【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は物品および人物等個体の確認をするための、生体情報を用いる認証技術に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
現代世界では、物品の製造においても、芸術品の世界においても、あるいは人物等個体の確認においても、真偽の立証が必要な場面が多く存在している。そのために物品等認証の市場は世界でも急速に増大してきている。物品の製造及び芸術の世界での認証は物品認証技術が必要になり、人物等個体の確認においては、いわゆる本人認証技術が必要とされる。
【０００３】
物品認証が必要なものとしては、クレジットカードや紙幣をはじめとする有価証券、パスポート等政府発行証明書類、ブランド製品やグッズ、飼料等の食品、工業用・科学用・農業用の化学品、医療用機械器具及び医療用品、貴金属製品、玩具・遊戯用具・運動用具、自動車等の乗り物その他移動用の装置及びその部品、芸術作品等幅広い分野の物品がある。
【０００４】
人物等個体の確認が必要なものとは、人、イヌ・ネコ等のペット、家畜やその他の動物、植物がある。
【０００５】
本人認証法としては、ＩＤカード・パスワード・鍵・身分証明書等のような非生体情報による方法と、生体情報を用いた方法に大きく分けられる。生体情報を用いた本人認証法としてはバイオメトリクスがある。バイオメトリクスは自分の体の一部を鍵とすることから、本人しか持ち得ず、ＩＤカード・パスワード・鍵・身分証明書等のように忘れたり紛失したり、他人に偽造・変造・コピーされてしまうということはないという特長がある。バイオメトリクスは人それぞれに固有な生体情報を用いた本人認証法で、利用されるのは生体情報なので、上記の他人による偽造・変造・コピー等は非常に困難で、また、個人保有のものなので忘れたり紛失したりすることはない。バイオメトリクス認証は「身体的特徴もしくは行動様式で人を自動的に認識する」方法で、主に、指紋、掌形、顔、網膜、眼球の虹彩（アイリス）、声、サイン（筆跡）等が用いられている。その他の方法としては、耳形状、キーストローク、手の甲の血管パターン、におい、ＤＮＡがある。
【０００６】
ＤＮＡ認証法は、本人認証及び物品認証に用いることができる。たとえば、真偽を立証したい物品の標識（特許文献１を参照）がある。この他にも関連するものとして、公開鍵暗号方法及びその装置（特許文献２を参照）、遺伝子情報のセキュリティ管理方法及びそのシステムとプログラム（特許文献３を参照）、遺伝子情報利用システム、及びＩＤカード等（特許文献４を参照）がある。このほかに、特許文献５、特許文献６、特許文献７等がある。
【０００７】
具体的には、株式会社アイ・ディ・テクニカは、ＤＮＡの混入したインキ（ＤＮＡインキ）を直径１／８インチの円形の目に見えないマークとして印刷し、発光性化学物質のスペクトラムの特性を読めるマイクロプロセッサーが制御するスキャナー、デコーダーによって認識するシステムを開発している。更に、同社は消費者がインターネット上で物品認証局に真偽鑑定データを問い合わせることにより、消費者が購入する商品の真偽鑑定を行うシステムの構築に関する物品のＤＮＡデータを利用したビジネスモデル特許を出願している（特許文献８を参照）。
【０００８】
ドイツのノーベンバーＡＧ社も、ＤＮＡを用いた真贋判定技術を開発している。これはある配列を持った合成ＤＮＡを、商品に貼付する純正品証書にあらかじめ入れておき、それに対する相補的な配列のプローブＤＮＡを用いて瞬時に鑑別する技術である（特許文献９を参照）。
【０００９】
【特許文献１】特許番号第２７２６８７７号
【００１０】
【特許文献２】特開２００１−２１１１７２
【００１１】
【特許文献３】特開２００２−２１５０２８
【００１２】
【特許文献４】特開２００２−１７５２８０
【００１３】
【特許文献５】ＵＳ５３６０６２８
【００１４】
【特許文献６】ＵＳ５５９９５７８
【００１５】
【特許文献７】ＵＳ５６４３７２８
【００１６】
【特許文献８】特開２００２−１４０４４９
【００１７】
【特許文献９】特表２００２−５０６６５４
【００１８】
【発明が解決しようとする課題】
従来のＤＮＡ認証法では、用いるＤＮＡは、各個人のＤＮＡそのものか、もしくは、そこから認証用途に用いやすいように必要な部分を選別して合成する等して作製したＤＮＡである。しかし、認証用途にＤＮＡを使用するには通常のＤＮＡではその安定性（熱、光、ｐＨ等）の点で不充分で実際に使用するには困難である。本発明では、物品認証及び本人認証において重要な、認証用途に適した安定な核酸、特に認証用途に適した安定なＤＮＡを提供するものである。これまで多くのＤＮＡ認証技術が開発されてきたが、この点に着目した技術は皆無である。
【００１９】
【課題を解決するための手段】
ＤＮＡ認証技術の用途としては、クレジットカードや紙幣をはじめとする有価証券、パスポート等政府発行証明書類、ブランド製品やグッズ、飼料等の食品、工業用・科学用・農業用の化学品、医療用機械器具及び医療用品、貴金属製品、玩具・遊戯用具・運動用具、自動車等の乗り物その他移動用の装置及びその部品芸術作品等幅広い分野の物品や本人認証に活用できる。本発明者らは、このような数多くの用途に使用するために必要な、ＤＮＡの安定化技術の構築を目指し、鋭意検討を重ねた結果、アプタマー構造をとった核酸、チミンダイマーを生成しない配列である核酸、ペプチド核酸及びＺ型ＤＮＡが、上記目的を満たし得るものであることを確認し、本発明を完成するに至った。
【００２０】
すなわち、本発明は安定な構造を有する認証用途に用いられる核酸に関する。好ましい態様は、前記核酸がアプタマー、特にＤＮＡアプタマーである。別の好ましい態様は、チミンダイマーを生成しない配列のＤＮＡである。また、別の好ましい態様は、ペプチド核酸である。さらに別の好ましい態様は、Ｚ型ＤＮＡである。
【００２１】
【発明の実施の形態】
以下に本発明を詳述する。まず、本発明を説明する上で用いられる用語を説明する。
【００２２】
本発明でいう「安定な構造を有する」とは、３７℃の暗室で３ヶ月放置したときに、９５％以上が分解しないで残っていることをいう。「認証用途に用いられる核酸」とは、認証用途に用いられる物質がＤＮＡ又はＲＮＡ等の核酸ということである。「アプタマー」とは、ある分子に特異的に結合する核酸のことで、ＤＮＡとＲＮＡを区別せず「アプタマー」と呼ぶ（「遺伝子化学」（杉本直己、化学同人））。アプタマーは特定の二次構造をとることが多く、「ヘアピン」、「バルジ」、「シュードノット」、「グアニンカルテット」の構造をとることが知られている。「チミンダイマー」とは、紫外線で形成される、ＤＮＡ中の隣り合った、２個のチミン残基又はシトシン残基であるピリミジン塩基間に共有結合で形成されるダイマー分子のことである（ワトソンら、細胞の分子生物学（第３版）ニュートンプレス）。従って、チミンダイマーを生成しない配列である核酸とは、２個のピリミジン塩基が並んだ配列が存在しない核酸配列ということである。 「ペプチド核酸」とは、ペプチド骨格に核酸塩基をもつ分子で、具体的には２−アミノエチルグリシンを骨格単位とし、これにメチレンカルボニル基を介して核酸塩基を結合させた構造をもった化合物である（図１）。コペンハーゲン大学のニールセンらのグループが１９９１年に報告した（ニールセンら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２５４：１４９７（１９９１）；特許番号第２７５８９８８号）。一般的に、ペプチド核酸は広い範囲のｐＨ域で安定で、核酸分解酵素やタンパク質分解酵素にも安定である。「Ｚ型ＤＮＡ」とは、左巻き二重らせんとして存在するＤＮＡ構造で、リン酸‐糖骨格が左巻きのジグザグ状になっている。DNA分子は常温で中性の水溶液中では、Ｂ型の二重らせん構造をとる。これは生物の体の中に存在する最も一般的な形である。これに対して、Ｚ型はポリ[d(TG）・d(CA)]等のように、プリン・ピリミジン交互の配列をもったＤＮＡ２本鎖を、高塩濃度水溶液中などの右巻きらせんのねじれをほどいてしまうような環境においた時に形成される左巻きのらせん状構造である。
【００２３】
認証用途にＤＮＡを使用するには、従来認証用途に用いられてきたような通常のＤＮＡでは、その安定性（熱、光、ｐＨ等）の点で不充分で実際に使用するには困難である。認証用途に使用可能な、熱、光、ｐＨ等に対して安定な核酸を探索した結果、驚くべきことに、アプタマー、好ましくは、ＤＮＡアプタマー、チミンダイマーを生成しない配列であるＤＮＡ、ペプチド核酸そしてＺ型ＤＮＡが認証用途に用いられる核酸として望ましいことがわかった。
【００２４】
二本鎖ＤＮＡの熱変性については、ＧＣ含量の高い方が安定であると報告されている（マーマーら、Ｎａｔｕｒｅ、１８３：１４２７（１９５９））ので、認証用途に用いる核酸についても、できる限りＧＣ含量が高いことが望ましいといえる。また、ＤＮＡは一本鎖ＤＮＡよりも、その相補鎖ＤＮＡと水素結合により結合した二本鎖ＤＮＡの方が種々の安定性が高いことが知られているので、認証用途にＤＮＡを使用するにおいても、二本鎖ＤＮＡで使用することが望ましい。
【００２５】
安定性試験は、熱については、３７℃で数ヶ月間、好ましくは1年間安定であることを指標に実施すればよい。あるいは、７０℃で１０分間、好ましくは９０℃で１０分間安定であることを指標に実施すればよい。光については、太陽光及び紫外線照射実験を行い、それに対する安定性を指標に実施すればよい。ｐＨについては、ＤＮＡが一般にアルカリに対して耐性があり、ＲＮＡの場合は酸耐性であることが知られている。従ってＤＮＡの場合は弱酸存在化での安定性を、ＲＮＡの場合は弱アルカリ存在下での安定性を指標に実施すればよい。核酸分解酵素やタンパク質分解酵素にも安定であることと、熱についての安定性を同時に簡便に評価するには、３７℃で３ヶ月間安定であることを見ればよい。
【００２６】
核酸が安定であることの指標としては、ＤＮＡシークエンサーでＤＮＡの塩基配列を分析し、正常に分析できることと、電気泳動分析し、目的の核酸のバンドが単一であることを指標に行う。ＲＮＡの場合は逆転写酵素でＤＮＡに逆転写してからＤＮＡシークエンサーで同様に塩基配列を分析する。
【００２７】
認証用途に用いられる核酸は、ＤＮＡ合成機で合成するかマニュアルで合成することにより行う方法と、遺伝子工学的手法、すなわち、大腸菌等の微生物にプラスミドを導入して作製する方法とがある。この方法では、目的の認証用途に用いられるＤＮＡを含むプラスミドを作製し、微生物へ導入し、微生物を培養することによって、目的のプラスミドを増幅し、適当な制限酵素等で目的のＤＮＡを切出すことによるものである。目的の核酸がＲＮＡの場合は、まず、上述の通りＤＮＡを作製し、そのＤＮＡをＲＮＡポリメラーゼでＲＮＡに返還することにより得られる。
【００２８】
このように認証用途に用いられる核酸の安定性を評価して、過酷な条件下でも使用可能な安定な認証用核酸を見出すことができる。
【００２９】
このようにして、アプタマー、好ましくは、ＤＮＡアプタマー、チミンダイマーを生成しない配列であるＤＮＡ、ペプチド核酸そしてＺ型ＤＮＡが認証用途に用いられる核酸として望ましい。
【００３０】
なお、これら認証用途に用いられる核酸の配列の長さに関して、ペプチド核酸の場合、ペプチドモノマーを使用して合成できるが、純度、品質、収量の点から、１８mer以下が好ましい。アプタマー、チミンダイマーを生成しない配列であるＤＮＡ、ペプチド核酸そしてＺ型ＤＮＡの場合では、より良い安定性の点から、１５０mer以下が好ましい。
【００３１】
上記の核酸を、クレジットカードや紙幣をはじめとする有価証券、パスポート等政府発行証明書類、ブランド製品やグッズ、飼料等の食品、工業用・科学用・農業用の化学品、医療用機械器具及び医療用品、貴金属製品、玩具・遊戯用具・運動用具、自動車等の乗り物その他移動用の装置及びその部品芸術作品等幅広い分野の物品にシールするかまたは素材に練り込むことにより認証用途に用いることができる。具体的には、上記の核酸そのものを用いた場合には、核酸の配列を同定することにより認証できるし、上記の核酸に蛍光ラベル等の標識をした場合は、その標識を検出することでも認証できる。
【００３２】
【実施例】
以下、本発明における認証用核酸についてさらに具体的に説明する。本発明は以下の実施例によって限定されるものではない。
【００３３】
（実施例１）
文献（ウイルソンら、Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ＆ Ｂｉｏｌｏｇｙ、５：６０９（１９９８））に従い、色素であるスルフォローダミンＢを認識できるＤＮＡアプタマーである配列１のＤＮＡをＤＮＡ合成機（アプライドバイオシステムズ社製モデル３９４）を用いて合成した。配列２のＤＮＡは、配列１のＤＮＡのアデニン、グアニン、シトシン、チミンの塩基をそれぞれの塩基の総数と同じにして全くランダムに配置したものである。配列１及び配列２は、１回のＤＮＡ合成では難しい長鎖のＤＮＡであるので、４本の合成ＤＮＡの酵素的連結によるＤＮＡの合成方法（大塚ら、新生化学実験講座２．核酸III、東京化学同人）を用いて二本鎖ＤＮＡを作製後、一本鎖に分離して作製した。配列１、配列２のＤＮＡを作製後、ＴＥ緩衝液（１０ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ７．５)、１ｍＭエチレンジアミン四酢酸三ナトリウム）に溶解し、３７℃で３ヶ月間処理した群（Ａ群）と２０℃で１０分間処理した対照群（Ｂ群）について、ＤＮＡシークエンサーでＤＮＡの塩基配列の分析と電気泳動分析を行い、核酸分解酵素やタンパク質分解酵素に対する安定性及び熱についての安定性を評価した。結果は、Ｂ群が配列１及び配列２共に、塩基配列分析では正常に分析ができ、正常な塩基配列が得られた。電気泳動分析での判定は、単一のバンドが得られた。一方、Ａ群では、配列１については、Ｂ群と同様の結果が得られたのに対して、配列２では、塩基配列分析では複数の配列が混在しており、しかも目的の配列は収量的にも低下していた。また、電気泳動分析でも、目的のバンドの他に低分子化した複数のバンドが認められた。これらのことより、配列２に対して、配列１は、ＤＮＡだけを分解するデオキシリボヌクレアーゼ、ＲＮＡだけを分解するリボヌクレアーゼ及びＤＮＡ、ＲＮＡ両方を分解するヌクレアーゼからなる核酸分解酵素や、ペプチド結合の加水分解を触媒する酵素であるセリンプロテアーゼ等のタンパク質分解酵素に対する安定性及び熱についての安定性を有しており、認証用途に用いる核酸として望ましいことがわかった。
【００３４】
（実施例２）
文献（ニールセンら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２５４：１４９７（１９９１）；ニールセンら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、２１：１９７（１９９３）；チェルニーら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９０：１６６７（１９９３））に従い、ペプチド合成機を用い、Ｆｍｏｃ法にて、ペプチド核酸モノマー（ＰＮＡ Ｆｍｏｃ−Ａ−ＯＨ、ＰＮＡ Ｆｍｏｃ−Ｃ−ＯＨ、ＰＮＡ Ｆｍｏｃ−Ｇ−ＯＨ、ＰＮＡ Ｆｍｏｃ−Ｔ−ＯＨ；アプライドバイオシステムズ社）を用い配列３のペプチド核酸を合成した。配列３のペプチド核酸の対照となるＤＮＡである配列４はＤＮＡ合成機で合成作製した。
【００３５】
配列３、配列４を作製後、ＴＥ緩衝液（１０ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ７．５）、１ｍＭエチレンジアミン四酢酸三ナトリウム）に溶解し、３７℃で３ヶ月間処理した群（Ａ群）と２０℃で１０分間処理した対照群（Ｂ群）について、電気泳動分析で判定したところ、Ｂ群については、配列３、配列４共に、単一のバンドが得られた。一方、Ａ群では、配列３については、Ｂ群と同様に単一のバンドが得られたのに対して、配列４では、電気泳動分析で、目的のバンドの他に低分子化した複数のバンドが認められた。これらのことより、配列４に対して、配列３は、核酸分解酵素やタンパク質分解酵素に対する安定性及び熱についての安定性を有しており、認証用途に用いる核酸として望ましいことがわかった。
【００３６】
【発明の効果】
本発明により、アプタマー構造をとった核酸、チミンダイマーを生成しない配列である核酸、ペプチド核酸及びＺ型ＤＮＡを用いて、物品認証及び本人認証において重要な、認証用途に適した安定な核酸を提供できる。
【００３７】
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、ペプチド核酸の構造を示した図である。[0001]
TECHNICAL FIELD OF THE INVENTION
The present invention relates to an authentication technique using biological information for confirming an individual such as an article and a person.
[0002]
[Prior art]
In the modern world, there are many situations in which authenticity is required in the manufacture of articles, in the art world, or in the identification of individuals such as persons. For this reason, the market for the certification of articles and the like is rapidly increasing in the world. Product authentication and authentication in the art world require an article authentication technology, and identification of individuals such as persons requires a so-called identity authentication technology.
[0003]
Items requiring product certification include securities such as credit cards and banknotes, government-issued certificates such as passports, branded products and goods, foodstuffs such as feed, chemicals for industrial, scientific and agricultural use, and medical care. There are a wide range of articles such as machinery and equipment for medical use, precious metal products, toys, play equipment, sports equipment, vehicles such as automobiles and other moving devices and their parts, and works of art.
[0004]
Those requiring confirmation of individuals such as humans include humans, pets such as dogs and cats, livestock and other animals, and plants.
[0005]
Personal authentication methods can be broadly divided into methods using non-biological information such as ID cards, passwords, keys, and identification cards, and methods using biological information. There is biometrics as an authentication method using biometric information. Since biometrics uses a part of one's body as a key, it can be held only by the person himself, and can be forgotten or lost like an ID card, password, key, ID card, or forged, altered or copied by another person. There is a feature that it does not happen. Biometrics is a personal authentication method that uses biometric information unique to each person.Because biometric information is used, it is very difficult to forge, falsify, copy, etc. by the above-mentioned others, and since it is owned by individuals, It will not be forgotten or lost. Biometrics authentication is a method of “automatically recognizing a person by physical characteristics or behavioral styles”, and mainly includes fingerprints, palms, faces, retina, iris (iris) of eyes, voice, signature (handwriting), etc. Used. Other methods include ear shapes, keystrokes, hand vascular patterns, smells, and DNA.
[0006]
The DNA authentication method can be used for personal authentication and article authentication. For example, there is a sign of an article whose authenticity is to be proved (see Patent Document 1). Other related items include a public key encryption method and a device thereof (see Patent Document 2), a security management method and a system and a program for genetic information (see Patent Document 3), a genetic information utilization system, and an ID. There are cards and the like (see Patent Document 4). In addition, there are Patent Document 5, Patent Document 6, Patent Document 7, and the like.
[0007]
Specifically, I-D-Technica Co., Ltd. prints an ink containing DNA (DNA ink) as a circular invisible mark of 1/8 inch in diameter to show the characteristics of the spectrum of the luminescent chemical substance. We are developing a system that recognizes by scanners and decoders controlled by a readable microprocessor. In addition, the company has issued a business model patent that uses DNA data of goods related to the construction of a system that allows consumers to check the authenticity of goods purchased by consumers by inquiring the certification authority on the Internet for authenticity data. An application has been filed (see Patent Document 8).
[0008]
Germany's November AG has also developed an authentication technology using DNA. This is a technique in which a synthetic DNA having a certain sequence is put in advance in a genuine article certificate to be attached to a product, and instantaneous discrimination is performed using a probe DNA having a sequence complementary to the DNA (see Patent Document 9). .
[0009]
[Patent Document 1] Japanese Patent No. 2726877
[Patent Document 2] JP-A-2001-212172
[0011]
[Patent Document 3] JP-A-2002-215028
[0012]
[Patent Document 4] JP-A-2002-175280
[0013]
[Patent Document 5] US5360628
[0014]
[Patent Document 6] US5599578
[0015]
[Patent Document 7] US5643728
[0016]
[Patent Document 8] JP-A-2002-140449
[0017]
[Patent Document 9] JP-T-2002-506654
[0018]
[Problems to be solved by the invention]
In the conventional DNA authentication method, the DNA to be used is DNA of each individual or DNA prepared by selecting and synthesizing a necessary portion from the individual DNA so that it can be easily used for authentication. However, in order to use DNA for authentication, ordinary DNA is insufficient in stability (heat, light, pH, etc.) and is difficult to actually use. An object of the present invention is to provide a stable nucleic acid suitable for authentication use, particularly a stable DNA suitable for authentication use, which is important in article authentication and personal authentication. Many DNA authentication technologies have been developed so far, but no technology has focused on this point.
[0019]
[Means for Solving the Problems]
Applications of DNA authentication technology include securities such as credit cards and banknotes, government-issued certificates such as passports, brand products and goods, foodstuffs such as feed, chemicals for industrial, scientific and agricultural uses, and medical uses. It can be used for goods and personal authentication in a wide range of fields, such as machinery and medical supplies, precious metal products, toys, play equipment, sports equipment, vehicles such as automobiles, and other moving devices and their art works. The present inventors have conducted intensive studies with the aim of constructing a DNA stabilization technique required for use in such a large number of applications, and as a result of conducting intensive studies, a nucleic acid having an aptamer structure and a sequence not producing a thymine dimer It has been confirmed that the nucleic acid, peptide nucleic acid and Z-type DNA satisfying the above objects can be achieved, and the present invention has been completed.
[0020]
That is, the present invention relates to a nucleic acid having a stable structure and used for authentication. In a preferred embodiment, the nucleic acid is an aptamer, especially a DNA aptamer. Another preferred embodiment is a DNA having a sequence that does not produce a thymine dimer. Another preferred embodiment is a peptide nucleic acid. Yet another preferred embodiment is a Z-type DNA.
[0021]
BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION
Hereinafter, the present invention will be described in detail. First, terms used in describing the present invention will be described.
[0022]
The expression "having a stable structure" in the present invention means that 95% or more remains without decomposition when left in a dark room at 37 ° C for 3 months. The term “nucleic acid used for authentication use” means that the substance used for authentication use is a nucleic acid such as DNA or RNA. An “aptamer” is a nucleic acid that specifically binds to a certain molecule, and is called an “aptamer” without distinguishing between DNA and RNA (“genochemistry” (Naoki Sugimoto, Chemical Doujin)). Aptamers often have a specific secondary structure, and are known to have “hairpin”, “bulge”, “pseudoknot”, and “guanine quartet” structures. A "thymine dimer" is a dimer molecule formed by the covalent bond between two adjacent thymine or cytosine pyrimidine bases in DNA formed by ultraviolet light (Watson). Et al., Molecular Biology of Cells (Third Edition, Newton Press). Therefore, a nucleic acid having a sequence that does not produce a thymine dimer is a nucleic acid sequence having no sequence in which two pyrimidine bases are arranged. “Peptide nucleic acid” is a molecule having a nucleobase in the peptide skeleton, specifically, a compound having a structure in which 2-aminoethylglycine is used as a skeleton unit and a nucleobase is bonded to the nucleobase via a methylenecarbonyl group. (FIG. 1). A group of Nielsen et al. Of the University of Copenhagen reported in 1991 (Nielsen et al., Science, 254: 1497 (1991); Patent No. 2758988). In general, peptide nucleic acids are stable over a wide pH range, and are also stable to nucleases and proteolytic enzymes. "Z-type DNA" is a DNA structure that exists as a left-handed double helix, in which the phosphate-sugar skeleton has a left-handed zigzag shape. DNA molecules adopt a B-type double helical structure in a neutral aqueous solution at room temperature. This is the most common form that exists in the body of an organism. On the other hand, the Z-type is a double-stranded DNA having an alternate sequence of purines and pyrimidines, such as poly [d (TG) / d (CA)], which is formed in a right-handed spiral such as in a high salt concentration aqueous solution. It is a left-handed helical structure that is formed when exposed to an environment that untwists.
[0023]
In order to use DNA for authentication, ordinary DNA, which has been conventionally used for authentication, is insufficient in stability (heat, light, pH, etc.) and difficult to use in practice. is there. As a result of searching for nucleic acids that are stable to heat, light, pH, etc., which can be used for authentication applications, surprisingly, aptamers, preferably DNA aptamers, DNAs that are sequences that do not produce thymine dimers, peptide nucleic acids, and It has been found that Z-type DNA is desirable as a nucleic acid used for authentication purposes.
[0024]
Regarding the thermal denaturation of double-stranded DNA, it is reported that the higher the GC content is, the more stable it is (Marmer et al., Nature, 183: 1427 (1959)). It can be said that a high content is desirable. Further, it is known that double-stranded DNA bonded to its complementary DNA by hydrogen bonding has higher stability than single-stranded DNA. Also, it is desirable to use double-stranded DNA.
[0025]
The stability test may be carried out using heat as an indicator that the heat is stable at 37 ° C. for several months, preferably one year. Alternatively, the measurement may be performed with reference to stability at 70 ° C. for 10 minutes, preferably at 90 ° C. for 10 minutes. For light, sunlight and ultraviolet irradiation experiments may be performed, and the stability may be used as an index. Regarding pH, it is known that DNA is generally resistant to alkali and RNA is acid-resistant. Therefore, in the case of DNA, the stability in the presence of a weak acid may be used as an index, and in the case of RNA, the stability in the presence of a weak alkali may be used as an index. In order to easily and simultaneously evaluate stability to nucleases and proteases and stability to heat, it is sufficient to see that the enzyme is stable at 37 ° C. for 3 months.
[0026]
As an indicator of the stability of the nucleic acid, the base sequence of the DNA is analyzed using a DNA sequencer and the DNA can be analyzed normally, and electrophoretic analysis is performed, and the target nucleic acid has a single band as an index. In the case of RNA, the DNA is reverse transcribed with reverse transcriptase, and the nucleotide sequence is similarly analyzed using a DNA sequencer.
[0027]
Nucleic acids used for authentication are classified into a method of synthesizing with a DNA synthesizer or manual synthesis, and a method of genetic engineering, that is, a method of introducing a plasmid into a microorganism such as Escherichia coli. In this method, a plasmid containing DNA used for the intended authentication purpose is prepared, introduced into a microorganism, and the microorganism is cultured to amplify the desired plasmid and cut out the desired DNA with an appropriate restriction enzyme or the like. It is because of that. When the target nucleic acid is RNA, it is obtained by first preparing DNA as described above, and then converting the DNA to RNA with RNA polymerase.
[0028]
As described above, the stability of the nucleic acid used for authentication can be evaluated to find a stable nucleic acid for authentication that can be used even under severe conditions.
[0029]
Thus, aptamers, preferably DNA aptamers, DNAs that do not produce thymine dimers, peptide nucleic acids and Z-type DNAs are desirable as nucleic acids used for authentication applications.
[0030]
Regarding the length of the sequence of the nucleic acid used for these authentication applications, in the case of a peptide nucleic acid, it can be synthesized using a peptide monomer, but is preferably 18 mer or less from the viewpoint of purity, quality and yield. In the case of DNA, peptide nucleic acid, and Z-type DNA which are sequences that do not produce aptamers and thymine dimers, 150 mer or less is preferable from the viewpoint of better stability.
[0031]
The nucleic acids described above can be used for securities such as credit cards and banknotes, government-issued certificates such as passports, brand products and goods, foodstuffs such as feed, chemicals for industrial / scientific / agricultural use, medical equipment It can be used for certification purposes by sealing or kneading into a wide range of articles such as medical supplies, precious metal products, toys, play equipment, sports equipment, vehicles such as automobiles and other moving devices and their art works. it can. Specifically, when the above-described nucleic acid itself is used, authentication can be performed by identifying the sequence of the nucleic acid. When the above-described nucleic acid is labeled with a fluorescent label or the like, authentication can be performed by detecting the label. it can.
[0032]
【Example】
Hereinafter, the authentication nucleic acid according to the present invention will be described more specifically. The present invention is not limited by the following examples.
[0033]
(Example 1)
According to the literature (Wilson et al., Chemistry & Biology, 5: 609 (1998)), the DNA of sequence 1 which is a DNA aptamer capable of recognizing sulfoldamine B as a dye was converted to a DNA synthesizer (Model 394 manufactured by Applied Biosystems). And synthesized. The DNA of Sequence 2 is obtained by arranging the bases of adenine, guanine, cytosine, and thymine of the DNA of Sequence 1 at random with the same total number of bases. Since sequence 1 and sequence 2 are long-chain DNAs that are difficult to synthesize in one DNA synthesis, a method for synthesizing DNA by enzymatic ligation of four synthetic DNAs (Otsuka et al., Shinsei Chemistry Laboratory Course 2. Nucleic Acid III, Tokyo, Japan) Double stranded DNA was prepared using Chemical Doujin Corporation) and then separated into single stranded DNA. After preparing DNAs of Sequences 1 and 2, the DNA was dissolved in TE buffer (10 mM Tris-HCl (pH 7.5), 1 mM trisodium ethylenediaminetetraacetate) and treated at 37 ° C. for 3 months (group A). With respect to the control group (group B) treated at 20 ° C. for 10 minutes, the DNA sequencer was used to analyze the base sequence of the DNA and electrophoretic analysis, and the stability to nuclease and protease and the stability to heat were evaluated. . As a result, both sequence 1 and sequence 2 of group B were successfully analyzed by nucleotide sequence analysis, and a normal nucleotide sequence was obtained. A single band was obtained by electrophoretic analysis. On the other hand, in group A, the same results as in group B were obtained for sequence 1, whereas in sequence 2, a plurality of sequences were mixed in the base sequence analysis, and the target sequence was not Had also dropped. In addition, in electrophoresis analysis, a plurality of low molecular weight bands were observed in addition to the target band. From these facts, in contrast to Sequence 2, Sequence 1 is a nuclease consisting of a deoxyribonuclease that degrades only DNA, a ribonuclease that degrades only RNA and a nuclease that degrades both DNA and RNA, and hydrolysis of peptide bonds. It has stability against proteolytic enzymes such as serine protease, which is an enzyme that catalyzes, and stability against heat, and was found to be desirable as a nucleic acid used for authentication applications.
[0034]
(Example 2)
According to the literature (Nielsen et al., Science, 254: 1497 (1991); Nielsen et al., Nucleic Acids Res., 21: 197 (1993); Chelney et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 1667 (1993)). Peptide nucleic acid monomers (PNA Fmoc-A-OH, PNA Fmoc-C-OH, PNA Fmoc-G-OH, PNA Fmoc-T-OH; Applied Biosystems) using a peptide synthesizer and Fmoc method. The peptide nucleic acid of sequence 3 was synthesized using the above. Sequence 4, which is DNA serving as a control for the peptide nucleic acid of sequence 3, was synthesized and prepared using a DNA synthesizer.
[0035]
After preparing Sequences 3 and 4, they were dissolved in TE buffer (10 mM Tris-hydrochloric acid (pH 7.5), 1 mM trisodium ethylenediaminetetraacetate) and treated at 37 ° C. for 3 months (Group A) and 20 ° C. As a result of electrophoretic analysis, a single band was obtained for both sequence 3 and sequence 4 for the control group (group B) treated for 10 minutes. On the other hand, in group A, a single band was obtained for sequence 3 as in group B, whereas in sequence 4, a plurality of low molecular weight molecules were obtained in addition to the target band by electrophoretic analysis. A band was observed. From these facts, it was found that, as compared with Sequence 4, Sequence 3 has stability against nucleases and proteolytic enzymes and stability against heat, and is therefore desirable as a nucleic acid used for authentication.
[0036]
【The invention's effect】
According to the present invention, a stable nucleic acid suitable for authentication use, which is important in article authentication and personal authentication, is provided by using a nucleic acid having an aptamer structure, a nucleic acid that does not produce a thymine dimer, a peptide nucleic acid, and a Z-type DNA. it can.
[0037]
[Sequence list]
[Brief description of the drawings]
FIG. 1 is a diagram showing the structure of a peptide nucleic acid.
