【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、薬剤を開発するための技術分野に属し、特に、抗癌剤となり得る酸化プリンヌクレオシド三リン酸分解酵素阻害剤をスクリーニングする方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
がん治療において化学療法は重要なアプローチの一つであり、現在臨床で用いられている抗癌剤は５０種以上にものぼるが、未だ充分ではなく、新しい抗癌剤の開発が日夜続けられている。抗癌剤の効率的な開発のためには、本格的な薬理学的試験や臨床試験の前に、学術的検討から明らかにされた知見に基づき、抗癌剤の候補となり得る各種の生理活性物質を予めスクリーニングすることのできる系を確立することが必要である。
【０００３】
酸化プリンヌクレオシド三リン酸分解酵素（一般に、ＭＴＨ１またはＮＵＤＴ１と略称される。本明細書においてもＭＴＨ１と略称することがある）は、酸化されたプリンヌクレオシド三リン酸（８−ｏｘｏ−ｄＧＴＰ，２−ＯＨ−ｄＡＴＰ，２−ＯＨ−ＡＴＰ等）を一リン酸に分解する活性を有することから、酸化核酸前駆体が複製や転写の際にゲノムＤＮＡやＲＮＡに取り込まれる結果引き起こされる突然変異や翻訳エラーを回避することにより遺伝情報の維持に重要な役割を持つと考えられている。事実、Ｍｔｈ１ノックアウトマウスでは肝細胞がんを始めとする複数の臓器の自然発癌頻度の増加が認められている（Ｔ． Ｔｓｕｚｕｋｉ， Ｙ． Ｎａｋａｂｅｐｐｕ他、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９８， １１４５６−１１４６１ （２００１）（非特許文献１）。一方、ＭＴＨ１は、脳腫瘍細胞において８−オキソデオキシグアノシン（８−ｏｘｏ−ｄＧ）の細胞内蓄積の上昇とともに高発現することも認められている（Ｔ． Ｉｉｄａ， Ｙ． Ｎａｋａｂｅｐｐｕ他、Ｎｅｕｒｏ−Ｏｎｃｏｌｏｇｙ， Ａｐｒｉｌ， ７３−８１ （２００１））。これらの事実から、ＭＴＨ１は遺伝情報の維持から腫瘍発生を抑制するのみならず、酸化ストレスを受けた細胞の機能障害や細胞死の回避に関わる可能性が示唆される。
【０００４】
したがって、ＭＴＨ１を阻害する薬剤は癌細胞の持つ酸化ストレス抵抗性を抑制することが予想され、他の抗癌剤との併用によりその抗癌剤の用量の軽減や、放射線療法時の照射線量の軽減、さらにこれらの療法に抵抗性の癌の化学療法及び放射線療法に応用できるものと期待されるが、そのような薬剤を簡便且つ確実にスクリーニングすることができる系は未だ見出されていない。特に、ＭＴＨ１は、試験管内では酸化プリンヌクレオシド二リン酸のような物質により効率よく阻害されることは知られているが、酸化プリンヌクレオシド二リン酸は細胞膜を透過できないために薬剤としては使用できない。すなわち、ＭＴＨ１を阻害する薬剤を判別するにあたり、無細胞スクリーニング系を用いることは、細胞膜透過性を有しない薬剤が得られるという問題がある。
【非特許文献１】Ｔ． Ｔｓｕｚｕｋｉ， Ｙ． Ｎａｋａｂｅｐｐｕ他、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９８， １１４５６−１１４６１ （２００１）
【非特許文献２】Ｔ． Ｉｉｄａ， Ｙ． Ｎａｋａｂｅｐｐｕ他、Ｎｅｕｒｏ−Ｏｎｃｏｌｏｇｙ， Ａｐｒｉｌ， ７３−８１ （２００１）
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、酸化プリンヌクレオシド三リン酸分解酵素（ＭＴＨ１）を阻害する薬剤を簡便且つ確実にスクリーニングすることのできる新しいアッセイ系を提供することにある。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
本発明者は、研究を重ねた結果、ＭＴＨ１が発現しないと細胞死に陥る細胞系に着目し、これを利用することにより上述の目的を達成し得る本発明を案出したものである。
かくして、本発明に従えば、酸化プリンヌクレオシド三リン酸分解酵素（ＭＴＨ１）を阻害する薬剤のスクリーニングが可能となり、Ｍｔｈ１欠損ノックアウトマウス胎仔の線維芽細胞にヒトＭＴＨ１を強制発現させた細胞に被験物質を添加し、過酸化水素の存在下に細胞を培養して、その細胞死が認められたときに被験物質をＭＴＨ１阻害剤として選択することを特徴とする方法が提供される。
【０００７】
【発明の実施の形態】
本発明が対象とする酸化プリンヌクレオシド三リン酸分解酵素ＭＴＨ１は、哺乳動物における核酸の酸化損傷の防御機構に関与する酵素の１種であり、そのｃＤＮＡと遺伝子は本発明者らによりクローニングされ、大腸菌のＭｕｔＴ蛋白質の配列とホモロジーを有することからＭＴＨ１（ｍｕｔＴ ｈｏｍｏｌｏｇ １）と命名された（Ｈ． Ｏｄａ， Ｙ． Ｎａｋａｂｅｐｐｕ他、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．， ２７， ４３３５ （１９９９））。
【０００８】
本発明者らは、このＭｔｈ１遺伝子が欠損したノックアウトマウスを用いて各種臓器の自然発癌性に関する研究を行なう（前記の非特許文献１）とともに、ＭＴＨ１欠損ノックアウトマウスの胎仔の線維芽細胞にヒトＭＴＨ１（ｈＭＴＨ１）を強制発現させた細胞株を樹立し、過酸化水素負荷条件下の細胞の機能障害や細胞死に注目して解析を行なった。その結果、ｈＭＴＨ１強制発現株は非発現株と比較して有意に高い生存率を示すことを見出し、この現象がＭＴＨ１（ヒトＭＴＨ１）を阻害する薬剤の当否判別に利用できるものと考え、本発明を導き出したものである。
【０００９】
以下、本発明に従うＭＴＨ１阻害剤のスクリーニング法において用いられる細胞株の由来するＭＴＨ１欠損ノックアウトマウスの作製法、その胎児線維芽細胞株およびｈＭＴＨ１過剰発現株の樹立法、ならびに、該細胞株を用いるスクリーニング法に沿って本発明の実施の形態を説明する。但し、以下に示す具体的な実施の形態は例示のためのものであり、本発明の実施の形態はこれに限定されるものではなく、当業者であれば同等の材料と手法を用いて同等のものを作製できることは勿論である。
【００１０】
ＭＴＨ１ 欠損マウスの作製
ＭＴＨ１が欠損したノックアウトマウスは、ＥＳ細胞と遺伝子ターゲッティングを用いる常法に従って作製することができ、その１例は本発明者らによる上記文献（非特許文献１）にも記載されているが、以下のとおりである：
マウス１２９ＳＶ系由来の遺伝子ライブラリー（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社より購入、 Ｃａｔ． Ｎｏ．９４６３１３）よりＭｔｈ１遺伝子を単離しその構造を解析した。Ｍｔｈ１遺伝子は約 ７ ｋｂｐ の大きさで ５ つのエクソンより成り、第１，第２の２つのエクソンは ５’ 側非翻訳領域で、開始コドンは第３エクソンに含まれていた。ヒト、マウス及び大腸菌を含む３種の細菌由来のＭｕｔＴ様蛋白質間でアミノ酸配列がよく保存されている領域が認められるが、その部分はマウスの遺伝子上でエクソン３と４に分かれてコードされていた。第３エクソンをＧ４１８耐性遺伝子カセット（Ｄｅｎｇ， Ｃ．， Ｔｈｏｍａｓ， Ｋ． Ｒ．およびＣａｐｅｃｃｈｉ， Ｍ． Ｒ．， Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ． １３： ２１３４−２１４０ （１９９３）参照）と置換したターゲティングベクターを構築した。ベクターの両端には、ネガティブ選別用にＨＳＶのチミジンキナーゼ遺伝子（Ｒａｎｃｏｕｒｔ， Ｄ． Ｅ．， Ｔｓｕｚｕｋｉ， Ｔ． ａｎｄ Ｃａｐｅｃｃｈｉ， Ｍ． Ｒ．， Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ． ９： １０８−１２２ （１９９５））を配置した。
【００１１】
このターゲティングベクターをエレクトロポレーション法によりＥＳ細胞に導入し、Ｇ４１８・ガンシクロビル耐性クローンの中からＭｔｈ１の対立遺伝子の片方にＧ４１８耐性遺伝子カセットが挿入されたＭｔｈ１ヘテロ欠損細胞クローン（Ｍｔｈ１＋／−）を選択した。なお、用いたＥＳ細胞は、ＣＣＥ細胞株（Ｅ． Ｊ． Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ博士より分与：Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ， Ｅ． Ｊ． Ｔｅｔｒａｃａｒｃｉｎｏｍａｓ ａｎｄ Ｅｍｂｒｉｏｎｉｃ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ： Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ， ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ， ＮＹ （１９８７）参照）であり、このＣＣＥ細胞は研究目的であれば無償配布されている。同等のＥＳ細胞は、例えば、ＡＴＣＣよりＣＲＬ−１１６３２としても入手することができる。
上述のＭｔｈ１＋／− ＥＳ細胞をマウスの胚盤胞に導入して得られたキメラマウスをＢＤＦ１マウス（日本クレア社より購入）と交配し、Ｍｔｈ１＋／− マウスを樹立した。Ｍｔｈ１＋／− マウスはＣ５７ＢＬ６マウスと１２世代戻し交配を行い、その遺伝的背景を純化した。
【００１２】
ＭＴＨ１ ホモ欠損マウス胎仔線維芽細胞株（ Ｍｔｈ１ −／− ＭＥＦ ）の樹立
ＭＴＨ１欠損ノックアウトマウスからその胎仔線維芽細胞株の樹立化は、当該分野で既知の細胞培養の手法に従い次のように実施することができる：
１２世代戻し交配したＭｔｈ１＋／− マウスの雄と雌を交配し、妊娠１７．５日目のマウスを開腹、無菌的に子宮から１個体づつ胎仔を摘出した。Ｍｔｈ１−／−マウス胎仔より約８ｍｍ×８ｍｍの皮膚を剥離、切除し、培養シャーレに移す。少量の培地中（ＤＭＥＭ （低グルコース）、１０％ウシ胎仔血清）で組織片をはさみでミンチし、シャーレの培養面に広げ、ＣＯ２インキュベーター中で静置する。
１時間後、組織片が剥がれないように注意深く培地を添加し、数日間培養する。組織片より移行して増殖してきた繊維芽細胞を０．０５％トリプシン−ＥＤＴＡで剥がして回収し、新しいディッシュに移して３日おきに継代培養を継続する。３０世代以上の継代の後にコロニー形成率（ｐｌａｔｉｎｇ ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ）が３０％を超えた段階で株化したものとみなした。Ｔ２およびＴ５の２つの独立の株を樹立した。
【００１３】
ヒト ＭＴＨ１ を過剰発現する Ｍｔｈ１ −／− ＭＥＦ の樹立
以上のようにして得られるＭＴＨ１ホモ欠損マウス胎仔線維芽細胞株Ｍｔｈ１−／−ＭＥＦ（Ｔ２およびＴ５）に、ヒトＭＴＨ１ ｃＤＮＡをサブクローニングした発現ベクター（ｐｃＤＥＢΔ：ｈＭＴＨ１）をリポフェクション法により導入し、ハイグロマイシンＢ耐性細胞クローンを複数分離した。単一細胞由来のコロニー形成を２回繰り返し、純化したクローンについて抗ＭＴＨ１抗体を用いたウエスタンブロッティング法によりヒトＭＴＨ１の発現を確認し、２つのクローン（Ｔ２：ｈＭＴＨ１およびＴ５：ｈＭＴＨ１）を樹立した。コントロールとしてｐｃＤＥＢΔのみを導入したＴ２：ｖｅｃｔｏｒおよびＴ５：ｖｅｃｔｏｒを樹立した。なお、上記の発現ベクター（ｐｃＤＥＢΔ：ｈＭＴＨ１）や抗ＭＴＨ１抗体については、文献（Ｋａｎｇ， Ｄ．，およびＴａｋｅｓｈｉｇｅ， Ｋ．他、Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７０， １４６５９−１４６６５ （１９９５））に詳述されている。また、ヒトＭＴＨ１ ｃＤＮＡはＴＨＥ Ｉ．Ｍ．Ａ．Ｇ．Ｅ． ＣＯＮＳＯＲＴＩＵＭから入手できる。
【００１４】
ＭＴＨ １阻害剤のスクリーニング法
本発明に従えば、以上のようにして樹立したＭＴＨ１欠損ノックアウトマウス胎仔線維芽細胞（Ｍｔｈ１−／−ＭＥＦ）を利用して、ＭＴＨ１を阻害する薬剤をスクリーニングすることができる。すなわち、Ｍｔｈ１−／−ＭＥＦにヒトＭＴＨ１を強制発現させた細胞に、ＭＴＨ１阻害剤の候補となる被験物質を添加し、過酸化水素の存在下に細胞を培養して、その細胞死が認められたときに被験物質をＭＴＨ１阻害剤として選択する。
実際の操作に当たっては、ヒトＭＴＨ１を過剰発現するＭｔｈ１−／−ＭＥＦを対数増殖期から適当な条件で培養（一般的には、３７℃、５％ＣＯ２存在下に２４時間程度）した後、被験物質を添加して適当時間（例えば１〜５時間）培養し、その後、異なる濃度の過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）を添加し、さらに培養（一般的には２４時間程度）し、細胞の生存率を測定または観察し、その細胞死が有意に認められたときに被験物質をＭＴＨ１阻害剤として選択する。用いる培地は、特殊なものではなく標準的なＭＥＭ培地でよい。また、細胞毒性の効果を軽減するためにピルビン酸を加えてもよいが、本発明のアッセイ系は一般にピルビン酸を添加しなくても測定できる。
【００１５】
本発明のスクリーニング法において細胞の生存率を測定または観察する手段は、特に限定されるものではなく、細胞死を判定するための各種の手法、例えば、代謝酵素活性測定法、コロニー形成法、細胞分染法による顕微鏡観察、生合成能測定法などを用いることができる。このうち、代謝酵素活性測定法は、９６穴マイクロプレートなどを用いて多数の検体を比較的簡単に測定できることから好ましい。代謝酵素活性測定法の例としては、Ｃｅｌｌ ｃｏｕｎｔ ｋｉｔ ＷＳＴ−８ （Ｄｏｊｉｎｄｏ：株式会社同仁化学研究所製）が挙げられ、これは、テトラゾリウム塩が細胞内脱水素酵素により還元されて生じる水溶性のホルマザンの吸光度を測定することにより生細胞数を検出するタイプの測定法の１種である。
【００１６】
【実施例】
本発明の特徴を更に具体的に示すために以下に実施例を記す。実施例１は、本発明のスクリーニング法の背景となる現象を明らかにするものであり、ＭＴＨ１ノックアウトマウス胎仔線維芽細胞にヒトＭＴＨ１を強制発現させた細胞株は非発現株と比較して過酸化水素負荷後に有意に高い細胞生存率を有し、この系においてはＭＴＨ１が存在しないと細胞死が起こることを示すものである。実施例２は、ＭＴＨ１ノックアウトマウス胎仔線維芽細胞にヒトＭＴＨ１を強制発現させた細胞株は、そのＭＴＨ１活性が、特定の物質の存在により阻害され、したがって、そのような阻害物質を選別し得るのに使用できることを示すものである。
【００１７】
実施例１：過酸化水素感受性試験
対数増殖期のＴ５：ｖｅｃｔｏｒ（ヒトＭＴＨ１非発現株：既述）とＴ５：ｈＭＴＨ細胞（ヒトＭＴＨ１強制発現株）を９６穴マイクロプレートに５０％飽和になるように播種し（３ｘ１０３ ｃｅｌｌｓ／１００μｌ／ｗｅｌｌ）、３７℃、５％ ＣＯ２存在下に２４時間培養した。用いた培地はＭＥＭ （Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ １１０９５−０８０）である。次に、異なる濃度のＨ２Ｏ２（１０μｌ／ｗｅｌｌ）を培地に添加し、さらに２４時間培養した。Ｃｅｌｌ ｃｏｕｎｔ Ｋｉｔ ＷＳＴ−８ （Ｄｏｊｉｎｄｏ）を１０ μｌ／ｗｅｌｌ添加し、９０分から１２０分後に培養液の２つの吸光度の差（Ａ４５０ｎｍ−Ａ６２０ｎｍ）を測定した。未処理細胞の吸光度の値を１．０として相対生存率を求めた。
その結果を図１に示す。この系では、ＭＴＨ１が存在しないと細胞死が起こることが理解される。
【００１８】
実施例２： ＭＴＨ １阻害剤
ＭＴＨ１阻害剤として硫酸銅（ＣｕＳＯ４）を用いた。試験管内ではＭＴＨ１の８−ｏｘｏ−ｄＧＴＰ分解活性は１７μＭのＣｕ２＋の存在下で５０％阻害されることが知られており（Ｐｏｒｔｅｒ， Ｄ． Ｗ．， Ｎａｋａｂｅｐｐｕ他、Ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ １８ （９）， １７８５−１７９１ （１９９７））、本発明で用いるＭＴＨ１ノックアウトマウス胎仔線維芽細胞にヒトＭＴＨ１を強制発現させた細胞のＭＴＨ１活性が、そのような阻害物質によって阻害されるか否かを調べた。
対数増殖期のＴ５：ｈＭＴＨ細胞を９６穴マイクロプレートに５０％飽和になるように播種し（３ｘ１０３ ｃｅｌｌｓ／１００μｌ／ｗｅｌｌ）、３７℃、５％ ＣＯ２存在下に２４時間培養した。培地はＭＥＭ （Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ １１０９５−０８０）である。次に、ＭＴＨ１阻害剤（ＣｕＳＯ４）を最終濃度５０μＭで培地に添加し２時間培養した。その後、異なる濃度のＨ２Ｏ２（１０μｌ／ｗｅｌｌ）を培地に添加し、さらに２４時間培養した。Ｃｅｌｌ ｃｏｕｎｔ Ｋｉｔ ＷＳＴ−８ （Ｄｏｊｉｎｄｏ）を１０μｌ／ｗｅｌｌ添加し、９０分から１２０分後に培養液の２つの吸光度の差（Ａ４５０ｎｍ−Ａ６２０ｎｍ）を測定した。Ｈ２Ｏ２未処理細胞の吸光度の値を１．０として相対生存率を求めた。測定結果を図２に示す。図２に示されるように、ＭＴＨ１阻害剤の存在により細胞死が認められる。
【００１９】
【発明の効果】
以上の説明から明らかなように、本発明の方法を用いれば、ＭＴＨ１を阻害する薬剤を簡便且つ確実にスクリーニングすることができ、無細胞スクリーニング系におけるような細胞膜透過性を有しない薬剤を選別するという問題も回避される。かくして、本発明は、ＭＴＨ１阻害剤の効率的なスクリーニングを通じて抗癌剤や癌治療法の開発に資するものである。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明で用いられるＭＴＨ１ノックアウトマウス胎仔線維芽細胞にヒトＭＴＨ１を強制発現させた細胞株が非発現株と比較して過酸化水素負荷条件下に有意に高い細胞生存率を有することを示す。
【図２】本発明で用いられるＭＴＨ１ノックアウトマウス胎仔線維芽細胞にヒトＭＴＨ１を強制発現させた細胞株がＭＴＨ１阻害剤により細胞死を起こすことを示す。[0001]
TECHNICAL FIELD OF THE INVENTION
The present invention belongs to the technical field for developing a drug, and particularly relates to a method for screening an oxidized purine nucleoside triphosphate degrading enzyme inhibitor that can be an anticancer agent.
[0002]
[Prior art]
Chemotherapy is one of the important approaches in cancer treatment. Currently, more than 50 kinds of anticancer drugs are being used in the clinic, but they are still insufficient, and new anticancer drugs are being developed day and night. For efficient development of anticancer drugs, various bioactive substances that can be candidates for anticancer drugs are screened in advance based on the findings revealed from academic studies before full-scale pharmacological and clinical trials It is necessary to establish a system that can do this.
[0003]
Oxidized purine nucleoside triphosphate degrading enzyme (generally abbreviated as MTH1 or NUDT1; sometimes also abbreviated as MTH1 herein) is an oxidized purine nucleoside triphosphate (8-oxo-dGTP, 2). -OH-dATP, 2-OH-ATP, etc.) into monophosphate, so that oxidized nucleic acid precursors are incorporated into genomic DNA or RNA during replication or transcription, resulting in mutation or translation. Avoiding errors is thought to play an important role in maintaining genetic information. In fact, an increase in spontaneous carcinogenesis frequency of multiple organs including hepatocellular carcinoma has been observed in Mth1 knockout mice (T. Tsuzuki, Y. Nakabeppu et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98 , 11456). -11461 (2001) (Non-Patent Document 1) On the other hand, it has also been recognized that MTH1 is highly expressed in brain tumor cells with an increase in intracellular accumulation of 8-oxodeoxyguanosine (8-oxo-dG) (T Iida, Y. Nakabeppu, et al., Neuro-Oncology, April, 73-81 (2001). These facts indicate that MTH1 not only suppresses tumor development from maintaining genetic information, but also inhibits oxidative stress in cells. Possible involvement in avoiding dysfunction and cell death
[0004]
Therefore, an agent that inhibits MTH1 is expected to suppress the oxidative stress resistance of cancer cells, and the dose of the anticancer agent can be reduced by using it in combination with other anticancer agents, and the irradiation dose during radiation therapy can be further reduced. Is expected to be applicable to chemotherapy and radiation therapy for cancer resistant to the treatment of cancer, but a system that can easily and reliably screen such a drug has not been found yet. In particular, MTH1 is known to be efficiently inhibited in vitro by substances such as oxidized purine nucleoside diphosphate, but cannot be used as a drug because oxidized purine nucleoside diphosphate cannot penetrate cell membranes. . That is, when a drug that inhibits MTH1 is determined, using a cell-free screening system has a problem that a drug that does not have cell membrane permeability can be obtained.
[Non-Patent Document 1] Tsuzuki, Y .; Nakabeppu et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98 , 11456-11461 (2001).
[Non-Patent Document 2] Iida, Y .; Nakabeppu et al., Neuro-Oncology, April, 73-81 (2001).
[0005]
[Problems to be solved by the invention]
An object of the present invention is to provide a new assay system that can easily and reliably screen for a drug that inhibits oxidized purine nucleoside triphosphate degrading enzyme (MTH1).
[0006]
[Means for Solving the Problems]
As a result of repeated studies, the present inventor has focused on a cell line that will undergo cell death if MTH1 is not expressed, and has devised the present invention that can achieve the above object by utilizing this.
Thus, according to the present invention, it is possible to screen for a drug that inhibits oxidized purine nucleoside triphosphate degrading enzyme (MTH1), and a test substance can be added to cells in which human MTH1 is forcibly expressed in fibroblasts of Mth1-deficient knockout mouse embryos. And culturing the cells in the presence of hydrogen peroxide, and when the cell death is observed, selecting a test substance as an MTH1 inhibitor.
[0007]
BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION
The oxidized purine nucleoside triphosphate degrading enzyme MTH1 targeted by the present invention is one of enzymes involved in the defense mechanism against oxidative damage of nucleic acids in mammals, and its cDNA and gene have been cloned by the present inventors, It was named MTH1 (mutT homolog 1) because of its homology with the MutT protein sequence of Escherichia coli (H. Oda, Y. Nakabeppu et al., Nucleic Acids Res., 27 , 4335 (1999)).
[0008]
The present inventors conduct studies on the spontaneous carcinogenicity of various organs using the knockout mouse lacking the Mth1 gene (Non-Patent Document 1 described above), and also show that human MTH1 is expressed in the fibroblasts of the fetus of the knockout mouse lacking MTH1. A cell line in which (hMTH1) was forcibly expressed was established, and the analysis was carried out focusing on cell dysfunction and cell death under hydrogen peroxide loading conditions. As a result, it was found that the strain forcedly expressing hMTH1 exhibited a significantly higher survival rate as compared with the non-expressing strain, and it was considered that this phenomenon could be used for discriminating the presence or absence of a drug that inhibits MTH1 (human MTH1). Is derived.
[0009]
Hereinafter, a method for producing an MTH1-deficient knockout mouse derived from a cell line used in the method for screening for an MTH1 inhibitor according to the present invention, a method for establishing a fetal fibroblast cell line and an hMTH1-overexpressing cell line, and screening using the cell line An embodiment of the present invention will be described in accordance with the law. However, the specific embodiments described below are for the purpose of illustration, and the embodiments of the present invention are not limited thereto, and those skilled in the art may use the same materials and techniques to make the same. Of course can be manufactured.
[0010]
Preparation of MTH1- deficient mouse Knockout mice deficient in MTH1 can be prepared according to a conventional method using ES cells and gene targeting, and one example is described in the above-mentioned document (Non-patent Document 1) by the present inventors. But as follows:
The Mth1 gene was isolated from a mouse 129SV-derived gene library (purchased from Stratagene, Cat. No. 946313) and its structure was analyzed. The Mth1 gene was about 7 kbp in size and consisted of five exons, the first and second two exons were 5 ′ untranslated regions, and the start codon was included in the third exon. A region in which the amino acid sequence is well conserved among MutT-like proteins derived from three kinds of bacteria including human, mouse and Escherichia coli is recognized, and this region is encoded separately in exons 3 and 4 on the mouse gene. Was. A targeting vector in which the third exon was replaced with a G418 resistance gene cassette (see Deng, C., Thomas, K. R. and Capecchi, M. R., Mol. Cell. Biol. 13 : 2134-2140 (1993)). It was constructed. The thymidine kinase gene of HSV (Rancourt, DE, Tsuzuki, T and capecchi, MR, Genes Dev. 9 : 108-122 (1995)) was placed at both ends of the vector for negative selection. .
[0011]
This targeting vector was introduced into ES cells by electroporation, and an Mth1 hetero-deficient cell clone (Mth1 +/− ) in which a G418 resistance gene cassette was inserted into one of the Mth1 alleles from among the G418 · gancyclovir-resistant clones. Selected. The ES cells used were CCE cell lines (distributed by Dr. JJ Robertson: Robertson, EJ Tetraccarinomas and Embronic Stem Cells: A Practical Approach, IRL Press, IRL Press 87). These CCE cells are distributed free of charge for research purposes. Equivalent ES cells can also be obtained, for example, from the ATCC as CRL-11632.
Chimeric mice obtained by introducing the above-described Mth1 +/− ES cells into mouse blastocysts were crossed with BDF1 mice (purchased from CLEA Japan) to establish Mth1 +/− mice. Mth1 +/− mice were backcrossed to C57BL6 mice for 12 generations to purify their genetic background.
[0012]
Establishment of MTH1 homo-deficient mouse fetal fibroblast cell line ( Mth1 − / − MEF ) Establishment of fetal fibroblast cell line from MTH1-deficient knockout mouse is performed according to a cell culture technique known in the art as follows. be able to:
Males and females of the Mth1 +/− mice backcrossed for 12 generations were bred, and the mice on day 17.5 of gestation were laparotomized and aseptically excised one fetus from the uterus. Approximately 8 mm × 8 mm skin is peeled off from the Mth1 − / − mouse embryo, excised, and transferred to a culture dish. The tissue pieces are minced with scissors in a small amount of medium (DMEM (low glucose), 10% fetal bovine serum), spread on the culture surface of a petri dish, and allowed to stand in a CO 2 incubator.
After 1 hour, the medium is carefully added so that the tissue pieces do not peel off, and the cells are cultured for several days. The fibroblasts that have migrated and proliferated from the tissue piece are detached and collected with 0.05% trypsin-EDTA, transferred to a new dish, and subcultured every three days. After 30 or more passages, the strain was considered to have established when the plating efficiency exceeded 30%. Two independent strains, T2 and T5, were established.
[0013]
Overexpressing human MTH1 Mth1 - / - MTH1 homo-deficient mouse embryonic fibers obtained as establishment <br/> more MEF blast cell lines Mth1 - / - in MEF (T2 and T5), subcloned into human MTH1 cDNA The obtained expression vector (pcDEBΔ: hMTH1) was introduced by a lipofection method, and a plurality of hygromycin B-resistant cell clones were separated. The formation of colonies derived from single cells was repeated twice, and the expression of human MTH1 was confirmed for the purified clones by Western blotting using an anti-MTH1 antibody, and two clones (T2: hMTH1 and T5: hMTH1) were established. As controls, T2: vector and T5: vector into which only pcDEBΔ was introduced were established. The expression vector (pcDEBΔ: hMTH1) and the anti-MTH1 antibody are described in detail in the literature (Kang, D., and Takeshige, K., et al., J. Biol. Chem. 270, 14659-14665 (1995)). Have been. In addition, human MTH1 cDNA was obtained from THEI. M. A. G. FIG. E. FIG. Available from CONSORTIUM.
[0014]
According to the screening method <br/> present invention MTH 1 inhibitors, or more way MTH1 was established by deficient knockout mouse embryonic fibroblasts (Mth1 - / - MEF) using a, an agent that inhibits MTH1 Can be screened. That is, a test substance that is a candidate for an MTH1 inhibitor is added to cells in which human MTH1 is forcibly expressed in Mth1 − / − MEF, and the cells are cultured in the presence of hydrogen peroxide. The test substance is selected as an MTH1 inhibitor when the test is completed.
In actual operation, Mth1 − / − MEFs that overexpress human MTH1 are cultured under appropriate conditions from the logarithmic growth phase (generally, at 37 ° C. for about 24 hours in the presence of 5% CO 2 ). A test substance is added and cultured for an appropriate time (for example, 1 to 5 hours), and then hydrogen peroxide (H 2 O 2 ) of a different concentration is added, and further cultured (generally for about 24 hours). Is measured or observed, and the test substance is selected as an MTH1 inhibitor when the cell death is significantly observed. The medium used may be a standard MEM medium, not a special one. Further, pyruvate may be added to reduce the cytotoxic effect, but the assay system of the present invention can generally measure without adding pyruvate.
[0015]
Means for measuring or observing cell viability in the screening method of the present invention is not particularly limited, and various methods for determining cell death, for example, a metabolic enzyme activity measuring method, a colony forming method, and a cell Microscopic observation by a staining method, a biosynthesis ability measuring method, and the like can be used. Among them, the metabolic enzyme activity measurement method is preferable because a large number of samples can be measured relatively easily using a 96-well microplate or the like. As an example of the method for measuring metabolic enzyme activity, Cell count kit WST-8 (Dojindo: manufactured by Dojindo Laboratories Inc.) may be mentioned, which is a water-soluble compound produced by reducing tetrazolium salts by intracellular dehydrogenase. This is a type of measuring method that detects the number of living cells by measuring the absorbance of formazan.
[0016]
【Example】
Examples are described below to more specifically illustrate the features of the present invention. Example 1 clarifies the phenomenon behind the screening method of the present invention. The cell line in which human MTH1 was forcibly expressed in MTH1 knockout mouse fetal fibroblasts was compared with a non-expressing cell line in comparison with a non-expressing cell line. It has significantly higher cell viability after hydrogen loading, indicating that cell death occurs in the absence of MTH1 in this system. Example 2 shows that a cell line in which human MTH1 was forcibly expressed in MTH1 knockout mouse fetal fibroblasts was inhibited in its MTH1 activity by the presence of a specific substance, and therefore, such an inhibitory substance could be selected. It shows that it can be used for
[0017]
Example 1: Sensitivity test of hydrogen peroxide T5: vector (human MTH1 non-expressing strain: described above) and T5: hMTH cells (human MTH1 forced expressing strain) in logarithmic growth phase were placed in a 96-well microplate at 50%. The cells were seeded so as to be saturated (3 × 10 3 cells / 100 μl / well) and cultured at 37 ° C. in the presence of 5% CO 2 for 24 hours. The medium used was MEM (Invitrogen 11095-080). Next, different concentrations of H 2 O 2 (10 μl / well) were added to the medium, and the cells were further cultured for 24 hours. Cell count Kit WST-8 (Dojindo) was added at 10 μl / well, and after 90 minutes to 120 minutes, the difference between the two absorbances of the culture solution (A450 nm-A620 nm) was measured. The relative viability was determined by setting the absorbance value of the untreated cells to 1.0.
The result is shown in FIG. In this system, it is understood that cell death occurs in the absence of MTH1.
[0018]
Example 2: MTH 1 inhibitor Copper sulfate (CuSO 4 ) was used as the MTH 1 inhibitor . It is known that the 8-oxo-dGTP degradation activity of MTH1 in vitro is inhibited by 50% in the presence of 17 μM Cu 2+ (Porter, DW, Nakabeppu et al., Carcinogenesis 18 (9), 1785). -1791 (1997)), it was examined whether or not the MTH1 activity of cells in which human MTH1 was forcibly expressed in MTH1 knockout mouse embryo fibroblasts used in the present invention was inhibited by such an inhibitor.
T5: hMTH cells in the logarithmic growth phase were seeded on a 96-well microplate at 50% saturation (3 × 10 3 cells / 100 μl / well), and cultured at 37 ° C. in the presence of 5% CO 2 for 24 hours. The medium is MEM (Invitrogen 11095-080). Next, an MTH1 inhibitor (CuSO 4 ) was added to the medium at a final concentration of 50 μM, and the cells were cultured for 2 hours. Thereafter, different concentrations of H 2 O 2 (10 μl / well) were added to the medium, and the cells were further cultured for 24 hours. 10 μl / well of Cell count Kit WST-8 (Dojindo) was added, and after 90 to 120 minutes, the difference between the two absorbances of the culture solution (A450 nm-A620 nm) was measured. The relative viability was determined by setting the absorbance value of the H 2 O 2 untreated cells to 1.0. FIG. 2 shows the measurement results. As shown in FIG. 2, cell death is observed due to the presence of the MTH1 inhibitor.
[0019]
【The invention's effect】
As is apparent from the above description, the use of the method of the present invention enables a simple and reliable screening for a drug that inhibits MTH1, and selects a drug that does not have cell membrane permeability as in a cell-free screening system. That problem is also avoided. Thus, the present invention contributes to the development of anticancer agents and cancer treatments through efficient screening of MTH1 inhibitors.
[Brief description of the drawings]
FIG. 1 shows that the cell line in which human MTH1 is forcibly expressed in MTH1 knockout mouse fetal fibroblasts used in the present invention has a significantly higher cell viability under hydrogen peroxide loading conditions compared to a non-expressing cell line. Is shown.
FIG. 2 shows that a cell line in which human MTH1 is forcibly expressed in MTH1 knockout mouse fetal fibroblasts used in the present invention causes cell death by an MTH1 inhibitor.
