【０００１】
【発明の属する技術分野】
この発明は、液体クロマトグラフ質量分析計による有機酸混合物の分析技術に関する。
【０００２】
【従来の技術】
従来、有機酸の分離はイオン排除カラムを使用した高速液体クロマトグラフィにより行われている（例えば、特許文献１参照）。このイオン排除クロマトグラフィでは負に帯電した固定相と酸性水溶液からなる移動相を用い、分析対象の有機酸の分離が該有機酸陰イオンと上記固定相との静電気斥力の強さに基づいて行われる。この方法にて有機酸を分離した後、ポストカラムｐＨ調製電気伝導度検出法や紫外可視（ＵＶ）吸光光度法で検出を行う。ポストカラムｐＨ調整電気伝導度検出法では、カラムから溶出した移動相に緩衝液を添加してｐＨを中性付近に固定した後、有機酸が解離してイオンとなる成分の変化量を測定する。また、紫外可視（ＵＶ）吸光光度法では、有機酸のカルボキシル基に着目して２０５−２１０ｎｍでの吸光度に基づいて検出する。
【０００３】
【特許文献１】特開平８−２０１３６５号公報
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、上記の従来検出法は検出感度が低い。上記ポストカラムｐＨ調整電気伝導度法の検出感度は３×１０−１１〜５×１０−１１であり、分子量１９２であるクエン酸を例にとると、４０ｐＮ×１９２／３＝２５６０ｐｇの感度となり、ナノグラムオーダーしかない。紫外可視（ＵＶ）吸光光度法の場合、検出感度はポストカラムｐＨ調整電気伝導度法より低い。
【０００５】
さらに、上記の従来検出法は選択性が低いために、多成分の有機酸を一斉分析する場合にはピークとピークが重ならないようにするために、２本のカラムをつなげて分析しなくてはならない。特に、紫外可視（ＵＶ）吸光光度法では、２０５−２１０ｎｍでの吸光度を検出するために共存する吸光性の中性夾雑物質の受けやすく、選択性が悪く十分な分析ができない。
【０００６】
一方、液体クロマトグラフィの検出方法として質量分析計を使用することが考えられる。質量分析計によれば、特に選択性の向上ができる。しかしながら、液体クロマトグラフ質量分析計に一般的に用いられているイオン化部である、エレクトロンスプレーイオン化法（ＥＳＩ法）あるいは大気圧化学イオン化法（ＡＰＣＩ法）では、分離カラムからの溶出液が酸性水溶液であるためにイオン化が抑制され、検出感度は低くなる。
本発明はこのような課題を解決するためになされたものであり、その主たる目的は、液体クロマトグラフ質量分析計による感度の高い有機酸分析法を提供することにある。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
上述のような問題点を解消するために、本発明は、有機酸を含有する試料を、酸性水溶液を移動相とした液体クロマトグラム用カラムに付して分離し、該カラムからの分離溶出液に、塩基もしくは有機溶媒、もしくは塩基および有機溶媒を添加混合した後、質量分析計にて検出を行うことを特徴とする有機酸分析方法を提供することを目的とする。
【０００８】
本発明は、前記塩基が、アンモニア水、アルキルアミンである、請求項１に記載の有機酸分析方法である。
【０００９】
本発明は、前記有機溶媒が、メタノール、アセトニトリル、イソプロパノール、ＴＨＦである、請求項１に記載の有機酸分析方法である。
【００１０】
ここで、液体クロマトグラフの分離カラムには、イオン排除カラム、イオン交換クロマトグラフカラムを使用する。イオン排除カラムは、負に帯電した固定相と酸性移動相とによる公知の組み合わせによるものを使用することができるが、この発明において固定相はスルホン基を有するイオン交換体を充填したカラムが、一方、酸性移動相としては、ｐＨ２〜３の強酸性のもので等量伝導度の低い酸、例えばｐ−トルエンスルホン酸、が好ましい。
【００１１】
分離カラムの移動相としては、例えば、イオン排除カラムを用いる場合、ギ酸水、過塩素酸水、りん酸水、酢酸水などの酸性移動相を使用する。ｐＨは２〜３の強酸性が好ましい。
【００１２】
質量分析計のイオン化部には、例えばエレクトロンスプレーイオン化法もしくは大気圧化学イオン化法を使用することができるが、これらに限定されない。
【００１３】
有機溶媒としては、例えばメタノール、アセトニトリル、イソプロパノール、ＴＨＦを使用することができるが、これらに限定されない。濃度は１０〜９０％が好ましい。
【００１４】
塩基としては、例えば、アンモニア水、アルキルアミンが使用できるが、これらに限定されない。最終ｐＨ６〜１０であり、好ましくは、ｐＨ８〜１２である。
【００１５】
有機溶媒と塩基の混合溶媒を用いる場合の混合比は、有機溶媒：塩基＝１：９〜９：１が好ましい。
【００１６】
混合手段としては、Ｔ字管、反応コイル、ミキサーが使用できるが、これらに限定されない。
【００１７】
なお、本発明で分析できる有機酸は、クエン酸、ピルビン酸、りんご酸、コハク酸、乳酸、フマル酸、酢酸が挙げられるが、これらに限定されない。
【００１８】
有機酸分離に用いるイオン排除カラムは、有機酸の解離を抑えるために移動相には酸性水溶液を用いる。一方、有機酸の質量分析ではプロトン脱離分子（［Ｍ−Ｈ］−）を検出するため、脱プロトンが起こり易い塩基性溶媒が適している。そこで、イオン排除カラム溶出後の移動相に塩基性溶液を添加・混合することにより、試料のｐＨを上昇させ、イオン化を促進し有機酸の検出感度を上げることができる。また、質量分析において多量の移動相溶媒が存在するとイオン化が抑制されるため、有機溶媒を添加することが望ましい。しかし、分離カラムには有機溶媒は導入不可能であるために、カラムによる分離が終了した時点で有機溶媒を添加・混合することで移動相溶媒の揮発性を高め、イオン化を促進し検出感度を上げることができる。
【００１９】
さらに、質量分析計では、分子量が特定できるために、分子量が異なる物質については必ずしもピークを分離する必要がなく、１本のカラムで有機酸を分離するだけで有機酸の同定が可能である。また、従来検出法では、未知のピークに対して保持時間以外の情報は得られなかったが、質量分析法を用いることによって未知ピークの分子量が推定でき、有機酸の同定が可能となる。
【００２０】
【実施例】
以下、本発明の実施例を図面を参照して説明するが、本発明はこれにより限定されるものではない。
図１にイオンクロマトグラフ質量分析計による有機酸分析システムの基本的な流路図を示す。図１中、１は移動相溜、２は移動相送液ポンプ、３はオートサンプラー、４は分離カラム、５は試薬（塩基または有機溶媒または有機溶媒混合塩基）溜、６は試薬送液ポンプ、７は混合部、８は質量分析計を各々示す。
【００２１】
以上の構成において、移動相送液ポンプ２によって移動相溜１から移動相がオートサンプラー４に送られて試料と混合され、分離カラム５に送られる。カラムから溶出した試料は、ポストカラム法によって塩基または有機溶媒または有機溶媒混合塩基が混合部８において添加・混合された後、質量分析計９に導入されて検出される。
【００２２】
次の条件にて本発明の有用性を調べた。
移動相として０．１％ギ酸水を流速０．２ｍＬ／ｍｉｎを使用し、４００ｎＭのクエン酸標準溶液を４０μｌ分離カラムに注入した。分離カラムから溶出した試料（ｐＨ＝２．６）に、Ｔ字管を用いて０．５％アンモニア水を添加混合し、試料のｐＨを８．９に上昇させた。その後、質量分析計に導入した。イオン化法はエレクトロンスプレーイオン化法とし、ネガティブイオンの測定を行った。
【００２３】
なお、分析条件の詳細は以下の通りである。
＜分析条件＞
（株）島津製作所製液体クロマトグラフ質量分析計ＬＣＭＳ−２０１０Ａにおいて、
カラム：Ｓｈｉｍ−ｐａｃｋ ＳＰＲ−Ｈ（株）島津製作所製（４．６ｍｍｌ．Ｄ． ×２５０ｍｍ，８μｍ）
移動相：０．１％ぎ酸水
移動相流量：０．２ｍＬ／ｍｉｎ
カラム温度：４５℃
試料注入量：５０μＬ
ポストカラム
塩基：０．５％アンモニウム水
移動相流量：０．１５ｍＬ／ｍｉｎ
最終ｐＨ：ｐＨ８．９
質量分析計
イオン化モード：ＥＳＩ（−）
霧化ガス流量：４．５Ｌ／ｍｉｎ
印加電圧：−３．５ｋＶ
ＣＤＬ温度：２５０℃
乾燥ガス流量：０．０５Ｍｐａ
分析モード：ＳＩＭ測定
分析範囲：ｍ／ｚ（−）１９０．８５
取込時間：１．０ｓｅｃ／Ｃｈ
【００２４】
＜結果＞
クエン酸の分子量は１９２であり、ＥＳＩ法ではプロトンが脱離したネガティブイオンｍ／ｚ１９１（＝［Ｍ−Ｈ］−）がメインピークとして観測される。図２に、上述分析による、ｍ／ｚ１９１をターゲットイオンとして、クエン酸標準液（４００ｎＭ）のＳＩＭ測定をしたマスクロマトグラムを示す。横軸はｍ／ｚ比、縦軸は相対強度である。この時のクエン酸ピークはＳ／Ｎ＝１５１（σ＝３）である。よって、定量限界をＳ／Ｎ＝１０と考えると、４００ｎＭ／１５１．０１×１０＝２６．４９ｎＭが定量限界となる。２６．４９ｎＭを５０μｌ注入して測定したので、２６．４６×１０−９μｇ／μＬ×５０μＬ×１９２＝２．５４×１０−４μｇ＝２５４μｇのクエン酸を定量できることになる。これは、従来の検出法であるポストカラムｐＨ調整電気伝導度検出法の感度より約１０倍上昇した。
【００２５】
なお、本発明に使用できる移動相の種類は、上記ギ酸水に限定されず、酸性であればＴＦＡ、過塩素酸水、りん酸水、酢酸水も使用することができる。
【００２６】
また、塩基は、上記アンモニア水に限定されず、アルカリ性であればアルキルアミンも利用することができる。
【００２７】
また、有機溶媒を添加することにより、移動相溶媒が揮発しやすくなることで、イオン化を促進させることができる。この場合の有機溶媒には、例えばメタノール、アセトニトリル、イソプロパノール、ＴＨＦを使用することができる。
【００２８】
【発明の効果】
本発明によれば、質量分析計で有機酸を選択的に感度良く分析可能となった。このことは、有機酸以外の未知物質が混合した試料の場合に未知物質と有機酸同定が容易になる。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の有機酸分析方法の流路図
【図２】本発明によりクエン酸標準液をＳＩＭ測定した結果
【符号の説明】
１…移動相溜
２…移動相送液ポンプ
３…オートサンプラー
４…分離カラム
５…試薬溜
６…試薬送液ポンプ
７…混合部
８…質量分析計[0001]
TECHNICAL FIELD OF THE INVENTION
The present invention relates to a technique for analyzing an organic acid mixture using a liquid chromatograph mass spectrometer.
[0002]
[Prior art]
Conventionally, organic acids are separated by high performance liquid chromatography using an ion exclusion column (for example, see Patent Document 1). In this ion exclusion chromatography, a mobile phase composed of a negatively charged stationary phase and an acidic aqueous solution is used, and the organic acid to be analyzed is separated based on the strength of electrostatic repulsion between the organic acid anion and the stationary phase. . After the organic acid is separated by this method, detection is performed by a post-column pH adjustment electric conductivity detection method or an ultraviolet-visible (UV) absorption spectrophotometry. In the post-column pH adjustment electrical conductivity detection method, a buffer solution is added to the mobile phase eluted from the column to fix the pH to around neutral, and then the amount of change in components that dissociate organic acids and become ions is measured. . In the ultraviolet-visible (UV) absorption spectrophotometry, the detection is performed based on the absorbance at 205 to 210 nm, focusing on the carboxyl group of the organic acid.
[0003]
[Patent Document 1] JP-A-8-201365
[Problems to be solved by the invention]
However, the above conventional detection methods have low detection sensitivity. The detection sensitivity of the above-mentioned post-column pH adjustment electric conductivity method is 3 × 10 −11 to 5 × 10 −11 , and taking citric acid having a molecular weight of 192 as an example, the sensitivity becomes 40 pN × 192/3 = 2560 pg, There is only nanogram order. In the case of UV-visible (UV) absorption spectroscopy, the detection sensitivity is lower than that of the post-column pH-adjusted conductivity method.
[0005]
Furthermore, since the conventional detection method described above has low selectivity, it is not necessary to connect two columns to perform analysis in order to prevent peaks from overlapping when performing simultaneous analysis of multiple organic acids. Not be. In particular, in the ultraviolet-visible (UV) absorption spectrophotometry, the absorbance at 205 to 210 nm is easily detected by the coexisting neutral contaminants that coexist, and the selectivity is poor, and sufficient analysis cannot be performed.
[0006]
On the other hand, it is conceivable to use a mass spectrometer as a detection method of liquid chromatography. According to the mass spectrometer, selectivity can be particularly improved. However, in an electron spray ionization method (ESI method) or an atmospheric pressure chemical ionization method (APCI method), which is an ionization unit generally used in a liquid chromatograph mass spectrometer, an eluate from a separation column is an acidic aqueous solution. Therefore, ionization is suppressed, and the detection sensitivity is lowered.
The present invention has been made to solve such a problem, and a main object of the present invention is to provide a highly sensitive organic acid analysis method using a liquid chromatograph mass spectrometer.
[0007]
[Means for Solving the Problems]
In order to solve the above-mentioned problems, the present invention provides a method for separating a sample containing an organic acid by subjecting the sample to a liquid chromatogram column using an acidic aqueous solution as a mobile phase, and separating and eluted from the column. And adding a base or an organic solvent, or a base and an organic solvent to the mixture, and then performing detection with a mass spectrometer.
[0008]
The present invention is the method for analyzing an organic acid according to claim 1, wherein the base is aqueous ammonia or an alkylamine.
[0009]
The present invention is the method for analyzing an organic acid according to claim 1, wherein the organic solvent is methanol, acetonitrile, isopropanol, or THF.
[0010]
Here, an ion exclusion column and an ion exchange chromatography column are used as the separation column of the liquid chromatograph. The ion exclusion column may be a known combination of a negatively charged stationary phase and an acidic mobile phase.In the present invention, the stationary phase is a column packed with an ion exchanger having a sulfone group. As the acidic mobile phase, a strongly acidic acid having a pH of 2 to 3 and a low equivalent conductivity, for example, p-toluenesulfonic acid is preferable.
[0011]
As the mobile phase of the separation column, for example, when an ion exclusion column is used, an acidic mobile phase such as aqueous formic acid, aqueous perchloric acid, aqueous phosphoric acid, or aqueous acetic acid is used. The pH is preferably a strong acidity of 2-3.
[0012]
For the ionization section of the mass spectrometer, for example, an electron spray ionization method or an atmospheric pressure chemical ionization method can be used, but is not limited thereto.
[0013]
Examples of the organic solvent include, but are not limited to, methanol, acetonitrile, isopropanol, and THF. The concentration is preferably from 10 to 90%.
[0014]
Examples of the base include, but are not limited to, aqueous ammonia and alkylamine. The final pH is 6 to 10, preferably 8 to 12.
[0015]
When a mixed solvent of an organic solvent and a base is used, the mixing ratio of the organic solvent and the base is preferably 1: 9 to 9: 1.
[0016]
As a mixing means, a T-tube, a reaction coil, and a mixer can be used, but are not limited thereto.
[0017]
The organic acids that can be analyzed in the present invention include, but are not limited to, citric acid, pyruvic acid, malic acid, succinic acid, lactic acid, fumaric acid, and acetic acid.
[0018]
The ion exclusion column used for organic acid separation uses an acidic aqueous solution as a mobile phase in order to suppress the dissociation of organic acids. On the other hand, in the mass analysis of an organic acid, a proton-eliminating molecule ([MH] − ) is detected, so that a basic solvent in which deprotonation easily occurs is suitable. Therefore, by adding and mixing a basic solution to the mobile phase after elution of the ion exclusion column, the pH of the sample can be increased, ionization can be promoted, and the detection sensitivity of organic acids can be increased. In addition, in mass spectrometry, when a large amount of a mobile phase solvent is present, ionization is suppressed. Therefore, it is desirable to add an organic solvent. However, since no organic solvent can be introduced into the separation column, the organic solvent is added and mixed at the end of the separation by the column to increase the volatility of the mobile phase solvent, promote ionization and improve detection sensitivity. Can be raised.
[0019]
Further, in the mass spectrometer, since the molecular weight can be specified, it is not always necessary to separate peaks for substances having different molecular weights, and it is possible to identify an organic acid simply by separating the organic acid with one column. Further, in the conventional detection method, information other than the retention time was not obtained for the unknown peak, but the molecular weight of the unknown peak can be estimated by using mass spectrometry, and the identification of the organic acid can be performed.
[0020]
【Example】
Hereinafter, embodiments of the present invention will be described with reference to the drawings, but the present invention is not limited thereto.
FIG. 1 shows a basic flow chart of an organic acid analysis system using an ion chromatograph mass spectrometer. In FIG. 1, 1 is a mobile phase reservoir, 2 is a mobile phase liquid sending pump, 3 is an autosampler, 4 is a separation column, 5 is a reagent (base or organic solvent or mixed base of organic solvent) reservoir, and 6 is a reagent sending pump. , 7 indicate a mixing section, and 8 indicates a mass spectrometer.
[0021]
In the above configuration, the mobile phase from the mobile phase reservoir 1 is sent to the autosampler 4 by the mobile phase liquid sending pump 2, mixed with the sample, and sent to the separation column 5. The sample eluted from the column is added and mixed in the mixing section 8 with a base or an organic solvent or an organic solvent mixed base by the post-column method, and then introduced into the mass spectrometer 9 for detection.
[0022]
The usefulness of the present invention was examined under the following conditions.
Using a 0.1% formic acid aqueous solution as a mobile phase at a flow rate of 0.2 mL / min, a 40 μl citric acid standard solution was injected into a 40 μl separation column. To the sample (pH = 2.6) eluted from the separation column, 0.5% ammonia water was added and mixed using a T-tube to raise the pH of the sample to 8.9. Then, it was introduced into a mass spectrometer. The ionization method was an electron spray ionization method, and negative ions were measured.
[0023]
The details of the analysis conditions are as follows.
<Analysis conditions>
In a liquid chromatograph mass spectrometer LCMS-2010A manufactured by Shimadzu Corporation,
Column: Shim-pack SPR-H (manufactured by Shimadzu Corporation, 4.6 mm.D. × 250 mm, 8 μm)
Mobile phase: 0.1% formic acid aqueous solution Mobile phase flow rate: 0.2 mL / min
Column temperature: 45 ° C
Sample injection volume: 50 μL
Post column base: 0.5% ammonium water Mobile phase flow rate: 0.15 mL / min
Final pH: pH 8.9
Mass spectrometer ionization mode: ESI (-)
Atomizing gas flow rate: 4.5 L / min
Applied voltage: -3.5 kV
CDL temperature: 250 ° C
Dry gas flow rate: 0.05Mpa
Analysis mode: SIM measurement Analysis range: m / z (-) 190.85
Acquisition time: 1.0sec / Ch
[0024]
<Result>
The molecular weight of citric acid is 192, and a negative ion m / z 191 (= [MH] − ) from which a proton has been eliminated is observed as a main peak in the ESI method. FIG. 2 shows a mass chromatogram obtained by performing SIM measurement of a citric acid standard solution (400 nM) using m / z 191 as a target ion according to the above analysis. The horizontal axis is the m / z ratio, and the vertical axis is the relative intensity. The citric acid peak at this time is S / N = 151 (σ = 3). Therefore, assuming that the limit of quantification is S / N = 10, the limit of quantification is 400 nM / 151.01 × 10 = 26.49 nM. Since measurement was performed by injecting 50 μl of 26.49 nM, 26.46 × 10 −9 μg / μL × 50 μL × 192 = 2.54 × 10 −4 μg = 254 μg of citric acid can be quantified. This was about 10 times higher than the sensitivity of the conventional detection method for post-column pH adjusted conductivity.
[0025]
The type of mobile phase that can be used in the present invention is not limited to the above-described formic acid aqueous solution, and TFA, aqueous perchloric acid, aqueous phosphoric acid, and aqueous acetic acid can be used as long as they are acidic.
[0026]
Further, the base is not limited to the above-mentioned aqueous ammonia, and an alkylamine can be used as long as it is alkaline.
[0027]
Further, by adding an organic solvent, the mobile phase solvent is easily volatilized, so that ionization can be promoted. As the organic solvent in this case, for example, methanol, acetonitrile, isopropanol, and THF can be used.
[0028]
【The invention's effect】
ADVANTAGE OF THE INVENTION According to this invention, it became possible to analyze an organic acid selectively and with high sensitivity with a mass spectrometer. This facilitates identification of the unknown substance and the organic acid in the case of a sample in which an unknown substance other than the organic acid is mixed.
[Brief description of the drawings]
FIG. 1 is a flow chart of an organic acid analysis method of the present invention. FIG. 2 is a result of SIM measurement of a citric acid standard solution according to the present invention.
DESCRIPTION OF SYMBOLS 1 ... Mobile phase reservoir 2 ... Mobile phase liquid sending pump 3 ... Autosampler 4 ... Separation column 5 ... Reagent reservoir 6 ... Reagent sending pump 7 ... Mixing part 8 ... Mass spectrometer
