【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は臨床検査の分野で用いられ、血小板の活性化を調べる検査装置および方法として用いられる。
【０００２】
【従来の技術】
心筋梗塞や脳梗塞をはじめとする虚血性疾患は血液の凝固異常として捕らえることができる。血液凝固機能検査は、プロトロンビン時間測定、種々の凝固指標分子の測定により行われている。一方、血液凝固に大きな役割をしている血小板の検査は、血小板数や血小板の機能を調べる血小板凝集検査を中心に行われている。血小板は、血管損傷などにより露出される内皮下組織のコラーゲンなどの結合組織蛋白質や血漿中に存在するトロンビンなどの血小板膜受容体への結合、あるいは血小板内の顆粒中に存在するアデノシンジフォスフェイト（ＡＤＰ）、アドレナリン、セロトニン、トロンボキサン（ＴＸ）Ａ２などの放出によるオートクライン的な膜受容体への結合によって活性化される。そして、フィブリノゲン受容体である糖蛋白質が細胞表面に提示され、その複合体（ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ）を形成することによって凝集可能となり、フィブリノゲン架橋を介した凝集を起こす。
【０００３】
血栓症の病態を把握する上で血小板活性化マーカーを測定することは各種血栓症の診断的意義に加えて、種々の抗血小板剤を用いた治療におけるモニターにも有用である。従来より活性化血小板のマーカーとして種々の血小板表面マーカーが知られている（臨床病理 ５０、 ７７３−７７８、２００２）。しかし、血小板の活性化マーカーは細胞の専用検査装置であるフローサイトメーターを使って行われており、その操作の煩雑さ、コスト等から汎用されるには至っていない。
【０００４】
一方、日常の臨床検査室で行われている血液学分析は、赤血球、白血球、血小板数等２０数項目を数分間で測定できる自動分析装置で行っている。また、このような血液学自動分析装置の中には、抗体を用いた白血球Ｔ細胞のサブセット検査や血小板数の測定が簡単にできる装置が開発されている。このような汎用装置を用いて活性化された血小板の検査が望まれている。山本らは、脳梗塞患者の血小板測定において、クエン酸採血した試料で測定した血小板数測定の分布図を解析することによって、ＥＤＴＡ採血試料より顕著に活性化血小板を検出しうることを報告している（日本臨床検査自動化学会、第３４回大会）。しかし、本報告では脳梗塞における提案された方法の感度（脳梗塞患者での活性化血小板の検出割合）は約６０％前後である。したがって、簡便で感度及び特異性に優れた活性化血小板の検査方法が望まれていた。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の課題は、簡便で感度及び特異性に優れた活性化した血小板を検査できる方法を提供することである。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、血小板の活性化に伴って出現する血小板表面に種々の糖蛋白質やリン脂質のひとつであるホスファチジルセリン等をリガンドを用いて検出すること及び臨床検査室で汎用されている血液分析装置で抗凝固剤にクエン酸を用いた試料で血小板を測定することによる血小板凝集塊の検出の検査を組合せることにより本発明を完成させた。
【０００７】
本発明は以下の構成からなる。
１、全血試料中の血小板を光学的に測定する工程、測定したデーターを解析し血小板凝集塊を検出する工程及び生理活性を利用して活性化血小板マーカーを検出する工程を含むことを特徴とする活性化血小板の検査方法。
２、生理活性を利用して活性化血小板マーカーを検出する工程が、活性型糖蛋白質ＩＩｂ／ＩＩＩａ（ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ）、Ｐ−セレクチン、ライソゾーム膜成分、ホスファチジルセリン又は血小板由来マイクロパーティクルのうちから選ばれた少なくとも１種類の物質を検出する工程であって、該物質と特異的に結合しうるリガンドを用いる上記１に記載の方法。
３、上記１〜２に記載の方法を行うための装置。
４、上記１〜３に記載の方法または装置に用いる試薬またはキット。
【０００８】
【発明の実施の形態】
本発明は、血小板の検査法に関するものであり、とりわけ活性化されている血小板の検査方法に関するものである。本発明は、試料中の血小板凝集塊の検出と活性化血小板マーカーの検出の２つの検査方法を組み合わせた検査方法および検査装置を提供するものである。
【０００９】
血小板をレーザーフローサイトメトリー法により測定した散乱光情報をスキャッターグラムに表して解析することにより活性化血小板を認識する。すなわちクエン酸採血された試料では血小板の活性化により凝集塊を形成した血小板がスキャッターグラム上で通常の血小板とは異なった分布で観察される。この血小板凝集塊の検出を活性化血小板の指標として検査する。
【００１０】
一方、血小板表面に活性化により特異的に出現してくるマーカーを、生理活性を利用して測定する方法として、抗体を用いる免疫学的方法が一般的である。その例として、活性型糖蛋白質ＩＩｂ／ＩＩＩａ（ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ）に結合する抗体（ＰＡＣ−１）、ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａに結合しているフィブリノゲンに結合する抗体、さらにはそのフィブリノゲンに結合しているトロンボスポンジンに結合する抗体、血小板表面のＰ−セレクチンに結合する抗体（ＣＤ６２Ｐ）、血小板表面のライソゾーム膜成分に結合する抗体（ＣＤ６３）、血小板由来マイクロパーティクルに結合する抗体（ＧＰＩＸ、ＧＰＩｂ、ＧＰＩＩｂ）、ホスファチジルセリンに結合する抗体、また抗体以外のリガンドとして、ホスファチジルセリンと特異的に結合するアネキシンＶ及び活性型ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａに結合しうるアルギニン−グリシン−アスパラギン酸のアミノ酸配列を有するペプチド（ＲＧＤペプチド）等が例示される。これらの抗体、アネキシンＶ及びＲＧＤペプチド等は適当な標識をしておくことにより簡単に検査が行える。標識の例としてはフルオレセイン、フィコエリスリン、ペリオジニン クロロフィル プロテイン、テキサスレッド、Ｃｙ３及びＣｙ５等の蛍光物質で標識することができる。標識したリガンドを検体と反応させることにより、血小板表面に結合した標識リガンドを指標として活性化血小板をフローサイトメトリー等により検出するか、あるいは血小板由来マイクロパーティクルの検出の場合にはフローサイトメトリーのスキャッターグラム上でその画分を検出する。
【００１１】
本発明の方法を簡単に実施するには、全自動の総合血液学分析装置、例えばＣＥＬＬ−ＤＹＮ４０００（ダイナボット社製）を用いることにより実施可能である。本装置では、免疫学的に血小板や白血球を測定するフローサイトメトリー機能が組み込まれていることを利用して、たとえば活性型のＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａを認識するＰＡＣ−１抗体をフルオレセインで標識したフルオレセイン標識ＰＡＣ−１抗体を用いて測定したのちスキャッターグラム又はヒストグラムを作成する等のデーター解析により、活性型ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａを検出することが可能である。その情報を基に活性化血小板の指標とすることができる。用いる検査試料は、もうひとつの検査である血小板の検査とリンクさせて、クエン酸採血した血液が好適である。
【００１２】
本発明の方法に用いるもう一方の血小板数測定は、クエン酸採血された血液でレーザー光学法により測定しスキャッターグラム化し解析することにより行われる。活性化された血小板を含む試料では通常の血小板の分布とは異なる領域に活性化血小板に起因する血小板凝集塊の分布が現れる。それらはたとえば、前記のＣＥＬＬ−ＤＹＮ４０００（ダイナボット社製）を用いてレーザー光学法により９０度散乱と小角散乱（７度）のスキャッターグラムにより検査できる。本発明の方法及び装置は、特にこれらに限定されるものではなく、血小板数検査において血小板凝集塊に起因する活性化血小板を検出しうるものであれば良く、そして同一装置内にフローサイトメトリー機能を備えた装置であれば好適である。すなわち、同一試料、装置を用いて、血小板の検査を行うことにより、活性化血小板をより簡単に、感度良く検査できるといった格別の効果がある。
【００１３】
【実施例】
本発明の実施例を以下に示すが、本発明は実施例に限定されるものではない。
【実施例１】
３．８％クエン酸ナトリウム添加全血（１：９）４０例を全自動血液学分析装置ＣＥＬＬ−ＤＹＮ４０００（ダイナボット社製）により２次元レーザー法モード（９０度／７度）で血小板数の測定を行い、スキャッターグラム解析により血小板凝集塊の有無を判定した。
一方、市販のＰＡＣ−１マウスモノクロナール抗体をフルオレセインで標識しＦＩＴＣ−ＰＡＣ−１抗体を調製した。調製したＦＩＴＣ−ＰＡＣ−１抗体を用いて、ＣＥＬＬ−ＤＹＮ４０００の免疫学的測定モード（ＰＬＴ−ｉｍｍ）で血小板表面の活性型ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ
をマーカーとして活性化血小板を検査した。その結果を表１に示した。
【００１４】
【表１】
【００１５】
以上の結果、ＰＡＣ−１抗体の陽性率は１０／４０であり、一方凝集塊陽性の検出率は７／４０である。両検出いずれかが陽性の数は１１／４０となり、両検出法を組み合わせることにより、より効果的な活性化血小板の検出が可能であり、本発明の有用性が確認できた。
【００１６】
【発明の効果】
本発明により、簡便で感度及び特異性に優れた活性化した血小板を検査できる方法、試薬及び装置を提供することができる。[0001]
TECHNICAL FIELD OF THE INVENTION
INDUSTRIAL APPLICABILITY The present invention is used in the field of clinical testing, and is used as a testing device and a method for checking platelet activation.
[0002]
[Prior art]
Ischemic diseases such as myocardial infarction and cerebral infarction can be regarded as abnormal blood coagulation. The blood coagulation function test is performed by measuring prothrombin time and measuring various coagulation index molecules. On the other hand, platelet tests, which play a major role in blood coagulation, are mainly performed on platelet aggregation tests for examining platelet count and platelet function. Platelets bind to connective tissue proteins such as collagen in the subendothelial tissue exposed by vascular damage, platelet membrane receptors such as thrombin present in plasma, or adenosine diphosphate present in granules in platelets Activated by autocrine binding to membrane receptors by release of (ADP), adrenaline, serotonin, thromboxane (TX) A2 and the like. Then, the glycoprotein, which is a fibrinogen receptor, is displayed on the cell surface, and forms a complex (GPIIb / IIIa), which enables aggregation, and causes aggregation through fibrinogen crosslinking.
[0003]
Measuring a platelet activation marker in understanding the pathology of thrombosis is useful not only for diagnostic significance of various thrombosis but also for monitoring in treatment with various antiplatelet agents. Conventionally, various platelet surface markers have been known as activated platelet markers (Clinical Pathology 50, 773-778, 2002). However, platelet activation markers are performed using a flow cytometer, which is a dedicated cell inspection device, and have not been widely used due to the complexity and cost of the operation.
[0004]
On the other hand, hematology analysis performed in daily clinical laboratories is performed by an automatic analyzer that can measure 20 items such as red blood cells, white blood cells, and platelets in a few minutes. Further, among such automatic hematology analyzers, an apparatus has been developed which can easily perform a subset test of white blood cell T cells and a measurement of platelet count using an antibody. Examination of platelets activated using such a general-purpose device is desired. Yamamoto et al. Reported that in platelet measurement in patients with cerebral infarction, activated platelets can be detected significantly in EDTA blood samples by analyzing the distribution map of platelet counts measured in citrated blood samples. (Japan Society of Clinical Laboratory Automation, 34th Annual Meeting). However, in this report, the sensitivity of the proposed method in cerebral infarction (detection rate of activated platelets in cerebral infarction patients) is around 60%. Therefore, a simple and highly sensitive and highly specific method for testing activated platelets has been desired.
[0005]
[Problems to be solved by the invention]
An object of the present invention is to provide a method that can easily and simply test activated platelets with excellent sensitivity and specificity.
[0006]
[Means for Solving the Problems]
The present inventors have found that using a ligand to detect phosphatidylserine, which is one of various glycoproteins and phospholipids, on the surface of platelets appearing with the activation of platelets using a ligand, and blood commonly used in clinical laboratories The present invention has been completed by combining a test for detecting platelet aggregates by measuring platelets in a sample using citric acid as an anticoagulant in an analyzer.
[0007]
The present invention has the following configuration.
1. a step of optically measuring platelets in a whole blood sample, a step of analyzing the measured data to detect a platelet aggregate, and a step of detecting an activated platelet marker using physiological activity. To test for activated platelets.
2. The step of detecting an activated platelet marker using physiological activity is selected from active glycoprotein IIb / IIIa (GPIIb / IIIa), P-selectin, lysosomal membrane component, phosphatidylserine, or platelet-derived microparticles 2. The method according to the above 1, wherein the method comprises the step of detecting at least one kind of substance obtained by using a ligand capable of specifically binding to the substance.
3. An apparatus for performing the method according to the above 1 or 2.
4. Reagents or kits used in the method or apparatus described in the above 1 to 3.
[0008]
BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION
The present invention relates to a method for testing platelets, and more particularly, to a method for testing activated platelets. The present invention provides an inspection method and an inspection apparatus that combine two inspection methods of detecting a platelet aggregate in a sample and detecting an activated platelet marker.
[0009]
Activated platelets are recognized by analyzing scattered light information obtained by measuring platelets by laser flow cytometry in a scattergram and analyzing the scattered light information. That is, in the sample collected with citric acid, platelets that have formed aggregates due to platelet activation are observed on the scattergram with a distribution different from that of ordinary platelets. The detection of the platelet aggregate is examined as an indicator of activated platelets.
[0010]
On the other hand, an immunological method using an antibody is generally used as a method for measuring a marker that specifically appears on the platelet surface by activation using a physiological activity. Examples thereof include an antibody (PAC-1) that binds to the active glycoprotein IIb / IIIa (GPIIb / IIIa), an antibody that binds to fibrinogen that binds to GPIIb / IIIa, and thrombo that binds to the fibrinogen. Antibodies that bind to Spondin, antibodies that bind to P-selectin on platelet surface (CD62P), antibodies that bind to lysosomal membrane components on platelet surface (CD63), and antibodies that bind to platelet-derived microparticles (GPIX, GPIb, GPIIb) , An antibody that binds to phosphatidylserine, and a peptide having an amino acid sequence of arginine-glycine-aspartic acid capable of binding to annexin V that specifically binds to phosphatidylserine and activated GPIIb / IIIa (RGD peptide De) and the like. These antibodies, annexin V, RGD peptide, etc. can be easily tested by labeling them appropriately. Examples of the label include a fluorescent substance such as fluorescein, phycoerythrin, periodinin chlorophyll protein, Texas Red, Cy3 and Cy5. By reacting the labeled ligand with the sample, activated platelets are detected by flow cytometry using the labeled ligand bound to the platelet surface as an index, or in the case of detection of platelet-derived microparticles, flow cytometry is performed. Detect the fraction on the Cattergram.
[0011]
The method of the present invention can be easily carried out by using a fully automatic hematology analyzer, for example, CELL-DYN4000 (manufactured by Dynabot). In this apparatus, for example, a PAC-1 antibody that recognizes active GPIIb / IIIa is fluorescein-labeled with fluorescein, utilizing the fact that a flow cytometry function for immunologically measuring platelets and leukocytes is incorporated. Active GPIIb / IIIa can be detected by data analysis such as preparing a scattergram or histogram after measurement using the PAC-1 antibody. Based on the information, it can be used as an indicator of activated platelets. The test sample to be used is preferably citrate-collected blood linked to another test, platelet test.
[0012]
The other platelet count measurement used in the method of the present invention is carried out by measuring the citrate-collected blood using a laser optical method, analyzing the scattergram, and analyzing. In a sample containing activated platelets, the distribution of platelet aggregates caused by activated platelets appears in a region different from the normal platelet distribution. For example, they can be inspected by scattergram of 90-degree scattering and small-angle scattering (7 degrees) by the laser optical method using the above-mentioned CELL-DYN4000 (manufactured by Dynabot). The method and apparatus of the present invention are not particularly limited to these, and any method can be used as long as it can detect activated platelets caused by platelet aggregates in a platelet count test, and a flow cytometry function can be provided in the same apparatus. Any device provided with In other words, by performing the platelet test using the same sample and device, there is a special effect that activated platelets can be more easily and highly sensitively tested.
[0013]
【Example】
Examples of the present invention will be described below, but the present invention is not limited to the examples.
Embodiment 1
Platelet counts of 40 cases of 3.8% sodium citrate-added whole blood (1: 9) were measured by a fully automatic hematology analyzer CELL-DYN4000 (manufactured by Dynabot) in a two-dimensional laser mode (90 ° / 7 °). The measurement was performed, and the presence or absence of platelet aggregates was determined by scattergram analysis.
On the other hand, a commercially available PAC-1 mouse monoclonal antibody was labeled with fluorescein to prepare a FITC-PAC-1 antibody. Using the prepared FITC-PAC-1 antibody, activated GPIIb / IIIa on the platelet surface in the immunoassay mode (PLT-imm) of CELL-DYN4000.
Activated platelets were examined using as a marker. The results are shown in Table 1.
[0014]
[Table 1]
As a result, the PAC-1 antibody positive rate is 10/40, while the aggregate positive detection rate is 7/40. The number of positives for either of the two detections was 11/40, and by combining both detection methods, more effective detection of activated platelets was possible, confirming the usefulness of the present invention.
[0016]
【The invention's effect】
According to the present invention, it is possible to provide a method, a reagent, and an apparatus that can easily test activated platelets excellent in sensitivity and specificity.