JP2004154027A

JP2004154027A - Cell culture chamber

Info

Publication number: JP2004154027A
Application number: JP2002321859A
Authority: JP
Inventors: Teruo Fujii; 輝夫藤井; Yasuyuki Sakai; 康行酒井; Leclerc Eric; ルクレールエリック
Original assignee: Foundation for the Promotion of Industrial Science
Current assignee: Foundation for the Promotion of Industrial Science
Priority date: 2002-11-05
Filing date: 2002-11-05
Publication date: 2004-06-03
Anticipated expiration: 2022-11-05
Also published as: JP4238972B2

Abstract

<P>PROBLEM TO BE SOLVED: To provide a cell culture chamber which comprises a biodegradable material, on whose surface fine three-dimensional structures are formed, can culture a large amount of cells in a high density, and can be applied to artificial organs and the like. <P>SOLUTION: This cell culture chamber is characterized by forming cell-attaching portions having fine three-dimensional structures on the surface and/or on the inside of a support comprising a biodegradable polymer. <P>COPYRIGHT: (C)2004,JPO

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は組織工学分野等において応用上有用な細胞培養チャンバーに関する。
【０００２】
【従来の技術及び発明が解決しようとする課題】
現在、組織工学分野においては、細胞を、長時間活性を保ちながら連続的に培養することができる細胞培養チャンバーの研究が行われている。このような細胞培養チャンバーは、バイオリアクターとして、医療分野や薬学分野において、薬剤スクリーニング、動物実験の代替実験などへの利用が期待されているほか、近い将来、ハイブリッド型人工臓器の構築にも有用であると考えられている。
【０００３】
細胞培養チャンバーをバイオリアクター、特に人工臓器等として利用するためには、高密度に多量の細胞を培養できることが必要である。
従来、細胞培養には、ペトリ皿などの培養容器が用いられている。このような培養容器の平滑な表面に細胞を付着させ、そこに栄養成分や酸素を含んだ培養液を供給することにより栄養成分及び酸素の供給が行われ、培養細胞から排出された老廃物を含む培養液を回収することにより老廃物の除去が行われる。
しかしながら、ペトリ皿のような細胞培養チャンバーの場合、表面が平坦であるため、表面に付着できる細胞の量に限度があり、多量の細胞を高密度に培養することは困難であった。
【０００４】
これに対し、多量の細胞を高密度に培養するために、表面に凹凸を設けるなどして培養面積の広い細胞培養チャンバーを作成することが提案されている。
しかしながら、このような細胞培養チャンバーを、例えば人工臓器として移植等に利用することは困難であった。これは、上述のような細胞培養チャンバーは、表面に凹凸を設けた構造とするために、ポリジメチルシロキサン（以下、ＰＤＭＳという）等の外来性の生分解性でない材料を用いる必要があるためである。外来性の材料を用いた人工臓器は、患者の負担が大きいため好ましくない。また、生分解性でない材料を用いた人工臓器は、患者の生体内に埋め込んだ後、再度取り出す必要があり、外来性の材料を用いた場合と同様、患者にかかる負担が大きい。
【０００５】
これに対し、生分解性材料を用いた、単純な構造（シート状、塊状など）の細胞培養チャンバーも提案されている。
しかしながら、従来の技術では、生分解性材料の表面に微細な三次元構造を形成することは困難であった。
【０００６】
本発明は、上記の事情に鑑みてなされたものであり、多量の細胞を高密度で培養することができ、人工臓器等に応用可能な細胞培養チャンバーを提供することを目的としている。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、鋭意研究の結果、フォトリソグラフィー技術を用いることにより、生分解性材料の表面及び／又は内部に微細な三次元構造を形成することができ、そのような微細な三次元構造が設けられた細胞培養チャンバーは、多量の細胞を高密度で培養するのに適していることを発見し、本発明を完成した。
すなわち、前記課題を解決する本発明は、生分解性ポリマーからなる支持体の表面及び／又は内部に、微細な三次元構造の細胞固着部が形成されていることを特徴とする細胞培養チャンバーである。
前記生分解性ポリマーは紫外線硬化型であることが好ましく、特に、モノマーとして、カプロラクトン変性ジペンタエリスリトールヘキサアクリレートを含有するポリマーが好ましい。
さらに、前記細胞固着部に培養液を灌流させるための流路が設けられていることが好ましい。
【０００８】
【発明の実施の形態】
以下、添付の図面を用いて、本発明の実施形態を説明する。
本発明の細胞培養チャンバーは、生分解性ポリマーからなる支持体の表面及び／又は内部に、微細な三次元構造の細胞固着部が形成されているものである。
図１は、本発明の第１実施形態における細胞培養チャンバーの細胞固着部を示す図である。本実施形態において、細胞培養チャンバーの表面には、略正方形（約７００μｍ×７００μｍ）の四隅の部分に小さな略正方形（約１００μｍ×１００μｍ）の切り欠きのある突起が複数、規則的に配置されている。
図２は、本発明の第２実施形態における細胞培養チャンバーの細胞固着部を示す図である。本実施形態において、細胞培養チャンバーの表面には、比較的幅の大きい（約７００μｍ程度）溝と、その溝から枝状に分岐した２本の溝（幅約１００μｍ）が形成されている。
図３は、本発明の第３実施形態における細胞培養チャンバーの細胞固着部を示す図である。本実施形態において、細胞培養チャンバーの表面には、略正方形（約７００μｍ×７００μｍ）の四隅の部分に小さな略正方形（約１００μｍ×１００μｍ）の切り欠きのある溝が複数、規則的に配置されている。
図４は、本発明の第４実施形態における細胞培養チャンバーの細胞固着部を示す図である。本実施形態において、細胞培養チャンバーの表面には、約１ｍｍ×１ｍｍの格子状の枠の内側に、その深さが３段階で深くなっていっている複雑な形状の溝が複数形成されている。
図５は、本発明の第５実施形態における細胞培養チャンバーの細胞固着部を示す図である。本実施形態において、細胞培養チャンバーの表面には、比較的大きな略正方形（約１ｍｍ×１ｍｍ）の溝が均等に配置された部分と、図４に示したのと同様の複雑な形状の溝が配置された部分が形成されている。
【０００９】
本発明の細胞培養チャンバーは、細胞固着部としてこれらの突起や溝が形成されていることにより細胞固着部の表面積が増大し、多量の細胞が固着できるようになっている。
【００１０】
支持体に使用される生分解性ポリマーは、培養する細胞に対して適合性を有するものであれば、既知の任意の生分解性ポリマーが利用可能であるが、好ましくは紫外線（ＵＶ）硬化型又は熱硬化型、特に好ましくは紫外線硬化型のものが用いられる。
熱硬化型の生分解性ポリマーとしては、具体的には、例えば、ポリ−（グリコール酸（ＧＡ）−ＤＬ−酪酸（ＬＡ））（以下、ｐＧＡＬＡという）が挙げられる。ｐＧＡＬＡには、任意の配合比率でｃｏ−カプロラクトン（ＣＬ）が配合されていて良く、ＣＬの配合比率が高いほど柔らかい材料となる。また、ポリ（ＬＡ−ＣＬ）（モル比：８６／１４〜６０／４０）も使用可能である。
ＵＶ硬化型の生分解性ポリマーとしては、具体的には、イニシエーターとしてペンタエリスリトールを用いたＬＡの開環反応と、４つのＣＬ−ＬＡ鎖の末端へのアクリロイル基の付加とによって合成される、ポリ−（ＣＬ−ＬＡ）テトラアクリレート（カプロラクトン変性ジペンタエリスリトールヘキサアクリレート）を高分子量の光架橋性モノマーとして含有するポリマーが挙げられる。このタイプの光架橋性モノマーから得られるポリマーとしては、特に、分子量が約１００００、ＣＬ：ＬＡ（モル比）がおよそ５０：５０のものが好適に用いられる。また、このようなＵＶ硬化型の生分解性モノマーとしては、日本化薬社からＫａｙａｒａｄＤＣＰＡ−６０、ＫａｙａｒａｄＤＣＰＡ−１２０等が市販されている。このようなカプロラクトン変性ジペンタエリスリトールヘキサアクリレートを重合させて得られるポリマーは、ＵＶ照射により素早く硬化すること、透明であるため培養時に細胞の形態を観察しやすいこと等の利点を有する。
【００１１】
本発明の細胞培養チャンバーを用いて培養可能な細胞は、その活性の維持に酸素を必要とする細胞であれば特に制限はなく、動物、特にヒト由来の肝細胞や繊維芽細胞など、応用上、非常に有用な細胞についても、長時間、その活性を維持しながら培養することができる。
また、細胞を固着させる前に予め、細胞固着部の表面をＩ型コラーゲン等でプレコーティングしておくと、細胞がより強固に固着するので好ましい。
【００１２】
本発明の細胞培養チャンバーは、静置培養にも、灌流培養にも用いることができる。特に、灌流培養は、細胞固着部に栄養成分や酸素を含んだ培養液を灌流させることにより栄養成分及び酸素の供給と老廃物の除去を同時に行うことができるので好ましい。
培養液は、培養液中に排出された老廃物や細胞の分泌物（例えばＨｅｐＧ２細胞培養時のアルブミン）を除去するために、少なくとも３〜４日毎に交換することが好ましい。
【００１３】
本発明の細胞培養チャンバーを用いて灌流培養を行う場合、特に、図４や図５に示すような複雑な３次元構造が細胞固着部として設けられている場合には、従来に比べて細胞固着が促進される。これは、３次元構造であることによって、溝の中で流速が遅くなる部分が生じるためと考えられる。
灌流培養に用いる場合は、細胞固着部に培養液を灌流させるための流路を設けることが好ましい。流路を設けることにより、細胞固着部全体に培養液を灌流させることができ、培養液中の栄養成分や酸素の供給や、培養液を介した老廃物の回収除去が偏りなく行われる。
灌流培養時の培養液の灌流速度は、流路構造部に固着した細胞が剥がれない程度より遅ければ特に制限はなく、培養する細胞によって適宜設定すればよいが、５〜３０μＬ／ｍｉｎとすることが好ましい。流速がこの範囲内にあると、流れによって生じる剪断応力によって細胞の固着や流路構造部への分布が妨げられず、また、死んだ細胞を除去することもできる。
【００１４】
上記細胞培養チャンバーは、組織工学分野等において応用上有用な肝細胞や繊維芽細胞等の細胞について、多量かつ高密度に培養し、臓器類の応答を再現可能なレベルの細胞数を達成できすることができるので、バイオリアクターとして、動物実験の代替、薬剤スクリーニング等に利用することができる。特に、生分解性を有するので、ハイブリッド型人工臓器等に用いた場合、移植後に再度取り出す必要がなく、有用であると考えられる。
【００１５】
本発明の細胞培養チャンバーは、下記（１）〜（４）のようなフォトリソグラフィー技術を用いたプロセスにより作成することができる。
【００１６】
［（１）モールディングプロセス］
この方法は、以下の工程を含有する。
（１ａ）基板上にフォトレジスト層を形成し、所定のマスクパターンを介して露光・現像を行って該基板上にパターンを転写して、微細な三次元構造のモールドを作成する工程。
（１ｂ）任意に、得られたパターンをマスクにしてイオンエッチングを行い、モールドの表面をコーティングする工程。この工程を設けることにより、モールドから、その上に形成される生分解性の支持体を剥離しやすくなる。
（１ｃ）モールド上に、未重合の生分解性ポリマーを堆積して生分解性ポリマー層を形成し、重合させて生分解性の支持体を得る工程。
（１ｄ）得られた支持体を剥離して、表面に微細な三次元構造が形成された細胞培養チャンバーを得る工程。
【００１７】
より具体的には、例えば図６に示すように
ｉ）まず、ガラスウェーハ６１を用意し、
ｉｉ）該ウェーハ６１上に、スピンコーティングによりＳＵ−８製の膜（以下、ＳＵ−８膜という）６２を形成する。次いで、
ｉｉｉ）所定のマスクパターン（すなわち三次元構造のパターン）６３を介して露光・現像を行い、ウェーハ６１上にパターン６４を転写して、三次元構造のモールド６５を作成する。
ｉｖ）得られたパターン６４をマスクにして、イオンエッチング処理を行うことにより、ポリテトラフルオロエチレン等のフルオロカーボンポリマーの膜を形成し、表面をコーティングする。
ｖ）得られたモールド６５上に、未重合のＵＶ硬化型又は熱硬化型の生分解性ポリマーを塗布して生分解性ポリマー層６６を形成し、ＵＶ照射又は加熱により重合させる。
ｖｉ）生分解性ポリマー層６６を剥離し、表面に三次元構造のパターンが形成された支持体６７を得る。得られた支持体６７は、そのまま細胞培養チャンバーとして用いてもよいし、また、
ｖｉｉ）三次元構造が内側になるようにして別の生分解性シート６８上に積層し、内部に細胞固着部を有する細胞培養チャンバー６９としてもよい。このとき、別の生分解性シート６８の表面は、平坦であってもよく、また、上記と同様の方法によって三次元構造が設けられていてもよい。このように、表面に三次元構造が形成された細胞培養チャンバーを、その三次元構造が内側になるようにして基板や別の細胞培養チャンバー上に積層することにより、内部に三次元構造を有する細胞培養チャンバーが得られる。
【００１８】
［（２）直接フォトリソグラフィープロセス］
このプロセスは、以下の工程を含有する。
（２ａ）基板上に、ＵＶ照射により可溶化する未重合の生分解性ポリマーを堆積し、重合させて、生分解性ポリマー層を形成し、所定のマスクパターンを介して露光・現像を行って該基板上にパターンを転写することによって、表面に微細な三次元構造が形成された細胞培養チャンバーを得る工程。
【００１９】
より具体的には、例えば図７に示すように
ｉ）まず、ガラスウェーハ７１を用意し、
ｉｉ）該ウェーハ７１上に、スピンコーティングにより、未重合のＵＶ硬化型の生分解性ポリマー層７２を形成する。次いで、
ｉｉｉ）所定のマスクパターン（すなわち三次元構造のパターン）７３を介して、ＵＶ（例えば２５０Ｗの光（波長ピーク：３４５ｎｍ、３４５ｎｍ））で露光し、現像して、ウェーハ７１上にパターン７４を転写する。このようにして、表面に三次元構造のパターンが形成された細胞培養チャンバー７５が得られる。
このプロセスでは、非常に素早く簡単に、細胞培養チャンバーを得ることができる。
【００２０】
［（３）スタンピングプロセス］
このプロセスは、以下の工程を含有する。
（３ａ）基板上に、未重合の生分解性ポリマーを堆積する工程。
（３ｂ）三次元構造のモールドを、前記未重合の生分解性ポリマーの層に積層し、型押し（スタンピング）する工程。
（３ｃ）前記生分解性ポリマーを硬化させ、表面に微細な三次元構造が形成された細胞培養チャンバーを得る工程。
【００２１】
このプロセスは、生分解性ポリマーとして熱硬化型のものを用いる場合、例えば図８に示すようにして行うことができる。
ｉ）まず、ガラスウェーハ８１上に、未重合の熱硬化型の生分解性ポリマー（ＰＬＧＡなど）を塗布して生分解性ポリマー層８２を形成する。
ｉｉ）耐熱性の材料（例えばＰＤＭＳ）を用いて作成した三次元構造のモールド８３を未重合の生分解性ポリマー層８２に積層し、そのまま加熱して生分解性ポリマーを重合させる。
ｉｉｉ）モールド８３を剥離し、表面に三次元構造を有する細胞培養チャンバー８４を得る。
【００２２】
また、生分解性ポリマーとしてＵＶ硬化型のものを用いてスタンピングプロセスを行う場合、例えば、モールドの材料としてＵＶ透過性の材料（例えばＰＤＭＳ）を用いることにより、図９に示すようにして細胞培養チャンバーを製造することができる。
ｉ）まず、ガラスウェーハ９１上に、未重合のＵＶ硬化型の生分解性ポリマーを塗布して生分解性ポリマー層９２を形成する。
ｉｉ）ＰＤＭＳを用いて作成した三次元構造のモールド９３を、未重合の生分解性ポリマー層９２に積層する。
ｉｉｉ）積層したモールド９３の上方から、モールド９３を介してＵＶを照射して、生分解性ポリマーを硬化させる。
ｉｖ）モールド９３を剥離し、表面に三次元構造を有する細胞培養チャンバー９４を得る。
【００２３】
本発明においては、ＵＶ硬化型の生分解性ポリマーが好ましく用いられる。これは、上述の熱硬化型のポリマーを用いた場合、支持体が熱により反ったり変形するなどの問題があり、また、硬化と硬化後の冷却にも多くの時間が必要なため生産性が劣るという問題が生じやすいが、ＵＶ硬化型のポリマーを用いれば、このような問題は見られないためである。
【００２４】
［（４）プラズマエッチングプロセス］
この方法は、以下の工程（４ａ）〜（４ｃ）を含有する。
（４ａ）基板上にフォトレジスト層を形成し、所定のマスクパターンを介して露光・現像を行って該基板上にパターンを転写して、微細な三次元構造のモールドを作成するモールド作成工程。
（４ｂ）任意に、得られたパターンをマスクにしてプラズマエッチングを行い、モールドの表面をコーティングする工程。この工程を設けることにより、モールドから、その上に形成される生分解性の支持体を剥離しやすくなる。
（４ｃ）モールド上に、未重合の生分解性ポリマーを堆積して生分解性ポリマー層を形成し、重合させて生分解性の支持体を得る工程。
（４ｄ）得られた支持体を剥離して、表面に微細な三次元構造が形成された細胞培養チャンバーを得る工程。
【００２５】
より具体的には、例えば図６に示すように
ｉ）まず、ガラスウェーハ６１を用意し、
ｉｉ）該ウェーハ６１上に、スピンコーティングによりＳＵ−８膜６２を形成する。次いで、
ｉｉｉ）所定のマスクパターン（すなわち三次元構造のパターン）６３を介して露光・現像を行い、ウェーハ６１上にパターン６４を転写して、三次元構造のモールド６５を作成する。
ｉｖ）得られたパターン６４をマスクにして、プラズマエッチング処理を行うことにより、ポリテトラフルオロエチレン等のフルオロカーボンポリマーの膜を形成し、表面をコーティングする。
ｖ）得られたモールド６５上に、未重合のＵＶ硬化型又は熱硬化型の生分解性ポリマーを塗布して生分解性ポリマー層６６を形成し、ＵＶ照射又は加熱により重合させる。
ｖｉ）生分解性ポリマー層６６を剥離し、表面に三次元構造のパターンが形成された支持体６７を得る。
ｖｉｉ）得られた支持体６７を三次元構造が内側になるようにして別の生分解性シート６８上に積層し、内部に細胞固着部を有する細胞培養チャンバー６９とする。
【００２６】
本発明の細胞培養チャンバーは、上述のような簡単な製造方法により得ることができ、設計上の自由度が大きく、様々なデザインの三次元構造に対応可能である。
【００２７】
【実施例】
＜細胞培養チャンバーの製造＞
下記製造例では、生分解性ポリマーとして、以下の化合物を用いた。
・ポリ（ラクチド−コ−グリコリド）（以下、ＰＬＧＡという）
・カプロラクトン変性ジペンタエリスリトールのヘキサアクリレート（商品名：ＫａｙａｒａｄＤＣＰＡ−６０）を重合させて得られるポリマー（以下、ｐＣＬＬＡという）ｐＣＬＬＡは、ＵＶ照射により素早く硬化する、透明であるため培養時に細胞の形態を観察しやすい等の利点を有する生分解性ポリマーである。
【００２８】
製造例１
図１に示すデザインの細胞培養部を有する細胞培養チャンバーを、上述したモールディングプロセスを用いて、以下のようにして製造した。
まず、ガラスウェーハを用意し、該ウェーハ上に、スピンコーティングによりＳＵ−８膜を形成した。次いで、図１に示すデザインのマスクパターンを介して露光・現像を行い、ウェーハ上にパターンを転写して、図１０に示すような三次元構造のモールドを作成した。次いで、イオンエッチング処理を行うことにより、ポリテトラフルオロエチレン膜を形成し、表面をコーティングした。得られたモールド上に、未重合のｐＣＬＬＡを塗布して生分解性ポリマー層を形成し、ＵＶ照射により重合させた。硬化後、生分解性ポリマー層を剥離し、表面に三次元構造のパターンが形成された細胞培養チャンバーを得た。
【００２９】
また、比較例として、ｐＣＬＬＡの代わりにＰＤＭＳを用いた以外は同様の方法で細胞培養チャンバーを作成し、その細胞固着部の形状を製造例１と比較した。その結果、製造例１の細胞固着部の形状は、ＰＤＭＳ製のもの（図１１参照）と比べてなんら遜色のない良好な形状であった。
【００３０】
製造例２
図２に示すデザインの細胞培養部を有する細胞培養チャンバーを、上述した直接フォトリソグラフィープロセスを用いて、以下のようにして製造した。
まず、ガラスウェーハを用意し、該ウェーハ上に、スピンコーティングにより、未重合のｐＣＬＬＡを塗布し、ｐＣＬＬＡ層を形成した。次いで、図２に示すデザインの三次元構造のマスクパターンを介して、２５０Ｗの光（波長ピーク：３４５ｎｍ、３４５ｎｍ）で露光し、現像して、ウェーハ上にパターンを転写した。このようにして、表面に三次元構造が形成された細胞培養チャンバーを得た。形成された三次元構造は、微細な部分まではっきりと形成されていた。
【００３１】
製造例３
モールドとして、製造例１で製造した細胞培養チャンバーをモールドとして用いてＰＤＭＳ製のモールドを作成し、このＰＤＭＳ製のモールドを用いて上述したスタンピングプロセスにより細胞培養チャンバーを製造した。
まず、ガラスウェーハ上に、未重合のＰＬＧＡを塗布してＰＬＧＡ層を形成した。ＰＤＭＳ製のモールドを、未重合のＰＬＧＡ層に積層した。積層したモールドの上方から、モールドを介してＵＶを照射して、ＰＬＧＡを硬化させた。モールドを剥離し、表面に三次元構造を有する細胞培養チャンバーを得た。形成された三次元構造は、図３に示すように、微細な部分まではっきりと形成されていた。
【００３２】
また、同様の方法によりず図２に示すような溝を有する細胞培養チャンバーを、作成し、これを、三次元構造を内側にしてガラス基板上に積層し、その間の空間にインクを流したところ、その溝以外の部分へのインクの漏れはほとんど確認されなかった。このことは、得られた細胞培養チャンバーに反りや変形がほとんどなかったことを示している。
【００３３】
製造例４
まず、ガラスウェーハを用意し、該ウェーハ上に、スピンコーティングによりＳＵ−８膜を形成した。次いで、マスクパターンを介しての露光・現像とパターンの転写を３回繰り返すことにより、図４に示すような三次元構造のモールドを作成した。次いで、イオンエッチング処理を行うことにより、ポリテトラフルオロエチレン膜を形成し、表面をコーティングした。得られたモールド上に、未重合のＰＤＭＳを塗布、硬化させて、図１２に示すようなモールドを作成した。このＰＤＭＳ製のモールドを用いて上述したスタンピングプロセスにより、ＰＬＧＡ製の細胞培養チャンバーを製造した。
【００３４】
【発明の効果】
本発明の細胞培養チャンバーは、生分解性材料で、微細な三次元構造の細胞固着部が形成されているので、多量の細胞を高密度で細胞することが可能である。そのため、外来性の材料を含まない人工臓器の製造に応用することが可能であり、そのような人工臓器は、生体内に埋め込む、埋め込まないにかかわらず、患者への負担の小さいものである。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の細胞培養チャンバーの第一実施形態を示す図である。
【図２】本発明の細胞培養チャンバーの第二実施形態を示す図である。
【図３】本発明の細胞培養チャンバー第三実施形態を示す図である。
【図４】本発明の細胞培養チャンバー第四実施形態を示す図である。
【図５】本発明の細胞培養チャンバー第五実施形態を示す図である。
【図６】本発明の細胞培養チャンバーの製造プロセスの一例を示す図である。
【図７】本発明の細胞培養チャンバーの製造プロセスの一例を示す図である。
【図８】本発明の細胞培養チャンバーの製造プロセスの一例を示す図である。
【図９】本発明の細胞培養チャンバーの製造プロセスの一例を示す図である。
【図１０】図３に示した細胞培養チャンバーの製造に用いられるＳＵ−８製モールドのＳＥＭ図である。
【図１１】図１０に示したモールドを用いて得られるＰＤＭＳ製モールドのＳＥＭ図である。
【図１２】図４に示した細胞培養チャンバーの製造に用いられるＰＤＭＳ製モールドのＳＥＭ図である。
【符号の説明】
６１…ガラスウェーハ、６２…ＳＵ−８膜、６３…マスクパターン、６４…パターン、６５…モールド、６６…生分解性ポリマー層、６７…支持体、６８…生分解性シート、６９…細胞培養チャンバー、７１…ガラスウェーハ、７２…生分解性ポリマー層、７３…マスクパターン、７４…パターン、７５…細胞培養チャンバー、８１…ガラスウェーハ、８２…生分解性ポリマー層、８３…モールド、８４…細胞培養チャンバー、９１…ガラスウェーハ、９２…生分解性ポリマー層、９３…モールド、９４…細胞培養チャンバー[0001]
TECHNICAL FIELD OF THE INVENTION
The present invention relates to a cell culture chamber useful for applications in the field of tissue engineering and the like.
[0002]
Problems to be solved by the prior art and the invention
At present, in the field of tissue engineering, a cell culture chamber capable of continuously culturing cells while maintaining the activity for a long time is being studied. Such a cell culture chamber is expected to be used as a bioreactor in medical and pharmaceutical fields for drug screening, alternative experiments to animal experiments, etc., and will be useful in the construction of hybrid artificial organs in the near future. Is believed to be.
[0003]
In order to use a cell culture chamber as a bioreactor, particularly as an artificial organ, it is necessary that a large amount of cells can be cultured at a high density.
Conventionally, culture vessels such as petri dishes have been used for cell culture. The cells are attached to the smooth surface of such a culture vessel, and nutrients and oxygen are supplied by supplying a nutrient and oxygen-containing culture solution to the cells, thereby removing waste products discharged from the cultured cells. By collecting the culture solution containing waste products, waste products are removed.
However, in the case of a cell culture chamber such as a petri dish, since the surface is flat, the amount of cells that can be attached to the surface is limited, and it has been difficult to culture a large number of cells at high density.
[0004]
On the other hand, in order to culture a large number of cells at high density, it has been proposed to create a cell culture chamber having a large culture area by providing irregularities on the surface or the like.
However, it has been difficult to use such a cell culture chamber for transplantation or the like as an artificial organ, for example. This is because the above-described cell culture chamber needs to use an exogenous non-biodegradable material such as polydimethylsiloxane (hereinafter, referred to as PDMS) in order to have a structure having irregularities on the surface. is there. Artificial organs using exogenous materials are not preferred because of the heavy burden on the patient. In addition, an artificial organ using a material that is not biodegradable needs to be taken out again after being implanted in a living body of a patient, and the burden on the patient is large as in the case of using an exogenous material.
[0005]
On the other hand, a cell culture chamber using a biodegradable material and having a simple structure (such as a sheet or a block) has been proposed.
However, it is difficult to form a fine three-dimensional structure on the surface of the biodegradable material by the conventional technology.
[0006]
The present invention has been made in view of the above circumstances, and has as its object to provide a cell culture chamber capable of culturing a large amount of cells at a high density and applicable to artificial organs and the like.
[0007]
[Means for Solving the Problems]
The present inventors have conducted intensive studies and, as a result, have been able to form a fine three-dimensional structure on the surface and / or inside of a biodegradable material by using photolithography technology. Was found to be suitable for culturing a large number of cells at high density, and completed the present invention.
That is, the present invention for solving the above-mentioned problems is directed to a cell culture chamber characterized in that a cell fixing portion having a fine three-dimensional structure is formed on the surface and / or inside of a support made of a biodegradable polymer. is there.
The biodegradable polymer is preferably an ultraviolet-curable polymer, and particularly preferably a polymer containing caprolactone-modified dipentaerythritol hexaacrylate as a monomer.
Further, it is preferable that a flow path for perfusing a culture solution is provided in the cell fixing portion.
[0008]
BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION
Hereinafter, embodiments of the present invention will be described with reference to the accompanying drawings.
The cell culture chamber of the present invention is one in which a fine three-dimensional cell fixing portion is formed on the surface and / or inside of a support made of a biodegradable polymer.
FIG. 1 is a diagram showing a cell fixing portion of a cell culture chamber according to the first embodiment of the present invention. In the present embodiment, a plurality of small square (about 100 μm × 100 μm) notched protrusions are regularly arranged at four corners of a substantially square (about 700 μm × 700 μm) on the surface of the cell culture chamber. I have.
FIG. 2 is a diagram showing a cell fixing portion of a cell culture chamber according to a second embodiment of the present invention. In the present embodiment, a relatively wide groove (about 700 μm) and two grooves (about 100 μm in width) branched from the groove are formed on the surface of the cell culture chamber.
FIG. 3 is a diagram showing a cell fixing portion of a cell culture chamber according to a third embodiment of the present invention. In the present embodiment, on the surface of the cell culture chamber, a plurality of small square (about 100 μm × 100 μm) notched grooves are regularly arranged at four corners of a substantially square (about 700 μm × 700 μm). I have.
FIG. 4 is a diagram showing a cell fixing portion of a cell culture chamber according to a fourth embodiment of the present invention. In the present embodiment, on the surface of the cell culture chamber, a plurality of grooves having a complicated shape whose depth is increased in three stages are formed inside a lattice-shaped frame of about 1 mm × 1 mm.
FIG. 5 is a diagram showing a cell fixing portion of a cell culture chamber according to a fifth embodiment of the present invention. In this embodiment, on the surface of the cell culture chamber, a relatively large substantially square (approximately 1 mm × 1 mm) groove is uniformly arranged, and a groove having a complicated shape similar to that shown in FIG. The arranged part is formed.
[0009]
In the cell culture chamber of the present invention, since these projections and grooves are formed as the cell fixing portion, the surface area of the cell fixing portion is increased, and a large amount of cells can be fixed.
[0010]
As the biodegradable polymer used for the support, any known biodegradable polymer can be used as long as it is compatible with the cells to be cultured. Alternatively, a thermosetting type, particularly preferably an ultraviolet curable type is used.
Specific examples of the thermosetting biodegradable polymer include, for example, poly- (glycolic acid (GA) -DL-butyric acid (LA)) (hereinafter referred to as pGALA). In pGALA, co-caprolactone (CL) may be blended at an arbitrary blending ratio, and the higher the blending ratio of CL, the softer the material. Also, poly (LA-CL) (molar ratio: 86/14 to 60/40) can be used.
Specifically, the UV-curable biodegradable polymer is synthesized by a ring opening reaction of LA using pentaerythritol as an initiator and addition of an acryloyl group to the terminals of four CL-LA chains. And polymers containing poly- (CL-LA) tetraacrylate (caprolactone-modified dipentaerythritol hexaacrylate) as a high molecular weight photocrosslinkable monomer. As the polymer obtained from this type of photocrosslinkable monomer, a polymer having a molecular weight of about 10,000 and a CL: LA (molar ratio) of about 50:50 is particularly preferably used. As such UV-curable biodegradable monomers, Kayrad DCPA-60, Kayrad DCPA-120, and the like are commercially available from Nippon Kayaku Co., Ltd. A polymer obtained by polymerizing such caprolactone-modified dipentaerythritol hexaacrylate has advantages such as quick curing by UV irradiation, and being transparent, so that the morphology of cells can be easily observed during culture.
[0011]
The cells that can be cultured using the cell culture chamber of the present invention are not particularly limited as long as they require oxygen to maintain their activity, and can be applied to animals, particularly human-derived hepatocytes and fibroblasts. Even very useful cells can be cultured for a long time while maintaining their activity.
In addition, it is preferable to pre-coat the surface of the cell fixing portion with type I collagen or the like before fixing the cells, since the cells are more firmly fixed.
[0012]
The cell culture chamber of the present invention can be used for both stationary culture and perfusion culture. In particular, perfusion culture is preferable since the supply of nutrient components and oxygen and the removal of waste products can be performed simultaneously by perfusing a culture solution containing nutrient components and oxygen into the cell fixing portion.
The culture solution is preferably replaced at least every 3 to 4 days in order to remove waste products and cell secretions (eg, albumin from Hep G2 cells) discharged into the culture solution.
[0013]
When perfusion culture is performed using the cell culture chamber of the present invention, especially when a complicated three-dimensional structure as shown in FIGS. Is promoted. This is probably because the three-dimensional structure causes a portion of the groove where the flow velocity becomes slow.
When used for perfusion culture, it is preferable to provide a flow channel for perfusing a culture solution in the cell fixing part. By providing the flow path, the culture solution can be perfused through the entire cell fixing portion, and the nutrient components and oxygen in the culture solution can be supplied, and the wastes can be collected and removed via the culture solution without bias.
The perfusion rate of the culture solution during perfusion culture is not particularly limited as long as the cells fixed to the flow channel structure are not detached, and may be appropriately set depending on the cells to be cultured, and is preferably 5 to 30 μL / min. Is preferred. When the flow rate is within this range, the shearing stress generated by the flow does not hinder the fixation and distribution of the cells to the channel structure, and can also remove dead cells.
[0014]
The cell culture chamber is capable of culturing a large amount and high density of cells such as hepatocytes and fibroblasts which are useful for application in the field of tissue engineering and the like, and achieving a cell number at a level capable of reproducing organ responses. Therefore, it can be used as a bioreactor for substituting animal experiments, drug screening, and the like. In particular, since it has biodegradability, it is considered to be useful when used for a hybrid artificial organ or the like, because it does not need to be removed again after transplantation.
[0015]
The cell culture chamber of the present invention can be prepared by a process using photolithography technology as described in (1) to (4) below.
[0016]
[(1) Molding process]
This method includes the following steps.
(1a) A step of forming a photoresist layer on a substrate, exposing and developing through a predetermined mask pattern to transfer the pattern onto the substrate, and forming a mold having a fine three-dimensional structure.
(1b) Optionally, a step of performing ion etching using the obtained pattern as a mask to coat the surface of the mold. By providing this step, the biodegradable support formed thereon can be easily separated from the mold.
(1c) a step of depositing an unpolymerized biodegradable polymer on a mold to form a biodegradable polymer layer and polymerizing to obtain a biodegradable support.
(1d) A step of peeling the obtained support to obtain a cell culture chamber having a fine three-dimensional structure formed on the surface.
[0017]
More specifically, for example, as shown in FIG. 6, i) First, a glass wafer 61 is prepared,
ii) A film made of SU-8 (hereinafter referred to as SU-8 film) 62 is formed on the wafer 61 by spin coating. Then
iii) Exposure and development are performed through a predetermined mask pattern (that is, a pattern of a three-dimensional structure) 63, and the pattern 64 is transferred onto the wafer 61 to form a mold 65 having a three-dimensional structure.
iv) A film of a fluorocarbon polymer such as polytetrafluoroethylene is formed by performing ion etching using the obtained pattern 64 as a mask, and the surface is coated.
v) On the obtained mold 65, an unpolymerized UV-curable or thermosetting biodegradable polymer is applied to form a biodegradable polymer layer 66, and polymerized by UV irradiation or heating.
vi) The biodegradable polymer layer 66 is peeled off to obtain a support 67 having a three-dimensional structure pattern formed on the surface. The obtained support 67 may be used as it is as a cell culture chamber,
vii) The cell culture chamber 69 may be laminated on another biodegradable sheet 68 such that the three-dimensional structure is on the inside, and the cell culture chamber 69 has a cell fixing portion inside. At this time, the surface of another biodegradable sheet 68 may be flat, or a three-dimensional structure may be provided by the same method as described above. Thus, by stacking the cell culture chamber having a three-dimensional structure formed on the surface on a substrate or another cell culture chamber such that the three-dimensional structure is on the inside, it has a three-dimensional structure inside A cell culture chamber is obtained.
[0018]
[(2) Direct photolithography process]
This process includes the following steps.
(2a) An unpolymerized biodegradable polymer that is solubilized by UV irradiation is deposited on a substrate, polymerized to form a biodegradable polymer layer, and exposed and developed through a predetermined mask pattern. Transferring a pattern onto the substrate to obtain a cell culture chamber having a fine three-dimensional structure formed on the surface.
[0019]
More specifically, for example, as shown in FIG. 7, i) First, a glass wafer 71 is prepared,
ii) An unpolymerized UV-curable biodegradable polymer layer 72 is formed on the wafer 71 by spin coating. Then
iii) Exposure to UV (for example, 250 W light (wavelength peak: 345 nm, 345 nm)) through a predetermined mask pattern (that is, a pattern of a three-dimensional structure) 73, development, and transfer of the pattern 74 onto the wafer 71 I do. In this way, a cell culture chamber 75 having a three-dimensional structure pattern formed on the surface is obtained.
In this process, a cell culture chamber can be obtained very quickly and easily.
[0020]
[(3) Stamping process]
This process includes the following steps.
(3a) a step of depositing an unpolymerized biodegradable polymer on the substrate.
(3b) A step of laminating a mold having a three-dimensional structure on the layer of the unpolymerized biodegradable polymer and stamping.
(3c) curing the biodegradable polymer to obtain a cell culture chamber having a fine three-dimensional structure formed on the surface.
[0021]
This process can be performed, for example, as shown in FIG. 8 when a thermosetting type is used as the biodegradable polymer.
i) First, an unpolymerized thermosetting biodegradable polymer (PLGA or the like) is applied on a glass wafer 81 to form a biodegradable polymer layer 82.
ii) A mold 83 having a three-dimensional structure formed using a heat-resistant material (for example, PDMS) is laminated on the unpolymerized biodegradable polymer layer 82 and heated as it is to polymerize the biodegradable polymer.
iii) The mold 83 is peeled off to obtain a cell culture chamber 84 having a three-dimensional structure on the surface.
[0022]
When a stamping process is performed using a UV-curable biodegradable polymer, for example, by using a UV-transmissive material (eg, PDMS) as a mold material, the cell culture can be performed as shown in FIG. A chamber can be manufactured.
i) First, an unpolymerized UV-curable biodegradable polymer is applied on a glass wafer 91 to form a biodegradable polymer layer 92.
ii) A mold 93 having a three-dimensional structure created by using PDMS is laminated on an unpolymerized biodegradable polymer layer 92.
iii) UV is irradiated from above the laminated mold 93 through the mold 93 to cure the biodegradable polymer.
iv) The mold 93 is peeled off to obtain a cell culture chamber 94 having a three-dimensional structure on the surface.
[0023]
In the present invention, a UV-curable biodegradable polymer is preferably used. This is because when the above-mentioned thermosetting polymer is used, there is a problem that the support is warped or deformed due to heat, and also, it takes a lot of time for curing and cooling after curing, so that productivity is increased. This is because the problem of inferiority is likely to occur, but such a problem is not observed when a UV-curable polymer is used.
[0024]
[(4) Plasma etching process]
This method includes the following steps (4a) to (4c).
(4a) A mold forming step of forming a photoresist layer on a substrate, exposing and developing through a predetermined mask pattern, transferring the pattern onto the substrate, and forming a mold having a fine three-dimensional structure.
(4b) Optionally, a step of performing plasma etching using the obtained pattern as a mask to coat the surface of the mold. By providing this step, the biodegradable support formed thereon can be easily separated from the mold.
(4c) a step of depositing an unpolymerized biodegradable polymer on the mold to form a biodegradable polymer layer, and polymerizing to obtain a biodegradable support.
(4d) a step of peeling off the obtained support to obtain a cell culture chamber having a fine three-dimensional structure formed on the surface.
[0025]
More specifically, for example, as shown in FIG. 6, i) First, a glass wafer 61 is prepared,
ii) An SU-8 film 62 is formed on the wafer 61 by spin coating. Then
iii) Exposure and development are performed through a predetermined mask pattern (that is, a pattern of a three-dimensional structure) 63, and the pattern 64 is transferred onto the wafer 61 to form a mold 65 having a three-dimensional structure.
iv) A film of a fluorocarbon polymer such as polytetrafluoroethylene is formed by performing plasma etching using the obtained pattern 64 as a mask, and coating the surface.
v) On the obtained mold 65, an unpolymerized UV-curable or thermosetting biodegradable polymer is applied to form a biodegradable polymer layer 66, and polymerized by UV irradiation or heating.
vi) The biodegradable polymer layer 66 is peeled off to obtain a support 67 having a three-dimensional structure pattern formed on the surface.
vii) The obtained support 67 is laminated on another biodegradable sheet 68 such that the three-dimensional structure is on the inside, and a cell culture chamber 69 having a cell fixing portion inside is obtained.
[0026]
The cell culture chamber of the present invention can be obtained by the above-described simple manufacturing method, has a large degree of freedom in design, and can correspond to three-dimensional structures of various designs.
[0027]
【Example】
<Manufacture of cell culture chamber>
In the following production examples, the following compounds were used as biodegradable polymers.
・ Poly (lactide-co-glycolide) (hereinafter referred to as PLGA)
-A polymer (hereinafter, referred to as pCLLA) obtained by polymerizing hexaacrylate of caprolactone-modified dipentaerythritol (trade name: Kyarad DCPA-60) pCLLA is rapidly cured by UV irradiation, and is transparent, and therefore has a cell morphology during culture. Is a biodegradable polymer having advantages such as easy observation.
[0028]
Production Example 1
A cell culture chamber having a cell culture unit having the design shown in FIG. 1 was manufactured as follows using the above-described molding process.
First, a glass wafer was prepared, and an SU-8 film was formed on the wafer by spin coating. Next, exposure and development were performed through a mask pattern having the design shown in FIG. 1, and the pattern was transferred onto a wafer to form a mold having a three-dimensional structure as shown in FIG. Next, a polytetrafluoroethylene film was formed by performing an ion etching treatment, and the surface was coated. An unpolymerized pCLLA was applied on the obtained mold to form a biodegradable polymer layer, and polymerized by UV irradiation. After curing, the biodegradable polymer layer was peeled off to obtain a cell culture chamber having a three-dimensional structure pattern formed on the surface.
[0029]
Further, as a comparative example, a cell culture chamber was prepared in the same manner except that PDMS was used instead of pCLLA, and the shape of the cell fixing portion was compared with that of Production Example 1. As a result, the shape of the cell anchoring portion of Production Example 1 was a favorable shape which was not inferior to that of PDMS (see FIG. 11).
[0030]
Production Example 2
A cell culture chamber having a cell culture unit having the design shown in FIG. 2 was manufactured using the above-described direct photolithography process as follows.
First, a glass wafer was prepared, and unpolymerized pCLLA was applied on the wafer by spin coating to form a pCLLA layer. Next, exposure was performed with 250 W light (wavelength peak: 345 nm, 345 nm) through a mask pattern having a three-dimensional structure having the design shown in FIG. 2, development was performed, and the pattern was transferred onto the wafer. Thus, a cell culture chamber having a three-dimensional structure formed on the surface was obtained. The formed three-dimensional structure was clearly formed to minute parts.
[0031]
Production Example 3
As a mold, a mold made of PDMS was prepared using the cell culture chamber manufactured in Production Example 1 as a mold, and a cell culture chamber was manufactured by the stamping process described above using this PDMS mold.
First, unpolymerized PLGA was applied onto a glass wafer to form a PLGA layer. A mold made of PDMS was laminated on the unpolymerized PLGA layer. UV was irradiated from above the laminated mold through the mold to cure the PLGA. The mold was peeled off to obtain a cell culture chamber having a three-dimensional structure on the surface. As shown in FIG. 3, the formed three-dimensional structure was clearly formed to a minute portion.
[0032]
In addition, a cell culture chamber having a groove as shown in FIG. 2 was prepared by the same method, and this was laminated on a glass substrate with the three-dimensional structure inside, and ink was flowed into the space between them. In addition, almost no leakage of ink to portions other than the grooves was confirmed. This indicates that the obtained cell culture chamber was hardly warped or deformed.
[0033]
Production Example 4
First, a glass wafer was prepared, and an SU-8 film was formed on the wafer by spin coating. Next, exposure / development via the mask pattern and transfer of the pattern were repeated three times to produce a mold having a three-dimensional structure as shown in FIG. Next, a polytetrafluoroethylene film was formed by performing an ion etching treatment, and the surface was coated. On the obtained mold, unpolymerized PDMS was applied and cured to prepare a mold as shown in FIG. A cell culture chamber made of PLGA was manufactured by the stamping process described above using the mold made of PDMS.
[0034]
【The invention's effect】
Since the cell culture chamber of the present invention is formed of a biodegradable material and has a fine three-dimensionally structured cell anchoring portion, a large number of cells can be cultured at a high density. Therefore, it can be applied to the production of an artificial organ that does not contain an exogenous material, and such an artificial organ has a small burden on a patient regardless of whether it is implanted in a living body or not.
[Brief description of the drawings]
FIG. 1 is a diagram showing a first embodiment of a cell culture chamber of the present invention.
FIG. 2 is a view showing a second embodiment of the cell culture chamber of the present invention.
FIG. 3 is a view showing a third embodiment of the cell culture chamber of the present invention.
FIG. 4 is a view showing a fourth embodiment of the cell culture chamber of the present invention.
FIG. 5 is a view showing a fifth embodiment of the cell culture chamber of the present invention.
FIG. 6 is a diagram showing an example of a manufacturing process of the cell culture chamber of the present invention.
FIG. 7 is a diagram showing an example of a manufacturing process of the cell culture chamber of the present invention.
FIG. 8 is a diagram showing an example of a manufacturing process of the cell culture chamber of the present invention.
FIG. 9 is a diagram showing an example of a manufacturing process of the cell culture chamber of the present invention.
FIG. 10 is an SEM diagram of a SU-8 mold used for manufacturing the cell culture chamber shown in FIG.
11 is an SEM diagram of a PDMS mold obtained by using the mold shown in FIG.
FIG. 12 is an SEM diagram of a PDMS mold used for manufacturing the cell culture chamber shown in FIG.
[Explanation of symbols]
61: glass wafer, 62: SU-8 film, 63: mask pattern, 64: pattern, 65: mold, 66: biodegradable polymer layer, 67: support, 68: biodegradable sheet, 69: cell culture chamber 71, glass wafer, 72, biodegradable polymer layer, 73, mask pattern, 74, pattern, 75, cell culture chamber, 81, glass wafer, 82, biodegradable polymer layer, 83, mold, 84, cell culture Chamber, 91: glass wafer, 92: biodegradable polymer layer, 93: mold, 94: cell culture chamber

Claims

A cell culture chamber, wherein a cell fixing portion having a fine three-dimensional structure is formed on the surface and / or inside of a support made of a biodegradable polymer.

The cell culture chamber according to claim 1, wherein the biodegradable polymer is an ultraviolet-curable type.

3. The cell culture chamber according to claim 1, wherein the biodegradable polymer is a polymer containing caprolactone-modified dipentaerythritol hexaacrylate as a monomer.

The cell culture chamber according to any one of claims 1 to 3, wherein a flow path for perfusing a culture solution is provided in the cell fixing part.