JP2004147537A - 環状dnaの伸長固定化法 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】カチオン性両親媒性物質と環状DNAとからなる複合単分子膜を気水界面に作製し、該複合単分子膜を固体基板上への移し取り、それにより固体基板上へ環状DNAを伸長固定化する方法を提供する。
【効果】本発明の方法を用いると、再現的に、効率よく、環状DNAを伸長した状態で固体基板上へ固定化することが可能となる。また、固定化されたDNA試料は、塩基配列解析のための試料として、あるいはこのDNAに特異的に結合するタンパク質の結合配列の特性解析に用いることができる。
【選択図】 なし
Description
【発明の属する技術分野】
本発明は、環状DNAを固体基板上へ伸長、固定化する方法等に関する。
【0002】
【従来の技術】
染色体DNAがもつ塩基配列情報を解読することにより、染色体上に存在する遺伝子が特定できる。しかし、遺伝子の染色体上での位置、遺伝子の並び方、遺伝子間の距離などの情報を知るだけでも、遺伝子解析にとって重要である。
これまでに、DNAをスライドガラス上で伸長し、蛍光色素により遺伝子を光らせ、その位置を直接的に光学顕微鏡で測定する方法が知られていた(X. Michalet et al., Science, 277, 1518−1523 (1997))。しかし、光学顕微鏡の解像度では一本鎖DNAと二本鎖DNAを区別したり、遺伝子の位置を正確に検出することは困難であった。
DNAの分子構造やDNAとタンパク質の間の特異的結合を、より詳細に、例えば1分子のレベルで蛍光像の画像解析などにより調べるためには、固体基板上へDNAを固定化することが必要不可欠である。すなわち、水溶液中では凝集状態にあるDNA分子を伸長して固体基板に固定化する方法が開発されている(非特許文献1:Allemand et al., Biophysical Journal, 73, 2064−2070 (1997))。Allemandらの方法は、特定のpH条件でポリスチレン等にDNAが特異的に結合することを利用し、ポリスチレン等で表面をコートした固体基板にDNAを選択的に結合する方法である。
【非特許文献1】Allemand et al., Biophysical Journal, 73, 2064−2070 (1997)
【0003】
【発明が解決しようとする課題】
前述のAllemandらの方法では、DNAを固体基板上に選択的に結合させるために、DNA分子に末端を必要とした。そのため、末端のない環状DNAに該方法を適用することは困難であった。また、環状DNAを固定化する技術についての開示あるいは示唆をする文献等は見当たらない。本発明は、環状DNAを伸長し、固体基板上に固定化する方法を提供することを目的とするものである。
【0004】
【課題を解決するための手段】
本発明者は上記課題を解決するために鋭意研究を行った結果、再現的に、効率よく、環状DNAを伸長した状態で、固体基板上へ固定化することに成功し、本発明を完成するに至った。
【0005】
すなわち本発明は、環状DNAを含有してなるDNA水溶液上に、カチオン性両親媒性物質を展開し、前記カチオン性両親媒性物質と前記環状DNAとからなる複合単分子膜を形成することを含む環状DNAの伸長固定化方法を提供する。本発明の方法においては、通常、複合単分子膜は、DNA水溶液に予め沈めておいた固体基板を垂直に引き上げることによって、その固体基板上に移し取ることができる。ここで用いられる固体基板は、好ましくはガラス基板である。
また、カチオン性両親媒性物質は、例えば、ジドデシルアンモニウム塩、ジテトラデシルアンモニウム塩、ジヘキサデシルアンモニウム塩、ジオクタデシルアンモニウム塩からなる群から選ばれる。本発明の方法においては、カチオン性両親媒性物質としては、ジオクタデシルアンモニウム塩が好ましい。DNA水溶液を調製する水として、好ましくは、比抵抗値18.3 Ωcm以上に精製された超純水を用いる。カチオン性両親媒性物質を展開するための展開液としては、ベンゼン、エタノール、スペクトロゾールクロロホルム等が用いられる。
また、本発明は、上記のようにして固定された環状DNAを、走査型近接場光学顕微鏡等の光学的解析および形状解析の手段によって解析することを含む環状DNAの解析方法も提供する。
以下、本発明を詳細に説明する。
【0006】
【発明の実施の形態】
本発明は、伸長した状態にある環状DNAを固体基板上へ固定化する方法に関する。具体的には、カチオン性両親媒性物質と環状DNAとからなる複合単分子膜を気水界面に作製し、該複合単分子膜を固体基板上へ移し取り、それにより固体基板上へ環状DNAを伸長固定化する方法に関するものである。ここで、「伸長」とは、例えばランダムなコイル状態にある部分を線状に引き伸ばすことをいう。固体基板上への環状DNAの固定化は、蛍光色素を結合させたDNAを試料として用いることにより、近接場光学顕微鏡等でその蛍光像および形状像を観察することにより確認できる。また、種々の結合特性を示す蛍光色素をDNA試料に結合させることによって、そのDNA試料の解析に役立てることができる。
【0007】
本発明の方法によって固定化される「環状DNA」は、例えばpBR322 DNA、M13mp8 RFI DNAなどの配列既知のDNA、および配列が未決定の環状DNAを含む。本発明によって固定化されるDNAのサイズ(塩基対)は特に限定されないが、例えば、1k〜1Mbp、より好ましくは2k〜100kbpである。配列既知のDNAの場合、そのDNAに特異的に結合するタンパク質の結合配列の特性解析等に、配列未決定のDNAの場合、その塩基配列、塩基数等の解析に用いることができる。DNA試料を、水に溶解しDNA水溶液を調製する。ここで用いられる水としては、固定化されたDNAの解析の妨げとならないように、不純物の混入量ができるだけ少ない純水が好ましい。ここで用いられる純水としては、好ましくは、Milli−Q SPシステム(日本ミリポア社製)等により比抵抗値18.3 Ωcm以上に精製された超純水が用いられる。なお、DNA水溶液は、例えば、1×10−6〜30×10−6 mg/ml、好ましくは5×10−6〜20×10−6 mg/ml、より好ましくは6×10−6〜10×10−6 mg/mlの濃度で調製される。
【0008】
本明細書中、「カチオン性両親媒性物質」とは、分子内に親水基と疎水基を有する物質を指し、例えば、細胞膜の構成物であるリン脂質、糖脂質などがあげられる。本発明では、カチオン性のものであればいずれでも構わないが、ジドデシルアンモニウム塩、ジテトラデシルアンモニウム塩、ジヘキサデシルアンモニウム塩、ジオクタデシルアンモニウム塩などが好ましく用いられる。なかでも、水に溶けにくく、安定な単分子膜を形成するという理由から、ジオクタデシルアンモニウム塩がより好ましい。前記カチオン性両親媒性物質は例えば、ベンゼン、エタノール、スペクトロゾールクロロホルム、好ましくはスペクトロゾールクロロホルムのような溶媒に溶解し、展開溶液とする。この展開溶液は、例えば、0.1〜1 mg/ml、好ましくは0.5〜0.8mg/mlの濃度で調製される。
【0009】
本発明の方法において、基板上への固定化を確認するために、蛍光物質をDNA水溶液に添加し、DNAに結合させることが好ましい。好ましく用いられる蛍光物質としては、例えば、アクリジンオレンジ、臭化エチジウム、DAPI(4’,6−diamidino−2−phenilindole (dihydrochloride))、YOYO(登録商標)−1(Molecular Probe: Quinolinium, 1,1’−[1,3−propanediylbis[(dimethyliminio)−3,1−propanediyl]]bis[4−[(3−methyl−2(3H)−benzoxazolylidene)methyl]]−, tetraiodide)などがあげられるが、本発明では特に、二本鎖DNAに特異的に結合性を示すDAPI、YOYO(登録商標)−1などが好ましく、より強い蛍光を発することからYOYO(登録商標)−1が最適である。YOYO(登録商標)−1は、DNAの塩基対に対してのモル比で1:8以下のときビスインターカレーターとして作用すると考えられている。本発明では、好ましくは1:8以下の比率、具体的には例えば、1:8〜1:10の比率で使用される。
【0010】
複合単分子膜の作製するには、まず、DNA水溶液をガラスセル、ラングミュアトラフ等の容器に入れる。ここでは、特にポリフッ化エチレン(テフロン(登録商標))コーティングしたラングミュアトラフが好ましく用いられる。水溶液量は、後述の固体基板が完全に沈む量であれば、いかなる量であっても構わない。DNA水溶液は、例えば、10℃から30℃、好ましくは18℃から22℃に保持する。次に、マイクロシリンジ等を用いて、10〜25 ml、好ましくは15〜20 mlの展開溶液をDNA溶液表面に展開し、展開溶媒が蒸発するまで一定時間、例えば2から15分、好ましくは3から10分、より好ましくは4から6分間静置する。静置後、フィルムバランスFSD−300を用いてバリアーによる圧縮を、例えば、0.05〜0.2 mm/sec、好ましくは0.1〜0.125 mm/secの速度で行う。この結果、カチオン性両親媒性物質によって形成される単分子膜は正電荷を有するので、負電荷を有しているDNAはその単分子膜に引き寄せられ、気水界面にDNA−カチオン性両親媒性物質の複合単分子膜が形成される。
【0011】
次に、上記のようにして形成されたDNA−カチオン性両親媒性物質の複合単分子膜を基板に移し取る操作を行なう。例えば、複合単分子膜を、DNA水溶液に予め沈めておいた固体基板を垂直に引き上げることによって、その固体基板上に移し取る。ここで、垂直とは、ほぼ垂直を意味し、複合単分子膜にしわがよることなく引き上げることができる限り多少傾斜していてもかまわない。複合膜を移し取るための基板としては、平坦であれば何れの基材を用いたものでもよい。例えば、固定化後に蛍光を観察する場合は、基板自身の蛍光を少なくするために、カバーガラスを用いることが好ましい。ガラス基板は、通常、界面活性剤、例えばデコン90(Decon 90、AR BROWN社製)溶液、続いて超純水を用いて超音波にて洗浄する。上記(1)において作製した複合単分子膜を、予めDNA溶液中に沈めておいた洗浄済みのガラス基板を一定速度、例えば0.5〜5 mm/sec、好ましくは1〜2 mm/secで引き上げることにより、基板上へ移し取る。
ここで、複合単分子膜の形成及びその引き上げ操作について、図1を参照して説明する。図1(a)は、単分子複合膜を形成する器具の概要を示す図、図1(b)は、ラングミュアトラフ中で単分子膜が形成される状況を示す図、そして図1(c)は、複合単分子膜を引き上げる操作を示す図である。
図1(a)中、ポリフッ化エチレン(テフロン(登録商標))コーティングしたラングミュアトラフ1中にDNA水溶液2が入れられている。DNA水溶液2には、引き上げ用の取っ手を有する固体基板3が浸漬される。カチオン性両親媒性物質を含む展開液(不図示)は、マイクロシリンジ4からDNA水溶液2上に展開される。なお、5は温度センサー、6は、カチオン性両親媒性物質の展開液に圧力を与えるバリアー、7は表面圧を測定するためのウィルヘルミー・プレートである。図1(b)に示すように、
DNA試料2aを含有するDNA水溶液2の表面に、カチオン性両親媒性物質8aの単分子膜8が形成されている。このカチオン性両親媒性物質8aにDNA試料2aが静電吸着し、複合単分子膜を形成する。固体基板3はDNA水溶液2中に予め浸漬されている。形成された複合単分子膜を引き上げる際は、図1(c)に示すように、バリアー6を移動し、カチオン性両親媒性物質8aに圧力をかけてカチオン性両親媒性物質8aからなる単分子膜8の密度を高くする。そして、固体基板3をゆっくりと垂直に引き上げることによって、DNA試料2aを伸長させながら固体基板3に移し取る。
【0012】
上記のように固定化されたDNA試料は、塩基配列解析のための試料として有効に用いられる。また、固定化されたDNA試料は、このDNAに特異的に結合するタンパク質の結合配列の特性解析に用いることができる。
【0013】
【実施例】
以下に参考例および実施例を示して、本発明をより詳細に説明するが、これらは本発明の範囲を限定するものではない。
【0014】
実施例1
(1)試薬
気液界面に展開するカチオン性脂質として、ジオクタデシルアンモニウム塩(相互薬工)を使用した。これをスペクトロゾールクロロホルム(和光純薬)を溶媒として、濃度約0.5 mg/mlの展開溶液を調製した。
環状DNAとして、M13mp8 RFI DNA(日本ジーン)およびpBR322 DNA(日本ジーン)を使用した。
DNAが固定化されたことを確認するために、DNAに特異的に結合し、蛍光を発する分子として、YOYO(登録商標)−1(Molecular Probe)を使用した。
【0015】
(2)DNA水溶液の調製
M13mp8 RFI DNA(7229 bp)およびpBR322 DNA(4363 bp)を一晩室温で放置することにより超純水に完全に溶解し、濃度が約0.3 μg/μlとなるように超純水を加えた。これを母液として、終濃度が1.0×10−8 in bpとなるように調製した。固定化を確認するために、YOYO(登録商標)−1を、DNA塩基対に対して、モル比が1:10となるようにDNA水溶液に添加した。YOYO(登録商標)−1をDNA分子に結合させるために、溶液調製後2時間以上静置した。
【0016】
(3)単分子膜の作製
表面圧−分子占有面積(π−A)等温線の測定には、マイクロプロセッサー制御のフィルムバランスFSD−300(USIシステム)を用いた。ポリフッ化エチレン(テフロン(登録商標))コーティングされたラングミュアトラフにDNA水溶液を満たし、20℃に保持した。その後、マイクロシリンジにて15 mlの展開溶液をDNA水溶液の表面に展開し、展開溶媒が蒸発するまで5分間静置した。静置後、FSD−300を用いてバリアーによる圧縮を0.1 mm/secの速度で行った。表面圧は1 cm四方の濾紙片を用いたウィルヘルミー法により測定した。
【0017】
(4)複合膜の移し取り
複合膜を移し取るための基板としてカバーガラスを用いた。ガラス基板を界面活性剤であるdcn90溶液(30 ml/L in Milli−Q 水)に浸漬し、約15分間超音波洗浄した後、さらに超純水中で15分間の超音波洗浄を3回繰り返した。種々の条件下で作製した複合膜を、予めDNA水溶液に沈めておいたガラス基板を2 mm/minの速度で引き上げることにより、基板上へ移し取った。
【0018】
(5)蛍光イメージの観察
前記(4)にて得られた複合膜を移し取った基板を十分乾燥させた後、走査型近接場光学顕微鏡SPA300/SNOAM(SEIKOインストルメンツ)を用いて、基板上のDNA分子の形状を観察した。波長488 nmの励起光のアルゴンイオンレーザーStabilite2017(Spectra−Physics)を用いて、近接場光学顕微鏡のファイバープローブ先端において、約300 μWの出力となるように調整した。YOYO(登録商標)−1からの蛍光を対物レンズで集光し、シングルフォトンカウンティングモジュールSPCM−AQR−14(EG&G)にて検出した。得られた検出フォトン数をSPI3800N(SEIKOインストルメンツ)を用いて画像化し、蛍光像を構成した。
【0019】
(6)蛍光像とヒストグラム
M13mp8 RFI DNAを環状DNAとして用いて得られた蛍光像(a)および蛍光像から得られる直剪の長さに関するヒストグラム(b)を図1に示す。また、pBR322 DNAから得られた蛍光像およびヒストグラムを図2(蛍光像(a)、ヒストグラム(b))に示す。
M13mp8 RFI DNAは7229 bpであり、一塩基対あたりの長さを0.34 nmとすると、全長2458 nmと見積もることができる。ヒストグラムから得られる蛍光像の最長は約1300 nmであることから、M13mp8 RFI DNAは環状のまま伸長され、固定化されていることが明らかとなった。
同様に、pBR322 DNAは4363 bpであり、全長を1477 nmと見積もることができる。ヒストグラムによると、800 nm付近が最長であるので、この場合もpBR322 DNAは環状のまま伸長され、固定化されていると考えられる。
【0020】
【発明の効果】
本発明の方法を用いると、再現的に、効率よく、環状DNAを伸長した状態で固体基板上へ固定化することが可能となる。また、固定化されたDNA試料は、塩基配列解析のための試料として、あるいはこのDNAに特異的に結合するタンパク質の結合配列の特性解析に用いることができる。
【図面の簡単な説明】
【図1】図1(a)は、単分子複合膜を形成する器具の概要を示す図、図1(b)は、ラングミュアトラフ中で単分子膜が形成される状況を示す図、そして図1(c)は、複合単分子膜を引き上げる操作を示す図である。
【図2】M13mp8 RFI DNAを環状DNAとして用いて得られた蛍光像(a)および蛍光像から得られる直線の長さに関するヒストグラム(b)を示す。
【図3】pBR322 DNAを環状DNAとして用いて得られた蛍光像(a)および蛍光像から得られる直線の長さに関するヒストグラム(b)を示す。
Claims (16)
- 環状DNAを含有してなるDNA水溶液上に、カチオン性両親媒性物質を展開し、前記カチオン性両親媒性物質と前記環状DNAとからなる複合単分子膜を形成することを含む環状DNAの伸長固定化方法。
- 前記複合単分子膜を、前記DNA水溶液に予め沈めておいた固体基板を垂直に引き上げることによって、その固体基板上に移し取ることを含む前記請求項1記載の方法。
- 前記固体基板がガラス基板である前記請求項2記載の方法。
- 前記カチオン性両親媒性物質がジドデシルアンモニウム塩、ジテトラデシルアンモニウム塩、ジヘキサデシルアンモニウム塩、ジオクタデシルアンモニウム塩からなる群から選ばれる前記請求項1または2記載の方法。
- 前記カチオン性両親媒性物質がジオクタデシルアンモニウム塩である前記請求項1または2記載の方法。
- 前記DNA水溶液を調製する水として、比抵抗値18.3 Ωcm以上に精製された超純水を用いる前記請求項1または2記載の方法。
- 前記カチオン性両親媒性物質を展開するための展開液として、ベンゼン、エタノール、スペクトロゾールクロロホルムからなる群から選ばれる前記請求項1または2記載の方法。
- 前記展開液が、スペクトロゾールクロロホルムである前記請求項7記載の方法。
- 環状DNAを含有してなるDNA水溶液上に、カチオン性両親媒性物質を展開し、前記カチオン性両親媒性物質と前記環状DNAとからなる複合単分子膜を形成することを含む環状DNAの伸長固定化法によって固定された環状DNAを、走査型近接場光学顕微鏡によって解析することを含む環状DNAの解析方法。
- 前記複合単分子膜を、前記DNA水溶液に予め沈めておいた固体基板を垂直に引き上げることによって、その固体基板上に移し取ることを含む前記請求項9記載の方法。
- 前記固体基板がガラス基板である前記請求項9または10記載の方法。
- 前記カチオン性両親媒性物質がジドデシルアンモニウム塩、ジテトラデシルアンモニウム塩、ジヘキサデシルアンモニウム塩、ジオクタデシルアンモニウム塩からなる群から選ばれる前記請求項9または10記載の方法。
- 前記カチオン性両親媒性物質がジオクタデシルアンモニウム塩である前記請求項9または10記載の方法。
- 前記DNA水溶液を調製する水として、比抵抗値18.3 Ωcm以上に精製された超純水を用いる前記請求項9または10記載の方法。
- 前記カチオン性両親媒性物質を展開するための展開液として、ベンゼン、エタノール、スペクトロゾールクロロホルムからなる群から選ばれる前記請求項9または10記載の方法。
- 前記展開液が、スペクトロゾールクロロホルムである前記請求項15記載の方法。
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