【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、マテ由来Ｎ−メチルトランスフェラーゼ、該酵素をコードするＤＮＡまたはＲＮＡ、該ＤＮＡで形質転換された微生物および植物、ならびに該植物またはその培養細胞または組織を用いて、該ＲＮＡを含む核酸構造物によりカフェイン及びテオブロミンまたはその前駆体量を変化させる方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
【０００３】
【非特許文献１】Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， ３１， ２５７５−（１９９２）
【０００４】
【非特許文献２】Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．， １４６， ８７−（１９７５）
【０００５】
【非特許文献３】Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， ３７， １５７７−（１９９４）
【０００６】
【非特許文献４】Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｐｌａｎｔ．， ９８， ６２９−（１９９６）
【０００７】
【特許文献１】特願平１１−１４６３５８号公報
【０００８】
【特許文献２】特願２０００−１５１７１８号公報
【０００９】
【特許文献３】特願２０００−２７５０６３）号公報
【００１０】
【特許文献４】特願２００１−２０９０７２公報
カフェインは、チャ（Ｃａｍｅｌｌｉａ ｓｉｎｅｎｓｉｓ）等のツバキ科ツバキ属植物、コーヒー（Ｃｏｆｆｅａ ａｒａｂｉｃａ）等のアカネ科コーヒー属植物、マテ（Ｉｌｅｘ ｐａｒａｇｕａｒｉｅｎｓｉｓ）等のモチノキ属植物等に含まれるプリンアルカロイドであり、医薬品原料や食品添加物として使用されている。現在のところ、カフェインは前記植物種を始めとするカフェイン産生植物からの抽出、または有機合成によって製造されている。また、チャやコーヒー、マテ茶などの嗜好品においては、それらの刺激性を緩和また又は増強するために、古典的な育種手法等を用いてカフェインおよびその中間体の含有量の低減または増加が試みられている。
【００１１】
カフェインはキサントシンからテオブロミンを経て３段階のＮ−メチル化により生合成されることが１４Ｃ−トレーサー実験により明らかにされている［非特許文献１］。このメチル化を触媒する酵素活性は、１９７５年にチャ葉の粗抽出液を用いた研究で最初に報告された［非特許文献２］。コーヒーでメチルトランスフェラーゼの精製が試みられているが［非特許文献３］、精製倍率はきわめて低かった。チャでは、メチルトランスフェラーゼの部分精製の報告はあるが［非特許文献４］、酵素タンパク質は単離されていなかった。このような中、カフェインシンターゼ、即ち、カフェイン生合成の最終反応である７−メチルキサンチン〜テオブロミン〜カフェインの２段階のメチル化反応を触媒するＮ−メチルトランスフェラーゼのアミノ酸配列及びそのアミノ酸配列をコードするＤＮＡに関しては、チャ（Ｃａｍｅｌｌｉａ ｓｉｎｅｎｓｉｓ）から加藤等が世界に先駆けて単離精製し、報告している（特許文献１、特許文献２、特許文献３）。
【００１２】
また、コーヒーにおいては７−メチルキサンチン〜テオブロミンの一段階のみのメチル化を触媒する酵素の存在について、同グループが世界に先駆けて単離し報告している（特許文献４）。しかしながら、マテにおいては、カフェイン生合成のメチル化反応を触媒する上記Ｎ−メチルトランスフェラーゼとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＮ−メチルトランスフェラーゼの存在は、これまでのところ全く知られていなかった。
【００１３】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、Ｎ−メチルトランスフェラーゼをコードするＤＮＡまたはＲＮＡの全部もしくは一部を微生物または植物細胞にセンスまたはアンチセンスの形で組み込むことにより、以下の目的を達成しようとするものである。
（１） 工業用、食品用または医療用酵素として利用できるＮ−メチルトランスフェラーゼを効率よく生産する。
（２） カフェイン産生植物、植物組織または植物細胞のカフェイン生合成代謝を改変してカフェイン代謝系の化合物群の生成比を改変する。
【００１４】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、鋭意研究の結果、先に単離したチャ（Ｃａｍｅｌｌｉａ ｓｉｎｅｎｓｉｓ）のカフェインシンターゼのＤＮＡ配列を基にプライマーを作成し、このプライマーを用いてマテ（Ｉｌｅｘ ｐａｒａｇｕａｒｉｅｎｓｉｓ）のｍＲＮＡから新たなホモログ遺伝子を単離した。次にこのＤＮＡをベクターに組み込んだ後大腸菌に導入し、当該ＤＮＡに由来するタンパク質を大量に発現させた。このタンパク質の酵素学的性質を調べたところ、得られた遺伝子がＮ−メチルトランスフェラーゼをコードする遺伝子であることを確認した。本発明者らは以上の知見に基づいて本発明を完成するに至った。
【００１５】
則ち本発明は以下のとおりである。
［１］ 配列表の配列番号１に記載の１番から３６６番のアミノ酸配列で規定され、かつＮ−メチルトランスフェラーゼの酵素活性を有するポリペプチド。
［２］ 上記［１］に記載のポリペプチドをコードするＤＮＡ。
［３］ 配列表の配列番号１の１番〜１４４６番の塩基配列で規定される上記［２］に記載のＤＮＡ。［４］ 上記［１］に記載のポリペプチドをコードするＲＮＡ。
［５］ 配列表の配列番号２の１番〜１４４６番の塩基配列で規定される上記［４］に記載のＲＮＡ。［６］ 上記［２］または［３］に記載のＤＮＡを含むベクター。
［７］ 微生物および／または植物の細胞内で、Ｎ−メチルトランスフェラーゼの酵素活性を有するポリペプチドを発現させる上記［６］記載のベクター。
［８］ 微生物および／または植物の細胞内で、Ｎ−メチルトランスフェラーゼの酵素の発現を抑える作用を有するアンチセンスＲＮＡを発現させることができる［６］記載のベクター。
［９］ 上記［４］または［５］に記載のＲＮＡを含むベクター。
［１０］ 微生物および／または植物の細胞内で、Ｎ−メチルトランスフェラーゼの酵素の発現を抑える作用を有するアンチセンスＲＮＡを発現させることができる上記［９］記載のベクター。
［１１］ 上記［６］〜［１０］のいずれか一項に記載のベクターで形質転換された微生物。
［１２］ 上記［１１］記載の形質転換された微生物を用いて、Ｎ−メチルトランスフェラーゼの酵素活性を有するポリペプチドを製造する方法。
［１３］ 上記［６］〜［１０］のいずれか一項に記載のベクターで形質転換された植物細胞、植物組織または植物体。
［１４］ 上記［１３］に記載の形質転換植物、該植物の培養細胞または植物を用いて植物二次代謝産物を製造する方法。
［１５］ 植物二次代謝産物が、キサントシン、７−メチルキサントシン、７−メチルキサンチン、テオブロミン、テオフィリン、カフェインから選ばれる少なくとも１つ以上の化合物である上記［１４］記載の方法。
［１６］ 形質転換植物がツバキ（Ｃａｍｅｌｌｉａ）属植物、コーヒー（Ｃｏｆｆｅａ）属植物、がコラノキ（Ｃｏｌａ）属植物、コカノキ（Ｅｒｙｔｈｒｏｘｙｌｕｍ）属植物、モチノキ（Ｉｌｅｘ）属植物、ネエア（Ｎｅｅａ）属植物、アオギリ（Ｆｉｒｍｉａｎａ）属植物、ポーリニア（Ｐａｕｌｌｉｎｉａ）属植物又はカカオノキ（Ｔｈｅｏｂｒｏｍａ）属植物である上記［１５］記載の方法。
【００１６】
【発明の実施の形態】
以下、本発明に関し詳細に説明する。
本発明にかかるＮ−メチルトランスフェラーゼは、７−メチルキサンチンＮ３メチルトランスフェラーゼ、テオブロミンＮ１メチルトランスフェラーゼ及びパラキサンチンＮ３メチルトランスフェラーゼとしての酵素活性を同時に有する、もしくはそれらの酵素活性のうちの少なくとも一つを有するチャもしくはコーヒー由来のＮ−メチルトランスフェラーゼとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることを特徴とするマテ由来のポリペプチドである。
【００１７】
このＮ−メチルトランスフェラーゼとしては、配列番号：１に示したアミノ酸配列を有しているもの、配列番号：１のアミノ酸配列に、所望とするＮ−メチルトランスフェラーゼ活性を損なわない範囲で、アミノ酸の置換、挿入または欠失を行って得られた変異アミノ酸配列を有しているものを挙げることができる。すなわち、所望とする上記のＮ−メチルトランスフェラーゼ活性を有する配列番号：１のアミノ酸配列及びその変異配列を有するポリペプチドをＮ−メチルトランスフェラーゼと総称する。
【００１８】
上記の変異アミノ酸配列を有するポリペプチドとしては、それ自身が実質的にマテのＮ−メチルトランスフェラーゼと同等の機能を有し、且つ配列番号：１のアミノ酸配列と酵素活性にかかわる部位においてストリンジェントな条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列によりコードされているポリペプチドを挙げることができる。
【００１９】
本発明にかかるＮ−メチルトランスフェラーゼをコードするヌクレオチド配列、すなわちＮ−メチルトランスフェラーゼ遺伝子としては、配列番号：１のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を挙げることができ、その具体例としては、配列番号：１のＤＮＡ配列、配列番号：２のＲＮＡ配列を挙げることができる。これらのＮ−メチルトランスフェラーゼ遺伝子に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、上記Ｎ−メチルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列も、本発明におけるＮ−メチルトランスフェラーゼをコード遺伝子に含まれる。
【００２０】
所望とするＮ−メチルトランスフェラーゼ活性を維持した変異アミノ酸配列としては、この変異アミノ酸配列をコードする変異ヌクレオチド配列と、配列番号：１のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列とがストリンジェントな条件下でハイブリダイズし得るものが実用上好適に利用し得る。
【００２１】
また、変異Ｎ−メチルトランスフェラーゼ遺伝子としても、配列番号：１のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし得るものが実用上好適に利用し得る。その具体例としては、配列番号：１のヌクレオチド配列にストリンジェントな条件下でハイブリダイズし得るＤＮＡ分子及び配列番号：２のヌクレオチド配列にストリンジェントな条件下でハイブリダイズし得るＲＮＡ分子を挙げることができる。
【００２２】
このストリンジェントな条件下でのハイブリダイゼーションは、例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ； Ｗｉｌｅｙ Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅに記載の方法によって行うことができ、市販のシステムとしては、ＧｅｎｅＩｍａｇｅシステム（アマシャム）を挙げることができる。具体的には以下の操作によってハイブリダイゼーションを行うことができる。
【００２３】
試験すべきＤＮＡまたはＲＮＡ分子を転写した膜を、製品プロトコールに従って、標識したプローブとプロトコール指定のハイブリダイゼーションバッファー中でハイブリダイズさせる。ハイブリダイゼーションバッファーの組成は、０．１重量％ＳＤＳ、５重量％デキストラン硫酸、１／２０容のキット添付のブロッキング試薬及び２〜７×ＳＳＣからなる。ブロッキング試薬としては、例えば、１００×Ｄｅｎｈａｒｄｔ′ｓ ｓｏｌｕｔｉｏｎ、２％（重量／容量）Ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ ａｌｂｕｍｉｎ ２％（重量／容量）ＦｉｃｌｌＴＭ４００、２％（重量／容量）ポリビニルピロリドンを５培濃度で調製したものを１／２０に希釈して使用することができる。２０×ＳＳＣは、３Ｍ塩化ナトリウム、０．３Ｍクエン酸溶液であり、ＳＳＣは、より好ましくは、３〜６×ＳＳＣ、更に好ましくは、４〜５×ＳＳＣの濃度で使用する。
【００２４】
ハイブリダイゼーションの温度は、４０〜８０℃、より好ましくは５０〜７０℃、更に好ましくは５５〜６５℃の範囲であり、数時間から一晩のインキュベーションを行った後、洗浄バッファーで洗浄する。洗浄の温度は、好ましくは室温、より好ましくはハイブリダイゼーション時の温度である。洗浄バッファーの組成は、６×ＳＳＣ＋０．１重量％ＳＤＳ溶液、より好ましくは４×ＳＳＣ＋０．１重量％ＳＤＳ溶液、更に好ましくは２×ＳＳＣ＋０．１重量％ＳＤＳ溶液、更に好ましくは１×ＳＳＣ＋０．１重量％ＳＤＳ溶液、最も好ましくは０．１×ＳＳＣ＋０．１重量％ＳＤＳ溶液である。このような洗浄バッファーで膜を洗浄し、プローブがハイブリダイズしたＤＮＡ分子またはＲＮＡ分子を、プローブに用いた標識を利用して識別することができる。
【００２５】
なお、変異は、自然界において生じたものでもよく、ヌクレオチド配列における部位突然変異により人工的に起こしたものでも良い。
【００２６】
本発明のＮ−メチルトランスフェラーゼ遺伝子を有するＤＮＡ分子は、例えば、Ｎ−メチルトランスフェラーゼをコードするＤＮＡ分子に特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いたＰＣＲ技術（植物のＰＣＲ実験プロトコール（細胞工学別冊、植物細胞工学シリーズ２）秀潤社（１９９５））を利用して、本発明にかかるＮ−メチルトランスフェラーゼを生産する細胞から分離することができる。
【００２７】
具体的には、ｍＲＮＡから合成したｃＤＮＡにリンカーを結合させ、Ｎ−メチルトランスフェラーゼを構成するアミノ酸配列をコードするＤＮＡとリンカー間でＰＣＲを行うこと等により、目的ｃＤＮＡの全長配列を単離することができる。
【００２８】
このようなハイブリダイゼーション技術やＰＣＲ技術により得られるＮ−メチルトランスフェラーゼをコードするＤＮＡ分子は、少なくとも単離に使用する部位においては、配列番号：１に記載のＮ−メチルトランスフェラーゼ遺伝子とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするヌクレオチドである。
【００２９】
本発明にかかるＮ−メチルトランスフェラーゼをコードするヌクレオチド配列（遺伝子）を有するＤＮＡ分子またはＲＮＡ分子を単離するために用いる生物としては、カフェインまたはその前駆体を産生する生物であればすべて使用できるが、中でもマテ（Ｉｌｅｘ ｐａｒａｇｕａｒｉｅｎｓｉｓ）等のモチノキ属植物、チャなどのツバキ科ツバキ（Ｃａｍｅｌｌｉａ）属植物、コーヒーなどのアカネ科コーヒー（Ｃｏｆｆｅａ）属植物、コラノキなどのアオギリ科コラノキ（Ｃｏｌａ）属植物などを例示することができる。
【００３０】
次にＮ−メチルトランスフェラーゼを含む発現ベクターの構築方法ならびに形質転換植物の作製方法及びＲＮＡｉ法によるＮ−メチルトランスフェラーゼ酵素の発現抑制方法について説明する。
【００３１】
本報告中のＮ−メチルトランスフェラーゼ遺伝子もしくはそのアンチセンスＲＮＡを植物細胞内で発現させるためには、（ｉ）植物細胞内で転写可能なプロモーター、（ｉｉ）プロモーターの下流にセンス方向またはアンチセンス方向に連結したＮ−メチルトランスフェラーゼ遺伝子ＤＮＡの全部または一部、（ｉｉｉ）必要に応じて該遺伝子ＤＮＡの下流に連結された転写産物の安定化に必要なポリアデニレーション部位を含むターミネーター配列、を含む発現カセットを植物細胞に導入する。
【００３２】
ここでアンチセンスＲＮＡの鋳型としては、Ｎ−メチルトランスフェラーゼ遺伝子を有するＤＮＡ分子の全部または一部またはそれらとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡ分子をアンチセンス方向に連結したヌクレオチド配列、あるいはＮ−メチルトランスフェラーゼ遺伝子を有するＲＮＡ分子の全部または一部またはそれらとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＲＮＡ分子をアンチセンス方向に連結したヌクレオチド配列であって、カフェインまたはその前駆体を産生する宿主細胞中において発現した際に宿主細胞におけるＮ−メチルトランスフェラーゼの発現を阻害する機能を有するものを挙げることができる。
【００３３】
ここで、Ｎ−メチルトランスフェラーゼ遺伝子の一部とは、その部分に相補性を有する配列を基礎として得られる阻害用のｍＲＮＡ、すなわちアンチセンスＲＮＡが宿主細胞中で形成された際に、これが宿主細胞におけるＮ−メチルトランスフェラーゼを発現させるためのｍＲＮＡと結合して、宿主細胞におけるＮ−メチルトランスフェラーゼの発現が阻害される部分である。この部分としては、このようなアンチセンスｍＲＮＡの形成に必要となる部分であり、例えば少なくとも１４塩基長の長さの部分を挙げることができる。
【００３４】
アンチセンスｍＲＮＡ形成用のＤＮＡ分子としては、例えば、配列番号：１のヌクレオチド配列の全部または一部と相補性を有しているＤＮＡ分子を挙げることができ、アンチセンスＲＮＡ分子としては、配列番号：２のヌクレオチド配列の全部または一部と相補性を有しているＲＮＡ分子を挙げることができる。これらのヌクレオチド配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし得る変異配列の全部または一部と相補性を有しているＤＮＡ分子またはＲＮＡ分子もこのような目的に用いることができる。
【００３５】
これらの阻害用のＤＮＡ分子またはＲＮＡ分子自体は、必ずしも本発明にかかるＮ−メチルトランスフェラーゼをコードするものでなくともよい。
【００３６】
発現カセットは、挿入されているＤＮＡを恒常的または誘導的に発現させるためのプロモーターを含有し得る。恒常的に発現させるためのプロモーターとしては、例えば、カリフラワーモザイクウイルスの３５Ｓプロモーター、イネのアクチンプロモーターなどが挙げられる。また、誘導的に発現させるためのプロモーターとしては、例えば糸状菌、細菌、ウイルスの感染や侵入、低温、高温、乾燥、嫌気的条件、特定の化合物の散布等の外因によって発現することが知られているプロモーター等が挙げられる。このようなプロモーターとしては、例えば、糸状菌、細菌、ウイルスの感染や侵入によって発現するイネのキチナーゼ遺伝子のプロモーターやタバコのＰＲタンパク質遺伝子のプロモーター、低温によって誘導されるイネの「ｌｉｐ１９」遺伝子のプロモーター、高温によって誘導されるシロイヌナズナの「ＨＳＰ１８．２」遺伝子のプロモーター、乾燥によって誘導されるイネの「ｒａｂ」遺伝子のプロモーター、嫌気的条件で誘導されるトウモロコシのアルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子のプロモーター等が挙げられる。またイネのキチナーゼ遺伝子のプロモーターとタバコのＰＲタンパク質遺伝子のプロモーターはサリチル酸等の特定の化合物によって、イネの「ｒａｂ」遺伝子プロモーターは植物ホルモンのアブシジン酸の散布によっても誘導される。
【００３７】
或いはまた、発現カセットに挿入されているＤＮＡを発現させるためのプロモーターとしては、Ｎ−メチルトランスフェラーゼ遺伝子のプロモーターを単離して利用する方法も挙げられる。具体的なプロモーターの単離方法の一例には、Ｎ−メチルトランスフェラーゼ遺伝子、例えばＮ−メチルトランスフェラーゼ遺伝子のＤＮＡの全部又は一部をプローブとしたハイブリダイゼーション技術の利用により、ゲノムＤＮＡ断片を選択し、該遺伝子の上流部ＤＮＡを特定する方法を挙げることができる。
【００３８】
組み換えＤＮＡ分子の植物への導入に備えるために、大腸菌の複製シグナル及び形質転換された細菌の細胞を選抜するためのマーカー遺伝子を含むクローニングベクターが数多く利用できる。このようなベクターの例には、ｐＢＲ３２２、ｐＵＣ系、Ｍ１３ｍｐ系等がある。適当な制限酵素切断部位で、目的の配列をベクターに導入することができる。得られたプラスミドＤＮＡの特徴を明らかにするため、制限酵素切断部位分析、ゲル電気泳動、及びその他の生化学的−分子生物学的方法が一般に用いられる。各々の操作を終えた後、プラスミドＤＮＡを切断して、別のＤＮＡに結合させることができる。各プラスミドＤＮＡの配列を、同じプラスミド又は別のプラスミド中にクローニングすることができる。
【００３９】
植物宿主細胞の中に発現カセットを導入するためには、さまざまな手法を用いることができる。これらの手法には、形質転換因子としてアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）または、アグロバクテリウム リゾゲネス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓ）を用いたＴ−ＤＮＡによる植物細胞の形質転換、プロトプラストへの直接導入（インジェクション法、エレクトロポレーション法等）、パーティクルガン法等やその他の可能性が含まれる。
【００４０】
プロトプラストへの直接導入では、特別に必要とされるベクターはない。例えば、ｐＵＣ誘導体のような単純なプラスミドを用いることができる。目的の遺伝子を植物細胞に導入する方法によっては、他のＤＮＡ配列が必要になることもある。例えばＴｉまたはＲｉプラスミドを植物細胞の形質転換に用いる場合には、ＴｉおよびＲｉプラスミドのＴ−ＤＮＡ領域の少なくとも右端の配列、大抵は両端の配列を、導入されるべき遺伝子の隣接領域となるように接続しなければならない。
【００４１】
アグロバクテリウム属菌を形質転換に用いる場合には、導入すべき発現カセットを、特別のプラスミド、すなわち中間ベクターまたはバイナリーベクター中にクローニングする必要がある。中間ベクターはアグロバクテリウム属菌の中では複製されない。中間ベクターは、ヘルパープラスミドあるいはエレクトロポレーションによってアグロバクテリウム属菌の中に移行される。中間ベクターは、Ｔ−ＤＮＡの配列と相同な領域をもつため、相同組換えによって、アグロバクテリウム属菌のＴｉまたはＲｉプラスミド中に取り込まれる。宿主として使われるアグロバクテリウム属菌には、ｖｉｒ領域が含まれている必要がある。通常ＴｉまたはＲｉプラスミドにｖｉｒ領域が含まれており、その働きにより、Ｔ−ＤＮＡを植物細胞に移行させることができる。
【００４２】
一方、バイナリーベクターはアグロバクテリウム属菌の中で複製、維持され得るので、ヘルパープラスミドあるいはエレクトロポレーション法によってアグロバクテリウム属菌中に取り込まれると、宿主のｖｉｒ領域の働きによって、バイナリーベクター上のＴ−ＤＮＡを植物細胞に移行させることができる。
【００４３】
なお、このようにして得られた発現カセットを含む中間ベクターまたはバイナリーベクター、及びこれを含む大腸菌やアグロバクテリウム属菌等の微生物も本発明の対象である。
【００４４】
形質転換された植物細胞は、再生過程を経ることにより植物体に変換することができる。再生の方法は植物細胞の種類により異なるが、例えばイネではＦｕｊｉｍｕｒａら［Ｐｌａｎｔ Ｔｉｓｓｕｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｌｅｔｔ．， ２， ７４−（１９９５）］の方法、トウモロコシでは、Ｓｈｉｌｌｉｔｏら［Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， ７， ５８１−（１９８９）］の方法、シロイヌナズナではＡｋａｍａらの方法［Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐ．， １２，
７−（１９９２）］などが挙げられる。
【００４５】
これらの方法により作出された植物体は、カフェイン及びカフェインまたはその前駆体を産生する野生型の植物体と比較して本発明のＮ−メチルトランスフェラーゼタンパク質の発現量が変化し、ホスト植物の代謝の改変によるカフェイン及びテオブロミン代謝系化合物の生成量の変化や、ホスト植物の代謝の改変によるカフェイン及びテオブロミン代謝系化合物群の生成比の変化が起こる。このようにして得られたトランスジェニック植物は本発明の対象である。本発明において、「植物体」とは植物に分類される生物個体の全体もしくは一部の器官（例えば、葉、茎、根、花、果実、種子等）もしくは培養細胞を指す。
【００４６】
前記のＳＡＭをメチル基供与体としてカフェインを生成する植物としては、チャなどのツバキ科ツバキ（Ｃａｍｅｌｌｉａ）属植物、コーヒーなどのアカネ科コーヒー（Ｃｏｆｆｅａ）属植物、カカオノキ（Ｔｈｅｏｂｒｏｍａ）属植物、コラノキなどのアオギリ科コラノキ（Ｃｏｌａ）属植物など、カフェイン産生植物を例示することができる。
【００４７】
本発明にかかるＮ−メチルトランスフェラーゼをコードするＤＮＡを導入してＮ−メチルトランスフェラーゼタンパク質を大量に発現させるための微生物としては、大腸菌や枯草菌等の細菌及びバキュロウイルス等のウイルスを例示することができる。
【００４８】
また、ホスト細胞の代謝を改変して特定化合物の生産性向上や特定の化合物群の生成比改変を図ることを目的に、本発明にかかるＮ−メチルトランスフェラーゼをコードするＤＮＡをセンスまたはアンチセンスの形で組み込む植物としては、カフェインまたはその前駆体を産生する植物であればすべて使用できるが、中でもチャなどのツバキ科ツバキ（Ｃａｍｅｌｌｉａ）属植物、コーヒーなどのアカネ科コーヒー（Ｃｏｆｆｅａ）属植物、カカオノキ（Ｔｈｅｏｂｒｏｍａ）属植物、コラノキなどのアオギリ科コラノキ（Ｃｏｌａ）属植物などを例示することができる。
【００４９】
これらの方法により作出された植物体は、カフェインまたはその前駆体を産生する野生型の植物体と比較して本発明のＮ−メチルトランスフェラーゼの発現量が変化し、ホスト植物の代謝の改変によるカフェイン代謝系化合物の生成量の変化や、ホスト植物の代謝の改変によるカフェイン代謝系化合物群の生成比の変化が起こる。このようにして得られたトランスジェニック植物は本発明の対象である。
【００５０】
また近年、植物のポストトランスレーショナルなジーンサイレンシングの研究から、ウイルス等の外来核酸に対して植物が本来備えている防御機項を利用して、目的遺伝子の発現を抑制することが可能なことがわかってきた（Ｃｅｌｌ，９５，１７７−１８７（１９９８）、化学と生物、３７、５３２−（１９９９）、蛋白質核酸酵素、４４、１３９６−（１９９９））。これによれば、ＤＮＡウイルスやＲＮＡウイルス等が植物に進入した場合、植物はこれらの鋳型からアベラントＲＮＡを転写し、植物が本来持っている配列の転写産物と配列特異的に二本鎖ＲＮＡを形成する。この二本鎖ＲＮＡはＲＮａｓｅにより分解されることにより、目的の遺伝子の発現を抑制することが可能となる（Ｃｅｌｌ，９６， ３０３−（１９９９））。本方法の重要な特徴のひとつは、発現を抑制したい配列を目的植物に必ずしも形質転換させる必要がない点にある。また本方法のさらなる特徴は、植物の一部（下位葉等）に目的の核酸を感染等により導入すれば、その効果が植物体全体に広がることである。具体的な発現抑制方法は、Ｎ−メチルトランスフェラーゼ遺伝子またはＮ−メチルトランスフェラーゼ遺伝子の一部の配列またはそれとストリンジェントな条件下でハイブリダイズする配列の全部または一部を含む二本鎖ＲＮＡや、二本鎖ＤＮＡを持つアグロバクテリウムを植物の下位葉に感染させる。ここで、Ｎ−メチルトランスフェラーゼ遺伝子の一部とは、その部分に相補性を有する配列を基礎として得られる阻害用のｍＲＮＡ、すなわちアベラントなＲＮＡが宿主細胞中で形成された際に、これが宿主細胞におけるＮ−メチルトランスフェラーゼを発現させるためのｍＲＮＡと結合して、宿主細胞におけるＮ−メチルトランスフェラーゼの発現が阻害される部分である。この部分としては、このようなアベラントなｍＲＮＡの形成に必要となる部分であり、例えば少なくとも１４塩基長の長さの部分を挙げることができる。
【００５１】
これらの方法を施された植物体は、カフェインまたはテオブロミンまたはその前駆体を産生する野生型の植物体と比較して本発明のＮ−メチルトランスフェラーゼタンパク質の発現量が変化し、ホスト植物の代謝の改変によるカフェイン代謝系化合物の生成量の変化や、ホスト植物の代謝の改変によるカフェイン代謝系化合物群の生成比の変化が起こる。このようにして得られた植物は本発明の対象である。本発明でいう植物には、葉、花、果実、種子などの植物の特定の組織または細胞も含まれる。
【００５２】
上記の構成のベクターで形質転換されたもしくはベクターの感染された植物細胞または植物組織を培養して、あるいは同様に形質転換された植物体を栽培して、カフェイン及びテオブロミン合成系にかかる二次代謝産物の製造やこれらの形質転換体で生産される二次代謝産物の組成の改変を行うことができる。この二次代謝産物としては、例えば、７−メチルキサンチン、パラキサンチン、テオブロミン及びカフェインからなる群から選ばれる少なくとも１つ以上の化合物を挙げることができる。
【００５３】
形質転換に用いる植物細胞、植物組織または植物体の供給原としては、例えば、形質転換植物体が、ツバキ（Ｃａｍｅｌｌｉａ）属植物、コーヒー（Ｃｏｆｆｅａ）属植物、コラノキ（Ｃｏｌａ）属植物、モチノキ（Ｉｌｅｘ）属植物、ネエア（Ｎｅｅａ）属植物、アオギリ（Ｆｉｒｍｉａｎａ）属植物、ポーリニア（Ｐａｕｌｌｉｎｉａ）属植物又はカカオノキ（Ｔｈｅｏｂｒｏｍａ）属植物を挙げることができる。中でもチャなどのツバキ科ツバキ（Ｃａｍｅｌｌｉａ）属植物、コーヒーなどのアカネ科コーヒー（Ｃｏｆｆｅａ）属植物、コラノキなどのアオギリ科コラノキ（Ｃｏｌａ）属植物などを好ましいものとして例示することができる。
【００５４】
【実施例】
以下、実施例および比較例により本発明を更に具体的に説明するが、本発明の範囲はこれらの実施例に限定されるものではない。
［実施例１］ Ｎ−メチルトランスフェラーゼのクローニングのための１本鎖ｃＤＮＡの合成
（１）ｔｏｔａｌ ＲＮＡの単離
５ｇの若いマテ（Ｉｌｅｘ ｐａｒａｇｕａｒｉｅｎｓｉｓ）を液体窒素存在下で乳棒、乳鉢を用いて破砕した。液体窒素の昇華後、５ｍｌの２％ＣＴＡＢ，０．１Ｍ Ｔｒｉｓ （ｐＨ９．５）、 ２０ｍＭ ＥＤＴＡ、 １．４Ｍ ＮａＣｌ、 ５％β− ｍｅｒｃａｐｔｏｅｔｈａｎｏｌに溶かして６５℃に１０分放置する。等量のクロロホルム液を加えて撹拌し、総量で１０ｍｌ程度にした。１５，０００ｒｐｍ、１０分間の遠心分離を行い、水層をとり、２．５ｍｌの１０Ｍ塩化リチウム液を加え、少なくとも２時間、−２０℃に放置する。４℃、１５，０００ｒｐｍ、１０分間の遠心分離を行い、上清を除去し、沈殿を１ｍｌのＴＥに溶解し、再度、遠心分離を行った。上清を回収し、１ｍｌのＴＥ飽和フェノール溶液を加えて転倒混和し、１５，０００ｒｐｍ、１０分間の遠心分離を行った。さらに上清にフェノール／クロロホルムを加えて撹拌し、１５，０００ｒｐｍ、１０分間の遠心分離を行った。水層を回収し、等量のクロロホルム液を加え、撹拌する。１５，０００ｒｐｍ、１０分間の遠心分離を行い、水層を回収し、１／４倍量の１０Ｍ塩化リチウム液を加え、少なくとも２時間、−２０℃に放置する。１５，０００ｒｐｍ、１０分間の遠心分離を行い、得られた沈殿に７０％ エタノールを加えて、再度、遠心分離を行った。沈殿を真空ポンプでドライアップした後、２００μｌの水に溶解しｔｏｔａｌ ＲＮＡの画分とした。
【００５５】
（２） ３’−ＲＡＣＥ法による３’末端のクローニングに必要なｃＤＮＡ合成３’−ＲＡＣＥはＴＡＫＡＲＡの３’−Ｆｕｌｌ ＲＡＣＥ Ｃｏｒｅ Ｓｅｔを使用した。配列表にないプライマーはこのセットに添付されているものである。６５℃５分間の熱処理を行ったｔｏｔａｌ ＲＮＡ １μｇをテンプレートにして、このセットの取扱説明書に書かれている方法でｏｌｉｇｏ ｄＴ−３−ｓｉｔｅｓ Ａｄａｐｔｏｒ Ｐｒｉｍｅｒを用いて逆転写反応によりｃＤＮＡを合成した。反応液の組成は以下の通りである。この反応液をＧｅｎｅ ＡｍｐＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ ２４００（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）を用いて、３０℃／１０分、５０℃／１時間、９５℃／５分反応させる条件で反応生成物を得た。
【００５６】
［実施例２］ ３’−ＲＡＣＥ法によるカフェインシンターゼ遺伝子のクローニング
先に述べた方法で調製した１本鎖ｃＤＮＡをテンプレートにした以下の反応液を調製した。本発明者等が既に単離報告しているチャ由来のカフェインシンターゼＴＣＳ１から配列番号３のプライマーＴＣＳ−ＳＡＭ１を設計しＰＣＲ反応に供試した。この反応液をＧｅｎｅ Ａｍｐ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ ２４００（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）を用いて、９５℃／１分の反応後、９４℃／１分、５７℃／１分、７２℃／１分３０秒を３０サイクル反応させる条件でＰＣＲを行い、反応生成物を得た。
【００５７】
テンプレートｃＤＮＡを含む先の反応液 ２０μｌ
１０×ｂｕｆｆｅｒ １０μｌ
２．５ｍＭ ＮＴＰ １６μｌ
ＴＣＳ−ＳＡＭ１ １μｌ（２０ｐｍｏｌ）
３ ｓｉｔｅｓ Ａｄａｐｔｏｒ Ｐｒｉｍｅｒ １μｌ（２０ｐｍｏｌ）
Ｈ２Ｏ ５１μｌ
ＥｘＴａｑ（ＴＡＫＡＲＡ） １μｌ
【００５８】
［実施例３］ プラスミドベクターへのサブクローニング
０．８％ アガロースゲルを用いてＴＡＥ中で反応生成物の電気泳動を行い、得られた目的生成物のバンドを切り取り、ＧＥＮＥ ＣＬＥＡＮ（フナコシ）を用いてゲルからＤＮＡを回収した。回収したＤＮＡをｐＴ７ｂｌｕｅベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ）にライゲーションした後、大腸菌ＤＨ５αにトランスフォーメーションした。Ｘ−ｇａｌを用いてカラーセレクションを行った後に、アンピシリンを含むＬＢ培地で液体培養を行い、アルカリ−ＳＤＳ法によりプラスミドを抽出した。インサートの有無はアガロース電気泳動によって確認した。
【００５９】
［実施例４］ 塩基配列の決定
単離したプラスミドを用いて下記のターミネーションミックス反応液中でプライマーエクステンションを行った。反応条件は９８℃／５分間反応させた後、９８℃／１分、５０℃／４５秒、７２℃／１．５分間を２５サイクル行った後に７２℃／１分間反応させた。反応終了後、各チューブに反応停止液を８μｌずつ加えた。９８℃／５分の熱変性を行い。サンプルを氷中で急冷した後に、島津ＤＳＱ−２０００Ｌ（Ｓ）システムを用いて分析した。試薬は、ＴｈｅｒｍｏＳｅｑｕｅｎａｓｅ Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｋｉｔ に添付されているものを用いた。
【００６０】
サンプルミックス反応液
プラスミドＤＮＡ （１ｐｍｏｌ） ３μｌ
標識Ｐｒｉｍｅｒ（２ｐｍｏｌ） １μｌ
Ｈ２Ｏ ２２μｌ
ターミネーションミックス反応液 （１サンプルにつき４種類）
Ａ反応液 ２μｌ
サンプルミックス ６μｌ
Ｇ反応液 ２μｌ
サンプルミックス ６μｌ
Ｃ反応液 ２μｌ
サンプルミックス ６μｌ
Ｔ反応液 ２μｌ
サンプルミックス ６μｌ
【００６１】
［実施例５］ ５’ＲＡＣＥ法によるＮ−メチルトランスフェラーゼｍＲＮＡの５’上流域の単離
５’上流域の単離には、５’−Ｆｕｌｌ ＲＡＣＥ Ｃｏｒｅ Ｓｅｔ（ＴＡＫＡＲＡ）を用いた。
３‘ＲＡＣＥの結果から得られた配列情報をもとに配列番号４〜８のプライマーを設計した。配列番号４（ＬＣＳ−ＲＴ）のプライマーを用いて１ｓｔ ｓｔｒａｎｄ ｃＤＮＡを行い、ｈｙｂｒｉｄ ＲＮＡの分解、ライゲーション反応による１本鎖ｃＤＮＡの環化の後に、配列番号５（ＬＣＳ１−ＡＲ）及び配列番号６（ＬＣＳ１−Ｂｎ）のプライマーを用いてＰＣＲ反応を行った。反応条件は９４℃／３分の反応後、９４℃／３０秒、６０℃／３０秒、７２℃／１分を３０サイクルとし、反応生成物を得た。さらにこれを鋳型として配列番号７（ＬＣＳ１−ＣＲ）及び配列番号８（ＬＣＳ１−Ｄｎ）のプライマーを用いて９４℃／３分の反応後、９４℃／３０秒、５２℃／３０秒、７２℃／３０秒を３０サイクルとし、反応生成物を得た。アクリルアミド電気泳動により反応生成物のバンドを分離し、ゲルからＤＮＡを回収し、ｐＴ７ｂｌｕｅベクターにサブクローニングし、島津製作所のＴｈｅｒｍｏＳｅｑｕｅｎａｓｅ Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｋｉｔを用いてサンプルを調製した後に、島津ＤＳＱ−２０００Ｌ（Ｓ）システムを用いてＤＮＡの塩基配列を決定した。３’ＲＡＣＥと５’ＲＡＣＥの結果を合わせて結合させ、得られた全長の配列を配列表の配列番号１に示す。該配列はＬＣＳ１と命名した。
【００６２】
［実施例６］ Ｎ−メチルトランスフェラーゼの大腸菌での発現
単離したＬＣＳ１遺伝子を発現ベクターｐＥＴ２３ｄ（Ｎｏｖａｇｅｎ）に組み込み、このプラスミドを大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）にトランスフォーメーションした。得られた大腸菌を３７℃で２時間培養した後に、ＩＰＴＧを最終濃度０．３ｍＭになるように加え、３０℃でさらに５時間培養を行った。培養終了後集菌し、３ｍｌの培養液の菌体に対し０．２ｍｌの１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）、０．１Ｍ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ−Ｎａ２中で１分間断続的に超音波破砕を行った。これを１４，０００ｒｐｍ、１０分間の遠心分離を行い、得られた上清を酵素液とした。この酵素液を用い活性を測定したところ、Ｎ−メチルトランスフェラーゼ活性が認められた。
【００６３】
【発明の効果】
本発明によれば、工業用、食品用または医療用酵素として利用できるＮ−メチルトランスフェラーゼを効率よく生産する事が可能になる。
【００６４】
本発明によれば、カフェイン産生植物、植物組織または植物細胞のカフェイン生合成代謝を改変してカフェイン代謝系の化合物群の生成比を改変することが可能になる。
【００６５】
【配列表】
[0001]
TECHNICAL FIELD OF THE INVENTION
The present invention relates to a mate-derived N-methyltransferase, DNA or RNA encoding the enzyme, microorganisms and plants transformed with the DNA, and a nucleic acid structure containing the RNA using the plant or its cultured cells or tissues. The present invention relates to a method for changing the amounts of caffeine and theobromine or a precursor thereof depending on a substance.
[0002]
[Prior art]
[0003]
[Non-Patent Document 1] Phytochemistry, 31, 2575- (1992)
[0004]
[Non-Patent Document 2] Biochem. J. , 146, 87- (1975).
[0005]
[Non-Patent Document 3] Phytochemistry, 37, 1577- (1994)
[0006]
[Non-Patent Document 4] Physiol. Plant. , 98, 629- (1996).
[0007]
[Patent Document 1] Japanese Patent Application No. 11-146358
[Patent Document 2] Japanese Patent Application No. 2000-151718
[Patent Document 3] Japanese Patent Application No. 2000-275063)
[Patent Document 4] Japanese Patent Application No. 2001-209072 Caffeine is a plant belonging to the genus Camellia sinensis, a plant belonging to the genus Camellia, a plant belonging to the genus Rubiaceae, such as coffee ( Coffea arabica ), the plant belonging to the genus Rubiaceae, and the genus Mochinoki, such as the mate ( Ilex paraguariensis ). It is a purine alkaloid contained in plants and the like, and is used as a pharmaceutical raw material and a food additive. At present, caffeine is produced by extraction from caffeine-producing plants including the above plant species, or by organic synthesis. In addition, in luxury items such as tea, coffee, and mate, the content of caffeine and its intermediates is reduced or increased using classical breeding techniques, etc., in order to alleviate or enhance their irritation. Have been tried.
[0011]
It has been revealed by 14C-tracer experiments that caffeine is biosynthesized from xanthosine via theobromine by three-step N-methylation [Non-Patent Document 1]. The enzyme activity that catalyzes this methylation was first reported in a study using a crude extract of tea leaves in 1975 [Non-Patent Document 2]. Attempts have been made to purify methyltransferase in coffee [Non-Patent Document 3], but the purification magnification was extremely low. In tea, partial transfer of methyltransferase has been reported [Non-patent Document 4], but the enzyme protein has not been isolated. Under such circumstances, the amino acid sequence of caffeine synthase, that is, an N-methyltransferase that catalyzes a two-step methylation reaction of 7-methylxanthine-theobromine-caffeine, which is the final reaction of caffeine biosynthesis, and its amino acid sequence For example, Kato et al. Have isolated and purified DNA from chamella sinensis and reported it (Patent Document 1, Patent Document 2, Patent Document 3).
[0012]
In addition, the same group has isolated and reported the presence of an enzyme that catalyzes only one-step methylation of 7-methylxanthine to theobromine in coffee (Patent Document 4). However, in Mate, the existence of an N-methyltransferase that hybridizes under stringent conditions with the above-mentioned N-methyltransferase that catalyzes the methylation reaction of caffeine biosynthesis has not been known so far. .
[0013]
[Problems to be solved by the invention]
The present invention aims to achieve the following objects by incorporating all or a part of DNA or RNA encoding N-methyltransferase into a microorganism or a plant cell in a sense or antisense form.
(1) To efficiently produce N-methyltransferase that can be used as an industrial, food or medical enzyme.
(2) Caffeine biosynthetic metabolism of a caffeine-producing plant, plant tissue or plant cell is modified to modify the formation ratio of a caffeine metabolic compound group.
[0014]
[Means for Solving the Problems]
The present inventors have made intensive studies and prepared a primer based on the DNA sequence of caffeine synthase of tea ( Camellia sinensis ) isolated previously, and newly used this primer to obtain mRNA from mate ( Ilex paraguariensis ). Various homolog genes were isolated. Next, this DNA was inserted into a vector and then introduced into Escherichia coli to express a large amount of a protein derived from the DNA. When the enzymatic properties of this protein were examined, it was confirmed that the obtained gene was a gene encoding N-methyltransferase. The present inventors have completed the present invention based on the above findings.
[0015]
That is, the present invention is as follows.
[1] A polypeptide defined by the amino acid sequence from No. 1 to No. 366 of SEQ ID NO: 1 in the sequence listing and having an enzyme activity of N-methyltransferase.
[2] A DNA encoding the polypeptide of [1].
[3] The DNA of the above-mentioned [2], which is defined by the nucleotide sequence of Nos. 1 to 1446 of SEQ ID NO: 1 in the sequence listing. [4] An RNA encoding the polypeptide of [1].
[5] The RNA of the above-mentioned [4], defined by the nucleotide sequence of Nos. 1 to 1446 of SEQ ID NO: 2 in the sequence listing. [6] A vector comprising the DNA of [2] or [3].
[7] The vector according to the above [6], which expresses a polypeptide having an enzyme activity of N-methyltransferase in a microorganism and / or a plant cell.
[8] The vector according to [6], which is capable of expressing an antisense RNA having an action of suppressing the expression of an enzyme of N-methyltransferase in a microorganism and / or a plant cell.
[9] A vector comprising the RNA of [4] or [5].
[10] The vector according to the above [9], which is capable of expressing an antisense RNA having an action of suppressing the expression of an N-methyltransferase enzyme in a microorganism and / or a plant cell.
[11] A microorganism transformed with the vector according to any one of [6] to [10].
[12] A method for producing a polypeptide having an N-methyltransferase enzymatic activity, using the transformed microorganism according to [11].
[13] A plant cell, plant tissue or plant transformed with the vector according to any one of [6] to [10].
[14] A method for producing a plant secondary metabolite using the transformed plant according to [13], a cultured cell of the plant or a plant.
[15] The method according to the above [14], wherein the plant secondary metabolite is at least one compound selected from xanthosine, 7-methylxanthosine, 7-methylxanthine, theobromine, theophylline, and caffeine.
[16] a transformed plant is camellia (Camellia) Genus, coffee (Coffea) genus plant, but Koranoki (Cola) Genus, coca (Erythroxylum) Genus, holly (Ilex) plant of the genus Neea (NEEA) plant of the genus The method of the above-mentioned [15], which is a plant of the genus Firmiana, a plant of the genus Paullinia, or a plant of the genus Theobroma .
[0016]
BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION
Hereinafter, the present invention will be described in detail.
The N-methyltransferase according to the present invention has the same enzyme activity as 7-methylxanthine N3 methyltransferase, theobromine N1 methyltransferase and paraxanthine N3 methyltransferase, or has at least one of these enzyme activities. Alternatively, it is a mate-derived polypeptide that hybridizes with coffee-derived N-methyltransferase under stringent conditions.
[0017]
The N-methyltransferase has the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1, and the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 is substituted with an amino acid as long as the desired N-methyltransferase activity is not impaired. And those having a mutated amino acid sequence obtained by insertion or deletion. That is, a polypeptide having the desired amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 having the above-mentioned N-methyltransferase activity and a mutant sequence thereof are collectively referred to as N-methyltransferase.
[0018]
The polypeptide having the above-mentioned mutant amino acid sequence itself has substantially the same function as that of Mate N-methyltransferase, and is stringent at a site related to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 and the enzyme activity. Mention may be made of polypeptides encoded by nucleotide sequences that hybridize under conditions.
[0019]
The nucleotide sequence encoding the N-methyltransferase according to the present invention, that is, the N-methyltransferase gene includes a nucleotide sequence encoding the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, and specific examples thereof include SEQ ID NO: 1 and the RNA sequence of SEQ ID NO: 2. Nucleotide sequences that hybridize to these N-methyltransferase genes under stringent conditions and encode the polypeptide having the N-methyltransferase activity are also included in the N-methyltransferase encoding gene of the present invention. .
[0020]
As the mutant amino acid sequence maintaining the desired N-methyltransferase activity, a mutant nucleotide sequence encoding this mutant amino acid sequence and a nucleotide sequence encoding the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 are hybridized under stringent conditions. What can be soyed can be suitably used practically.
[0021]
In addition, as the mutant N-methyltransferase gene, a gene that can hybridize with a nucleotide sequence encoding the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 under stringent conditions can be suitably used practically. Specific examples thereof include a DNA molecule capable of hybridizing to the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 under stringent conditions and an RNA molecule capable of hybridizing to the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2 under stringent conditions. Can be.
[0022]
Hybridization under this stringent condition can be performed, for example, by a method described in Molecular Cloning: Cold Spring Harbor Laboratory Press, Current Protocols in Molecular Biology; a system described in Wiley Interscience, and a commercially available system, which can be used as a commercial system. ). Specifically, hybridization can be performed by the following operation.
[0023]
The membrane onto which the DNA or RNA molecule to be tested has been transferred is hybridized with the labeled probe in a protocol-specific hybridization buffer according to the product protocol. The composition of the hybridization buffer consisted of 0.1% by weight of SDS, 5% by weight of dextran sulfate, 1/20 volume of the blocking reagent attached to the kit, and 2 to 7 × SSC. As the blocking reagent, for example, 100 × Denhardt's solution, 2% (weight / volume) Bovine serum albumin 2% (weight / volume) Ficoll ™ 400, 2% (weight / volume) polyvinylpyrrolidone prepared at a concentration of 5% Diluted 1/20. 20 × SSC is a 3M sodium chloride, 0.3M citric acid solution, and SSC is more preferably used at a concentration of 3 to 6 × SSC, more preferably 4 to 5 × SSC.
[0024]
The hybridization temperature is in the range of 40 to 80 ° C, more preferably 50 to 70 ° C, and still more preferably 55 to 65 ° C. After incubation for several hours to overnight, washing is performed with a washing buffer. The temperature for washing is preferably room temperature, more preferably the temperature for hybridization. The composition of the washing buffer is 6 × SSC + 0.1% by weight SDS solution, more preferably 4 × SSC + 0.1% by weight SDS solution, further preferably 2 × SSC + 0.1% by weight SDS solution, further preferably 1 × SSC + 0.1%. % SDS solution, most preferably 0.1 × SSC + 0.1% SDS solution. The membrane is washed with such a washing buffer, and the DNA or RNA molecule hybridized with the probe can be identified using the label used for the probe.
[0025]
The mutation may be caused in nature or artificially caused by site mutation in the nucleotide sequence.
[0026]
The DNA molecule having an N-methyltransferase gene of the present invention can be obtained, for example, by a PCR technique using an oligonucleotide that specifically hybridizes to a DNA molecule encoding N-methyltransferase as a primer (PCR experiment protocol for plants (cell engineering). Separate volume, Plant Cell Engineering Series 2) Shujunsha (1995)) can be used to separate cells from cells producing the N-methyltransferase of the present invention.
[0027]
Specifically, by isolating the full-length sequence of the target cDNA by, for example, binding a linker to cDNA synthesized from mRNA and performing PCR between the linker and DNA encoding the amino acid sequence constituting N-methyltransferase. Can be.
[0028]
A DNA molecule encoding N-methyltransferase obtained by such a hybridization technique or a PCR technique, at least at a site used for isolation, can be combined with the N-methyltransferase gene of SEQ ID NO: 1 under stringent conditions. Nucleotides that hybridize below.
[0029]
As an organism used for isolating a DNA molecule or an RNA molecule having a nucleotide sequence (gene) encoding the N-methyltransferase according to the present invention, any organism that produces caffeine or a precursor thereof can be used. Among them, among others, ilex paraguauriensis and other genus plants, Camellia and other Camellia plants such as tea, Rutaceae and coffee plants such as coffee, and genus Coleoptera and other plants belonging to the genus Cola. Can be exemplified.
[0030]
Next, a method for constructing an expression vector containing N-methyltransferase, a method for producing a transformed plant, and a method for suppressing expression of an N-methyltransferase enzyme by the RNAi method will be described.
[0031]
In order to express the N-methyltransferase gene or its antisense RNA in plant cells in this report in plant cells, (i) a promoter that can be transcribed in plant cells, and (ii) a sense or antisense direction downstream of the promoter. And (iii) a terminator sequence containing a polyadenylation site necessary for stabilization of a transcript linked downstream of the gene DNA, if necessary. The expression cassette is introduced into a plant cell.
[0032]
Here, as a template of the antisense RNA, a nucleotide sequence obtained by linking all or a part of a DNA molecule having an N-methyltransferase gene or a DNA molecule that hybridizes with them under stringent conditions in the antisense direction, or N A nucleotide sequence in which all or a part of an RNA molecule having a methyltransferase gene or an RNA molecule that hybridizes with them under stringent conditions is linked in the antisense direction, and a host that produces caffeine or a precursor thereof. Examples thereof include those having a function of inhibiting the expression of N-methyltransferase in a host cell when expressed in a cell.
[0033]
Here, a part of the N-methyltransferase gene is defined as an inhibitory mRNA obtained based on a sequence complementary to the part, that is, an antisense RNA formed in the host cell. Is a portion that binds to mRNA for expressing N-methyltransferase in and inhibits N-methyltransferase expression in host cells. This portion is a portion necessary for the formation of such antisense mRNA, and includes, for example, a portion having a length of at least 14 bases.
[0034]
Examples of the DNA molecule for forming an antisense mRNA include a DNA molecule having complementarity with all or a part of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1, and examples of the antisense RNA molecule include SEQ ID NO: : RNA molecules having complementarity with all or part of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2. A DNA or RNA molecule having complementarity with all or part of a mutant sequence capable of hybridizing with these nucleotide sequences under stringent conditions can also be used for such a purpose.
[0035]
These DNA or RNA molecules for inhibition may not necessarily encode the N-methyltransferase of the present invention.
[0036]
The expression cassette may contain a promoter for constitutively or inducibly expressing the inserted DNA. Examples of the promoter for constant expression include a cauliflower mosaic virus 35S promoter and a rice actin promoter. In addition, as a promoter for inducible expression, it is known that expression is caused by external factors such as infection or invasion of filamentous fungi, bacteria, and viruses, low temperature, high temperature, drying, anaerobic conditions, and spraying of a specific compound. Promoters and the like. Examples of such a promoter include a promoter of a rice chitinase gene expressed by infection or invasion of a filamentous fungus, a bacterium, and a virus, a promoter of a PR protein gene of tobacco, and a promoter of a rice “lip19” gene induced by low temperature. And the promoter of the Arabidopsis "HSP18.2" gene induced by high temperature, the promoter of the rice "rab" gene induced by drought, the promoter of the maize alcohol dehydrogenase gene induced by anaerobic conditions, and the like. The rice chitinase gene promoter and the tobacco PR protein gene promoter are also induced by specific compounds such as salicylic acid, and the rice “rab” gene promoter is induced by spraying the plant hormone abscisic acid.
[0037]
Alternatively, as a promoter for expressing the DNA inserted into the expression cassette, a method of isolating and using the promoter of the N-methyltransferase gene can also be mentioned. As an example of a specific method for isolating a promoter, a genomic DNA fragment is selected by using a hybridization technique with a probe of all or a part of the DNA of an N-methyltransferase gene, for example, an N-methyltransferase gene, A method for specifying the upstream DNA of the gene can be mentioned.
[0038]
To prepare for the introduction of the recombinant DNA molecule into plants, a number of cloning vectors are available that contain a replication signal for E. coli and a marker gene for selecting transformed bacterial cells. Examples of such vectors include pBR322, pUC, M13mp, and the like. The target sequence can be introduced into the vector at an appropriate restriction enzyme cleavage site. Restriction enzyme cleavage site analysis, gel electrophoresis, and other biochemical-molecular biological methods are commonly used to characterize the resulting plasmid DNA. After each operation, the plasmid DNA can be cut and ligated to another DNA. The sequence of each plasmid DNA can be cloned into the same plasmid or another plasmid.
[0039]
Various techniques can be used to introduce the expression cassette into a plant host cell. These techniques include transformation of plant cells with T-DNA using Agrobacterium tumefaciens or Agrobacterium rhizogenes as a transforming factor, and direct introduction into protoplasts (injection method). , Electroporation, etc.), particle gun, etc., and other possibilities.
[0040]
For direct introduction into protoplasts, no special vectors are required. For example, a simple plasmid such as a pUC derivative can be used. Depending on the method of introducing the target gene into plant cells, other DNA sequences may be required. For example, when a Ti or Ri plasmid is used for transformation of a plant cell, at least the sequence at the right end, usually both ends of the T-DNA region of the Ti and Ri plasmids is used as a region adjacent to the gene to be introduced. Must be connected to.
[0041]
When Agrobacterium is used for transformation, the expression cassette to be introduced must be cloned into a special plasmid, ie, an intermediate vector or a binary vector. Intermediate vectors are not replicated in Agrobacterium. The intermediate vector is transferred into Agrobacterium by helper plasmid or electroporation. Since the intermediate vector has a region homologous to the sequence of the T-DNA, it is incorporated into a Ti or Ri plasmid of Agrobacterium by homologous recombination. Agrobacterium used as a host must contain a vir region. Usually, a Ti or Ri plasmid contains a vir region, and the T-DNA can be transferred to a plant cell by its function.
[0042]
On the other hand, since a binary vector can be replicated and maintained in Agrobacterium, when incorporated into Agrobacterium by a helper plasmid or electroporation, the vir region of the host acts on the binary vector. Can be transferred to plant cells.
[0043]
The intermediate vector or binary vector containing the expression cassette thus obtained, and microorganisms such as Escherichia coli and Agrobacterium containing the expression cassette are also objects of the present invention.
[0044]
The transformed plant cells can be converted into plants by undergoing a regeneration process. The method of regeneration differs depending on the type of plant cell. For example, in rice, Fujimura et al. [Plant Tissue Culture Lett. , 2, 74- (1995)], for corn, the method of Shellito et al. [Bio / Technology, 7, 581- (1989)], and for Arabidopsis, the method of Akayama et al. [Plant Cell Rep. , 12,
7- (1992)].
[0045]
Plants produced by these methods have an altered expression level of the N-methyltransferase protein of the present invention as compared to wild-type plants that produce caffeine and caffeine or a precursor thereof. Changes in the amount of production of caffeine and theobromine metabolic compounds due to alteration of metabolism and changes in the production ratio of caffeine and theobromine metabolite compounds due to alteration of metabolism of the host plant occur. The transgenic plants thus obtained are the subject of the present invention. In the present invention, the term "plant" refers to all or a part of organs (eg, leaves, stems, roots, flowers, fruits, seeds, etc.) or cultured cells of a biological individual classified as a plant.
[0046]
Examples of plants that produce caffeine using the SAM as a methyl group donor include plants of Camellia genus such as tea, plants of the genus Camellia , such as coffee, plants of the genus Raffaceae ( Coffea ), plants of the genus Theobroma , and coconut trees. And caffeine-producing plants such as plants of the genus Coleoptera ( Cola ).
[0047]
Examples of the microorganism for introducing the DNA encoding the N-methyltransferase according to the present invention to express a large amount of the N-methyltransferase protein include bacteria such as Escherichia coli and Bacillus subtilis, and viruses such as baculovirus. it can.
[0048]
Further, for the purpose of improving the productivity of a specific compound or modifying the production ratio of a specific compound group by modifying the metabolism of a host cell, a DNA encoding the N-methyltransferase according to the present invention may be subjected to sense or antisense. As the plant to be incorporated in the form, any plant that produces caffeine or a precursor thereof can be used. Among them, plants of the genus Camellia ( Camellia ) such as tea, plants of the genus Coffea ( Coffea ) such as coffee, Examples include plants of the genus Theobroma and plants of the genus Collanaceae ( Cola ), such as the plant of the genus Koranoki.
[0049]
Plants produced by these methods have altered expression levels of the N-methyltransferase of the present invention compared to wild-type plants that produce caffeine or its precursor, Changes in the amount of caffeine metabolic compounds produced and changes in the production ratio of caffeine metabolic compounds due to alterations in the metabolism of the host plant occur. The transgenic plants thus obtained are the subject of the present invention.
[0050]
In recent years, from studies of plant post-translational gene silencing, it is possible to suppress the expression of a target gene by utilizing the defense mechanism inherent in plants against foreign nucleic acids such as viruses. (Cell, 95, 177-187 (1998), Chemistry and Biology, 37, 532- (1999), Protein Nucleic Acid Enzyme, 44, 1396- (1999)). According to this, when a DNA virus, an RNA virus, or the like enters a plant, the plant transcribes the Averant RNA from these templates, and transcribes the double-stranded RNA in a sequence-specific manner with the transcript of the sequence originally possessed by the plant. Form. When this double-stranded RNA is degraded by RNase, it becomes possible to suppress the expression of the target gene (Cell, 96, 303- (1999)). One of the important features of this method is that it is not always necessary to transform a target plant into a sequence whose expression is to be suppressed. Further, a further feature of the present method is that if a target nucleic acid is introduced into a part of a plant (lower leaf or the like) by infection or the like, the effect spreads to the whole plant. Specific methods for suppressing expression include double-stranded RNA containing the whole or part of the N-methyltransferase gene or a partial sequence of the N-methyltransferase gene or a sequence that hybridizes therewith under stringent conditions; Agrobacterium having single-stranded DNA is transmitted to lower leaves of plants. Here, a part of the N-methyltransferase gene is defined as an inhibitory mRNA obtained on the basis of a sequence having complementarity with the part, that is, when an averager RNA is formed in the host cell, Is a portion that binds to mRNA for expressing N-methyltransferase in and inhibits N-methyltransferase expression in host cells. This portion is a portion necessary for forming such an average mRNA, and includes, for example, a portion having a length of at least 14 bases.
[0051]
Plants that have been subjected to these methods have altered expression levels of the N-methyltransferase protein of the present invention compared to wild-type plants that produce caffeine or theobromine or a precursor thereof, and Changes in the amount of caffeine metabolic compounds caused by the alteration of the compound, and changes in the production ratio of the caffeine metabolic compounds caused by alteration in the metabolism of the host plant. The plants thus obtained are the subject of the present invention. The plant in the present invention also includes specific tissues or cells of the plant, such as leaves, flowers, fruits, and seeds.
[0052]
Cultivating plant cells or plant tissues transformed with or infected with the vector of the above-described configuration, or cultivating similarly transformed plants, secondary to caffeine and theobromine synthesis system Production of metabolites and modification of the composition of secondary metabolites produced by these transformants can be performed. Examples of the secondary metabolite include at least one compound selected from the group consisting of 7-methylxanthine, paraxanthine, theobromine and caffeine.
[0053]
As a source of a plant cell, plant tissue or plant used for transformation, for example, the transformed plant is a plant of the genus Camellia, a plant of the genus Coffee (Coffea), a plant of the genus Collan (Cola), or a plant of Ilex (Ilex) ) Genus plants, Neea genus plants, Firmiana genus plants, Paulinia genus plants, or Kakaonoki (Theobroma) genus plants. Among them, preferred are Camellia plants of the family Camellia, such as tea, plants of the genus Coffea, such as coffee, and plants of the genus Coleana, such as Chinese lantern.
[0054]
【Example】
Hereinafter, the present invention will be described more specifically with reference to Examples and Comparative Examples, but the scope of the present invention is not limited to these Examples.
Example 1 Synthesis of Single-Stranded cDNA for Cloning of N-Methyltransferase (1) Isolation of Total RNA 5 g of young yerba mate (Ilex paraguariensis) was crushed using a pestle and a mortar in the presence of liquid nitrogen. . After sublimation of liquid nitrogen, it is dissolved in 5 ml of 2% CTAB, 0.1 M Tris (pH 9.5), 20 mM EDTA, 1.4 M NaCl, 5% β-mercaptoethanol and left at 65 ° C. for 10 minutes. An equal volume of a chloroform solution was added and stirred, and the total volume was reduced to about 10 ml. Centrifuge at 15,000 rpm for 10 minutes, remove the aqueous layer, add 2.5 ml of 10M lithium chloride solution, and leave at -20 ° C for at least 2 hours. Centrifugation was performed at 4 ° C., 15,000 rpm for 10 minutes, the supernatant was removed, the precipitate was dissolved in 1 ml of TE, and centrifuged again. The supernatant was recovered, and 1 ml of a TE-saturated phenol solution was added thereto, mixed by inversion, and centrifuged at 15,000 rpm for 10 minutes. Further, phenol / chloroform was added to the supernatant, and the mixture was stirred and centrifuged at 15,000 rpm for 10 minutes. The aqueous layer is collected, an equal volume of a chloroform solution is added, and the mixture is stirred. The mixture is centrifuged at 15,000 rpm for 10 minutes, the aqueous layer is collected, a 1/4 volume of a 10 M lithium chloride solution is added, and the mixture is left at −20 ° C. for at least 2 hours. After centrifugation at 15,000 rpm for 10 minutes, 70% ethanol was added to the obtained precipitate, and centrifugation was performed again. The precipitate was dried up with a vacuum pump and dissolved in 200 μl of water to obtain a total RNA fraction.
[0055]
(2) Synthesis of cDNA required for cloning of 3 'end by 3'-RACE method For 3'-RACE, 3'-Full RACE Core Set of TAKARA was used. Primers not listed in the sequence listing are those attached to this set. Using 1 μg of total RNA that had been heat-treated at 65 ° C. for 5 minutes as a template, cDNA was synthesized by reverse transcription using oligo dT-3-sites Adapter Primer according to the method described in the instruction manual for this set. The composition of the reaction solution is as follows. Using a Gene Amp PCR System 2400 (Perkin Elmer), a reaction product was obtained from this reaction solution under the conditions of 30 ° C./10 minutes, 50 ° C./1 hour, and 95 ° C./5 minutes.
[0056]
[Example 2] Cloning of caffeine synthase gene by 3'-RACE method The following reaction solution was prepared using the single-stranded cDNA prepared by the method described above as a template. The present inventors designed primer TCS-SAM1 of SEQ ID NO: 3 from tea-derived caffeine synthase TCS1 which has already been isolated and reported, and used it for PCR reaction. Using a Gene Amp PCR System 2400 (Perkin Elmer), the reaction solution was reacted at 95 ° C / 1 minute, and then subjected to 30 cycles of 94 ° C / 1 minute, 57 ° C / 1 minute, 72 ° C / 1 minute 30 seconds. PCR was performed under the conditions to obtain a reaction product.
[0057]
20 μl of the previous reaction containing template cDNA
10 × buffer 10 μl
16 mM 2.5 mM NTP
TCS-SAM1 1 μl (20 pmol)
3 sites Adapter Primer 1 μl (20 pmol)
H2O 51μl
ExTaq (TAKARA) 1 μl
[0058]
Example 3 Subcloning into a Plasmid Vector The reaction product was subjected to electrophoresis in TAE using 0.8% agarose gel, the band of the target product was cut out, and the band was cut using GENE CLEAN (Funakoshi). DNA was recovered from the gel. The collected DNA was ligated to a pT7blue vector (Novagen), and then transformed into Escherichia coli DH5α. After performing color selection using X-gal, liquid culture was performed in an LB medium containing ampicillin, and a plasmid was extracted by an alkali-SDS method. The presence or absence of the insert was confirmed by agarose electrophoresis.
[0059]
[Example 4] Determination of base sequence Using the isolated plasmid, primer extension was performed in the following termination mix reaction solution. The reaction conditions were as follows: a reaction was performed at 98 ° C. for 5 minutes, 25 cycles of 98 ° C. for 1 minute, 50 ° C. for 45 seconds, and 72 ° C. for 1.5 minutes, followed by a reaction at 72 ° C. for 1 minute. After the reaction was completed, 8 µl of the reaction stop solution was added to each tube. Thermal denaturation was performed at 98 ° C for 5 minutes. After quenching the sample in ice, it was analyzed using a Shimadzu DSQ-2000L (S) system. As the reagent, the one attached to ThermoSequenase Cycle Sequencing Kit was used.
[0060]
Sample mix reaction solution plasmid DNA (1 pmol) 3 μl
Labeled Primer (2 pmol) 1 μl
H2O 22μl
Termination mix reaction solution (4 types per sample)
A reaction solution 2μl
Sample mix 6μl
G reaction solution 2μl
Sample mix 6μl
C reaction solution 2μl
Sample mix 6μl
T reaction solution 2μl
Sample mix 6μl
[0061]
[Example 5] Isolation of 5 'upstream region of N-methyltransferase mRNA by 5' RACE method For isolation of 5 'upstream region, 5'-Full RACE Core Set (TAKARA) was used.
Primers of SEQ ID NOs: 4 to 8 were designed based on the sequence information obtained from the result of 3 ′ RACE. Using the primer of SEQ ID NO: 4 (LCS-RT), 1st strand cDNA is performed, and after degradation of hybrid RNA and cyclization of single-stranded cDNA by ligation reaction, SEQ ID NO: 5 (LCS1-AR) and SEQ ID NO: 6 ( A PCR reaction was performed using the primers of LCS1-Bn). The reaction conditions were 94 ° C./3 min, 30 cycles of 94 ° C./30 sec, 60 ° C./30 sec, and 72 ° C./1 min to obtain a reaction product. Further, after using this as a template and using the primers of SEQ ID NO: 7 (LCS1-CR) and SEQ ID NO: 8 (LCS1-Dn) at 94 ° C./3 minutes, 94 ° C./30 seconds, 52 ° C./30 seconds, 72 ° C. The reaction product was obtained by setting 30 cycles of / 30 seconds. The band of the reaction product was separated by acrylamide electrophoresis, DNA was recovered from the gel, subcloned into the pT7blue vector, and a sample was prepared using the ThermoSequenase Cycle Sequencing Kit of Shimadzu Corporation, followed by Shimadzu DSQ-2000L (S) System Was used to determine the nucleotide sequence of the DNA. The results of 3′RACE and 5′RACE were combined and combined, and the resulting full-length sequence is shown as SEQ ID NO: 1 in the sequence listing. The sequence was named LCS1.
[0062]
Example 6 Expression of N-methyltransferase in Escherichia coli The isolated LCS1 gene was incorporated into an expression vector pET23d (Novagen), and this plasmid was transformed into Escherichia coli BL21 (DE3). After culturing the obtained E. coli at 37 ° C. for 2 hours, IPTG was added to a final concentration of 0.3 mM, and culturing was further performed at 30 ° C. for 5 hours. After completion of the culture, the cells were collected, and the cells in 3 ml of the culture were intermittently sonicated for 1 minute in 0.2 ml of 10 mM Tris-HCl buffer (pH 7.5), 0.1 M NaCl, and 1 mM EDTA-Na2. Crushing was performed. This was centrifuged at 14,000 rpm for 10 minutes, and the obtained supernatant was used as an enzyme solution. When the activity was measured using this enzyme solution, N-methyltransferase activity was observed.
[0063]
【The invention's effect】
According to the present invention, it is possible to efficiently produce N-methyltransferase that can be used as an industrial, food or medical enzyme.
[0064]
ADVANTAGE OF THE INVENTION According to this invention, it becomes possible to modify caffeine biosynthesis metabolism of a caffeine producing plant, a plant tissue, or a plant cell, and to modify the production ratio of the compound group of a caffeine metabolism system.
[0065]
[Sequence list]
