JP2004168685A - New compound f-20916a - Google Patents

Abstract

<P>PROBLEM TO BE SOLVED: To provide a compound which has an excellent anti-fungal activity, especially an excellent antifungal activity against fungi including resistant fungi. <P>SOLUTION: This compound is represented by formula (I). The method for producing the compound comprises culturing a fungus which belongs to the genus Trichoderma and produces the compound, and collecting the compound from the cultured product. <P>COPYRIGHT: (C)2004,JPO

Description

【００１０】
（２） 下記の物理化学的性状を有する化合物又はその塩、
１）物質の性状：白色粉末状物質
溶解性：ピリジン、メタノール、ＤＭＳＯに可溶、水、ノルマルヘキサンに不溶
３）分子式：Ｃ_４１Ｈ_７３Ｎ_９Ｏ_１５
４）分子量：９３１ （ＦＡＢマススペクトル法により測定）
５）高分解能二重収束質量分析計を用い、ＥＳＩマススペクトル法にて測定した精密質量：［Ｍ＋Ｈ］^＋は次に示す通りである。
実測値：９３２．５３１６
計算値：９３２．５３０４
６）赤外吸収スペクトル：臭化カリウム （ＫＢｒ） 錠剤法で測定した赤外吸収スペクトルは以下に示す極大吸収を示す。
３３１６，２９２５，１７４９，１６３２，１５３４，１０６８ ｃｍ^−１
７）^１Ｈ−核磁気共鳴スペクトル：重ピリジン中でピリジンの最も低磁場のシグナルを８．７４ ｐｐｍとして測定した、^１Ｈ−核磁気共鳴スペクトルは、以下に示すとおりである。括弧中の水素の数はＨＳＱＣ法およびＤＥＰＴ法により観測されたものである。０．８４ （３Ｈ， ｄ， Ｊ ＝ ７ Ｈｚ）， ０．８８ （３Ｈ， ｔ， Ｊ ＝ ７ Ｈｚ）， １．０５−１．３３ （１８Ｈ， ｍ）， １．５５（３Ｈ， ｄ， Ｊ ＝ ６．５ Ｈｚ）， １．５９ （３Ｈ， ｄ， Ｊ ＝ ７ Ｈｚ）， １．８２ （１Ｈ， ｍ）， ２．２８ （２Ｈ， ｍ）， ２．４０ （１Ｈ， ｍ）， ２．６７ （１Ｈ， ｍ）， ２．８３ （２Ｈ， ｍ）， ３．２８ （１Ｈ， ｍ）， ３．３５ （１Ｈ， ｍ）， ４．２２ （１Ｈ， ｂｒ ｄ， Ｊ ＝ １６．５ Ｈｚ）， ４．３０−４．５２ （８Ｈ， ｍ）， ４．５９−４．６５ （２Ｈ， ｍ）， ４．８６（１Ｈ， ｍ）， ５．０３ （１Ｈ， ｄ， Ｊ ＝ ７ Ｈｚ）， ５．１６ （１Ｈ， ｍ）， ５．２８ （３Ｈ， ｍ）， ５．４７ （１Ｈ， ｍ）， ５．６５ （１Ｈ， ｍ）， ｐｐｍ
８）^１３Ｃ−核磁気共鳴スペクトル：重ピリジン中でピリジンの最も低磁場のシグナルを１５０．３５ ｐｐｍとして測定した、^１３Ｃ−核磁気共鳴スペクトルは、以下に示すとおりである。
１４．８ （ｑ）， １５．３ （ｑ）， １８．２ （ｑ）， １８．２ （ｔ）， ２１．３ （ｑ）， ２３．４ （ｔ）， ２５．９ （ｔ）， ２７．７ （ｔ）， ３０．１ （ｔ）， ３０．３ （ｔ，炭素２個分として）， ３０．４ （ｔ）， ３０．５ （ｔ）， ３０．７（ｔ），３２．６ （ｔ）， ３３．０ （ｔ）， ３７．６ （ｄ）， ３８．９ （ｔ）， ４０．２ （ｔ）， ４２．９ （ｔ）， ５１．１ （ｄ）， ５３．７ （ｄ）， ５７．５ （ｄ）， ５７．８ （ｄ）， ６０．１ （ｄ）， ６０．５ （ｄ）， ６１．８ （ｔ）， ６３．０ （ｔ）， ６３．３ （ｔ）， ６３．７ （ｔ）， ６８．３ （ｄ）， ７６．８ （ｄ）， １７０．７ （ｓ）， １７１．６ （ｓ）， １７２．２ （ｓ）， １７２．４ （ｓ）， １７２．７ （ｓ）， １７３．３ （ｓ）， １７３．９ （ｓ）， １７４．２ （ｓ）， １７４．７ （ｓ） ｐｐｍ
９）高速液体クロマトグラフィー：
カラム：カプセルパック Ｃ_１８ ＡＣＲ， ４．６ Φ ｘ １５０ ｍｍ （（株）資生堂社製）
溶媒：アセトニトリル／０．２ ％ トリエチルアミン燐酸緩衝液（ｐＨ７．０）＝４０／６０
流速：１．０ ｍｌ／ 分
検出：紫外部吸収 ２１０ ｎｍ
保持時間：６．０ 分
（３） トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）属に属する（１）または（２）に記載の化合物の生産菌を培養し、その培養物より（１）または（２）に記載の化合物を採取することを特徴とする（１）または（２）に記載の化合物の製造方法、
（４） トリコデルマ属に属する、（１）または（２）に記載の化合物の生産菌がトリコデルマ・ハマータム（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｈａｍａｔｕｍ （Ｂｏｎｏｒｄ．） Ｂａｉｎｉｅｒ）ＳＡＮＫ１８５０２株である（３）に記載の製造方法、
（５） （１）または（２）に記載の化合物又はその薬理上許容される塩を有効成分として含有する医薬、
（６） （１）または（２）に記載の化合物又はその薬理上許容される塩を有効成分として含有する真菌感染症の予防薬又は治療薬、
（７） トリコデルマ ハマータム（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｈａｍａｔｕｍ （Ｂｏｎｏｒｄ．） Ｂａｉｎｉｅｒ）ＳＡＮＫ１８５０２株に関する。
【００１１】
以下、本明細書において、上記（１）または（２）に記載の化合物をＦ−２０９１６Ａという。
【００１２】
本発明のＦ−２０９１６Ａは、和歌山県おいて採集された土壌から分離したトリコデルマ ハマータム（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｈａｍａｔｕｍ （Ｂｏｎｏｒｄ．） Ｂａｉｎｉｅｒ）ＳＡＮＫ１８５０２株（以下、単に「ＳＡＮＫ１８５０２株」と称する。）の培養液中に生産される。
【００１３】
本発明の化合物は、いくつかの不斉炭素原子を有するため、種々の光学異性体が存在する。式（Ｉ）において、これらの異性体はすべて単一の式で示されているが、本発明はラセミ化合物を含むこれらの異性体、およびこれらの異性体の混合物をもすべて含む。これらの異性体は、立体特異的合成法により、または光学活性化合物を原料化合物とした合成により、製造することができ、または、異性体の混合物として製造した後、所望の異性体をクロマトグラフィー等を用いて常法により単離することにより製造することもできる。
【００１４】
本発明の化合物は、アミノ基等を有するため、酸を用いて当業者に周知の方法により塩にすることができる。本発明はこれらの塩も包含する。本発明の化合物の塩を医薬として使用する場合、医学的に使用され、薬理学的に許容されるものであれば特に限定はなく、また、医薬以外の用途に用いる場合、例えば中間体として用いる場合には、該用途に用いることのできるものであれば特に限定されない。
【００１５】
そのような塩としては、例えば、酢酸塩、臭化物塩、塩化物塩、塩酸塩、臭酸塩、ヨウ化物塩、硫酸塩、リン酸塩、ニリン酸塩のような無機塩；およびクエン酸塩、マレイン酸塩、パモ酸塩、酒石酸塩のような有機酸塩等を挙げることができる。好適には、薬理学的に許容される塩であり、より好適には、塩酸塩、パモ酸塩である。
【００１６】
また、本発明の化合物およびその塩は、大気中に放置したり、水又は有機溶媒と混和することによって水又は溶媒と結合し、水和物又は溶媒和物を形成する場合があるが、これらの水和物及び溶媒和物も「薬理上許容される塩」として本発明に含まれる。
【００１７】
更に、本発明は、生体内において代謝されることによりＦ−２０９１６Ａに変換される化合物、いわゆるプロドラッグもすべて含むものである。
【００１８】
【発明の実施の形態】
（１）生産菌
本発明Ｆ−２０９１６Ａの製造方法において用いられる、トリコデルマ （Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ） 属に属する菌株としては、例えばトリコデルマ ハマータム（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｈａｍａｔｕｍ （Ｂｏｎｏｒｄ．） Ｂａｉｎｉｅｒ）ＳＡＮＫ１８５０２株（以下、単に「ＳＡＮＫ１８５０２株」と称する）をあげることができる。ＳＡＮＫ１８５０２株は、２００１年２月和歌山県で採集した土壌より分離された。
【００１９】
本菌の菌学的性状を観察するため、次の各培地上で培養を行った。使用した各培地の組成を以下に記載する。
【００２０】
【表１】
＜２％ＭＡ培地（２％麦芽エキス寒天培地）＞
麦芽エキス ２０ｇ
寒天 ２０ｇ
蒸留水 １０００ｍｌ
＜ＣＭＡ培地（コーンミール寒天（Ｃｏｒｎ Ｍｅａｌ Ａｇａｒ）培地）＞
コーンミールアカ゛ール（日水製薬（株）製） １７ｇ
寒天 ５ｇ
蒸留水 １０００ｍｌ
＜ＷＳＨ培地＞
オートミール １０ｇ
硫酸マグネシウム七水和物 １ｇ
リン酸二水素カリウム １ｇ
硝酸ナトリウム １ｇ
寒天 ２０ｇ
蒸留水 １０００ｍｌ。
【００２１】
色調の表示はコーネラップ、ワンスチャー，「メチューン・ハンドブック・オブ・カラー」，第３版，ロンドン，エアメチューン，１９７８年（Ｋｏｒｎｅｒｕｐ Ａ， Ｗａｎｓｃｈｅｒ ＪＨ “Ｍｅｔｈｕｅｎ ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ ｃｏｌｏｕｒ” ３ｒｄ． ｅｄｉｔｉｏｎ． Ｅｒｙｅ Ｍｅｔｈｕｅｎ， Ｌｏｎｄｏｎ， （１９７８））に従った。ＳＡＮＫ１８５０２株の各平板培地上での生育は次の通りである。
【００２２】
２％ＭＡ培地上での成長は、２０℃、４日の培養で直径６０乃至６２ｍｍである。コロニーは平坦で薄く、気菌糸は少ない。コロニー表面は白色である。培養を継続すると多数のプステル（ｐｕｓｔｕｌｅｓ）が同心円状にまたはコロニー縁辺部に形成される。プステルは直径６ ｍｍ以下、半球形、表面はビロード状、初め白色でしだいにディープグリーン（２５Ｅ８）となる。浸出液および匂いはない。裏面は無色である。
【００２３】
ＣＭＡ培地上での成長は、２０℃、４日の培養で直径５６ｍｍである。コロニーは平坦で薄く、気菌糸は少ない。コロニー表面は白色である。浸出液および匂いはない。裏面は無色である。
【００２４】
ＷＳＨ培地上での成長は、２０℃、４日の培養で直径６４乃至６６ｍｍである。コロニーは平坦で薄く、気菌糸は少ない。コロニー表面は白色である。浸出液および匂いはない。裏面は無色である。
【００２５】
ＳＡＮＫ１８５０２株の微小形態は次の通りである。
分生子柄は平滑で薄壁、無色で幅６ μｍ以下、下部では規則的に分枝し、分枝はほぼ直角に分かれる。分生子柄主軸の先端部は不稔、不規則に分枝し、波状乃至かぎ状、不稔部分は長さ１２０ μｍ以下である。フィアライドは４乃至５×２．５乃至３．５ μｍ、つぼ形、多くは４乃至６個輪生する。分生子は３乃至４．５×２．５乃至３μｍ、楕円形で平滑、薄壁で薄い緑色。厚膜胞子は直径５乃至１２μｍ、菌糸末端部または菌糸に介在して形成され、亜球形乃至楕円形、平滑で壁は厚さ１ μｍ以下、無色である。
【００２６】
本菌の以上のような菌学的性状は、ビセット等，「アリヴィジョンオブザジーナストリコデルマ． ＩＩＩ． セクションパキバシディウム カナディアンジャーナルオブボタニー」，カナディアンジャーナルオブバトニー，１９９１年，第６９巻，ｐ．２３７３−２４１７（Ｂｉｓｓｅｔｔ Ｊ， “Ａ ｒｅｖｉｓｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｇｅｎｕｓ Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ． ＩＩＩ． Ｓｅｃｔｉｏｎ Ｐａｃｈｙｂａｓｉｄｉｕｍ”， Ｃａｎａｄｉａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｏｔａｎｙ， ６９， ｐ．２３７３−２４１７ （１９９１））やガムス、ビセット等，「モルホロジーアンドアイデンティフィケーションオブトリコデルマ」，キュビセック、ハルマン編集、「トリコデルマアンドグリオクラディウム」，第１巻，テイラーアンドフランシスジャーナル，１９９８年，ｐ．３−３４（Ｇａｍｓ Ｗ， Ｂｉｓｓｅｔｔ Ｊ， Ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙ ａｎｄ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆ Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ． Ｉｎ：Ｋｕｂｉｃｅｋ ＣＰ， Ｈａｒｍａｎ ＧＥ （ｅｄｓ） Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ａｎｄ Ｇｌｉｏｃｌａｄｉｕｍ ． Ｔａｙｌｏｒ ＆ Ｆｒａｎｃｉｓ Ｊｏｕｒｎａｌ， Ｌｏｎｄｏｎ， １， ｐ．３−３４ （１９９８））に記載されているトリコデルマ ハマータム（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｈａｍａｔｕｍ （Ｂｏｎｏｒｄ．） Ｂａｉｎｉｅｒ）と一致した。よって本菌株を、トリコデルマ ハマータムと同定した。
【００２７】
なお、ＳＡＮＫ１８５０２株は、トリコデルマ ハマータム ＳＡＮＫ１８５０２株として、平成１４年１１月１日付けで日本国茨城県つくば市東１−１−１の独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに国際寄託され、受託番号 ＦＥＲＭ ＢＰ−８２３０を付与された。
【００２８】
周知の通り、真菌類は自然界において、又は人工的な操作（例えば、紫外線照射、放射線照射、化学薬品処理等）により、変異を起こしやすく、本発明のＳＡＮＫ１８５０２株もその点は同じである。本発明にいうＳＡＮＫ１８５０２株はその全ての変異株を包含する。
【００２９】
また、これらの変異株の中には、遺伝的方法、たとえば組み換え、形質導入、形質転換等によりえられたものも包含される。即ち、Ｆ−２０９１６Ａを生産するＳＡＮＫ１８５０２株、それらの変異株およびそれらと明確に区別されない菌株は全てＳＡＮＫ１８５０２株に包含される。
【００３０】
（２）培養法及び精製法
本発明のＦ−２０９１６Ａを得るため、これらの微生物の培養は一般に他の発酵生成物を生産するために用いられる培地と同様の培地を用いて行なわれる。このような培地は、微生物が資化出来る炭素源、窒素源および無機塩を含有する。
【００３１】
炭素源としては、例えば、グルコース、フラクトース、マルトース、シュークロース、マンニトール、グリセリン、デキストリン、オート麦、ライ麦、トウモロコシデンプン、ジャガイモ、トウモロコシ粉、大豆油、綿実油、糖蜜、クエン酸、酒石酸等をあげることができる。これらの炭素源は単独または組み合わせて用いることができる。
【００３２】
培地に加える炭素源の量は、培地中の他の成分により異なるが、通常、培地量の１乃至１０重量％である。
【００３３】
窒素源としては、例えば、大豆粉、フスマ、落下生粉、綿実紛、カゼイン加水分解物、ファーマミン、コーンスチープリカー、ペプトン、肉エキス、イースト、イーストエキス、マルトエキス、硝酸ナトリウム、硝酸アンモニウム、硫酸アンモニウム等をあげることができる。これらの炭素源は単独または組み合わせて用いることができる。
【００３４】
培地に加える窒素源の量は、培地中の他の成分により異なるが、通常、０．２乃至６重量％である。
【００３５】
炭素源および窒素源は、一般に組み合わせて用いるが、純粋な形態である必要はなく、微量の生育因子、ビタミンおよび無機栄養を含むより純度の低いものを用いてもよい。
【００３６】
無機塩としては、例えば、ナトリウム、カリウム、マグネシウム、アンモニウム、カルシウム、リン酸、硫酸、塩酸、炭酸等のイオンを生じる塩類をあげることができる。
【００３７】
また、菌の資化しうるビタミンＢ_１、ビオチンのようなビタミン類、チアミンのような菌体増殖促進物質等も必要に応じて添加してもよい。
【００３８】
更に、マンガン、モリブデン、その他の金属塩を必要に応じて添加してもよい。
【００３９】
栄養培地がかなり泡立つ場合など、必要に応じて、シリコンオイル、ポリアルキレングリコールエーテル、植物油、動物油、界面活性剤のような消泡剤を培地に添加してもよい。特に、液体培養に際しては、これらの消泡剤を添加することが好適である。
【００４０】
培地のｐＨは、培地の成分、生育温度等により異なるが、通常発酵生成物を生産するために用いられるｐＨであればよく、好適には、４．０乃至６．５の範囲である。
【００４１】
菌の生育温度は、培地の成分、ｐＨ等により異なるが、通常、１０℃乃至３３℃であり、２０℃から３０℃の範囲が生育に良好である。Ｆ−２０９１６Ａの生産には、２０℃から２７℃が好適である。
【００４２】
培養方法としては、特に制限はなく、微生物一般に用いられる培養法であればよく、固形培地を用いた培養法、攪拌培養法、振とう培養法、通気培養法等を使用することができる。好適には、好気的な液体培養法である攪拌培養法、振とう培養法、又は通気培養法であり、更に好適には、振とう培養法である。なお、工業的には、通気攪拌培養法が好適である。
【００４３】
小規模な培養においては、２０乃至２７℃（好適には、２３℃）で数日間、振とう培養を行なうのが好適である。培養は三角フラスコ中で、１または２段階の種の発育工程により開始させる。種の発育段階の培地には、炭素源、窒素源、微量の生育因子、無機塩類および微量金属類を併用できる。種フラスコは定温インキュベーター中で２０乃至２７℃（好適には２３℃）、２乃至７日間（好適には４日間）振とうするか、又は充分に成育するまで振とうする。成育した種は、第二の種培地又は生産培地に接種するために用いられる。中間の発育工程を用いる場合には、本質的に同様の方法で成育させ、生産培地に接種するためにそれを部分的にあるいは全てを用いる。接種したフラスコを一定温度で数日間振とうし、本培養を行なう。
【００４４】
大量培養の場合には、攪拌および通気装置を付けた適当なジャーファーメンター又はタンクで行なうのが好ましい。この方法によれば栄養培地をジャーファーメンター又はタンクの中で作成できる。栄養培地を１２１℃まで加熱して必要時間滅菌し、冷却後、滅菌培地にあらかじめ成長させてあった種を接種する。培養は２０乃至２７度（好適には２３℃）で通気攪拌して行なう。この方法は、多量の化合物を得るのに適している。
【００４５】
培養の経過に伴って生産されるＦ−２０９１６Ａの量の経時変化は、高速液体クロマトグラフィーを用いて測定することができる。通常は、１００乃至２４０時間の培養でＦ−２０９１６Ａの生産量は最高値に達する。
【００４６】
培養終了後、培養液中の液体部分および菌体内に存在するＦ−２０９１６Ａは、培養終了液の全て、あるいは菌体、その他の固形部分を珪藻土をろ過助剤とするろ過操作又は遠心分離によって分別し、得られたろ液又は上清および菌体中から、その物理化学的性状を利用し抽出精製することができる。例えば、ろ液又は上清中に存在するＦ−２０９１６Ａは、水と混和しない有機溶剤、例えば、クロロホルム、塩化エチレン、塩化メチレン、酢酸エチル、ブタノール等を組み合わせることにより抽出精製することができる。あるいは吸着剤として、例えば活性炭又は吸着用樹脂であるアンバーライトＸＡＤ−２、ＸＡＤ−４（登録商標、ローム・アンド・ハース社製）等や、ダイアイオンＨＰ−１０、ＨＰ−２０、ＣＨＰ−２０Ｐ、ＨＰ−５０、セパビーズＳＰ−２０７（登録商標、三菱化学（株）社製）等が使用される。Ｆ−２０９１６Ａを含む液を上記のごとき吸着剤の層を通過させて不純物を吸着させて取り除くか、又はＦ−２０９１６Ａを吸着させた後、メタノール水、アセトン水、ブタノ−ル水等を用いて溶出させることにより得られる。
【００４７】
また菌体内に存在するＦ−２０９１６Ａは、５０乃至９０％の含水アセトン又は含水メタノールにより抽出し有機溶剤を除去した後、ろ液と同様な抽出精製操作を行なうことにより得られる。
【００４８】
培養終了液の全てを用いる場合には、培養終了後に適当量、好ましくは終濃度５０％になる様にアセトン又はメタノールを添加し、Ｆ−２０９１６Ａを抽出することができる。抽出終了後、珪藻土をろ過助剤とするろ過操作を行い、得られた抽出液をろ液と同様な抽出精製操作を行なうことにより以降の精製に用いることができる。
【００４９】
このようにして得られたＦ−２０９１６Ａは、更にシリカゲル、マグネシウム−シリカゲル系のフロリジルのような担体を用いた吸着カラム又は薄層クロマトグラフィー、ＴＳＫゲルトヨパールＨＷ−４０Ｆ（登録商標、トーソー（株）社製）、セファデックスＬＨ−２０（登録商標、アマシャム バイオサイエンス社製）等を用いた分配カラムクロマトグラフィーあるいはコスモシール１４０Ｃ１８（登録商標、ナカライテスク社製）等を用いた逆層カラムクロマトグラフィーを用いて粗精製できる。
【００５０】
またこのようにして粗精製されたＦ−２０９１６Ａは、更に逆層カラムを用いた高速液体クロマトグラフィー、例えばカプセルパックＣ１８ＵＧ１２０（登録商標、資生堂社製）、カプセルパックＣ１８ＡＣＲ（登録商標、資生堂社製）、デベロシルＣ３０ＵＧ−３（登録商標、野村化学（株）社製）、等のカラムを用いて精製することができる。
【００５１】
以上の単離、精製の手段を単独又は適宜組み合わせ、又は反復して用いることによりＦ−２０９１６Ａを単離精製することができる。
【００５２】
本発明のＦ−２０９１６Ａ又はその塩は抗真菌作用を有し、真菌感染症の予防薬又は治療薬として使用することができる。
【００５３】
本発明のＦ−２０９１６Ａ又はその塩を真菌感染症の予防薬又は治療薬として用いる場合、種々の形態で投与される。その投与形態としては特に限定はなく、各種製剤形態、患者の年齢、性別その他の条件、疾患の程度等に応じて決定される。例えば錠剤、丸剤、散剤、顆粒剤、シロップ剤、液剤、懸濁剤、乳剤、顆粒剤、およびカプセル剤の場合には経口投与される。また注射剤の場合には、単独、もしくはブドウ糖、アミノ酸等の通常の補液との混合、あるいはポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル類等と混和してエマルジョンとして静脈内投与され、さらには必要に応じて単独で筋肉内、皮内、皮下もしくは腹腔内投与される。坐剤の場合には直腸内投与される。
【００５４】
これらの各種製剤は、常法に従って主薬に賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、溶解剤、矯味矯臭剤、コーティング剤等既知の医薬製剤分野において通常使用しうる既知の補助剤を用いて製剤化することができる。
【００５５】
錠剤の形態に成形するに際しては、担体としてこの分野で従来公知のものを広く使用でき、例えば乳糖、白糖、塩化ナトリウム、ブドウ糖、尿素、澱粉、炭酸カルシウム、カオリン、結晶セルロース、珪酸等の賦形剤、水、エタノール、プロパノール、単シロップ、ブドウ糖液、澱粉液、ゼラチン溶液、カルボキシメチルセルロース、セラック、メチルセルロース、リン酸カリウム、ポリビニルピロリドン等の結合剤、乾燥澱粉、アルギン酸ナトリウム、カンテン末、ラミナラン末、炭酸水素ナトリウム、炭酸カルシウム、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル類、ラウリル硫酸ナトリウム、ステアリン酸モノグリセリド、澱粉、乳糖等の崩壊剤、白糖、ステアリン、カカオバター、水素添加油等の崩壊抑制剤、第四級アンモニウム塩基、ラウリル硫酸ナトリウム等の吸収促進剤、グリセリン、澱粉等の保湿剤、澱粉、乳糖、カオリン、ベントナイト、コロイド状珪酸等の吸着剤、精製タルク、ステアリン酸塩、硼酸末、ポリエチレングリコール等の滑沢剤等が例示できる。更に錠剤は必要に応じ通常の剤皮を施した錠剤、例えば糖衣錠、ゼラチン被包錠、腸溶被錠、フィルムコーティング錠あるいは二重錠、多重錠とすることができる。
【００５６】
丸剤の形態に成形するに際しては、担体としてこの分野で従来公知のものを広く使用でき、例えばブドウ糖、乳糖、澱粉、カカオ脂、硬化植物油、カオリン、タルク等の賦形剤、アラビアゴム末、トラガント末、ゼラチン、エタノール等の結合剤、ラミナラン、カンテン等の崩壊剤が例示できる。
【００５７】
坐剤の形態に成形するに際しては、担体としてこの分野で従来公知のものを広く使用でき、例えばポリエチレングリコール、カカオ脂、高級アルコール、高級アルコールのエステル類、ゼラチン、半合成グリセライド等を挙げることができる。
【００５８】
注射剤として調製される場合には、液剤および懸濁剤は殺菌され、且つ血液と等張であるのが好ましく、これら液剤、乳剤および懸濁剤の形態に形成するに際しては、希釈剤としてこの分野において慣用されているものを全て使用でき、例えば水、エチルアルコール、プロピレングリコール、エポキシ化イソステアリルアルコール、ポリオキシ化イソステアリルアルコール、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル類等を挙げることができる。尚、この場合、等張性の溶液を調製するに充分な量の食塩、ブドウ糖又はグリセリンを医薬製剤中に含有せしめてもよく、また通常の溶解補助剤、緩衝剤、無痛化剤等を添加してもよい。
【００５９】
更に必要に応じて着色剤、保存剤、香料、風味剤、甘味剤等や他の医薬品を含有せしめてもよい。
【００６０】
上記医薬製剤中に含まれる有効成分化合物の量は、特に限定されず広範囲に適宜選択されるが、通常、全組成物中１乃至７０重量％、好ましくは１乃至３０重量％含まれる量とするのが適当である。
【００６１】
その投与量は症状、年齢、体重、投与方法および剤形等によって異なるが通常は成人に対して１日、上限として２０００ｍｇ（好ましくは２００ｍｇ、更に好ましくは２０ｍｇ）であり、下限として０．００１ｍｇ（好ましくは０．０１ｍｇ、更に好ましくは０．１ｍｇ）を投与することができる。
【００６２】
【実施例】
次に、実施例をあげて本発明を更に具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
（実施例１） Ｆ−２０９１６Ａの培養
ＳＡＮＫ１８５０２株のスラントより約１ｃｍ角の菌子片を切り取り生理食塩水約２ｍｌに懸濁した。ガラスポッターを用いてホモジナイズし、全量を滅菌（１２１℃、３０分間）した後述の組成からなる前培養培地８０ ｍｌを含む５００ｍｌ容三角フラスコに接種した。同様の操作を行い、３本の種培養フラスコを用意した。２３℃で２１０ｒｐｍ（７ ｃｍの回転半径）のロータリー振とう培養機中で４日間培養した。このようにして得られた培養液を、同じ組成の培地８０ｍｌを含む５００ｍｌ容三角フラスコ５０本に５ ％ 接種し、２３℃で２１０ｒｐｍ（７ ｃｍの回転半径）のロータリー振とう培養機中で７日間培養した。
【００６３】
【表２】前培養培地の培地組成
―――――――――――――――――――――――――――――――――
グリセリン ３０ｇ
グルコース ３０ｇ
可溶性澱粉 ２０ｇ
大豆粉 １０ｇ
ゼラチン ２．５ｇ
イーストエキス（Ｄｉｆｃｏ） ２．５ｇ
ＮＨ_４ＮＯ_３ ２．５ｇ
寒天 ３ｇ
消泡剤^＊ ０．０５ｍｌ
水道水 １０００ｍｌ
―――――――――――――――――――――――――――――――――
滅菌前 ｐＨ ６．５
＊ ニッサン・ディスフォームＣＢ−４４２（登録商標、日本油脂（株）社製）
【００６４】
【表３】本培養培地の培地組成
―――――――――――――――――――――――――――――――――
グリセリン ３０ ｇ
グルコース ３０ ｇ
可溶性澱粉 ２０ ｇ
大豆粉 １０ ｇ
ゼラチン ２．５ ｇ
イーストエキス（Ｄｉｆｃｏ） ２．５ ｇ
ＮＨ_４ＮＯ_３ ２．５ ｇ
消泡剤^＊ ０．０５ ｍｌ
水道水 １０００ ｍｌ
―――――――――――――――――――――――――――――――――
滅菌前ｐＨ ６．５
＊ ニッサン・ディスフォームＣＢ−４４２（登録商標、日本油脂（株）社製）（実施例２） Ｆ−２０９１６Ａの精製
以降の精製においては、活性画分を以下の高速液体クロマトグラフィー （ＨＰＬＣ） でモニターした。
カラム：カプセルパック Ｃ_１８ ＡＣＲ， ４．６ Φ ｘ １５０ ｍｍ （（株）資生堂社製）
溶媒：アセトニトリル／０．２ ％ トリエチルアミン燐酸緩衝液（ｐＨ７．０）＝４０／６０
流速：１．０ ｍｌ／ 分
検出：紫外部吸収 ２１０ ｎｍ
保持時間：６．０ 分。
【００６５】
実施例１で得られた培養液 （５ Ｌ） を遠心し、菌体と培養上清を分離した。菌体に ５０％ アセトン溶液 １ Ｌ を加え、 ３ 時間室温にて抽出した。抽出液中のアセトンを減圧留去した後培養上清と合わせ、以降の精製に用いた。得られた水溶液５ Ｌ のうち４ Ｌを、水で平衡化した ４００ ｍｌ の ＨＰ−２０ カラムに付し、 １．５ Ｌの水および１．５ Ｌの５０％ メタノール水で洗浄後、 １．８ Ｌの メタノールで溶出した。溶出液中のメタノールを減圧留去し、黄色粉末 １．３ ｇ を得た。このうち ３５０ ｍｇを、メタノール （５０ ｍｌ） に溶解し、０．０２ ％ トリフルオロ酢酸含有 ３０ ％ アセトニトリル水で平衡化した １８０ ｍｌ の コスモシールオープンカラムに付した。このカラムを ８００ ｍｌ の ０．０２ ％ トリフルオロ酢酸含有 ３０ ％ アセトニトリル水で洗浄後、 １ Ｌ の ０．０２ ％ トリフルオロ酢酸含有 ４０ ％ アセトニトリル水で溶出した。溶出液のアセトニトリルを減圧留去した後凍結乾燥し、黄色油状物質６３．５ ｍｇ を得た。
【００６６】
このうち ２０ ｍｇ を１０ ｍｌ のジメチルスルフォキシド溶液に溶解し、以下のように精製した。すなわち試料溶液 ０．５ ｍｌ を １０ ｍＭ ギ酸アンモニウム含有 ４０％ アセトニトリル水で平衡化したＨＰＬＣカラム （Ｄｅｖｅｌｏｓｉｌ Ｃ３０ ＵＧ−３， ２０ Φ ｘ １００ ｍｍ，（株）野村化学社製） にチャージし、同じ溶媒で １０ ｍｌ／分の流速で展開した。
【００６７】
２１０ ｎｍ の紫外部吸収を検出し、１３ 分から１５ 分を分取して、分取液 ２０ ｍｌ を得た。残りの試料についても同様に分取を行い、分取液 ４００ ｍｌ を得た。分取液のアセトニトリルを減圧留去した後凍結乾燥し、４．６ ｍｇ の Ｆ−２０９１６Ａ を得た。
（試験例１）抗真菌活性の測定
抗真菌活性（最小発育阻止濃度）は次の方法に従って測定した。即ち、０．１６５ＭのＭＯＰＳバッファー（ｐＨ ７．０）（３−［Ｎ−モルフォリノ］プロパンスルホン酸：シグマ社製）を含むＲＰＭＩ１６４０培地を用いて９６穴マイクロタイタープレートによるブロス希釈法で測定した（山口英世ら，「日本医真菌学会標準化委員会報告（１９９２−１９９４年）」ジャーナルオブメディカルマイコロジー，１９９５年，第３６巻，ｐ．６１−８６参照（Ｈｉｄｅｏ Ｙａｍａｇｕｃｈｉ ｅｔ ａｌ，“Ｒｅｐｏｒｔ ｏｆ ｔｈｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｌａｂｏｒａｔｒｙ Ｓｔａｎｄａｒｄｓ １９９２−１９９４”Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｍｙｃｏｌｏｇｙ， ３６， ｐ．６１−８６，（１９９５））。
結果を以下の表３に示す。
【００６８】
【表４】

表３に示したように、Ｆ−２０９１６Ａは試験したすべての真菌に対して顕著な抗真菌活性を示した。
（製剤例１） 経口用カプセル剤
【００６９】
【表５】

上記処方の粉末を混合し、３０メッシュのふるいを通した後、この粉末をゼラチンカプセルに入れ、カプセル剤とする。
【００７０】
【発明の効果】
本発明の新規化合物Ｆ−２０９１６Ａ又はその塩は優れた抗真菌作用を示し、各種真菌感染症の予防又は治療薬として有用である。
【００７１】
【配列表】

[0001]
TECHNICAL FIELD OF THE INVENTION
The present invention relates to a compound having excellent antifungal activity or a salt thereof, a method for producing the compound, a medicament containing the compound as an active ingredient (particularly an antifungal agent), or a novel microorganism producing the compound.
[0002]
[Prior art]
Conventionally, amphotericin B, flucytosine, azoles and the like have been clinically used as antifungal agents. However, these drugs have problems such as high toxicity, difficulty in use, and appearance of resistant bacteria. In addition, among fungi, antifungal agents effective against Aspergillus have hardly been found, and none have been clinically used.
[0003]
In order to solve these problems, research has been conducted to find a compound having antifungal activity from among compounds produced by microorganisms. For example, as a compound having antifungal activity against resistant bacteria, aureobasidins produced by the genus Aureobasidium (for example, see Non-Patent Document 1) have been reported. The compounds are not sufficiently effective against the genus Aspergillus, and at present, drugs for solving the above problems have not been used clinically.
[0004]
It is feared that the number of patients with serious underlying diseases such as cancer and the number of patients with immunodeficiency will increase in the future, and the number of patients infected with drug-resistant bacteria or Aspergillus sp. As would be expected, antifungal agents more effective against these fungi were craved.
[0005]
[Non-patent document 1]
"New Antifungal Antibiotics Aureobasidin", Journal of Antibiotics, 1991, Vol. 44, p. 919-924 ("AUREOBASIDINS, NEW ANTIFUNGAL ANTIBIOTICS", The Journal of Antibiotics, 1991, 44, pp. 919-924).
[0006]
[Problems to be solved by the invention]
The present inventors have found a novel compound from a culture solution of a microorganism, established a method for producing such a novel compound, a novel microorganism producing the compound, and a method for culturing the compound. As a result, the present inventors have found that this compound has excellent antifungal activity, and in particular, has excellent antifungal activity against fungi including resistant bacteria, which are currently becoming a problem, and have completed the present invention.
[0007]
Further, the compound of the present invention can be used as a starting material for synthesizing a derivative having better antifungal activity.
[0008]
[Means for Solving the Problems]
The present invention
(1) a compound represented by the following formula (I) or a salt thereof,
[0009]
Embedded image

[0010]
(2) a compound having the following physicochemical properties or a salt thereof,
1) Property of substance: white powdery substance
Solubility: Soluble in pyridine, methanol and DMSO, insoluble in water and n-hexane
3) Molecular formula: C₄₁H₇₃N₉O_Fifteen
4) Molecular weight: 931 (measured by FAB mass spectrometry)
5) Accurate mass measured by ESI mass spectrometry using a high-resolution double focusing mass spectrometer: [M + H]⁺Is as shown below.
Obtained: 932.5316
Calculated value: 932.5304
6) Infrared absorption spectrum: potassium bromide (KBr) The infrared absorption spectrum measured by the tablet method shows the maximum absorption shown below.
3316, 2925, 1749, 1632, 1534, 1068 cm^-1
7)¹H-nuclear magnetic resonance spectrum: the lowest field signal of pyridine in heavy pyridine was measured at 8.74 ppm.¹The H-nuclear magnetic resonance spectrum is as shown below. The number of hydrogens in parentheses was observed by the HSQC method and the DEPT method. 0.84 (3H, d, J = 7 Hz), 0.88 (3H, t, J = 7 Hz), 1.05-1.33 (18H, m), 1.55 (3H, d, J) = 6.5 Hz), 1.59 (3H, d, J = 7 Hz), 1.82 (1H, m), 2.28 (2H, m), 2.40 (1H, m), 2. 67 (1H, m), 2.83 (2H, m), 3.28 (1H, m), 3.35 (1H, m), 4.22 (1H, brd, J = 16.5 Hz) , 4.30-4.52 (8H, m), 4.59-4.65 (2H, m), 4.86 (1H, m), 5.03 (1H, d, J = 7 Hz), 5.16 (1H, m), 5.28 (3H, m), 5.47 (1H, m) 5.65 (1H, m), ppm
8)^ThirteenC-nuclear magnetic resonance spectrum: the lowest field signal of pyridine in heavy pyridine was determined as 150.35 ppm,^ThirteenThe C-nuclear magnetic resonance spectrum is as shown below.
14.8 (q), 15.3 (q), 18.2 (q), 18.2 (t), 21.3 (q), 23.4 (t), 25.9 (t), 27 0.7 (t), 30.1 (t), 30.3 (t, as two carbons), 30.4 (t), 30.5 (t), 30.7 (t), 32.6 (T), 33.0 (t), 37.6 (d), 38.9 (t), 40.2 (t), 42.9 (t), 51.1 (d), 53.7 ( d), 57.5 (d), 57.8 (d), 60.1 (d), 60.5 (d), 61.8 (t), 63.0 (t), 63.3 (t ), 63.7 (t), 68.3 (d), 76.8 (d), 170.7 (s), 171.6 (s), 172.2 (s), 172.4 (S), 172.7 (s), 173.3 (s), 173.9 (s), 174.2 (s), 174.7 (s) ppm
9) High performance liquid chromatography:
Column: Capsule pack C₁₈  ACR, 4.6 Φ x 150 mm (manufactured by Shiseido Co., Ltd.)
Solvent: acetonitrile / 0.2% triethylamine phosphate buffer (pH 7.0) = 40/60
Flow rate: 1.0 ml / min
Detection: UV absorption 210 nm
Retention time: 6.0 minutes
(3) A bacterium which produces the compound according to (1) or (2) belonging to the genus Trichoderma is cultured, and the compound according to (1) or (2) is collected from the culture. A method for producing the compound according to (1) or (2),
(4) The production method according to (3), wherein the bacterium producing the compound according to (1) or (2), which belongs to the genus Trichoderma, is Trichoderma hamatum (Bonord.) Bainer SANK18502 strain.
(5) a medicament comprising the compound according to (1) or (2) or a pharmacologically acceptable salt thereof as an active ingredient;
(6) a prophylactic or therapeutic agent for a fungal infection comprising the compound according to (1) or (2) or a pharmacologically acceptable salt thereof as an active ingredient;
(7) The present invention relates to Trichoderma hamatum (Bonord.) Bainer strain SANK18502.
[0011]
Hereinafter, in the present specification, the compound described in the above (1) or (2) is referred to as F-20916A.
[0012]
The F-20916A of the present invention is produced in a culture of Trichoderma hamatum (Bonord.) Bainier SANK 18502 strain (hereinafter simply referred to as “SANK 18502 strain”) isolated from soil collected in Wakayama Prefecture. Is done.
[0013]
Since the compound of the present invention has several asymmetric carbon atoms, various optical isomers exist. In formula (I), all of these isomers are represented by a single formula, but the present invention also includes all of these isomers, including racemates, and mixtures of these isomers. These isomers can be produced by a stereospecific synthesis method or a synthesis using an optically active compound as a starting compound, or after producing as a mixture of isomers, a desired isomer is subjected to chromatography or the like. It can also be produced by isolation using a conventional method.
[0014]
Since the compound of the present invention has an amino group and the like, it can be converted into a salt using an acid by a method well known to those skilled in the art. The present invention also includes these salts. When the salt of the compound of the present invention is used as a medicine, it is not particularly limited as long as it is used medically and is pharmacologically acceptable, and when it is used for a purpose other than medicine, for example, it is used as an intermediate In this case, there is no particular limitation as long as it can be used for the purpose.
[0015]
Such salts include, for example, inorganic salts such as acetate, bromide, chloride, hydrochloride, bromate, iodide, sulfate, phosphate, diphosphate; and citrate And organic acid salts such as maleate, pamoate and tartrate. Preferably, it is a pharmacologically acceptable salt, and more preferably, hydrochloride or pamoate.
[0016]
In addition, the compound of the present invention and a salt thereof may be left in the air or mixed with water or an organic solvent by mixing with water or an organic solvent to form a hydrate or a solvate. Hydrates and solvates of the present invention are also included in the present invention as “pharmacologically acceptable salts”.
[0017]
Furthermore, the present invention also includes all compounds that are converted to F-20916A by being metabolized in vivo, so-called prodrugs.
[0018]
BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION
(1) Producing bacteria
Examples of the strain belonging to the genus Trichoderma used in the method of producing the present invention F-20916A include, for example, Trichoderma hamatum (Bonord.) Bainer. be able to. SANK18502 strain was isolated from soil collected in February 2001 in Wakayama Prefecture.
[0019]
In order to observe the mycological properties of this bacterium, culturing was performed on each of the following media. The composition of each medium used is described below.
[0020]
[Table 1]
<2% MA medium (2% malt extract agar medium)>
Malt extract 20g
20g agar
Distilled water 1000ml
<CMA medium (Corn Meal Agar medium)>
17g cornmeal adapour (Nissui Pharmaceutical Co., Ltd.)
5g agar
Distilled water 1000ml
<WSH medium>
Oatmeal 10g
Magnesium sulfate heptahydrate 1g
Potassium dihydrogen phosphate 1g
Sodium nitrate 1g
20g agar
1000 ml of distilled water.
[0021]
The display of the color tone is shown by Cornellup, Onesture, "Metune Handbook of Color", Third Edition, London, Airmetune, 1978 (Kornerup A, Waanscher JH "Methuen handbook of color" 3rd. Edition, E., United States. (1978)). The growth of the SANK18502 strain on each plate medium is as follows.
[0022]
Growth on 2% MA medium is 60-62 mm in diameter at 20 ° C. for 4 days. Colonies are flat and thin, with few aerial hyphae. The colony surface is white. As the culture continues, a large number of pustules form concentrically or on the periphery of the colony. The pustels are less than 6 mm in diameter, hemispherical, velvety on the surface, initially white and increasingly deep green (25E8). No exudates and odors. The back is colorless.
[0023]
Growth on CMA medium is 56 mm in diameter at 20 ° C. for 4 days of culture. Colonies are flat and thin, with few aerial hyphae. The colony surface is white. No exudates and odors. The back is colorless.
[0024]
Growth on WSH medium is 64 to 66 mm in diameter at 20 ° C. for 4 days of culture. Colonies are flat and thin, with few aerial hyphae. The colony surface is white. No exudates and odors. The back is colorless.
[0025]
The micromorphology of the SANK18502 strain is as follows.
The conidiophores are smooth, thin-walled, colorless and less than 6 μm in width. The lower part is regularly branched, and the branches are divided almost at right angles. The tip of the conidiophore spindle is sterile and irregularly branched, and is wavy or hooked. The sterile part is 120 μm or less in length. The phialides are 4-5 × 2.5-3.5 μm, pot-shaped, often 4-6. Conidia are 3 to 4.5 × 2.5 to 3 μm, oval and smooth, thin-walled and pale green. Chlamydospores are 5 to 12 μm in diameter, are formed at the hyphal ends or interspersed with hyphae, are subspherical to elliptical, smooth, have a wall thickness of 1 μm or less, and are colorless.
[0026]
The above mycological properties of this bacterium are described in, for example, Bisset et al., "Arivation of the genus Trichoderma. III. . 2373-2417 (Bissett J, "A revision of the genus Trichoderma. III. Section Pachybasidium", Canadian Journal of Botany, 69, p. 2371 and the like of D. Gum, et al. Obtricoderma ", edited by Cubicec and Harman," Trichoderma and Gliocladium ", Volume 1, Taylor and Francis Journal, 1998, p. 3-34 (Gams W, Bissett J, Morphology and identification of Trichoderma. In: Kubicek CP, Harman GE (eds) Trichoderma & Gliocradim. Trichoderma hamatum (Bonord.) Bainier. Therefore, this strain was identified as Trichoderma hamartum.
[0027]
The SANK 18502 strain was deposited internationally as Trichoderma hammertam SANK 18502 strain with the Patent Organism Depositary, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, 1-1-1, Higashi 1-1, Tsukuba, Ibaraki, Japan on November 1, 2002. Accession number FERM BP-8230 has been assigned.
[0028]
As is well known, fungi are liable to be mutated in nature or by artificial operations (for example, ultraviolet irradiation, irradiation, chemical treatment, etc.), and the same applies to the SANK18502 strain of the present invention. The SANK18502 strain mentioned in the present invention includes all the mutant strains.
[0029]
These mutants also include those obtained by genetic methods, for example, recombination, transduction, transformation and the like. That is, the SANK18502 strain that produces F-20916A, mutants thereof, and strains that are not clearly distinguished therefrom are all included in the SANK18502 strain.
[0030]
(2) Culture method and purification method
To obtain F-20916A of the present invention, the culture of these microorganisms is generally performed using media similar to those used to produce other fermentation products. Such a medium contains a carbon source, a nitrogen source and inorganic salts that can be assimilated by the microorganism.
[0031]
Examples of the carbon source include glucose, fructose, maltose, sucrose, mannitol, glycerin, dextrin, oats, rye, corn starch, potato, corn flour, soybean oil, cottonseed oil, molasses, citric acid, tartaric acid, and the like. Can be. These carbon sources can be used alone or in combination.
[0032]
The amount of the carbon source added to the medium depends on other components in the medium, but is usually 1 to 10% by weight of the medium amount.
[0033]
Nitrogen sources include, for example, soybean flour, bran, fallen flour, cottonseed powder, casein hydrolyzate, pharmamine, corn steep liquor, peptone, meat extract, yeast, yeast extract, malt extract, sodium nitrate, ammonium nitrate, Ammonium sulfate and the like. These carbon sources can be used alone or in combination.
[0034]
The amount of nitrogen source added to the medium depends on the other components in the medium, but is usually 0.2 to 6% by weight.
[0035]
The carbon and nitrogen sources are generally used in combination, but need not be in pure form, and may be of lesser purity containing trace amounts of growth factors, vitamins and mineral nutrition.
[0036]
Examples of the inorganic salt include salts that generate ions such as sodium, potassium, magnesium, ammonium, calcium, phosphoric acid, sulfuric acid, hydrochloric acid, and carbonic acid.
[0037]
Vitamin B that can be used by bacteria₁And vitamins such as biotin, and a cell growth promoting substance such as thiamine may be added as necessary.
[0038]
Further, manganese, molybdenum, and other metal salts may be added as needed.
[0039]
If the nutrient medium foams considerably, an antifoaming agent such as silicone oil, polyalkylene glycol ether, vegetable oil, animal oil, or a surfactant may be added to the medium as needed. In particular, at the time of liquid culture, it is preferable to add these antifoaming agents.
[0040]
The pH of the medium varies depending on the components of the medium, the growth temperature, and the like, but may be any pH that is usually used for producing a fermentation product, and is preferably in the range of 4.0 to 6.5.
[0041]
The growth temperature of the bacterium varies depending on the components of the medium, pH, etc., but is usually 10 ° C. to 33 ° C., and a range of 20 ° C. to 30 ° C. is good for growth. For production of F-20916A, 20 ° C to 27 ° C is suitable.
[0042]
The culture method is not particularly limited and may be any culture method generally used for microorganisms, and examples thereof include a culture method using a solid medium, a stirring culture method, a shaking culture method, and an aeration culture method. Preferably, an aerobic liquid culture method, such as a stirring culture method, a shaking culture method, or an aeration culture method, is more preferably a shaking culture method. In addition, aeration stirring culture method is suitable industrially.
[0043]
In small-scale culture, it is preferable to carry out shaking culture at 20 to 27 ° C (preferably 23 ° C) for several days. The culture is started in an Erlenmeyer flask by one or two stages of seed development. The medium at the stage of seed development can contain a carbon source, a nitrogen source, trace amounts of growth factors, inorganic salts and trace metals. The seed flask is shaken in a constant temperature incubator at 20-27 ° C. (preferably 23 ° C.), for 2-7 days (preferably 4 days), or until fully grown. The grown seed is used to inoculate a second seed or production medium. If an intermediate growth step is used, it is grown in essentially the same way and is used partially or completely to inoculate the production medium. The inoculated flask is shaken at a constant temperature for several days to perform main culture.
[0044]
In the case of large-scale culture, it is preferable to perform the culture in a suitable jar fermenter or tank equipped with a stirring and aeration device. According to this method, a nutrient medium can be prepared in a jar fermenter or tank. The nutrient medium is heated to 121 ° C. and sterilized for the required time, and after cooling, the sterile medium is inoculated with seeds that have been previously grown. The culture is carried out at 20 to 27 ° C. (preferably 23 ° C.) with aeration and agitation. This method is suitable for obtaining large amounts of compounds.
[0045]
The time-dependent change in the amount of F-20916A produced as the culture proceeds can be measured using high performance liquid chromatography. Normally, the production of F-20916A reaches the maximum value after 100 to 240 hours of culture.
[0046]
After the completion of the culture, the liquid portion in the culture solution and F-20916A present in the cells are separated by filtration or centrifugation using diatomaceous earth as a filter aid for all of the culture termination solution or the cells and other solid portions. Then, it can be extracted and purified from the obtained filtrate or supernatant and the cells by utilizing its physicochemical properties. For example, F-20916A present in the filtrate or supernatant can be extracted and purified by combining an organic solvent immiscible with water, for example, chloroform, ethylene chloride, methylene chloride, ethyl acetate, butanol and the like. Alternatively, as an adsorbent, for example, Amberlite XAD-2 or XAD-4 (registered trademark, manufactured by Rohm and Haas Co.), which is an activated carbon or an adsorption resin, or Diaion HP-10, HP-20, or CHP-20P HP-50, Sepabeads SP-207 (registered trademark, manufactured by Mitsubishi Chemical Corporation) and the like are used. The liquid containing F-20916A is passed through a layer of the adsorbent as described above to adsorb and remove impurities, or after adsorbing F-20916A, methanol water, acetone water, butanol water or the like is used. Obtained by elution.
[0047]
F-20916A present in the cells can be obtained by extracting with 50 to 90% aqueous acetone or aqueous methanol to remove the organic solvent, and then performing the same extraction and purification operation as the filtrate.
[0048]
When all of the culture termination solution is used, F-20916A can be extracted by adding acetone or methanol so as to have a final concentration of 50% after the completion of the culture. After completion of the extraction, a filtration operation using diatomaceous earth as a filter aid is performed, and the obtained extract is subjected to the same extraction and purification operation as the filtrate, so that it can be used for the subsequent purification.
[0049]
The F-20916A thus obtained can be further subjected to adsorption column or thin layer chromatography using a carrier such as silica gel, magnesium-silica gel type florisil, TSK Gel Toyopearl HW-40F (registered trademark, Tosoh Corporation) Column chromatography using Sephadex LH-20 (registered trademark, manufactured by Amersham Bioscience) or reverse layer column chromatography using Cosmo Seal 140C18 (registered trademark, manufactured by Nacalai Tesque). Can be roughly purified.
[0050]
Further, F-20916A thus roughly purified is further subjected to high performance liquid chromatography using a reverse layer column, for example, Capsule Pack C18UG120 (registered trademark, manufactured by Shiseido Co., Ltd.), Capsule Pack C18ACR (registered trademark, manufactured by Shiseido Co., Ltd.) And Deverosil C30UG-3 (registered trademark, manufactured by Nomura Chemical Co., Ltd.).
[0051]
F-20916A can be isolated and purified by using the above isolation and purification means alone or in an appropriate combination, or repeatedly.
[0052]
The F-20916A or a salt thereof of the present invention has an antifungal effect and can be used as a preventive or therapeutic agent for fungal infections.
[0053]
When F-20916A or a salt thereof of the present invention is used as a prophylactic or therapeutic agent for fungal infection, it is administered in various forms. The administration form is not particularly limited, and is determined according to various preparation forms, the age, sex, and other conditions of the patient, the degree of the disease, and the like. For example, tablets, pills, powders, granules, syrups, solutions, suspensions, emulsions, granules, and capsules are orally administered. In the case of an injection, it may be administered alone, or mixed with a normal replacement fluid such as glucose or amino acid, or mixed with polyoxyethylene sorbitan fatty acid esters and the like, and administered intravenously as an emulsion. Is administered intramuscularly, intradermally, subcutaneously or intraperitoneally. In the case of suppositories, they are administered rectally.
[0054]
These various preparations are prepared by adding known excipients, such as excipients, binders, disintegrants, lubricants, dissolving agents, flavoring agents, coating agents and the like, which can be generally used in the field of known pharmaceutical preparations, to a main drug according to a conventional method. Can be used to formulate.
[0055]
In molding into tablets, those conventionally known in the art can be widely used as carriers, such as lactose, sucrose, sodium chloride, glucose, urea, starch, calcium carbonate, kaolin, crystalline cellulose, silica, and the like. Agent, water, ethanol, propanol, simple syrup, glucose solution, starch solution, gelatin solution, carboxymethylcellulose, shellac, methylcellulose, potassium phosphate, polyvinylpyrrolidone and other binders, dried starch, sodium alginate, agar powder, laminaran powder, Sodium bicarbonate, calcium carbonate, polyoxyethylene sorbitan fatty acid esters, sodium lauryl sulfate, monoglyceride stearate, starch, lactose, etc., disintegration inhibitors such as sucrose, stearin, cocoa butter, hydrogenated oil, quaternary Ammonium Groups, absorption promoters such as sodium lauryl sulfate, humectants such as glycerin and starch, adsorbents such as starch, lactose, kaolin, bentonite, and colloidal silicic acid, and lubricants such as purified talc, stearate, boric acid powder, and polyethylene glycol. Sourcing agents can be exemplified. Further, the tablet can be a tablet coated with a usual coating, if necessary, for example, a sugar-coated tablet, a gelatin-encapsulated tablet, an enteric-coated tablet, a film-coated tablet or a double tablet or a multiple tablet.
[0056]
In molding into the form of pills, those conventionally known in the art can be widely used as carriers, for example, excipients such as glucose, lactose, starch, cocoa butter, hydrogenated vegetable oil, kaolin, talc, gum arabic powder, Examples thereof include binders such as tragacanth powder, gelatin and ethanol, and disintegrants such as laminaran and agar.
[0057]
In molding into suppositories, those conventionally known in the art can be widely used as carriers, for example, polyethylene glycol, cocoa butter, higher alcohols, higher alcohol esters, gelatin, semi-synthetic glycerides and the like. it can.
[0058]
When prepared as an injection, the solutions and suspensions are preferably sterilized and isotonic with blood, and when formed into the form of these solutions, emulsions and suspensions, they may be used as diluents. Any of those commonly used in the field can be used, and examples thereof include water, ethyl alcohol, propylene glycol, epoxidized isostearyl alcohol, polyoxylated isostearyl alcohol, and polyoxyethylene sorbitan fatty acid esters. In this case, a sufficient amount of salt, glucose or glycerin to prepare an isotonic solution may be included in the pharmaceutical preparation, and a usual solubilizing agent, buffer, soothing agent, etc. may be added. May be.
[0059]
Further, if necessary, a coloring agent, a preservative, a fragrance, a flavor, a sweetener, and the like, and other pharmaceuticals may be added.
[0060]
The amount of the active ingredient compound contained in the pharmaceutical preparation is not particularly limited and may be appropriately selected in a wide range, but is usually 1 to 70% by weight, preferably 1 to 30% by weight in the whole composition. Is appropriate.
[0061]
The dose varies depending on symptoms, age, body weight, administration method, dosage form and the like, but is usually 2,000 mg (preferably 200 mg, more preferably 20 mg) as an upper limit per day for an adult, and 0.001 mg as a lower limit ( Preferably 0.01 mg, more preferably 0.1 mg) can be administered.
[0062]
【Example】
Next, the present invention will be described more specifically with reference to examples, but the present invention is not limited thereto.
(Example 1) Culture of F-20916A
A piece of mycelia of about 1 cm square was cut off from the slant of SANK18502 strain and suspended in about 2 ml of physiological saline. The mixture was homogenized using a glass potter, and the whole amount was inoculated into a 500 ml Erlenmeyer flask containing 80 ml of a preculture medium having the following composition and sterilized (121 ° C, 30 minutes). The same operation was performed to prepare three seed culture flasks. The cells were cultured at 23 ° C. for 4 days in a rotary shaker at 210 rpm (rotation radius of 7 cm). 5% of the thus obtained culture solution was inoculated into 50 500-ml Erlenmeyer flasks containing 80 ml of the medium having the same composition, and incubated in a rotary shaking incubator at 210 rpm (rotational radius of 7 cm) at 23 ° C. Cultured for days.
[0063]
[Table 2] Medium composition of preculture medium
―――――――――――――――――――――――――――――――――
Glycerin 30g
30g glucose
20g soluble starch
10g soy flour
2.5g gelatin
2.5 g yeast extract (Difco)
NH₄NO₃                                  2.5g
3g agar
Defoamer^*                                  0.05ml
Tap water 1000ml
―――――――――――――――――――――――――――――――――
Before sterilization pH 6.5
* Nissan Deform CB-442 (registered trademark, manufactured by NOF CORPORATION)
[0064]
[Table 3] Medium composition of main culture medium
―――――――――――――――――――――――――――――――――
Glycerin 30 g
30 g of glucose
Soluble starch 20 g
Soy flour 10 g
2.5 g of gelatin
Yeast extract (Difco) 2.5 g
NH₄NO₃                                    2.5 g
Defoamer^*                                    0.05 ml
Tap water 1000 ml
―――――――――――――――――――――――――――――――――
PH 6.5 before sterilization
* Nissan Deform CB-442 (registered trademark, manufactured by NOF Corporation) (Example 2) Purification of F-20916A
In the subsequent purification, the active fraction was monitored by the following high performance liquid chromatography (HPLC).
Column: Capsule pack C₁₈  ACR, 4.6 Φ x 150 mm (manufactured by Shiseido Co., Ltd.)
Solvent: acetonitrile / 0.2% triethylamine phosphate buffer (pH 7.0) = 40/60
Flow rate: 1.0 ml / min
Detection: UV absorption 210 nm
Retention time: 6.0 minutes.
[0065]
The culture solution (5 L) obtained in Example 1 was centrifuged to separate the cells from the culture supernatant. One liter of a 50% acetone solution was added to the cells and extracted at room temperature for 3 hours. After acetone in the extract was distilled off under reduced pressure, the extract was combined with the culture supernatant and used for the subsequent purification. 4 L of the obtained 5 L of aqueous solution was applied to a 400 ml HP-20 column equilibrated with water, and washed with 1.5 L of water and 1.5 L of 50% methanol water. Eluted with 8 L of methanol. The methanol in the eluate was distilled off under reduced pressure to obtain 1.3 g of a yellow powder. Of these, 350 mg was dissolved in methanol (50 ml) and applied to a 180 ml Cosmoseal open column equilibrated with 30% acetonitrile water containing 0.02% trifluoroacetic acid. The column was washed with 800 ml of 30% aqueous acetonitrile containing 0.02% trifluoroacetic acid, and then eluted with 1 L of 40% aqueous acetonitrile containing 0.02% trifluoroacetic acid. Acetonitrile in the eluate was distilled off under reduced pressure and freeze-dried to obtain 63.5 mg of a yellow oily substance.
[0066]
Of these, 20 mg was dissolved in 10 ml of a dimethyl sulfoxide solution and purified as follows. That is, 0.5 ml of the sample solution was charged into an HPLC column (Develosil C30 UG-3, 20φ × 100 mm, manufactured by Nomura Chemical Co., Ltd.) equilibrated with 40% acetonitrile water containing 10 mM ammonium formate, and the same solvent was used. At a flow rate of 10 ml / min.
[0067]
Ultraviolet absorption at 210 nm was detected, and 13 to 15 minutes were fractionated to obtain 20 ml of a fraction. The remaining sample was similarly fractionated to obtain a 400 ml fraction. The acetonitrile in the fraction was distilled off under reduced pressure and freeze-dried to obtain 4.6 mg of F-20916A.
(Test Example 1) Measurement of antifungal activity
Antifungal activity (minimum inhibitory concentration) was measured according to the following method. That is, it was measured by a broth dilution method using a 96-well microtiter plate using an RPMI1640 medium containing 0.165 M MOPS buffer (pH 7.0) (3- [N-morpholino] propanesulfonic acid: manufactured by Sigma) ( Hideyo Yamaguchi et al., "Report of the Standardization Committee of the Japanese Society for Medical Mycology (1992-1994)", Journal of Medical Mycology, 1995, Vol. 36, pp. 61-86 (Hideo Yamaguchi et al, "Report of the Committee"). of Clinical Laboratory Standards 1992-1994 "Journal of Medical Mycology, 36, p.61-86, (1995)).
The results are shown in Table 3 below.
[0068]
[Table 4]

As shown in Table 3, F-20916A showed significant antifungal activity against all fungi tested.
(Formulation Example 1) Oral capsule
[0069]
[Table 5]

After mixing the powder of the above formulation and passing through a 30 mesh sieve, the powder is placed in a gelatin capsule to form a capsule.
[0070]
【The invention's effect】
The novel compound F-20916A of the present invention or a salt thereof exhibits excellent antifungal activity and is useful as a preventive or therapeutic agent for various fungal infections.
[0071]
[Sequence list]

Claims (7)

A compound represented by the following formula (I) or a salt thereof.

A compound having the following physicochemical properties or a salt thereof.
1) Properties of substance: White powdery substance Solubility: Soluble in pyridine, methanol, DMSO, insoluble in water and n-hexane 3) Molecular formula: C ₄₁ H ₇₃ N ₉ O ₁₅
4) Molecular weight: 931 (measured by FAB mass spectrometry)
5) Exact mass measured by ESI mass spectrometry using a high-resolution double focusing mass spectrometer: [M + H] ⁺ is as follows.
Obtained: 932.5316
Calculated value: 932.5304
6) Infrared absorption spectrum: potassium bromide (KBr) The infrared absorption spectrum measured by the tablet method shows the maximum absorption shown below.
3316, 2925, 1749, 1632, 1534, 1068 cm ^-1
7) 1 H- nuclear magnetic resonance spectrum was measured signals for the lowest field of pyridine in heavy pyridine as 8.74 ^ppm, 1 H- nuclear magnetic resonance spectrum is as shown below. The number of hydrogens in parentheses was observed by the HSQC method and the DEPT method.
0.84 (3H, d, J = 7 Hz), 0.88 (3H, t, J = 7 Hz), 1.05-1.33 (18H, m), 1.55 (3H, d, J) = 6.5 Hz), 1.59 (3H, d, J = 7 Hz), 1.82 (1H, m), 2.28 (2H, m), 2.40 (1H, m), 2. 67 (1H, m), 2.83 (2H, m), 3.28 (1H, m), 3.35 (1H, m), 4.22 (1H, brd, J = 16.5 Hz) , 4.30-4.52 (8H, m), 4.59-4.65 (2H, m), 4.86 (1H, m), 5.03 (1H, d, J = 7 Hz), 5.16 (1H, m), 5.28 (3H, m), 5.47 (1H, m), 5.65 (1H, m), ppm
⁸⁾ 13 C-Nuclear magnetic resonance spectrum: signals for most downfield pyridine in heavy pyridine was measured as 150.4 ^ppm, 13 C-nuclear magnetic resonance spectrum is as shown below.
14.8 (q), 15.3 (q), 18.2 (q), 18.2 (t), 21.3 (q), 23.4 (t), 25.9 (t), 27 0.7 (t), 30.1 (t), 30.3 (t, as two carbons), 30.4 (t), 30.5 (t), 30.7 (t), 32.6 (T), 33.0 (t), 37.6 (d), 38.9 (t), 40.2 (t), 42.9 (t), 51.1 (d), 53.7 ( d), 57.5 (d), 57.8 (d), 60.1 (d), 60.5 (d), 61.8 (t), 63.0 (t), 63.3 (t ), 63.7 (t), 68.3 (d), 76.8 (d), 170.7 (s), 171.6 (s), 172.2 (s), 172.4 (s) , 172.7 (s), 173.3 (s , 173.9 (s), 174.2 (s), 174.7 (s) ppm
9) High performance liquid chromatography:
Column: Capsule Pack C ₁₈ ACR, 4.6 Φ x 150 mm (manufactured by Shiseido Co., Ltd.)
Solvent: acetonitrile / 0.2% triethylamine phosphate buffer (pH 7.0) = 40/60
Flow rate: 1.0 ml / min Detection: ultraviolet absorption 210 nm
Retention time: 6.0 minutes A bacterium producing the compound according to claim 1 or 2, which belongs to the genus Trichoderma, is cultured, and the compound according to claim 1 or 2 is collected from the culture. A method for producing the compound according to claim 1 or 2. The production method according to claim 3, wherein the bacterium producing the compound according to claim 1 or 2, which belongs to the genus Trichoderma, is Trichoderma hamatum (Bonord.) Bainer SANK18502 strain. A medicament comprising the compound according to claim 1 or 2 or a pharmacologically acceptable salt thereof as an active ingredient. A prophylactic or therapeutic agent for a fungal infection comprising the compound according to claim 1 or 2 or a pharmacologically acceptable salt thereof as an active ingredient. Trichoderma hamatum (Bonord.) Bainier SANK18502 strain.