JP2004175727A

JP2004175727A - New antimicrobial polypeptide and utilization thereof

Info

Publication number: JP2004175727A
Application number: JP2002344538A
Authority: JP
Inventors: Hiroki Koma; 寛紀高麗; Takuya Maeda; 拓也前田; Hideaki Nagamune; 秀明長宗; Naoko Kobayashi; 菜穂子小林
Original assignee: Toagosei Co Ltd
Current assignee: Toagosei Co Ltd
Priority date: 2002-11-27
Filing date: 2002-11-27
Publication date: 2004-06-24
Anticipated expiration: 2022-11-27
Also published as: JP4154218B2

Abstract

<P>PROBLEM TO BE SOLVED: To provide an antimicrobial polypeptide having an amino acid sequence different from that of a peptide present and functioning as an antimicrobial peptide in the natural world without depending on a conventional developing approach to the antimicrobial peptide by substituting an amino acid of a well-known antimicrobial peptide. <P>SOLUTION: The antimicrobial peptide exhibiting high antimicrobial activities and having a wide antimicrobial spectrum against Gram-positive bacillus, Gram-negative bacillus and chemical-resistant bacteria such as MRSA can be achieved by incorporating characteristics of having a sequence part comprising basic amino acid residues at two sites in the peptide molecule, and hydrophobicity at both terminals of the peptide into the molecular design. <P>COPYRIGHT: (C)2004,JPO

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は抗菌性ペプチドおよび当該抗菌性ペプチドの設計に関する。
【０００２】
【従来の技術】
抗菌性ペプチドは幅広い抗菌スペクトルを有し、薬剤耐性菌が出現し難いと考えられていることから、ヒトおよび動物の細菌感染性疾患の予防や治療、或いは、食材などの物品に抗菌性を付与する目的に抗菌性ペプチドの利用が期待されている。
これまでに多くの抗菌性ペプチドが動植物から単離されている。例えば、タイワンカブトムシ由来の抗菌性ペプチドおよび当該抗菌性ペプチドを有効成分とする抗菌剤が開示されている（例えば特許文献１参照）。
また、サソリ毒由来の抗菌性ペプチドおよび当該抗菌性ペプチドを有効成分とする抗菌剤が開示されている（例えば特許文献２参照）。
上記記載の抗菌性ペプチドは、いずれもリジン、アルギニンおよび／またはヒスチジンなどの塩基性アミノ酸を含むもので、ペプチド分子全体の電荷が正となるカチオン性抗菌性ペプチドと呼ばれるものである。これら抗菌性ペプチドの作用原理は、抗菌性ペプチド中の正に荷電した塩基性アミノ酸部分が菌表面の膜と静電相互作用することによるものと考えられている（例えば、非特許文献１参照）。
上記の各公報に記載の抗菌性ペプチドは、何れも自然界において元々抗菌性ペプチドとして存在していたものを発見し単離したもの（或いは天然型抗菌性ペプチドのアミノ酸配列を一部改変したペプチド）であり、当該抗菌性ペプチドの抗菌活性や抗菌スペクトルを上回る抗菌性能を有するものを開発することは困難である。
【０００３】
○先行文献
【特許文献１】
特開２０００−０６３４００号公報（特許請求の範囲）
【特許文献２】
特開２００１−１８６８８７号公報（特許請求の範囲）
【非特許文献１】
Ｍ．Ｚａｓｌｏｆｆ、「Ｎａｔｕｒｅ」，２００２年，４１５巻，ｐ．３８９−３９５
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、既知の抗菌性ペプチドのアミノ酸残基を置換する従前の抗菌性ペプチドの開発アプローチによらず、自然界において抗菌性ペプチドとして存在し機能しているペプチドとは異なるアミノ酸配列の抗菌性ペプチドを提供することを目的の一つとする。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、鋭意検討した結果、ペプチド分子中に２ヶ所の塩基性アミノ酸残基による配列部を持つこと、およびペプチド両末端が疎水性であるという特徴を抗菌性ペプチドの分子設計に取り入れることで、高い抗菌活性を発揮し、グラム陰性細菌、グラム陽性細菌、およびＭＲＳＡなどの薬剤耐性菌に対して幅広い抗菌スペクトルを有する抗菌性ペプチドを実現できることを見出し、本発明を完成するに至った。
本発明の設計方法によって提供される抗菌性ペプチドは、天然に存在しない人為的に合成された抗菌性ペプチドである。また、本発明によって提供される抗菌性ペプチドをコードするヌクレオチド配列および／または該配列と相補的なヌクレオチド配列を含む（典型的には該配列により実質的に構成される）天然に存在しない人為的に合成されたポリヌクレオチドが提供される。
【０００６】
本発明により、本発明の抗菌性ペプチドを成分として含有する抗菌剤が提供される。典型的には、当該抗菌剤は、用途に応じて、本発明の抗菌性ペプチドの他に製薬上許容される担体を含有する。また、本発明の抗菌性ペプチドをコードするヌクレオチド配列および／または該配列と相補的なヌクレオチド配列を含むか或いはそれら配列により実質的に構成される、天然に存在しない人為的に合成されたポリヌクレオチド（ＤＮＡセグメントまたはＲＮＡセグメントの形態であり得る）が提供される。
【０００７】
【発明の実施の形態】
以下、本発明の実施形態を説明する。
なお、本明細書において特に言及している事項（例えば抗菌性ペプチドの一次構造や鎖長）以外の事柄であって本発明の実施に必要な事柄（例えばペプチド合成、ポリヌクレオチド合成、ペプチドを成分とする薬剤の調製に関するような一般的事項など）は、有機化学、生化学、遺伝子工学、タンパク質工学、分子生物学、薬学、医学などの分野における従来技術に基づく当業者の設計事項として把握され得る。本発明は、本明細書に開示されている内容と当該分野における技術常識とに基づいて実施することができる。なお、以下の説明では、アミノ酸をＩＵＰＡＣ−ＩＵＢガイドラインで示されたアミノ酸に関する命名法に準拠した１文字表記（但し配列表では３文字表記）で表す。
【０００８】
ここで「天然に存在しない人為的に合成された抗菌性ペプチドまたはポリヌクレオチド」とは、そのペプチド鎖またはヌクレオチド鎖（全長）がそれ単独で自然界に存在するものではなく、化学合成或いは生合成（即ち遺伝子工学に基づく生産）によって人為的に製造された抗菌性ペプチドまたはポリヌクレオチドをいう。ここで「ペプチド」とは、複数のペプチド結合を有するアミノ酸ポリマーを指す用語であり、ペプチド鎖に含まれるアミノ酸残基の数によって限定されない。アミノ酸残基数が１０未満の所謂オリゴペプチドも本明細書におけるペプチドに包含される。また、「ポリヌクレオチド」とは、複数のヌクレオチドがリン酸ジエステル結合で結ばれたポリマー（核酸）を指す用語であり、ヌクレオチドの数によって限定されない。種々の長さのＤＮＡフラグメントおよびＲＮＡフラグメントが本明細書におけるポリヌクレオチドに包含される。
【０００９】
○抗菌性ペプチドの設計
１９３５年、Ｄｏｍａｇｋによって開発されたカチオン性界面活性剤である長鎖アルキル基を持つ第４アンモニウム塩が、抗菌剤として優れた特性をもち広く利用されていること、および長鎖アルキル基を持つ第４アンモニウム塩部分を分子内に２ヶ所有するという構造的特徴を持つビス型第４アンモニウム塩化合物が、第４アンモニウム塩を１つ有する化合物と比較して、抗菌力が著しく向上し、環境、ｐＨや温度などの影響に対してもほとんど受けなくなることを基礎にして、本発明の抗菌性ペプチドの設計方法を完成させた。
【００１０】
即ち、抗菌性ペプチドの末端ではない２ヶ所に塩基性アミノ酸残基部を持つこと、この塩基性アミノ酸残基部をつなぐ疎水性および／または中性のアミノ酸残基部（なお、当該塩基性アミノ酸残基部に隣接しないで塩基性アミノ酸残基を有することもある）、およびペプチドの両末端に疎水性のアミノ酸残基部を有するという特徴を抗菌性ペプチドの分子設計に取り入れることで、高い抗菌活性を発揮し、グラム陰性細菌、グラム陽性細菌、およびＭＲＳＡなどの薬剤耐性菌に対して幅広い抗菌スペクトルを有する抗菌性ペプチドを得ることが実現できた。
【００１１】
本発明の抗菌性ペプチドは、ペプチドの末端ではない２ヶ所に、塩基性アミノ酸残基が２個以上連続している部位を含む７〜３０アミノ酸残基の抗菌性ペプチドである。
【００１２】
本発明の抗菌性ペプチドは、塩基性アミノ酸残基が２個以上連続している部位の配列が、同一残基、同一配列または逆配列であり、Ｎ末端およびＣ末端にある疎水性のアミノ酸残基部位が、同一残基、同一配列または逆配列である抗菌性ペプチドである。
【００１３】
本発明の抗菌性ペプチドのアミノ酸配列は、下記式（１）で示されるものである。
Ｄ−（Ｘａ）ｎ１−（Ｘｂ）ｎ２−（Ｘｃ）ｎ３−（Ｘｂ）ｎ２−（Ｘａ）ｎ１−ＣＯ−Ｅ（１）
式（１）のＸａは、それぞれ異なってもよい疎水性のアミノ酸残基を示し、
Ｘｂは、それぞれ異なってもよい塩基性のアミノ酸残基を示し、
Ｘｃは、Ｘｂと隣接しない塩基性のアミノ酸残基を有してもよい、疎水性のアミノ酸残基および／または中性のアミノ酸残基を示し、これらがそれぞれ異なってもよく、
Ｄは、アミノ基、ＮＨＣＨＯ基またはＮＨアシル基を示し、
Ｅは、水酸基またはアミノ基を示し、
ｎ１は１以上の整数であり、ｎ２は２以上の整数であり、ｎ３は１以上の整数である。
【００１４】
式（１）のｎ１は、好ましくは１〜１０であり、更に好ましくは、２〜８である。また、式（１）のｎ２は、好ましくは２〜１２であり、更に好ましくは、２〜１０であり、特に好ましくは２〜８である。また、式（１）のｎ３は、好ましくは１〜１５であり、更に好ましくは２〜１０であり、特に好ましくは２〜８である。
【００１５】
本発明の抗菌性ペプチドにおける塩基性のアミノ酸残基に該当するアミノ酸としては即ち式（１）のＸｂのアミノ酸残基に該当するものとしては、リジン、アルギニンおよびヒスチジンであり、好ましくはリジンおよびアルギニンである。
式（１）のＸｂにおいて、それぞれ異なっていてもよい塩基性のアミノ酸残基とは、連続している部位内におけるアミノ酸配列が異なっていてもよいこと、例えば「ＲＫ」であり、抗菌性ペプチドにおいて２ヶ所にある部位との間でアミノ酸配列が異なっていてもよいこと、例えば「ＲＫ」と「ＫＲ」、「ＨＲ」などのことである。このことは、式（１）のＸａおよびＸｃにおいても同様である。
【００１６】
本発明の抗菌性ペプチドにおける疎水性のアミノ酸残基に該当するアミノ酸としては即ち式（１）のＸａのアミノ酸残基に該当するものとしては、バリン、ロイシン、イソロイシン、フェニルアラニン、トリプトファン、プロリン、グリシン、アラニンおよびメチオニンなどであり、好ましくはバリン、ロイシン、イソロイシン、フェニルアラニンおよびアラニンであり、更に好ましくはバリン、ロイシン、イソロイシンおよびアラニンである。
【００１７】
本発明の抗菌性ペプチドにおける疎水性および／または中性のアミノ酸残基に該当するアミノ酸としては即ち式（１）のＸｃのアミノ酸残基の一部に該当するものとしては、バリン、ロイシン、イソロイシン、フェニルアラニン、トリプトファン、グリシン、アラニン、メチオニン、セリン、トレオニン、システイン、チロシン、アスパラギンおよびグルタミンなどが例示でき、好ましくはバリン、ロイシン、イソロイシン、フェニルアラニン、トリプトファン、グリシン、アラニン、セリン、トレオニンであり、更に好ましくはバリン、トリプトファン、グリシン、アラニン、セリン、トレオニンである。
本発明の抗菌性ペプチドにおける式（１）のＸｃのアミノ酸残基の一部に該当する塩基性のアミノ酸残基に該当するアミノ酸としては、リジン、アルギニンおよびヒスチジンであり、好ましくはリジンおよびアルギニンであり、今まで述べてきたように式（１）のＸｂに隣接することはない。
【００１８】
更に本発明は、ペプチドの末端ではない２ヶ所にある塩基性アミノ酸残基が２個以上連続している部位の配列を同一残基、同一配列または逆配列とし、Ｎ末端およびＣ末端にある疎水性のアミノ酸残基部位の配列を同一残基、同一配列または逆配列とし、ペプチドの末端ではない２ヶ所にある塩基性アミノ酸残基が２個以上連続している部位に挟まれた配列を、当該塩基性アミノ酸残基が２個以上連続している部位と隣接しない塩基性のアミノ酸残基を有してもよい、疎水性のアミノ酸残基および／または中性のアミノ酸残基とする、アミノ酸残基が７〜３０個の抗菌性ペプチドの設計方法である。
【００１９】
本発明の抗菌性ペプチドは、アミノ酸残基としてＬ型アミノ酸および／またはＤ型アミノ酸を用いることができるが、Ｌ型アミノ酸であるものが好ましい。
本発明の抗菌性ペプチドは、抗菌活性を失わない限りにおいて、アミノ酸残基の一部または全部が「抗原」になり難いという観点から直鎖状またはへリックス状のものが好ましい。このような形状のペプチドはエピトープを構成し難い。
【００２０】
かかる観点から、抗菌性ペプチドとしては、直鎖状であり比較的低分子量なものであり、アミノ酸残基数が７〜３０が好ましく、更にアミノ酸残基数が９〜２５のものが好ましく、特にアミノ酸残基数が１０〜２０のものが好ましい。
【００２１】
また、Ｎ末端のアミノ基およびＣ末端のカルボキシル基を化学修飾することもでき、例えば、Ｎ末端のアミノ基のホルミル化またはアシル化であり、Ｃ末端のカルボキシル基のアミド化を行うことが抗菌力を高めることに有効である場合がある。Ｎ末端のアミノ基のアシル化としては、アセチル基、プロピル基、ブチル基などの低級脂肪酸によるもの、または高級脂肪酸によるものでも良く、分岐を有していてもよい。
【００２２】
本発明の抗菌性ペプチドにおいて同一残基とは，例えば２ヶ所にある塩基性アミノ酸残基が２個以上連続する部位において，片方の配列中に存在する塩基性アミノ酸残基の種類と数とが他方と同一のものであり、下記にこの例を示す。
即ち、片方の配列が「ＲＲＫ」であるとき、他方の配列が「ＲＫＲ」であるものである。疎水性のアミノ酸残基の配列においても同様である。
本発明の抗菌性ペプチドにおいて同一配列とは，例えば２ヶ所にある塩基性アミノ酸残基が２個以上連続する部位におけるアミノ酸配列が同一であり、下記にこの例を示す。
即ち、片方の配列が「ＲＲＫ」であるとき、他方の配列が「ＲＲＫ」であるものである。疎水性のアミノ酸残基の配列においても同様である。
本発明の抗菌性ペプチドにおいて逆配列とは，２ヶ所にある塩基性アミノ酸残基が２個以上連続する部位におけるアミノ酸配列が他方と逆配列であり、下記にこの例を示す。
即ち、片方の配列が「ＲＲＫ」であるとき、他方の配列が「ＫＲＲ」であるものである。疎水性のアミノ酸残基の配列においても同様である。
【００２３】
本発明の抗菌性ペプチドは、塩基性アミノ酸残基が２個以上連続している部位の配列が同一残基、同一配列または逆配列であり、好ましくは同一配列または逆配列であり、更に好ましくは逆配列である。またＮ末端およびＣ末端にある疎水性のアミノ酸残基部位は、同一残基、同一配列または逆配列であり、好ましくは同一配列または逆配列であり、更に好ましくは逆配列である。なお、本発明においてアミノ酸残基数の１個程度の増減は、許容される範囲である（但し、式（１）のｎ１、ｎ２およびｎ３の数値が優先する）。
本発明の抗菌性ペプチドは、ペプチド配列が対称型のものが好ましい。この対称型のペプチド配列とは、Ｎ末端側から見た抗菌性ペプチド配列の中心までの配列とＣ末端側から見た抗菌性ペプチド配列の中心までの配列とが同一であるペプチド配列である。例えば、
ＶＬＬＫＲＡＡＲＫＬＬＶ
のような配列をいう。即ち、Ｎ末側からは、「ＶＬＬＫＲＡ」の配列であり、Ｃ末側からは、「ＡＲＫＬＬＶ」の配列であり、ペプチド配列の中心から左右対称となっているものである。なお、アミノ酸残基数が奇数の場合は、中心のアミノ酸残基から左右対称となっているものである。
アミノ酸には、ロイシンをイソロイシンに置換しても同一の性能を示すものがあり、このようなもので置換した配列のものは、同一と見なすことができる。このようなアミノ酸残基の置換は、同一残基、同一配列または逆配列の場合にも適用できる。
【００２４】
置換同一性のアミノ酸としては、
バリンでは、イソロイシン、ロイシン
ロイシンでは、イソロイシン、バリン
イソロイシンでは、ロイシン、バリン
トリプトファンでは、チロシン
セリンでは、トレオニン
トレオニンでは、セリン
アラニンでは、グリシン、セリン
グリシンでは、アラニン
リジンでは、アルギニン
アルギニンでは、リジン
などである。
【００２５】
本発明によって提供される新規なアミノ酸配列の抗菌性ペプチドの具体例として、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４または配列番号５に示されるアミノ酸配列から実質的に構成されるペプチドが挙げられる。これら５種のペプチドは、何れも３０アミノ酸以下（具体的には１１〜１５アミノ酸）で構成されており、直鎖形状を維持するのに好適である。また、免疫原性も低いために抗菌剤の成分（抗菌成分）として好適である。
【００２６】
本発明の抗菌性ペプチドは、一般的な化学合成法に準じて容易に製造することができる。例えば、従来公知の固相合成法または液相合成法のいずれを採用してもよい。アミノ基の保護基としてＢｏｃ（ｔ−ｂｕｔｙｌｏｘｙｃａｒｂｏｎｙｌ）、或いはＦｍｏｃ（９−ｆｌｕｏｒｅｎｙｌｍｅｔｈｏｘｙｃａｒｂｏｎｙｌ）を適用した固相合成法が好適である。
本発明の抗菌性ペプチドは、市販のペプチド合成機（例えば、ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社などから入手可能である。）を用いた固相合成法により、所望するアミノ酸配列、修飾（Ｃ末端アミド化など）部分を有するペプチド鎖を合成することができる。
【００２７】
本発明は、従前の抗菌性ペプチド含有抗菌剤の開発アプローチによらず、自然界において抗菌性ペプチドとして存在し機能しているペプチドとは異なるアミノ酸配列の抗菌性ペプチドおよび該ペプチドをコードするポリヌクレオチドを提供することを目的の一つとする。また、そのような抗菌性ペプチドまたは該ペプチドをコードするポリヌクレオチドを成分とする抗菌剤（薬学上の組成物）の提供を目的の一つとする。
【００２８】
或いは、遺伝子工学的手法に基づいて本発明の抗菌性ペプチドを生合成してもよい。このアプローチは、比較的鎖長の長いペプチドを製造する場合に好適である。すなわち、所望する抗菌性ペプチドのアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列（ＡＴＧ開始コドンを含む）のＤＮＡを合成する。そして、このＤＮＡと該アミノ酸配列を宿主細胞内で発現させるための種々の調節エレメント（プロモーター、リボゾーム結合部位、ターミネーター、エンハンサー、発現レベルを制御する種々のシスエレメントを包含する）とから成る発現用遺伝子構築物を有する組換えベクターを、宿主細胞に応じて構築する。一般的な技法によって、この組換えベクターを所定の宿主細胞（例えばイースト、昆虫細胞、植物細胞、動物（哺乳類）細胞）に導入し、所定の条件で当該宿主細胞または該細胞を含む組織や個体を培養する。このことにより、目的とするペプチドを細胞内で発現、生産させることができる。そして、宿主細胞（分泌された場合は培地中）からペプチドを単離し、精製することによって、目的の抗菌性ペプチドを得ることができる。
【００２９】
本発明の抗菌性ペプチドをコードするヌクレオチド配列および／または該配列と相補的なヌクレオチド配列から実質的に構成されるポリヌクレオチドは、従来公知の方法によって容易に製造（合成）することができる。すなわち、抗菌性ペプチドのアミノ酸配列を構成する各アミノ酸残基に対応するコドンを選択し、抗菌性ペプチドのアミノ酸配列に対応するヌクレオチド配列を容易に決定することができる。ひとたびヌクレオチド配列が決定されれば、ＤＮＡ合成機などを利用して、所望するヌクレオチド配列に対応するポリヌクレオチド（一本鎖）を容易に得ることができる。さらに得られた一本鎖ＤＮＡを鋳型として用い、種々の酵素的合成手段を採用して目的の二本鎖ＤＮＡを得ることができる。
【００３０】
本発明によって提供されるポリヌクレオチドは、ＲＮＡ（ｍＲＮＡなど）の形態であってもよく、ＤＮＡの形態であってもよい。ＤＮＡは、二本鎖または一本鎖で提供され得る。一本鎖で提供される場合は、コード鎖（センス鎖）であってもよく、それと相補的な配列の非コード鎖（アンチセンス鎖）であってもよい。
本発明によって提供されるポリヌクレオチドは、種々の宿主細胞中で本発明の抗菌性ペプチドを発現させるための組換え遺伝子（発現カセット）を構築するための材料として使用することができる。
【００３１】
例えば、本発明に係る抗菌性ペプチドをコードするヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドと、該アミノ酸配列を宿主細胞内で発現させるための種々の調節エレメント（プロモーター、リボゾーム結合部位、ターミネーター、エンハンサー、発現レベルを制御する種々のシスエレメントなどを包含する。）とを用いて外来ペプチド発現用遺伝子構築物を有する組換えベクターを構築することができる。ベクターの構成やその構築に使用される調節エレメントの種類は、目的とする宿主細胞のタイプに依存して異なり得る。組換えベクターの構築には、遺伝子工学分野でよく理解されている種々の制限酵素によるポリヌクレオチド切断技法（ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ）やポリヌクレオチド断片連結技法（ｌｉｇａｔｉｏｎ）が採用される。これら技法は、市販されている種々の装置類を利用することによって容易に行うことができる。なお、組換えベクターの構築方法および構築した組換えベクターの宿主細胞への導入方法などは、当該分野で従来から行われている方法をそのまま採用すればよく、かかる方法自体は特に本発明を特徴付けるものではないため、詳細な説明は省略する。
【００３２】
本発明の抗菌性ペプチドは、広い抗菌スペクトルを有していることから、抗菌剤、殺菌剤、消毒剤、防腐剤、防臭剤などの成分として好適に用いられる。例えば、細菌感染症の治療、創傷面の消毒、眼病予防、ロ腔内洗浄（例えばうがい）や練り歯磨き用の抗菌剤または殺菌剤、化粧品の防腐剤、コンタクトレンズの保存、食品の防腐剤や鮮度保持剤、台所用品、浴室用品およびトイレ用品などの静菌剤または殺菌剤、家具や衛生機器表面の殺菌剤または静菌剤などに用いることができる。また、衣類やカーテンなどの繊維製品の静菌剤または殺菌剤、壁や床の静菌剤または殺菌剤、さらには各種用水例えば工業用水、ビル管理用水および浴用水などの殺菌剤、静菌剤または防腐剤などに用いることができる。また、抗菌または殺菌作用から防臭効果も期待できる。更に、農業分野での静菌剤または殺菌剤として、例えば作物や農業資材に対する農薬などとして使用できる。また、畜産・養蜂業分野での静菌剤または殺菌剤として、例えば畜産飼料の防腐剤として、養蜂箱の静菌剤または殺菌剤などに用いることができる。また、漁業分野での静菌剤または殺菌剤として、例えば養魚場において細菌に感染した魚の治療、網や手袋などの資材の殺菌などに用いることができる。
本発明の抗菌性ペプチドは、１〜１０００μｇ／ｍｌ含有することで、上記に記載した抗菌剤、殺菌剤などに使用することができる。
【００３３】
本発明の抗菌性ペプチドを含有する抗菌剤の形態に関して特に限定はない。例えば、内用剤および外用剤の典型的な形態として、液剤、懸濁剤、乳剤、エアロゾル、泡沫剤、顆粒剤、粉末剤、錠剤、カプセル、軟膏、クリームなどが挙げられる。また、注射などに用いるため、使用直前に生理食塩水などに溶解して薬液を調製するための凍結乾燥物、造粒物とすることもできる。
【００３４】
本発明の抗菌性ペプチドを含有する抗菌剤などの製剤において、他の担体すなわち副次的成分（製薬上許容されるもの）としては、抗菌剤などの用途や形態に応じて適宜異なり得るが、種々の充填剤、増量剤、結合剤、付湿剤、表面活性剤、賦形剤、色素、香料など一般的に製剤として製造するときに用いるものが使用できる。
なお、本発明の抗菌性ペプチドおよび種々の担体を材料にして上記形態の各種薬剤を調製するプロセス自体は公知の方法に準じればよく、かかる製剤方法自体は本発明を特徴付けるものでもないため詳細な説明は省略する。
【００３５】
本発明の抗菌性ペプチドによって提供される抗菌剤は、その形態および目的に応じた方法や用量で使用することができる。例えば、液剤は、静脈内、筋肉内、皮下、皮内若しくは腹腔内への注射によって投与することができる。また、鼻腔内や気管支内に噴霧して投与してもよい。また、錠剤などの固体形態のものは経口投与することができる。このときの投与量は、目的とする菌に対する抗菌活性から算出することができる。
【００３６】
また、衛生陶器表面の消毒（殺菌）や食品の防腐目的に使用する場合は、比較的多量（例えば１〜１００ｍｇ／ｍｌ）の本発明の抗菌性ペプチドを含有する液剤を対象物の表面に直接スプレーするか、或いは、当該液剤で濡れた布や紙で対象物の表面を拭くことにより行うことができる。これらは例示にすぎず、従来の抗菌剤による農薬、医薬部外品などの抗菌剤や消毒剤と同じ形態、使用方法を適用することができる。
【００３７】
例えば、放射線治療を受けているガン患者やエイズ患者は、免疫不全症を合併症として発症し、本来の疾病それ自体の原因であることよりも細菌感染により重篤な症状をきたすことがある。本発明によって提供される抗菌性ペプチドは、細菌に選択的に抗菌作用を示すとともにヒトなどの哺乳動物に対しては毒性を有しない。このため、本発明に係る抗菌性ペプチドは、抗菌剤の成分として有用であり、本発明によって提供される抗菌剤は人体に対して安全に適用することができる。
【００３８】
再生医療の分野において、皮膚、骨、各種の臓器などの培養時における細菌感染を防止することを目的として本発明の抗菌性ペプチドを用いることができる。例えば、適当な濃度で本発明の抗菌性ペプチド単独または当該ペプチドを成分の一つとする抗菌剤を培養液中に添加することにより、培養中の組織や臓器などの細菌感染を防止することができる。
【００３９】
また、培養細胞や培養組織に対して、本発明の抗菌性ペプチドをコードするポリヌクレオチドを遺伝子治療に使用する素材として用いることができる。例えば、本発明の抗菌性ペプチドをコードする遺伝子（ＤＮＡセグメントまたはＲＮＡセグメント）を適当なベクターに組み込み、目的とする培養組織（細胞）に導入することにより、常時或いは所望する時期に培養組織（細胞）内で、本発明の抗菌性ペプチドを発現させることが可能となる。従って、本発明の抗菌性ペプチドをコードするポリヌクレオチド（ＤＮＡセグメントまたはＲＮＡセグメント）は、培養組織（細胞）の細菌感染を防止する薬剤として有用である。
【００４０】
本発明の抗菌性ペプチドをコードするポリヌクレオチドは、いわゆる遣伝子治療に使用する素材として用いることができる。例えば、本発明の抗菌性ペプチドをコードする遺伝子（ＤＮＡセグメントまたはＲＮＡセグメント）を適当なベクターに組み込み、目的とする部位に導入することにより、常時生体（細胞）内で本発明の抗菌性ペプチドを発現させることが可能となる。従って、本発明の抗菌性ペプチドをコードするポリヌクレオチド（ＤＮＡセグメントまたはＲＮＡセグメント）は、上述した患者などに対し、細菌感染を予防または治療する薬剤として有用である。
【００４１】
【実施例】
以下に説明する実施例によって、本発明を更に詳細に説明するが、本発明をかかる実施例に示すものに限定するものではない。
【００４２】
＜実施例１＞
○ペプチドの合成
下記表１に記載したペプチド（サンプル１〜５、サンプル６）を後述するペプチド合成機を用いて製造した。
【００４３】
【表１】

【００４４】
上述した各ペプチド（個々のアミノ酸配列は配列表を参照）は、市販のペプチド合成機（ＡＢＩ４３３Ａｐｅｐｔｉｄｅｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製品））を用いてＦａｓｔＭｏｃ^ＴＭｐｒｏｔｏｃｏｌに従い固相合成法（Ｆｍｏｃ法）により合成した。なお、縮合剤としてＨＡＴＵ（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製品）を使用し、固相合成法に用いた樹脂およびアミノ酸はＮＯＶＡｂｉｏｃｈｅｍ社から購入したものを用いた。また、Ｆｍｏｃ−アミノ酸において、リジンの側鎖官能基の保護基にはｔｅｒｔ−ｂｕｔｏｘｙｃａｒｂｏｎｙｌ（Ｂｏｃ）を、ヒスチジンの側鎖官能基の保護基にはｔｒｉｐｈｅｎｙｌｍｅｔｈｙｌ（Ｔｒｔ）を、アルギニンの側鎖官能基の保護基にはｐｅｎｔａｍｅｔｈｙｌｃｈｒｏｍａｎ−６−ｓｕｌｆｏｎｙｌ（Ｐｍｃ）を使用した。
アミノ酸配列のＣ末端をアミド化する場合には、固相担体として「Ｆｍｏｃ−ＰＡＬ−Ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎ（ＰＥＧ−ＰＳ）樹脂」を使用した。
【００４５】
上記ペプチド合成機の合成プログラムに準じて脱保護基反応および縮合反応を反復して樹脂に結合するＦｍｏｃ−アミノ酸からペプチド鎖を伸長していき、目的の鎖長の合成ペプチドを得た。
具体例としては、２０％ピペリジン／ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）（ペプチド合成用グレード、関東化学（株）製品）によって、アミノ酸のアミノ保護基であるＦｍｏｃを切断除去し、ＤＭＦで洗浄し、Ｆｍｏｃ−アミノ酸（−ＯＨ）各３ｅｑを反応させ、ＤＭＦで洗浄する操作を反復した。そして、ペプチド鎖の伸長反応が全て終了した後、２０％ピペリジン／ＤＭＦによりＦｍｏｃ基を切断し、ＤＭＦ、メタノールの順で上記反応物を洗浄した。
側鎖官能基の脱保護と同時に樹脂からペプチドを切断した。この方法は、８２．５％Ｔｒｉｆｌｕｏｒｏａｃｅｔｉｃａｃｉｄ（以下ＴＦＡ）（ＴＦＡ：１，２−ｅｔｈａｎｄｉｔｈｉｏｌ：ｍ−ｃｒｅｓｏｌｅ：Ｔｈｉｏａｎｉｓｏｌｅ：水＝８２．５：２．５：５：５：５）（以上、和光純薬）５ｍｌを加え、室温で３時間反応させた。
樹脂を除き、ジエチルエーテル中に沈殿させた後、遠心（３０００ｒｐｍ、４℃、３ｍｉｎ）しエーテル層を取り除いた。この操作を３回繰返した。最後にエーテル層を取り除いた後、ペプチドを風乾させ、純水に溶解させた。純水に溶解しないものは３０％以下のエタノール水溶液に溶解させた。その後、凍結乾燥した。
【００４６】
得られたペプチド沈殿物を真空乾燥し、高速液体クロマトグラフを用いて精製を行った。具体的には、プレカラム（Ｇｕａｒｄ−Ｐａｋ社製品、製品名ＤｅｌｔａｐａｋＣ１８Ａ３００）およびＣ１８逆相カラム（ＤＡＩＳＯＰＡＫＳＰ−１２０−５−ＯＤＳ−ＡＰ、２０ｍｍＩ．Ｄ．×２５０ｍｍ（ＤＡＩＳＯ））を使用し、０．１％トリフルオロ酢酸水溶液と０．１％トリフルオロ酢酸アセトニトリル溶液との混合液を溶離液に用いた。すなわち、溶離液に含まれる上記トリフルオロ酢酸アセトニトリル溶液の分量を経時的に増大させつつ（容積比で１０％から８０％への濃度勾配を設ける）、７ｍｌ／分の流速で上記カラムを用いて４０〜５０分間分離精製を行った。なお、逆相カラムから溶離したペプチドは紫外線検出器を用いて２２０ｎｍで検出し、記録チャート上にピークとして示される。また、溶離した各ペプチドの分子量をＫＲＡＴＯＳ質量分析装置ＫＯＭＰＡＣＴＭＡＬＤＩＩＩＩ（島津製作所製）を用いてＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＭＳ（Ｍａｔｒｉｘ−ＡｓｓｉｓｔｅｄＬａｓｅｒＤｅｓｏｒｐｔｉｏｎＴｉｍｅｏｆＦｌｉｇｈｔＭａｓｓＳｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ：マトリックス支援レーザーイオン化−飛行時間型−質量分析）に基づいて決定した。その結果、目的のペプチドが合成・精製されていることを確認した。
【００４７】
＜実施例２＞
○合成ペプチドの抗菌活性
本発明に係る抗菌性ペプチド（サンプル１〜５）、および比較例について、下記に記載のグラム陰性細菌およびグラム陽性細菌に対する抗菌活性（最小発育阻止濃度：ＭＩＣ）を９６穴（ｗｅｌｌ）マイクロプレートを用いた液体培地希釈法により求めた。
○供試菌
・グラム陽性菌
ＢａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓＡＴＣＣ６６３３
ＭｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓｌｕｔｅｕｓＩＦＯ１２７０８
ＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓａｕｒｅｕｓＩＦＯ１２７３２
ＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓａｕｒｅｕｓＩＩＤ１６７７（ＭＲＳＡ）
・グラム陰性菌
ＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉＩＦＯ１２７１３
ＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉＯ１５７：Ｈ７ｓａｋａｉ
ＫｌｅｂｓｉｅｌｌａｐｎｅｕｍｏｎｉａｅＡＴＣＣ４３５２
ＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓａｅｒｕｇｉｎｏｓａＡＴＣＣ１０１４５
ＳａｌｍｏｎｅｌｌａｅｎｔｅｒｉｔｉｄｉｓＩＦＯ３３１３
【００４８】
ペプチド濃度が５００、２５０、１２５、６２．５、３１．３、１５．６、７．８、３．９、１．９、１．０および０．５μＭとなる液体肉汁培地（ＤＩＦＣＯ社製品「ＮＵＴＲＩＥＮＴＢＲＯＴＨＤｅｈｙｄｒａｔｅｄ」）をそれぞれ作製し、９６穴マイクロプレートに１５０μｌずつ分注した。一方、ＬＢＢｒｏｔｈ，Ｌｅｎｎｏｘ（ＤＩＦＣＯ社製品）で１８時間、３７℃にて静置培養した菌液（約２×１０^６ｃｅｌｌｓ／ｍＬ）を、薬剤溶液（上記ペプチド含有肉汁培地）と等量、９６穴マイクロプレートの各ウェルに接種した。接種後、３７℃の恒温器内で培養し、２４時間後の濁度により菌の生育状況を調べた。この計測時において、菌の増殖が認められない検体の最小の濃度を、本実施例におけるＭＩＣと定めた。
かかる抗菌試験に基づくサンプル１〜５および比較サンプルとして用いたＮｉｓｉｎのＭＩＣを表２に示す。
【００４９】
【表２】

【００５０】
表２に示す結果から明らかなように、本発明に係るペプチド（サンプル１〜５）は、比較例とした世界中で広く利用されている既存の抗菌性ペプチドであるナイシン（Ｎｉｓｉｎ、ＳｉｇｍａＡｌｄｒｉｃｈ社より購入）と比べ、グラム陽性菌に対しては遜色のない高い抗菌力を示し、かつグラム陰性菌、薬剤耐性菌に対しても高い抗菌力を示した。
表２に示す結果より、本発明に係る抗菌性ペプチドが、グラム陰性、グラム陽性、薬剤耐性菌に対して優れた抗菌活性と広い抗菌スペクトルを有することが確かめられた。
【００５１】
＜比較例２＞
サンプル６については、ＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓａｕｒｅｕｓＩＦＯ１２７３２およびＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉＩＦＯ１２７１３について抗菌活性を実施例２と同様にして調べたが、ＭＩＣはともに４００μｇ／ｍｌ以上となり、抗菌活性が認められなかった。
【００５２】
塩基性アミノ酸残基が１個であるサンプル６について抗菌活性を調べたが、抗菌活性が認められなかった。しかし、実施例２に記載のサンプル１〜５には、抗菌活性が認められることから、本発明の抗菌性ペプチドには、塩基性アミノ酸残基が２個以上連続している部位が２ヶ所存在する必要があることを示している。
【００５３】
以上、本発明の具体例を詳細に説明したが、これらは例示にすぎず、特許請求の範囲を限定するものではない。特許請求の範囲に記載の技術には、以上に例示した具体例を様々に変形、変更したものが含まれる。また、本明細書に説明した技術要素は、単独であるいは各種の組み合わせによって技術的有用性を発揮するものであり、出願時請求項記載に限定されるものではない。また、本明細書に例示した技術は複数目的を同時に達成するものであり、そのうちの一つの目的を達成すること自体で技術的有用性を持つものである。
【００５４】
【発明の効果】
本発明の抗菌性ペプチドは、グラム陰性、グラム陽性、薬剤耐性菌に対して優れた抗菌活性と広い抗菌スペクトルを有することから、抗菌剤または消毒剤などとして有用である。また、本発明の抗菌性ペプチドの設計方法により、溶解性および抗菌性ペプチド全体の荷電などをコントロールすることができることから、用途に応じた抗菌性ペプチドを得ることが可能となる。
【００５５】
【配列表フリーテキスト】
配列番号１設計された抗菌性ペプチド。
配列番号２設計された抗菌性ペプチド。
配列番号３設計された抗菌性ペプチド。
配列番号４設計された抗菌性ペプチド。
配列番号５設計された抗菌性ペプチド。
配列番号６設計されたペプチド。
【００５６】
【配列表】

[0001]
TECHNICAL FIELD OF THE INVENTION
The present invention relates to antimicrobial peptides and the design of the antimicrobial peptides.
[0002]
[Prior art]
Antimicrobial peptides have a broad antimicrobial spectrum and are considered to be resistant to the emergence of drug-resistant bacteria, thus preventing or treating bacterial and infectious diseases in humans and animals, or imparting antimicrobial properties to food and other articles The use of antimicrobial peptides has been expected for this purpose.
Many antimicrobial peptides have been isolated from animals and plants. For example, an antimicrobial peptide derived from a Chinese beetle and an antimicrobial agent containing the antimicrobial peptide as an active ingredient are disclosed (for example, see Patent Document 1).
Further, an antimicrobial peptide derived from scorpion venom and an antimicrobial agent containing the antimicrobial peptide as an active ingredient have been disclosed (for example, see Patent Document 2).
Each of the antimicrobial peptides described above contains a basic amino acid such as lysine, arginine and / or histidine, and is called a cationic antimicrobial peptide in which the entire peptide molecule has a positive charge. It is considered that the principle of action of these antimicrobial peptides is due to the fact that a positively charged basic amino acid moiety in the antimicrobial peptide interacts electrostatically with the membrane on the bacterial surface (for example, see Non-Patent Document 1). .
The antimicrobial peptides described in each of the above publications are those which were found and isolated from those originally existing as antimicrobial peptides in nature (or peptides obtained by partially modifying the amino acid sequence of natural antimicrobial peptides). Therefore, it is difficult to develop a peptide having an antibacterial activity exceeding the antibacterial activity and antibacterial spectrum of the antibacterial peptide.
[0003]
○ Prior literature
[Patent Document 1]
JP 2000-063400 A (Claims)
[Patent Document 2]
Japanese Patent Application Laid-Open No. 2001-186887 (Claims)
[Non-patent document 1]
M. Zasloff, "Nature", 2002, vol. 415, p. 389-395
[0004]
[Problems to be solved by the invention]
The present invention provides an antimicrobial peptide having an amino acid sequence different from that of a peptide which exists and functions as an antimicrobial peptide in nature, regardless of the conventional antimicrobial peptide development approach of substituting amino acid residues of a known antimicrobial peptide. One of the purposes is to provide
[0005]
[Means for Solving the Problems]
As a result of intensive studies, the present inventors incorporate into the molecular design of an antimicrobial peptide the features that the peptide molecule has a sequence portion composed of two basic amino acid residues and that both ends of the peptide are hydrophobic. As a result, it has been found that an antimicrobial peptide exhibiting high antibacterial activity and having a broad antibacterial spectrum against drug-resistant bacteria such as Gram-negative bacteria, Gram-positive bacteria, and MRSA can be realized, and completed the present invention. .
The antimicrobial peptide provided by the design method of the present invention is an artificially synthesized antimicrobial peptide that does not exist in nature. Also, a non-naturally occurring artificial sequence comprising (typically substantially constituted by) a nucleotide sequence encoding the antimicrobial peptide provided by the present invention and / or a nucleotide sequence complementary to said sequence. Are provided.
[0006]
According to the present invention, there is provided an antibacterial agent containing the antibacterial peptide of the present invention as a component. Typically, the antimicrobial agent contains a pharmaceutically acceptable carrier in addition to the antimicrobial peptide of the present invention depending on the use. Also, a non-naturally occurring artificially synthesized polynucleotide comprising or substantially consisting of a nucleotide sequence encoding the antimicrobial peptide of the invention and / or a nucleotide sequence complementary to said sequence. (Which can be in the form of DNA or RNA segments) are provided.
[0007]
BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION
Hereinafter, embodiments of the present invention will be described.
In addition, matters other than matters specifically referred to in this specification (eg, primary structure and chain length of an antimicrobial peptide) and matters necessary for carrying out the present invention (eg, peptide synthesis, polynucleotide synthesis, General matters such as the preparation of pharmaceuticals) are regarded as design matters of those skilled in the art based on conventional techniques in fields such as organic chemistry, biochemistry, genetic engineering, protein engineering, molecular biology, pharmacology and medicine. obtain. The present invention can be implemented based on the contents disclosed in this specification and common general technical knowledge in the relevant field. In the following description, amino acids are represented by one-letter code (three-letter code in the sequence listing) based on the nomenclature for amino acids indicated in the IUPAC-IUB guidelines.
[0008]
As used herein, the term “artificially synthesized antibacterial peptide or polynucleotide that does not exist in nature” means that the peptide chain or nucleotide chain (full length) does not exist in nature by itself, but is chemically synthesized or biosynthesized ( That is, the term refers to an antimicrobial peptide or polynucleotide artificially produced by the production based on genetic engineering). Here, “peptide” is a term indicating an amino acid polymer having a plurality of peptide bonds, and is not limited by the number of amino acid residues contained in the peptide chain. So-called oligopeptides having less than 10 amino acid residues are also encompassed by the peptides herein. The term "polynucleotide" is a term indicating a polymer (nucleic acid) in which a plurality of nucleotides are linked by phosphodiester bonds, and is not limited by the number of nucleotides. DNA and RNA fragments of various lengths are encompassed by the polynucleotides herein.
[0009]
○ Design of antimicrobial peptides
A cationic surfactant, a quaternary ammonium salt having a long-chain alkyl group, developed by Domagk in 1935, has excellent properties as an antibacterial agent and is widely used. A bis-type quaternary ammonium salt compound having a structural feature of possessing two quaternary ammonium salts in a molecule has significantly improved antibacterial activity as compared with a compound having one quaternary ammonium salt, and has an environmental and pH value. Based on the fact that it is hardly affected by the influence of temperature and temperature, the method for designing the antimicrobial peptide of the present invention was completed.
[0010]
That is, the antimicrobial peptide has basic amino acid residue portions at two positions other than the terminal, and a hydrophobic and / or neutral amino acid residue portion connecting the basic amino acid residue portions (the basic amino acid residue portion) Higher antibacterial properties can be achieved by incorporating the features of a basic amino acid residue that is not adjacent to the residue part) into the molecular design of the antimicrobial peptide. It was possible to obtain an antimicrobial peptide exhibiting activity and having a broad antibacterial spectrum against drug-resistant bacteria such as Gram-negative bacteria, Gram-positive bacteria, and MRSA.
[0011]
The antimicrobial peptide of the present invention is an antimicrobial peptide having 7 to 30 amino acid residues including a site where two or more basic amino acid residues are continuous at two positions other than the terminal of the peptide.
[0012]
In the antimicrobial peptide of the present invention, the sequence of the site where two or more basic amino acid residues are continuous is the same residue, the same sequence or the reverse sequence, and the N-terminal and C-terminal hydrophobic amino acid residues An antimicrobial peptide whose base moiety is the same residue, the same sequence or the reverse sequence.
[0013]
The amino acid sequence of the antimicrobial peptide of the present invention is represented by the following formula (1).
D- (Xa) n1- (Xb) n2- (Xc) n3- (Xb) n2- (Xa) n1-CO-E (1)
Xa in the formula (1) represents a hydrophobic amino acid residue which may be different from each other;
Xb represents a basic amino acid residue which may be different from each other;
Xc represents a hydrophobic amino acid residue and / or a neutral amino acid residue which may have a basic amino acid residue which is not adjacent to Xb, which may be different from each other;
D represents an amino group, an NHCHO group or an NH acyl group;
E represents a hydroxyl group or an amino group,
n1 is an integer of 1 or more, n2 is an integer of 2 or more, and n3 is an integer of 1 or more.
[0014]
N1 in the formula (1) is preferably 1 to 10, and more preferably 2 to 8. Further, n2 in the formula (1) is preferably 2 to 12, more preferably 2 to 10, and particularly preferably 2 to 8. Further, n3 in the formula (1) is preferably 1 to 15, more preferably 2 to 10, and particularly preferably 2 to 8.
[0015]
The amino acid corresponding to the basic amino acid residue in the antimicrobial peptide of the present invention, that is, the amino acid corresponding to the Xb amino acid residue of the formula (1) is lysine, arginine and histidine, preferably lysine and arginine. It is.
In Xb of the formula (1), the basic amino acid residue which may be different from each other means that the amino acid sequence in a continuous site may be different, for example, “RK”, and the antibacterial peptide In the above, the amino acid sequence may be different between the two sites, for example, "RK", "KR", "HR" and the like. This is the same for Xa and Xc in the formula (1).
[0016]
The amino acids corresponding to the hydrophobic amino acid residues in the antimicrobial peptide of the present invention, that is, those corresponding to the amino acid residue of Xa in the formula (1) include valine, leucine, isoleucine, phenylalanine, tryptophan, proline, and glycine. , Alanine and methionine, preferably valine, leucine, isoleucine, phenylalanine and alanine, more preferably valine, leucine, isoleucine and alanine.
[0017]
The amino acids corresponding to the hydrophobic and / or neutral amino acid residues in the antimicrobial peptide of the present invention, ie, those corresponding to a part of the amino acid residues of Xc in the formula (1), include valine, leucine, isoleucine Phenylalanine, tryptophan, glycine, alanine, methionine, serine, threonine, cysteine, tyrosine, asparagine and glutamine, and the like, preferably valine, leucine, isoleucine, phenylalanine, tryptophan, glycine, alanine, serine, threonine, and Preferred are valine, tryptophan, glycine, alanine, serine and threonine.
The amino acids corresponding to the basic amino acid residues corresponding to a part of the amino acid residues of Xc in the formula (1) in the antimicrobial peptide of the present invention are lysine, arginine and histidine, preferably lysine and arginine. There is no adjacency with Xb in equation (1) as described above.
[0018]
Further, the present invention provides a method in which the sequence of two or more basic amino acid residues at two non-terminal positions of a peptide is the same residue, the same sequence or the reverse sequence, and the N-terminal and C-terminal hydrophobic The sequence of the amino acid residue site is the same residue, the same sequence or the reverse sequence, the sequence sandwiched by two or more consecutive basic amino acid residues at two positions other than the terminal of the peptide, An amino acid that is a hydrophobic amino acid residue and / or a neutral amino acid residue that may have a basic amino acid residue that is not adjacent to a site where two or more of the basic amino acid residues are continuous This is a method for designing an antimicrobial peptide having 7 to 30 residues.
[0019]
The antimicrobial peptide of the present invention can use an L-amino acid and / or a D-amino acid as an amino acid residue, but an L-amino acid is preferable.
As long as the antimicrobial peptide of the present invention does not lose the antimicrobial activity, a linear or helical peptide is preferred from the viewpoint that some or all of the amino acid residues are unlikely to become “antigens”. Peptides having such a shape are unlikely to constitute an epitope.
[0020]
From this viewpoint, the antimicrobial peptide is a linear and relatively low-molecular-weight peptide, preferably having 7 to 30 amino acid residues, and more preferably having 9 to 25 amino acid residues, particularly Those having 10 to 20 amino acid residues are preferred.
[0021]
The N-terminal amino group and the C-terminal carboxyl group can also be chemically modified. For example, N-terminal amino group is formylation or acylation, and C-terminal carboxyl group is amidated. It can be effective in increasing power. The N-terminal amino group may be acylated by a lower fatty acid such as an acetyl group, a propyl group, or a butyl group, or by a higher fatty acid, or may have a branch.
[0022]
The same residue in the antimicrobial peptide of the present invention means that the type and number of the basic amino acid residues present in one of the sequences are, for example, at two or more consecutive basic amino acid residues. It is the same as the other, and this example is shown below.
That is, when one of the arrays is “RRK”, the other array is “RKR”. The same applies to the sequence of hydrophobic amino acid residues.
The term “identical sequence” in the antimicrobial peptide of the present invention refers to, for example, an amino acid sequence at a site where two or more basic amino acid residues at two positions are continuous, and examples thereof are shown below.
That is, when one array is “RRK”, the other array is “RRK”. The same applies to the sequence of hydrophobic amino acid residues.
In the antimicrobial peptide of the present invention, the reverse sequence means that the amino acid sequence at a site where two or more basic amino acid residues are continuous at two or more positions is the reverse sequence to the other, and this example is shown below.
That is, when one of the arrays is “RRK”, the other array is “KRR”. The same applies to the sequence of hydrophobic amino acid residues.
[0023]
In the antimicrobial peptide of the present invention, the sequence of the site where two or more basic amino acid residues are continuous is the same residue, the same sequence or a reverse sequence, preferably the same sequence or the reverse sequence, more preferably It is an inverted arrangement. The N-terminal and C-terminal hydrophobic amino acid residue sites are the same residue, the same sequence or the reverse sequence, preferably the same sequence or the reverse sequence, and more preferably the reverse sequence. In the present invention, an increase or decrease of the number of amino acid residues by about 1 is within an allowable range (however, numerical values of n1, n2 and n3 in the formula (1) take precedence).
The antimicrobial peptide of the present invention preferably has a symmetric peptide sequence. This symmetrical peptide sequence is a peptide sequence in which the sequence up to the center of the antimicrobial peptide sequence viewed from the N-terminal side is identical to the sequence up to the center of the antimicrobial peptide sequence viewed from the C-terminal side. For example,
VLLKRAARKLLV
An array such as That is, from the N-terminal side, the sequence is "VLLKRA", and from the C-terminal side, the sequence is "ARKLLV", which is symmetrical from the center of the peptide sequence. When the number of amino acid residues is odd, it is symmetrical with respect to the central amino acid residue.
Some amino acids show the same performance even when leucine is replaced by isoleucine, and the sequences substituted with such amino acids can be regarded as identical. Such substitution of amino acid residues can be applied to the case of the same residue, the same sequence or the reverse sequence.
[0024]
Amino acids having substitution identity include:
For valine, isoleucine, leucine
For leucine, isoleucine, valine
For isoleucine, leucine, valine
Tryptophan, tyrosine
For serine, threonine
For threonine, serine
For alanine, glycine, serine
In glycine, alanine
In lysine, arginine
In arginine, lysine
And so on.
[0025]
Specific examples of the novel antimicrobial peptide having an amino acid sequence provided by the present invention substantially consist of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, or SEQ ID NO: 5. Peptides. Each of these five peptides is composed of 30 amino acids or less (specifically, 11 to 15 amino acids), and is suitable for maintaining a linear shape. In addition, since it has low immunogenicity, it is suitable as a component of an antibacterial agent (antibacterial component).
[0026]
The antimicrobial peptide of the present invention can be easily produced according to a general chemical synthesis method. For example, any of the conventionally known solid phase synthesis method and liquid phase synthesis method may be adopted. A solid phase synthesis method using Boc (t-butyloxycarbonyl) or Fmoc (9-fluorenylmethoxycarbonyl) as an amino-protecting group is preferable.
The antimicrobial peptide of the present invention can be obtained by a solid-phase synthesis method using a commercially available peptide synthesizer (for example, available from Applied Biosystems) or the like, with a desired amino acid sequence and a modified (C-terminal amidation, etc.) moiety. Can be synthesized.
[0027]
The present invention provides an antimicrobial peptide having an amino acid sequence different from that of a peptide that exists and functions as an antimicrobial peptide in nature and a polynucleotide that encodes the peptide, regardless of a conventional approach to developing an antimicrobial peptide-containing antimicrobial agent. One of the purposes is to provide. Another object is to provide an antibacterial agent (pharmaceutical composition) containing such an antibacterial peptide or a polynucleotide encoding the peptide as a component.
[0028]
Alternatively, the antimicrobial peptide of the present invention may be biosynthesized based on a genetic engineering technique. This approach is suitable for producing a peptide having a relatively long chain length. That is, a DNA having a nucleotide sequence (including the ATG initiation codon) encoding the amino acid sequence of the desired antimicrobial peptide is synthesized. For expression comprising this DNA and various regulatory elements (including a promoter, a ribosome binding site, a terminator, an enhancer, and various cis elements controlling the expression level) for expressing the amino acid sequence in a host cell. A recombinant vector having the gene construct is constructed depending on the host cell. This recombinant vector is introduced into a predetermined host cell (eg, yeast, insect cell, plant cell, animal (mammalian) cell) by a general technique, and under the predetermined conditions, the host cell or a tissue or individual containing the cell. Is cultured. This allows the target peptide to be expressed and produced in cells. Then, the target antimicrobial peptide can be obtained by isolating and purifying the peptide from the host cell (in the medium if secreted).
[0029]
A polynucleotide substantially consisting of a nucleotide sequence encoding the antimicrobial peptide of the present invention and / or a nucleotide sequence complementary to the sequence can be easily produced (synthesized) by a conventionally known method. That is, a codon corresponding to each amino acid residue constituting the amino acid sequence of the antimicrobial peptide can be selected, and the nucleotide sequence corresponding to the amino acid sequence of the antimicrobial peptide can be easily determined. Once the nucleotide sequence is determined, a polynucleotide (single strand) corresponding to the desired nucleotide sequence can be easily obtained using a DNA synthesizer or the like. Furthermore, using the obtained single-stranded DNA as a template and employing various enzymatic synthesis means, a target double-stranded DNA can be obtained.
[0030]
The polynucleotide provided by the present invention may be in the form of RNA (such as mRNA) or DNA. The DNA can be provided in double stranded or single stranded. When provided as a single strand, it may be a coding strand (sense strand) or a non-coding strand (antisense strand) having a sequence complementary thereto.
The polynucleotide provided by the present invention can be used as a material for constructing a recombinant gene (expression cassette) for expressing the antimicrobial peptide of the present invention in various host cells.
[0031]
For example, a polynucleotide having a nucleotide sequence encoding the antimicrobial peptide of the present invention and various regulatory elements (promoter, ribosome binding site, terminator, enhancer, expression level, etc.) for expressing the amino acid sequence in a host cell. And various cis elements to be controlled) can be used to construct a recombinant vector having a gene construct for expressing a foreign peptide. The construction of the vector and the types of regulatory elements used in its construction can vary depending on the type of host cell of interest. For construction of a recombinant vector, a technique of polynucleotide cleavage by various restriction enzymes and a technique of ligation of polynucleotide fragments, which are well understood in the field of genetic engineering, are employed. These techniques can be easily performed by utilizing various commercially available devices. The method for constructing the recombinant vector and the method for introducing the constructed recombinant vector into host cells may be any method conventionally used in the art, and such a method itself particularly characterizes the present invention. Therefore, a detailed description is omitted.
[0032]
Since the antimicrobial peptide of the present invention has a broad antimicrobial spectrum, it is suitably used as a component of an antimicrobial agent, a bactericide, a disinfectant, a preservative, a deodorant, and the like. For example, treatment of bacterial infections, disinfection of wound surfaces, prevention of eye diseases, antibacterial or bactericide for buccal washing (eg, gargle) and toothpaste, preservatives for cosmetics, preservation of contact lenses, preservatives for foods, It can be used as a bacteriostatic or bactericide for freshness preserving agents, kitchenware, bathroom and toilet articles, and a bactericide or bacteriostat for furniture and sanitary equipment surfaces. In addition, bacteriostat or bactericide for textiles such as clothing and curtains, bacteriostat or bactericide for walls and floors, and bactericides and bacteriostats for various types of water such as industrial water, building management water and bath water. Alternatively, it can be used as a preservative. In addition, an anti-odor effect can be expected from the antibacterial or bactericidal action. Furthermore, it can be used as a bacteriostat or fungicide in the agricultural field, for example, as a pesticide for crops and agricultural materials. Further, it can be used as a bacteriostatic agent or a bactericide in the field of livestock and beekeeping, for example, as a preservative for livestock feed, a bacteriostatic agent or a bactericide in beekeeping boxes. Further, it can be used as a bacteriostatic agent or a bactericide in the field of fisheries, for example, for treating fish infected with bacteria in a fish farm, sterilizing materials such as nets and gloves, and the like.
By containing the antimicrobial peptide of the present invention in an amount of 1 to 1000 μg / ml, it can be used as the above-described antimicrobial agent, bactericide and the like.
[0033]
The form of the antimicrobial agent containing the antimicrobial peptide of the present invention is not particularly limited. For example, typical forms of internal and external preparations include solutions, suspensions, emulsions, aerosols, foams, granules, powders, tablets, capsules, ointments, creams, and the like. In addition, since it is used for injection or the like, it can be dissolved in physiological saline or the like immediately before use to prepare a lyophilized product or granulated product for preparing a drug solution.
[0034]
In the preparation of the antimicrobial agent or the like containing the antimicrobial peptide of the present invention, the other carrier, that is, a secondary component (a pharmaceutically acceptable substance) may be appropriately varied depending on the use or form of the antimicrobial agent. Various fillers, extenders, binders, humectants, surfactants, excipients, pigments, fragrances and the like generally used in the production of pharmaceuticals can be used.
The process itself of preparing the above-mentioned various drugs using the antimicrobial peptide of the present invention and various carriers as materials may be in accordance with a known method, and since such a formulation method itself does not characterize the present invention, it is described in detail. Detailed description is omitted.
[0035]
The antimicrobial agent provided by the antimicrobial peptide of the present invention can be used in a method and dosage depending on its form and purpose. For example, solutions can be administered by intravenous, intramuscular, subcutaneous, intradermal, or intraperitoneal injection. The drug may be administered by spraying into the nasal cavity or bronchi. Solid forms such as tablets can be administered orally. The dose at this time can be calculated from the antibacterial activity against the target bacteria.
[0036]
When used for the purpose of disinfecting (sterilizing) the surface of sanitary ware or preserving food, a liquid preparation containing a relatively large amount (for example, 1 to 100 mg / ml) of the antimicrobial peptide of the present invention is directly applied to the surface of the object. It can be performed by spraying or by wiping the surface of the object with a cloth or paper wet with the liquid agent. These are merely examples, and the same forms and methods of use as conventional antibacterial agents and disinfectants such as pesticides and quasi-drugs using antibacterial agents can be applied.
[0037]
For example, cancer patients and AIDS patients undergoing radiation therapy may develop immunodeficiency as a complication and cause more severe symptoms due to bacterial infection than to cause the disease itself. The antimicrobial peptide provided by the present invention exhibits an antimicrobial activity selectively to bacteria and has no toxicity to mammals such as humans. Therefore, the antimicrobial peptide according to the present invention is useful as a component of an antimicrobial agent, and the antimicrobial agent provided by the present invention can be safely applied to a human body.
[0038]
In the field of regenerative medicine, the antimicrobial peptide of the present invention can be used for the purpose of preventing bacterial infection during culture of skin, bone, various organs and the like. For example, by adding an antimicrobial peptide of the present invention alone or an antimicrobial agent containing the peptide as one of the components at an appropriate concentration to a culture solution, it is possible to prevent bacterial infection of tissues and organs during culture. .
[0039]
In addition, a polynucleotide encoding the antimicrobial peptide of the present invention can be used as a material for gene therapy for cultured cells or tissues. For example, a gene (DNA segment or RNA segment) encoding the antimicrobial peptide of the present invention is inserted into an appropriate vector and introduced into a target cultured tissue (cell), so that the cultured tissue (cell) is always or at a desired time. Within), the antimicrobial peptide of the present invention can be expressed. Therefore, the polynucleotide (DNA segment or RNA segment) encoding the antimicrobial peptide of the present invention is useful as an agent for preventing bacterial infection of cultured tissues (cells).
[0040]
The polynucleotide encoding the antimicrobial peptide of the present invention can be used as a material for so-called gene therapy. For example, the gene (DNA segment or RNA segment) encoding the antimicrobial peptide of the present invention is integrated into an appropriate vector and introduced into a target site, so that the antimicrobial peptide of the present invention is always in vivo (cells). It can be expressed. Therefore, the polynucleotide (DNA segment or RNA segment) encoding the antimicrobial peptide of the present invention is useful as an agent for preventing or treating bacterial infection in the above-mentioned patients and the like.
[0041]
【Example】
The present invention will be described in more detail with reference to the following examples, but the present invention is not limited to the examples.
[0042]
<Example 1>
○ Synthesis of peptides
The peptides (Samples 1 to 5 and Sample 6) described in Table 1 below were produced using a peptide synthesizer described later.
[0043]
[Table 1]

[0044]
Each of the above-mentioned peptides (refer to the sequence listing for the individual amino acid sequence) was obtained by using a commercially available peptide synthesizer (ABI 433A peptide synthesizer (a product of Applied Biosystems)). ^TM It was synthesized by a solid phase synthesis method (Fmoc method) according to the protocol. In addition, HATU (Applied Biosystems) was used as a condensing agent, and the resin and amino acid used in the solid phase synthesis method were purchased from NOVA biochem. In the Fmoc-amino acid, tert-butoxycarbonyl (Boc) is used as a protective group for the side chain functional group of lysine, triphenylmethyl (Trt) is used as a protective group for the functional group of histidine, and triphenylmethyl (Trt) is used as a protective group for arginine. Pentamethylchroman-6-sulfonyl (Pmc) was used as a protecting group.
When amidating the C-terminus of the amino acid sequence, "Fmoc-PAL-Polyethylene (PEG-PS) resin" was used as a solid phase carrier.
[0045]
The peptide chain was extended from the Fmoc-amino acid bound to the resin by repeating the deprotection group reaction and the condensation reaction according to the synthesis program of the peptide synthesizer to obtain a synthetic peptide having a desired chain length.
As a specific example, Fmoc which is an amino protecting group of an amino acid is cleaved and removed with 20% piperidine / dimethylformamide (DMF) (a grade for peptide synthesis, manufactured by Kanto Chemical Co., Ltd.), washed with DMF, and washed with DMF. (-OH) The operation of reacting each 3 eq and washing with DMF was repeated. Then, after all the elongation reactions of the peptide chain were completed, the Fmoc group was cleaved with 20% piperidine / DMF, and the reaction product was washed in the order of DMF and methanol.
The peptide was cleaved from the resin simultaneously with the deprotection of the side chain functional groups. This method is based on 82.5% Trifluoroacetic acid (TFA) (TFA: 1,2-ethandithiol: m-cresole: Thioanisole: water = 82.5: 2.5: 5: 5: 5) (above, Wako Pure) 5 ml) and reacted at room temperature for 3 hours.
After removing the resin and precipitating in diethyl ether, the mixture was centrifuged (3000 rpm, 4 ° C., 3 min) to remove the ether layer. This operation was repeated three times. Finally, after removing the ether layer, the peptide was air-dried and dissolved in pure water. Those not dissolved in pure water were dissolved in a 30% or less aqueous solution of ethanol. Thereafter, it was freeze-dried.
[0046]
The obtained peptide precipitate was vacuum-dried and purified using a high performance liquid chromatograph. Specifically, a precolumn (product of Guard-Pak, product name Deltapak C18 A300) and a C18 reverse phase column (DAISOPAK SP-120-5-ODS-AP, 20 mm ID × 250 mm (DAISO)) were used. A mixture of a 0.1% aqueous trifluoroacetic acid solution and a 0.1% trifluoroacetic acid acetonitrile solution was used as an eluent. That is, while increasing the amount of the trifluoroacetate acetonitrile solution contained in the eluent with time (providing a concentration gradient from 10% to 80% in volume ratio), the above column was used at a flow rate of 7 ml / min. Separation and purification were performed for 40 to 50 minutes. The peptide eluted from the reversed phase column was detected at 220 nm using an ultraviolet detector, and is shown as a peak on a recording chart. In addition, the molecular weight of each eluted peptide was determined by using a KRATOS mass spectrometer KOMPACT MALDI III (manufactured by Shimadzu Corporation) using MALDI-TOF / MS (Matrix-Assisted Laser Desorption Time of Flight Mass Spec-Time laser-assisted time-type laser-time-time-time-time-time-time-time-time-time-time-time laser-time matrix-time-on-time laser-time matrix-time-on-time laser-on-time-on-line-on-time-on-line-time Mass spectrometry). As a result, it was confirmed that the target peptide was synthesized and purified.
[0047]
<Example 2>
○ Antibacterial activity of synthetic peptides
For the antimicrobial peptide according to the present invention (samples 1 to 5) and the comparative example, the antimicrobial activity against gram-negative bacteria and gram-positive bacteria (minimum inhibitory concentration: MIC) described below was measured using a 96-well microplate. It was determined by the liquid medium dilution method used.
○ Test bacteria
・ Gram-positive bacteria
Bacillus subtilis ATCC 6633
Micrococcus luteus IFO12708
Staphylococcus aureus IFO12732
Staphylococcus aureus IID1677 (MRSA)
・ Gram-negative bacteria
Escherichia coli IFO12713
Escherichia coli O157: H7 sakai
Klebsiella pneumoniae ATCC4352
Pseudomonas aeruginosa ATCC10145
Salmonella enteritidis IFO3313
[0048]
A liquid broth medium (DIFCO product "", which has a peptide concentration of 500, 250, 125, 62.5, 31.3, 15.6, 7.8, 3.9, 1.9, 1.0 and 0.5 μM. NUTRIENT BROTH Dehydrated ”) was prepared and dispensed into a 96-well microplate by 150 μl each. On the other hand, a bacterial solution (approximately 2 × 10 5 ⁶ cells / mL) was inoculated into each well of a 96-well microplate in the same amount as the drug solution (the above-mentioned peptide-containing broth medium). After the inoculation, the cells were cultured in a thermostat at 37 ° C., and the growth of the bacteria was examined by turbidity 24 hours later. At the time of this measurement, the minimum concentration of the specimen in which no bacterial growth was observed was defined as the MIC in this example.
Table 2 shows the MICs of Nisin used as Samples 1 to 5 and Comparative Samples based on the antibacterial test.
[0049]
[Table 2]

[0050]
As is clear from the results shown in Table 2, the peptides according to the present invention (samples 1 to 5) are nisin (Nisin, Sigma Aldrich), which is an existing antibacterial peptide widely used worldwide as a comparative example. As compared to gram-positive bacteria, and also showed high antibacterial activity against gram-negative bacteria and drug-resistant bacteria.
From the results shown in Table 2, it was confirmed that the antibacterial peptide according to the present invention had excellent antibacterial activity and broad antibacterial spectrum against Gram-negative, Gram-positive, and drug-resistant bacteria.
[0051]
<Comparative Example 2>
With respect to Sample 6, the antibacterial activity of Staphylococcus aureus IFO12732 and Escherichia coli IFO12713 was examined in the same manner as in Example 2, but the MIC was 400 μg / ml or more, and no antibacterial activity was observed.
[0052]
The antibacterial activity of sample 6 having one basic amino acid residue was examined, but no antibacterial activity was observed. However, since antimicrobial activity is observed in samples 1 to 5 described in Example 2, the antimicrobial peptide of the present invention has two sites where two or more basic amino acid residues are continuous. Indicates that you need to.
[0053]
As mentioned above, although the specific example of this invention was demonstrated in detail, these are only illustrations and do not limit a claim. The technology described in the claims includes various modifications and alterations of the specific examples illustrated above. In addition, the technical elements described in the present specification exhibit technical usefulness alone or in various combinations, and are not limited to the claims as filed. Further, the technology exemplified in the present specification achieves a plurality of objects at the same time, and has technical utility by achieving one of the objects.
[0054]
【The invention's effect】
The antimicrobial peptide of the present invention has excellent antibacterial activity against gram-negative, gram-positive, drug-resistant bacteria and a broad antibacterial spectrum, and is therefore useful as an antibacterial agent or a disinfectant. In addition, the solubility and the charge of the whole antimicrobial peptide can be controlled by the method for designing an antimicrobial peptide of the present invention, so that an antimicrobial peptide suitable for the intended use can be obtained.
[0055]
[Sequence List Free Text]
SEQ ID NO: 1 designed antimicrobial peptide
SEQ ID NO: 2 designed antimicrobial peptide
SEQ ID NO: 3 designed antimicrobial peptide
SEQ ID NO: 4 designed antimicrobial peptide
SEQ ID NO: 5 designed antimicrobial peptide
SEQ ID NO: 6 designed peptide
[0056]
[Sequence list]

Claims

An antibacterial peptide having 7 to 30 amino acid residues, including a site where two or more basic amino acid residues are continuous at two positions other than the terminal of the peptide.

The sequence at the site where two or more basic amino acid residues are continuous is the same residue, the same sequence or the reverse sequence, and the sequence at the N-terminal and C-terminal hydrophobic amino acid residue sites is the same residue. The antimicrobial peptide according to claim 1, which has a group, an identical sequence or an inverted sequence.

The amino acid sequence has the following formula (1)
D- (Xa) n1- (Xb) n2- (Xc) n3- (Xb) n2- (Xa) n1-CO-E (1)
The antimicrobial peptide according to claim 1 or 2, which is
Xa in the formula (1) represents a hydrophobic amino acid residue which may be different from each other;
Xb represents a basic amino acid residue which may be different from each other;
Xc represents a hydrophobic amino acid residue and / or a neutral amino acid residue which may have a basic amino acid residue which is not adjacent to Xb, which may be different from each other;
D represents an amino group, an NHCHO group or an NH acyl group;
E represents a hydroxyl group or an amino group,
n1 is an integer of 1 or more, n2 is an integer of 2 or more, and n3 is an integer of 1 or more.

An antimicrobial peptide comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, or SEQ ID NO: 5 in the sequence listing.

An antibacterial agent or disinfectant comprising the antibacterial peptide according to claim 1.

The sequence of the site where two or more basic amino acid residues at two positions other than the terminal of the peptide are continuous is the same residue, the same sequence or the reverse sequence,
N-terminal and C-terminal hydrophobic amino acid residue site sequence is the same residue, the same sequence or reverse sequence,
A sequence flanked by two or more consecutive basic amino acid residues at two positions other than the terminal of the peptide is defined as a basic sequence not adjacent to the two or more consecutive basic amino acid residues. May have a hydrophobic amino acid residue and / or a neutral amino acid residue,
A method for designing an antimicrobial peptide having 7 to 30 amino acid residues.