of a microwell plate of the present invention.
FIG. 2 is a cross-sectional view taken along the line AA ′ after bonding the substrate and the thin plate of FIG. 1;
FIG. 3 is a perspective view showing an example of a conventional microwell plate.
4A is a plan view showing another example of a conventional microwell plate, and FIG. 4B is a cross-sectional view taken along the line BB 'of FIG.
[Explanation of symbols]
10: microwell plate 20: substrate 30: thin plate 31: through hole 40: coating 50: well 51: bottom surface 52: inner peripheral surface
