JP2004201688A - 熱不安定性デオキシリボヌクレアーゼiバリアント - Google Patents
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Abstract
【解決手段】ウシ膵臓デオキシリボヌクレアーゼIの特定アミノ酸残基が異なるアミノ酸残基で置換され、デオキシリボヌクレアーゼI活性を有するウシ膵臓デオキシリボヌクレアーゼIバリアント;該バリアントをコードする塩基配列を用いる製造方法;並びに該バリアントとシグナルペプチドとからなるプレタンパク質をコードし、Pichia pastoris AOX1プロモーター又はそのプロモーターエレメントと作動可能に連結した特定の塩基配列を含み、ここで、該プレタンパク質をコードする塩基配列が、ウシ膵臓デオキシリボヌクレアーゼIの塩基配列と融合させた染色体を有するPichia pastoris株。
【選択図】なし
Description
〔1〕 配列番号:2の260アミノ酸ウシ膵臓デオキシリボヌクレアーゼIのN末端から番号付けして、Cys173、Cys101、Cys104、Lys117、Arg185、Arg187、Ile3、Phe82及びPhe128からなる群より選ばれたウシ膵臓デオキシリボヌクレアーゼIのアミノ酸残基の少なくとも1つであるアミノ酸残基について、少なくとも1つの異なるアミノ酸残基で置換して、デオキシリボヌクレアーゼI活性を有するウシ膵臓デオキシリボヌクレアーゼI バリアントを形成させたものである、アミノ酸置換によるウシ膵臓デオキシリボヌクレアーゼIのバリアント、
〔2〕 異なるアミノ酸残基でCys173を置換する場合、異なるアミノ酸残基が、Ala、Ser、Thr、Gly及びValからなる群より選ばれたものである、前記〔1〕記載のウシ膵臓デオキシリボヌクレアーゼIのバリアント、
〔3〕 異なるアミノ酸残基でCys101を置換する場合、異なるアミノ酸残基が、Ala、Ser、Thr、Gly及びValからなる群より選ばれたものである、前記〔1〕又は〔2〕記載のウシ膵臓デオキシリボヌクレアーゼIのバリアント、
〔4〕 異なるアミノ酸残基でCys104を置換する場合、異なるアミノ酸残基が、Ala、Ser、Thr、Gly及びValからなる群より選ばれたものである、前記〔1〕〜〔3〕いずれか1項に記載のウシ膵臓デオキシリボヌクレアーゼIのバリアント、
〔5〕 異なるアミノ酸残基でLys117を置換する場合、異なるアミノ酸残基が、Asp、Glu、Asn、Gln及びIleからなる群より選ばれたものである、前記〔1〕〜〔4〕いずれか1項に記載のウシ膵臓デオキシリボヌクレアーゼIのバリアント、
〔6〕 異なるアミノ酸残基でArg185を置換する場合、異なるアミノ酸残基が、His、Ala、Asn及びGlnからなる群より選ばれたものである、前記〔1〕〜〔5〕いずれか1項に記載のウシ膵臓デオキシリボヌクレアーゼIのバリアント、
〔7〕 異なるアミノ酸残基でArg187を置換する場合、異なるアミノ酸残基が、His、Ala、Asn及びGlnからなる群より選ばれたものである、前記〔1〕〜〔6〕いずれか1項に記載のウシ膵臓デオキシリボヌクレアーゼIのバリアント、
〔8〕 異なるアミノ酸残基でIle3を置換する場合、異なるアミノ酸残基が、Ala、Ser、Thr、Gly及びValからなる群より選ばれたものである、前記〔1〕〜〔7〕いずれか1項に記載のウシ膵臓デオキシリボヌクレアーゼIのバリアント、
〔9〕 異なるアミノ酸残基でPhe82を置換する場合、異なるアミノ酸残基が、Asn、Gln及びIleからなる群より選ばれたものである、前記〔1〕〜〔8〕いずれか1項に記載のウシ膵臓デオキシリボヌクレアーゼIのバリアント、
〔10〕 異なるアミノ酸残基でPhe128を置換する場合、異なるアミノ酸残基が、Asn、Gln及びIleからなる群より選ばれたものである、前記〔1〕〜〔9〕いずれか1項に記載のウシ膵臓デオキシリボヌクレアーゼIのバリアント、
〔11〕 ウシ膵臓デオキシリボヌクレアーゼIのバリアントを95℃未満で約5分間加熱した後、ウシ膵臓デオキシリボヌクレアーゼIのバリアントのデオキシリボヌクレアーゼI比活性が、1mgタンパク質あたり約0単位である、前記〔1〕〜〔10〕いずれか1項に記載のウシ膵臓デオキシリボヌクレアーゼIのバリアント、
〔12〕 (a)ウシ膵臓デオキシリボヌクレアーゼIのバリアントをコードする塩基配列を含有したベクターを供給する工程、
(b)前記(a)のベクターを用いて微生物宿主株を形質転換する工程、
(c)栄養素を含む増殖培地中で、前記(b)で得られた形質転換微生物宿主株を培養し、それにより、該微生物宿主株が、ウシ膵臓デオキシリボヌクレアーゼIのバリアントを発現する工程、及び
(d)微生物宿主株及び/又は増殖培地からウシ膵臓デオキシリボヌクレアーゼIのバリアントを精製する工程
を含む、前記〔1〕〜〔11〕いずれか1項に記載のウシ膵臓デオキシリボヌクレアーゼIのバリアントの製造方法、
〔13〕 ウシ膵臓デオキシリボヌクレアーゼIのバリアントをコードする塩基配列が、配列番号:3である、前記〔12〕記載の方法、
〔14〕 (a)ベクターは、ウシ膵臓デオキシリボヌクレアーゼIとシグナルペプチドとからなるプレタンパク質をコードする塩基配列を含有し、
(b)微生物宿主株は、メチロトローフ酵母株であり、
(c)増殖培地は、炭素源としてメタノールを含み、
(d)メチロトローフ酵母株は、ウシ膵臓デオキシリボヌクレアーゼIのバリアントを発現し、分泌し、
(e)ウシ膵臓デオキシリボヌクレアーゼIのバリアントは、増殖培地から精製される
ものである、前記〔12〕又は〔13〕記載の方法、
〔15〕 シグナルペプチドが、ウシ膵臓デオキシリボヌクレアーゼIのバリアントの1番目のアミノ酸に直接隣接して位置するシグナルペプチダーゼ切断部位を含む、前記〔14〕記載の方法、
〔16〕 発現されたプレタンパク質のアミノ酸配列が、(a)配列番号:8、
(b)配列番号:9、及び
(c)配列番号:10
からなる群より選ばれたものである、前記〔14〕又は〔15〕記載の方法、
〔17〕 ウシ膵臓デオキシリボヌクレアーゼIのバリアントをコードする塩基配列が、配列番号:3である、前記〔14〕〜〔16〕いずれか1項に記載の方法、
〔18〕 プレタンパク質をコードする塩基配列が、ウシ膵臓デオキシリボヌクレアーゼIのバリアントをコードする塩基配列に融合したシグナルペプチドをコードする塩基配列からなるものである、前記〔14〕〜〔17〕いずれか1項に記載の方法、
〔19〕 シグナルペプチドをコードする塩基配列が、
(a)配列番号:5、
(b)配列番号:6、及び
(c)配列番号:7
からなる群より選ばれたものである、前記〔14〕〜〔18〕いずれか1項に記載の方法、
〔20〕 プレタンパク質をコードする塩基配列が、プロモーター又はプロモーターエレメントに作動可能に連結されたものである、前記〔14〕〜〔19〕いずれか1項に記載の方法、
〔21〕 メチロトローフ酵母株が、Hansenula、Pichia、Candida及びTorulopsis種からなる群より選ばれたものである、前記〔14〕〜〔20〕いずれか1項に記載の方法、
〔22〕 メチロトローフ酵母株が、Pichia pastoris、Hansenula polymorpha、Candida boidinii及びTorulopsis glabrataからなる群より選ばれたものである、前記〔21〕記載の方法、
〔23〕 メチロトローフ酵母株が、アメリカンタイプカルチャーコレクションアクセッション番号76273のPichia pastoris又はその誘導体である、前記〔22〕記載の方法、
〔24〕 ウシ膵臓デオキシリボヌクレアーゼIのバリアントとシグナルペプチドとからなるプレタンパク質をコードし、配列番号:11のPichia pastoris AOX1プロモーター又はそのプロモーターエレメントと作動可能に連結した塩基配列を含み、ここで、該プレタンパク質をコードする塩基配列が、配列番号:3と融合した配列番号:6又は7である染色体を有するPichia pastoris株、
〔25〕 前記〔12〕〜〔23〕いずれか1項に記載の方法により得られうる、ウシ膵臓デオキシリボヌクレアーゼIのバリアント、
〔26〕 DNAを加水分解し、ついで、ウシ膵臓デオキシリボヌクレアーゼIのバリアントのデオキシリボヌクレアーゼI比活性を、ウシ膵臓デオキシリボヌクレアーゼIのバリアントを、95℃未満の温度で約5分間加熱することにより1mgのタンパク質あたり約0まで減少させるための、前記〔1〕〜〔11〕及び前記〔25〕いずれか1項に記載のウシ膵臓デオキシリボヌクレアーゼIのバリアントの使用、
〔27〕 ウシ膵臓デオキシリボヌクレアーゼIのバリアントを約70℃の温度で1mgのタンパク質あたり約0まで減少させるための、約5分間加熱することによりウシ膵臓デオキシリボヌクレアーゼIのバリアントのデオキシリボヌクレアーゼI比活性が、前記〔26記載のウシ膵臓デオキシリボヌクレアーゼIのバリアントの使用、
〔28〕 前記〔1〕〜〔11〕及び前記〔25〕いずれか1項に記載のウシ膵臓デオキシリボヌクレアーゼIのバリアントと、二価カチオンを含有した反応緩衝液とを含んでなる、パーツのキット、並びに
〔29〕 ウシ膵臓デオキシリボヌクレアーゼIのバリアントが、2mM Tris-HCl、2mM MgCl2、4mM CaCl2、50%グリセロール、pH7.6並びに100mM Tris-HCl pH7.5、100mM MgCl2及び10mM ジチオエリスリトールを含む10倍濃縮反応液を含む緩衝液に溶解されたものである、前記〔28〕記載のパーツのキット、
に関する。
(a)ウシ膵臓デオキシリボヌクレアーゼIのバリアントをコードする塩基配列を含有したベクターを供給する工程、
(b)前記(a)のベクターを用いて微生物宿主株を形質転換する工程、
(c)栄養素を含む増殖培地中で、前記(b)で得られた形質転換微生物宿主株を培養し、それにより、該微生物宿主株が、ウシ膵臓デオキシリボヌクレアーゼIのバリアントを発現する工程及び
(d)微生物宿主株及び/又は増殖培地からウシ膵臓デオキシリボヌクレアーゼIのバリアントを精製する工程
を含む、ウシ膵臓デオキシリボヌクレアーゼIのバリアントの製造方法である。
一般的に、Invitrogenのマニュアルである、「Pichia Expression Kit」バージョン M 011102 25-0043、「pPICZ A、B及びC」バージョン D 110801 25-0148「pPICZαA、B及びC」バージョン E 010302 25-0150及び「pPIC9K」バージョン E 030402 25-0106において示唆され、記載される方法を、適用した。そこで言及されるさらなるベクター、酵母株及び培地に対しても参照される。Sambrook, Fritsch & Maniatis,Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 第3版, CSHL Press, 2001に記載等の分子生物学の基本的方法を適用した。
一般的に、Sambrook, Fritsch & Maniatis, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 第3版, CSHL Press, 2001に記載等の分子生物学の標準的方法を適用した。以下で説明した方法は、「部位特異的変異誘発(site-directed mutagenesis)」としても公知である、非常に一般的な方法の具体的な適用である。
配列番号:1において571-519位に見出される塩基トリプレット「TGC」を、「GCC」によって置換した。このために、第1のPCRにおいて、DNAオリゴヌクレオチド「5’Cys173Ala」(配列番号:14)を、プライマーとして、「3’DNaseI」と組み合わせて用い、第2のPCRにおいては、「3’Cys173Ala」(配列番号:15)を、プライマーとして、「5’DNaseI」と組み合わせて用いた。全長産物を生成するために、単離された中間断片を引き続いて、第3のPCRのために用いた。
配列番号:1において301-303位に見出される塩基トリプレット「TGC」を、「GCC」によって置換した。このために、第1のPCRにおいて、DNAオリゴヌクレオチド「5’Cys101Ala」(配列番号:16)を、プライマーとして、「3’DNaseI」と組み合わせて用い、第2のPCRにおいては、「3’Cys101Ala」(配列番号:17)を、プライマーとして、「5’DNaseI」と組み合わせて用いた。全長産物を生成するために、単離された中間断片を引き続いて、第3のPCRのために用いた。
配列番号:1において310-312位に見出される塩基トリプレット「TGT」を、「GCT」によって置換した。このために、第1のPCRにおいて、DNAオリゴヌクレオチド「5’Cys104Ala」(配列番号:18)を、プライマーとして、「3’DNaseI」と組み合わせて用い、第2のPCRにおいては、「3’Cys104Ala」(配列番号:19)を、プライマーとして、「5’DNaseI」と組み合わせて用いた。全長産物を生成するために、単離された中間断片を引き続いて、第3のPCRのために用いた。
配列番号:1において349-351位に見出される塩基トリプレット「AAA」を、「GAC」によって置換した。このために、第1のPCRにおいて、DNAオリゴヌクレオチド「5’Lys117Asp」(配列番号:20)を、プライマーとして、「3’DNaseI」と組み合わせて用い、第2のPCRにおいては、「3’Lys117Asp」(配列番号:21)を、プライマーとして、「5’DNaseI」と組み合わせて用いた。全長産物を生成するために、単離された中間断片を引き続いて、第3のPCRのために用いた。
配列番号:1において553-555位に見出される塩基トリプレット「AGA」を、「CAC」によって置換した。このために、第1のPCRにおいて、DNAオリゴヌクレオチド「5’Arg185His」(配列番号:22)を、プライマーとして、「3’DNaseI」と組み合わせて用い、第2のPCRにおいては、「3’Arg185His」(配列番号:23)を、プライマーとして、「5’DNaseI」と組み合わせて用いた。全長産物を生成するために、単離された中間断片を引き続いて、第3のPCRのために用いた。
配列番号:1において553-555位に見出される塩基トリプレット「AGA」を、「GCA」によって置換した。このために、第1のPCRにおいて、DNAオリゴヌクレオチド「5’Arg185Ala」(配列番号:24)を、プライマーとして、「3’DNaseI」と組み合わせて用い、第2のPCRにおいては、「3’Arg185Ala」(配列番号:25)を、プライマーとして、「5’DNaseI」と組み合わせて用いた。全長産物を生成するために、単離された中間断片を引き続いて、第3のPCRのために用いた。
配列番号:1において558-561位に見出される塩基トリプレット「AGA」を、「CAC」によって置換した。このために、第1のPCRにおいて、DNAオリゴヌクレオチド「5’Arg187His」(配列番号:26)を、プライマーとして、「3’DNaseI」と組み合わせて用い、第2のPCRにおいては、「3’Arg187His」(配列番号:27)を、プライマーとして、「5’DNaseI」と組み合わせて用いた。全長産物を生成するために、単離された中間断片を引き続いて、第3のPCRのために用いた。
配列番号:1において558-561位に見出される塩基トリプレット「AGA」を、「GCA」によって置換した。このために、第1のPCRにおいて、DNAオリゴヌクレオチド「5’Arg187His」(配列番号:28)を、プライマーとして、「3’DNaseI」と組み合わせて用い、第2のPCRにおいては、「3’Arg187His」(配列番号:29)を、プライマーとして、「5’DNaseI」と組み合わせて用いた。全長産物を生成するために、単離された中間断片を引き続いて、第3のPCRのために用いた。
配列番号:1において7-9位に見出される塩基トリプレット「ATT」を、「TCT」によって置換した。このために、第1のPCRにおいて、DNAオリゴヌクレオチド「5’Ile3Ser」(配列番号:30)を、プライマーとして、「3’DNaseI」と組み合わせて用いた。この「5’Ile3Ser」は、「5’DNaseI」と同様の5’末端塩基配列を含有する。従って、全長産物が形成され、この場合、第2及び第3のPCRは必要なかった。
配列番号:1において244-246位に見出される塩基トリプレット「TTC」を、「AAC」によって置換した。このために、第1のPCRにおいて、DNAオリゴヌクレオチド「5’Phe82Asn」(配列番号:31)を、プライマーとして、「3’DNaseI」と組み合わせて用い、第2のPCRにおいては、「3’Phe82Asn」(配列番号:32)を、プライマーとして、「5’DNaseI」と組み合わせて用いた。全長産物を生成するために、単離された中間断片を引き続いて、第3のPCRのために用いた。
配列番号:1において382-384位に見出される塩基トリプレット「TTC」を、「AAC」によって置換した。このために、第1のPCRにおいて、DNAオリゴヌクレオチド「5’Phe128Asn」(配列番号:33)を、プライマーとして、「3’DNaseI」と組み合わせて用い、第2のPCRにおいては、「3’Phe128Asn」(配列番号:34)を、プライマーとして、「5’DNaseI」と組み合わせて用いた。全長産物を生成するために、単離された中間断片を引き続いて、第3のPCRのために用いた。
配列番号:1において301-303位に見出される塩基トリプレット「TGC」を、「GCC」によって置換して、310-312位における塩基トリプレット「TGT」を、「GCT」で置換した。このために、第1のPCRにおいて、DNAオリゴヌクレオチド「5’Cys101Ala、Cys104Ala」(配列番号:35)を、プライマーとして、「3’DNaseI」と組み合わせて用い、第2のPCRにおいては、「3’Cys101Ala、Cys104Ala」(配列番号:36)を、プライマーとして、「5’DNaseI」と組み合わせて用いた。全長産物を生成するために、単離された中間断片を引き続いて、第3のPCRのために用いた。
配列番号:1において553-555位に見出される塩基トリプレット「AGA」を、「GCA」によって置換して、559-561位における塩基トリプレット「AGA」を、「CAC」で置換した。このために、第1のPCRにおいて、DNAオリゴヌクレオチド「5’Arg185Ala,Arg187His」(配列番号:37)を、プライマーとして、「3’DNaseI」と組み合わせて用い、第2のPCRにおいては、「3’Arg185Ala,Arg187His」(配列番号:38)を、プライマーとして、「5’DNaseI」と組み合わせて用いた。全長産物を生成するために、単離された中間断片を、引き続いて、第3のPCRのために用いた。
Lys117Aspにおける変異を、二重変異体Arg185Ala、Arg187Hisと組み合わせた。固有のStyI切断部位は、変異部位間に位置する。従って、上記のように得られた全長産物を、StyIを用いて別々に切断して、この所望の変異体を含む断片を、アガロース電気泳動後に単離した。所望の変異体を含む断片が連結され得るように、切断した部分を合わせた。標準的な連結反応後、プライマー「5’DNaseI」と「3’DNaseI」とを用いて、トリプレット変異体全長断片を、PCRによって増幅した。トリプレット変異体全長断片を引き続いて、配列決定によって確認した。
一般的に、Invitrogenのマニュアル「Pichia Expression Kit」バージョン M 011102 25-0043、「pPICZ A、B及びC」バージョン D 110801 25-0148、「pPICZαA、B及びC」バージョン E 010302 25-0150及び「pPIC9K」バージョン E 030402 25-0106において示唆され、かつ記載される方法を適用した。そこで言及されるさらなるベクター、酵母株及び培地に対しても参照される。Sambrook, Fritsch & Maniatis, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 第3版, CSHL Press, 2001に記載等の分子生物学の基本的方法を適用した。
一般的に、Invitrogenのマニュアル「Pichia Expression Kit」バージョン M 011102 25-0043、「pPICZ A、B及びC」バージョン D 110801 25-0148、「pPICZαA,B及びC」バージョン E 010302 25-0150及び「pPIC9K」バージョン E 030402 25-0106において示唆され、記載される方法を、適用した。そこで言及されるさらなるベクター、酵母株及び培地に対しても参照される。Sambrook, Fritsch & Maniatis, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 第3版, CSHL Press, 2001に記載等の分子生物学の基本的方法を適用した。
一般的に、Invitrogenのマニュアル「Pichia Expression Kit」バージョン M 011102 25-0043、「pPICZ A、B及びC」バージョン D 110801 25-0148、「pPICZαA、B及びC」バージョン E 010302 25-0150及び「pPIC9K」バージョン E 030402 25-0106において示唆され、かつ記載される方法を、適用した。そこで言及されるさらなるベクター、酵母株及び培地に対しても参照される。Sambrook, Fritsch & Maniatis, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 第3版, CSHL Press, 2001に記載等の分子生物学の基本的方法を適用した。
実施例5に記載されたように得られた試料アリコートについて、最初にOD600nmを決定した。引き続き、細胞を遠心分離によってペレット化して、上清を保存した。希釈されていない上清中において及び1:10希釈において、デオキシリボヌクレアーゼ活性を測定した。
一般的に、Invitrogenのマニュアル「Pichia Expression Kit」バージョン M 011102 25-0043、「pPICZ A、B及びC」バージョン D 110801 25-0148、「pPICZαA、B及びC」バージョン E 010302 25-0150及び「pPIC9K」バージョン E 030402 25-0106において示唆され、かつ記載される方法を、適用した。そこで言及されるさらなるベクター、酵母株及び培地に対しても参照される。Sambrook, Fritsch & Maniatis, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 第3版, CSHL Press, 2001に記載等の分子生物学の基本的方法を適用した。
一般的に、Invitrogenのマニュアル「Pichia Expression Kit」バージョン M 011102 25-0043、「pPICZ A、B及びC」バージョン D 110801 25-0148、「pPICZαA、B及びC」バージョン E 010302 25-0150及び「pPIC9K」バージョン E 030402 25-0106において示唆され、かつ記載される方法を、適用した。そこで言及されるさらなるベクター、酵母株及び培地に対しても参照される。Sambrook, Fritsch & Maniatis, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 第3版, CSHL Press, 2001に記載等の分子生物学の基本的方法を適用した。
濾過又は遠心分離によって、増殖培地の上清からバイオマスを取り出した。陽イオン交換体を用いるイオン交換クロマトグラフィーによって、バリアントウシ膵臓デオキシリボヌクレアーゼIを引き続き精製した。陽イオン交換体への結合は、pHが5.0であり、かつ20mMの酢酸Ca2+を含む結合緩衝液を用いて生じた。結合緩衝液を用いて繰り返し固相を洗浄することによって、他のタンパク質及び不純物を除去し、これにより、バリアントウシ膵臓デオキシリボヌクレアーゼIは、固相、すなわち陽イオン交換体によって結合されたまま残った。pHが5.0であり、かつ0.3M NaCl、20mMの酢酸Ca2+を含む溶出緩衝液を用いて、ウシ膵臓デオキシリボヌクレアーゼIのバリアントの溶出を達成した。この工程後に得たバリアントウシ膵臓デオキシリボヌクレアーゼIの純度は、SDS-PAGEを行ない、クマーシーブルーを用いてゲルを染色することによって試験した場合、約95%よりも高かった。引き続く精製工程は、ヘパリンセファロースを用いるアフィニティークロマトグラフィーであった。この工程後、ウシ膵臓デオキシリボヌクレアーゼIのバリアントの純度は、SDS-PAGEを行ない、クマーシーブルーを用いてゲルを染色することによって試験した場合、約98%よりも高かった。
Kunitz(Kunitz, M., J.Gen. Physiol. 33(1950)349-62及び363)に従って、試料のアリコート中のデオキシリボヌクレアーゼ活性について試験を実施した。10mM Tris-HCl pH8.0, 0.1mM CaCl2, 1mM MgCl2を含む緩衝液中で、0.05mg/mlの濃度で、仔ウシ胸腺DNAを溶解した。清澄な(濾過された)培養上清等のデオキシリボヌクレアーゼ活性含有増殖培地を、添加して、260nmにおける吸光度の増大を25℃において経時的に光度測定した。1単位(1U)は、1分あたり0.001の吸光度上昇(ΔE)に相当する。
デオキシリボヌクレアーゼなしの参照試料は、試料緩衝液であった。この試料緩衝液は、1部の1M酢酸ナトリウムpH5.0と、1部の50mM MgSO4と8部の二回蒸留水との混合物である。基質緩衝液のために、5mM MgSO4と100mM酢酸ナトリウムとを含む緩衝液(pH5.0)に仔ウシ胸腺DNAを溶解して、水浴中において37℃で24〜30時間インキュベートした。13,000×gで10分間の遠心分離によって、不溶性の部分を除去した。基質緩衝液は、DNAを0.04mg/mlの濃度で含んだ。上清のDNA含量を、260nmで光度的に決定した。必要な場合、試料緩衝液を用いて基質緩衝液を調節して、0.8の吸光度にした。基質緩衝液を使用の前に4℃で少なくとも3日間貯蔵した。
20mM Tris-HClと2mM MgCl2と4mM CaCl2と50%グリセロールとを含む貯蔵緩衝液(pH7.6)中でウシ膵臓デオキシリボヌクレアーゼIの精製されたバリアントのアリコートを94℃で5分間インキュベートし、ここで、各アリコートは、500μlの容積を有し、1mlあたり500単位以上(実施例11のアッセイによって決定した場合)を含んだ。微調整した(変動限界0.5℃未満)サーモスタットブロックヒーターにおける加熱期間を超えて、各アリコートを保持した。インキュベーション後、直ちに、実施例11に記載のアッセイを用いて、容量あたりの活性として、残存デオキシリボヌクレアーゼ比活性を測定した。
5μlの10×「Shure Cut Buffer L」(Roche Diagnostics GmbH, Mannheim;カタログ番号1417975)及び5μgの精製バクテリオファージMS2 RNA」(Roche Diagnostics GmbH, Mannheim;カタログ番号0165948)を含有する総容積50μl中で、ウシ膵臓デオキシリボヌクレアーゼIのLys117Asp,Arg185Ala,Arg187His三重変異バリアントの10単位を37℃で4時間インキュベートした。1×濃度で、「Shure Cut Buffer L」は、10mM Tris pH7.5と10mM MgCl2と1mMジチオトレイトールとを含む。
Claims (13)
- 配列番号:2の260アミノ酸ウシ膵臓デオキシリボヌクレアーゼIのN末端から番号付けして、Cys173、Cys101、Cys104、Lys117、Arg185、Arg187、Ile3、Phe82及びPhe128からなる群より選ばれたウシ膵臓デオキシリボヌクレアーゼIのアミノ酸残基の少なくとも1つであるアミノ酸残基について、少なくとも1つの異なるアミノ酸残基で置換して、デオキシリボヌクレアーゼI活性を有するウシ膵臓デオキシリボヌクレアーゼIのバリアントを形成させたものである、アミノ酸置換によるウシ膵臓デオキシリボヌクレアーゼIのバリアント。
- 異なるアミノ酸残基でLys117を置換する場合、異なるアミノ酸残基が、Asp、Glu、Asn、Gln及びIleからなる群より選ばれたものである、請求項1記載のウシ膵臓デオキシリボヌクレアーゼIのバリアント。
- 異なるアミノ酸残基でArg185を置換する場合、異なるアミノ酸残基が、His、Ala、Asn及びGlnからなる群より選ばれたものである、請求項1又は2記載のウシ膵臓デオキシリボヌクレアーゼIのバリアント。
- 異なるアミノ酸残基でArg187を置換する場合、異なるアミノ酸残基が、His、Ala、Asn及びGlnからなる群より選ばれたものである、請求項1〜3いずれか1項に記載のウシ膵臓デオキシリボヌクレアーゼIのバリアント。
- ウシ膵臓デオキシリボヌクレアーゼIのバリアントを95℃未満で約5分間加熱した後、ウシ膵臓デオキシリボヌクレアーゼIのバリアントのデオキシリボヌクレアーゼI比活性が、1mgタンパク質あたり約0単位である、請求項1〜4いずれか1項に記載のウシ膵臓デオキシリボヌクレアーゼIのバリアント。
- (a)ウシ膵臓デオキシリボヌクレアーゼIのバリアントをコードする塩基配列を含有したベクターを供給する工程、
(b)前記(a)のベクターを用いて微生物宿主株を形質転換する工程、
(c)栄養素を含む増殖培地中で、前記(b)で得られた形質転換微生物宿主株を培養し、それにより、該微生物宿主株が、ウシ膵臓デオキシリボヌクレアーゼIのバリアントを発現する工程、及び
(d)微生物宿主株及び/又は増殖培地からウシ膵臓デオキシリボヌクレアーゼIのバリアントを精製する工程
を含む、請求項1〜5いずれか1項に記載のウシ膵臓デオキシリボヌクレアーゼIのバリアントの製造方法。 - (a)ベクターは、ウシ膵臓デオキシリボヌクレアーゼIとシグナルペプチドとからなるプレタンパク質をコードする塩基配列を含有し、
(b)微生物宿主株は、メチロトローフ酵母株であり、
(c)増殖培地は、炭素源としてメタノールを含み、
(d)メチロトローフ酵母株は、ウシ膵臓デオキシリボヌクレアーゼIのバリアントを発現し、分泌し、
(e)ウシ膵臓デオキシリボヌクレアーゼIのバリアントは、増殖培地から精製される
ものである、請求項6記載の方法。 - シグナルペプチドが、ウシ膵臓デオキシリボヌクレアーゼIのバリアントの1番目のアミノ酸に直接隣接して位置するシグナルペプチダーゼ切断部位を含む、請求項7記載の方法。
- 発現されたプレタンパク質のアミノ酸配列が、(a)配列番号:8、
(b)配列番号:9、及び
(c)配列番号:10
からなる群より選ばれたものである、請求項7又は8記載の方法。 - ウシ膵臓デオキシリボヌクレアーゼIのバリアントをコードする塩基配列が、配列番号:3である、請求項7〜9いずれか1項に記載の方法。
- プレタンパク質をコードする塩基配列が、ウシ膵臓デオキシリボヌクレアーゼIのバリアントをコードする塩基配列に融合したシグナルペプチドをコードする塩基配列からなるものである、請求項7〜10いずれか1項に記載の方法。
- プレタンパク質をコードする塩基配列が、プロモーター又はプロモーターエレメントに作動可能に連結されたものである、請求項7〜11いずれか1項に記載の方法。
- ウシ膵臓デオキシリボヌクレアーゼIのバリアントとシグナルペプチドとからなるプレタンパク質をコードし、配列番号:11のPichia pastorisAOX1プロモーター又はそのプロモーターエレメントと作動可能に連結した塩基配列を含み、ここで、該プレタンパク質をコードする塩基配列が、配列番号:3と融合した配列番号:6又は7である染色体を有するPichia pastoris株。
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