【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、コーヒー由来パラキサンチンＮ−メチルトランスフェラーゼ、該酵素をコードするＤＮＡまたはＲＮＡ、該ＤＮＡで形質転換された微生物および植物、ならびに該植物またはその培養細胞または組織を用いて、該ＲＮＡを含む核酸構造物によりカフェインまたはその前駆体量を変化させる方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
カフェインは、チャ（Ｃａｍｅｌｌｉａ ｓｉｎｅｎｓｉｓ）等のツバキ科ツバキ属植物、コーヒー（Ｃｏｆｆｅａ ａｒａｂｉｃａ）等のアカネ科コーヒー属植物、マテ（Ｉｌｅｘ ｐａｒａｇｕａｒｉｅｎｓｉｓ）等のモチノキ属植物等に含まれるプリンアルカロイドであり、医薬品原料や食品添加物として使用されている。現在のところ、カフェインは前記植物種を始めとするカフェイン産生植物からの抽出、または有機合成によって製造されている。また、チャやコーヒー、マテ茶などの嗜好品においては、それらの刺激性を緩和また又は増強するために、古典的な育種手法等を用いてカフェインおよびその中間体の含有量の低減または増加が試みられている。
【０００３】
カフェインはキサントシンからテオブロミンを経る３段階のＮ−メチル化、ないしキサントシンからパラキサンチンを経るバイパス経路により生合成されることが１４Ｃ−トレーサー実験により明らかにされている。［Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， ３１， ２５７５−（１９９２）］。このメチル化を触媒する酵素活性は、１９７５年にチャ葉の粗抽出液を用いた研究で最初に報告された［Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．， １４６， ８７−（１９７５）］。コーヒーでメチルトランスフェラーゼの精製が試みられているが［Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， ３７， １５７７−（１９９４）］、精製倍率はきわめて低かった。チャでは、メチルトランスフェラーゼの部分精製の報告はあるが［Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｐｌａｎｔ．， ９８， ６２９−（１９９６）］、酵素タンパク質は単離されていなかった。このような中、カフェインシンターゼ、即ち、カフェイン生合成の最終反応である７−メチルキサンチンからテオブロミンを経由してカフェインへの２段階のメチル化反応を触媒するＮ−メチルトランスフェラーゼのアミノ酸配列及びそのアミノ酸配列をコードするＤＮＡに関しては、チャ（Ｃａｍｅｌｌｉａ ｓｉｎｅｎｓｉｓ）から加藤等が世界に先駆けて単離精製し、報告している（欧州特許公開第１０５５７２７号公報、特開２００２−８５０７２公報）。
【０００４】
また、コーヒーにおいては７−メチルキサンチン〜テオブロミンの一段階のみのメチル化を触媒する酵素の存在について、同グループが世界に先駆けて単離し報告している（日本植物生理学会２００１年度年会講演要旨集、平成１３年３月２５日）。更に、コーヒーより７−メチルキサンチンからテオブロミンを経由してカフェインへの２段階のメチル化反応を触媒するＮ−メチルトランスフェラーゼのアミノ酸配列及びその酵素をコードするＤＮＡに関しては、同グループが世界に先駆けて単離精製している（日本植物生理学会２００２年度年会講演要旨集、平成１４年３月３０日）。
しかしながら、パラキサンチンのみを基質とするＮ−メチルトランスフェラーゼの存在は、これまでのところ全く知られていなかった。
【０００５】
【特許文献１】欧州特許公開第１０５５７２７号公報
【０００６】
【特許文献２】特開２００２−８５０７２公報
【０００７】
【非特許文献１】Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， ３１， ２５７５−（１９９２）
【０００８】
【非特許文献２】Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．， １４６， ８７−（１９７５）
【０００９】
【非特許文献３】Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｐｌａｎｔ．， ９８， ６２９−（１９９６）
【００１０】
【非特許文献４】日本植物生理学会２００１年度年会講演要旨集
【００１１】
【非特許文献５】日本植物生理学会２００２年度年会講演要旨集
【００１２】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、パラキサンチンＮ−メチルトランスフェラーゼをコードするＤＮＡまたはＲＮＡの全部もしくは一部を微生物または植物細胞にセンスまたはアンチセンスの形で組み込むことにより、以下の目的を達成しようとするものである。
（１） 工業用、食品用または医療用酵素として利用できるパラキサンチンＮ−メチルトランスフェラーゼを効率よく生産する。
（２） カフェイン産生植物、植物組織または植物細胞のカフェイン生合成代謝を改変してカフェイン代謝系の化合物群の生成比を改変する。
【００１３】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、鋭意研究の結果、先に単離したチャ（Ｃａｍｅｌｌｉａ ｓｉｎｅｎｓｉｓ）のカフェインシンターゼのＤＮＡ配列を基にプライマーを作成し、このプライマーを用いてコーヒー（Ｃｏｆｆｅａ ａｒａｂｉｃａ）のｍＲＮＡから新たなホモログ遺伝子を単離した。次にこのＤＮＡをベクターに組み込んだ後大腸菌に導入し、当該ＤＮＡに由来するタンパク質を大量に発現させた。このタンパク質の酵素学的性質を調べたところ、得られた遺伝子が基質としてパラキサンチンのみを基質とするパラキサンチンＮ−メチルトランスフェラーゼをコードする遺伝子であることを確認した。本発明者らは以上の知見に基づいて本発明を完成するに至った。
【００１４】
則ち本発明は以下のとおりである。
［１］ 配列表の配列番号１に記載の１番から３８４番のアミノ酸配列で規定され、かつパラキサンチンＮ−メチルトランスフェラーゼの酵素活性を有するポリペプチド。
［２］ 上記［１］に記載のポリペプチドをコードするＤＮＡ。
［３］ 配列表の配列番号１の１番〜１３４５番の塩基配列で規定される上記［２］に記載のＤＮＡ。
［４］ 上記［１］に記載のポリペプチドをコードするＲＮＡ。
［５］ 配列表の配列番号２の１番〜１３４５番の塩基配列で規定される上記［４］に記載のＲＮＡ。
［６］ 上記［２］または［３］に記載のＤＮＡを含むベクター。
［７］ 微生物および／または植物の細胞内で、パラキサンチンＮ−メチルトランスフェラーゼの酵素活性を有するポリペプチドを発現させることができる上記［６］記載のベクター。
［８］ 微生物および／または植物の細胞内で、パラキサンチンＮ−メチルトランスフェラーゼの酵素の発現を抑える効果を有するアンチセンスＲＮＡを発現させることができる［６］記載のベクター。
［９］ 上記［４］または［５］に記載のＲＮＡを含むベクター。
［１０］ 微生物および／または植物の細胞内で、パラキサンチンＮ−メチルトランスフェラーゼの酵素の発現を抑える効果を有するアンチセンスＲＮＡを発現させることができる上記［９］記載のベクター。
［１１］ 上記［６］〜［１０］のいずれか一項に記載のベクターで形質転換された微生物。
［１２］ 上記［１１］記載の形質転換された微生物を用いて、パラキサンチンＮ−メチルトランスフェラーゼの酵素活性を有するポリペプチドを製造する方法。
［１３］ 上記［６］〜［１０］のいずれか一項に記載のベクターで形質転換された植物細胞、植物組織または植物体。
［１４］ 上記［１３］に記載の形質転換植物、該植物の培養細胞または植物を用いて植物二次代謝産物を製造する方法。
［１５］ 植物二次代謝産物が、キサントシン、７−メチルキサントシン、７−メチルキサンチン、テオブロミン、テオフィリン、カフェインから選ばれる少なくとも１つ以上の化合物である上記［１４］記載の方法。
［１６］ 形質転換植物がツバキ（Ｃａｍｅｌｌｉａ）属植物、コーヒー（Ｃｏｆｆｅａ）属植物、がコラノキ（Ｃｏｌａ）属植物、コカノキ（Ｅｒｙｔｈｒｏｘｙｌｕｍ）属植物、モチノキ（Ｉｌｅｘ）属植物、ネエア（Ｎｅｅａ）属植物、アオギリ（Ｆｉｒｍｉａｎａ）属植物、ポーリニア（Ｐａｕｌｌｉｎｉａ）属植物又はカカオノキ（Ｔｈｅｏｂｒｏｍａ）属植物である上記［１５］記載の方法。
【００１５】
【発明の実施の形態】
本発明にかかるパラキサンチンＮ−メチルトランスフェラーゼは、基質として、唯一パラキサンチンのみを触媒するＮ３メチルトランスフェラーゼとしての酵素活性を有することを特徴とするポリペプチドであり、一例としてコーヒー由来のポリペプチドである。
【００１６】
このパラキサンチンＮ−メチルトランスフェラーゼとしては、配列番号：１に示したアミノ酸配列を有しているもの、配列番号：１のアミノ酸配列に、所望とするパラキサンチンＮ−メチルトランスフェラーゼ活性を損なわない範囲で、アミノ酸の置換、挿入または欠失を行って得られた変異アミノ酸配列を有しているものを挙げることができる。すなわち、本発明においては所望とする上記のパラキサンチンＮ−メチルトランスフェラーゼ活性を有する配列番号：１のアミノ酸配列及びその変異配列を有するポリペプチドをパラキサンチンＮ−メチルトランスフェラーゼと称する。
【００１７】
上記の変異アミノ酸配列を有するポリペプチドとしては、それ自身が実質的にコーヒーのパラキサンチンＮ−メチルトランスフェラーゼと同等の機能を有し、且つ配列番号：１のアミノ酸配列と酵素活性にかかわる部位においてストリンジェントな条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列によりコードされているポリペプチドを挙げることができる。
【００１８】
本発明にかかるパラキサンチンＮ−メチルトランスフェラーゼをコードするヌクレオチド配列、すなわちパラキサンチンＮ−メチルトランスフェラーゼ遺伝子としては、配列番号：１のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を挙げることができ、その具体例としては、配列番号：１のＤＮＡ配列、配列番号：２のＲＮＡ配列を挙げることができる。これらのパラキサンチンＮ−メチルトランスフェラーゼ遺伝子に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、上記パラキサンチンＮ−メチルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列も、本発明におけるパラキサンチンＮ−メチルトランスフェラーゼをコード遺伝子に含まれる。
【００１９】
所望とするパラキサンチンＮ−メチルトランスフェラーゼ活性を維持した変異アミノ酸配列としては、この変異アミノ酸配列をコードする変異ヌクレオチド配列と、配列番号：１のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列とがストリンジェントな条件下でハイブリダイズし得るものが実用上好適に利用し得る。
【００２０】
また、変異パラキサンチンＮ−メチルトランスフェラーゼ遺伝子としても、配列番号：１のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし得るものが実用上好適に利用し得る。その具体例としては、配列番号：１のヌクレオチド配列にストリンジェントな条件下でハイブリダイズし得るＤＮＡ分子及び配列番号：２のヌクレオチド配列にストリンジェントな条件下でハイブリダイズし得るＲＮＡ分子を挙げることができる。
【００２１】
このストリンジェントな条件下でのハイブリダイゼーションは、例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ； Ｗｉｌｅｙ Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅに記載の方法によって行うことができ、市販のシステムとしては、ＧｅｎｅＩｍａｇｅシステム（アマシャム）を挙げることができる。具体的には以下の操作によってハイブリダイゼーションを行うことができる。
【００２２】
試験すべきＤＮＡまたはＲＮＡ分子を転写した膜を、製品プロトコールに従って、標識したプローブとプロトコール指定のハイブリダイゼーションバッファー中でハイブリダイズさせる。ハイブリダイゼーションバッファーの組成は、０．１重量％ＳＤＳ、５重量％デキストラン硫酸、１／２０容のキット添付のブロッキング試薬及び２〜７×ＳＳＣからなる。ブロッキング試薬としては、例えば、１００×Ｄｅｎｈａｒｄｔ‘ｓ ｓｏｌｕｔｉｏｎ、２％（重量／容量）Ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ ａｌｂｕｍｉｎ ２％（重量／容量）ＦｉｃｏｌｌＴＭ４００、２％（重量／容量）ポリビニルピロリドンを５倍濃度で調製したものを１／２０に希釈して使用することができる。２０×ＳＳＣは、３Ｍ塩化ナトリウム、０．３Ｍクエン酸溶液であり、ＳＳＣは、より好ましくは、３〜６×ＳＳＣ、更に好ましくは、４〜５×ＳＳＣの濃度で使用する。
【００２３】
ハイブリダイゼーションの温度は、４０〜８０℃、より好ましくは５０〜７０℃、更に好ましくは５５〜６５℃の範囲であり、数時間から一晩のインキュベーションを行った後、洗浄バッファーで洗浄する。洗浄の温度は、好ましくは室温、より好ましくはハイブリダイゼーション時の温度である。洗浄バッファーの組成は、６×ＳＳＣ＋０．１重量％ＳＤＳ溶液、より好ましくは４×ＳＳＣ＋０．１重量％ＳＤＳ溶液、更に好ましくは２×ＳＳＣ＋０．１重量％ＳＤＳ溶液、更に好ましくは１×ＳＳＣ＋０．１重量％ＳＤＳ溶液、最も好ましくは０．１×ＳＳＣ＋０．１重量％ＳＤＳ溶液である。このような洗浄バッファーで膜を洗浄し、プローブがハイブリダイズしたＤＮＡ分子またはＲＮＡ分子を、プローブに用いた標識を利用して識別することができる。
【００２４】
なお、変異は、自然界において生じたものでもよく、ヌクレオチド配列における部位突然変異により人工的に起こしたものでも良い。
【００２５】
本発明のパラキサンチンＮ−メチルトランスフェラーゼ遺伝子とその近傍の領域を有するＤＮＡ分子は、例えば、パラキサンチンＮ−メチルトランスフェラーゼをコードするＤＮＡ分子に特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いたＰＣＲ技術（植物のＰＣＲ実験プロトコール（細胞工学別冊、植物細胞工学シリーズ２）秀潤社（１９９５））を利用して、本発明にかかるパラキサンチンＮ−メチルトランスフェラーゼを生産する細胞から分離することができる。
【００２６】
具体的には、ｍＲＮＡから合成したｃＤＮＡにリンカーを結合させ、パラキサンチンＮ−メチルトランスフェラーゼを構成するアミノ酸配列をコードするＤＮＡとリンカー間でＰＣＲを行うこと等により、目的ｃＤＮＡの全長配列を単離することができる。
【００２７】
このようなハイブリダイゼーション技術やＰＣＲ技術により得られるパラキサンチンＮ−メチルトランスフェラーゼをコードするＤＮＡ分子は、少なくとも単離に使用する部位においては、配列番号：１に記載のパラキサンチンＮ−メチルトランスフェラーゼ遺伝子とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするヌクレオチドである。
【００２８】
本発明にかかるパラキサンチンＮ−メチルトランスフェラーゼをコードするヌクレオチド配列（遺伝子）を有するＤＮＡ分子またはＲＮＡ分子を単離するために用いる生物としては、カフェインまたはその前駆体を産生する生物であればすべて使用できるが、中でもマテ（Ｉｌｅｘ ｐａｒａｇｕａｒｉｅｎｓｉｓ）等のモチノキ属植物、チャ等のツバキ科ツバキ（Ｃａｍｅｌｌｉａ）属植物、コーヒー等のアカネ科コーヒー（Ｃｏｆｆｅａ）属植物、コラノキ等のアオギリ科コラノキ（Ｃｏｌａ）属植物等を例示することができる。
【００２９】
次にパラキサンチンＮ−メチルトランスフェラーゼを含む発現ベクターの構築方法ならびに形質転換植物の作製方法及びＲＮＡｉ法によるパラキサンチンＮ−メチルトランスフェラーゼ酵素の発現抑制方法について説明する。
本発明のパラキサンチンＮ−メチルトランスフェラーゼ遺伝子もしくはそのアンチセンスＲＮＡを植物細胞内で発現させるためには、（ｉ）植物細胞内で転写可能なプロモーター、（ｉｉ）プロモーターの下流にセンス方向またはアンチセンス方向に連結したパラキサンチンＮ−メチルトランスフェラーゼ遺伝子ＤＮＡの全部または一部、（ｉｉｉ）必要に応じて該遺伝子ＤＮＡの下流に連結された転写産物の安定化に必要なポリアデニレーション部位を含むターミネーター配列、を含む発現カセットを植物細胞に導入する。
【００３０】
ここでアンチセンスＲＮＡの鋳型としては、パラキサンチンＮ−メチルトランスフェラーゼ遺伝子を有するＤＮＡ分子の全部または一部またはそれらとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡ分子をアンチセンス方向に連結したヌクレオチド配列、あるいはパラキサンチンＮ−メチルトランスフェラーゼ遺伝子を有するＲＮＡ分子の全部または一部またはそれらとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＲＮＡ分子をアンチセンス方向に連結したヌクレオチド配列であって、カフェインまたはその前駆体を産生する宿主細胞中において発現した際に宿主細胞におけるパラキサンチンＮ−メチルトランスフェラーゼの発現を阻害する機能を有するものを挙げることができる。
【００３１】
ここで、パラキサンチンＮ−メチルトランスフェラーゼ遺伝子の一部とは、その部分に相補性を有する配列を基礎として得られる阻害用のｍＲＮＡ、すなわちアンチセンスＲＮＡが宿主細胞中で形成された際に、これが宿主細胞におけるパラキサンチンＮ−メチルトランスフェラーゼを発現させるためのｍＲＮＡと結合して、宿主細胞におけるパラキサンチンＮ−メチルトランスフェラーゼの発現が阻害される部分である。この部分としては、このようなアンチセンスｍＲＮＡの形成に必要となる部分であり、例えば少なくとも１４塩基長の長さの部分を挙げることができる。
【００３２】
アンチセンスｍＲＮＡ形成用のＤＮＡ分子としては、例えば、配列番号：１のヌクレオチド配列の全部または一部と相補性を有しているＤＮＡ分子を挙げることができ、アンチセンスＲＮＡ分子としては、配列番号：２のヌクレオチド配列の全部または一部と相補性を有しているＲＮＡ分子を挙げることができる。これらのヌクレオチド配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし得る変異配列の全部または一部と相補性を有しているＤＮＡ分子またはＲＮＡ分子もこのような目的に用いることができる。
【００３３】
これらの阻害用のＤＮＡ分子またはＲＮＡ分子自体は、必ずしも本発明にかかるパラキサンチンＮ−メチルトランスフェラーゼをコードするものでなくともよい。
【００３４】
発現カセットは、挿入されているＤＮＡを恒常的または誘導的に発現させるためのプロモーターを含有し得る。恒常的に発現させるためのプロモーターとしては、例えば、カリフラワーモザイクウイルスの３５Ｓプロモーター、イネのアクチンプロモーターなどが挙げられる。また、誘導的に発現させるためのプロモーターとしては、例えば糸状菌、細菌、ウイルスの感染や侵入、低温、高温、乾燥、嫌気的条件、特定の化合物の散布等の外因によって発現することが知られているプロモーター等が挙げられる。このようなプロモーターとしては、例えば、糸状菌、細菌、ウイルスの感染や侵入によって発現するイネのキチナーゼ遺伝子のプロモーターやタバコのＰＲタンパク質遺伝子のプロモーター、低温によって誘導されるイネの「ｌｉｐ１９」遺伝子のプロモーター、高温によって誘導されるシロイヌナズナの「ＨＳＰ１８．２」遺伝子のプロモーター、乾燥によって誘導されるイネの「ｒａｂ」遺伝子のプロモーター、嫌気的条件で誘導されるトウモロコシのアルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子のプロモーター等が挙げられる。またイネのキチナーゼ遺伝子のプロモーターとタバコのＰＲタンパク質遺伝子のプロモーターはサリチル酸等の特定の化合物によって、イネの「ｒａｂ」遺伝子プロモーターは植物ホルモンのアブシジン酸の散布によっても誘導される。
【００３５】
或いはまた、発現カセットに挿入されているＤＮＡを発現させるためのプロモーターとしては、パラキサンチンＮ−メチルトランスフェラーゼ遺伝子のプロモーターを単離して利用する方法も挙げられる。具体的なプロモーターの単離方法の一例には、パラキサンチンＮ−メチルトランスフェラーゼ遺伝子、例えばパラキサンチンＮ−メチルトランスフェラーゼ遺伝子のＤＮＡの全部又は一部をプローブとしたハイブリダイゼーション技術の利用により、ゲノムＤＮＡ断片を選択し、該遺伝子の上流部ＤＮＡを特定する方法を挙げることができる。
【００３６】
組み換えＤＮＡ分子の植物への導入に備えるために、大腸菌の複製シグナル及び形質転換された細菌の細胞を選抜するためのマーカー遺伝子を含むクローニングベクターが数多く利用できる。このようなベクターの例には、ｐＢＲ３２２、ｐＵＣ系、Ｍ１３ｍｐ系等がある。適当な制限酵素切断部位で、目的の配列をベクターに導入することができる。得られたプラスミドＤＮＡの特徴を明らかにするため、制限酵素切断部位分析、ゲル電気泳動、及びその他の生化学的−分子生物学的方法が一般に用いられる。各々の操作を終えた後、プラスミドＤＮＡを切断して、別のＤＮＡに結合させることができる。各プラスミドＤＮＡの配列を、同じプラスミド又は別のプラスミド中にクローニングすることができる。
【００３７】
植物宿主細胞の中に発現カセットを導入するためには、さまざまな手法を用いることができる。これらの手法には、形質転換因子としてアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）または、アグロバクテリウムリゾゲネス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓ）を用いたＴ−ＤＮＡによる植物細胞の形質転換、プロトプラストへの直接導入（インジェクション法、エレクトロポレーション法等）、パーティクルガン法等やその他の可能性が含まれる。
【００３８】
プロトプラストへの直接導入では、特別に必要とされるベクターはない。例えば、ｐＵＣ誘導体のような単純なプラスミドを用いることができる。目的の遺伝子を植物細胞に導入する方法によっては、他のＤＮＡ配列が必要になることもある。例えばＴｉまたはＲｉプラスミドを植物細胞の形質転換に用いる場合には、ＴｉおよびＲｉプラスミドのＴ−ＤＮＡ領域の少なくとも右端の配列、大抵は両端の配列を、導入されるべき遺伝子の隣接領域となるように接続しなければならない。
【００３９】
アグロバクテリウム属菌を形質転換に用いる場合には、導入すべき発現カセットを、特別のプラスミド、すなわち中間ベクターまたはバイナリーベクター中にクローニングする必要がある。中間ベクターはアグロバクテリウム属菌の中では複製されない。中間ベクターは、ヘルパープラスミドあるいはエレクトロポレーションによってアグロバクテリウム属菌の中に移行される。中間ベクターは、Ｔ−ＤＮＡの配列と相同な領域をもつため、相同組換えによって、アグロバクテリウム属菌のＴｉまたはＲｉプラスミド中に取り込まれる。宿主として使われるアグロバクテリウム属菌には、ｖｉｒ領域が含まれている必要がある。通常ＴｉまたはＲｉプラスミドにｖｉｒ領域が含まれており、その働きにより、Ｔ−ＤＮＡを植物細胞に移行させることができる。
【００４０】
一方、バイナリーベクターはアグロバクテリウム属菌の中で複製、維持され得るので、ヘルパープラスミドあるいはエレクトロポレーション法によってアグロバクテリウム属菌中に取り込まれると、宿主のｖｉｒ領域の働きによって、バイナリーベクター上のＴ−ＤＮＡを植物細胞に移行させることができる。
なお、このようにして得られた発現カセットを含む中間ベクターまたはバイナリーベクター、及びこれを含む大腸菌やアグロバクテリウム属菌等の微生物も本発明の対象である。
【００４１】
形質転換された植物細胞は、再生過程を経ることにより植物体に変換することができる。再生の方法は植物細胞の種類により異なるが、例えばイネではＦｕｊｉｍｕｒａら［Ｐｌａｎｔ Ｔｉｓｓｕｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｌｅｔｔ．， ２， ７４−（１９９５）］の方法、トウモロコシでは、Ｓｈｉｌｌｉｔｏら［Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， ７， ５８１−（１９８９）］の方法、シロイヌナズナではＡｋａｍａらの方法［Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐ．， １２，７−（１９９２）］などが挙げられる。
【００４２】
これらの方法により作出された植物体は、カフェイン及びカフェインまたはその前駆体を産生する野生型の植物体と比較して本発明のパラキサンチンＮ−メチルトランスフェラーゼタンパク質の発現量が変化し、ホスト植物の代謝の改変によるカフェイン及びテオブロミン代謝系化合物の生成量の変化や、ホスト植物の代謝の改変によるカフェイン及びテオブロミン代謝系化合物群の生成比の変化が起こる。このようにして得られたトランスジェニック植物は本発明の対象である。本発明において、「植物体」とは植物に分類される生物個体の全体もしくは一部の器官（例えば、葉、茎、根、花、果実、種子等）もしくは培養細胞を指す。
【００４３】
前記のＳＡＭをメチル基供与体としてカフェインを生成する植物としては、チャなどのツバキ科ツバキ（Ｃａｍｅｌｌｉａ）属植物、コーヒーなどのアカネ科コーヒー（Ｃｏｆｆｅａ）属植物、カカオノキ（Ｔｈｅｏｂｒｏｍａ）属植物、コラノキなどのアオギリ科コラノキ（Ｃｏｌａ）属植物など、カフェイン産生植物を例示することができる。
【００４４】
本発明にかかるパラキサンチンＮ−メチルトランスフェラーゼをコードするＤＮＡを導入してパラキサンチンＮ−メチルトランスフェラーゼタンパク質を大量に発現させるための微生物としては、大腸菌や枯草菌等の細菌及びバキュロウイルス等のウイルスを例示することができる。
【００４５】
また、ホスト細胞の代謝を改変して特定化合物の生産性向上や特定の化合物群の生成比改変を図ることを目的に、本発明にかかるパラキサンチンＮ−メチルトランスフェラーゼをコードするＤＮＡをセンスまたはアンチセンスの形で組み込む植物としては、カフェインまたはその前駆体を産生する植物であればすべて使用できるが、中でもチャなどのツバキ科ツバキ（Ｃａｍｅｌｌｉａ）属植物、コーヒーなどのアカネ科コーヒー（Ｃｏｆｆｅａ）属植物、カカオノキ（Ｔｈｅｏｂｒｏｍａ）属植物、コラノキなどのアオギリ科コラノキ（Ｃｏｌａ）属植物などを例示することができる。
【００４６】
これらの方法により作出された植物体は、カフェインまたはその前駆体を産生する野生型の植物体と比較して本発明のパラキサンチンＮ−メチルトランスフェラーゼの発現量が変化し、ホスト植物の代謝の改変によるカフェイン代謝系化合物の生成量の変化や、ホスト植物の代謝の改変によるカフェイン代謝系化合物群の生成比の変化が起こる。このようにして得られたトランスジェニック植物は本発明の対象である。
【００４７】
また近年、植物のポストトランスレーショナルなジーンサイレンシングの研究から、ウイルス等の外来核酸に対して植物が本来備えている防御機項を利用して、目的遺伝子の発現を抑制することが可能なことがわかってきた（Ｃｅｌｌ，９５，１７７−１８７（１９９８）、化学と生物、３７、５３２−（１９９９）、蛋白質核酸酵素、４４、１３９６−（１９９９））。これによれば、ＤＮＡウイルスやＲＮＡウイルス等が植物に進入した場合、植物はこれらの鋳型からアベラントＲＮＡを転写し、植物が本来持っている配列の転写産物と配列特異的に二本鎖ＲＮＡを形成する。この二本鎖ＲＮＡはＲＮａｓｅにより分解されることにより、目的の遺伝子の発現を抑制することが可能となる（Ｃｅｌｌ，９６， ３０３−（１９９９））。本方法の重要な特徴のひとつは、発現を抑制したい配列を目的植物に必ずしも形質転換させる必要がない点にある。また本方法のさらなる特徴は、植物の一部（下位葉等）に目的の核酸を感染等により導入すれば、その効果が植物体全体に広がることである。具体的な発現抑制方法は、パラキサンチンＮ−メチルトランスフェラーゼ遺伝子またはパラキサンチンＮ−メチルトランスフェラーゼ遺伝子の一部の配列またはそれとストリンジェントな条件下でハイブリダイズする配列の全部または一部を含む二本鎖ＲＮＡや、二本鎖ＤＮＡを持つアグロバクテリウムを植物の下位葉に感染させる。ここで、パラキサンチンＮ−メチルトランスフェラーゼ遺伝子の一部とは、その部分に相補性を有する配列を基礎として得られる阻害用のｍＲＮＡ、すなわちアベラントなＲＮＡが宿主細胞中で形成された際に、これが宿主細胞におけるパラキサンチンＮ−メチルトランスフェラーゼを発現させるためのｍＲＮＡと結合して、宿主細胞におけるパラキサンチンＮ−メチルトランスフェラーゼの発現が阻害される部分である。この部分としては、このようなアベラントなｍＲＮＡの形成に必要となる部分であり、例えば少なくとも１４塩基長の長さの部分を挙げることができる。
【００４８】
これらの方法を施された植物体は、カフェインまたはテオブロミンまたはその前駆体を産生する野生型の植物体と比較して本発明のパラキサンチンＮ−メチルトランスフェラーゼタンパク質の発現量が変化し、ホスト植物の代謝の改変によるカフェイン代謝系化合物の生成量の変化や、ホスト植物の代謝の改変によるカフェイン代謝系化合物群の生成比の変化が起こる。このようにして得られた植物は本発明の対象である。本発明でいう植物には、葉、花、果実、種子などの植物の特定の組織または細胞も含まれる。
【００４９】
上記の構成のベクターで形質転換されたもしくはベクターの感染された植物細胞または植物組織を培養して、あるいは同様に形質転換された植物体を栽培して、カフェイン及びテオブロミン合成系にかかる二次代謝産物の製造やこれらの形質転換体で生産される二次代謝産物の組成の改変を行うことができる。この二次代謝産物としては、例えば、７−メチルキサンチン、パラキサンチン、テオブロミン及びカフェインからなる群から選ばれる少なくとも１つ以上の化合物を挙げることができる。
【００５０】
形質転換に用いる植物細胞、植物組織または植物体の供給原としては、例えば、形質転換植物体が、ツバキ（Ｃａｍｅｌｌｉａ）属植物、コーヒー（Ｃｏｆｆｅａ）属植物、コラノキ（Ｃｏｌａ）属植物、モチノキ（Ｉｌｅｘ）属植物、ネエア（Ｎｅｅａ）属植物、アオギリ（Ｆｉｒｍｉａｎａ）属植物、ポーリニア（Ｐａｕｌｌｉｎｉａ）属植物又はカカオノキ（Ｔｈｅｏｂｒｏｍａ）属植物を挙げることができる。中でもチャなどのツバキ科ツバキ（Ｃａｍｅｌｌｉａ）属植物、コーヒーなどのアカネ科コーヒー（Ｃｏｆｆｅａ）属植物、コラノキなどのアオギリ科コラノキ（Ｃｏｌａ）属植物などを好ましいものとして例示することができる。
【００５１】
【実施例】
以下、実施例および比較例により本発明を更に具体的に説明するが、本発明の範囲はこれらの実施例に限定されるものではない。
【００５２】
［実施例１］ コーヒーからのＲＮＡの調製
（１）ｔｏｔａｌ ＲＮＡの単離
筑波大学農林技術センターから入手した０．５ｇのコーヒー（Ｃｏｆｆｅａ ａｒａｂｉｃａ）の登熟種子胚乳を液体窒素存在下で乳棒、乳鉢を用いて破砕した。液体窒素の昇華後、５ｍｌの２％ＣＴＡＢ、０．１Ｍ Ｔｒｉｓ（ｐＨ９．５）、２０ｍＭ ＥＤＴＡ、 １．４Ｍ ＮａＣｌ、 ５％β− ｍｅｒｃａｐｔｏｅｔｈａｎｏｌに溶かして６５℃に１０分放置した。等量のクロロホルム液を加えて撹拌し、総量で１０ｍｌ程度にした。１５，０００ｒｐｍ、１０分間の遠心分離を行い、水層をとり、２．５ｍｌの１０Ｍ塩化リチウム液を加え、少なくとも２時間、−２０℃に放置した。４℃、１５，０００ｒｐｍ、１０分間の遠心分離を行い、上清を除去し、沈殿を１ｍｌのＴＥに溶解し、再度、遠心分離を行った。上清を回収し、１ｍｌのＴＥ飽和フェノール溶液を加えて転倒混和し、１５，０００ｒｐｍ、１０分間の遠心分離を行った。さらに上清にフェノール／クロロホルムを加えて撹拌し、１５，０００ｒｐｍ、１０分間の遠心分離を行った。水層を回収し、等量のクロロホルム液を加え、撹拌した。１５，０００ｒｐｍ、１０分間の遠心分離を行い、水層を回収し、１／４倍量の１０Ｍ塩化リチウム液を加え、少なくとも２時間、−２０℃に放置した。１５，０００ｒｐｍ、１０分間の遠心分離を行い、得られた沈殿に７０％ エタノールを加えて、再度、遠心分離を行った。沈殿を真空ポンプでドライアップした後、２００μｌの水に溶解しｔｏｔａｌ ＲＮＡの画分とした。
【００５３】
（２） ｍＲＮＡの単離
上述の方法で得たｔｏｔａｌ ＲＮＡ（２ｍｇ）に６５℃、５分間の熱処理を行った後、等量の２倍濃度Ａ液（１０ ｍＭ Ｔｒｉｓ−塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）、１ｍＭ Ｎａ２−ＥＤＴＡ、０．１％ ＳＤＳ、０．５Ｍ ＮａＣｌ）と混合した。０．１ｇのｏｌｉｇｏ（ｄＴ）−Ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ Ｔｙｐｅ７（ファルマシア）を２ｍｌのＢ液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）、１ｍＭ Ｎａ２−ＥＤＴＡ、０．１％ ＳＤＳ、０．１Ｍ ＮａＣｌ）中で膨潤させ、その懸濁液を先端にガラスウールをつめたブルーチップに注ぎ、２．５ ｍｌの０．１Ｎ ＮａＯＨで洗浄した後、５ｍｌのＡ液を流して平衡化した。このカラムにｔｏｔａｌ ＲＮＡをアプライし、３ｍｌのＡ液、４ｍｌのＢ液を流した後に、ｍＲＮＡを３ｍｌのＣ液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）、１ｍＭ Ｎａ２−ＥＤＴＡ、０．０５％ ＳＤＳ）で溶出した。溶出液をエタノール沈殿によって濃縮し、ドライアップした後水に溶解し−８０℃で保存した。
【００５４】
［実施例２］ コーヒーからのカフェインシンターゼｃＤＮＡの単離
（１）３‘−ＲＡＣＥ法による３’末端側の単離
Ａ． これまでに本発明者等はコーヒーからＮ−メチルトランスフェラーゼを複数単離しているが、パラキサンチンＮ３メチルトランスフェラーゼとしての酵素活性を有するポリペプチドであるＮ−メチルトランスフェラーゼはコーヒーからは単離できなかった。そこで、本発明者等がこれまでに単離したコーヒー由来Ｎ−メチルトランスフェラーゼであるＣＴＳ１（配列番号３）及びＣＴＳ２（配列番号４）を元に、新たに配列番号５〜６のプライマーを設計し、新規なカフェインシンターゼｃＤＮＡ部分配列の単離を行なった。３’−ＲＡＣＥは３’−Ｆｕｌｌ ＲＡＣＥ ＣＯＲＥ Ｓｅｔ（ＴＡＫＡＲＡ）を使用し、下記の反応液中で１ｓｔ ｓｔｒａｎｄ ｃＤＮＡを合成した。尚、合成反応の反応条件は３０℃１０分、５０℃４０分、９５℃５分後氷冷とした。
【００５５】
変性ＲＮＡ（約２μｇ） ９．５μｌ
１０×ＲＮＡ−ＰＣＲバッファー ２ μｌ
ＭｇＣｌ２（２５ｍＭ） ４ μｌ
ｄＮＴＰｓ（１０ｍＭ ｅａｃｈ） ２ μｌ
ｏｌｉｇｏ−ｄＴ ３ｓｉｔｅｓ
ａｄａｐｔｏｒ ｐｒｉｍｅｒ（２．５μＭ） １ μｌ
ＲＮａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ０．５μｌ
ＡＭＶ ＲＴ ｅｎｚｙｍｅ（５Ｕ／μｌ） １ μｌ
【００５６】
Ｂ． 上記Ａ．で得られた生成物を鋳型とし、以下の反応溶液中で、９５℃／１分間反応させた後、９４℃／１分間、５５℃／１分間、７２℃／１．５分間を３０サイクルでＰＣＲを行なった。Ｐｒｉｍｅｒ１には配列番号５の配列を用いた。
【００５７】
１ｓｔ ｓｔｒａｎｄ ｃＤＮＡ ３ μｌ
１０×ＥｘＴａｑ バッファー ５ μｌ
ｄＮＴＰｓ（２．５ｍＭ ｅａｃｈ） ８ μｌ
Ｐｒｉｍｅｒ１（ＣＳ８ｆ） １ μｌ
ｏｌｉｇｏ−ｄＴ ３ｓｉｔｅｓ
ａｄａｐｔｏｒ ｐｒｉｍｅｒ（２．５μＭ））１ μｌ
ＥｘＴａｑ ０．５μｌ
Ｈ２Ｏ ３１．５μｌ
【００５８】
Ｃ． 上記Ｂ．で得られた生成物を鋳型とし、以下の反応液中で、９４℃／１分間、５５℃／１分間、７２℃／４０秒間を３０サイクルでＰＣＲを行ない、ＰＣＲ増幅産物を得た。Ｐｒｉｍｅｒ１には配列番号６の配列を用いた。
【００５９】
１ｓｔ ｓｔｒａｎｄ ｃＤＮＡ ３ μｌ
１０×ＥｘＴａｑ バッファー ５ μｌ
ｄＮＴＰｓ（２．５ｍＭ ｅａｃｈ） ８ μｌ
Ｐｒｉｍｅｒ１（ＣＳ９ｆ） １ μｌ
ｏｌｉｇｏ−ｄＴ ３ｓｉｔｅｓ
ａｄａｐｔｏｒ ｐｒｉｍｅｒ（２．５μＭ） １ μｌ
ＥｘＴａｑ ０．５μｌ
Ｈ２Ｏ ３１．５μｌ
【００６０】
Ｄ． 上記Ｃ．で得られた反応生成物を０．８％ アガロースゲルを用いてＴＡＥ中で電気泳動し、得られた目的生成物のバンドを切り取り、ＧＥＮＥ ＣＬＥＡＮ（フナコシ）を用いてゲルからＤＮＡを回収した。回収したＤＮＡをｐＴ７ｂｌｕｅベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ）にライゲーションした後、大腸菌ＤＨ５αにトランスフォーメーションした。Ｘ−ｇａｌを用いてカラーセレクションを行った後に、アンピシリンを含むＬＢ培地で液体培養を行い、アルカリ−ＳＤＳ法によりプラスミドを抽出した。インサートの有無はアガロース電気泳動によって確認した。
【００６１】
Ｅ． 上記Ｄ．得られた生成物の塩基配列を決定するため、単離したプラスミドを用いて下記の反応液中でプライマーエクステンションを行った。反応条件は９６℃／１分間反応させた後、９６℃／０．２分間、５０℃／０．１分間、６０℃／４分間を２５サイクル行った。反応液に対してエタノール沈殿を行い、得られたＤＮＡ をＴｅｍｐｌａｔｅ ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ ｒｅａｇｅｎｔに溶解し、ＡＢＩ−３１０ジェネティックアナライザーを用いて分析した。
【００６２】
プライマーエクステンション反応液
プラスミドＤＮＡ （２０ｎｇ） ２μｌ
Ｐｒｅｍｉｘ ４μｌ
Ｐｒｉｍｅｒ １μｌ
Ｈ２Ｏ ３μｌ
【００６３】
（２） ５’ＲＡＣＥ法による５’上流域の単離
５’上流域の単離には、５’−Ｆｕｌｌ ＲＡＣＥ Ｃｏｒｅ Ｓｅｔ（ＴＡＫＡＲＡ）を用いた。３’−ＲＡＣＥ法で得られた配列を元に配列番号７〜９のプライマーを設計し、下記の反応液中で１ｓｔ ｓｔｒａｎｄ ｃＤＮＡを合成した。反応中のＰｒｉｍｅｒには配列番号７の配列を用いた。
【００６４】
変性ＲＮＡ（約１５μｇ） １５μｌ
１０×ＲＴバッファー ３μｌ
ＲＮａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ １μｌ
Ｐｒｉｍｅｒ（ＣＳ１０ｒ） １０μｌ
ＡＭＶ ＲＴ ｅｎｚｙｍｅ １μｌ
【００６５】
得られた３０μｌのＲＮＡ−ｃＤＮＡハイブリッドに、２５μｌ ５×バッファー、４５μｌ Ｈ２Ｏ、２μｌ ＲＮａｓｅＨを加え、３０℃ １ｈｒで反応させ、ＲＮＡを分解した。得られた１本鎖ｃＤＮＡは、Ｔ７−ＲＮＡ ｌｉｇａｓｅでセルフライゲーションまたはコンカテマー化した。これを鋳型にし、以下の反応溶液中で、９４℃／１分間、６２℃／１分間、７２℃／１．５分間を３０サイクルでＰＣＲを行い反応生成物を得た。Ｐｒｉｍｅｒ１、２は、配列番号８、９の配列を用いた。アクリルアミド電気泳動により反応生成物のバンドを分離し、ゲルからＤＮＡを回収し、ｐＧＥＭ−Ｔ Ｅａｓｙベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ）にサブクローニングした。
【００６６】
１ｓｔ ｓｔｒａｎｄ ｃＤＮＡ ２ μｌ
１０×ＥｘＴａｑ バッファー ５ μｌ
ｄＮＴＰｓ（２．５ｍＭ ｅａｃｈ） ８ μｌ
Ｐｒｉｍｅｒ１（ＣＳ１１ｆ） １ μｌ
Ｐｒｉｍｅｒ２（ＣＳ１２ｒ） １ μｌ
ＥｘＴａｑ ０．５μｌ
Ｈ２Ｏ ３２．５μｌ
【００６７】
サブクローニングした配列の塩基配列は上述のプライマーエクステンション方法で決定した。得られた塩基配列を配列表の配列番号１に示す。
【００６８】
［実施例３］ カフェインシンターゼの大腸菌での発現と活性測定
単離した新規カフェインシンターゼ遺伝子を発現ベクターｐＥＴ３２ａ（Ｎｏｖａｇｅｎ）に組み込み、このプラスミドを大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）にトランスフォーメーションした。得られた大腸菌を３７℃で２時間培養した後に、ＩＰＴＧを最終濃度０．３ｍＭになるように加え、２５℃でさらに８時間培養を行った。培養終了後集菌し、２００μｌのＴＥＳ−Ｇ ｂｕｆｆｅｒ（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−塩酸緩衝液（ｐＨ８．５）、５ｍＭ ＤＴＴ、５０ｍＭ ＮａＣｌ、２ｍＭ ＥＤＴＡ−Ｎａ２、２０％ ｇｌｙｃｅｒｏｌ）に懸濁し、−８０℃で凍結後、１分間断続的に超音波破砕を行った。これを１４，０００ｒｐｍ、１０分間の遠心分離を行い、得られた上清を酵素液とした。
カフェインシンターゼ活性測定のための反応液は、１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−塩酸緩衝液（ｐＨ８．５）、０．２ｍＭ ＭｇＣｌ２、０．２ｍＭ パラメチルキサンチン、４μＭ ［メチル−１４Ｃ］Ｓ−アデノシルメチオニン（０．９ｋＢｑ）に酵素液１０μｌを加えた物とし、反応液の体積は１００μｌとした。２７℃で１０分間の反応を行い、得られた１４Ｃ−カフェインを１ｍｌのクロロホルムを加えて抽出し、クロロホルム層の放射活性を測定した。対照としては、反応液からパラメチルキサンチンを除いたものを用いた。活性測定の結果、パラキサンチンを基質として加えたときのみカフェインが生成したことが判明した。一方、パラキサンチン以外の基質を使用した場合にはカフェインの生成は認められなかった。
【００６９】
【発明の効果】
本発明によれば、工業用、食品用または医療用酵素として利用できるパラキサンチンＮ−メチルトランスフェラーゼを効率よく生産する事が可能になる。
本発明によれば、カフェイン産生植物、植物組織または植物細胞のカフェイン生合成代謝を改変してカフェイン代謝系の化合物群の生成比を改変することが可能になる。
【００７０】
【配列表】
[0001]
TECHNICAL FIELD OF THE INVENTION
The present invention includes coffee-derived paraxanthine N-methyltransferase, DNA or RNA encoding the enzyme, microorganisms and plants transformed with the DNA, and the RNA using the plant or its cultured cells or tissues. The present invention relates to a method for changing the amount of caffeine or a precursor thereof by a nucleic acid structure.
[0002]
[Prior art]
Caffeine is a purine alkaloid contained in a camellia plant such as Camellia sinensis, a plant belonging to the genus Rubiaceae such as coffee (Coffea arabica), and a plant belonging to the genus Ilex such as mate (Ilex paraguarianensis). Used as a raw material and food additive. At present, caffeine is produced by extraction from caffeine-producing plants including the above plant species, or by organic synthesis. In addition, in luxury items such as tea, coffee, and mate, the content of caffeine and its intermediates is reduced or increased using classical breeding techniques, etc., in order to alleviate or enhance their irritation. Have been tried.
[0003]
14 C-tracer experiments have shown that caffeine is biosynthesized by a three-step N-methylation of xanthosine via theobromine or by a bypass pathway from xanthosine to paraxanthine. [Phytochemistry, 31, 2575- (1992)]. This enzymatic activity to catalyze methylation was first reported in a study using a crude extract of tea leaves in 1975 [Biochem. J. , 146, 87- (1975)]. Attempts have been made to purify methyltransferase in coffee [Phytochemistry, 37, 1577- (1994)], but the purification ratio was extremely low. In Cha, there have been reports of partial purification of methyltransferase [Physiol. Plant. , 98, 629- (1996)], and the enzyme protein was not isolated. Under such circumstances, the amino acid sequence of caffeine synthase, that is, an N-methyltransferase that catalyzes a two-step methylation reaction from 7-methylxanthine to caffeine via theobromine, which is the final reaction of caffeine biosynthesis. Kato et al. Isolated and purified the DNA encoding the amino acid sequence from tea (Camellia sinensis) and reported it (European Patent Publication No. 1055727 and JP-A-2002-85072).
[0004]
In addition, in the coffee, the group isolated and reported the presence of an enzyme that catalyzes only one-step methylation of 7-methylxanthine to theobromine (the abstract of the 2001 Annual Meeting of the Japanese Society for Plant Physiology). Shu, March 25, 2001). Furthermore, regarding the amino acid sequence of N-methyltransferase, which catalyzes a two-step methylation reaction from coffee to 7-methylxanthine via theobromine to caffeine, and the DNA encoding the enzyme, the group is the world's first. (Abstracts of the 2002 Annual Meeting of the Japanese Society of Plant Physiology, March 30, 2002).
However, the existence of N-methyltransferase using only paraxanthine as a substrate has not been known so far.
[0005]
[Patent Document 1] European Patent Publication No. 1055727
[Patent Document 2] JP-A-2002-85072
[Non-Patent Document 1] Phytochemistry, 31, 2575- (1992)
[0008]
[Non-Patent Document 2] Biochem. J. , 146, 87- (1975).
[0009]
[Non-Patent Document 3] Physiol. Plant. , 98, 629- (1996).
[0010]
[Non-Patent Document 4] Abstracts of 2001 Annual Meeting of the Japanese Society of Plant Physiology [0011]
[Non-Patent Document 5] Abstracts of 2002 Annual Meeting of the Japanese Society of Plant Physiology
[Problems to be solved by the invention]
The present invention aims to achieve the following objects by incorporating all or a part of DNA or RNA encoding paraxanthine N-methyltransferase into a microorganism or a plant cell in a sense or antisense form.
(1) To efficiently produce paraxanthine N-methyltransferase that can be used as an industrial, food or medical enzyme.
(2) Caffeine biosynthetic metabolism of a caffeine-producing plant, plant tissue or plant cell is modified to modify the formation ratio of a caffeine metabolic compound group.
[0013]
[Means for Solving the Problems]
The present inventors have made intensive studies and made a primer based on the DNA sequence of caffeine synthase of tea (Camellia sinensis) isolated previously, and newly used this primer to synthesize mRNA from coffee (Coffea arabica). Various homolog genes were isolated. Next, this DNA was inserted into a vector and then introduced into Escherichia coli to express a large amount of a protein derived from the DNA. When the enzymatic properties of this protein were examined, it was confirmed that the obtained gene was a gene encoding paraxanthine N-methyltransferase using only paraxanthine as a substrate. The present inventors have completed the present invention based on the above findings.
[0014]
That is, the present invention is as follows.
[1] A polypeptide defined by the amino acid sequence from No. 1 to No. 384 of SEQ ID NO: 1 in the sequence listing, and having an enzymatic activity of paraxanthine N-methyltransferase.
[2] A DNA encoding the polypeptide of [1].
[3] The DNA of the above-mentioned [2], which is defined by the nucleotide sequence of Nos. 1 to 1345 of SEQ ID NO: 1 in the sequence listing.
[4] An RNA encoding the polypeptide of [1].
[5] The RNA of the above-mentioned [4], defined by the nucleotide sequence from No. 1 to 1345 of SEQ ID NO: 2 in the sequence listing.
[6] A vector comprising the DNA of [2] or [3].
[7] The vector according to the above [6], which is capable of expressing a polypeptide having an enzymatic activity of paraxanthine N-methyltransferase in a microorganism and / or a plant cell.
[8] The vector according to [6], which is capable of expressing an antisense RNA having an effect of suppressing the expression of a paraxanthine N-methyltransferase enzyme in a microorganism and / or a plant cell.
[9] A vector comprising the RNA of [4] or [5].
[10] The vector of the above-mentioned [9], which is capable of expressing an antisense RNA having an effect of suppressing the expression of a paraxanthine N-methyltransferase enzyme in a microorganism and / or a plant cell.
[11] A microorganism transformed with the vector according to any one of [6] to [10].
[12] A method for producing a polypeptide having the enzymatic activity of paraxanthine N-methyltransferase, using the transformed microorganism according to [11].
[13] A plant cell, plant tissue or plant transformed with the vector according to any one of [6] to [10].
[14] A method for producing a plant secondary metabolite using the transformed plant according to [13], a cultured cell of the plant or a plant.
[15] The method according to the above [14], wherein the plant secondary metabolite is at least one compound selected from xanthosine, 7-methylxanthosine, 7-methylxanthine, theobromine, theophylline, and caffeine.
[16] Transformed plants are camellia (Camellia) genus plants, coffee (Coffea) genus plants, are Kolana (Cola) genus plants, coca (Erythroxylum) genus plants, Mochinoki (Ilex) genus plants, Neea (Neea) genus plants, The method of the above-mentioned [15], wherein the plant is a plant of the genus Firmiana, a plant of the genus Paulinia, or a plant of the genus Theokamaki (Theobroma).
[0015]
BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION
The paraxanthine N-methyltransferase according to the present invention is a polypeptide characterized by having an enzymatic activity as an N3 methyltransferase that catalyzes only paraxanthine as a substrate, and is, for example, a coffee-derived polypeptide. .
[0016]
The paraxanthine N-methyltransferase has the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 and the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 in the range not impairing the desired paraxanthine N-methyltransferase activity. And those having a mutated amino acid sequence obtained by performing amino acid substitution, insertion or deletion. That is, in the present invention, a polypeptide having the desired amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 having the above-mentioned paraxanthine N-methyltransferase activity and a mutant sequence thereof is referred to as paraxanthine N-methyltransferase.
[0017]
The polypeptide having the above-described mutant amino acid sequence has a function substantially equivalent to that of coffee paraxanthine N-methyltransferase, and has a stringency at a site related to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 and the enzyme activity. Mention may be made of polypeptides encoded by nucleotide sequences which hybridize under mild conditions.
[0018]
The nucleotide sequence encoding the paraxanthine N-methyltransferase according to the present invention, that is, the paraxanthine N-methyltransferase gene includes a nucleotide sequence encoding the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, and specific examples thereof include , SEQ ID NO: 1 and RNA sequence of SEQ ID NO: 2. The nucleotide sequence encoding a polypeptide that hybridizes to these paraxanthine N-methyltransferase genes under stringent conditions and has the paraxanthine N-methyltransferase activity is also the paraxanthine N-methyltransferase of the present invention. Is included in the encoding gene.
[0019]
As the mutant amino acid sequence maintaining the desired paraxanthine N-methyltransferase activity, a mutant nucleotide sequence encoding this mutant amino acid sequence and a nucleotide sequence encoding the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 under stringent conditions Can be suitably used practically.
[0020]
In addition, as the mutant paraxanthine N-methyltransferase gene, a gene that can hybridize with a nucleotide sequence encoding the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 under stringent conditions can be suitably used practically. Specific examples thereof include a DNA molecule capable of hybridizing to the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 under stringent conditions and an RNA molecule capable of hybridizing to the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2 under stringent conditions. Can be.
[0021]
Hybridization under this stringent condition can be performed, for example, by a method described in Molecular Cloning: Cold Spring Harbor Laboratory Press, Current Protocols in Molecular Biology; Amersham). Specifically, hybridization can be performed by the following operation.
[0022]
The membrane onto which the DNA or RNA molecule to be tested has been transferred is hybridized with the labeled probe in a protocol-specific hybridization buffer according to the product protocol. The composition of the hybridization buffer consisted of 0.1% by weight of SDS, 5% by weight of dextran sulfate, 1/20 volume of the blocking reagent attached to the kit, and 2 to 7 × SSC. As the blocking reagent, for example, 100 × Denhardt's solution, 2% (weight / volume) Bovine serum albumin 2% (weight / volume) Ficoll ™ 400, 2% (weight / volume) polyvinylpyrrolidone prepared at a 5-fold concentration Diluted 1/20. 20 × SSC is a 3M sodium chloride, 0.3M citric acid solution, and SSC is more preferably used at a concentration of 3 to 6 × SSC, more preferably 4 to 5 × SSC.
[0023]
The hybridization temperature is in the range of 40 to 80 ° C, more preferably 50 to 70 ° C, and still more preferably 55 to 65 ° C. After incubation for several hours to overnight, washing is performed with a washing buffer. The temperature for washing is preferably room temperature, more preferably the temperature for hybridization. The composition of the washing buffer is 6 × SSC + 0.1% by weight SDS solution, more preferably 4 × SSC + 0.1% by weight SDS solution, further preferably 2 × SSC + 0.1% by weight SDS solution, further preferably 1 × SSC + 0.1%. % SDS solution, most preferably 0.1 × SSC + 0.1% SDS solution. The membrane is washed with such a washing buffer, and the DNA or RNA molecule hybridized with the probe can be identified using the label used for the probe.
[0024]
The mutation may be caused in nature or artificially caused by site mutation in the nucleotide sequence.
[0025]
The DNA molecule having the paraxanthine N-methyltransferase gene and a region near the paraxanthine N-methyltransferase of the present invention can be obtained, for example, by a PCR technique using, as a primer, an oligonucleotide that specifically hybridizes to a DNA molecule encoding paraxanthine N-methyltransferase. Using a plant PCR experiment protocol (Cell Engineering Separate Volume, Plant Cell Engineering Series 2) Shujunsha (1995), it can be isolated from cells that produce the paraxanthine N-methyltransferase according to the present invention.
[0026]
Specifically, a linker is bound to cDNA synthesized from mRNA, and PCR is performed between DNA encoding the amino acid sequence constituting paraxanthine N-methyltransferase and the linker to isolate the full-length sequence of the target cDNA. can do.
[0027]
A DNA molecule encoding paraxanthine N-methyltransferase obtained by such a hybridization technique or a PCR technique, at least at a site used for isolation, contains a paraxanthine N-methyltransferase gene described in SEQ ID NO: 1. Nucleotides that hybridize under stringent conditions.
[0028]
As an organism used for isolating a DNA molecule or an RNA molecule having a nucleotide sequence (gene) encoding the paraxanthine N-methyltransferase according to the present invention, any organism that produces caffeine or a precursor thereof can be used. Among them, among others, genus Ilex paraguauriensis and the like, Camellia plant such as tea, Camellia genus plant such as tea, Rutaceae coffee (Coffea) genus plant such as coffee, and Coleoptera genus (Cola) genus such as Japanese lantern. Plants and the like can be exemplified.
[0029]
Next, a method for constructing an expression vector containing paraxanthine N-methyltransferase, a method for preparing a transformed plant, and a method for suppressing expression of paraxanthine N-methyltransferase enzyme by the RNAi method will be described.
In order to express the paraxanthine N-methyltransferase gene of the present invention or its antisense RNA in plant cells, (i) a promoter transcribeable in plant cells, and (ii) a sense direction or antisense downstream of the promoter. A terminator sequence containing all or part of the paraxanthine N-methyltransferase gene DNA linked in the direction, and (iii) a polyadenylation site necessary for stabilization of a transcript linked downstream of the gene DNA if necessary Is introduced into a plant cell.
[0030]
Here, as a template of the antisense RNA, a nucleotide sequence obtained by linking all or part of a DNA molecule having a paraxanthine N-methyltransferase gene or a DNA molecule that hybridizes with the DNA molecule under stringent conditions in the antisense direction, Alternatively, it is a nucleotide sequence in which all or a part of an RNA molecule having a paraxanthine N-methyltransferase gene or an RNA molecule that hybridizes therewith under stringent conditions is linked in the antisense direction, and comprises caffeine or a precursor thereof. And those having a function of inhibiting the expression of paraxanthine N-methyltransferase in the host cell when expressed in the host cell that produces the.
[0031]
Here, a part of the paraxanthine N-methyltransferase gene is defined as an inhibitory mRNA obtained based on a sequence complementary to the part, that is, an antisense RNA formed in a host cell. It is a portion that binds to mRNA for expressing paraxanthine N-methyltransferase in the host cell and inhibits the expression of paraxanthine N-methyltransferase in the host cell. This portion is a portion necessary for the formation of such antisense mRNA, and includes, for example, a portion having a length of at least 14 bases.
[0032]
Examples of the DNA molecule for forming an antisense mRNA include a DNA molecule having complementarity with all or a part of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1, and examples of the antisense RNA molecule include SEQ ID NO: : RNA molecules having complementarity with all or part of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2. A DNA or RNA molecule having complementarity with all or part of a mutant sequence capable of hybridizing with these nucleotide sequences under stringent conditions can also be used for such a purpose.
[0033]
These DNA or RNA molecules for inhibition may not necessarily encode the paraxanthine N-methyltransferase according to the present invention.
[0034]
The expression cassette may contain a promoter for constitutively or inducibly expressing the inserted DNA. Examples of the promoter for constant expression include a cauliflower mosaic virus 35S promoter and a rice actin promoter. In addition, as a promoter for inducible expression, it is known that expression is caused by external factors such as infection or invasion of filamentous fungi, bacteria, and viruses, low temperature, high temperature, drying, anaerobic conditions, and spraying of a specific compound. Promoters and the like. Examples of such a promoter include a promoter of a rice chitinase gene expressed by infection or invasion of a filamentous fungus, a bacterium, and a virus, a promoter of a PR protein gene of tobacco, and a promoter of a rice “lip19” gene induced by low temperature. And the promoter of the Arabidopsis "HSP18.2" gene induced by high temperature, the promoter of the rice "rab" gene induced by drought, the promoter of the maize alcohol dehydrogenase gene induced by anaerobic conditions, and the like. The rice chitinase gene promoter and the tobacco PR protein gene promoter are also induced by specific compounds such as salicylic acid, and the rice “rab” gene promoter is induced by spraying the plant hormone abscisic acid.
[0035]
Alternatively, as a promoter for expressing the DNA inserted in the expression cassette, a method of isolating and using the promoter of the paraxanthine N-methyltransferase gene can also be mentioned. One example of a specific method for isolating a promoter is a genomic DNA fragment obtained by using a hybridization technique using all or part of the DNA of the paraxanthine N-methyltransferase gene, for example, the paraxanthine N-methyltransferase gene. And a method for specifying the upstream DNA of the gene.
[0036]
To prepare for the introduction of the recombinant DNA molecule into plants, a number of cloning vectors are available that contain a replication signal for E. coli and a marker gene for selecting transformed bacterial cells. Examples of such vectors include pBR322, pUC, M13mp, and the like. The target sequence can be introduced into the vector at an appropriate restriction enzyme cleavage site. Restriction enzyme cleavage site analysis, gel electrophoresis, and other biochemical-molecular biological methods are commonly used to characterize the resulting plasmid DNA. After each operation, the plasmid DNA can be cut and ligated to another DNA. The sequence of each plasmid DNA can be cloned into the same plasmid or another plasmid.
[0037]
Various techniques can be used to introduce the expression cassette into a plant host cell. These techniques include transformation of plant cells with T-DNA using Agrobacterium tumefaciens or Agrobacterium rhizogenes as a transforming factor, and direct introduction into protoplasts (injection). Methods, electroporation methods, etc.), particle gun methods, and other possibilities.
[0038]
For direct introduction into protoplasts, no special vectors are required. For example, a simple plasmid such as a pUC derivative can be used. Depending on the method of introducing the target gene into plant cells, other DNA sequences may be required. For example, when a Ti or Ri plasmid is used for transformation of a plant cell, at least the sequence at the right end, usually both ends of the T-DNA region of the Ti and Ri plasmids is used as a region adjacent to the gene to be introduced. Must be connected to.
[0039]
When Agrobacterium is used for transformation, the expression cassette to be introduced must be cloned into a special plasmid, ie, an intermediate vector or a binary vector. Intermediate vectors are not replicated in Agrobacterium. The intermediate vector is transferred into Agrobacterium by helper plasmid or electroporation. Since the intermediate vector has a region homologous to the sequence of the T-DNA, it is incorporated into a Ti or Ri plasmid of Agrobacterium by homologous recombination. Agrobacterium used as a host must contain a vir region. Usually, a Ti or Ri plasmid contains a vir region, and the T-DNA can be transferred to a plant cell by its function.
[0040]
On the other hand, since a binary vector can be replicated and maintained in Agrobacterium, when incorporated into Agrobacterium by a helper plasmid or electroporation, the vir region of the host acts on the binary vector. Can be transferred to plant cells.
The intermediate vector or binary vector containing the expression cassette thus obtained, and microorganisms such as Escherichia coli and Agrobacterium containing the expression cassette are also objects of the present invention.
[0041]
The transformed plant cells can be converted into plants by undergoing a regeneration process. The method of regeneration differs depending on the type of plant cell. For example, in rice, Fujimura et al. [Plant Tissue Culture Lett. , 2, 74- (1995)], for corn, the method of Shellito et al. [Bio / Technology, 7, 581- (1989)], and for Arabidopsis, the method of Akayama et al. [Plant Cell Rep. , 12, 7- (1992)].
[0042]
Plants produced by these methods have altered expression levels of the paraxanthine N-methyltransferase protein of the present invention as compared to wild-type plants that produce caffeine and caffeine or a precursor thereof, and Changes in the production of caffeine and theobromine metabolic compounds due to alteration of plant metabolism, and changes in the production ratio of caffeine and theobromine metabolite compounds due to alteration of host plant metabolism occur. The transgenic plants thus obtained are the subject of the present invention. In the present invention, the term "plant" refers to all or a part of organs (eg, leaves, stems, roots, flowers, fruits, seeds, etc.) or cultured cells of a biological individual classified as a plant.
[0043]
Examples of plants that produce caffeine by using the SAM as a methyl group donor to produce caffeine include plants of the family Camellia, such as tea; plants of the genus Coffea, such as coffee; plants of the genus Coffea; plants of the genus Theobroma; And caffeine-producing plants, such as plants of the family Coleoptera (Cola) belonging to the family Aomori.
[0044]
Examples of microorganisms for introducing a DNA encoding the paraxanthine N-methyltransferase of the present invention to express a large amount of paraxanthine N-methyltransferase protein include bacteria such as Escherichia coli and Bacillus subtilis, and viruses such as baculovirus. Examples can be given.
[0045]
In addition, for the purpose of improving the productivity of a specific compound or modifying the production ratio of a specific compound group by modifying the metabolism of a host cell, a DNA encoding the paraxanthine N-methyltransferase according to the present invention is sense or antisense. As a plant to be incorporated in the form of sense, any plant that produces caffeine or a precursor thereof can be used. Among them, plants of the genus Camellia of the family Camellia, such as tea, and plants of the genus Coffea, such as coffee, belong to the genus Coffea. Examples include plants, plants of the genus Theobroma, plants of the family Coleoptera (Cola), such as plants of the genus Coleoptera.
[0046]
Plants produced by these methods have altered expression levels of the paraxanthine N-methyltransferase of the present invention compared to wild-type plants that produce caffeine or its precursor, and Changes in the production amount of caffeine metabolic compounds due to the modification and changes in the production ratio of the caffeine metabolic compounds due to the modification of the metabolism of the host plant occur. The transgenic plants thus obtained are the subject of the present invention.
[0047]
In recent years, from studies of plant post-translational gene silencing, it is possible to suppress the expression of a target gene by utilizing the defense mechanism inherent in plants against foreign nucleic acids such as viruses. (Cell, 95, 177-187 (1998), Chemistry and Biology, 37, 532- (1999), Protein Nucleic Acid Enzyme, 44, 1396- (1999)). According to this, when a DNA virus, an RNA virus, or the like enters a plant, the plant transcribes the Averant RNA from these templates, and transcribes the double-stranded RNA in a sequence-specific manner with the transcript of the sequence originally possessed by the plant. Form. When this double-stranded RNA is degraded by RNase, it becomes possible to suppress the expression of the target gene (Cell, 96, 303- (1999)). One of the important features of this method is that it is not always necessary to transform a target plant into a sequence whose expression is to be suppressed. Further, a further feature of the present method is that if a target nucleic acid is introduced into a part of a plant (lower leaf or the like) by infection or the like, the effect spreads to the whole plant. A specific method for suppressing expression is a double-stranded sequence containing all or a part of the sequence of the paraxanthine N-methyltransferase gene or the partial sequence of the paraxanthine N-methyltransferase gene or a sequence that hybridizes therewith under stringent conditions. Infects lower leaves of plants with Agrobacterium having RNA or double-stranded DNA. Here, a part of the paraxanthine N-methyltransferase gene is defined as an inhibitory mRNA obtained on the basis of a sequence having complementarity with the part, that is, when an averager RNA is formed in a host cell, It is a portion that binds to mRNA for expressing paraxanthine N-methyltransferase in the host cell and inhibits the expression of paraxanthine N-methyltransferase in the host cell. This portion is a portion necessary for forming such an average mRNA, and includes, for example, a portion having a length of at least 14 bases.
[0048]
Plants that have been subjected to these methods have altered expression levels of the paraxanthine N-methyltransferase protein of the present invention as compared to wild-type plants that produce caffeine or theobromine or a precursor thereof. Changes in the amount of caffeine metabolic system compounds caused by alteration of the metabolism of caffeine, and changes in the production ratio of caffeine metabolic compounds caused by alteration of the metabolism of host plants. The plants thus obtained are the subject of the present invention. The plant in the present invention also includes specific tissues or cells of the plant, such as leaves, flowers, fruits, and seeds.
[0049]
Cultivating plant cells or plant tissues transformed with or infected with the vector of the above-described configuration, or cultivating similarly transformed plants, secondary to caffeine and theobromine synthesis system Production of metabolites and modification of the composition of secondary metabolites produced by these transformants can be performed. Examples of the secondary metabolite include at least one compound selected from the group consisting of 7-methylxanthine, paraxanthine, theobromine and caffeine.
[0050]
As a source of a plant cell, plant tissue or plant used for transformation, for example, the transformed plant is a plant of the genus Camellia, a plant of the genus Coffee (Coffea), a plant of the genus Collan (Cola), or a plant of Ilex (Ilex) ) Genus plants, Neea genus plants, Firmiana genus plants, Paulinia genus plants, or Kakaonoki (Theobroma) genus plants. Among them, preferred are Camellia plants of the family Camellia, such as tea, plants of the genus Coffea, such as coffee, and plants of the genus Coleana, such as Chinese lantern.
[0051]
【Example】
Hereinafter, the present invention will be described more specifically with reference to Examples and Comparative Examples, but the scope of the present invention is not limited to these Examples.
[0052]
[Example 1] Preparation of RNA from coffee (1) Isolation of total RNA 0.5 g of coffee (Coffea arabica) ripened seed endosperm obtained from the University of Tsukuba Agricultural and Forestry Research Center was subjected to pestle and mortar in the presence of liquid nitrogen. And crushed. After sublimation of liquid nitrogen, it was dissolved in 5 ml of 2% CTAB, 0.1 M Tris (pH 9.5), 20 mM EDTA, 1.4 M NaCl, 5% β-mercaptoethanol, and left at 65 ° C. for 10 minutes. An equal volume of a chloroform solution was added and stirred, and the total volume was reduced to about 10 ml. The mixture was centrifuged at 15,000 rpm for 10 minutes, the aqueous layer was removed, 2.5 ml of a 10 M lithium chloride solution was added, and the mixture was allowed to stand at −20 ° C. for at least 2 hours. Centrifugation was performed at 4 ° C., 15,000 rpm for 10 minutes, the supernatant was removed, the precipitate was dissolved in 1 ml of TE, and centrifuged again. The supernatant was recovered, and 1 ml of a TE-saturated phenol solution was added thereto, mixed by inversion, and centrifuged at 15,000 rpm for 10 minutes. Further, phenol / chloroform was added to the supernatant, and the mixture was stirred and centrifuged at 15,000 rpm for 10 minutes. The aqueous layer was collected, an equal amount of a chloroform solution was added, and the mixture was stirred. The mixture was centrifuged at 15,000 rpm for 10 minutes, and the aqueous layer was collected. A 1/4 volume of a 10 M lithium chloride solution was added, and the mixture was left at -20 ° C for at least 2 hours. After centrifugation at 15,000 rpm for 10 minutes, 70% ethanol was added to the obtained precipitate, and centrifugation was performed again. The precipitate was dried up with a vacuum pump and dissolved in 200 μl of water to obtain a total RNA fraction.
[0053]
(2) Isolation of mRNA After subjecting the total RNA (2 mg) obtained by the above method to heat treatment at 65 ° C. for 5 minutes, an equal amount of a 2 × concentration A solution (10 mM Tris-HCl buffer (pH 7. 5) 1 mM Na 2 -EDTA, 0.1% SDS, 0.5 M NaCl). 0.1 g of oligo (dT) -Cellulose Type 7 (Pharmacia) in 2 ml of solution B (10 mM Tris-HCl buffer (pH 7.5), 1 mM Na 2 -EDTA, 0.1% SDS, 0.1 M NaCl) The suspension was poured into a blue chip filled with glass wool at the tip, washed with 2.5 ml of 0.1 N NaOH, and allowed to equilibrate by flowing 5 ml of solution A. After applying total RNA to this column and flowing 3 ml of solution A and 4 ml of solution B, mRNA was added to 3 ml of solution C (10 mM Tris-HCl buffer (pH 7.5), 1 mM Na2-EDTA, 0.05 mM). % SDS). The eluate was concentrated by ethanol precipitation, dried up, dissolved in water, and stored at -80 ° C.
[0054]
Example 2 Isolation of Caffeine Synthase cDNA from Coffee (1) 3′-RACE Isolation of 3 ′ Terminal Side To date, the present inventors have isolated a plurality of N-methyltransferases from coffee, but N-methyltransferase, a polypeptide having an enzymatic activity as paraxanthine N3 methyltransferase, could not be isolated from coffee. . Therefore, the present inventors newly designed primers of SEQ ID NOS: 5 to 6 based on CTS1 (SEQ ID NO: 3) and CTS2 (SEQ ID NO: 4), which are coffee-derived N-methyltransferases isolated so far. , A novel caffeine synthase cDNA partial sequence was isolated. For 3′-RACE, 3′-Full RACE CORE Set (TAKARA) was used to synthesize 1st strand cDNA in the following reaction solution. The reaction conditions for the synthesis reaction were 30 ° C. for 10 minutes, 50 ° C. for 40 minutes, and 95 ° C. for 5 minutes followed by ice cooling.
[0055]
9.5 μl of denatured RNA (about 2 μg)
2 x 1x RNA-PCR buffer
MgCl 2 (25 mM) 4 μl
dNTPs (10 mM each) 2 μl
oligo-dT 3sites
adapter primer (2.5 μM) 1 μl
RNase inhibitor 0.5 μl
AMV RT enzyme (5 U / μl) 1 μl
[0056]
B. The above A. Using the product obtained in step 1 as a template and reacting in the following reaction solution at 95 ° C. for 1 minute, 30 cycles of 94 ° C. for 1 minute, 55 ° C. for 1 minute, and 72 ° C. for 1.5 minutes. PCR was performed. The sequence of SEQ ID NO: 5 was used for Primer 1.
[0057]
1st strand cDNA 3 μl
5 μl of 10 × ExTaq buffer
dNTPs (2.5 mM each) 8 μl
Primer1 (CS8f) 1 μl
oligo-dT 3sites
adapter primer (2.5 μM) 1 μl
ExTaq 0.5μl
31.5 μl of H 2 O
[0058]
C. B. above. Using the product obtained in step 1 as a template, PCR was performed in the following reaction mixture at 94 ° C for 1 minute, 55 ° C for 1 minute, and 72 ° C for 40 seconds for 30 cycles to obtain a PCR amplified product. The sequence of SEQ ID NO: 6 was used for Primer 1.
[0059]
1st strand cDNA 3 μl
5 μl of 10 × ExTaq buffer
dNTPs (2.5 mM each) 8 μl
Primer1 (CS9f) 1 μl
oligo-dT 3sites
adapter primer (2.5 μM) 1 μl
ExTaq 0.5μl
31.5 μl of H 2 O
[0060]
D. C. above. Was electrophoresed in TAE using a 0.8% agarose gel, the band of the obtained target product was cut out, and DNA was recovered from the gel using GENE CLEAN (Funakoshi). The collected DNA was ligated to a pT7blue vector (Novagen), and then transformed into Escherichia coli DH5α. After performing color selection using X-gal, liquid culture was performed in an LB medium containing ampicillin, and a plasmid was extracted by an alkali-SDS method. The presence or absence of the insert was confirmed by agarose electrophoresis.
[0061]
E. FIG. The above D. To determine the nucleotide sequence of the obtained product, primer extension was performed in the following reaction solution using the isolated plasmid. The reaction was performed at 96 ° C for 1 minute, followed by 25 cycles of 96 ° C for 0.2 minutes, 50 ° C for 0.1 minutes and 60 ° C for 4 minutes. The reaction solution was subjected to ethanol precipitation, and the obtained DNA was dissolved in Template replacement reagent and analyzed using an ABI-310 Genetic Analyzer.
[0062]
Primer extension reaction solution Plasmid DNA (20 ng) 2 μl
Premix 4μl
Primer 1μl
3 μl of H 2 O
[0063]
(2) Isolation of 5 'upstream region by 5' RACE method For isolation of 5 'upstream region, 5'-Full RACE Core Set (TAKARA) was used. Primers of SEQ ID NOs: 7 to 9 were designed based on the sequence obtained by the 3′-RACE method, and 1st strand cDNA was synthesized in the following reaction solution. The sequence of SEQ ID NO: 7 was used as a Primer during the reaction.
[0064]
Denatured RNA (about 15 μg) 15 μl
3 μl of 10 × RT buffer
RNase inhibitor 1 μl
Primer (CS10r) 10 μl
AMV RT enzyme 1μl
[0065]
To the obtained 30 μl of the RNA-cDNA hybrid, 25 μl of 5 × buffer, 45 μl of H 2 O and 2 μl of RNase H were added and reacted at 30 ° C. for 1 hour to degrade RNA. The resulting single-stranded cDNA was self-ligated or concatamerized with T7-RNA ligase. Using this as a template, PCR was performed in the following reaction solution for 30 cycles of 94 ° C./1 minute, 62 ° C./1 minute, and 72 ° C./1.5 minutes to obtain a reaction product. The primers 1 and 2 used the sequences of SEQ ID NOs: 8 and 9. The band of the reaction product was separated by acrylamide electrophoresis, DNA was recovered from the gel, and subcloned into a pGEM-T Easy vector (Promega).
[0066]
2 μl of 1st strand cDNA
5 μl of 10 × ExTaq buffer
dNTPs (2.5 mM each) 8 μl
Primer1 (CS11f) 1 μl
Primer2 (CS12r) 1 μl
ExTaq 0.5μl
H 2 O 32.5 μl
[0067]
The nucleotide sequence of the subcloned sequence was determined by the primer extension method described above. The obtained base sequence is shown as SEQ ID NO: 1 in the sequence listing.
[0068]
[Example 3] Expression of caffeine synthase in Escherichia coli and measurement of activity The isolated novel caffeine synthase gene was incorporated into an expression vector pET32a (Novagen), and this plasmid was transformed into Escherichia coli BL21 (DE3). After culturing the obtained Escherichia coli at 37 ° C for 2 hours, IPTG was added to a final concentration of 0.3 mM, and culturing was further performed at 25 ° C for 8 hours. After completion of the culture, the cells were collected, suspended in 200 μl of TES-G buffer (50 mM Tris-HCl buffer (pH 8.5), 5 mM DTT, 50 mM NaCl, 2 mM EDTA-Na 2 , 20% glycerol), and suspended at −80 ° C. After freezing, ultrasonic crushing was performed intermittently for 1 minute. This was centrifuged at 14,000 rpm for 10 minutes, and the obtained supernatant was used as an enzyme solution.
The reaction solution for measuring caffeine synthase activity was 100 mM Tris-HCl buffer (pH 8.5), 0.2 mM MgCl 2 , 0.2 mM paramethylxanthine, 4 μM [methyl- 14C ] S-adenosylmethionine ( 0.9 kBq) plus 10 μl of the enzyme solution, and the volume of the reaction solution was 100 μl. The reaction was carried out at 27 ° C for 10 minutes, and the obtained 14C-caffeine was extracted by adding 1 ml of chloroform, and the radioactivity of the chloroform layer was measured. As a control, a reaction solution excluding paramethylxanthine was used. As a result of activity measurement, it was found that caffeine was generated only when paraxanthine was added as a substrate. On the other hand, when a substrate other than paraxanthine was used, no caffeine was generated.
[0069]
【The invention's effect】
According to the present invention, it becomes possible to efficiently produce paraxanthine N-methyltransferase that can be used as an industrial, food or medical enzyme.
ADVANTAGE OF THE INVENTION According to this invention, it becomes possible to modify caffeine biosynthesis metabolism of a caffeine producing plant, a plant tissue, or a plant cell, and to modify the production ratio of the compound group of a caffeine metabolism system.
[0070]
[Sequence list]
