JP2004205435A - 標識色素を不要とする結合性分析対象物質の分析方法ならびにそれに用いる分析キット - Google Patents
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Abstract
【課題】色素等の標識を用いずに、分析対象物質の分子間相互作用の解析を水溶液中において行うこと、複数の分析対象物質の検出を特異的かつ定量的に行うことを目的とする。
【解決手段】分析対象物質と量論関係をなすラマン活性物質に、群をなしている貴金属コロイドからなる表面増強ラマン散乱の基質を共存させて、その増強電場による表面増強ラマン散乱を測定して行う。
【選択図】 図１
【解決手段】分析対象物質と量論関係をなすラマン活性物質に、群をなしている貴金属コロイドからなる表面増強ラマン散乱の基質を共存させて、その増強電場による表面増強ラマン散乱を測定して行う。
【選択図】 図１
Description
【０００１】
【発明が属する技術分野】
本発明は、分子間相互作用解析、マイクロチップテクノロジーなど、生体成分の定性と定量の分析を必要とするライフサイエンス分野に関する。
【０００２】
【従来の技術】
生体分子の分子間相互作用解析には、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）、ＱＣＭが主として用いられている。また生体分子および相補的に結合する分子を異なる蛍光色素で標識して行うＦＲＥＴが利用されている。
【０００３】
ＤＮＡマイクロアレイなどマイクロチップテクノロジーには、生体分子ないしは相補的に結合する分子を蛍光色素または金ナノ粒子で標識し、色素の蛍光や、金ナノ粒子の表面プラズモン共鳴による吸光度や共鳴レイリー散乱を測定する検出方法が利用されている。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
ＳＰＲ、ＱＣＭは、金を蒸着したプリズムや水晶振動子という固相上に、相補的に結合する分子を固定化する必要があり、その固定化収率と固定化分子の安定性が問題になっていた。また生体分子の分子間相互作用は生体中と同じ水溶液中で解析されるのが本来であるが、固相上に固定した分子との分子間相互作用に制限されていた。
【０００５】
一方、ＦＲＥＴや蛍光色素、金ナノ粒子標識による光検出方法では、リンカー分子の設計、標識反応、未標識分子の分離など、繁雑な標識操作を必要としていた。
【０００６】
しかも、これらの光検出方法では、検出に利用される波長領域がせいぜい可視領域であるため、試料中のきょう雑物の影響を抑制するには十分とは言えなかった。具体的には、分析対象物質を含む試料は通常、細胞や体液であるため、６５０ｎｍよりも短波長には吸収や蛍光を示す生体中のきょう雑物を含むことがあり、そのため正確な測定ができないことがあった。
【０００７】
きょう雑物の干渉が少ない近赤外領域で利用可能な蛍光色素は数少ないうえに、それらの色素は化学的に不安定であった。分子設計と合成も困難であった。
【０００８】
金ナノ粒子は化学的に安定であるが、一定の波長において吸収ないしはレイリー散乱を有するためには、金ナノ粒子の粒子径と形状を揃える必要がある。そのような金ナノ粒子の合成には多大な労力を必要とした。
【０００９】
またＤＮＡマイクロアレイでは、異なる波長の色素を用いるマルチカラーラベルの利用が求められているが、上述の色素、金ナノ粒子による蛍光ピーク、吸収ピークの半値幅は数十ｎｍとブロードであり、複数の標識が光学的に干渉する問題があった。
【００１０】
さらに標識によるコンタミネーションや非特異吸着が生じやすく、高いＳ／Ｎ比で検出することは難しかった。
【００１１】
【課題を解決するための手段】
本発明は、上記課題に鑑みてなされたものであって、色素等の標識を用いずに、分析対象物質の分子間相互作用の解析を水溶液中において行うこと、複数の分析対象物質の検出を特異的かつ定量的に行うことを目的としている。
【００１２】
上記目的を達成するために本発明の分析方法は、分析対象物質と量論関係をなすラマン活性物質に、群をなしている貴金属コロイドからなる表面増強ラマン散乱の基質を共存させて、その増強電場による表面増強ラマン散乱を測定して行う。これにより、ラマン活性物質の波長特異的な表面増強ラマン散乱を測定するので、標識を特に用いずに、分析対象物質を特異的かつ定量的に行うことができる。
【００１３】
本発明では近赤外領域のレーザーを光源にすることができ、励起光、ラマン散乱光ともに近赤外光であるため、容易に試料中のきょう雑物の影響が少ない近赤外光での光分析となる。ラマン散乱では、ラマン活性分子の構造に特異的であるので、特異的な検出が可能となる。さらにラマン散乱は蛍光や吸収に比べ著しく波長分解能が高く、異なる構造の複数の分子を容易に識別できる。
【００１４】
【発明の実施の形態】
この発明は、分析対象物質と、分析対象物質結合性分子と、分析対象物質と競合して該分析対象物質結合性分子と結合する、少なくとも一つ以上のラマン活性分子と、表面増強ラマン散乱の基質からなる系であって、該ラマン活性分子の該分析対象物質結合性分子に対する結合力が該分析対象物質よりも弱いことを特徴とする系において、該分析対象物質結合性分子と該ラマン活性分子が結合した複合体に分析対象物質を加え、分析対象物質の置換によって該ラマン活性分子を遊離せしめ、次いで表面増強ラマン散乱の基質で捕捉し、この状態で励起光を照射し、発生する該ラマン活性分子の表面増強ラマン散乱光を測定することによって行うものである。これによって分析対象物質と分析対象物質結合性分子の分子間相互作用の解析と、分析対象物質の特異的、定量的測定が達成される。
【００１５】
またこの発明は、分析対象物質と、分析対象物質結合性分子と、分析対象物質結合性分子と競合して分析対象物質と結合する、少なくとも一つ以上のラマン活性分子と、表面増強ラマン散乱の基質からなる系であって、該ラマン活性分子の該分析対象物質に対する結合力が該分析対象物質結合性分子よりも弱いことを特徴とする系において、該分析対象物質と該ラマン活性分子が結合した複合体に分析対象物質結合性分子を加え、分析対象物質結合性分子の置換によって該ラマン活性分子を遊離せしめ、次いで表面増強ラマン散乱の基質で捕捉し、この状態で励起光を照射し、発生する該ラマン活性分子の表面増強ラマン散乱光を測定することによって行うものである。これによって分析対象物質と分析対象物質結合性分子の分子間相互作用の解析と、分析対象物質の特異的、定量的測定が達成される。
【００１６】
またこの発明は、分析対象物質と、分析対象物質結合性分子と、分析対象物質と競合して該分析対象物質結合性分子と結合する、少なくとも一つ以上のラマン活性分子と、表面増強ラマン散乱の基質からなる系であって、該ラマン活性分子の該分析対象物質結合性分子に対する結合力が該分析対象物質よりも強いことを特徴とする系において、分析対象物質と該分析対象物質結合性分子が結合した複合体に該ラマン活性分子を加え、分析対象物質の置換によって該ラマン活性分子を結合せしめ、この状態で励起光を照射し、分析対象物質が存在しないときに発生する該ラマン活性分子の表面増強ラマン散乱光との差分を測定することによって行うものである。これによって分析対象物質と分析対象物質結合性分子の分子間相互作用の解析と、分析対象物質の特異的、定量的測定が達成される。
【００１７】
またこの発明は、分析対象物質と、分析対象物質結合性分子と、該分析対象物質と該分析対象物質結合性分子が結合した複合体に結合する、少なくとも一つ以上のラマン活性分子と、表面増強ラマン散乱の基質からなる系であって、分析対象物質と分析対象物質結合性分子が結合した該複合体に該ラマン活性分子を結合せしめ、この状態で励起光を照射し、分析対象物質が存在しないときに発生する該ラマン活性分子の表面増強ラマン散乱光との差分を測定することによって行うものである。これによって分析対象物質と分析対象物質結合性分子の分子間相互作用の解析と、分析対象物質の特異的、定量的測定が達成される。
【００１８】
分析対象物質は、オリゴヌクレオチド、酵素、抗体からなる群から選ぶことができるが、これに限定されるものではない。分析対象物質結合性分子は、分析対象物質と、相補的あるいは特異的に結合する分子を選ぶことができる。ラマン活性分子の少なくとも一部にオリゴヌクレオチド、ペプチドを含むことができる。ラマン活性分子は、窒素を含む複素環化合物をその分子の一部に含むことが特に好ましい。
【００１９】
このような分析対象物質、分析対象物質物質結合性分子、ラマン活性分子の組み合わせの例は、特に限定されないが、互いに相補的なオリゴヌクレオチドと、末端にアデニンを有するプライマーの例があげられる。
【００２０】
表面増強ラマン散乱の基質には、粗さを持った電極の金属面、金属微粒子のコロイド、金属微粒子を島状に沈積させたフィルム、ゾルゲル法でガラスマトリックスに包括された金属微粒子、ポリマー中に包括された金属微粒子が今まで報告されている。これらの基質のうち、水溶液中での貴金属ナノ粒子のコロイドが実用上もっとも便利であるとされる。その理由として、１）微粒子が液相法で合成でき、取扱いが簡便である。２）連続流れ分析系への適用ができる。３）粒子サイズと形状の制御が可能である。４）簡単に表面積を定義できる。５）理論的解析のために形態を変えられる。等の利点が指摘されている。
【００２１】
貴金属コロイドは、塩等の添加により凝集し、水中で群をなした状態が好ましく用いられる。
【００２２】
しかし、通常、水溶液中では凝集した貴金属コロイドの状態は不安定である。
【００２３】
本発明では、表面増強ラマン散乱の基質を構成する、群をなしている貴金属コロイドは、分散性微粒子によって保持されているものとすることが望ましい。これにより、群をなしている貴金属コロイドの安定性を向上させることができ、表面増強ラマン散乱を簡便に利用することができる（ＰＣＴ／ＪＰ０１／０１８５４）。ここで、分散性微粒子には合成スメクタイトなどの膨潤性層状ケイ酸塩を用いることができる。
【００２４】
このような膨潤性層状ケイ酸塩はいくつか市販されており、たとえば商品名ルーセンタイトＳＷＮもしくはルーセンタイトＳＷＦ（合成ヘクトライト）またはＭＥ（フッ素雲母）、商品名スメクトンＳＡ（合成サポナイト）もしくは商品名クニピアＦ（精製モンモリロナイト）、商品名チキソピーＷ（合成ヘクトライト）、商品名ラポナイトＸＬＧもしくはラポナイトＲＤもしくはラポナイトＸＬＳ（合成ヘクトライト）、商品名マルチゲル（ベントナイト）、膨潤性合成フッ素雲母等が挙げられる。
【００２５】
本発明では、水中で群をなす貴金属コロイドの増強電場によって、分子間相互作用と量論関係にあるラマン活性物質の表面増強ラマン散乱を特異的に測定するので、溶液中において分子間相互作用を解析することができる。
【００２６】
本発明は、また、近赤外領域でラマン分光法による高感度分析を可能とした点に大きな特徴がある。近赤外領域においてラマン分光法によって分析することにより、分析対象物が含有されるマトリックス中のきょう雑物の影響を排除して、分析対象物の検出において特異性・選択性を向上させることが可能となるという、極めて実用的価値のある効果が得られる。
【００２７】
これらのラマン活性分子および分析対象物質結合性分子は、表面増強ラマン散乱の基質と共に有用な分析キットを構成する。
【００２８】
【実施例】
以下に実施例を挙げて本発明を具体的に説明する。
【実施例１】
図１は、本発明の実施の一形態を示す模式図である。
【００２９】
【図１】
【００３０】
上記の図において、分析対象物質Ａと、分析対象物質結合性分子Bと、分析対象物質と競合して該分析対象物質結合性分子と結合する、少なくとも一つ以上のラマン活性分子Ｃと、表面増強ラマン散乱の基質Ｄからなる系であって、該ラマン活性分子Ｃの該分析対象物質結合性分子Ｂに対する結合力が該分析対象物質Ａよりも弱いことを特徴とする系において、該分析対象物質結合性分子Ｂと該ラマン活性分子Ｃが結合した複合体ＢＣに分析対象物質Ａを加え、分析対象物質Ａの置換によって該ラマン活性分子Ｃを遊離せしめ、次いで表面増強ラマン散乱の基質Ｄで捕捉し、この状態で励起光を照射し、発生する該ラマン活性分子Ｃの表面増強ラマン散乱光を測定する。
【００３１】
【実施例２】
スメクタイトによって保持された、群をなしている貴金属コロイドの増強電場による、アデニン水溶液の特異的な表面増強ラマン散乱スペクトルを図２に示す。図２のａ、ｂ、ｃ、ｄのアデニン濃度はそれぞれ６２．５μＭ、２０μＭ、６．２５μＭ、０μＭである。ラマン分光機には、サーモニコレー社のＦＴ−ラマンＭａｇｎａを用い、１０６４nmの近赤外レーザーを照射し１２８回積算した。７３５ｃｍ−１における検量線を図３に示す。図３のａは表面増強ラマン散乱であり、ｂは通常のラマン散乱である。近赤外光によってアデニンを定量できた。
【００３２】
【実施例３】
図１の模式図において、分析対象物質をオリゴアデニン（１０塩基対）、分析対象物質結合性分子をオリゴチミン（２０塩基対）、ラマン活性分子をアデニンとして、オリゴアデニン（２０塩基対）を測定した。図３のａは、オリゴチミン（２０塩基対）１μＭとアデニン２０μＭの混合液の表面増強ラマンスペクトルである。図３のｂは、オリゴチミン（２０塩基対）１μＭとアデニン２０μＭの混合液に、さらにオリゴアデニン（１０塩基対）１μＭを加えた混合液の表面増強ラマンスペクトルである。図３のＣはオリゴチミン（２０塩基対）５μＭの表面増強ラマンスペクトルである。アデニンはオリゴチミンと結合すると表面増強ラマン強度が弱まること、オリゴチミンの表面増強ラマンはほとんど現れないことがわかった。オリゴチミンとアデニンの複合体に、オリゴアデニンを加えると、アデニンが遊離し、アデニンの表面増強ラマン強度が増大していた。したがって、本発明の方法により、オリゴアデニンの分析と、オリゴアデニンとオリゴチミンの分子間相互作用解析が可能であることが示唆された。
【００３３】
【発明の効果】
本発明によれば、色素等の標識を用いずに、分析対象物質の分子間相互作用の解析を水溶液中において行うこと、および複数の分析対象物質の検出を特異的かつ定量的に行うことができる。また近赤外光による測定を容易に利用できる。
【図面の簡単な説明】
【図１】発明の実施の一形態の模式図を示す。
【図２】アデニンの表面増強ラマン散乱を示す
【図３】アデニンの検量線を示す。
【図４】分析対象物質がオリゴアデニン、分析対象物質結合性分子がオリゴチミン、ラマン活性分子がアデニンであるときのオリゴアデニンの応答を示す。
【発明が属する技術分野】
本発明は、分子間相互作用解析、マイクロチップテクノロジーなど、生体成分の定性と定量の分析を必要とするライフサイエンス分野に関する。
【０００２】
【従来の技術】
生体分子の分子間相互作用解析には、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）、ＱＣＭが主として用いられている。また生体分子および相補的に結合する分子を異なる蛍光色素で標識して行うＦＲＥＴが利用されている。
【０００３】
ＤＮＡマイクロアレイなどマイクロチップテクノロジーには、生体分子ないしは相補的に結合する分子を蛍光色素または金ナノ粒子で標識し、色素の蛍光や、金ナノ粒子の表面プラズモン共鳴による吸光度や共鳴レイリー散乱を測定する検出方法が利用されている。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
ＳＰＲ、ＱＣＭは、金を蒸着したプリズムや水晶振動子という固相上に、相補的に結合する分子を固定化する必要があり、その固定化収率と固定化分子の安定性が問題になっていた。また生体分子の分子間相互作用は生体中と同じ水溶液中で解析されるのが本来であるが、固相上に固定した分子との分子間相互作用に制限されていた。
【０００５】
一方、ＦＲＥＴや蛍光色素、金ナノ粒子標識による光検出方法では、リンカー分子の設計、標識反応、未標識分子の分離など、繁雑な標識操作を必要としていた。
【０００６】
しかも、これらの光検出方法では、検出に利用される波長領域がせいぜい可視領域であるため、試料中のきょう雑物の影響を抑制するには十分とは言えなかった。具体的には、分析対象物質を含む試料は通常、細胞や体液であるため、６５０ｎｍよりも短波長には吸収や蛍光を示す生体中のきょう雑物を含むことがあり、そのため正確な測定ができないことがあった。
【０００７】
きょう雑物の干渉が少ない近赤外領域で利用可能な蛍光色素は数少ないうえに、それらの色素は化学的に不安定であった。分子設計と合成も困難であった。
【０００８】
金ナノ粒子は化学的に安定であるが、一定の波長において吸収ないしはレイリー散乱を有するためには、金ナノ粒子の粒子径と形状を揃える必要がある。そのような金ナノ粒子の合成には多大な労力を必要とした。
【０００９】
またＤＮＡマイクロアレイでは、異なる波長の色素を用いるマルチカラーラベルの利用が求められているが、上述の色素、金ナノ粒子による蛍光ピーク、吸収ピークの半値幅は数十ｎｍとブロードであり、複数の標識が光学的に干渉する問題があった。
【００１０】
さらに標識によるコンタミネーションや非特異吸着が生じやすく、高いＳ／Ｎ比で検出することは難しかった。
【００１１】
【課題を解決するための手段】
本発明は、上記課題に鑑みてなされたものであって、色素等の標識を用いずに、分析対象物質の分子間相互作用の解析を水溶液中において行うこと、複数の分析対象物質の検出を特異的かつ定量的に行うことを目的としている。
【００１２】
上記目的を達成するために本発明の分析方法は、分析対象物質と量論関係をなすラマン活性物質に、群をなしている貴金属コロイドからなる表面増強ラマン散乱の基質を共存させて、その増強電場による表面増強ラマン散乱を測定して行う。これにより、ラマン活性物質の波長特異的な表面増強ラマン散乱を測定するので、標識を特に用いずに、分析対象物質を特異的かつ定量的に行うことができる。
【００１３】
本発明では近赤外領域のレーザーを光源にすることができ、励起光、ラマン散乱光ともに近赤外光であるため、容易に試料中のきょう雑物の影響が少ない近赤外光での光分析となる。ラマン散乱では、ラマン活性分子の構造に特異的であるので、特異的な検出が可能となる。さらにラマン散乱は蛍光や吸収に比べ著しく波長分解能が高く、異なる構造の複数の分子を容易に識別できる。
【００１４】
【発明の実施の形態】
この発明は、分析対象物質と、分析対象物質結合性分子と、分析対象物質と競合して該分析対象物質結合性分子と結合する、少なくとも一つ以上のラマン活性分子と、表面増強ラマン散乱の基質からなる系であって、該ラマン活性分子の該分析対象物質結合性分子に対する結合力が該分析対象物質よりも弱いことを特徴とする系において、該分析対象物質結合性分子と該ラマン活性分子が結合した複合体に分析対象物質を加え、分析対象物質の置換によって該ラマン活性分子を遊離せしめ、次いで表面増強ラマン散乱の基質で捕捉し、この状態で励起光を照射し、発生する該ラマン活性分子の表面増強ラマン散乱光を測定することによって行うものである。これによって分析対象物質と分析対象物質結合性分子の分子間相互作用の解析と、分析対象物質の特異的、定量的測定が達成される。
【００１５】
またこの発明は、分析対象物質と、分析対象物質結合性分子と、分析対象物質結合性分子と競合して分析対象物質と結合する、少なくとも一つ以上のラマン活性分子と、表面増強ラマン散乱の基質からなる系であって、該ラマン活性分子の該分析対象物質に対する結合力が該分析対象物質結合性分子よりも弱いことを特徴とする系において、該分析対象物質と該ラマン活性分子が結合した複合体に分析対象物質結合性分子を加え、分析対象物質結合性分子の置換によって該ラマン活性分子を遊離せしめ、次いで表面増強ラマン散乱の基質で捕捉し、この状態で励起光を照射し、発生する該ラマン活性分子の表面増強ラマン散乱光を測定することによって行うものである。これによって分析対象物質と分析対象物質結合性分子の分子間相互作用の解析と、分析対象物質の特異的、定量的測定が達成される。
【００１６】
またこの発明は、分析対象物質と、分析対象物質結合性分子と、分析対象物質と競合して該分析対象物質結合性分子と結合する、少なくとも一つ以上のラマン活性分子と、表面増強ラマン散乱の基質からなる系であって、該ラマン活性分子の該分析対象物質結合性分子に対する結合力が該分析対象物質よりも強いことを特徴とする系において、分析対象物質と該分析対象物質結合性分子が結合した複合体に該ラマン活性分子を加え、分析対象物質の置換によって該ラマン活性分子を結合せしめ、この状態で励起光を照射し、分析対象物質が存在しないときに発生する該ラマン活性分子の表面増強ラマン散乱光との差分を測定することによって行うものである。これによって分析対象物質と分析対象物質結合性分子の分子間相互作用の解析と、分析対象物質の特異的、定量的測定が達成される。
【００１７】
またこの発明は、分析対象物質と、分析対象物質結合性分子と、該分析対象物質と該分析対象物質結合性分子が結合した複合体に結合する、少なくとも一つ以上のラマン活性分子と、表面増強ラマン散乱の基質からなる系であって、分析対象物質と分析対象物質結合性分子が結合した該複合体に該ラマン活性分子を結合せしめ、この状態で励起光を照射し、分析対象物質が存在しないときに発生する該ラマン活性分子の表面増強ラマン散乱光との差分を測定することによって行うものである。これによって分析対象物質と分析対象物質結合性分子の分子間相互作用の解析と、分析対象物質の特異的、定量的測定が達成される。
【００１８】
分析対象物質は、オリゴヌクレオチド、酵素、抗体からなる群から選ぶことができるが、これに限定されるものではない。分析対象物質結合性分子は、分析対象物質と、相補的あるいは特異的に結合する分子を選ぶことができる。ラマン活性分子の少なくとも一部にオリゴヌクレオチド、ペプチドを含むことができる。ラマン活性分子は、窒素を含む複素環化合物をその分子の一部に含むことが特に好ましい。
【００１９】
このような分析対象物質、分析対象物質物質結合性分子、ラマン活性分子の組み合わせの例は、特に限定されないが、互いに相補的なオリゴヌクレオチドと、末端にアデニンを有するプライマーの例があげられる。
【００２０】
表面増強ラマン散乱の基質には、粗さを持った電極の金属面、金属微粒子のコロイド、金属微粒子を島状に沈積させたフィルム、ゾルゲル法でガラスマトリックスに包括された金属微粒子、ポリマー中に包括された金属微粒子が今まで報告されている。これらの基質のうち、水溶液中での貴金属ナノ粒子のコロイドが実用上もっとも便利であるとされる。その理由として、１）微粒子が液相法で合成でき、取扱いが簡便である。２）連続流れ分析系への適用ができる。３）粒子サイズと形状の制御が可能である。４）簡単に表面積を定義できる。５）理論的解析のために形態を変えられる。等の利点が指摘されている。
【００２１】
貴金属コロイドは、塩等の添加により凝集し、水中で群をなした状態が好ましく用いられる。
【００２２】
しかし、通常、水溶液中では凝集した貴金属コロイドの状態は不安定である。
【００２３】
本発明では、表面増強ラマン散乱の基質を構成する、群をなしている貴金属コロイドは、分散性微粒子によって保持されているものとすることが望ましい。これにより、群をなしている貴金属コロイドの安定性を向上させることができ、表面増強ラマン散乱を簡便に利用することができる（ＰＣＴ／ＪＰ０１／０１８５４）。ここで、分散性微粒子には合成スメクタイトなどの膨潤性層状ケイ酸塩を用いることができる。
【００２４】
このような膨潤性層状ケイ酸塩はいくつか市販されており、たとえば商品名ルーセンタイトＳＷＮもしくはルーセンタイトＳＷＦ（合成ヘクトライト）またはＭＥ（フッ素雲母）、商品名スメクトンＳＡ（合成サポナイト）もしくは商品名クニピアＦ（精製モンモリロナイト）、商品名チキソピーＷ（合成ヘクトライト）、商品名ラポナイトＸＬＧもしくはラポナイトＲＤもしくはラポナイトＸＬＳ（合成ヘクトライト）、商品名マルチゲル（ベントナイト）、膨潤性合成フッ素雲母等が挙げられる。
【００２５】
本発明では、水中で群をなす貴金属コロイドの増強電場によって、分子間相互作用と量論関係にあるラマン活性物質の表面増強ラマン散乱を特異的に測定するので、溶液中において分子間相互作用を解析することができる。
【００２６】
本発明は、また、近赤外領域でラマン分光法による高感度分析を可能とした点に大きな特徴がある。近赤外領域においてラマン分光法によって分析することにより、分析対象物が含有されるマトリックス中のきょう雑物の影響を排除して、分析対象物の検出において特異性・選択性を向上させることが可能となるという、極めて実用的価値のある効果が得られる。
【００２７】
これらのラマン活性分子および分析対象物質結合性分子は、表面増強ラマン散乱の基質と共に有用な分析キットを構成する。
【００２８】
【実施例】
以下に実施例を挙げて本発明を具体的に説明する。
【実施例１】
図１は、本発明の実施の一形態を示す模式図である。
【００２９】
【図１】
【００３０】
上記の図において、分析対象物質Ａと、分析対象物質結合性分子Bと、分析対象物質と競合して該分析対象物質結合性分子と結合する、少なくとも一つ以上のラマン活性分子Ｃと、表面増強ラマン散乱の基質Ｄからなる系であって、該ラマン活性分子Ｃの該分析対象物質結合性分子Ｂに対する結合力が該分析対象物質Ａよりも弱いことを特徴とする系において、該分析対象物質結合性分子Ｂと該ラマン活性分子Ｃが結合した複合体ＢＣに分析対象物質Ａを加え、分析対象物質Ａの置換によって該ラマン活性分子Ｃを遊離せしめ、次いで表面増強ラマン散乱の基質Ｄで捕捉し、この状態で励起光を照射し、発生する該ラマン活性分子Ｃの表面増強ラマン散乱光を測定する。
【００３１】
【実施例２】
スメクタイトによって保持された、群をなしている貴金属コロイドの増強電場による、アデニン水溶液の特異的な表面増強ラマン散乱スペクトルを図２に示す。図２のａ、ｂ、ｃ、ｄのアデニン濃度はそれぞれ６２．５μＭ、２０μＭ、６．２５μＭ、０μＭである。ラマン分光機には、サーモニコレー社のＦＴ−ラマンＭａｇｎａを用い、１０６４nmの近赤外レーザーを照射し１２８回積算した。７３５ｃｍ−１における検量線を図３に示す。図３のａは表面増強ラマン散乱であり、ｂは通常のラマン散乱である。近赤外光によってアデニンを定量できた。
【００３２】
【実施例３】
図１の模式図において、分析対象物質をオリゴアデニン（１０塩基対）、分析対象物質結合性分子をオリゴチミン（２０塩基対）、ラマン活性分子をアデニンとして、オリゴアデニン（２０塩基対）を測定した。図３のａは、オリゴチミン（２０塩基対）１μＭとアデニン２０μＭの混合液の表面増強ラマンスペクトルである。図３のｂは、オリゴチミン（２０塩基対）１μＭとアデニン２０μＭの混合液に、さらにオリゴアデニン（１０塩基対）１μＭを加えた混合液の表面増強ラマンスペクトルである。図３のＣはオリゴチミン（２０塩基対）５μＭの表面増強ラマンスペクトルである。アデニンはオリゴチミンと結合すると表面増強ラマン強度が弱まること、オリゴチミンの表面増強ラマンはほとんど現れないことがわかった。オリゴチミンとアデニンの複合体に、オリゴアデニンを加えると、アデニンが遊離し、アデニンの表面増強ラマン強度が増大していた。したがって、本発明の方法により、オリゴアデニンの分析と、オリゴアデニンとオリゴチミンの分子間相互作用解析が可能であることが示唆された。
【００３３】
【発明の効果】
本発明によれば、色素等の標識を用いずに、分析対象物質の分子間相互作用の解析を水溶液中において行うこと、および複数の分析対象物質の検出を特異的かつ定量的に行うことができる。また近赤外光による測定を容易に利用できる。
【図面の簡単な説明】
【図１】発明の実施の一形態の模式図を示す。
【図２】アデニンの表面増強ラマン散乱を示す
【図３】アデニンの検量線を示す。
【図４】分析対象物質がオリゴアデニン、分析対象物質結合性分子がオリゴチミン、ラマン活性分子がアデニンであるときのオリゴアデニンの応答を示す。
Claims (12)
- 分析対象物質と、分析対象物質結合性分子と、分析対象物質と競合して該分析対象物質結合性分子と結合する、少なくとも一つ以上のラマン活性分子と、表面増強ラマン散乱の基質からなる系であって、該ラマン活性分子の該分析対象物質結合性分子に対する結合力が該分析対象物質よりも弱いことを特徴とする系において、該分析対象物質結合性分子と該ラマン活性分子が結合した複合体に分析対象物質を加え、分析対象物質の置換によって該ラマン活性分子を遊離せしめ、次いで表面増強ラマン散乱の基質で捕捉し、この状態で励起光を照射し、発生する該ラマン活性分子の表面増強ラマン散乱光を測定することを特徴とする分析対象物質の分析方法。
- 分析対象物質と、分析対象物質結合性分子と、分析対象物質結合性分子と競合して分析対象物質と結合する、少なくとも一つ以上のラマン活性分子と、表面増強ラマン散乱の基質からなる系であって、該ラマン活性分子の該分析対象物質に対する結合力が該分析対象物質結合性分子よりも弱いことを特徴とする系において、該分析対象物質と該ラマン活性分子が結合した複合体に分析対象物質結合性分子を加え、分析対象物質結合性分子の置換によって該ラマン活性分子を遊離せしめ、次いで表面増強ラマン散乱の基質で捕捉し、この状態で励起光を照射し、発生する該ラマン活性分子の表面増強ラマン散乱光を測定することを特徴とする分析対象物質の分析方法。
- 分析対象物質と、分析対象物質結合性分子と、分析対象物質と競合して該分析対象物質結合性分子と結合する、少なくとも一つ以上のラマン活性分子と、表面増強ラマン散乱の基質からなる系であって、該ラマン活性分子の該分析対象物質結合性分子に対する結合力が該分析対象物質よりも強いことを特徴とする系において、分析対象物質と該分析対象物質結合性分子が結合した複合体に該ラマン活性分子を加え、分析対象物質の置換によって該ラマン活性分子を結合せしめ、この状態で励起光を照射し、分析対象物質が存在しないときに発生する該ラマン活性分子の表面増強ラマン散乱光との差分を測定することを特徴とする分析対象物質の分析方法。
- 分析対象物質と、分析対象物質結合性分子と、該分析対象物質と該分析対象物質結合性分子が結合した複合体に結合する、少なくとも一つ以上のラマン活性分子と、表面増強ラマン散乱の基質からなる系であって、分析対象物質と分析対象物質結合性分子が結合した該複合体に該ラマン活性分子を結合せしめ、この状態で励起光を照射し、分析対象物質が存在しないときに発生する該ラマン活性分子の表面増強ラマン散乱光との差分を測定することを特徴とする分析対象物質の分析方法。
- 分析対象物質、分析対象物質結合性分子の少なくとも一つ以上が、オリゴヌクレオチド、酵素、抗体からなる群から選ばれることを特徴とする請求の範囲１〜４に記載の分析方法。
- ラマン活性分子の少なくとも一部にオリゴヌクレオチド、ペプチドを含むことを特徴とする請求の範囲１〜４に記載の分析方法。
- 分析対象物質、分析対象物質結合性分子がそれぞれ相補的なオリゴヌクレオチドから構成されることを特徴とする請求の範囲１〜４に記載の分析方法。
- 表面増強ラマン散乱の基質が、群をなした貴金属コロイドであることを特徴とする請求の範囲１〜４に記載の分析方法。
- 群をなした貴金属コロイドが、合成スメクタイトなどの膨潤性層状ケイ酸塩からなる分散性微粒子によって保持されていることを特徴とする請求項８に記載の分析方法。
- 結合の反応を、溶液中で進行させることを特徴とする請求の範囲１〜４に記載の分析方法。
- 表面増強ラマン散乱の励起に、６５０ｎｍより長波長の近赤外レーザーを用いることを特徴とする請求の範囲１〜４に記載の分析方法。
- 請求の範囲１〜４に記載の分析方法で用いられるラマン活性分子および分析対象物質結合性分子および表面増強ラマン散乱の基質からなる分析キット。
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| CN104568909A (zh) * | 2015-02-10 | 2015-04-29 | 吕志伟 | 一种基于表面增强拉曼散射技术牛奶中双氰胺含量的检测方法 |
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- 2002-12-26 JP JP2002377375A patent/JP4341242B2/ja not_active Expired - Fee Related
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