JP2004159556A

JP2004159556A - Method for producing cyclamen tuber, liquid medium used for the method, cyclamen tuber produced by the method and method for producing cyclamen seedling

Info

Publication number: JP2004159556A
Application number: JP2002328735A
Authority: JP
Inventors: Atsushi Kuboki; 篤久保木; Keiko Takahashi; 恵子高橋; Kichi Fuwa; 規智不破; Kenichiro Sugimura; 謙一郎杉村; Tomoko Terauchi; 知子寺内; Takashi Fujita; 孝藤田
Original assignee: Snow Brand Seed Co Ltd
Current assignee: Snow Brand Seed Co Ltd
Priority date: 2002-11-12
Filing date: 2002-11-12
Publication date: 2004-06-10
Anticipated expiration: 2022-11-12
Also published as: JP4316221B2

Abstract

<P>PROBLEM TO BE SOLVED: To provide a method for producing cyclamen tubers, by which cyclamen tubers that are directly planted in culture soil and germinated are produced without requiring more labor for cutting off leaf and stem parts and root parts of young plant bodies. <P>SOLUTION: The cyclamen tubers are produced by inducing calluses from tissue of cyclamen, culturing the calluses in a liquid medium exhibiting 220-750 mOsm osmotic pressure to induce the cyclamen tubers and enlarging the cyclamen tubers. Consequently, the cyclamen tubers enlarged into spherical shapes having 4-8 mm diameters are obtained. The cyclamen tubers are directly planted in culture soil, germinated and grown to simply produce a large amount of cyclamen seedlings without acclimation. <P>COPYRIGHT: (C)2004,JPO

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、シクラメン（本明細書において、「シクラメン」とは、シクラメン属植物Ｃｙｃｌａｍｅｎを意味する。）の組織培養によるシクラメン塊茎の生産方法、この方法に使用する液体培地、この方法により得られるシクラメン塊茎、およびこの塊茎を使用してシクラメン苗を生産する方法に関する。
【０００２】
【従来技術】
シクラメンは観賞用植物として日本で最も多く生産されている鉢物である。このシクラメンの繁殖は、従来、種子を採取し、播種して発芽させ、育苗することによって行われてきた。しかし、シクラメンは花色や草型等の形質の揃った優良品種を大量に生産することが困難な植物である。形質の固定を目的として自殖交配を繰り返すと草勢が劣化する等のいわゆる自殖弱勢が顕著に起こり、自殖系統間の交雑により一代雑種を育成することが困難である。また、自殖交配および兄姉交配を組み合わせることにより形質をある程度揃えた固定品種を育成することはできるものの、この場合にも近交弱勢により生長が遅く病害に弱い等の問題が生じている。
【０００３】
このような問題を解決するために、これまでに組織培養を利用したシクラメンの生産方法が提案されてきた。１つの方法として、シクラメン塊茎等の組織から不定芽を形成させ、この不定芽を増殖・育成することによりシクラメン苗を生産する方法が提案されている（特公平３−５３８９５号公報等）。しかし、これらの方法は小規模な培養器内での固形培地を利用した方法であり、不定芽の培養期間が長く、また培養中に枯死する不定芽の割合も高いため、効率的に不定芽を増殖することができない。
【０００４】
他の方法として、シクラメンの組織を培養して得たエンブリオジェニックカルス（「エンブリオジェニックカルス」とは、不定胚形成能を有するカルスを意味する。）から不定胚を分化させ、分化させた不定胚をさらに培養してシクラメン幼苗を生産する方法が提案されている。例えば、大谷らは、テーブルミニライラックローズの展開葉を一定の植物ホルモンを含む固形Ｌｉｓｍａｉｅｒ＆Ｓｋｏｏｇ（ＬＳ）培地で培養してエンブリオジェニックカルスを得、さらにエンブリオジェニックカルスを植物ホルモンを含まない固形ＬＳ培地で培養してカルス増殖と不定胚形成を続け、形成された不定胚を固形ＬＳ培地で照明下に培養することにより、塊茎様体を経て幼植物体を得る方法を報告している（ＰｌａｎｔＴｉｓｓｕｅＣｕｌｔｕｒｅＬｅｔｔｅｒｓ，８（２），ｐｐ１２１−１２３，１９９１参照）。また、大橋らは、品種ショパンＮｏ．１２の根を植物ホルモンを添加した固形Ｍｕｒａｓｈｉｇｅ＆Ｓｋｏｏｇ（ＭＳ）培地に置床してカルスを形成させ、形成したカルスを植物ホルモン無添加の固形ＭＳ培地に移植して幼植物体を得る方法を報告している（栃木県農業試験研究報告、第３９号、ｐｐ５７−７４、１９９２参照）。
【０００５】
不定胚を利用した生産方法は、上述の不定芽を利用した方法に比較して、多くの苗を低価格で短期間に生産できる点で優れている。しかし、上述の大谷らの方法および大橋らの方法は固形培地を使用しているため、培養のための広い空間や大型の温調設備等が必要となる。また、固形培地により培養して幼植物体を得る方法では、固形培地上で充分に生育させてからポットに鉢上げしなければ苗を得ることができない。そして鉢上げの際には手間のかかる馴化処理を行うことが必須である。
【０００６】
これに対し、液体培地による植物組織の培養は、固形培地による培養と比較して培養のための空間や温調設備等の節約が可能であり、かつ単位体積あたりの培養効率が高いことが知られており、液体培養を取り入れたシクラメンの生産方法も提案されている。
【０００７】
特開平５−２１１８２４号公報は、シクラメンの植物組織または細胞をピクロラムを含む液体培地によって培養することによりシクラメンを増殖させる方法を開示している。この公報には、固形培地で得たカルスを、３％のショ糖、２ｐｐｍピクロラムおよび２ｐｐｍのゼアチンを含む液体ＳＨ培地を使用して通気培養することにより、または同一組成の液体ＳＨ培地で培養した不定胚を植物ホルモンを含まない固形ＭＳ培地で培養することにより、塊茎様体が得られることが報告されている。
【０００８】
特開平５−２３６８３４号公報は、シクラメンの外植片を２，４−ジクロロフェノキシ酢酸（２，４−Ｄ）とカイネチンを含む固形培地で培養してカルスを形成させた後、ホルモンを含まない固形培地にて小瘤状の不定胚を誘導し、この不定胚を２，４−Ｄとカイネチンを含む液体培地にて培養し、得られた培養物から一定範囲の大きさの細胞塊のみを選別しながら継代培養するシクラメンの不定胚誘導方法を開示している。この公報には、ショ糖３％を含む固形ＭＳ培地で培養して小瘤状の不定胚を得、この不定胚を１ｐｐｍの２，４−Ｄ、０．０１ｐｐｍのカイネチンおよび５％のショ糖を含む液体ＬＳ培地で培養する例が記載されている。
【０００９】
特公平７−５５１１２号公報は、シクラメンの組織を培養して得たエンブリオジェニックカルスを液体培養する工程、および、得られたカルスをジベレリンを含む培地で培養して不定胚を形成させた後に得られた不定胚から幼植物体を再生成させる工程、からなるシクラメン幼植物体の再生方法を開示している。この公報には、固形培地で得たエンブリオジェニックカルスを、ショ糖２０〜１２０ｇ／ｌを含む液体培地で培養して増殖させた後、ジベレリンおよびショ糖２０〜１２０ｇ／ｌを含む固形ＭＳ培地で培養して不定胚を形成させ、さらに同一培地上で培養を続けることにより幼植物体を再生する方法が記載されている。
【００１０】
特開平６−１６９６６２号公報は、シクラメンの幼植物体の一部から形成させたカルスを固形培地上で培養してカルスを増殖させるＡ工程と、Ａ工程で増殖したカルスを液体培地中で培養して増殖させるＢ工程と、Ｂ工程で増殖させたカルスを培養して不定胚を形成させた後、不定胚から幼植物体を再生させるＣ工程と、Ｃ工程で得られた幼植物体を育成するＤ工程、からなるシクラメンの幼苗の大量生産方法を開示している。各工程の培地の炭素源としては、好ましくはショ糖を２０〜９０ｇ／ｌ、さらに好ましくはＡ工程およびＢ工程においては５０ｇ／ｌ、Ｃ工程およびＤ工程においては３０ｇ／ｌの濃度で使用するのがよいと記載されており、また、Ｃ工程およびＤ工程において使用される培地は固形培地であっても液体培地であってもよいが、Ｃ工程は固形培地、Ｄ工程は液体培地を使用するのが好ましいと記載されている。
【００１１】
また、組織培養によりシクラメンの保存用塊茎を生産する方法も開示されており、特開平７−１２３８８１号公報には、シクラメンの不定胚から再分化させた幼植物体を、炭素源として濃度２〜９％のショ糖を含有し、かつ植物ホルモンを含有しない液体培地中で培養することによって幼植物体の塊茎部を育成した後、幼植物体の葉茎部および根部を除去して保存用塊茎を得る方法が開示されている。
【００１２】
【特許文献１】
特公平３−５３８９５号公報
【特許文献２】
特開平５−２１１８２４号公報
【特許文献３】
特開平５−２３６８３４号公報
【特許文献４】
特公平７−５５１１２号公報
【特許文献５】
特開平６−１６９６６２号公報
【特許文献６】
特開平７−１２３８８１号公報
【非特許文献１】
“ＰｌａｎｔＴｉｓｓｕｅＣｕｌｔｕｒｅＬｅｔｔｅｒｓ”、（日本）、１９９１年、８巻、２号、ｐ１２１−１２３
【非特許文献２】
“栃木県農業試験研究報告”、（日本）、１９９２年、３９号、ｐ５７−７４
【００１３】
【発明が解決しようとする課題】
特開平５−２１１８２４号公報、特開平５−２３６８３４号公報、特公平７−５５１１２号公報、および特開平６−１６９６６２号公報に記載された方法は、カルス誘導・増殖工程および不定胚誘導工程のいずれかの工程において生産効率の高い液体培地による培養を採用しているが、全工程を通して液体培地を使用した方法ではない。また、ショ糖濃度の培養に与える影響については、詳細な記載がない。さらに、これらの公報には不定胚形成後幼植物体を得る工程については、詳細な記載が認められないか、または固形培地による培養を記載している。
【００１４】
しかし、固形培地により培養して幼植物体を得る方法では、上述のように、鉢上げの際に手間のかかる馴化処理を行うことが必須である。また、シクラメンの幼植物体を生長抑制のために低温下に置くと、葉茎部や根部に障害が生じ、保存中に枯死したりまたは雑菌汚染などにより生育不良となる恐れがあり、シクラメンの幼植物体を保存することが難しく、そのためシクラメン鉢物の出荷時期に合わせて幼植物体を生産する必要がある。また、幼植物体の大量搬送は嵩張り手間を要する。
【００１５】
これに対し、特開平７−１２３８８１号公報に記載されたシクラメンの保存用塊茎の生産方法によると、塊茎を保存することによりシクラメン鉢物の出荷時期に合わせて塊茎を生産する必要がなくなり、また塊茎の大量搬送が容易となるため好ましい。しかし、この方法では幼植物体の葉茎部および根部を除去しなければならないため、多大な労力が必要とされる。
【００１６】
そこで、本発明の課題は、幼植物体の葉茎部および根部を除去するという多大な労力を必要とせず収集・保存することができ、かつ発芽率の高いシクラメン塊茎を提供することである。
【００１７】
また、本発明の別の目的は、種子と同様の条件で定植することにより簡便かつ大量にシクラメン苗を生産する方法を提供することである。
【００１８】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは上記課題を解決すべく鋭意研究を行った結果、シクラメンの組織から誘導したカルスを培養してシクラメン塊茎を誘導する際に、浸透圧を一定の範囲に調整した液体培地を使用すれば、シクラメン塊茎の発芽・発根を抑制して均一に肥大させることができることを見出し、本発明を完成させた。
【００１９】
すなわち、本発明は、まず、シクラメンの組織からカルスを誘導し、該カルスを２２０〜７５０ｍＯｓｍ（ミリオスモル）の範囲の浸透圧を示す液体培地中で培養することによりシクラメン塊茎を誘導して肥大させることを特徴とするシクラメン塊茎の生産方法である。浸透圧が２２０〜７５０ｍＯｓｍの範囲に調節された液体培地を使用することにより、シクラメン塊茎を均一に肥大させることができ、しかも発芽・発根の程度を顕著に抑えることができる。従って、塊茎を収集し保存するにあたって、幼植物体の葉茎部と根部を切除するという多大な労力を必要としない。また、シクラメン鉢物の出荷時期に合わせて組織培養する必要もない。また、シクラメンの組織からカルスを誘導する際に、２２０〜７５０ｍＯｓｍの範囲の浸透圧を示す液体培地または固形培地を使用すると、塊茎の獲得率が高まるため好ましい。
【００２０】
本発明のシクラメン塊茎の生産方法に使用される液体培地は、無機成分よび炭素源を少なくとも含んでおり、単糖、二糖、オリゴ糖、水溶性多糖、糖アルコール、水溶性高級アルコール、またはこれらの混合物から選択された浸透圧調整剤を含有しており、浸透圧が２２０〜７５０ｍＯｓｍである液体培地である。尚、本明細書において、「浸透圧調整剤」とは、組織や細胞の生育のための栄養成分として添加されるのではなく、浸透圧を調整する目的で添加される、水溶性の化合物を意味する。
【００２１】
本発明の生産方法により得られたシクラメン塊茎は、従来の固形培地上で培養する方法により生産された幼植物体よりも高い乾燥耐性を有するため、特別な馴化処理を施さなくても、種子と同様の条件で栽培することにより簡便にシクラメン苗を生産することが可能であり、その結果、均一性の高いシクラメン鉢物を簡便かつ大量に生産することができる。得られたシクラメン塊茎を培養土に定植した後の発芽率は約５０％以上になる。従って、本発明はまた、上述の生産方法によって得られる実質的に発芽・発根していないシクラメン塊茎、および、このシクラメン塊茎を培養土に定植し、塊茎を発芽・発根させて育苗することを特徴とするシクラメン苗の生産方法をも提供する。
【００２２】
【発明の実施の形態】
以下に、図１に示したシクラメン塊茎の製造方法の概略図を参照しながら、本発明を詳細に説明する。
【００２３】
本発明において使用することができるシクラメンの品種としては、ビクトリア、バーバーグ、ピュアホワイト、ピアス、パステル、ミニシクラメン等が挙げられるが、本発明はこれらの品種に限定されるものではない。また、外植片として培養に供することができるシクラメン組織としては、例えば、次亜塩素酸ナトリウム溶液等で表面を殺菌した後滅菌水で洗浄した開花株の葉身、葉柄、塊茎、葯基部、花柱等の各組織、または、次亜塩素酸ナトリウム溶液等で表面を殺菌した後滅菌水で洗浄した種子を無菌的に固形培地に定植して得られる無菌幼植物の各組織、あるいは、これらの各組織を培養して得られる不定芽の葉身、葉柄等を挙げることができる。
【００２４】
上述の不定芽は公知の方法によって得ることができ、例えば、無機成分の濃度を３分の１に希釈したＭＳ培地（１／３ＭＳ培地）に０〜２．０ｍｇ／ｌ濃度の１−ナフタレン酢酸（ＮＡＡ）および０．１〜２．０ｍｇ／ｌ濃度の６−ベンジルアミノプリン（ＢＡ）、２０〜６０ｇ／ｌ、好ましくは３０〜５０ｇ／ｌのショ糖、３ｇ／ｌのジェランガムを添加して調整した固形ＭＳ培地に、無菌幼植物や開花株の各組織を置床することにより誘導することができる。
【００２５】
図１に示すように、上述の各組織を培養することによりカルスを誘導する。カルスは公知の方法で誘導することができ、例えば、ＭＳ培地に１〜１０ｍｇ／ｌのオーキシンおよび０〜０．１ｍｇ／ｌのサイトカイニン、２０〜１２０ｇ／ｌのショ糖、３ｇ／ｌのジェランガムを添加して調整した固形ＭＳ培地に、葉身などを５〜１０ｍｍ四方に切断して置床することによって誘導することができる。もしくは、同組成でジェランガムを添加しない液体培地に組織を直接投入してもよい。いずれの場合も２５℃、暗所で１〜３ケ月間培養することにより、図２に示すようなカルスが得られる。
【００２６】
尚、シクラメン組織を培養することによりカルスを誘導する際には、以下に示すような２２０〜７５０ｍＯｓｍの範囲の浸透圧を示す液体培地を使用することができ、または、この液体培地にジェランガム、寒天、アガロース等を添加して固化させた固形培地を使用することもできる。浸透圧を２２０〜７５０ｍＯｓｍの範囲に調整すると、塊茎の獲得率が向上するため好ましい。
【００２７】
本発明では、得られたカルスを２２０〜７５０ｍＯｓｍの範囲の浸透圧を示す液体培地を使用して培養し、懸濁細胞、不定胚を経て塊茎を得る（図１参照）。尚、本明細書において、「懸濁細胞」とは、液体培地中に懸濁した状態で増殖させた細胞塊（増殖したカルス）を意味する。液体培地の浸透圧を２２０〜７５０ｍＯｓｍの範囲に保つことにより、塊茎の発芽・発根を抑制することができ、塊茎を均一に肥大させることができる。得られた塊茎は、種子と同様の条件で培養土に定植することにより発芽する。シクラメン塊茎の発芽率は約５０％を超える。浸透圧が２２０ｍＯｓｍより小さいと塊茎が膨潤し、また７５０ｍＯｓｍより大きいと塊茎が肥大しにくくなりまたは褐変する傾向があるため、得られた塊茎を培養土に定植した後の発芽率が低下する。
【００２８】
本発明において、培養に使用する液体培地の浸透圧は、培地に添加される全成分、即ち、組織や細胞の生育に必要な無機成分および炭素源、必要に応じて添加される植物ホルモン、ビタミン、アミノ酸等の他、浸透圧を調整するために添加される浸透圧調整剤、の全ての成分によって決定される。
【００２９】
液体培地には、組織や細胞の生育に必要な無機成分が必須成分として含まれている。無機成分としては、Ｎ、Ｐ、Ｋ、Ｎａ、Ｃａ、Ｍｇ、Ｓ、Ｆｅ、Ｍｎ、Ｚｎ、Ｂ、Ｍｏ、Ｃｌ、Ｉ、Ｃｏ等の元素を含む無機成分、例えば、硝酸カリウム、硝酸アンモニウム、燐酸二水素カリウム、硫酸第一鉄、塩化カルシウム、硫酸マグネシウム等が挙げられる。これらの無機成分を含有する一般的に用いられる植物培養用培地を特に制限なく使用することができる。例えば、ＭＳ培地、Ｗｈｉｔｅ培地、ＬＳ培地、ＧａｍｂｏｒｇのＢ５培地、ニッチ−ニッチ培地、Ｎ６培地等を使用することができる。特に、ＭＳ培地、１／３ＭＳ培地を使用するのが好ましい。
【００３０】
液体培地にはまた、組織や細胞の生育に必要な炭素源が必須成分として含まれている。炭素源としては、ショ糖、ブドウ糖、果糖等の糖を挙げることができ、好ましくはショ糖を使用する。炭素源としてのショ糖の濃度は、２０〜１２０ｇ／ｌが好ましい。
【００３１】
液体培地にはさらに、必要に応じて、少量の植物ホルモン、ビタミン、アミノ酸その他の慣用的に使用される添加物等が添加されていてもよい。使用される植物ホルモンとしては、例えば、ＮＡＡ、２，４−Ｄ、３−インドール酢酸（ＩＡＡ）等のオーキシン（濃度：０〜１０ｍｇ／ｌ）やＢＡ、カイネチン、ゼアチン等のサイトカイニン（濃度：０〜１．０ｍｇ／ｌ）が挙げられる。また、ビタミン類としては、ビタミンＢ１、Ｂ２、Ｂ６、Ｃ等（濃度：０〜１５０ｍｇ／ｌ）を例示することができる。アミノ酸類としては、グリシン、アラニン、システイン、リシン等（濃度：０〜１０００ｍｇ／ｌ）を例示することができる。
【００３２】
使用される液体培地には、さらに、浸透圧を２２０〜７５０ｍＯｓｍに調整するための浸透圧調整剤が含まれる。浸透圧調整剤としては、ブドウ糖、果糖等の単糖；麦芽糖、ショ糖等の二糖；ガラクトオリゴ糖等のオリゴ糖；カルボキシメチルセルロース等の水溶性多糖；ソルビット、マンニット等の糖アルコール；グリセリン等の水溶性高級アルコール；またはこれらの混合物を挙げることができる。浸透圧調整剤は、上述の無機成分および炭素源と同じ化合物であってもよい。浸透圧調整剤としては、グリセリンまたはマンニットが好ましい。グリセリンは１０〜４０ｇ／ｌの濃度で、マンニットは２０〜８０ｇ／ｌの濃度で使用する。
【００３３】
上述のように、液体培地の浸透圧は、液体培地に添加された成分の全体によって決定される。また液体培地のｐＨは、４．０〜７．０、好ましくは５．８に調整される。ｐＨが４．０より小さい場合にも７．０より大きい場合にも生育障害が生じやすくなる。
【００３４】
本発明では、図１に示すように、カルスから懸濁細胞を誘導する。この際、上述の２２０〜７５０ｍＯｓｍの浸透圧を示すように調整された液体培地、好ましくは２０〜１２０ｇ／ｌのショ糖、１０〜４０ｇ／ｌのグリセリンまたは２０〜８０ｇ／ｌのマンニット、１〜１０ｍｇ／ｌのオーキシンおよび０〜１．０ｍｇ／ｌのサイトカイニンを含む浸透圧２２０〜７５０ｍＯｓｍの液体ＭＳ培地にカルスを導入し、暗所にて培養することにより行う。培養は、１０〜３０℃、好ましくは２０〜２５℃の範囲の温度下で行う。温度が１０℃より低い場合にも３０℃より高い場合にも生育障害が発生しやすくなる。また、液体培養は、回転振盪培養機で１分間に６０〜１２０回、好ましくは１分間に８０〜１００回の回転培養条件下で行うが、ボトルローラー式培養器、ジャーファーメンター等を使用して行うこともできる。２〜４週間培養すると、図３に示すような懸濁細胞を得ることができる。
【００３５】
次に、図１に示すように、上述の２２０〜７５０ｍＯｓｍの浸透圧を示すように調整された液体培地、好ましくは２０〜１２０ｇ／ｌのショ糖、１０〜４０ｇ／ｌのグリセリンまたは２０〜８０ｇ／ｌのマンニット、０〜１ｍｇ／ｌのオーキシンおよび０〜１．０ｍｇ／ｌのサイトカイニンを含む浸透圧２２０〜７５０ｍＯｓｍの液体ＭＳ培地に懸濁細胞を継代し、暗所、１０〜３０℃、好ましくは２０〜２５℃の温度下で、１分間に６０〜１２０回、好ましくは１分間に８０〜１００回の回転培養条件で４〜８週間培養すると、図４に示すような不定胚が分化する。
【００３６】
さらに、図１に示すように、上述の２２０〜７５０ｍＯｓｍの浸透圧を示すように調整された液体培地、好ましくは２０〜１２０ｇ／ｌのショ糖、１０〜４０ｇ／ｌのグリセリンまたは２０〜８０ｇ／ｌのマンニット、０〜１ｍｇ／ｌのオーキシンおよび０〜１．０ｍｇ／ｌのサイトカイニンを含む浸透圧２２０〜７５０ｍＯｓｍの液体１／３ＭＳ培地に不定胚を継代し、暗所、１０〜３０℃、好ましくは２０〜２５℃の温度下で、１分間に６０〜１２０回、好ましくは１分間に８０〜１００回の回転培養条件で４〜１２週間培養すると、図５に示すような小塊茎が誘導される。
【００３７】
本発明によると、図５に示すような発芽・発根が抑制されている肥大したシクラメン塊茎が得られる。特に、実質的に発芽・発根しておらずかつ直径が４〜８ｍｍの球形に肥大したシクラメン塊茎は、培養土に定植した後の発芽率が高く、発芽後に良好な苗へと導く。
【００３８】
得られた塊茎は滅菌済みの容器を用いて密閉して保存することができる。また、図１に示すように、種子と同様の条件で定植することにより発芽させることができる。即ち、水で湿潤したシクラメン発芽用の培養土、例えばバーミキュライト、ピートモス、パーライト等を充填したポットまたはプラグトレー等に塊茎を植付け、温度を１０〜２５℃、好ましくは２０℃に維持すると発芽し、簡便かつ大量に図６に示すようなシクラメン苗を生産することができる。固形培地上で培養して得た幼植物体を使用する場合のような、鉢上げの際の手間のかかる馴化処理は行う必要がない。
【００３９】
【実施例】
以下、本発明の実施例を示すが、本発明はこれに限定されるものではない。
【００４０】
実施例１：浸透圧調整剤としてのグリセリンを添加した液体培地を使用したシクラメン塊茎の誘導
▲１▼カルスの誘導
シクラメン（品種ビクトリア）の開花株の展開葉を７０％エタノール溶液に１０秒間浸漬した後に、有効塩素濃度１％の次亜塩素酸ナトリウム溶液に１５分間浸漬して殺菌処理を行った。次いで、この葉を滅菌水で３回洗浄して表面の次亜塩素酸ナトリウムを除去した。洗浄後の葉を約５ｍｍ四方に切断し、ＭＳ培地に１０ｍｇ／ｌのＮＡＡ、０．１ｍｇ／ｌのカイネチン、３０ｇ／ｌのショ糖を添加してｐＨ５．８とし、さらに３ｇ／ｌのジェランガムを添加してオートクレーブで滅菌処理した固形ＭＳ培地に置床した。これを、２５℃、暗所にて２ケ月間培養してカルスを得た。
【００４１】
▲２▼懸濁細胞の誘導
ＭＳ培地にＮＡＡを１０ｍｇ／ｌ、カイネチンを０．１ｍｇ／ｌ添加し、これにショ糖を３０ｇ／ｌとグリセリンをそれぞれ１０、２０、３０、４０ｇ／１加え、ｐＨ５．８とし、オートクレーブで滅菌処理して液体培地を調整した。カルスをこの液体培地に懸濁して、２５℃、暗所にて、１分間に８０〜１００回の回転培養条件で２〜４週間培養することにより、懸濁細胞を誘導した。
【００４２】
▲３▼不定胚の誘導
ＭＳ培地にＮＡＡを０．１ｍｇ／ｌ、カイネチンを０．１ｍｇ／１添加し、これにショ糖を３０ｇ／１とグリセリンをそれぞれ１０、２０、３０、４０ｇ／ｌ加え、ｐＨ５．８とし、オートクレーブで滅菌処理して液体培地を調整した。細胞を１０００Ｇで遠心分離し、この液体培地に再懸濁した。２週間毎に新鮮培地に継代し、６週間振盪培養することにより不定胚を誘導した。
【００４３】
▲４▼塊茎の誘導
１／３ＭＳ培地にＮＡＡを０．１ｍｇ／ｌ、カイネチンを０．１ｍｇ／ｌ添加し、これにショ糖を３０ｇ／１とグリセリンをそれぞれ１０、２０、３０、４０ｇ／ｌ加え、ｐＨ５．８とし、オートクレーブで滅菌処理して液体培地を調整した。不定胚を集めてこの液体培地に再懸濁した。２週間毎に新鮮培地に継代し、１２週間振盪培養して塊茎を誘導した。
【００４４】
▲５▼塊茎の発芽
このようにして得られた発芽・発根していないシクラメン塊茎を、シクラメン発芽用の培養土を充填したポットに定植し、適度な水分を与え、２０℃、暗所にて発芽させた。発芽した塊茎の割合を調べた。以下の表１に、各液体培地の浸透圧および発芽した塊茎の割合（発芽率）を示す。
【００４５】
実施例２：浸透圧調整剤としてのマンニットを添加した液体培地を使用したシクラメン塊茎の誘導
使用する培地のショ糖濃度が３０ｇ／１であり、浸透圧調整剤としてマンニットをそれぞれ２０、４０、６０、８０ｇ／１添加した以外は、上記実施例１と同様に培養して塊茎を得た。これを実施例１と同様にシクラメン発芽用の培養土に定植して発芽させ、発芽した塊茎の割合を算出した。以下の表１に、各液体培地の浸透圧および発芽した塊茎の割合（発芽率）を示す。
【００４６】
比較例１：
使用する培地のショ糖濃度が３０ｇ／ｌであり、ショ糖以外の浸透圧調整剤を培地に添加しない以外は、上記実施例１と同様に培養して塊茎を得た。これを実施例１と同様にシクラメン発芽用の培養土に定植して発芽させ、発芽した塊茎の割合を算出した。以下の表１に、各液体培地の浸透圧および発芽した塊茎の割合（発芽率）を示す。
【００４７】
【表１】

１）発芽率＝茎葉が展開した数÷定植した数×１００
【００４８】
【発明の効果】
以上説明したように、シクラメンの組織または脱分化組織を２２０〜７５０ｍＯｓｍの範囲の浸透圧を示す液体培地中で培養して、懸濁細胞、不定胚を経てシクラメン塊茎を誘導することにより、発芽・発根を抑制して塊茎を均一に肥大させることができ、塊茎を収集し保存するにあたって、幼植物体の葉茎部と根部を切除するという多大な労力を必要としない。また、得られたシクラメン塊茎は従来の方法で生産された幼植物体よりも高い乾燥耐性を有するため、特別な馴化処理を施さなくても、種子と同様の条件で栽培することにより簡便にシクラメン苗を生産することが可能であり、その結果、均一性の高いシクラメン鉢物を大量に生産することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明のシクラメン塊茎の生産方法の概略を示した図である。
【図２】塊茎誘導に使用するカルスの生物の形態の写真である。
【図３】塊茎誘導の過程で得られる懸濁細胞の生物の形態の写真である。
【図４】塊茎誘導の過程で得られる不定胚の生物の形態の写真である。
【図５】本発明において得られるシクラメン塊茎の生物の形態の写真である。
【図６】シクラメン塊茎を定植して得られる苗の様子を示した生物の形態の写真である。[0001]
TECHNICAL FIELD OF THE INVENTION
The present invention relates to a method for producing cyclamen tubers by tissue culture of cyclamen (herein, “cyclamen” means a cyclamen plant Cyclamen), a liquid medium used in this method, and a cyclamen obtained by this method. Tuber and a method for producing cyclamen seedlings using the tuber.
[0002]
[Prior art]
Cyclamen are the most frequently produced ornamental plants in Japan. Conventionally, cyclamen have been propagated by collecting seeds, sowing them, germinating them, and raising them. However, cyclamen is a plant in which it is difficult to mass-produce excellent varieties with uniform characteristics such as flower color and plant type. When self-breeding is repeated for the purpose of fixing traits, so-called weak self-breeding, such as deterioration of grass, occurs remarkably, and it is difficult to grow a first-generation hybrid by crossing between self-breeding lines. In addition, although it is possible to breed fixed varieties with a certain degree of traits by combining self-breeding and sibling mating, in this case, too, inbreeding weakness causes slow growth and weakness to disease.
[0003]
In order to solve such a problem, a method for producing cyclamen using tissue culture has been proposed. As one method, a method has been proposed in which adventitious buds are formed from tissues such as cyclamen tubers and cyclamen seedlings are produced by growing and growing the adventitious shoots (Japanese Patent Publication No. 3-53895). However, these methods use a solid medium in a small-scale incubator, and the culture period of adventitious shoots is long, and the proportion of adventitious shoots that die during culture is high, so that adventitious shoots can be efficiently performed. Cannot grow.
[0004]
As another method, an adventitious embryo obtained by differentiating an adventitious embryo from an embryogenic callus obtained by culturing a cyclamen tissue (“embryogenic callus” means a callus having an adventitious embryogenic ability) is obtained. Is further cultured to produce cyclamen seedlings. For example, Otani et al. Cultivated the developed leaves of table mini lilac rose in a solid Lismeier & Skoog (LS) medium containing a certain plant hormone to obtain an embryogenic callus, and further obtained the embryogenic callus in a solid LS medium containing no plant hormone. A method of obtaining seedlings through tuber-like bodies by culturing to continue callus growth and adventitious embryo formation and culturing the formed adventitious embryos in a solid LS medium under illumination (Plant Tissue Culture) has been reported. Letters, 8 (2), pp 121-123, 1991). Also, Ohashi et al. Reported is a method in which twelve roots are placed on a solid Murashige & Skoog (MS) medium supplemented with plant hormones to form calli, and the formed callus is transplanted to a solid MS medium without plant hormones to obtain a young plant. (See Tochigi Prefectural Agricultural Research Report No. 39, pp. 57-74, 1992).
[0005]
The production method using the adventitious embryo is superior to the method using the adventitious bud in that many seedlings can be produced at a low price in a short period of time. However, since the methods of Otani et al. And Ohashi et al. Described above use a solid medium, a large space for cultivation, large-scale temperature control equipment, and the like are required. In the method of culturing on a solid medium to obtain a young plant, seedlings cannot be obtained unless the seedlings are sufficiently grown on the solid medium and then raised to a pot. In addition, it is indispensable to perform a troublesome acclimatization process at the time of raising the pot.
[0006]
On the other hand, it is known that the cultivation of plant tissue using a liquid medium can save space for culturing, temperature control equipment, and the like, and that the culturing efficiency per unit volume is high as compared with culturing using a solid medium. A method for producing cyclamen using liquid culture has also been proposed.
[0007]
JP-A-5-212824 discloses a method of growing cyclamen by culturing cyclamen plant tissues or cells in a liquid medium containing picloram. According to this publication, callus obtained on a solid medium was cultured by aeration using a liquid SH medium containing 3% sucrose, 2 ppm picloram and 2 ppm zeatin, or cultured in a liquid SH medium having the same composition. It has been reported that tuber-like bodies can be obtained by culturing somatic embryos in a solid MS medium containing no plant hormone.
[0008]
JP-A-5-236834 discloses that a cyclamen explant is cultured in a solid medium containing 2,4-dichlorophenoxyacetic acid (2,4-D) and kinetin to form a callus and then contains no hormone. Nodular adventitious embryos are induced in a solid medium, and the adventitious embryos are cultured in a liquid medium containing 2,4-D and kinetin, and only a cell mass of a certain range in size is obtained from the obtained culture. A method for inducing somatic embryos of cyclamen to be subcultured while selecting is disclosed. In this publication, a nodular somatic embryo is obtained by culturing in a solid MS medium containing 3% of sucrose, and the somatic embryo is prepared by adding 1 ppm of 2,4-D, 0.01 ppm of kinetin and 5% of sucrose. An example of culturing in a liquid LS medium containing
[0009]
Japanese Patent Publication No. 7-55112 discloses a process of liquid culturing an embryogenic callus obtained by culturing cyclamen tissue, and a method of culturing the obtained callus in a medium containing gibberellin to form an adventitious embryo. A method of regenerating a young plant from the somatic embryo obtained. According to this publication, an embryogenic callus obtained on a solid medium is cultured and grown on a liquid medium containing 20 to 120 g / l of sucrose, and then cultured on a solid MS medium containing gibberellin and 20 to 120 g / l of sucrose. A method of regenerating a young plant by culturing to form an adventitious embryo and continuing culturing on the same medium is described.
[0010]
JP-A-6-169662 discloses a step A in which callus formed from a part of a young plant of cyclamen is cultured on a solid medium to grow callus, and a step in which the callus grown in step A is cultured in a liquid medium. Step B of culturing the callus grown in Step B to form an adventitious embryo, and then regenerating the seedling from the adventitious embryo. It discloses a method for mass-producing cyclamen seedlings, comprising a D step of growing. As a carbon source for the medium in each step, sucrose is preferably used at a concentration of 20 to 90 g / l, more preferably 50 g / l in steps A and B, and 30 g / l in steps C and D. The medium used in step C and step D may be a solid medium or a liquid medium, but step C uses a solid medium and step D uses a liquid medium. Is stated to be preferred.
[0011]
Further, a method for producing a tuber for preservation of cyclamen by tissue culture has also been disclosed. Japanese Patent Application Laid-Open No. 7-123881 discloses that a young plant regenerated from an adventitious embryo of cyclamen has a concentration of 2 to 2 as a carbon source. After cultivating the tubers of the young plant by culturing in a liquid medium containing 9% sucrose and no plant hormone, the tubers for preservation by removing the leaf stem and the root of the young plant are removed. Are disclosed.
[0012]
[Patent Document 1]
Japanese Patent Publication No. 3-53895
[Patent Document 2]
JP-A-5-212824
[Patent Document 3]
JP-A-5-236834
[Patent Document 4]
Japanese Patent Publication No. 7-55112
[Patent Document 5]
JP-A-6-169662
[Patent Document 6]
JP-A-7-123881
[Non-patent document 1]
"Plant Tissue Culture Letters", (Japan), 1991, Vol. 8, No. 2, p. 121-123.
[Non-patent document 2]
"Tochigi Agricultural Experiment Research Report", (Japan), 1992, No. 39, pp. 57-74.
[0013]
[Problems to be solved by the invention]
The methods described in JP-A-5-212824, JP-A-5-236834, JP-B-7-55112, and JP-A-6-169662 disclose a method for inducing and growing callus and inducing somatic embryos. Cultivation in a liquid medium with high production efficiency is adopted in any of the steps, but it is not a method using a liquid medium throughout all steps. Further, there is no detailed description of the effect of sucrose concentration on culture. Further, in these publications, there is no detailed description of the step of obtaining a young plant after somatic embryo formation, or the culture in a solid medium is described.
[0014]
However, in the method of culturing in a solid medium to obtain a young plant, as described above, it is indispensable to perform a complicated acclimatization process at the time of raising the pot. In addition, if the cyclamen seedlings are placed at low temperatures to suppress growth, the leaf stems and roots may be damaged, and they may die during storage or become poorly grown due to contamination by various bacteria. It is difficult to store the seedlings, so it is necessary to produce the seedlings in time for the cyclamen pots to be shipped. In addition, bulk transport of young plants requires bulky labor.
[0015]
On the other hand, according to the method for producing tubers for storing cyclamen described in Japanese Patent Application Laid-Open No. 7-123881, it is not necessary to produce tubers at the time of shipment of cyclamen pots by storing tubers, and This is preferable because it facilitates large-volume transport of the product. However, this method requires a great deal of effort because the leaf stem and root of the young plant must be removed.
[0016]
Therefore, an object of the present invention is to provide a cyclamen tuber that can be collected and stored without requiring a great deal of labor for removing the leaf stem and root of the young plant and has a high germination rate.
[0017]
Another object of the present invention is to provide a method for producing cyclamen seedlings easily and in large quantities by planting them under the same conditions as for seeds.
[0018]
[Means for Solving the Problems]
The present inventors have conducted intensive studies to solve the above problems, and as a result, when culturing callus derived from cyclamen tissue to induce cyclamen tubers, use a liquid medium with osmotic pressure adjusted to a certain range The present inventors have found that germination and rooting of cyclamen tubers can be suppressed and the cyclamen tuber can be uniformly enlarged, thereby completing the present invention.
[0019]
That is, the present invention firstly induces callus from cyclamen tissue and induces the callus to grow by incubating the callus in a liquid medium having an osmotic pressure in the range of 220 to 750 mOsm (milliosmol). A method for producing cyclamen tubers, characterized in that: By using a liquid medium whose osmotic pressure is adjusted in the range of 220 to 750 mOsm, cyclamen tubers can be uniformly enlarged, and the degree of germination and rooting can be significantly suppressed. Therefore, collecting and preserving tubers does not require a great deal of labor to cut off the leaf stem and root of the young plant. In addition, there is no need to carry out tissue culture at the time of shipment of the cyclamen pot. In addition, when inducing callus from cyclamen tissue, it is preferable to use a liquid medium or a solid medium having an osmotic pressure in the range of 220 to 750 mOsm because the tuber acquisition rate increases.
[0020]
The liquid medium used in the cyclamen tuber production method of the present invention contains at least an inorganic component and a carbon source, and is a monosaccharide, disaccharide, oligosaccharide, water-soluble polysaccharide, sugar alcohol, water-soluble higher alcohol, or Is a liquid medium containing an osmotic pressure regulator selected from the following mixture, and having an osmotic pressure of 220 to 750 mOsm. In this specification, the term "osmotic pressure adjusting agent" refers to a water-soluble compound that is not added as a nutrient component for the growth of tissues or cells but is added for the purpose of adjusting the osmotic pressure. means.
[0021]
The cyclamen tuber obtained by the production method of the present invention has higher drought tolerance than the seedlings produced by the conventional method of culturing on a solid medium, so that the seeds and seeds do not need to be subjected to special acclimation treatment. By cultivating under the same conditions, cyclamen seedlings can be easily produced, and as a result, highly uniform cyclamen pots can be produced easily and in large quantities. The germination rate after planting the obtained cyclamen tubers in the culture soil is about 50% or more. Therefore, the present invention also provides a substantially non-germinated and rooted cyclamen tuber obtained by the above-described production method, and a method of planting the cyclamen tuber in a culture soil and germinating and rooting the tuber to grow a seedling. The present invention also provides a method for producing cyclamen seedlings.
[0022]
BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION
Hereinafter, the present invention will be described in detail with reference to the schematic diagram of the method for producing cyclamen tubers shown in FIG.
[0023]
Cyclamen varieties that can be used in the present invention include Victoria, Barberg, Pure White, Piercing, Pastel, Mini Cyclamen, and the like, but the present invention is not limited to these varieties. As the cyclamen tissue that can be used for culture as an explant, for example, the leaf blade, petiole, tuber, anther base, of a flowering strain that has been sterilized on the surface with a sodium hypochlorite solution and then washed with sterile water, Each tissue such as a style, or each tissue of a sterile seedling obtained by aseptically planting seeds washed with sterile water after sterilizing the surface with a sodium hypochlorite solution or the like, or these Leaf blades and petioles of adventitious buds obtained by culturing each tissue can be mentioned.
[0024]
The adventitious shoots described above can be obtained by a known method. For example, 0-2.0 mg / l concentration of 1-naphthaleneacetic acid is added to an MS medium (1 / 3MS medium) in which the concentration of the inorganic component is reduced to one third. (NAA) and 0.1-2.0 mg / l concentration of 6-benzylaminopurine (BA), 20-60 g / l, preferably 30-50 g / l sucrose, 3 g / l gellan gum It can be induced by placing each tissue of a sterile young plant or a flowering strain on the adjusted solid MS medium.
[0025]
As shown in FIG. 1, callus is induced by culturing each of the above tissues. Calli can be induced by known methods. For example, 1 to 10 mg / l auxin and 0 to 0.1 mg / l cytokinin, 20 to 120 g / l sucrose, and 3 g / l gellan gum in MS medium. It can be induced by cutting a leaf blade or the like into a square of 5 to 10 mm and placing it on a solid MS medium prepared by addition. Alternatively, the tissue may be directly introduced into a liquid medium having the same composition and without adding gellan gum. In any case, callus as shown in FIG. 2 is obtained by culturing at 25 ° C. in a dark place for 1 to 3 months.
[0026]
When the callus is induced by culturing the cyclamen tissue, a liquid medium having an osmotic pressure in the range of 220 to 750 mOsm as shown below can be used. Alternatively, gellan gum, agar may be used in this liquid medium. , Agarose or the like can be used to solidify the solid medium. Adjusting the osmotic pressure in the range of 220 to 750 mOsm is preferable because the tuber acquisition rate is improved.
[0027]
In the present invention, the obtained callus is cultured using a liquid medium having an osmotic pressure in the range of 220 to 750 mOsm, and tubers are obtained through suspension cells and somatic embryos (see FIG. 1). In this specification, the term “suspended cells” refers to a cell mass (proliferated callus) grown in a state suspended in a liquid medium. By maintaining the osmotic pressure of the liquid medium in the range of 220 to 750 mOsm, germination and rooting of tubers can be suppressed, and tubers can be uniformly enlarged. The obtained tubers germinate by planting them in a culture soil under the same conditions as the seeds. The germination rate of cyclamen tubers exceeds about 50%. When the osmotic pressure is smaller than 220 mOsm, the tubers swell, and when the osmotic pressure is larger than 750 mOsm, the tubers tend not to enlarge or brown, so that the germination rate after the obtained tubers are planted in the culture soil decreases.
[0028]
In the present invention, the osmotic pressure of the liquid medium used for culturing is controlled by all components added to the medium, that is, inorganic components and carbon sources necessary for the growth of tissues and cells, and plant hormones and vitamins added as necessary. , An amino acid, etc., and an osmotic pressure adjusting agent added to adjust the osmotic pressure.
[0029]
The liquid medium contains, as essential components, inorganic components necessary for the growth of tissues and cells. Examples of the inorganic component include inorganic components including elements such as N, P, K, Na, Ca, Mg, S, Fe, Mn, Zn, B, Mo, Cl, I, and Co, such as potassium nitrate, ammonium nitrate, and diphosphate. Examples thereof include potassium hydrogen, ferrous sulfate, calcium chloride, and magnesium sulfate. A commonly used plant culture medium containing these inorganic components can be used without particular limitation. For example, MS medium, White medium, LS medium, Gamburg's B5 medium, niche-niche medium, N6 medium and the like can be used. In particular, it is preferable to use an MS medium and a 1 / 3MS medium.
[0030]
The liquid medium also contains a carbon source necessary for the growth of tissues and cells as an essential component. Examples of the carbon source include sugars such as sucrose, glucose, and fructose, and sucrose is preferably used. The concentration of sucrose as a carbon source is preferably 20 to 120 g / l.
[0031]
If necessary, a small amount of plant hormones, vitamins, amino acids, and other commonly used additives may be added to the liquid medium. Examples of the plant hormone used include auxins (concentration: 0 to 10 mg / l) such as NAA, 2,4-D, and 3-indoleacetic acid (IAA), and cytokinins (concentration: 0) such as BA, kinetin, and zeatin. To 1.0 mg / l). Examples of vitamins include vitamins B1, B2, B6, and C (concentration: 0 to 150 mg / l). Examples of the amino acids include glycine, alanine, cysteine, lysine and the like (concentration: 0 to 1000 mg / l).
[0032]
The liquid medium used further contains an osmotic pressure adjusting agent for adjusting the osmotic pressure to 220 to 750 mOsm. Examples of the osmotic pressure adjusting agent include monosaccharides such as glucose and fructose; disaccharides such as maltose and sucrose; oligosaccharides such as galactooligosaccharides; water-soluble polysaccharides such as carboxymethylcellulose; sugar alcohols such as sorbit and mannitol; Or a mixture thereof. The osmotic pressure adjusting agent may be the same compound as the above-mentioned inorganic component and carbon source. Glycerin or mannitol is preferred as the osmotic pressure adjusting agent. Glycerin is used at a concentration of 10-40 g / l and mannitol at a concentration of 20-80 g / l.
[0033]
As described above, the osmotic pressure of the liquid medium is determined by the total components added to the liquid medium. The pH of the liquid medium is adjusted to 4.0 to 7.0, preferably 5.8. When the pH is lower than 4.0 or higher than 7.0, growth disorders are likely to occur.
[0034]
In the present invention, as shown in FIG. 1, suspension cells are derived from calli. At this time, a liquid medium adjusted to exhibit the above-mentioned osmotic pressure of 220 to 750 mOsm, preferably 20 to 120 g / l sucrose, 10 to 40 g / l glycerin or 20 to 80 g / l mannitol, 1 Callus is introduced into a liquid MS medium having an osmotic pressure of 220 to 750 mOsm containing auxin of 10 to 10 mg / l and cytokinin of 0 to 1.0 mg / l, and cultured in a dark place. The cultivation is performed at a temperature in the range of 10 to 30C, preferably 20 to 25C. When the temperature is lower than 10 ° C. or higher than 30 ° C., growth disorders easily occur. In addition, the liquid culture is performed on a rotary shaking incubator under the conditions of 60 to 120 times per minute, preferably 80 to 100 times per minute under a rotary culture condition, using a bottle roller type incubator, a jar fermenter, or the like. You can also do it. After culturing for 2 to 4 weeks, suspension cells as shown in FIG. 3 can be obtained.
[0035]
Next, as shown in FIG. 1, a liquid medium adjusted to exhibit the above-mentioned osmotic pressure of 220 to 750 mOsm, preferably 20 to 120 g / l sucrose, 10 to 40 g / l glycerin or 20 to 80 g / L of mannitol, 0-1 mg / l auxin and 0-1.0 mg / l cytokinin, the suspension cells were passaged into liquid MS medium with an osmotic pressure of 220-750 mOsm, in the dark, 10-30 ° C. When cultured at a temperature of preferably 20 to 25 ° C. for 4 to 8 weeks under a rotation culture condition of 60 to 120 times per minute, preferably 80 to 100 times per minute, an adventitious embryo as shown in FIG. Differentiate.
[0036]
Further, as shown in FIG. 1, a liquid medium adjusted to exhibit the above-mentioned osmotic pressure of 220 to 750 mOsm, preferably 20 to 120 g / l sucrose, 10 to 40 g / l glycerin or 20 to 80 g / l The adventitious embryos were subcultured into liquid 1 / 3MS medium with an osmotic pressure of 220-750 mOsm containing 1 mannitol, 0-1 mg / l auxin and 0-1.0 mg / l cytokinin, in the dark at 10-30 ° C. When culturing at a temperature of 20 to 25 ° C. for 60 to 120 times per minute, preferably 80 to 100 times per minute for 4 to 12 weeks, small tubers as shown in FIG. Be guided.
[0037]
According to the present invention, an enlarged cyclamen tuber having suppressed germination and rooting as shown in FIG. 5 is obtained. In particular, cyclamen tubers that have not substantially germinated and rooted and have a spherical shape and have a diameter of 4 to 8 mm have a high germination rate after planting in culture soil, and lead to good seedlings after germination.
[0038]
The obtained tuber can be sealed and stored using a sterilized container. Also, as shown in FIG. 1, germination can be achieved by planting under the same conditions as for seeds. That is, planting tubers in pots or plug trays filled with water for cyclamen germination, such as vermiculite, peat moss, perlite, etc., germinated when the temperature is maintained at 10 to 25 ° C, preferably 20 ° C, Cyclamen seedlings as shown in FIG. 6 can be produced simply and in large quantities. It is not necessary to perform a complicated acclimatization process at the time of raising a pot, such as when using a young plant obtained by culturing on a solid medium.
[0039]
【Example】
Hereinafter, examples of the present invention will be described, but the present invention is not limited thereto.
[0040]
Example 1: Induction of cyclamen tubers using liquid medium supplemented with glycerin as an osmotic agent
(1) Callus induction
The developed leaves of the flowering cyclamen (variety Victoria) were immersed in a 70% ethanol solution for 10 seconds, and then immersed in a sodium hypochlorite solution having an effective chlorine concentration of 1% for 15 minutes to perform a sterilization treatment. The leaves were then washed three times with sterile water to remove the surface sodium hypochlorite. The washed leaves are cut into squares of about 5 mm, and 10 mg / l of NAA, 0.1 mg / l of kinetin and 30 g / l of sucrose are added to the MS medium to adjust the pH to 5.8, and further 3 g / l of gellan gum. Was added and placed on a solid MS medium sterilized by an autoclave. This was cultured in a dark place at 25 ° C. for 2 months to obtain callus.
[0041]
(2) Induction of suspension cells
10 mg / l of NAA and 0.1 mg / l of kinetin were added to the MS medium, and 30 g / l of sucrose and 10, 20, 30, and 40 g / 1 of glycerin were added thereto to adjust the pH to 5.8, and sterilized in an autoclave. Processing was performed to prepare a liquid medium. The callus was suspended in this liquid medium and cultured at 25 ° C. in a dark place under the conditions of rotation culture for 80 to 100 times per minute for 2 to 4 weeks to induce suspension cells.
[0042]
(3) Induction of somatic embryos
0.1 mg / l of NAA and 0.1 mg / l of kinetin were added to the MS medium, and 30 g / 1 of sucrose and 10, 20, 30, 40 g / l of glycerin were added thereto to adjust the pH to 5.8. To prepare a liquid medium. Cells were centrifuged at 1000 G and resuspended in this liquid medium. A somatic embryo was induced by subculturing to a fresh medium every 2 weeks and culturing with shaking for 6 weeks.
[0043]
4) Induction of tubers
0.1 mg / l of NAA and 0.1 mg / l of kinetin were added to the 1/3 MS medium, and 30 g / 1 of sucrose and 10, 20, 30, 40 g / l of glycerin were added thereto to adjust the pH to 5.8. Then, the liquid medium was prepared by sterilization in an autoclave. Somatic embryos were collected and resuspended in this liquid medium. The cells were subcultured every two weeks to a fresh medium, and cultured with shaking for 12 weeks to induce tubers.
[0044]
5) Germination of tubers
The cyclamen tuber which has not germinated and rooted thus obtained was planted in a pot filled with a culture soil for cyclamen germination, given an appropriate amount of water, and germinated in a dark place at 20 ° C. The percentage of germinated tubers was determined. Table 1 below shows the osmotic pressure of each liquid medium and the ratio of germinated tubers (germination rate).
[0045]
Example 2: Induction of cyclamen tubers using liquid medium supplemented with mannitol as an osmotic agent
A tuber was obtained by culturing in the same manner as in Example 1 except that the sucrose concentration of the medium to be used was 30 g / 1 and mannitol was added as an osmotic pressure adjusting agent at 20, 40, 60 and 80 g / 1, respectively. Was. This was planted and germinated in culture soil for cyclamen germination in the same manner as in Example 1, and the percentage of germinated tubers was calculated. Table 1 below shows the osmotic pressure of each liquid medium and the ratio of germinated tubers (germination rate).
[0046]
Comparative Example 1:
Tubers were obtained by culturing in the same manner as in Example 1 except that the sucrose concentration of the medium used was 30 g / l and no osmotic pressure adjusting agent other than sucrose was added to the medium. This was planted and germinated in culture soil for cyclamen germination in the same manner as in Example 1, and the percentage of germinated tubers was calculated. Table 1 below shows the osmotic pressure of each liquid medium and the ratio of germinated tubers (germination rate).
[0047]
[Table 1]

1) Germination rate = number of stems and leaves developed / number of planted plants × 100
[0048]
【The invention's effect】
As described above, cyclamen tissue or dedifferentiated tissue is cultured in a liquid medium exhibiting an osmotic pressure in the range of 220 to 750 mOsm, and cyclamen tubers are induced through suspension cells and somatic embryos, thereby germinating and germinating. The rooting can be suppressed and the tubers can be uniformly enlarged, and the tubers are collected and stored without a great effort for cutting off the leaf stems and roots of the young plant. In addition, since the obtained cyclamen tubers have higher drought tolerance than seedlings produced by a conventional method, cyclamen can be easily cultivated under the same conditions as seeds without special acclimation treatment. Seedlings can be produced, and as a result, cyclamen pots with high uniformity can be produced in large quantities.
[Brief description of the drawings]
FIG. 1 is a diagram schematically showing a method for producing cyclamen tubers of the present invention.
FIG. 2 is a photograph of the morphology of callus organisms used for tuber induction.
FIG. 3 is a photograph of an organism morphology of suspension cells obtained in the process of tuber induction.
FIG. 4 is a photograph of the morphology of the organism of the somatic embryo obtained in the process of tuber induction.
FIG. 5 is a photograph showing the morphology of a cyclamen tuber obtained in the present invention.
FIG. 6 is a photograph of the form of an organism showing a state of a seedling obtained by planting cyclamen tubers.

Claims

Induce callus from cyclamen tissue,
Cultivating the callus in a liquid medium exhibiting an osmotic pressure in the range of 220 to 750 mOsm to induce and enlarge cyclamen tubers,
A method for producing cyclamen tubers.

The method for producing cyclamen tubers according to claim 1, wherein the induction of callus from the cyclamen tissue is performed in a liquid medium or a solid medium having an osmotic pressure in the range of 220 to 750 mOsm.

A liquid medium used in the method for producing cyclamen tubers according to claim 1 or 2,
It contains at least an inorganic component and a carbon source,
Monosaccharide, disaccharide, oligosaccharide, water-soluble polysaccharide, sugar alcohol, water-soluble higher alcohol, and contains an osmotic pressure regulator selected from among these mixtures,
The osmotic pressure is in the range of 220 to 750 mOsm,
A liquid culture medium characterized by the above-mentioned.

A cyclamen tuber substantially non-germinated and rooted, obtained by the production method according to claim 1 or 2.

Planting the cyclamen tuber according to claim 4 in a culture soil,
Germinating and rooting tubers to grow seedlings,
A method for producing cyclamen seedlings.