【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ウロキナーゼ型プラスミノーゲンアクチベーター受容体関連タンパク質（ｕＰＡＲＡＰ）の細胞外ドメインを認識する抗体等のｕＰＡＲＡＰに特異的に結合するペプチド・タンパク質、低分子化合物等の化合物を有効成分として含有する脳腫瘍の診断・治療薬やｕＰＡＲＡＰをコードするＤＮＡ又はＲＮＡのアンチセンス鎖を有効成分として含有する脳腫瘍の診断・治療薬、それらを用いた脳腫瘍の治療方法等に関する。
【０００２】
【従来の技術】
近年マイクロアレイの技術が発達し、一度に多くの遺伝子及びタンパク質の発現を解析することを可能にした。特にＤＮＡマイクロアレイによる癌組織における遺伝子発現の解析によって癌の進行や薬剤の感受性の面で新たな知見が得られている。最近、遺伝子発見モニタリング、シークエンス解析及びジェノタイピングなどの広範な核酸解析に利用可能なジーンチップ（Ｇｅｎｅ Ｃｈｉｐ）が、米国アフィメトリクス（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ）社から販売されている。
【０００３】
他方、ウロキナーゼ型プラスミノーゲンアクチベーター受容体関連タンパク質（ｕＰＡＲＡＰ）は、ＫＩＡＡ０７０９あるいはＥｎｄｏ１８０としても報告され、また、ｕＰＡＲＡＰを特異的に認識する抗体も知られている。ＫＩＡＡ０７０９は、５０ｋＤａ以上の分子量を持つタンパク質をコードするヒト脳から得られた１００個の新規なｃＤＮＡクローン（ＫＩＡＡ０６１１〜ＫＩＡＡ０７１０遺伝子と名付けられた）のうちのＫＩＡＡ０７０９遺伝子（アクセッションナンバーＡＢ０１４６０９）がコードするタンパク質として報告されている（非特許文献１）。また、抗Ｅｎｄｏ１８０モノクローナル抗体とポリクローナル抗血清を用いて、Ｅｎｄｏ１８０の完全ｃＤＮＡをクローニングし、マクロファージのマンノース受容体と関連するエンドサイト−シスリサイクリングタンパク質であるＥｎｄｏ１８０が、繊維芽細胞、内皮細胞、マクロファージで発現し、レクチン受容体として機能することも報告されている（非特許文献２）。ｕＰＡＲＡＰは、マクロファージ・マンノース受容体タンパク質の一種で、８Ｃタイプ炭水化物認識領域に加えて、コラーゲン結合型（フィブロネクチンタイプＩＩ）領域を含み、コラーゲン及びコラーゲンＶと強く結合することが報告されている（非特許文献３）。
【０００４】
また、ウロキナーゼ型プラスミノーゲンアクチベーター（ｕＰＡ）及びｕＰＡ受容体（ｕＰＡＲ）は、プラスミノーゲン活性化システムにおいて重要な要素であり、組織の再構築及び癌浸潤を促進する働きをし、かかるｕＰＡとｕＰＡＲとの複合体のクリアランスに関与する内在性受容体としてのｕＰＡＲＡＰや、ｕＰＡＲＡＰを特異的に認識する抗ｕＰＡＲＡＰポリクロナール抗体についての報告もなされている（非特許文献４）。この報告によると、良性胸部障害及び悪性胸部障害においてｕＰＡＲＡＰの発現を調べたところ、健常な胸部組織では陰性であったものの、すべての良性障害及び非浸潤乳管癌では障害に関連する繊維芽様細胞及び筋上皮細胞中で免疫反応性を示し、浸潤癌では、ｕＰＡＲＡＰの免疫反応性は腫瘍に関連する間葉系細胞に限定され、ｕＰＡＲＡＰが筋線維芽細胞及びマクロファージ中に局在化しているとされている。
【０００５】
【非特許文献１】
ＤＮＡ Ｒｅｓ．， ５（３）， １６９−１７６， １９９８
【非特許文献２】
Ｊ． Ｃｅｌｌ Ｓｃｉ．， １１３， ６， １０２１−１０３２， ２０００
【非特許文献３】
Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．， ２７５（３）， １９９３−２００２， ２０００ Ｊａｎ ２１
【非特許文献４】
Ｉｎｔ． Ｊ． Ｃａｎｃｅｒ， １， ９８， ６５６−６４， ２００２
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の課題は、腫瘍、特に脳腫瘍の治療薬や診断薬、脳腫瘍の検出・診断用プローブ、脳腫瘍の診断キット、腫瘍、特に脳腫瘍の治療方法、抗脳腫瘍剤のスクリーニング方法を提供することにある。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、ヒト脳腫瘍患者の約１１，０００遺伝子の中から、ヒト脳腫瘍において非癌部脳組織と比較し顕著に発現が亢進している１６個の遺伝子をＧｅｎｅＣｈｉｐ解析により選び出し、その中からＥＳＴデーターベースを用いたスクリーニングにより絞り込み、ＲＴ−ＰＣＲやリアルタイム定量ＰＣＲを用いた解析により、ｕＰＡＲＡＰが腫瘍、特に脳腫瘍で高発現していることを見い出し、本発明を完成するに至った。
【０００８】
すなわち本発明は、ｕＰＡＲＡＰに特異的に結合するペプチド・タンパク質、低分子化合物等の化合物を有効成分として含有することを特徴とする腫瘍の治療薬（請求項１）や、ｕＰＡＲＡＰに特異的に結合するペプチド・タンパク質、低分子化合物等の化合物が、ｕＰＡＲＡＰの細胞外ドメインを特異的に認識する抗体であることを特徴とする請求項１記載の腫瘍の治療薬（請求項２）や、ｕＰＡＲ及び／又はＰｒｏ−ｕＰＡに特異的に結合するペプチド・タンパク質、低分子化合物等の化合物を有効成分として含有することを特徴とする腫瘍の治療薬（請求項３）や、ｕＰＡＲＡＰ、ｕＰＡＲ及び／又はＰｒｏ−ｕＰＡをコードするＤＮＡ又はＲＮＡのアンチセンス鎖の全部又は一部を有効成分として含有することを特徴とする腫瘍の治療薬（請求項４）や、腫瘍が脳腫瘍であることを特徴とする請求項１〜４のいずれか記載の腫瘍の治療薬（請求項５）に関する。
【０００９】
また本発明は、ｕＰＡＲＡＰに特異的に結合するペプチド・タンパク質、低分子化合物等の化合物を腫瘍患者に投与することを特徴とする腫瘍の治療方法（請求項６）や、ｕＰＡＲＡＰに特異的に結合するペプチド・タンパク質、低分子化合物等の化合物が、ｕＰＡＲＡＰの細胞外ドメインを特異的に認識する抗体であることを特徴とする請求項６記載の腫瘍の治療方法（請求項７）や、ｕＰＡＲ及び／又はＰｒｏ−ｕＰＡに特異的に結合するペプチド・タンパク質、低分子化合物等の化合物を腫瘍患者に投与することを特徴とする腫瘍の治療方法（請求項８）や、ｕＰＡＲＡＰ、ｕＰＡＲ及び／又はＰｒｏ−ｕＰＡをコードするＤＮＡ又はＲＮＡのアンチセンス鎖の全部又は一部を腫瘍患者に投与することを特徴とする腫瘍の治療方法（請求項９）や、腫瘍が脳腫瘍であることを特徴とする請求項６〜９のいずれか記載の腫瘍の治療方法（請求項１０）に関する。
【００１０】
さらに本発明は、ｕＰＡＲＡＰに特異的に結合するペプチド・タンパク質、低分子化合物等の化合物を有することを特徴とする腫瘍の診断薬（請求項１１）や、ｕＰＡＲＡＰに特異的に結合するペプチド・タンパク質、低分子化合物等の化合物が、ｕＰＡＲＡＰの細胞外ドメインを特異的に認識する抗体であることを特徴とする請求項１１記載の腫瘍の診断薬（請求項１２）や、ｕＰＡＲ及び／又はＰｒｏ−ｕＰＡに特異的に結合するペプチド・タンパク質、低分子化合物等の化合物を有することを特徴とする腫瘍の診断薬（請求項１３）や、ｕＰＡＲＡＰ、ｕＰＡＲ及び／又はＰｒｏ−ｕＰＡをコードするＤＮＡ又はＲＮＡのアンチセンス鎖の全部又は一部を有することを特徴とする腫瘍の診断薬（請求項１４）や、腫瘍が脳腫瘍であることを特徴とする請求項１１〜１４のいずれか記載の腫瘍の診断薬（請求項１５）や、ＲＮＡ抽出液、ｃＤＮＡ及びｃＲＮＡ合成酵素、ＤＮＡチップ若しくはオリゴヌクレオチドチップ又はタンパク質チップ、プローブ及びｕＰＡＲＡＰ増幅用プライマー、抗ｕＰＡＲＡＰ抗体を備えたことを特徴とする脳腫瘍の診断キット（請求項１６）や、腫瘍が脳腫瘍であることを特徴とする請求項１６記載の腫瘍の診断キット（請求項１７）や、ｕＰＡＲＡＰ遺伝子を含む発現ベクターを導入した細胞を被検物質の存在下で培養し、ｕＰＡＲＡＰの発現及び／又は機能低下の程度を測定評価することを特徴とする抗腫瘍剤のスクリーニング方法（請求項１８）や、ｕＰＡＲＡＰとｕＰＡＲを膜表面に共発現した細胞に、被検物質の存在下、Ｐｒｏ−ｕＰＡを接触せしめ、Ｐｒｏ−ｕＰＡとｕＰＡＲの結合の程度を測定評価することを特徴とする抗腫瘍剤のスクリーニング方法（請求項１９）や、ｕＰＡＲＡＰ又はその一部分を披検物質と接触させ、披検物質のｕＰＡＲＡＰに対する結合の強さの程度を測定評価することを特徴とする抗腫瘍剤のスクリーニング方法（請求項２０）や、抗腫瘍剤が抗脳腫瘍剤であることを特徴とする請求項１８〜２０のいずれか記載の抗腫瘍剤のスクリーニング方法（請求項２１）に関する。
【００１１】
【発明の実施の形態】
脳腫瘍患者から摘出した脳腫瘍組織において非癌部と発現レベルが異なる遺伝子やタンパク質は、脳腫瘍組織と脳非癌部組織との比較から得ることができる。まず複数の患者より提供された脳非癌部組織における各遺伝子やタンパク質発現レベルの平均を得る。次に、各遺伝子やタンパク質発現レベルの平均をそれぞれの患者の脳腫瘍組織中の各伝子又はタンパク質の発現レベルと比較し、多くの患者で非癌部の平均よりも発現が亢進している遺伝子又はタンパク質を選択する。また、正常組織との発現の違いの程度によって、脳腫瘍組織において発現が亢進している遺伝子をランク付けすることもできる。脳腫瘍組織及び非癌部組織における遺伝子の発現は、ＲＮＡの発現レベル又はタンパク質の発現レベルで解析することができ、多くの場合、ＲＮＡやタンパク質の発現レベルは、ＤＮＡマイクロアレイ、ＲＴ−ＰＣＲ、ノーザンブロッティング、ＲＮａｓｅ プロテクションアッセイ、ウエスタンブロッティング、ＥＬＩＳＡ法、タンパク質アレイといった一般によく知られた方法で測定することができ、フルオロセインやロダミン、ルミノールによる化学蛍光又は３Ｈ、１４Ｃ、３５Ｓ、３３Ｐ、３２Ｐ、１２５Ｉといった放射性同位体による放射線、光学的密度を測定することにより行われる。かかる方法により得られた脳腫瘍組織で特に発現が亢進した遺伝子やタンパク質に関する知見から、本発明の脳腫瘍等の腫瘍の治療・診断薬は導かれる。
【００１２】
本発明の脳腫瘍等の腫瘍の治療薬としては、ｕＰＡＲＡＰに特異的に結合するペプチド・タンパク質、低分子化合物等の化合物を有効成分として含有するものであれば特に制限されるものではなく、ｕＰＡＲＡＰに特異的に結合するペプチド・タンパク質、低分子化合物等の化合物としては、ｕＰＡＲＡＰの細胞外ドメインを特異的に認識する抗体の他、コラーゲンＶ、レクチン、Ｎ−アセチルグルコサミン、グリコプロテイン、マトリックスメタロプロテアーゼ、放線菌やカビの生産する天然物化合物、合成化合物、及びこれらの誘導体等を挙げることができる。また、本発明の脳腫瘍等の腫瘍の治療薬としては、ｕＰＡＲ及び／又はＰｒｏ−ｕＰＡに特異的に結合するペプチド・タンパク質、低分子化合物等の化合物を有効成分として含有するものであれば特に制限されるものではなく、ｕＰＡＲ及び／又はＰｒｏ−ｕＰＡに特異的に結合するペプチド・タンパク質、低分子化合物等の化合物としては、ｕＰＡＲやＰｒｏ−ｕＰＡを特異的に認識する抗体を挙げることができる。さらに、本発明の脳腫瘍等の腫瘍の治療薬としては、ｕＰＡＲＡＰ、ｕＰＡＲ及び／又はＰｒｏ−ｕＰＡをコードするＤＮＡ又はＲＮＡのアンチセンス鎖の全部又は一部を有効成分として含有するものであれば特に制限されるものではなく、これらアンチセンス鎖の全部又は一部はベクター等に組み込んだ形態で用いることもできる。
【００１３】
上記ｕＰＡＲＡＰの細胞外ドメインを特異的に認識する抗体や、ｕＰＡＲやＰｒｏ−ｕＰＡを特異的に認識する抗体としては、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、一本鎖抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、２つのエピトープを同時に認識することができる二機能性抗体等を例示することができる。これら抗体は、慣用のプロトコールを用いて、動物（好ましくはヒト以外）にｕＰＡＲＡＰ等のタンパク質又はエピトープを含む断片、類似体若しくはｕＰＡＲＡＰ等を膜表面に発現している細胞を投与することにより産生され、例えばモノクローナル抗体の調製には、連続細胞系の培養物により産生される抗体をもたらす、ハイブリドーマ法（Ｎａｔｕｒｅ ２５６， ４９５−４９７， １９７５）、トリオーマ法、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ法（Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｔｏｄａｙ， ４， ７２， １９８３）及びＥＢＶ−ハイブリドーマ法（ＭＯＮＯＣＬＯＮＡＬ ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ ＡＮＤ ＣＡＮＣＥＲ ＴＨＥＲＡＰＹ， ７７−９６， Ａｌａｎ Ｒ．Ｌｉｓｓ， Ｉｎｃ．，１９８５）など任意の方法を用いることができる。
【００１４】
また、一本鎖抗体をつくるために、一本鎖抗体の調製法（米国特許第４，９４６，７７８ 号、米国特許第５，２６０，２０３号、米国特許第５，０９１，５１３号、米国特許第５，４５５，０３０号）を用いることができ、ヒト化抗体をつくるために、ヒト化抗体の調製法（米国特許第５，５８５，０８９号、Ｎａｔｕｒｅ， ３２１， ５２２−５２５， １９８６、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ， ４，７７３−７８３， １９９１）を用いることができ、キメラ抗体をつくるために、キメラ抗体の調製法（米国特許第４，８１６，５６７号、Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２２９，１２０２−１２０７， １９８５、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ， ４， ２１４， １９８６、Ｎａｔｕｒｅ， ３１２， ６４３−６４６， １９８４、Ｎａｔｕｒｅ， ３１４， ２６８．２７０， １９８５）を用いることができる。二機能性抗体は、２つの関連した抗体を産生する２つのモノクローナル細胞系同士のハイブリッド、又は２つの抗体の断片の化学結合によって産生することができ、例えば、ｕＰＡＲＡＰとｕＰＡＲとに同時に結合しうる二機能性抗体を挙げることができる。
【００１５】
また、上記抗体のＦａｂ断片やＦ（ａｂ’）２断片等も、上記抗体と同様に、ｕＰＡＲＡＰ等に特異的に結合するペプチド・タンパク質、低分子化合物等の化合物として例示することができる。例えば、Ｆａｂ断片は抗体をパパイン等で処理することにより、またＦ（ａｂ’）２断片はペプシン等で処理することにより調製することができる。
【００１６】
本発明の脳腫瘍等の腫瘍の治療方法としては、上述のｕＰＡＲＡＰに特異的に結合するペプチド・タンパク質、低分子化合物等の化合物を脳腫瘍患者に投与する方法であれば特に制限されるものではなく、ｕＰＡＲＡＰに特異的に結合するペプチド・タンパク質、低分子化合物等の化合物としては、上述のｕＰＡＲＡＰの細胞外ドメインを特異的に認識する抗体を好適に例示することができる。また、本発明の脳腫瘍等の腫瘍の治療方法としては、上述のｕＰＡＲ及び／又はＰｒｏ−ｕＰＡに特異的に結合するペプチド・タンパク質、低分子化合物等の化合物を脳腫瘍患者に投与する方法であれば特に制限されない。さらに、本発明の脳腫瘍等の腫瘍の治療薬としては、ｕＰＡＲＡＰ、ｕＰＡＲ及び／又はＰｒｏ−ｕＰＡをコードするＤＮＡ又はＲＮＡのアンチセンス鎖の全部又は一部を有効成分として含有するものであれば特に制限されるものではなく、これらアンチセンス鎖の全部又は一部はそのまま投与してもよいが、ベクター等に組み込んだ形態で投与することもできる。
【００１７】
上記本発明の脳腫瘍等の腫瘍の治療薬や、後述する本発明のスクリーニング方法により得られる抗脳腫瘍剤等の抗腫瘍剤を医薬品として用いる場合は、薬学的に許容される通常の担体、結合剤、安定化剤、賦形剤、希釈剤、ｐＨ緩衝剤、崩壊剤、可溶化剤、溶解補助剤、等張剤などの各種調剤用配合成分を添加することができる。またこれら治療薬や抗脳腫瘍剤は、経口的又は非経口的に投与することができる。すなわち通常用いられる投与形態、例えば粉末、顆粒、カプセル剤、シロップ剤、懸濁液等の剤型で経口的に投与することができ、あるいは、例えば溶液、乳剤、懸濁液等の剤型にしたものを注射の型で非経口投与することができる他、スプレー剤の型で鼻孔内投与することもできる。
【００１８】
本発明の脳腫瘍等の腫瘍の診断薬としては、上述のｕＰＡＲＡＰの細胞外ドメインを特異的に認識する抗体などのｕＰＡＲＡＰに特異的に結合するペプチド・タンパク質、低分子化合物等の化合物を有するものを挙げることができ、また、本発明の脳腫瘍等の腫瘍の診断薬としては、上述のｕＰＡＲ及び／又はＰｒｏ−ｕＰＡに特異的に結合するペプチド・タンパク質、低分子化合物等の化合物を有するものや、上述のｕＰＡＲＡＰ、ｕＰＡＲ及び／又はＰｒｏ−ｕＰＡをコードするＤＮＡ又はＲＮＡのアンチセンス鎖の全部又は一部を有するものであれば特に制限されるものではなく、かかるアンチセンス鎖は脳腫瘍等の腫瘍の検出・診断用プローブとして有利に用いることができる。上記抗体などの化合物やアンチセンス鎖は、通常標識されているものを用いることが好ましい。標識物質としては、単独で又は他の物質と反応することにより検出可能なシグナルをもたらすことができる物質、例えば、酵素、蛍光物質、化学発光物質、ビオチン、アビジンあるいは放射性同位体等を挙げることができる。具体的には、ペルオキシダーゼ（例えば、ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ）、アルカリフォスファターゼ、β−Ｄ−ガラクトシダーゼ、グルコースオキシダーゼ、グルコ−ス−６−ホスフェートデヒドロゲナーゼ、アルコール脱水素酵素、リンゴ酸脱水素酵素、ペニシリナーゼ、カタラーゼ、アポグルコースオキシダーゼ、ウレアーゼ、ルシフェラーゼ若しくはアセチルコリンエステラーゼ等の酵素、フルオレスセインイソチオシアネート、フィコビリタンパク、希土類金属キレート、ダンシルクロライド若しくはテトラメチルローダミンイソチオシアネート等の蛍光物質、３Ｈ 、１４Ｃ、１２５Ｉ若しくは１３１Ｉ等の放射性同位体、ビオチン、アビジン、又は化学発光物質を挙げることができる。上記の放射性同位体及び蛍光物質は、単独で検出可能なシグナルをもたらすことができる。一方、酵素、化学発光物質、ビオチン及びアビジンは、単独では検出可能なシグナルをもたらすことができないため、さらに１種以上の他の物質と反応することにより検出可能なシグナルをもたらすことができる。例えば、酵素の場合には少なくとも基質が必要であり、酵素活性を測定する方法（比色法、蛍光法、生物発光法あるいは化学発光法等）に依存して種々の基質が用いられる。また、ビオチンの場合には少なくともアビジンあるいは酵素修飾アビジン（例えば、ストレプトアビジン−β−ガラクトシダーゼ（Ｓｔｒｅｐｔｏａｖｉｄｉｎ−β−ｇａｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅ））を基質として反応させるのが一般的である。
【００１９】
本発明の脳腫瘍等の腫瘍の診断キットとしては、ノーザン・ブロット、ｉｎ ｓｉｔｕ ハイブリダイゼーション、ＲＮａｓｅプロテクションアッセイ、ウエスタンブロッティング、ＥＬＩＳＡ法、ＲＴ−ＰＣＲといった選択した遺伝子やタンパク質の発現を評価するのに必要な、ＲＮＡ抽出液、ｃＤＮＡ及びｃＲＮＡ合成酵素、ＤＮＡチップ若しくはオリゴヌクレオチドチップ又はタンパク質チップ、プローブ及びｕＰＡＲＡＰ増幅用プライマー、抗ｕＰＡＲＡＰ抗体を備えたものであれば特に制限されないが、ＧＡＰＤＨ（グリセルアルデヒド−３−フォスフェートデヒドロゲナーゼ）遺伝子等のコントロール遺伝子増幅用プライマー、ＧＡＰＤＨ等に対する抗体などをも有するものが好ましい。かかる本発明の脳腫瘍の診断キットを用いて、脳組織、血液あるいは他の組織おいてｕＰＡＲＡＰ遺伝子やｕＰＡＲＡＰの発現レベルを調べることによって脳腫瘍の診断を行うことが可能となる。
【００２０】
本発明の抗脳腫瘍剤のスクリーニング方法としては、ｕＰＡＲＡＰ遺伝子を含む発現ベクターを導入した細胞を被検物質の存在下で培養し、ｕＰＡＲＡＰの発現及び／又は機能低下の程度、例えば、プラスミノーゲンアクチベーター等のｕＰＡＲＡＰ活性化シグナルにより増幅される遺伝子を測定評価する方法や、ｕＰＡＲＡＰとｕＰＡＲを膜表面に共発現した細胞に、被検物質の存在下、Ｐｒｏ−ｕＰＡを接触せしめ、Ｐｒｏ−ｕＰＡとｕＰＡＲの結合の程度、例えば、プラスミノーゲンアクチベーター等のｕＰＡＲＡＰ活性化シグナルにより増幅される遺伝子を測定評価する方法や、ｕＰＡＲＡＰ又はｕＰＡＲＡＰの細胞外ドメイン等その一部分を披検物質と接触させ、披検物質のｕＰＡＲＡＰに対する結合の強さの程度、例えば、披検物質のｕＰＡＲＡＰに対する結合の強さを測定評価するであれば特に制限されるものではなく、上記細胞としては、大腸菌、ストレプトミセス、枯草菌、ストレプトコッカス、スタフィロコッカス等の細菌原核細胞や、酵母、アスペルギルス等の真核細胞や、ドロソフィラＳ２、スポドプテラＳｆ９等の昆虫細胞や、Ｌ細胞、ＣＨＯ細胞、ＣＯＳ細胞、ＨｅＬａ細胞、Ｃ１２７細胞、ＢＡＬＢ／ｃ３Ｔ３細胞（ジヒドロ葉酸レダクターゼやチミジンキナーゼなどを欠損した変異株を含む）、ＢＨＫ２１細胞、ＨＥＫ２９３細胞、Ｂｏｗｅｓメラノーマ細胞、卵母細胞等の動植物細胞などを挙げることができ、上記ｕＰＡＲＡＰ等を発現することができる発現ベクターの細胞への導入は、Ｄａｖｉｓら（ＢＡＳＩＣ ＭＥＴＨＯＤＳ ＩＮ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＢＩＯＬＯＧＹ， １９８６）及びＳａｍｂｒｏｏｋら（ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＣＬＯＮＩＮＧ： Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ， ２ｎｄ Ｅｄ．， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， Ｎ．Ｙ．， １９８９）などの多くの標準的な実験室マニュアルに記載される方法、例えば、リン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介トランスフェクション、トランスベクション（ｔｒａｎｓｖｅｃｔｉｏｎ）、マイクロインジェクション、カチオン性脂質媒介トランスフェクション、エレクトロポレーション、形質導入、スクレープローディング （ｓｃｒａｐｅ ｌｏａｄｉｎｇ）、弾丸導入（ｂａｌｌｉｓｔｉｃ ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ）、感染等を例示することができる。
【００２１】
上記ｕＰＡＲＡＰ活性化シグナルにより増幅される遺伝子は、定量的ＰＣＲにより測定することができる。定量的ＰＣＲは、標的遺伝子及びコントロール遺伝子の増幅産物の量に基づいて、生物集団中の異種個体の存在割合を定量的に測定することを可能にするＰＣＲである。例えば、定量的な測定を可能にするような反応条件下でＰＣＲを行い、増幅産物を電気泳動にかけ、増幅産物に対応するバンドの強度に基づいて定量的測定を達成することができる。より簡便かつ正確に定量的測定を実施するためには、増幅産物の経時的定量的な測定を可能にするＰＣＲ用装置（リアルタイム（Ｒｅａｌ Ｔｉｍｅ）ＰＣＲ装置）を使用することが好ましい。このようなＰＣＲ装置として、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（ロシュ社製）、ＡＢＩ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄｅｔｅｃｔｏｒ ＰＲＩＳＭ ７７００（パーキンエルマーバイオシステムズ社製）などが市販されている。リアルタイムＰＣＲを行う方法としては、ＴａｑＭａｎ法（特許第２８２５９７６号）、ハイブリダイゼーション法あるいはサイバーグリーンＩなどのインターカレーターを用いる方法等を挙げることができる。
【００２２】
【実施例】
以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明の技術的範囲はこれらの例示に限定されるものではない。
実施例１（ヒト脳腫瘍検体の調整）
慶應義塾大学病院において外科的治療を受けた１１人の患者からヒト脳腫瘍組織、及び隣接正常部を採取した。手術前にすべての患者からインフォームドコンセントを書面により得た。研究プロトコールは慶應義塾大学医学部のＩＲＢＨＵにより承認された。すべての患者に対する脳腫瘍の組織学的診断は術後に行われ、グリオーマの診断を得たものをヒト脳腫瘍検体とした。採取したヒト非癌部脳組織と脳腫瘍組織は液体窒素中又はドライアイスを入れたアセトン中で凍結し、必要に応じてＯ．Ｃ．Ｔ．コンパウンドに埋胞し、−７０℃から−８０℃の間で保存し、ヒト脳腫瘍において非癌部脳組織と比較し顕著に発現が亢進している遺伝子又はタンパク質を同定するために用いた。
【００２３】
実施例２（組織からのＲＮＡ抽出）
組織片（約１２５ｍ３）はＴＲＩＺＯＬ又はＳｅｐａｓｏｌ−ＲＮＡＩ中でポリトロンにより破砕された（最高速度で５秒間×２回）。クロロホルムを添加後、１５，０００×ｇで１０分間遠心し、ＲＮＡを含んだ水層を採取した。イソプロピルアルコールを用いトータルＲＮＡを沈殿させ、７０％エタノールで１度洗浄し、それをＤＥＰＣ処理Ｈ２Ｏに溶解した。トータルＲＮＡは１．５ユニットのＤｎａｓｅ Ｉで処理し、再度、ＴＲＩＺＯＬ／クロロホルム抽出を行った後に、エタノール沈殿し、ＤＥＰＣ処理Ｈ２Ｏに懸濁した。その後、Ｒｎｅａｓｙ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔを使い、低分子の核酸を除去した。トータルＲＮＡの質はアガロースゲルから２８Ｓと１８ＳリボソームＲＮＡの比で確認した。精製したトータルＲＮＡは７０％エタノール中で−８０℃に使用まで保存した。
【００２４】
実施例３（ｃＤＮＡの合成と標識したｃＲＮＡの合成）
ｃＤＮＡの合成はＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ Ｃｈｏｉｃｅ Ｓｙｓｔｅｍを用いて行った。５マイクログラムの精製したトータルＲＮＡとＴ７プロモーター配列を有するオリゴｄＴプライマーを用いて、２００ユニットの ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＩＩ 逆転写酵素で４２℃１時間反応させ（１ｓｔ ｓｔｒａｎｄのｃＤＮＡを合成した後に２ｎｄ ｓｔｒａｎｄのｃＤＮＡを合成し）、フェノール／クロロホルムで抽出し、Ｐｈａｓｅ Ｌｏｃｋ Ｇｅｌにて精製した。合成したｃＤＮＡをテンプレートにし、ＭＥＧＡｓｃｒｉｐｔ Ｔ７キットを用いてｃＲＮＡを合成した。２マイクロリットルのＴ７ポリメラーゼを含む酵素ミックスと７．５ｍＭのＡＴＰ、ＧＴＰと５．６２５ｍＭのＣＴＰ、ＵＴＰ及び１．８７５ｍＭのＢｉｏ−１１−ＣＴＰ、Ｂｉｏ−１６−ＵＴＰとｃＤＮＡを３７℃、６時間反応させた。未反応や短いオリゴヌクレオチドはＣＨＲＯＭＡＳＰＩＮを用いて除去した。得られたｃＲＮＡはエタノール沈殿により回収した。ｃＲＮＡの性質は電気泳導により確認した。精製したｃＲＮＡは使用まで７０％エタノール中で−８０℃で保存した。
【００２５】
実施例４（脳腫瘍患者の癌、非癌部における遺伝子発現解析）
脳腫瘍患者の原発癌の遺伝子発現は高密度オリゴヌクレオチドマイクロアレイを用いて試験した。チップへハイブリダイゼーションするにあたり、ｃＲＮＡを４０ｍＭトリス−酢酸緩衝液（ｐＨ８．１）、１００ｍＭ酢酸カリウム、３０ｍＭ酢酸マグネシウム中で９５℃、３５分間反応させ、断片化を行った。ハイブリダイゼーションは２００μｌ中、０．１Ｍ ＭＥＳ ｐＨ６．７（２−（Ｎ−Ｍｏｒｐｈｏｌｉｎｏ）ｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ ａｃｉｄ）、１Ｍ ＮａＣｌ、０．０１％ Ｐｏｌｙｏｘｙｌｅｎｅ（１０）ｏｃｔｙｌｐｈｅｎｙｌ ｅｔｈｅｒ、２０μｇ ｈｅｒｒｉｎｇ Ｓｐｅｒｍ ＤＮＡ、１００μｇ アセチル化ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ ａｌｂｕｍｉｎ、１０μｇ断片化したｃＲＮＡ、ビオチン化したコントロールオリゴヌクレオチド（ｂｉｏｔｉｎ−５’−ＣＴＧＡＡＣＧＧＴＡＧＣＡＴＣＴＴＧＡＣ−３’）を含むサンプルで４５℃、１２時間行った。チップを０．１Ｍ ＭＥＳ ｐＨ６．７、０．１Ｍ ＮａＣｌ、０．０１％ Ｐｏｌｙｏｘｙｌｅｎｅ（１０） ｏｃｔｙｌｐｈｅｎｙｌ ｅｔｈｅｒ緩衝液で洗浄後、ビオチン化した抗ストレプトアビジン抗体とチップを反応させた後に、ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ Ｒ−ｐｈｙｃｏｅｒｙｔｈｒｉｎによりシグナルを増幅させるように処理した。各ピクセルの蛍光強度はＨＰ社製レーザースキャナー（ＧｅｎｅＡｒｒａｙ Ｓｃａｎｎｅｒ Ｇ２５００Ａ）にて測定し、発現強度と信頼度（Ｐｒｅｓｅｎｔ／Ａｂｓｅｎｔ Ｃａｌｌ）をＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘのソフトウエアＭｉｃｒｏａｒｒａｙ Ｓｕｉｔｅ ｖｅｒ．４．０により算出した。この実験により、ヒト脳腫瘍患者の約１１，０００遺伝子の発現を測定した。
【００２６】
実施例５（Ｇｅｎｅ Ｃｈｉｐ解析）
腫瘍組織と隣接正常組織において異なる（発現をする）遺伝子群を同定するため、Ｇｅｎｅ Ｃｈｉｐ解析を行った。（オリゴ）ＤＮＡチップの感受性を考慮し、ａｖｅｒａｇｅ ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ （発現レベルに相当）が２０以下のものは２０に繰り上げた。遺伝子毎に３検体のヒト正常脳組織のａｖｅｒａｇｅ ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ の平均を求め、求めた平均の値と各々１１検体のヒト脳腫瘍組織のａｖｅｒａｇｅ ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅを比較した。脳腫瘍組織の１１検体の全てにおいて、正常脳組織の平均と比較して３倍以上の発現量（ａｖｅｒａｇｅ ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅの比）を示した遺伝子を選び出した。その結果、図１に示すように、ｇｌｕｔａｍａｔｅ ｐｙｒｕｖａｔｅ ｔｒａｎｓａｍｉｄａｓｅ（ＧＰＴ）、Ｈｏｍｏ Ｓａｐｉｅｎｓ Ｃｌｏｎｅ２３９３３（Ｈｕｍａｎ Ｃｌｏｎｅ ２３９３３）、Ｇタンパク質結合型レセプター（ＥＤＧ４）、Ｎｕｃｌｅｏｐｌａｓｍｉｎ−３（ＮＰＭ３）、ｖａｓｃｕｌａｒ ｃｅｌｌ ａｄｈｅｓｉｏｎ ｍｏｌｅｃｕｌｅ−１（ＶＣＡＭ１）、ＫＩＡＡ０１９７（ＮＵＰ１６０）、ＤＫＦＺｐ５８６Ｅ０５１８（ＢＡＺ１Ａ）、ＳＷＩ／ＳＮＦ 複合体１５５Ｋｄａ サブユニット（ＢＡＦ１５５）（ＳＭＡＲＣ Ｃ１）、ＢＡＣ クローンＲＧ１５８Ｏ１７（ＣＡＰＲＩ）、Ｉｎｔｅｒ−ａｌｐｈａ−ｔｒｙｐｓｉｎ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｈｅａｖｙ ｃｈａｉｎ Ｈ１（ＩＴＩＨ１）、ＧＭ２ ａｃｔｉｖａｔｏｒ（ＧＭ２Ａ）、ＫＩＡＡ０７０９（ｕＰＡＲＡＰ）、ｗｉｌｄ−ｔｙｐｅ ｐ５３ ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｆｒａｇｍｅｎｔ−１（ＷＡＦ１）、ＮＦＫＢ ｈｕｍａｎ ｎｕｃｌｅａｒ ｆａｃｔｏｒ ｋａｐｐａ−Ｂ ＤＮＡ結合サブユニット（ＮＦ−ｋａｐｐａ−Ｂ）、ｄｅａｔｈ ａｄａｐｔｏｒ ｍｏｌｅｃｕｌｅ ＲＡＩＤＤ（ＲＡＩＤＤ）、Ｔｅｎａｓｃｉｎ Ｃの１６個の遺伝子を選び出した。
【００２７】
実施例６（ＥＳＴスクリーニング）
次に、ＥＳＴデーターベースを用いて、実施例５のＧｅｎｅ Ｃｈｉｐ解析で得られたＥＤＧ４、ＧＭ２Ａ、ＳＭＡＲＣ Ｃ１、ＷＡＦ１、ｕＰＡＲＡＰ、Ｈｕｍａｎ Ｃｌｏｎｅ ２３９３３、ＮＦ−ｋａｐｐａ−Ｂ、ＮＰＭ３、ＣＡＰＲＩ、ＲＡＩＤＤ、ＮＵＰ１６０、ＧＰＴ、ＩＴＩＨ１、ＶＣＡＭ１、ＢＡＺ１Ａ、Ｔｅｎａｓｃｉｎ Ｃの１６個の遺伝子の各配列情報に基づいてホモロジー検索を行い、相同なＥＳＴが存在する組織・細胞を集計したスクリーニングの結果の一部を図２に示す。図２中、「未分化組織」は腫瘍細胞とみなすことができるから、「未分化組織／ｔｏｔａｌ」が大きいほど、腫瘍細胞において高発現する遺伝子ということができ、「未分化組織／Ｎｏｒｍａｌ ｂｒａｉｎ」が大きいほど、脳腫瘍において高発現する遺伝子ということができる。表１に、上記１６個の遺伝子を「未分化組織／ｔｏｔａｌ」と「未分化組織／Ｎｏｒｍａｌ ｂｒａｉｎ」の大きさ別に表した。
【００２８】
【表１】
【００２９】
実施例７（ｕＰＡＲＡＰの発現を検出するためのＲＴ−ＰＣＲ）
次にｕＰＡＲＡＰ（Ｅｎｄｏ１８０）遺伝子の各正常組織、各種細胞株、グリオーマ細胞株及び組織並びに他の腫瘍細胞株における発現特異性をＲＴ−ＰＣＲ法により調べてみた。脳、心臓、肺、胃、小腸、結腸、肝臓、脾臓、腎臓、精巣、胎盤、筋肉の各正常組織由来のＲＮＡ（全てクローンテック社製より購入）、線維芽細胞、１０８８ＥＢＶ−Ｂ（ヒトＢ細胞）、１３６２ＴＩＬ（ヒト腫瘍浸潤Ｔ細胞）、２９３ＵＴ（ヒト腎細胞）の４種の細胞株由来のＲＮＡ、４種のグリオーマ細胞株（Ｕ８７ＭＧ、Ｔ９８Ｇ、ＧＩ１、Ｕ２５１）及び４種のグリオーマ組織（ＧＢ１３、ＧＢ１７、ＧＢ１６、ＧＢ４）由来のＲＮＡ、並びに、悪性黒色腫細胞株（ＳＫｍｅｌ２３、６２４ｍｅｌ）、腎細胞癌細胞株（ＲＣＣ７、Ｓａｉｔｏ）、肺癌細胞株（ＬＵ９９、ＥＢＣ１）、膵癌細胞株（ＫＵ７）、前立腺癌細胞株（ＰＣ３）及び白血病細胞株（ＨＬ６０、Ｍｏｌｔ４）の各細胞株由来から、トータルＲＮＡをＴｒｉｚｏｌ（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ社製）を使用して単離した。このトータルＲＮＡを、各１０μｇづつ使用し、トリ骨髄芽球ウイルス逆転写酵素ＸＬ（ＴＡＫＡＲＡ社製）と、プライマーとしてオリゴ（ｄＴ）を用いて、全反応量１００μｌ、４２℃でＲＴ−ＰＣＲの鋳型となるｃＤＮＡのパネルを作製した。
【００３０】
ｕＰＡＲＡＰ検出用には、センスプライマーとして（５’−ＧＡＧＣＡＡＣＡＧＣＧＧＧＣＴＡＴＧＧ−３’；配列番号１）を、アンチセンスプライマーとして（５’−ＴＣＴＧＧＣＧＣＣＴＣＣＧＧＴＡＡＡ−３’；配列番号２）を、コントロールとしてのＧＡＰＤＨ検出用には、センスプライマーとして（５’−ＴＧＡＡＣＧＧＧＡＡＧＣＴＣＡＣＴＧＧ−３’；配列番号３）とアンチセンスプライマー（５’−ＴＣＣＡＣＣＡＣＣＣＴＧＴＴＧＣＴＧＴＡ−３’；配列番号４）を用いた。０．５μｌのｃＤＮＡテンプレートを、２．５μｌのＰＣＲ緩衝液を１０倍希釈した２５μｌの反応液中で、２μｌのｄＮＴＰ（デオキシリボヌクレオチド３リン酸）混合物、０．１５μｌのＥＸＴａｑ（ＴＡＫＡＲＡ社製）、及び０．５μｌの各プライマーを用いて増幅した。ＰＣＲは、サーマルサイクラー（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ社製）を用いて、ｕＰＡＲＡＰについては、最初９４．０℃で４分間熱変性させ、以後９４．０℃で１分間熱変性させて、６２．２℃で１分間アニーリングし、７２．０℃で１分間伸張反応させるというサイクルで、３０サイクル繰り返し行い、ＧＡＰＤＨについては、最初９４．０℃で４分間熱変性させ、以後９４．０℃で１分間熱変性させて、５８．０℃で１分間アニーリングし、７２．０℃で１分間伸張反応させるというサイクルで、２５サイクル繰り返し行った。得られたＰＣＲ産物をアガロースゲル電気泳動（２．０％）にかけ、エチジウムブロマイド（ＥｔＢｒ）で染色し、紫外線照射によりバンドを検出した。ＲＴ−ＰＣＲの結果を図３に示す。図３に示すように、ｕＰＡＲＡＰは、Ｕ８７ＭＧ、Ｔ９８Ｇ（ヒトグリオーマ細胞株）、ＧＢ１３、ＧＢ１７、ＧＢ４（グリオーマ組織）、腎細胞癌細胞株（ＲＣＣ７）、肺癌細胞株（ＬＵ９９）、白血病細胞株（ＨＬ６０）、１３６２ＴＩＬ（ヒト腫瘍浸潤Ｔ細胞）及び精巣、線維芽細胞、小腸及び肺において発現が認められた。なお、小腸及び肺における発現は、混在した線維芽細胞やマクロファージによるものと考えられる。これらの結果から、ｕＰＡＲＡＰ遺伝子は、腫瘍、特に脳腫瘍の遺伝子診断薬として有用であると考えられる。
【００３１】
実施例８（ｕＰＡＲＡＰの定量的ＰＣＲ解析）
リアルタイム定量ＰＣＲを用いた解析は、標的ｍＲＮＡ量とＰＣＲプロダクト量との間に比例関係が成立する指数関数的増幅領域での速度論的解析に基づいた定量法である。ＲＮＡ調整時に生じるサンプル間での質的差、逆転写効率の差はリアルタイム定量ＰＣＲにおける変動要因の１つなので、これらの変動を標的ｍＲＮＡ相対量に対して標準化する方法として常に一定レベルで発現しているＧＡＰＤＨをスタンダードとした。合成したｃＤＮＡ１μｌをテンプレートにし、５μｌのＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ（２本鎖ＤＮＡに特異的に結合し発光する色素）、４μｌのｄＮＴＰ混合物、３μｌのＭｇＣｌ２、０．５μｌのＡｍｐ Ｅｒａｓｅ、０．２５μｌのＡｍｐｌｉ Ｔａｑ Ｇｏｌｄ、各０．５μｌのプライマーを含んだ５０μｌの反応系でＰＣＲを行った。ｕＰＡＲＡＰ及びＧＡＰＤＨ増幅用のプライマーとしては、ＲＴ−ＰＣＲにおけると同様なプライマーを用いた。ＰＣＲは、５０℃２分、９５℃１０分、そして９５℃１５秒と６０℃１分を４５サイクルの条件で行った。ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎの蛍光の増大はＤＮＡ濃度に比例することからＰＣＲプロダクト量を測定して、サイクル数に対する増幅曲線を作成した。
【００３２】
ｕＰＡＲＡＰの正常脳に対する各組織及び細胞の相対的発現量を図４及び５に示す。ｕＰＡＲＡＰの相対的発現量（図４及び５のｕＰＡＲＡＰ Ｒｅｌ．）は、２−△△ ＣＴで求めることができる。△△ＣＴ＝△ＣＴＡ−△ＣＴＢ 、Ａ：比較サンプル；Ｂ：基準サンプル；△ＣＴ＝（ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ ｃｙｃｌｅ ｆｏｒ ｕＰＡＲＡＰ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ，図４及び５のｕＰＡＲＡＰの値）−（ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ ｃｙｃｌｅ ｆｏｒ ＧＡＰＤＨ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ，図４及び５のＧＡＰＤＨの値）。また、例えば図４におけるｔｅｓｔｉｓの脳に対するｕＰＡＲＡＰ Ｒｅｌ．は次の計算により求めることができる。△ＣＴ．ｔｅｓｔｉｓ＝３８．２９−２０．８５＝１７．４４，△ＣＴ．ｂｒａｉｎ＝４１．５６−１８．６１＝２２．９５，△△ＣＴ＝△ＣＴ．ｔｅｓｔｉｓ−△ＣＴ．ｂｒａｉｎ＝１７．４４−２２．９５＝−５．５１，２−△△ ＣＴ＝２５．５１＝４５．５８
【００３３】
【発明の効果】
本発明によると、非癌部脳組織と脳腫瘍組織の遺伝子発現を比較し、癌部において発現が著しく変化している遺伝子群を選択することができ、これらの遺伝子群を利用して脳腫瘍に対する新規治療薬剤の探索及び診断薬の創製を行うことが可能となる。
【００３４】
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】ヒト脳腫瘍に発現する遺伝子群のＧｅｎｅ Ｃｈｉｐ解析の結果を示す図である。
【図２】ヒト脳腫瘍に高発現する１６個の遺伝子のＥＳＴスクリーニングの結果を示す図である。
【図３】ｕＰＡＲＡＰの発現を検出するためのＲＴ−ＰＣＲの結果を示す図である。
【図４】ｕＰＡＲＡＰの定量的ＰＣＲ解析の結果を示す図である。
【図５】ｕＰＡＲＡＰの定量的ＰＣＲ解析の結果を示す図である。[0001]
TECHNICAL FIELD OF THE INVENTION
The present invention contains as an active ingredient a compound such as a peptide / protein or a low molecular weight compound which specifically binds to uPARAP such as an antibody recognizing an extracellular domain of urokinase-type plasminogen activator receptor-related protein (uPARAP). The present invention relates to an agent for diagnosing and treating brain tumors, an agent for diagnosing and treating brain tumors containing an antisense strand of DNA or RNA encoding uPARAP as an active ingredient, a method for treating brain tumors using the same, and the like.
[0002]
[Prior art]
In recent years, microarray technology has been developed, and it has become possible to analyze the expression of many genes and proteins at once. In particular, analysis of gene expression in cancer tissues using a DNA microarray has provided new findings in terms of cancer progression and drug sensitivity. Recently, a gene chip (Gene @ Chip) that can be used for a wide range of nucleic acid analysis such as gene discovery monitoring, sequence analysis, and genotyping has been sold by Affymetrix, Inc. of the United States.
[0003]
On the other hand, urokinase-type plasminogen activator receptor-related protein (uPARAP) is reported as KIAA0709 or Endo180, and an antibody that specifically recognizes uPARAP is also known. KIAA0709 is encoded by KIAA0709 gene (accession number AB014609) among 100 novel cDNA clones (named KIAA0611 to KIAA0710 genes) obtained from human brain that encode proteins having a molecular weight of 50 kDa or more. It has been reported as a protein (Non-Patent Document 1). Further, using an anti-Endo180 monoclonal antibody and a polyclonal antiserum, the complete cDNA of Endo180 was cloned, and Endo180, an endocytic recycling protein associated with the mannose receptor of macrophages, was used for fibroblasts, endothelial cells, and macrophages. And has been reported to function as a lectin receptor (Non-Patent Document 2). uPARAP is a type of macrophage mannose receptor protein and contains a collagen-binding (fibronectin type II) region in addition to an 8C-type carbohydrate recognition region, and has been reported to strongly bind to collagen and collagen V (non-human). Patent Document 3).
[0004]
In addition, urokinase-type plasminogen activator (uPA) and uPA receptor (uPAR) are important elements in the plasminogen activation system and act to promote tissue remodeling and cancer invasion. There have also been reports on uPARAP as an endogenous receptor involved in clearance of a complex between PAR and uPAR and an anti-uPARAP polyclonal antibody that specifically recognizes uPARAP (Non-Patent Document 4). According to this report, the expression of uPARAP in benign and malignant thoracic disorders was negative in healthy thoracic tissue, but in all benign and non-invasive ductal carcinomas, the fibroblast-like phenotype associated with the disorder was reported. Shows immunoreactivity in cells and myoepithelial cells; in invasive carcinomas, uPARAP immunoreactivity is limited to tumor-associated mesenchymal cells, and uPARAP is localized in myofibroblasts and macrophages It has been.
[0005]
[Non-patent document 1]
DNA @ Res. , $ 5 (3), $ 169-176, $ 1998
[Non-patent document 2]
J. {Cell} Sci. , $ 113, $ 6, $ 1021-1032, $ 2000
[Non-Patent Document 3]
J. {Biol. {Chem. , 275 (3), 1993-2002, 2000 Jan 21
[Non-patent document 4]
Int. {J. Cancer, 1, 98, 656-64, 2002
[0006]
[Problems to be solved by the invention]
An object of the present invention is to provide a therapeutic or diagnostic agent for tumors, particularly brain tumors, a probe for detecting and diagnosing brain tumors, a diagnostic kit for brain tumors, a method for treating tumors, particularly brain tumors, and a method for screening anti-brain tumor agents. .
[0007]
[Means for Solving the Problems]
The present inventors selected, from GeneChip analysis, out of about 11,000 genes of human brain tumor patients, 16 genes whose expression was significantly enhanced in human brain tumors as compared with non-cancerous brain tissues, and among them, And by using RT-PCR and real-time quantitative PCR to find out that uPARAP was highly expressed in tumors, particularly brain tumors, and completed the present invention.
[0008]
That is, the present invention provides a therapeutic agent for tumors comprising a compound such as a peptide / protein or a low molecular weight compound which specifically binds to uPARAP as an active ingredient (Claim 1), or specifically binds to uPARAP. 2. The therapeutic agent for tumors according to claim 1, wherein the compound such as a peptide, protein, or low molecular weight compound is an antibody that specifically recognizes the extracellular domain of uPARAP. And / or a therapeutic agent for tumors comprising a compound such as a peptide / protein or a low molecular weight compound which specifically binds to Pro-uPA as an active ingredient (claim 3), uPARAP, uPAR and / or Pro. -Treatment of tumors characterized by containing as an active ingredient all or part of the antisense strand of DNA or RNA encoding uPA. Drugs (claim 4) or tumor tumor therapeutic agent according to claim 1, wherein the brain tumor related (claim 5).
[0009]
The present invention also provides a method for treating a tumor, which comprises administering a compound such as a peptide / protein or a low molecular weight compound that specifically binds to uPARAP to a tumor patient (Claim 6), and a method for specifically binding to uPARAP. 7. The method for treating a tumor according to claim 6, wherein the peptide, protein, or compound such as a low molecular weight compound is an antibody that specifically recognizes an extracellular domain of uPARAP. And / or a method for treating a tumor, which comprises administering a compound such as a peptide / protein or a low molecular weight compound that specifically binds to Pro-uPA to a tumor patient (claim 8), uPARAP, uPAR and / or Pro. -A method for treating a tumor, which comprises administering all or a part of the antisense strand of DNA or RNA encoding uPA to a tumor patient. Section 9) and relates to the tumor The method of treatment according to any one of claims 6-9, wherein the tumor is a brain tumor (claim 10).
[0010]
Further, the present invention provides a diagnostic agent for tumors comprising a compound such as a peptide / protein or a low molecular weight compound which specifically binds to uPARAP, and a peptide / protein which specifically binds to uPARAP. , A compound such as a low molecular weight compound is an antibody that specifically recognizes the extracellular domain of uPARAP, the diagnostic agent for tumor according to claim 11 (claim 12), and uPAR and / or Pro- A diagnostic agent for a tumor characterized by having a compound such as a peptide / protein or a low-molecular compound that specifically binds to uPA (claim 13), and DNA or RNA encoding uPARAP, uPAR and / or Pro-uPA A diagnostic agent for a tumor characterized by having all or a part of the antisense strand of the present invention (claim 14); A diagnostic agent for a tumor according to any one of claims 11 to 14 (claim 15), an RNA extract, a cDNA and cRNA synthetase, a DNA chip or an oligonucleotide chip or a protein chip, a probe and uPARAP amplification. A diagnostic kit for a brain tumor comprising a primer and an anti-uPARAP antibody (claim 16); a diagnostic kit for a tumor according to claim 16 wherein the tumor is a brain tumor (claim 17); A method for screening an antitumor agent, comprising culturing cells into which an expression vector containing a uPARAP gene has been introduced in the presence of a test substance, and measuring and evaluating the degree of uPARAP expression and / or function reduction (claim 18). ) Or uPARAP and uPAR co-expressed on the membrane surface were added to Pro-uP in the presence of the test substance. And a method for screening an antitumor agent, which comprises measuring and evaluating the degree of binding between Pro-uPA and uPAR (claim 19), and contacting uPARAP or a part thereof with a test substance. 21. A screening method for an antitumor agent, which comprises measuring and evaluating the degree of binding of uPARAP to uPARAP (claim 20), and wherein the antitumor agent is an anti-brain tumor agent. (Claim 21).
[0011]
BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION
Genes and proteins having different expression levels from the non-cancerous part in the brain tumor tissue removed from the brain tumor patient can be obtained by comparing the brain tumor tissue with the brain non-cancerous part tissue. First, the average of the expression levels of each gene and protein in non-cancerous brain tissues provided by a plurality of patients is obtained. Next, the average of the expression level of each gene or protein is compared with the expression level of each gene or protein in the brain tumor tissue of each patient. Or select a protein. Genes whose expression is enhanced in brain tumor tissue can also be ranked according to the degree of difference in expression from normal tissue. Gene expression in brain tumor tissues and non-cancerous tissues can be analyzed by RNA expression levels or protein expression levels. In many cases, RNA and protein expression levels can be analyzed by DNA microarray, RT-PCR, Northern blotting. , RNase II protection assay, Western blotting, ELISA, protein array, and other well-known methods, and can be measured by chemiluminescence with fluorescein, rhodamine, or luminol.3H,14C,35S,33P,32P,125The measurement is performed by measuring the radiation and optical density of a radioisotope such as I. The therapeutic and diagnostic agents for tumors such as brain tumors of the present invention can be derived from the knowledge on genes and proteins whose expression is particularly enhanced in brain tumor tissues obtained by such a method.
[0012]
The therapeutic agent for tumors such as brain tumors of the present invention is not particularly limited as long as it contains as an active ingredient a compound such as a peptide / protein or low molecular weight compound that specifically binds to uPARAP. Specific compounds such as peptides / proteins and low molecular weight compounds that bind specifically include antibodies specifically recognizing the extracellular domain of uPARAP, collagen V, lectin, N-acetylglucosamine, glycoprotein, matrix metalloprotease, Examples include natural products and synthetic compounds produced by actinomycetes and molds, and derivatives thereof. The therapeutic agent for a tumor such as a brain tumor of the present invention is not particularly limited as long as it contains a compound such as a peptide / protein or a low molecular weight compound which specifically binds to uPAR and / or Pro-uPA as an active ingredient. However, examples of the compound such as a peptide / protein or a low molecular weight compound that specifically binds to uPAR and / or Pro-uPA include an antibody that specifically recognizes uPAR and Pro-uPA. Furthermore, the therapeutic agent for a tumor such as a brain tumor according to the present invention is not particularly limited as long as it contains, as an active ingredient, all or a part of the antisense strand of DNA or RNA encoding uPARAP, uPAR and / or Pro-uPA. There is no limitation, and all or part of these antisense strands can be used in a form incorporated in a vector or the like.
[0013]
Antibodies that specifically recognize the extracellular domain of uPARAP and antibodies that specifically recognize uPAR and Pro-uPA include monoclonal antibodies, polyclonal antibodies, single-chain antibodies, humanized antibodies, chimeric antibodies, Bifunctional antibodies capable of simultaneously recognizing epitopes can be exemplified. These antibodies are produced by administering a protein such as uPARAP or a fragment containing an epitope or an analog or a cell expressing uPARAP or the like on the membrane surface to an animal (preferably other than a human) using a conventional protocol. For example, for the preparation of monoclonal antibodies, the hybridoma method (Nature 256, −４495-497, 1975), the trioma method, the human B cell hybridoma method (Immunology Today, 4, resulting in antibodies produced by continuous cell line cultures) 72, 1983) and any method such as the EBV-hybridoma method (MONOCRONAL ANTIBODIES AND CANCER THERAPY, 77-96, Alan R.Liss, Inc., 1985). It can be.
[0014]
In order to prepare a single-chain antibody, a method for preparing a single-chain antibody (US Pat. No. 4,946,778７, US Pat. No. 5,260,203, US Pat. No. 5,091,513, US Pat. No. 5,455,030), and methods for preparing humanized antibodies (US Pat. No. 5,585,089, Nature, Ｎ321, 522-525, 1986, US Pat. Protein {Engineering, 4,773-883, 1991) can be used, and to prepare chimeric antibodies, a method for preparing chimeric antibodies (US Pat. No. 4,816,567, Science, 229, 1202-1207, 1985, BioTechniques, $ 4, $ 214, $ 1986, Nature, $ 312, $ 643-646, $ 1 84, Nature, 314, 268.270, it is possible to use 1985). Bifunctional antibodies can be produced by hybridizing two monoclonal cell lines that produce two related antibodies, or by chemical conjugation of fragments of two antibodies, eg, can bind simultaneously to uPARAP and uPAR. Mention may be made of bifunctional antibodies.
[0015]
In addition, Fab fragment or F (ab ')2Fragments and the like can also be exemplified as compounds such as peptides / proteins and low molecular weight compounds that specifically bind to uPARAP and the like, similarly to the above-mentioned antibodies. For example, a Fab fragment can be obtained by treating an antibody with papain or the like, or by preparing F (ab ')2The fragment can be prepared by treating with pepsin or the like.
[0016]
The method for treating a tumor such as a brain tumor of the present invention is not particularly limited as long as it is a method of administering a compound such as the above-mentioned peptide / protein specifically binding to uPARAP or a low molecular weight compound to a brain tumor patient. Preferred examples of the compound such as a peptide / protein or low molecular weight compound that specifically binds to uPARAP include the above-mentioned antibodies that specifically recognize the extracellular domain of uPARAP. In addition, the method for treating a tumor such as a brain tumor of the present invention is a method for administering a compound such as a peptide / protein or low-molecular compound specifically binding to uPAR and / or Pro-uPA to a brain tumor patient. There is no particular limitation. Furthermore, the therapeutic agent for a tumor such as a brain tumor according to the present invention is not particularly limited as long as it contains, as an active ingredient, all or a part of the antisense strand of DNA or RNA encoding uPARAP, uPAR and / or Pro-uPA. Without limitation, all or a part of these antisense strands may be administered as they are, or they may be administered in a form incorporated in a vector or the like.
[0017]
When a therapeutic drug for a tumor such as a brain tumor of the present invention or an antitumor agent such as an anti-brain tumor agent obtained by the screening method of the present invention described below is used as a drug, a pharmaceutically acceptable ordinary carrier, binder Various compounding ingredients for preparations such as stabilizers, excipients, diluents, pH buffers, disintegrants, solubilizers, solubilizers, and isotonic agents can be added. These therapeutic agents and anti-brain tumor agents can be administered orally or parenterally. That is, it can be orally administered in a commonly used dosage form, for example, a powder, granule, capsule, syrup, suspension or the like, or, for example, a solution, emulsion, suspension or the like. The preparation can be administered parenterally in the form of an injection, or can be administered intranasally in the form of a spray.
[0018]
As the diagnostic agent for tumors such as brain tumors of the present invention, those having a compound such as a peptide / protein or a low-molecular compound that specifically binds to uPARAP, such as the antibody specifically recognizing the extracellular domain of uPARAP described above, may be used. Examples of the diagnostic agent for a tumor such as a brain tumor of the present invention include those having a compound such as a peptide / protein or a low-molecular compound that specifically binds to the above-mentioned uPAR and / or Pro-uPA, It is not particularly limited as long as it has all or a part of the antisense strand of DNA or RNA encoding uPARAP, uPAR and / or Pro-uPA, and such antisense strand is useful for tumors such as brain tumors. It can be used advantageously as a probe for detection and diagnosis. It is preferable to use usually labeled compounds such as the antibody and the antisense strand. As the labeling substance, a substance capable of producing a detectable signal alone or by reacting with another substance, for example, an enzyme, a fluorescent substance, a chemiluminescent substance, biotin, avidin, a radioisotope, and the like. it can. Specifically, peroxidase (for example, horseradish peroxidase), alkaline phosphatase, β-D-galactosidase, glucose oxidase, glucose-6-phosphate dehydrogenase, alcohol dehydrogenase, malate dehydrogenase, penicillinase, catalase, apoase Enzymes such as glucose oxidase, urease, luciferase or acetylcholinesterase, fluorescein isothiocyanate, phycobiliprotein, rare earth metal chelates, fluorescent substances such as dansyl chloride or tetramethylrhodamine isothiocyanate,3H,14C,125I or131Radioisotopes such as I, biotin, avidin, or chemiluminescent substances. The radioisotopes and fluorescent materials described above can alone provide a detectable signal. On the other hand, enzymes, chemiluminescent substances, biotin, and avidin alone cannot provide a detectable signal, and thus can react with one or more other substances to provide a detectable signal. For example, in the case of an enzyme, at least a substrate is required, and various substrates are used depending on the method for measuring the enzyme activity (colorimetric method, fluorescent method, bioluminescent method, chemiluminescent method, etc.). In the case of biotin, the reaction is generally performed using at least avidin or an enzyme-modified avidin (for example, streptavidin-β-galactosidase) as a substrate.
[0019]
The diagnostic kit for a tumor such as a brain tumor of the present invention includes a kit necessary for evaluating the expression of selected genes and proteins such as Northern blot, in situ hybridization, RNase protection assay, Western blotting, ELISA, and RT-PCR. , RNA extract, cDNA and cRNA synthetase, DNA chip or oligonucleotide chip or protein chip, probe, uPARAP amplification primer, anti-uPARAP antibody, GAPDH (glyceraldehyde-3) -Phosphate dehydrogenase) It is preferable that the primer also has a primer for amplifying a control gene such as a gene and an antibody against GAPDH and the like. Using such a brain tumor diagnostic kit of the present invention, a brain tumor can be diagnosed by examining the expression level of the uPARAP gene or uPARAP in brain tissue, blood, or other tissues.
[0020]
As a method for screening an anti-brain tumor agent of the present invention, cells into which an expression vector containing a uPARAP gene has been introduced are cultured in the presence of a test substance, and the degree of uPARAP expression and / or function reduction, for example, plasminogen activator, is reduced. A method for measuring and estimating a gene amplified by a uPARAP activation signal such as beta, or a method in which u-PARAP and uPAR are co-expressed on the membrane surface with Pro-uPA in the presence of a test substance, A method for measuring and evaluating the degree of uPAR binding, for example, a gene amplified by a uPARAP activation signal such as a plasminogen activator, or bringing a part thereof such as uPARAP or the extracellular domain of uPARAP into contact with a test substance, Degree of binding of the test substance to uPARAP, eg, No particular limitation is imposed as long as the strength of binding to quality uPARAP is measured and evaluated. Examples of the cells include bacterial prokaryotic cells such as Escherichia coli, Streptomyces, Bacillus subtilis, Streptococcus, Staphylococcus, yeast, Eukaryotic cells such as Aspergillus, insect cells such as Drosophila S2 and Spodoptera Sf9, L cells, CHO cells, COS cells, HeLa cells, C127 cells, BALB / c3T3 cells (mutants lacking dihydrofolate reductase, thymidine kinase, etc.) (Including strains), BHK21 cells, HEK293 cells, Bowes melanoma cells, animal and plant cells such as oocytes, and the like. The expression vector capable of expressing uPARAP or the like can be introduced into cells by Davis et al. BASIC METHODS IN M (LECULAR BIOLOGY, 1986) and Sambrook et al. (MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, 2nd Ed., Cold Spring Harbor, Laboratory Press, Laboratories, 1992, etc .; For example, calcium phosphate transfection, DEAE-dextran mediated transfection, transvection, microinjection, cationic lipid mediated transfection, electroporation, transduction, scrape loading, bullet introduction ( balistic (induction), infection and the like.
[0021]
The gene amplified by the uPARAP activation signal can be measured by quantitative PCR. Quantitative PCR is PCR that enables quantitative measurement of the proportion of heterologous individuals in a biological population based on the amounts of amplification products of a target gene and a control gene. For example, PCR can be performed under reaction conditions that allow a quantitative measurement, the amplification product can be subjected to electrophoresis, and a quantitative measurement can be achieved based on the intensity of the band corresponding to the amplification product. In order to more easily and accurately perform quantitative measurement, it is preferable to use a PCR device (real-time (PCR) real-time PCR device) that enables quantitative measurement of an amplification product over time. LightCycler (manufactured by Roche), ABI Sequence Detector PRISM 7700 (manufactured by PerkinElmer Biosystems), and the like are commercially available as such PCR devices. Examples of a method for performing real-time PCR include a TaqMan method (Japanese Patent No. 2825976), a hybridization method, and a method using an intercalator such as Cyber Green I.
[0022]
【Example】
Hereinafter, the present invention will be described more specifically with reference to examples, but the technical scope of the present invention is not limited to these examples.
Example 1 (Preparation of human brain tumor specimen)
Human brain tumor tissue and adjacent normal parts were collected from 11 patients who underwent surgical treatment at Keio University Hospital. Informed consent was obtained from all patients before surgery. The research protocol was approved by IRBHU of Keio University School of Medicine. Histological diagnosis of brain tumor in all patients was performed postoperatively, and those with glioma diagnosis were used as human brain tumor specimens. The collected human non-cancerous brain tissue and brain tumor tissue were frozen in liquid nitrogen or acetone containing dry ice and, if necessary, O.D. C. T. The cells were embedded in the compound, stored at -70 ° C to -80 ° C, and used to identify genes or proteins whose expression was significantly enhanced in human brain tumors compared to non-cancerous brain tissue.
[0023]
Example 2 (RNA extraction from tissue)
Tissue pieces (about 125m3) Was disrupted by polytron in TRIZOL or Sepasol-RNAI (5 seconds x 2 at maximum speed). After adding chloroform, the mixture was centrifuged at 15,000 × g for 10 minutes, and an aqueous layer containing RNA was collected. Precipitate total RNA using isopropyl alcohol, wash once with 70% ethanol, and treat with DEPC-treated H2Dissolved in O. The total RNA was treated with 1.5 units of Dnase I, extracted again with TRIZOL / chloroform, precipitated with ethanol, and treated with DEPC.2Suspended in O. Thereafter, low molecular nucleic acids were removed using Rneasy Mini Mini Kit. The quality of total RNA was confirmed by a ratio of 28S and 18S ribosomal RNA from agarose gel. Purified total RNA was stored at -80 ° C in 70% ethanol until use.
[0024]
Example 3 (Synthesis of cDNA and synthesis of labeled cRNA)
cDNA synthesis was performed using SuperScript \ Choice \ System. Using 5 micrograms of purified total RNA and oligo dT primer having a T7 promoter sequence, a reaction was performed with 200 units of {SuperScriptII} reverse transcriptase at 42 ° C for 1 hour (synthesis of first-strand cDNA followed by synthesis of second-strand cDNA) ), Extracted with phenol / chloroform, and purified by Phase @ Lock @ Gel. Using the synthesized cDNA as a template, cRNA was synthesized using MEGAscript @ T7 kit. Enzyme mix containing 2 microliters of T7 polymerase, 7.5 mM ATP, GTP and 5.625 mM CTP, UTP and 1.875 mM Bio-11-CTP, Bio-16-UTP and cDNA at 37 ° C. for 6 hours Reacted. Unreacted and short oligonucleotides were removed using CHROMASPIN. The obtained cRNA was recovered by ethanol precipitation. The nature of cRNA was confirmed by electrophoresis. The purified cRNA was stored at -80 ° C in 70% ethanol until use.
[0025]
Example 4 (Gene expression analysis in cancer and non-cancer parts of brain tumor patients)
Gene expression of primary cancer in brain tumor patients was tested using high-density oligonucleotide microarray. Upon hybridization to the chip, cRNA was reacted in a 40 mM Tris-acetate buffer (pH 8.1), 100 mM potassium acetate, and 30 mM magnesium acetate at 95 ° C. for 35 minutes to perform fragmentation. Hybridization was performed in 200 μl of 0.1 M MES pH 6.7 (2- (N-Morpholino) ethanesulfonic acid), 1 M NaCl, 0.01% Polyoxylene (10) octylphenyl ether, 20 μg herring Sperm DNA, 100 μg biotin acetylated DNA A sample containing 10 μg of fragmented cRNA and a biotinylated control oligonucleotide (biotin-5′-CTGAACGGTAGCATCTTGAC-3 ′) was performed at 45 ° C. for 12 hours. After washing the chip with 0.1 M MES pH 6.7, 0.1 M NaCl, 0.01% Polyoxylen (10) octylphenyl ether buffer, and reacting the chip with a biotinylated anti-streptavidin antibody, streptavidin R-phycoerythrin To amplify the signal. The fluorescence intensity of each pixel was measured with a laser scanner (GeneArray @ Scanner @ G2500A) manufactured by HP, and the expression intensity and reliability (Present / Absent @ Call) were measured using Affymetrix software Microarray @ Suite @ ver. Calculated from 4.0. This experiment measured the expression of about 11,000 genes in human brain tumor patients.
[0026]
Example 5 (Gene @ Chip analysis)
Gene @ Chip analysis was performed to identify a group of genes that differ (express) in tumor tissue and adjacent normal tissue. In consideration of the sensitivity of the (oligo) DNA chip, those with an average {difference} (corresponding to the expression level) of 20 or less were rounded up to 20. The average of the average of three human normal brain tissues was determined for each gene, and the average was compared to the average of 11 human brain tumor tissues. In all of the 11 samples of the brain tumor tissue, genes showing expression levels (ratio of average to difference) three times or more as compared to the average of normal brain tissues were selected. As a result, as shown in FIG. 1, glutamate \ pyruvate \ transamidase (GPT), Homo \ Sapiens \ Clone 23933 (Human \ Clone \ 23933), G protein-coupled receptor (EDG4), Nucleoplasm3e1 sul ~ e3e sul ~ e3e ~ l sul ~ e3e ~ l svl ~ e ~ l sv ~ e ~ l ~ e sv ~ e ~ l ~ e ~ l ~ e ~ l ~ e ~ l ~ e ~ l ~ e ~ l ~ e ~ l ~ e sv ~ l ~ e ~ l ~ e ~ l ~ e ~ e ~ l ~ e ~ e ~ e ~ l ~ e ~ e ~ e ~ e ~ l ~ e ~ e ~ e ~ e ~ n ~ e ~ l ~ e ~ l ~ e ~ l ~ e ~ l ~ e ~ l ~ e ~ l ~ e ~ l ~ e ~ l ~ e ~ l ~ e3e ~ l ~ e ~ l ~ e ~ l ~ e ~ l ~ e ~ l ~ e ~ l ~ e ~ l ~ e ~ l ~ e ~ l ~ e ~ l ~ e ~ l ~ e ~ l ~ e ~ l ~ e) ), KIAA0197 (NUP160), DKFZp586E0518 (BAZ1A), SWI / SNF complex 155Kda {subunit (BAF155) (SMARC @ C1), BAC clone RG158O17 (CAPRI), Inter-alpha-tripyin @ HIBA. GM2 @ activator (GM2A), KIAA0709 (uPARAP), wild-type @ p53 @ activated @ fragment-1 (WAF1), NFKB @ human @ nuclear @ factor @ kappa-RA @ DapDapDapdaNapDapdaNapDapdaNapDapdaNapDapdaNapDapAda , TenascinΔC 16 genes were selected.
[0027]
Example 6 (EST screening)
Next, using the EST database, EDG4, GM2A, SMARC @ C1, WAF1, uPARAP, Human @ Clone @ 23933, NF-kappa-B, NPM3, CAPRI, RAIDD, NUP160, DG2A, SMARC @ C1, WAF1, and uPARAP obtained by the Gene @ Chip analysis of Example 5 FIG. 2 shows a part of the screening results obtained by performing a homology search based on the sequence information of each of the 16 genes of GPT, ITIH1, VCAM1, BAZ1A, and TenascinΔC, and summing up the tissues and cells having homologous ESTs. . In FIG. 2, since “undifferentiated tissue” can be regarded as a tumor cell, it can be said that the larger the “undifferentiated tissue / total”, the more highly expressed the gene is in the tumor cell, and the “undifferentiated tissue / Normal brain” Is larger, it can be said that the gene is highly expressed in brain tumors. In Table 1, the 16 genes are shown according to the size of “undifferentiated tissue / total” and “undifferentiated tissue / Normal @ brain”.
[0028]
[Table 1]
[0029]
Example 7 (RT-PCR for detecting uPARAP expression)
Next, the expression specificity of the uPARAP (Endo180) gene in normal tissues, various cell lines, glioma cell lines and tissues, and other tumor cell lines was examined by RT-PCR. RNA from normal tissues of brain, heart, lung, stomach, small intestine, colon, liver, spleen, kidney, testis, placenta and muscle (all purchased from Clontech), fibroblasts, 1088 EBV-B (human B Cells, 1362 TIL (human tumor infiltrating T cells), 293UT (human kidney cells), RNA from four cell lines, four glioma cell lines (U87MG, T98G, GI1, U251) and four glioma tissues ( RNAs derived from GB13, GB17, GB16, and GB4) and malignant melanoma cell lines (SKmel23, 624mel), renal cell carcinoma cell lines (RCC7, Saito), lung cancer cell lines (LU99, EBC1), and pancreatic cancer cell line (KU7) ), Prostate cancer cell line (PC3) and leukemia cell line (HL60, Molt4) It was isolated using (Gibco BRL). This total RNA was used in an amount of 10 μg each, and using avian myeloblast virus reverse transcriptase XL (manufactured by TAKARA) and oligo (dT) as a primer, a total reaction volume of 100 μl and a template for RT-PCR at 42 ° C. Was prepared.
[0030]
For detection of uPARAP, (5′-GAGCAACAGCGGGCTATGG-3 ′; SEQ ID NO: 1) was used as a sense primer, (5′-TCTGGCGCCTCCGGTAAA-3 ′; SEQ ID NO: 2) was used as an antisense primer, and GAPDH was used as a control for detection. Used (5'-TGAACGGGAAGCTCACTGG-3 '; SEQ ID NO: 3) and an antisense primer (5'-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3'; SEQ ID NO: 4) as sense primers. 0.5 μl of the cDNA template was mixed with 2 μl of a dNTP (deoxyribonucleotide triphosphate) mixture, 0.15 μl of EXTaq (manufactured by TAKARA) in a 25 μl reaction solution obtained by diluting 2.5 μl of PCR buffer with 10 times. And 0.5 μl of each primer. The PCR was performed using a thermal cycler (Perkin-Elmer), and uPARAP was first heat-denatured at 94.0 ° C. for 4 minutes, and then heat-denatured at 94.0 ° C. for 1 minute and then at 62.2 ° C. The cycle of annealing for 1 minute and extension reaction at 72.0 ° C. for 1 minute was repeated 30 cycles. For GAPDH, heat denaturation was initially performed at 94.0 ° C. for 4 minutes, and thereafter heat denaturation at 94.0 ° C. for 1 minute. Then, annealing was performed at 58.0 ° C. for 1 minute, and an extension reaction was performed at 72.0 ° C. for 1 minute. This cycle was repeated 25 times. The obtained PCR product was subjected to agarose gel electrophoresis (2.0%), stained with ethidium bromide (EtBr), and a band was detected by ultraviolet irradiation. FIG. 3 shows the results of RT-PCR. As shown in FIG. 3, uPARAP is composed of U87MG, T98G (human glioma cell line), GB13, GB17, GB4 (glioma tissue), renal cell carcinoma cell line (RCC7), lung cancer cell line (LU99), leukemia cell line ( HL60), 1362 TIL (human tumor infiltrating T cells) and expression in testis, fibroblasts, small intestine and lung. The expression in the small intestine and lung is considered to be caused by mixed fibroblasts and macrophages. From these results, the uPARAP gene is considered to be useful as a gene diagnostic agent for tumors, particularly for brain tumors.
[0031]
Example 8 (Quantitative PCR analysis of uPARAP)
Analysis using real-time quantitative PCR is a quantitative method based on kinetic analysis in an exponential amplification region where a proportional relationship is established between the amount of target mRNA and the amount of PCR product. Since qualitative differences between samples and differences in reverse transcription efficiency that occur during RNA adjustment are one of the factors in real-time quantitative PCR, they are always expressed at a constant level as a method of normalizing these variations to the relative amount of target mRNA. GAPDH as a standard. Using 1 μl of the synthesized cDNA as a template, 5 μl of SYBR @ Green (a dye that specifically binds to and emits double-stranded DNA), 4 μl of dNTP mixture, 3 μl of MgCl2PCR was carried out in a 50 μl reaction system containing 0.5 μl of Amp \ Erase, 0.25 μl of Ampli \ Taq \ Gold and 0.5 μl of each primer. As a primer for amplifying uPARAP and GAPDH, the same primer as in RT-PCR was used. The PCR was performed at 50 ° C. for 2 minutes, 95 ° C. for 10 minutes, and 45 cycles of 95 ° C. for 15 seconds and 60 ° C. for 1 minute. Since the increase in the fluorescence of SYBR @ Green is proportional to the DNA concentration, the amount of the PCR product was measured, and an amplification curve with respect to the cycle number was created.
[0032]
The relative expression levels of uPARAP in each tissue and cell relative to normal brain are shown in FIGS. The relative expression level of uPARAP (uPARAP @ Rel. in FIGS. 4 and 5) was 2− △△ CTCan be obtained by △△ CT= △ CTA− △ CTB, A: Comparative sample; B: Reference sample; ΔCT= (Threshold \ cycle \ uPARAP \ amplification, uPARAP value in FIGS. 4 and 5)-(threshold \ cycle \ for GAPDH \ amplification, GAPDH value in FIGS. 4 and 5). Also, for example, uPARAP @ Rel. Can be obtained by the following calculation. △ CT. testis= 38.29-20.85 = 17.44, ΔCT. brain= 41.56-18.61 = 22.95, ΔCT= △ CT. testis− △ CT. brain= 17.44-22.95 = -5.51,2− △△ CT= 25.51= 45.58
[0033]
【The invention's effect】
ADVANTAGE OF THE INVENTION According to this invention, the gene expression of a non-cancerous part brain tissue and a brain tumor tissue can be compared, and the gene group whose expression in a cancer part has changed remarkably can be selected. It becomes possible to search for therapeutic agents and create diagnostic agents.
[0034]
[Sequence list]
[Brief description of the drawings]
FIG. 1 shows the results of Gene @ Chip analysis of a group of genes expressed in human brain tumors.
FIG. 2 shows the results of EST screening of 16 genes highly expressed in human brain tumors.
FIG. 3 shows the results of RT-PCR for detecting uPARAP expression.
FIG. 4 shows the results of quantitative PCR analysis of uPARAP.
FIG. 5 shows the results of quantitative PCR analysis of uPARAP.
