JP2004166540A

JP2004166540A - New plastic splitting enzyme and gene encoding the enzyme

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Publication number: JP2004166540A
Application number: JP2002334151A
Authority: JP
Inventors: Toshiaki Kanbe; 敏明神戸; Yukie Shigeno; ゆき枝茂野
Original assignee: Japan Science and Technology Agency
Current assignee: Japan Science and Technology Agency
Priority date: 2002-11-18
Filing date: 2002-11-18
Publication date: 2004-06-17
Anticipated expiration: 2022-11-18
Also published as: JP4117644B2

Abstract

<P>PROBLEM TO BE SOLVED: To obtain a new plastic splitting enzyme and a polynucleotide encoding the enzyme and to provide a method for decomposing a plastic using the enzyme or a bacterium expressing the enzyme. <P>SOLUTION: The enzyme and the polynucleotide encoding the enzyme have ability of decomposing a plastic containing an ester bond in the molecular structure. The method for decomposing a plastic comprises using the enzyme or the bacterium expressing the enzyme. <P>COPYRIGHT: (C)2004,JPO

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、新規なプラスチック分解酵素およびその酵素をコードするポリヌクレオチド、該酵素もしくは該酵素を発現している微生物を利用したプラスチックの分解方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】近年、プラスチック廃棄物の処理が問題になっている。プラスチック廃棄物の処理方法としては焼却や埋め立てが主であるが、焼却は地球温暖化の促進、埋め立ては埋立地の減少等の問題を抱えている。例えばポリウレタンは、全世界で年間約６００万ｔ，国内では約５５万ｔが消費されている。このうち、その発泡緩衝体は断熱性に優れることから冷蔵庫等の断熱材として大量に利用されている。現在、このポリウレタン廃棄物は不燃ゴミとして埋め立て処分される場合が多いが処分場の不足ならびに環境汚染の問題が生じている。一方、自然環境の点から好ましいものに微生物を利用した生分解法があるが、プラスチックは一般に生分解性ではなく、プラスチックを分解することのできる微生物に関する報告は限られている。
【０００３】
更に、プラスチックを分解することのできる酵素に関する報告は、アシドボラックスデラフィルディ（Ａｃｉｄｏｖｏｒａｘｄｅｌａｆｉｅｌｄｉｉ）由来のポリブチレンサクシネート分解酵素（ＵｃｈｉｄａＨ，Ｎａｋａｊｉｍａ−ＫａｍｂｅＴ，Ｓｈｉｇｅｎｏ−ＡｋｕｔｓｕＹ，ＮｏｍｕｒａＮ，ＴｏｋｉｗａＹ，ＮａｋａｈａｒａＴ（２００２）Ｃｌｏｎｉｎｇａｎｄｓｅｑｕｅｎｃｅａｎａｌｙｓｉｓｏｆｐｏｌｙ（ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｅｎｅｓｕｃｃｉｎａｔｅ）ｄｅｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｆｒｏｍＡｃｉｄｏｖｏｒａｘｄｅｌａｆｉｅｌｄｉｉｓｔｒａｉｎＢＳ−３．Ｊ．Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｅｎｇ．９３：２４５〜２４７）、コマモナスアシドボランス（Ｃｏｍａｍｏｎａｓａｃｉｄｏｖｏｒａｎｓ）由来のポリウレタン分解酵素、アミコラトプシス（Ａｍｙｃｏｌａｔｏｐｓｉｓ）属菌（ＰｒａｎａｍｕｄａＨ，ＴｓｕｃｈｉｉＡ，ＴｏｋｉｗａＹ（２００１）Ｐｏｌｙ（Ｌ−ｌａｃｔｉｄｅ）−ｄｅｇｒａｄｉｎｇｅｎｚｙｍｅｐｒｏｄｕｃｅｄｂｙＡｍｙｃｏｌａｔｏｐｓｉｓｓｐ．Ｍａｃｒｏｍｏｌ．Ｂｉｏｓｃｉ．１：２５〜２９，ＮａｋａｍｕｒａＫ，ＴｏｍｉｔａＴ，ＡｂｅＮ，ＫａｍｉｏＹ（２００１）Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎａｎｄｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎｏｆａｎｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｐｏｌｙ（Ｌ−ｌａｃｔｉｃａｃｉｄ）ｄｅｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｆｒｏｍａｓｏｉｌｉｓｏｌａｔｅ，Ａｍｙｃｏｌａｔｏｐｓｉｓｓｐ．ｓｔｒａｉｎＫ１０４−１．Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｌｏｂｉｏｌ．６７：３４５〜３５３）およびバチラススミッチイ（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｍｉｔｈｉｉ）由来（ＳａｋａｉＫ，ＫａｗａｎｏＨ，ＩｗａｍｉＡ，ＮａｋａｍｕｒａＭ，ＭｏｒｉｇｕｃｈｉＭ（２００１）Ｉｓｏｌａｔｉｏｎｏｆａｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｉｃｐｏｌｙ−Ｌ−ｌａｃｔｉｄｅｄｅｇｒａｄｉｎｇｂａｃｔｅｒｉｕｍｆｒｏｍｃｏｍｐｏｓｔａｎｄｉｔｓｅｎｚｙｍａｔｉｃｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ．Ｊ．Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｅｎｇ．９２：２９８〜３００）のポリ乳酸分解酵素に限られている。
【０００４】
【非特許文献１】
ＵｃｈｉｄａＨ，Ｎａｋａｊｉｍａ−ＫａｍｂｅＴ，Ｓｈｉｇｅｎｏ−ＡｋｕｔｓｕＹ，ＮｏｍｕｒａＮ，ＴｏｋｉｗａＹ，ＮａｋａｈａｒａＴ著、Ｃｌｏｎｉｎｇａｎｄｓｅｑｕｅｎｃｅａｎａｌｙｓｉｓｏｆｐｏｌｙ（ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｅｎｅｓｕｃｃｉｎａｔｅ）ｄｅｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｆｒｏｍＡｃｉｄｏｖｏｒａｘｄｅｌａｆｉｅｌｄｉｉｓｔｒａｉｎＢＳ−３．Ｊ．Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｅｎｇ．９３：２４５〜２４７、２００２年
【非特許文献２】
ＰｒａｎａｍｕｄａＨ，ＴｓｕｃｈｉｉＡ，ＴｏｋｉｗａＹ著、Ｐｏｌｙ（Ｌ−ｌａｃｔｉｄｅ）−ｄｅｇｒａｄｉｎｇｅｎｚｙｍｅｐｒｏｄｕｃｅｄｂｙＡｍｙｃｏｌａｔｏｐｓｉｓｓｐ．Ｍａｃｒｏｍｏｌ．Ｂｉｏｓｃｉ．１：２５〜２９、２００１年
【非特許文献３】
ＮａｋａｍｕｒａＫ，ＴｏｍｉｔａＴ，ＡｂｅＮ，ＫａｍｉｏＹ著、Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎａｎｄｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎｏｆａｎｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｐｏｌｙ（Ｌ−ｌａｃｔｉｃａｃｉｄ）ｄｅｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｆｒｏｍａｓｏｉｌｉｓｏｌａｔｅ，Ａｍｙｃｏｌａｔｏｐｓｉｓｓｐ．ｓｔｒａｉｎＫ１０４−１．Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｌｏｂｉｏｌ．６７：３４５〜３５３、２００１年
【非特許文献４】
ＳａｋａｉＫ，ＫａｗａｎｏＨ，ＩｗａｍｉＡ，ＮａｋａｍｕｒａＭ，ＭｏｒｉｇｕｃｈｉＭ著、Ｉｓｏｌａｔｉｏｎｏｆａｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｉｃｐｏｌｙ−Ｌ−ｌａｃｔｉｄｅｄｅｇｒａｄｉｎｇｂａｃｔｅｒｉｕｍｆｒｏｍｃｏｍｐｏｓｔａｎｄｉｔｓｅｎｚｙｍａｔｉｃｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ．Ｊ．Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｅｎｇ．９２：２９８〜３００、２００１年
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】本発明は、プラスチックを分解することのできる酵素、および該その酵素をコードするポリヌクレオチド、更には該酵素もしくは該酵素を発現する微生物を利用したプラスチックの分解方法を提供することを目的とする。
【０００６】
【課題を解決するための手段】本発明はプラスチック、特に分子構造中にエステル結合を有するプラスチックを分解する能力を有する、平成１４年１１月１４日付けで、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに寄託されたペニバチルスアミロリチカス（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓａｍｙｌｏｌｙｔｉｃｕｓ）ＴＢ−１３株（受託番号ＦＥＲＭＰ−１９１０４）が生産する、プラスチック分解能を有する酵素、該酵素をコードするポリヌクレオチド、および該ポリヌクレオチドを組み込んだ微生物にプラスチック分解能を有する酵素を発現させ、該酵素を精製取得する方法である。尚、ペニバチルス（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ）属に属する微生物がプラスチックの分解能を有することはこれまで知られていなかった。一方、プラスチック分解活性を有するペニバチルス属菌について、同一出願人による「発明の名称：新規プラスチック分解菌」の同日特許出願に記載されている。
【０００７】
更に本発明は、該酵素もしくは該酵素を発現する微生物を用いるプラスチックの分解方法である。
本発明の酵素は、プラスチック、特に分子構造中にエステル結合を有するプラスチックを分解する能力を有する。より具体的には、本発明の酵素は、ペニバチルスアミロリチカスに由来する、新規なプラスチック分解酵素であり、エステラーゼの一種である。
【０００８】
【発明の実施の形態】
酵素
本発明の酵素は、下記の性質を有する。
（ａ）プラスチック分解能を有し：
（ｂ）分子量が、２１６６１であり：
（ｃ）至適温度は、４５〜５５ ℃であり：
（ｄ）至適ｐＨは、１０である。
【０００９】
本発明の酵素は２０１のアミノ酸から構成され、分子量２１，６６１のポリペプチドであり、配列番号１のアミノ酸番号１−２０１で示されるアミノ酸配列により特定される。このアミノ酸配列は、配列番号２に記載されている塩基配列の、オープンリーディングフレーム（読み枠）部分によりコードされるポリペプチドのアミノ酸配列である。
【００１０】
尚、配列番号１のオープンリーディングフレームはシグナルペプチド部分を有しており、その切断点は配列番号１のＡｌａ−３１とＡｌａ−３２の間である。このことから成熟型酵素は１７０のアミノ酸からなる分子量１８，２３２のポリペプチドである。本酵素はプラスチック以外にエステラーゼの活性測定用の基質であるパラ−ニトロフェノールアセテート（ｐ−ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｙｌａｃｅｔａｔｅ）に対しても分解活性が認められることから、エステラーゼの一種であると考えられる。
【００１１】
更に、ＤＤＢＪデータベースを用いた本酵素および、それをコードするポリヌクレオチドのホモロジー解析の結果、本酵素はアミノ酸レベルでバチルスピュミラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｐｕｍｉｌｕｓ）のリパーゼ、バチルスサブチルス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）のリパーゼ、およびガラクトマイセスジェオトリカム（Ｇａｌａｃｔｏｍｙｃｅｓｇｅｏｔｒｉｃｕｍ）のリパーゼとそれぞれ５１，４９，４８％の相同性が認められる。また、本酵素にはＢａｃｉｌｌｕｓ属菌のリパーゼに見られる共通配列Ａ−Ｘ１−Ｓ−Ｘ２−Ｇが認められる（配列番号１の配列中の１０７−１１０番Ｘ１；Ｈｉｓ，Ｘ２；Ｍｅｔ）。
【００１２】
本発明のアミノ酸配列には、配列番号１に示したアミノ酸配列、ならびにその類似体および誘導体が含まれる。さらに、他の微生物に由来する対応するアミノ酸相同配列も本発明に包含される。また、配列番号２のヌクレオチド配列がコードするいかなるポリペプチドも本発明の範囲に含まれる。
【００１３】
配列番号１に示すポリペプチドのアミノ酸の一部が欠失、置換、挿入若しくは付加されたポリペプチド、例えば配列番号１に示すアミノ酸配列において、２０個以下、好ましくは１０個以下、更に好ましくは５個以下のアミノ酸が置換されたポリペプチドも、同じ酵素活性を示すことがありうる。従って、同じ酵素活性を有する限り、それらのペプチドも、本発明の酵素に含まれる。また、その様なポリペプチドと配列番号１に示すアミノ酸配列とは、７０％以上、好ましくは８０％以上、更に好ましくは９０％以上の相同性を有する（相同性の計算は、例えばＢＬＡＳＴ（ＢａｓｉｃＬｏｃａｌＡｌｉｇｎｍｅｎｔＳｅａｒｃｈＴｏｏｌ）検索を用いることにより行うことができる。）。その様なポリペプチドも、プラスチック分解反応を触媒するという特徴を有する限り、本発明の範囲に含まれる。
【００１４】
本酵素が分解できるプラスチックは、プラスチックの分子構造中にエステル結合を有するものであればよい。制限的でない例としては、ポリ乳酸、ポリウレタン、ポリブチレンサクシネート、ポリブチレンサクシネート−ｃｏ−アジペート、およびポリエチレンサクシネートが挙げられる。
【００１５】
ポリ乳酸とは、乳酸を主要成分とする重合体をさし、ポリＬ−乳酸や、ポリＤ−乳酸等のポリ乳酸ホモポリマー、ポリＬ／Ｄ−乳酸共重合体、およびこれらにε−カプロラクトン、グリコリド、デプシペプチド等の他の成分を共重合させたポリ乳酸共重合体、そして上記ポリマー間、および他の成分ポリマーとのブレンド体を含む。その重合方法としては、乳酸からの直接重合法、ラクタイド（乳酸の環状二量体）を介する開環重合法等が知られている。また、本発明の酵素により分解されるポリ乳酸樹脂の数平均分子量は、特に制限はなく、分子量５，０００〜２０，０００のポリ乳酸の分解については実施例に示している。
【００１６】
ポリウレタンとは、分子中にウレタン結合（−ＮＨＣＯＯ−）を有する高分子化合物の総称で、多官能イソシアネートとヒドロキル基含有化合物との反応により得られ、エステル、エーテル、アミド、ウレア、カルバメートなどの基を有するポリマーである。ヒドロキシル基もしくはイソシアネート基の官能性数を変化させることで多種多様の分岐あるいは架橋ポリマーを調製することができる。用いるポリオールの種類によってエステル系とエーテル系に大別できる。ポリウレタンは、易加工性、耐腐敗性、耐変質性、低比重等の優れた特性により、弾性体、発泡体、接着剤、塗料、繊維、合成皮革など幅広い用途を持っており、自動車部品としても広く使用されている。本発明の酵素により分解されるポリウレタン樹脂の数平均分子量は特に制限はない。
【００１７】
ポリブチレンサクシネートとは、コハク酸とブタンジオールからなる高分子をいう。ポリプロピレンやＰＥＴなみの機械的強度を有し、融点もポリカプロラクトンより高い。成形加工性もポリエチレンに近く、同種の成形加工機が使用できる。本発明の酵素により分解されるポリブチレンサクシネートの数平均分子量は、特に制限はなく、分子量１４０，０００のポリブチレンサクシネートの分解については実施例に示している。
【００１８】
ポリブチレンサクシネート−ｃｏ−アジペートとは、ポリブチレンサクシネート合成において原料にアジピン酸を加えることにより調製される高分子をいう。融点は９０℃ぐらいにまで下がるが、柔軟性が向上する。包装材や苗のポット、ゴミ袋などに利用されている。本発明の酵素により分解されるポリブチレンサクシネート−ｃｏ−アジペートの数平均分子量は、特に制限はなく、分子量１４０，０００および２５０，０００のポリブチレンサクシネート−ｃｏ−アジペートの分解については実施例に示している。
【００１９】
遺伝子
次に本発明の酵素をコードする遺伝子は、配列番号２のオープンリーディングフレームがコードするアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドである。例えば配列表の配列番号２に示す、塩基番号１−６０６で示される塩基配列を含むポリヌクレオチドである。尚、配列番号２に示す配列は、ＴＴＧが開始コドンとなる。
【００２０】
本発明のポリヌクレオチドは、その縮重を含むことができる。縮重とは、異なるヌクレオチドコドンによって１つのアミノ酸がコードされ得る現象をいう。かくして、本発明のプラスチック分解酵素をコードする核酸分子のヌクレオチド配列は縮重により変化することができる。
【００２１】
本発明には、配列番号２に示したＤＮＡ配列、配列番号２に示したＤＮＡ配列の相補配列に高度にストリンジェントな条件下で［たとえば０．５ＭＮａＨＰＯ_４、７％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、１ｍＭＥＤＴＡ中、６５℃でフィルター結合ＤＮＡにハイブリダイゼーション、そして０．１×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ中、６８℃で洗浄（Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．ｅｔａｌ．編，１９８９，ＣｕｒｒｅｎｔＰｒｏｔｏｃｏｌｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．Ｉ，ＧｒｅｅｎＰｕｂｌｉｓｈｉｎｇＡｓｓｏｃｉａｔｅｓ社，およびＪｏｈｎＷｉｌｙ＆Ｓｏｎｓ社，ニューヨーク，ｐ．２．１０．３）］ハイブリダイズするヌクレオチド配列により、コードされるタンパク質も同じ酵素活性を示すことがありうる。従って、同じ酵素活性を有する限り、それらのヌクレオチド配列も、本発明の範囲に含まれる。さらに、配列番号２に示したＤＮＡ配列の相補配列に中程度にストリンジェントな条件下で［たとえば０．２×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ中、４２℃で洗浄（Ａｕｓｕｂｅｌ，ｅｔａｌ．，１９８９，前掲）］ハイブリダイズするヌクレオチド配列により、コードされるタンパク質も同じ酵素活性を示すことがありうる。従って、同じ酵素活性を有する限り、それらのヌクレオチド配列も、本発明の範囲に含まれる。
【００２２】
遺伝子組み換え技術によれば、基本となるＤＮＡの特定の部位に、当該ＤＮＡの基本的な特性を変化させることなく、あるいはその特性を改善する様に、人為的に変異を起こすことができる。本発明により提供される天然の塩基配列を有するポリヌクレオチド、あるいは天然のものとは異なる塩基配列を有するポリヌクレオチドに関しても、同様に人為的に挿入、欠失、置換、付加を行う事により、天然のポリヌクレオチドと同等のあるいは改善された特性を有するものとすることが可能であり、本発明はそのような変異ポリヌクレオチドを含むものである。即ち、配列表の配列番号２に示すポリヌクレオチドの一部が挿入、欠失、置換若しくは付加されたポリヌクレオチドとは、配列番号２に示す塩基配列において、２０個以下、好ましくは１０個以下、更に好ましくは５個以下の塩基が置換されたポリヌクレオチドである。また、その様なポリヌクレオチドと配列番号２に示す塩基配列とは、７０％以上、好ましくは８０％以上、更に好ましくは９０％以上の相同性を有する（相同性の計算は、例えばＢＬＡＳＴ（ＢａｓｉｃＬｏｃａｌＡｌｉｇｎｍｅｎｔＳｅａｒｃｈＴｏｏｌ）検索を用いることにより行うことができる。）。その様なポリヌクレオチドも、プラスチックを分解する能力を有するという特徴を有するポリペプチドをコードしている限り、本発明の範囲に含まれる。
【００２３】
酵素の生産方法
本発明の酵素は、ペニバチルス属に属し、プラスチック分解能を有する微生物を培養し、該微生物中の酵素を分離・精製することにより、あるいは、本発明のポリヌクレオチド配列を組み込んだ宿主細胞を培養し、該宿主から酵素を分離・精製することにより、生産することができる。
【００２４】
ペニバチルス属に属し、プラスチック分解能を有する微生物は、公知の微生物であってもよく、新たにスクリーニングされた微生物であってもよい。具体的には、代表例として、平成１４年１１月１４日付けで、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに寄託されたペニバチルスアミロリチカス（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓａｍｙｌｏｌｙｔｉｃｕｓ）ＴＢ−１３株（受託番号ＦＥＲＭＰ−１９１０４）が挙げられる。微生物のスクリーニングの一例を示せば、各地より採取した土壌をポリ乳酸の粉末を含む培地の入った試験管に入れ、３０℃にて振とう培養し、一週間ごとに植え継ぎを繰り返した後、エマルジョン化したポリ乳酸を含んだ寒天平板に希釈塗布し、コロニー周辺にプラスチックの分解に伴うクリヤーゾーンの形成が見られた菌を取得することにより行うことができる。
【００２５】
ペニバチルス属に属する微生物の培養に用いる培地としては、ペニバチルス属に属する微生物が生育できる培地であれば特に制限なく用いることができ、例えば、ＬＢ培地（１％トリプトン、０．５％酵母エキス、１％ＮａＣｌ）が挙げられるがこれらに限定されない。本発明の微生物の生育に使用する培地は、具体的には、本発明の微生物が資化し得る炭素源、例えばグルコース等、及び本発明の微生物が資化し得る窒素源を含有し、窒素源としては有機窒素源、例えばペプトン、肉エキス、酵母エキス、コーン・スチープ・リカー等、無機窒素源、例えば硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム等を含有することができる。さらに所望により、ナトリウムイオン、カリウムイオン、カルシウムイオン、マグネシウムイオン等の陽イオンと硫酸イオン、塩素イオン、リン酸イオン等の陰イオンとからなる無類を含んでもよい。さらに、ビタミン類、核酸類等の微量要素を含有することもできる。炭素源の濃度は、例えば０．１〜１０％程度であり、窒素源の濃度は、種類により異るが、例えば０．０１〜５％程度である。また、無核酸類の濃度は、例えば０．００１〜１％程度である。ペニバチルス属に属する微生物の培養は、好気条件で、静置培養、振盪培養あるいは通気培養により行うことができる。好ましくは回転振盪培養が良く、回転数は３０〜２５０回転／分の範囲であるのが良い。培養温度は１０〜５０℃、特に３０℃付近が好ましい。また、培地のｐＨは４〜１０の範囲、好ましくは７付近であるのが良い。
【００２６】
本発明の酵素を、遺伝子組換え細胞により生産する方法は以下の通りである。まず、ポリヌクレオチド分子を宿主細胞に導入して組換え微生物を形成することができる何れかのベクターに挿入する。ベクターはＲＮＡまたはＤＮＡ何れか、原核生物または真核生物何れかであり得るが、典型的にはウイルスまたはプラスミドである。ベクターは染色体外エレメント（例えば、プラスミド）として発現させることができるか、あるいはそれを染色体に組込むことができる。組込まれたポリヌクレオチド分子は、染色体プロモーター制御した、天然もしくはプラスミドプロモーター制御下、または幾つかのプロモーター制御の組合せ下とすることができる。ポリヌクレオチド分子の単一または複数コピーを染色体に組み込むことができる。次に、該ベクターを宿主細胞にトランスフェクトして組換え細胞を形成させる。トランスフェクトするための適当な宿主細胞はトランスフェクトできる何れかの細菌、菌類（例えば酵母）、昆虫、植物または動物細胞を含む。本発明で使用される好ましい宿主細胞は、限定されるものではないが、例えば大腸菌、ペニバチルス属菌、枯草菌、酵母等を含めた、本発明の酵素の発現に適した何れの微生物細胞も含む。更に、該宿主を、該宿主に適した培養条件にて培養することにより、本発明の酵素を含有した遺伝子組換え細胞を得ることができる。該宿主に適した培養条件は、当業者に周知である。
【００２７】
ペニバチルス属に属しプラスチック分解能を有する微生物、あるいは本発明のポリヌクレオチド配列を組み込んだ宿主細胞からの本発明の酵素の分離・精製は、通常細胞からの蛋白質の分離・精製に用いられる方法を用いることにより行うことができる。具体的には、細胞を破壊後、通常用いられる分離精製手段を用いることにより行うことができる。細胞の破壊には、制限的でない例として、超音波処理、高圧ホモジナイザー処理、浸透圧ショック法が挙げられる。分離精製手段は、例えば塩析、ゲルろ過法、イオン交換クロマトグラフィーなどの方法を適宜組み合わせて用いればよい。更に、遺伝子組換えによる酵素の生産では、組み換え型酵素のＣ末端にＨｉｓ−ｔａｇを有するように生産させ、培養菌体を遠心集菌し、ペリプラズム画分を浸透圧ショック法にて抽出し、組み換え型酵素はＣ末端にＨｉｓ−ｔａｇを有しているため、ニッケルをキレートしたカラムによって容易に精製できる。
【００２８】
プラスチック分解方法
更に、本発明は、本酵素により、もしくは該酵素を発現する微生物を利用したプラスチック、特に分子構造中にエステル結合を有するプラスチックを分解する方法を提供する。つまり、本発明のプラスチックを分解する方法は、酵素のプラスチックを分解する作用を利用するもの、該酵素を発現する微生物の増殖過程でプラスチックが分解され栄養源として消費されることを利用する、あるいは該酵素を発現する微生物菌体、例えば休止菌体を利用するものである。
【００２９】
あるいは、本発明の酵素を発現する微生物菌体を常法により凍結乾燥した粉末状、その粉末と各種ビタミンやミネラル、必要な栄養源、例えば酵母エキス、カザミノ酸、ペプトン等を配合した後に打錠した錠剤等固形状の形態の調製物としてプラスチックの処理に提供しても良い。また、該酵素を発現する微生物菌株を活性汚泥およびコンポストの成分として利用することもできる。
【００３０】
本発明の酵素を、該酵素を含有する錠剤等として利用に供することもできる。酵素の粗酵素液、粗酵素粉末、または精製酵素の他に、通常酵素錠剤等に用いられる他の成分、例えば安定化剤、賦形剤、ｐＨ調整剤、増量剤、結合剤等を適宜配合してもよい。また、剤型も特に限定されず、用途に応じて散財、顆粒剤、錠剤等の剤型を選択すればよい。
【００３１】
本発明の方法に用いる酵素は、ペニバチルスアミロリチカスＴＢ−１３株（受託番号ＦＥＲＭＰ−１９１０４）から調製される酵素に限定されるわけではなく、組換えＤＮＡ技術によって創製された微生物、例えば発現ベクターに接続された該酵素をコードするポリヌクレオチドが導入された宿主、例えば大腸菌、ペニバチルス属菌、枯草菌、酵母等により生産された酵素を使用することも可能である。
【００３２】
組換えＤＮＡ技術による微生物の創製は、当該分野において通常用いられている方法により行うことができる。例えば、プラスチック分解酵素遺伝子の高効率発現系の構築は、現在最も効率的なポリペプチド発現用宿主−ベクター系の一つであるｐＥＴｓｙｓｔｅｍを用いて構築することができる。
【００３３】
本発明の方法で使用する酵素は、必ずしも十分に精製する必要はないが、酵素の精製が望まれるときは、通常蛋白質の精製に用いられる方法、例えば塩析、ゲルろ過法、イオン交換クロマトグラフィーなどの方法を適宜組み合わせて用いればよい。一例を示せば、組み換え型酵素のＣ末端にＨｉｓ−ｔａｇを有するように生産させ、培養菌体を遠心集菌し、ペリプラズム画分を浸透圧ショック法にて抽出する。組み換え型酵素はＣ末端にＨｉｓ−ｔａｇを有しているため、ニッケルをキレートしたカラムによって容易に精製できる。
【００３４】
本発明のプラスチックを分解する方法により分解できるプラスチックは、前記した通り、プラスチックの分子構造中にエステル結合を有するものであればよい。制限的でない例としては、ポリ乳酸、ポリウレタン、ポリブチレンサクシネート、ポリブチレンサクシネート−ｃｏ−アジペート、およびポリエチレンサクシネートが挙げられる。
【００３５】
分解に共されるプラスチックは、例えば液体の培地中にエマルジョンとして、あるいは粉体の形で加えても良いし、フィルム、ペレット等の塊として加えても良い。なお、培地に対するプラスチックの投入量は、０．０１〜１０重量％が望ましい。添加する酵素あるいは微生物量は極少量であってもよいが、分解効率を考慮してプラスチックに対して湿重量として、酵素の場合は０．００１重量％以上、微生物の場合は０．１重量％以上が好ましい。また、分解に供するプラスチックは、１種類であっても複数種類であっても良い。
【００３６】
精製酵素あるいは粗精製酵素のプラスチックを分解する作用を利用する態様では、プラスチックの分解に際し、緩衝液にプラスチックを添加した培地などであっても良いが、その他に窒素源、無機塩、ビタミンなどを添加しても良い。緩衝液としては、例えばリン酸緩衝液が挙げられる。
【００３７】
本発明の酵素を発現する微生物の増殖過程でプラスチックが分解され栄養源として消費されることを利用する態様では、プラスチックを単一の炭素源として与えることも、他の炭素源とともに与えることもできる。使用し得る培地としては、用いる微生物に適した培地であれば特に制限はないが、炭素源としては、グルコース等、及び該微生物が資化し得る窒素源を含有し、窒素源としては有機窒素源、例えばペプトン、肉エキス、酵母エキス、コーン・スチープ・リカー等、無機窒素源、例えば硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム等を含有することができる。さらに所望により、ナトリウムイオン、カリウムイオン、カルシウムイオン、マグネシウムイオン等の陽イオンと硫酸イオン、塩素イオン、リン酸イオン等の陰イオンとからなる無機塩を含んでもよい。さらに、ビタミン類、核酸類等の微量要素を含有することもできる。炭素源の濃度は、例えば０．１〜１０％程度であり、窒素源の濃度は、種類により異るが、例えば０．０１〜５％程度である。また、無機塩類の濃度は、例えば０．００１〜１％程度である。
【００３８】
微生物の有する酵素のプラスチックを分解する作用を利用する態様、すなわち増殖した後の微生物菌体、例えば休止菌体を利用する態様では、プラスチックの分解に際し、該微生物の増殖を伴わないため、緩衝液にプラスチックを添加した培地などであっても良いが、その他に窒素源、無機塩、ビタミンなどを添加しても良い。緩衝液としては、例えばリン酸緩衝液が挙げられる。
【００３９】
本発明において、酵素を発現する増殖中の微生物をプラスチックの分解に利用する場合は、好気条件で、静置培養、振盪培養あるいは通気培養を行えばプラスチックの分解がみられる。好ましくは回転振盪培養が良く、回転数は３０〜２５０回転／分の範囲であるのが良い。培養条件としては、培養温度は１０〜５０℃、特に３０℃付近が好ましい。また、培地のｐＨは４〜１０の範囲、好ましくは７付近であるのが良い。
【００４０】
プラスチックの分解に要する時間は、分解に供するプラスチックの種類、組成、形状及び量、使用した微生物の種類及び樹脂に対する相対量、その他種々の培養条件等に応じて変化しうる。
【００４１】
培地中のプラスチックの分解の確認は、例えば、分解に供したプラスチックの重量減少の測定、エマルジョンとして供する場合はプラスチックの分解によるクリアーゾーンの形成により測定することができる。
【００４２】
【実施例】本発明を実施例によってさらに詳しく説明するが、本発明の範囲はこれらのみに限定されるものではない。
実施例１染色体ＤＮＡライブラリの作成
クローニングにおいては、遺伝子供与体として前記ペニバチルスアミロリチカスＴＢ−１３株を用い、宿主菌としてＥ．ｃｏｌｉＸＬ１０Ｇｏｌｄを、ベクターとしてｐＵＣ１８およびｐＵＣ１９を用いた。染色体ＤＮＡ抽出はＳａｉｔｏ＆Ｍｉｕｒａの方法（ＳａｉｔｏＨａｎｄＭｉｕｒａＫ（１９６３）Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎｏｆｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅｉｃａｃｉｄｂｙｐｈｅｎｏｌｔｒｅａｔｍｅｎｔ．Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，７２，６１９−６２９．）に準じた。得られたＤＮＡを制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩにて完全分解し、２−４ｋｂのフラグメントを回収して、ＨｉｎｄＩＩＩにて切断したｐＵＣ１８に結合した。このプラスミドをＥ．ｃｏｌｉＸＬ１０Ｇｏｌｄに導入し、検定培地に塗布した。
【００４３】
検定培地としてエマルジョン化した各種プラスチックを含んだ寒天溶液をＬＢ平板上に重層したものを用いて、各種プラスチックの分解活性をコロニー周辺のクリヤーゾーンの形成にて確認した。尚、エマルジョンの作成は以下の方法に従った。各種プラスチック２ｇを４０ｍｌのジクロロメタンに溶解し、４０ｍｇのアニオン界面活性剤であるＰｌｙｓｕｒｆＡ２１０Ｇを含んだ蒸留水２５０ｍｌに加えてホモジナイザー（１０，０００ｒｐｍ１０ｍｉｎ）にてエマルジョン化した。その後、これを８０℃に加熱してジクロロメタンを揮発させた。
【００４４】
ＴＢ−１３株の染色体ＤＮＡの遺伝子ライブラリーを作成し、プラスチック分解能を持ったクローン１株を得た。本クローンはポリ乳酸（和光純薬工業社製）およびポリブチレンサクシネート−ｃｏ−アジペート（昭和高分子（株）製のビオノーレ、分子量１４０００）をエマルジョン化した検定培地にクリヤーゾーンを形成した。本プラスミドをｐＬＡ２９とした。ｐＬＡ２９にはＴＢ−１３株由来の約２．９ｋｂの断片が挿入されていた。この断片の制限酵素地図を図１に示した。プラスチック分解酵素の位置を特定するため、本断片を各種制限酵素で切断し、サブクローニングを行った。得られたクローンのプラスチック分解活性を検討した結果、ｐＬＡ−ｓｓ中の０．９ｋｂの部分に酵素遺伝子がコードされていることが明らかになった。
【００４５】
実施例２遺伝子配列の決定
ｐＬＡ−ｓｓ中の挿入断片のうちの７３６ｂｐについて塩基配列をＡＢＩＰｒｉｓｍ３１０ＤＮＡシーケンサー（米国Ｐｅｒｋｉｎ−ＥｌｍｅｒＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用いて決定し、得られた配列はＧＥＮＥＴＹＸ−ＭＡＣｐｒｏｇｒａｍによって解析した。データベース解析にはＦＡＳＴＡおよびＢＬＡＳＴＡプログラムを用いＤＤＢＪ／ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬの遺伝子データベースを利用した。
【００４６】
塩基配列を決定した全９３０塩基配列を配列表の配列番号３に示した。配列表３の１９５から８００番目の塩基がひとつのＯＲＦをコードしていた。ＴＴＧで始まる開始コドンの８塩基上流にはリボゾーム結合領域と見られる配列が認められた。また、−３５， −１０と思われる領域も存在していた。さらに終始コドンの下流にはステムループ構造が認められた。本断片中には他に合理的なＯＲＦが存在しないことから、本ＯＲＦがプラスチック分解酵素遺伝子本体である。
【００４７】
遺伝子解析の結果より、本酵素は２０１のアミノ酸から構成され、分子量２１，６６１のポリペプチドであることが明らかとなった。また、本酵素はシグナルペプチドを有しており、その切断点はＡｌａ−３１とＡｌａ−３２の間であると推定された。このことから成熟型酵素は１７０のアミノ酸からなる分子量１８，２３２のポリペプチドであると考えられた。
【００４８】
次に、ＤＤＢＪデータベースを用いて本酵素遺伝子のホモロジー解析を行った。本酵素はアミノ酸レベルでバチルスピュミラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｐｕｍｉｌｕｓ）のリパーゼ、バチルスサブチルス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）のリパーゼ、およびガラクトマイセスジェオトリカムのリパーゼとそれぞれ５１，４９，４８％の相同性が認められた。また、本酵素にはバチルス属菌のリパーゼに見られる共通配列Ａ−Ｘ１−Ｓ−Ｘ２−Ｇが認められた（配列中の１０７−１１０番Ｘ１；Ｈｉｓ，Ｘ２；Ｍｅｔ）。しかし、これらの酵素ではプラスチックの分解性は報告されていない。本酵素はプラスチック以外にエステラーゼの活性測定用の基質であるパラ−ニトロフェノールアセテートに対しても分解活性が認められたことから、エステラーゼの一種であると考えられた。
【００４９】
実施例３高発現系の構築
プラスチック分解酵素遺伝子の高効率発現系を構築するため、現在最も効率的なポリペプチド発現用宿主−ベクター系の一つであるｐＥＴｓｙｓｔｅｍを用いて構築を行った。
【００５０】
得られたポジティブクローンから、プラスチック分解酵素遺伝子本体（リーダーペプチド部分を除く）を含んだポリヌクレオチド断片をＰＣＲ法によって特異的に取り出した。このとき、ポリヌクレオチド断片の両末端にＥｃｏＲＩとＮｈｅＩサイトを組み込んだ。また、本酵素遺伝子中のシグナル配列は大腸菌では機能しなかったため、この部分を削除し、ベクターに存在するｐｅｒＢ配列（ペリプラズム内への分泌を可能にする）の下流に本酵素遺伝子本体を直結し、また、Ｃ末端には精製を簡便にするためのＨｉｓ−ｔａｇ配列（ベクターに含まれる）を付与するようにプライマーを設計した。ＰＣＲに用いたプライマーを以下に示す。
フォワード５’−ＣＣＧＧＡＡＴＴＣＧＧＣＡＡＣＴＧＡＡＣＧＣＡＣＧＣＣＡ−３’ ＜配列番号４＞
リバース５’−ＣＣＴＡＧＣＴＡＧＣＴＴＣＧＡＴＡＡＧＴＧＣＧＧＣＣＴＴ−３’ ＜配列番号５＞（ＥｃｏＲＩとＮｈｅＩサイトを下線で示した。）
ＰＣＲは、９４℃にて２分１サイクル、それから９６℃でそれぞれ１５秒の３０サイクル、６０℃にて３０秒、６８℃にて１分という条件で行った。これをＥｃｏＲＩとＮｈｅＩにて切断し、同酵素で切断したプラスミドｐＥＴ２５ｂ（＋）（米国Ｎｏｖａｇｅｎ製）に結合した。作成したプラスミドをｐＬＡ−ＥＮと呼ぶが、それを大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）に導入し、発現系を構築した。
【００５１】
実施例４高効率発現系を用いた組み換え型プラスチック分解酵素の発現および精製
ｐＬＡ−ＥＮをＥ．ｃｏｌｉＢＬ２１（ＤＥ３）に導入し、０．１ｍｇ／ｍｌのアンピシリンを含んだＬＢ（Ｌｕｒｉａ−Ｂｅｒｔａｎｉ）培地１００ｍｌの入った三角フラスコ２本に植菌した。３７℃にて８時間培養後、ＩＰＴＧ（０．１ｍＭ）を加え、さらに２時間培養した。これを遠心集菌し、ペリプラズム画分を浸透圧ショック法にて抽出した。組み換え型酵素はＣ末端にＨｉｓ−ｔａｇを有しているため、ニッケルをキレートしたカラムによって容易に精製できる。集めたペリプラズム画分をニッケルを固定したＣｈｅｌａｔｉｎｇＳｅｐｈａｒｏｓｅＦａｓｔＦｌｏｗカラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）にてＨｉｓ−ｔａｇと特異的に吸着させて精製した。精製ステップ表を表１に示す。カラムはあらかじめ０．１ＭのＮａＣｌを含んだ２０ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ７．０）にて平衡化しておいた。その後０−２００ｍＭのイミダゾール濃度勾配にて溶出を行った。酵素活性の認められたフラクションを集めて、限外ろ過にて濃縮し、−８０℃にて保存した。
【００５２】
尚、酵素活性の定量には、本酵素はエステラーゼ活性を有するのでパラ−ニトロフェノールアセテートを基質としたエステラーゼ活性を用いた。エステラーゼ活性はＫａｙらの方法（ＫａｙＭＪ，ＭｃＣａｂｅＲＷａｎｄＭｏｒｔｏｎＬＨＧ（１９９３）Ｃｈｅｍｉｃａｌａｎｄｐｈｙｓｉｃａｌｃｈａｎｇｅｓｏｃｃｕｒｒｉｎｇｉｎｐｏｌｙｅｓｔｅｒｐｏｌｙｕｒｅｔｈａｎｅｄｕｒｉｎｇｂｉｏｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ．Ｉｎｔ．Ｂｉｏｄｅｔｅｒｉｏｒ．Ｂｉｏｄｅｇｒａｄ．，３１，２０９−２２５）に従ってパラ−ニトロフェノールアセテートを基質として測定した。プラスチック分解酵素の酵素量は１分間に１μモルのｐ−ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｏｌを生成する酵素量を１ｕｎｉｔ（Ｕ）として定義した。
【００５３】
【表１】

【００５４】
実施例５プラスチック分解試験１
組み換え型プラスチック分解酵素による各種ポリエステル型プラスチックの分解精製した組み換え型プラスチック分解酵素を用いて、ポリ乳酸、ポリブチレンサクシネート、ポリブチレンサクシネート−ｃｏ−アジペートに対する分解活性の検討を行った。
【００５５】
分解試験は、エマルジョンを含んだリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）２ｍｌに酵素３０マイクログラムを加えて、３０℃にて１時間反応することにより行った。
ポリ乳酸、ポリブチレンサクシネートおよびポリブチレンサクシネート−ｃｏ−アジペートに対する分解活性は、エマルジョン（ＯＤ_５８０ｎｍ＝１）の分解による濁度の減少を５８０ｎｍ吸光度を測定することによって求めた。その結果を表２に示した。
【００５６】
本酵素は約１８時間でポリブチレンサクシネート−ｃｏ−アジペートの８０％以上を、ポリブチレンサクシネートの５０％以上を分解可能であった。また、ポリ乳酸に対しては、分子量１．５万までのものに対しては１８時間以内に５０％以上分解可能であったが、分子量２万のものでは２５％程度しか分解しなかった。
【００５７】
【表２】

【００５８】
実施例６プラスチック分解試験２
組み換え型プラスチック分解酵素によるポリウレタンの分解
エステル型ポリウレタンは、ポリジエチレングリコールアジペート（平均分子量２，５００）と２，４−トリレンジイソシアネートより合成した物を用いた。ポリウレタンは有機溶媒に不溶なためエマルジョン化できない。そのため、固体を用いて分解試験を行った。４ｘ４ｘ１ｍｍのポリウレタン片に酵素を加え、０．１Ｍリン酸バッファー（ｐＨ７．０）を加えて全量を０．５ｍｌとして３０℃、２４時間反応した。ポリウレタンの重量変化およびポリウレタン中のエステル結合の分解によって生じるジエチレングリコールをガスクロマトグラフィーにて定量した。ガスクロマトグラフィーの条件は、カラムにＵｎｉｓｏｌｅ３０Ｔを用い、インジェクション温度２５０℃、カラム温度１９０℃にて行った。検出にはＦＩＤを用いた。分解試験の結果を表３に示した。
【００５９】
本酵素は固体ポリウレタンに対して分解活性を持ち、分解とともに供試ポリウレタンのポリエステル部分の構成成分であるジエチレングリコールの生成が確認された。
【００６０】
【表３】

【００６１】
【配列表】

【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、ｐＬＡ２９の制限酵素地図を示す。
【図２】図２は、高発現型プラスミドの構築の概念図を示す。[0001]
TECHNICAL FIELD The present invention relates to a novel plastic-decomposing enzyme, a polynucleotide encoding the enzyme, and a method for decomposing plastic using the enzyme or a microorganism expressing the enzyme.
[0002]
2. Description of the Related Art In recent years, treatment of plastic waste has become a problem. Incineration and landfills are the main methods of treating plastic waste, but incineration has problems such as promotion of global warming and landfilling has a problem of reduction of landfills. For example, about 6 million tons of polyurethane are consumed worldwide every year, and about 550,000 t in Japan. Among them, the foamed buffer is used in large quantities as a heat insulating material for refrigerators and the like because of its excellent heat insulating properties. At present, this polyurethane waste is often landfilled as non-combustible garbage, but there is a shortage of disposal sites and problems of environmental pollution. On the other hand, a biodegradation method using microorganisms is preferable in view of the natural environment. However, plastics are not generally biodegradable, and reports on microorganisms capable of decomposing plastics are limited.
[0003]
In addition, reports on enzymes capable of degrading plastics are reported in Polybutylene succinate degrading enzyme (Uchida H, Nakajima-Kambe T, Shigeno-Akutsu, Japan, Acidovorax delafieldi). Y, Nakahara T (2002) Cloning and sequence analysis of poly (tetramethylene succinate) depolymerase from Acidovorax.Jo.24.B.de. sacidovorans), a protease of the genus Amycolatopsis (Pranamuda H, Tsuchii A, Tokiwa Y (2001) Poly (L-lactide oxidosystem. -29, Nakamura K, Tomita T, Abe N, Kamio Y (2001) Purification and Characterization of an extracellular lamination polymer (L-lactic acidopolyamide lipoylase acryloylase acryloylase acryloylase acryloylase oleomere) Strain sp. strain K104-1. Appl. Environ. Microbiol. 67: 345-353) and from Bacillus smithiii (Sakai K, Kawano H, Iwanami, Iwanami, Japan). a thermophilic poly-L-lactide degrading bacterium from compost and it's enzymatic characteristic. J. Biosci. Bioeng. 92: 298-300).
[0004]
[Non-patent document 1]
Uchida H, Nakajima-Kambe T, Shigeno-Akutsu Y, Nomura N, Tokiwa Y, Nakahara T al., Cloning and sequence analysis of poly (tetramethylene succinate) depolymerase from Acidovorax delafieldii strain BS-3. J. Biosci. Bioeng. 93: 245-247, 2002
[Non-patent document 2]
Pranamuda H, Tsuchiii A, Tokyo Y, Poly (L-lactide) -degrading enzyme produced by Amycolatopsis sp. Macromol. Biosci. 1: 25-29, 2001
[Non-Patent Document 3]
Authors Nakamura K, Tomita T, Abe N, Kamio Y, Purification and Characterization of an extracellular poly (L-lactic acidopolyamide foam). strain K104-1. Appl. Environ. Microbiol. 67: 345-353, 2001
[Non-patent document 4]
Sakai K, Kawano H, Iwami A, Nakamura M, Moriguchi M, Isolation of the thermophilic poly-L-lactide catalyzing stomach framing stomach framing scoping. J. Biosci. Bioeng. 92: 298-300, 2001
[0005]
The present invention relates to an enzyme capable of degrading plastic, a polynucleotide encoding the enzyme, and a method for degrading plastic using the enzyme or a microorganism expressing the enzyme. The purpose is to provide.
[0006]
SUMMARY OF THE INVENTION The present invention is based on a patent issued by the National Institute of Advanced Industrial Science and Technology on November 14, 2002, having the ability to decompose plastics, especially plastics having an ester bond in the molecular structure. An enzyme having a plastic degradability, a polynucleotide encoding the enzyme, and a polynucleotide produced by Paenibacillus amyloliticus strain TB-13 (Accession No. FERM P-19104) deposited at the Organism Depositary Center. This is a method in which an enzyme having a plastic decomposability is expressed in a microorganism incorporating nucleotides, and the enzyme is purified and obtained. It has not been known that microorganisms belonging to the genus Paenibacillus have the resolution of plastics. On the other hand, a Penicillus bacterium having plastic-decomposing activity is described in the same patent application entitled "Title of the Invention: New Plastic-Decomposing Bacteria" by the same applicant.
[0007]
Furthermore, the present invention is a method for decomposing plastics using the enzyme or a microorganism expressing the enzyme.
The enzymes of the present invention have the ability to degrade plastics, especially those having ester bonds in the molecular structure. More specifically, the enzyme of the present invention is a novel plastic-degrading enzyme derived from Penicillus amylolyticus and is a kind of esterase.
[0008]
BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION
enzyme
The enzyme of the present invention has the following properties.
(A) With plastic resolution:
(B) the molecular weight is 21661:
(C) the optimal temperature is 45-55 ° C:
(D) The optimum pH is 10.
[0009]
The enzyme of the present invention is a polypeptide composed of 201 amino acids and having a molecular weight of 21,661, and is specified by the amino acid sequence represented by amino acid numbers 1-201 of SEQ ID NO: 1. This amino acid sequence is the amino acid sequence of the polypeptide encoded by the open reading frame (reading frame) of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 2.
[0010]
The open reading frame of SEQ ID NO: 1 has a signal peptide portion, and the cleavage point is between Ala-31 and Ala-32 of SEQ ID NO: 1. Thus, the mature enzyme is a polypeptide having a molecular weight of 18,232 and consisting of 170 amino acids. This enzyme is considered to be a type of esterase, since it has degrading activity not only on plastic but also on para-nitrophenol acetate, which is a substrate for measuring the activity of esterase.
[0011]
Furthermore, as a result of homology analysis of the present enzyme and a polynucleotide encoding the same using the DDBJ database, the present enzyme was found to be lipase of Bacillus pumilus, lipase of Bacillus subtilis at the amino acid level, And 51, 49 and 48% homology to lipase of Galactomyces geotricum, respectively. In addition, this enzyme has a common sequence A-X1-SX-G found in the lipase of the genus Bacillus (107-110 X1 in the sequence of SEQ ID NO: 1; His, X2; Met).
[0012]
The amino acid sequence of the present invention includes the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1, and analogs and derivatives thereof. Furthermore, corresponding amino acid homologous sequences derived from other microorganisms are also included in the present invention. Also, any polypeptide encoded by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2 is included in the scope of the present invention.
[0013]
A polypeptide in which a part of the amino acids of the polypeptide shown in SEQ ID NO: 1 has been deleted, substituted, inserted or added, for example, in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1, 20 or less, preferably 10 or less, more preferably 5 or less. Polypeptides having less than one amino acid substitution may exhibit the same enzymatic activity. Therefore, as long as they have the same enzyme activity, those peptides are also included in the enzyme of the present invention. Further, such a polypeptide has 70% or more, preferably 80% or more, and more preferably 90% or more homology between the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 (the homology calculation is, for example, BLAST (Basic Local Alignment Search Tool) search.) Such polypeptides are also included in the scope of the present invention as long as they have a characteristic of catalyzing a plastic decomposition reaction.
[0014]
The plastic from which the present enzyme can be degraded may be any plastic having an ester bond in the molecular structure of the plastic. Non-limiting examples include polylactic acid, polyurethane, polybutylene succinate, polybutylene succinate-co-adipate, and polyethylene succinate.
[0015]
Polylactic acid refers to a polymer containing lactic acid as a main component, and polylactic acid homopolymers such as poly-L-lactic acid and poly-D-lactic acid, poly-L / D-lactic acid copolymer, and ε-caprolactone. , Glycolide, depsipeptide and the like, and a polylactic acid copolymer obtained by copolymerizing other components, and blends between the above-mentioned polymers and with other component polymers. As the polymerization method, a direct polymerization method from lactic acid, a ring-opening polymerization method via lactide (cyclic dimer of lactic acid) and the like are known. The number average molecular weight of the polylactic acid resin decomposed by the enzyme of the present invention is not particularly limited, and the decomposition of polylactic acid having a molecular weight of 5,000 to 20,000 is shown in Examples.
[0016]
Polyurethane is a generic term for a polymer compound having a urethane bond (—NHCOO—) in a molecule, and is obtained by reacting a polyfunctional isocyanate with a hydroxyl group-containing compound, and is a group such as ester, ether, amide, urea, and carbamate. Is a polymer having A wide variety of branched or crosslinked polymers can be prepared by varying the number of hydroxyl or isocyanate functionalities. Depending on the type of polyol used, it can be broadly classified into ester type and ether type. Polyurethane has a wide range of applications such as elastic materials, foams, adhesives, paints, fibers, and synthetic leather due to its excellent properties such as easy processability, rot resistance, deterioration resistance, and low specific gravity. Are also widely used. The number average molecular weight of the polyurethane resin decomposed by the enzyme of the present invention is not particularly limited.
[0017]
Polybutylene succinate refers to a polymer composed of succinic acid and butanediol. It has the same mechanical strength as polypropylene and PET, and has a higher melting point than polycaprolactone. The molding processability is close to that of polyethylene, and the same type of molding machine can be used. The number average molecular weight of polybutylene succinate decomposed by the enzyme of the present invention is not particularly limited, and the decomposition of polybutylene succinate having a molecular weight of 140,000 is shown in Examples.
[0018]
Polybutylene succinate-co-adipate refers to a polymer prepared by adding adipic acid to a raw material in the synthesis of polybutylene succinate. Although the melting point is lowered to about 90 ° C., the flexibility is improved. It is used for packaging materials, seedling pots, garbage bags, etc. The number average molecular weight of polybutylene succinate-co-adipate decomposed by the enzyme of the present invention is not particularly limited, and the decomposition of polybutylene succinate-co-adipate having a molecular weight of 140,000 and 250,000 is described in Examples. Is shown in
[0019]
gene
Next, the gene encoding the enzyme of the present invention is a polynucleotide encoding a polypeptide consisting of an amino acid sequence encoded by the open reading frame of SEQ ID NO: 2. For example, it is a polynucleotide containing the base sequence represented by base numbers 1-606 shown in SEQ ID NO: 2 in the sequence listing. In the sequence shown in SEQ ID NO: 2, TTG is the start codon.
[0020]
A polynucleotide of the invention can include its degeneracy. Degeneracy refers to the phenomenon where one amino acid can be encoded by different nucleotide codons. Thus, the nucleotide sequence of a nucleic acid molecule encoding a plasticolytic enzyme of the present invention can change due to degeneracy.
[0021]
In the present invention, the DNA sequence shown in SEQ ID NO: 2 and the complementary sequence of the DNA sequence shown in SEQ ID NO: 2 are prepared under highly stringent conditions [eg, 0.5M NaHPO₄, 7% sodium dodecyl sulfate (SDS), hybridized to filter-bound DNA at 65 ° C. in 1 mM EDTA, and washed at 68 ° C. in 0.1 × SSC / 0.1% SDS (Ausubel, FM et al.). al., 1989, Current Protocols in Molecular Biology, Vol. I, Green Publishing Associates, Inc., and John Wily & Sons, New York, p. 2.10.3)]. May also exhibit the same enzyme activity. Therefore, as long as they have the same enzymatic activity, their nucleotide sequences are also included in the scope of the present invention. In addition, under moderately stringent conditions to the complement of the DNA sequence shown in SEQ ID NO: 2 [eg, washing at 42 ° C. in 0.2 × SSC / 0.1% SDS (Ausubel, et al., 1989) , Supra)] depending on the hybridizing nucleotide sequence, the encoded protein may also exhibit the same enzymatic activity. Therefore, as long as they have the same enzymatic activity, their nucleotide sequences are also included in the scope of the present invention.
[0022]
According to the genetic recombination technique, a specific site of the basic DNA can be artificially mutated without changing or improving the basic characteristics of the DNA. Polynucleotides having a natural base sequence provided by the present invention, or polynucleotides having a base sequence different from the natural ones, can also be artificially inserted, deleted, substituted, and added in the same manner as described above. It is possible to have the same or improved properties as the polynucleotide of the present invention, and the present invention includes such a mutant polynucleotide. That is, the polynucleotide in which a part of the polynucleotide shown in SEQ ID NO: 2 is inserted, deleted, substituted or added is, in the base sequence shown in SEQ ID NO: 2, 20 or less, preferably 10 or less, More preferably, it is a polynucleotide having 5 or less bases substituted. In addition, such a polynucleotide has a homology of 70% or more, preferably 80% or more, and more preferably 90% or more with the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 2 (the homology calculation is, for example, BLAST (Basic Local Alignment Search Tool) search.) Such polynucleotides are also within the scope of the invention, as long as they encode a polypeptide having the property of being capable of degrading plastic.
[0023]
Enzyme production method
The enzyme of the present invention belongs to the genus Penibacillus, by culturing a microorganism having plastic decomposability, by isolating and purifying the enzyme in the microorganism, or by culturing a host cell incorporating the polynucleotide sequence of the present invention, It can be produced by separating and purifying the enzyme from the host.
[0024]
The microorganism belonging to the genus Penibacilus and having the ability to degrade plastic may be a known microorganism or a newly screened microorganism. Specifically, as a representative example, Penibacillus amylolyticus TB-13 strain deposited at the National Institute of Advanced Industrial Science and Technology Patent Organism Depositary on November 14, 2002 (Paenibacillus amyloliticus) strain TB-13 ( Accession number FERM P-19104). As an example of screening for microorganisms, soil collected from various places is placed in a test tube containing a medium containing polylactic acid powder, shake-cultured at 30 ° C., and subculture is repeated every week. It can be carried out by diluting and applying to an agar plate containing emulsified polylactic acid, and obtaining a bacterium in which a clear zone is formed around the colony due to decomposition of the plastic.
[0025]
As a medium used for culturing a microorganism belonging to the genus Penibacillus, any medium can be used as long as it can grow a microorganism belonging to the genus Penicillus. For example, an LB medium (1% tryptone, 0.5% yeast extract, % NaCl). The medium used for growing the microorganism of the present invention specifically contains a carbon source that can be assimilated by the microorganism of the present invention, such as glucose, and a nitrogen source that can be assimilated by the microorganism of the present invention. May contain an organic nitrogen source such as peptone, meat extract, yeast extract, corn steep liquor and the like, and an inorganic nitrogen source such as ammonium sulfate and ammonium chloride. Further, if desired, it may contain an unmatched cation composed of a cation such as sodium ion, potassium ion, calcium ion and magnesium ion and an anion such as sulfate ion, chloride ion and phosphate ion. Further, it may contain trace elements such as vitamins and nucleic acids. The concentration of the carbon source is, for example, about 0.1 to 10%, and the concentration of the nitrogen source varies depending on the type, but is, for example, about 0.01 to 5%. The concentration of non-nucleic acids is, for example, about 0.001 to 1%. Cultivation of a microorganism belonging to the genus Penibacillus can be performed by static culture, shaking culture, or aeration culture under aerobic conditions. Rotational shaking culture is preferable, and the number of rotations is preferably in the range of 30 to 250 rotations / minute. The cultivation temperature is preferably from 10 to 50C, particularly preferably around 30C. The pH of the medium is preferably in the range of 4 to 10, preferably around 7.
[0026]
The method for producing the enzyme of the present invention by genetically modified cells is as follows. First, a polynucleotide molecule is introduced into a host cell and inserted into any vector capable of forming a recombinant microorganism. Vectors can be either RNA or DNA, either prokaryotic or eukaryotic, but are typically viruses or plasmids. The vector can be expressed as an extrachromosomal element (eg, a plasmid), or it can be integrated into the chromosome. The integrated polynucleotide molecule can be under the control of a chromosomal promoter, under the control of a native or plasmid promoter, or under a combination of several promoter controls. Single or multiple copies of the polynucleotide molecule can be integrated into the chromosome. Next, the vector is transfected into a host cell to form a recombinant cell. Suitable host cells for transfection include any bacterial, fungal (eg, yeast), insect, plant or animal cells that can be transfected. Preferred host cells for use in the present invention include, but are not limited to, any microbial cells suitable for expression of the enzymes of the present invention, including, for example, E. coli, Penicillus, Bacillus subtilis, yeast, and the like. . Furthermore, by culturing the host under culturing conditions suitable for the host, genetically modified cells containing the enzyme of the present invention can be obtained. Culture conditions suitable for the host are well known to those skilled in the art.
[0027]
Isolation / purification of the enzyme of the present invention from microorganisms belonging to the genus Penibacillus and having the ability to degrade plastic, or host cells incorporating the polynucleotide sequence of the present invention, should be carried out using a method generally used for the separation / purification of proteins from cells. Can be performed. Specifically, after the cells are disrupted, it can be carried out by using a commonly used separation and purification means. Non-limiting examples of cell disruption include sonication, high pressure homogenizer treatment, and osmotic shock. As the separation and purification means, for example, salting out, gel filtration, ion exchange chromatography and the like may be appropriately combined and used. Further, in the production of the enzyme by genetic recombination, the recombinant enzyme is produced so as to have a His-tag at the C-terminus, the cultured cells are collected by centrifugation, and the periplasmic fraction is extracted by an osmotic shock method. Since the recombinant enzyme has a His-tag at the C-terminus, it can be easily purified by a column chelating nickel.
[0028]
Plastic disassembly method
Furthermore, the present invention provides a method for decomposing a plastic, particularly a plastic having an ester bond in the molecular structure, using the present enzyme or a microorganism expressing the enzyme. In other words, the method for decomposing plastic of the present invention utilizes the action of an enzyme to decompose plastic, or utilizes the fact that plastic is decomposed and consumed as a nutrient source during the growth of microorganisms expressing the enzyme, or A microbial cell expressing the enzyme, for example, a quiescent cell is used.
[0029]
Alternatively, microbial cells expressing the enzyme of the present invention are freeze-dried by a conventional method in the form of a powder, and the tablet is mixed with the powder and various vitamins and minerals, necessary nutrients, such as yeast extract, casamino acid, peptone and the like. May be provided for the processing of plastics as a solid form preparation such as a tablet. Microbial strains expressing the enzyme can also be used as components of activated sludge and compost.
[0030]
The enzyme of the present invention can also be used as a tablet or the like containing the enzyme. In addition to the crude enzyme solution, crude enzyme powder, or purified enzyme, other components commonly used in enzyme tablets and the like, such as stabilizers, excipients, pH adjusters, bulking agents, binders, etc. are appropriately compounded. May be. Also, the dosage form is not particularly limited, and dosage forms such as splinters, granules, tablets and the like may be selected according to the use.
[0031]
The enzyme used in the method of the present invention is not limited to an enzyme prepared from Penicillus amylolyticus TB-13 strain (Accession No. FERM P-19104), and microorganisms created by recombinant DNA technology, For example, it is also possible to use an enzyme produced by a host into which a polynucleotide encoding the enzyme connected to an expression vector has been introduced, for example, Escherichia coli, Penicillus, Bacillus subtilis, yeast, or the like.
[0032]
Creation of a microorganism by recombinant DNA technology can be performed by a method generally used in the art. For example, a high-efficiency expression system for a plasticase gene can be constructed using pET system, which is one of the most efficient host-vector systems for polypeptide expression at present.
[0033]
The enzyme used in the method of the present invention does not necessarily need to be sufficiently purified. However, when purification of the enzyme is desired, a method usually used for protein purification, for example, salting out, gel filtration, ion exchange chromatography, etc. And the like may be used in appropriate combination. As an example, the recombinant enzyme is produced so as to have a His-tag at the C-terminus, the cultured cells are collected by centrifugation, and the periplasmic fraction is extracted by an osmotic shock method. Since the recombinant enzyme has a His-tag at the C-terminus, it can be easily purified by a column chelating nickel.
[0034]
As described above, the plastic that can be decomposed by the method for decomposing plastic according to the present invention may be any plastic having an ester bond in the molecular structure of the plastic. Non-limiting examples include polylactic acid, polyurethane, polybutylene succinate, polybutylene succinate-co-adipate, and polyethylene succinate.
[0035]
The plastics to be decomposed may be added, for example, in a liquid medium as an emulsion or in the form of a powder, or may be added as a lump such as a film or a pellet. The amount of the plastic added to the medium is preferably 0.01 to 10% by weight. The amount of the enzyme or the microorganism to be added may be very small, but it is 0.001% by weight or more for the enzyme and 0.1% by weight for the microorganism as a wet weight with respect to the plastic in consideration of the decomposition efficiency. The above is preferable. Further, the plastic to be disassembled may be one kind or a plurality of kinds.
[0036]
In the embodiment utilizing the action of the purified enzyme or the crude enzyme to decompose plastic, when decomposing the plastic, a medium in which the plastic is added to a buffer may be used, but in addition, a nitrogen source, inorganic salts, vitamins, etc. It may be added. Examples of the buffer include a phosphate buffer.
[0037]
In an embodiment utilizing the fact that plastic is decomposed and consumed as a nutrient source during the growth process of the microorganism expressing the enzyme of the present invention, the plastic can be provided as a single carbon source or can be provided together with another carbon source. . The medium that can be used is not particularly limited as long as it is a medium suitable for the microorganism to be used.The carbon source contains glucose and the like, and a nitrogen source that can be assimilated by the microorganism, and the nitrogen source is an organic nitrogen source. For example, peptone, meat extract, yeast extract, corn steep liquor, and the like, and inorganic nitrogen sources such as ammonium sulfate and ammonium chloride. Further, if desired, an inorganic salt composed of a cation such as sodium ion, potassium ion, calcium ion and magnesium ion and an anion such as sulfate ion, chloride ion and phosphate ion may be contained. Further, it may contain trace elements such as vitamins and nucleic acids. The concentration of the carbon source is, for example, about 0.1 to 10%, and the concentration of the nitrogen source varies depending on the type, but is, for example, about 0.01 to 5%. The concentration of the inorganic salts is, for example, about 0.001 to 1%.
[0038]
In the embodiment utilizing the action of the enzyme of the microorganism to decompose the plastic, that is, in the embodiment utilizing microbial cells after proliferation, for example, resting cells, the decomposition of the plastic does not accompany the growth of the microorganism, so the buffer solution The medium may be a medium to which plastic is added, or a nitrogen source, an inorganic salt, a vitamin or the like may be added. Examples of the buffer include a phosphate buffer.
[0039]
In the present invention, when a growing microorganism that expresses an enzyme is used for the decomposition of plastic, the decomposition of the plastic can be observed by static culture, shaking culture or aeration culture under aerobic conditions. Rotational shaking culture is preferable, and the number of rotations is preferably in the range of 30 to 250 rotations / minute. As the culturing conditions, the culturing temperature is preferably from 10 to 50C, particularly preferably around 30C. The pH of the medium is preferably in the range of 4 to 10, preferably around 7.
[0040]
The time required for decomposing the plastic may vary depending on the type, composition, shape and amount of the plastic to be decomposed, the type of microorganism used and the relative amount to the resin, various other culture conditions, and the like.
[0041]
The degradation of the plastic in the medium can be confirmed, for example, by measuring the weight loss of the plastic subjected to the degradation, or when providing as an emulsion, by forming a clear zone by the degradation of the plastic.
[0042]
EXAMPLES The present invention will be described in more detail with reference to Examples, but the scope of the present invention is not limited only to these.
Example 1 Chromosome DNA Creating a library
In the cloning, the aforementioned Penibacillus amylolyticus TB-13 strain was used as a gene donor, and E. coli was used as a host bacterium. coli XL10Gold, and pUC18 and pUC19 were used as vectors. Chromosomal DNA extraction was performed according to the method of Saito & Miura (Saito Hand and Miura K (1963) Preparation of transforming deoxyribonucleic acid by phenol treatment. Biochem. 6, Physi. Biochemistry. The obtained DNA was completely digested with a restriction enzyme HindIII, a 2-4 kb fragment was recovered, and ligated to pUC18 cut with HindIII. This plasmid was transformed into E. coli. E. coli XL10Gold and applied to the assay medium.
[0043]
Using an agar solution containing various emulsified plastics as an assay medium on an LB plate, the decomposition activity of the various plastics was confirmed by formation of a clear zone around the colony. The emulsion was prepared according to the following method. 2 g of each plastic was dissolved in 40 ml of dichloromethane, added to 250 ml of distilled water containing 40 mg of Plysurf A210G as an anionic surfactant, and emulsified with a homogenizer (10,000 rpm, 10 min). Thereafter, this was heated to 80 ° C. to evaporate dichloromethane.
[0044]
A gene library of the chromosomal DNA of the TB-13 strain was prepared, and one clone having plastic resolution was obtained. This clone formed a clear zone in an assay medium obtained by emulsifying polylactic acid (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) and polybutylene succinate-co-adipate (Bionole manufactured by Showa Polymer Co., Ltd., molecular weight: 14,000). This plasmid was designated as pLA29. Approximately 2.9 kb fragment derived from TB-13 strain was inserted into pLA29. The restriction map of this fragment is shown in FIG. This fragment was cut with various restriction enzymes and subcloned to identify the position of the plasticase. As a result of examining the plastic decomposition activity of the obtained clone, it was found that the 0.9 kb portion of pLA-ss encodes an enzyme gene.
[0045]
Example 2 Determination of Gene Sequence
The base sequence of 736 bp of the inserted fragment in pLA-ss was determined using an ABI Prism 310 DNA sequencer (Perkin-Elmer Applied Biosystems, USA), and the obtained sequence was analyzed by GENETYX-MAC program. For database analysis, DDBJ / GenBank / EMBL gene database was used using FASTA and BLASTA programs.
[0046]
The entire 930 nucleotide sequence for which the nucleotide sequence was determined is shown in SEQ ID NO: 3 in the sequence listing. The 195th to 800th base in Sequence Listing 3 encoded one ORF. A sequence that appeared to be a ribosome binding region was found 8 bases upstream of the start codon beginning with TTG. In addition, there were regions thought to be -35 and -10. Further, a stem-loop structure was observed downstream of the stop codon. Since no other reasonable ORF is present in this fragment, this ORF is the main body of the plasticase enzyme gene.
[0047]
The results of the gene analysis revealed that the present enzyme is a polypeptide composed of 201 amino acids and having a molecular weight of 21,661. In addition, this enzyme had a signal peptide, and its cleavage point was estimated to be between Ala-31 and Ala-32. This suggests that the mature enzyme is a polypeptide consisting of 170 amino acids and having a molecular weight of 18,232.
[0048]
Next, homology analysis of the present enzyme gene was performed using the DDBJ database. This enzyme has 51, 49, and 48% homology with Bacillus pumilus lipase, Bacillus subtilis lipase, and Galactomyces geotricum lipase at the amino acid level, respectively. Was. In addition, a common sequence A-X1-SX-G found in the lipase of the genus Bacillus was found in this enzyme (107-110 X1 in the sequence; His, X2; Met). However, no degradability of plastics has been reported for these enzymes. This enzyme was considered to be a type of esterase, as it exhibited degrading activity not only on plastic but also on para-nitrophenol acetate, a substrate for measuring esterase activity.
[0049]
Example 3 Construction of high expression system
In order to construct a high-efficiency expression system for the plasticase gene, construction was performed using pET system, which is one of the most efficient host-vector systems for polypeptide expression at present.
[0050]
A polynucleotide fragment containing the main body of the plasticase enzyme gene (excluding the leader peptide portion) was specifically extracted from the obtained positive clones by PCR. At this time, Eco RI and Nhe I sites were incorporated into both ends of the polynucleotide fragment. In addition, since the signal sequence in this enzyme gene did not function in Escherichia coli, this part was deleted and the main body of this enzyme gene was directly connected to the downstream of the perB sequence (which enables secretion into the periplasm) of the vector. In addition, a primer was designed to add a His-tag sequence (included in the vector) to the C-terminus for easy purification. The primers used for PCR are shown below.
Forward 5'-CCGGAATTCGGCAACTGAACGCACGCCA-3 '<SEQ ID NO: 4>
Reverse 5'-CCTAGCTAGCTTCGATAAGTGCGCCTT-3 '<SEQ ID NO: 5> (Eco RI and Nhe I sites are underlined)
The PCR was performed under the conditions of 1 cycle at 94 ° C. for 2 minutes, 30 cycles of 15 seconds each at 96 ° C., 30 seconds at 60 ° C., and 1 minute at 68 ° C. This was cut with Eco RI and Nhe I, and ligated to plasmid pET25b (+) (Novagen, USA) cut with the same enzyme. The prepared plasmid was called pLA-EN, which was introduced into Escherichia coli BL21 (DE3) to construct an expression system.
[0051]
Example 4 Expression and Purification of Recombinant Plastic Degrading Enzyme Using High Efficiency Expression System
pLA-EN was transformed into E. coli. coli BL21 (DE3) and inoculated into two Erlenmeyer flasks containing 100 ml of LB (Luria-Bertani) medium containing 0.1 mg / ml of ampicillin. After culturing at 37 ° C. for 8 hours, IPTG (0.1 mM) was added, and the cells were further cultured for 2 hours. This was collected by centrifugation, and the periplasmic fraction was extracted by the osmotic shock method. Since the recombinant enzyme has a His-tag at the C-terminus, it can be easily purified by a column chelating nickel. The collected periplasmic fraction was purified by specifically adsorbing His-tag on a Chelating Sepharose Fast Flow column (manufactured by Pharmacia) on which nickel was immobilized. The purification step table is shown in Table 1. The column was previously equilibrated with 20 mM phosphate buffer (pH 7.0) containing 0.1 M NaCl. Thereafter, elution was performed with a 0-200 mM imidazole concentration gradient. Fractions in which the enzyme activity was recognized were collected, concentrated by ultrafiltration, and stored at -80 ° C.
[0052]
In addition, since this enzyme has an esterase activity, the esterase activity using para-nitrophenol acetate as a substrate was used for the quantification of the enzyme activity. Esterase activity was determined according to the method of Kay et al. Measured as substrate. The amount of the enzyme of the plastic decomposing enzyme was defined as 1 unit (U) of the enzyme producing 1 μmol of p-nitrophenol per minute.
[0053]
[Table 1]

[0054]
Example 5 Plastic decomposition test 1
Decomposition of Various Polyester Plastics by Recombinant Plastic Degrading Enzyme The degradation activity of polylactic acid, polybutylene succinate, polybutylene succinate-co-adipate was examined using the recombinant plastic degrading enzymes purified.
[0055]
The decomposition test was carried out by adding 30 micrograms of the enzyme to 2 ml of a phosphate buffer (pH 7.0) containing the emulsion and reacting at 30 ° C. for 1 hour.
Degradation activity for polylactic acid, polybutylene succinate and polybutylene succinate-co-adipate was determined by using emulsion (OD₅₈₀The reduction in turbidity due to decomposition of nm = 1) was determined by measuring the absorbance at 580 nm. The results are shown in Table 2.
[0056]
This enzyme was able to degrade more than 80% of polybutylene succinate-co-adipate and more than 50% of polybutylene succinate in about 18 hours. In addition, polylactic acid having a molecular weight of up to 15,000 could be degraded by 50% or more within 18 hours, while that having a molecular weight of 20,000 could be degraded by only about 25%.
[0057]
[Table 2]

[0058]
Example 6 Plastic decomposition test 2
Degradation of polyurethane by recombinant plasticase
As the ester-type polyurethane, a product synthesized from polydiethylene glycol adipate (average molecular weight: 2,500) and 2,4-tolylene diisocyanate was used. Polyurethane cannot be emulsified because it is insoluble in organic solvents. Therefore, a decomposition test was performed using a solid. The enzyme was added to a 4 × 4 × 1 mm piece of polyurethane, and 0.1 M phosphate buffer (pH 7.0) was added to make a total volume of 0.5 ml, followed by reaction at 30 ° C. for 24 hours. Diethylene glycol produced by the change in the weight of the polyurethane and the decomposition of the ester bond in the polyurethane was quantified by gas chromatography. The gas chromatography was carried out at an injection temperature of 250 ° C. and a column temperature of 190 ° C. using Unisole 30T for the column. FID was used for detection. Table 3 shows the results of the decomposition test.
[0059]
This enzyme had decomposition activity on solid polyurethane, and it was confirmed that diethylene glycol, which is a constituent component of the polyester portion of the test polyurethane, was generated together with the decomposition.
[0060]
[Table 3]

[0061]
[Sequence list]

[Brief description of the drawings]
FIG. 1 shows a restriction map of pLA29.
FIG. 2 shows a conceptual diagram of construction of a high expression type plasmid.

Claims

A plasticase that is derived from a microorganism of the genus Penibacilus and has the following properties:
(A) having a plastic resolution;
(B) the molecular weight is 21661;
(C) the optimal temperature is 45 to 55 ° C;
(D) The optimum pH is 10.

A method for producing an enzyme according to claim 1, wherein
Steps of culturing a microorganism of the genus Penibacillus:
Separating and purifying the enzyme from the microorganism:
A method for producing the enzyme, comprising:

A plastic comprising the peptide sequence shown in SEQ ID NO: 1 or a peptide sequence having deletion, substitution, insertion or addition of one or several amino acids in the peptide sequence, wherein the peptide sequence maintains the activity of decomposing plasticase. Degrading enzymes.

The plastic degrading enzyme according to claim 3, wherein the peptide sequence shown in SEQ ID NO: 1 is deleted from the first amino acid to Ala-31 or one or several amino acids are deleted from the peptide sequence. A plastic degrading enzyme comprising a peptide sequence having a loss, substitution, insertion or addition and maintaining the activity of the plastic degrading enzyme.

A polynucleotide comprising the nucleotide sequence shown in (f), (g), or (h):
(F) a polynucleotide that encodes the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1, or an amino acid sequence in which the first amino acid of the amino acid sequence to Ala-31 is deleted, or a polynucleotide consisting of a complementary sequence thereof;
(G) a polynucleotide encoding a polypeptide having plastic-degrading activity and comprising a sequence in which a part of the base sequence of (f) is deleted, substituted, inserted or added, or a complementary sequence thereof;
(H) a polynucleotide that hybridizes under stringent conditions to the nucleotide sequence of (f) or (g).

The enzyme according to claim 1, 3 or 4, wherein the plastic has an ester bond in the molecular structure.

The enzyme according to claim 1, 3 or 4, wherein the plastic is polyurethane.

The enzyme according to claim 1, 3 or 4, wherein the plastic is polylactic acid, polybutylene succinate, polybutylene succinate-co-adipate, or polyethylene succinate.

The polynucleotide according to claim 5, wherein the plastic has an ester bond in a molecular structure.

The polynucleotide according to claim 5, wherein the plastic is a polyurethane.

The polynucleotide according to claim 5, wherein the plastic is polylactic acid, polybutylene succinate, polybutylene succinate-co-adipate, or polyethylene succinate.

A method for decomposing plastic, comprising a step of bringing the enzyme according to claim 1, 3 or 4 into contact with plastic.

The method according to claim 12, wherein the plastic has an ester bond in a molecular structure.

13. The method according to claim 12, wherein the plastic is a polyurethane.

13. The method of claim 12, wherein the plastic is polylactic acid, polybutylene succinate, polybutylene succinate-co-adipate, or polyethylene succinate.

A method for decomposing plastic, comprising the step of contacting a genetically modified cell expressing the enzyme according to claim 1, 3 or 4 with plastic.

17. The method for decomposing plastic according to claim 16, wherein the cells are Escherichia coli.

The method according to claim 16 or 17, wherein the plastic has an ester bond in a molecular structure.

The method according to claim 16 or 17, wherein the plastic is a polyurethane.

The method according to claim 16 or 17, wherein the plastic is polylactic acid, polybutylene succinate, polybutylene succinate-co-adipate, or polyethylene succinate.

A method for producing a recombinant enzyme, comprising:
(I) culturing a host cell containing a vector containing the polynucleotide sequence encoding the enzyme according to claim 1, 3 or 4 under conditions suitable for the growth of the host cell;
(J) separating and purifying the enzyme from the host cell;
A method for producing a recombinant enzyme comprising: