JP2004105152A - Gene of amidase hydrolyzing (r)-form amide bond selectively and use of the same - Google Patents

Abstract

<P>PROBLEM TO BE SOLVED: To provide a method for producing an optically active carboxylic acid or amide which is an industrially useful compound as an intermediate of a medicine, an agrochemical, etc. <P>SOLUTION: The new stereo-selective amide-hydrolyzing enzymes derived from Pseudomonas sp MCI3434 or Pseudomonas aeruginosa PA01 strain and DNAs encoding each of them are provided. By stereo-selectively hydrolyzing an amide by using the amide-hydrolyzing enzymes, it is possible to produce a chiral carboxylic acid or its amide, especially a chiral nitrogen-containing heterocyclic compound carboxylic acid or its amide (including the N-alkylamide). The amide-hydrolyzing enzymes are excellent in activity and stereo-selectivity. <P>COPYRIGHT: (C)2004,JPO

Description

【００１２】
（式中、Ａは、置換されていてもよい主鎖原子数２〜５の炭化水素鎖を示し、該炭化水素鎖には二重結合が含まれていてもよいし、窒素原子または窒素原子以外のヘテロ原子が一個含まれていてもよい。Ｒ及びＲ’は、それぞれ独立に、水素原子、置換されていてもよいアルキル基又は置換されていても良いアリール基を示す。ｎは０または１を示す。）で表されるカルボン酸アミド類に、上記した本発明のアミダーゼ若しくはタンパク質、または形質転換宿主細胞若しくはその処理物を作用させることにより、（Ｒ）−体のアミド結合を選択的に加水分解させた後、下記一般式（ＩＩ）
【００１３】
【化８】

【００１４】
（式中、Ａ、Ｒ’及びｎは前記と同義である。）で表される（Ｒ）−体のカルボン酸類および／または下記一般式（ＩＩＩ）
【００１５】
【化９】

【００１６】
（式中、Ａ、Ｒ、Ｒ’及びｎは前記と同義である。）で表される（Ｓ）−体のカルボン酸アミド類を単離することを特徴とする光学活性なカルボン酸類および／またはアミド類の製造方法が提供される。
本発明のさらに別の側面によれば、上記した本発明のＤＮＡまたは組換えＤＮＡ分子若しくはベクターと、該ＤＮＡと５０％以上の相同性を示す１種以上のＤＮＡとをランダムリコンビネーションし、立体選択的アミダーゼ活性を指標として選択することを特徴とする立体選択的アミダーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡの調製方法が提供される。
【００１７】
以下に、本発明を詳細に説明する。
【００１８】
【発明の実施の形態】
以下に、本発明の実施形態および実施方法について詳細に説明する。
（１）本発明のアミダーゼおよびタンパク質
本発明は、以下の理化学的性質を有する立体選択的アミダーゼに関するものである。
（Ａ）ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより測定したみかけの分子量が２９，０００〜３１，０００程度である；
（Ｂ）（ＲＳ）−ピペラジン−２−カルボキサミドまたは（ＲＳ）−Ｎ−ｔｅｒｔブチルピペラジン−２−カルボキサミドを基質として用いたときのアミダーゼ反応の至適ｐＨがｐＨ８付近である；
（Ｃ）（ＲＳ）−ピペラジン−２−カルボキサミドまたは（ＲＳ）−Ｎ−ｔｅｒｔブチルピペラジン−２−カルボキサミドを基質として用いたときのアミダーゼ反応の至適温度が４５〜５０℃である；
（Ｄ）ｐＨ８．０付近において４５℃以下の温度で安定である；
（Ｅ）ｐ−クロロ水銀安息香酸、Ｃｕ^２＋、Ｚｎ^２＋、Ｃｄ^２＋、Ｈｇ^２＋、Ｐｂ^２＋により活性が完全に阻害される；及び
（Ｆ）（ＲＳ）−ピペラジン−２−カルボキサミドを基質として用いたときのアミダーゼ反応の立体選択性が、（Ｒ）−体選択的であり、Ｅ値が３０〜６０である。
【００１９】
本発明のアミダーゼの例としては、例えば、配列番号１または３記載のアミノ酸配列で表されるタンパク質、それらのホモログであって（Ｒ）−体選択的にピペラジン−２−カルボキサミドを加水分解する酵素活性を有するタンパク質、または配列番号１または３記載のアミノ酸配列又はそのホモログのアミノ酸配列を分子内に含むタンパク質である。
【００２０】
ここで、本発明のタンパク質のホモログとは、配列番号１または３に示されるアミノ酸配列と６０％以上、好ましくは７０％以上、より好ましくは９０％以上のホモロジーを有するタンパク質であって、ピペラジン−２−カルボキサミドに作用し、そのアミド結合を（Ｒ）−体選択的に加水分解する活性を有するタンパク質をいう。これらのホモログには、配列番号１または３に示されるアミノ酸配列において１から複数個のアミノ酸が欠失、付加または置換されているアミノ酸配列で表されるタンパク質であって、ピペラジン−２−カルボキサミドに作用し、そのアミド結合を（Ｒ）−体選択的に加水分解する活性を有するタンパク質も含まれる。
【００２１】
ちなみに上記タンパク質のホモロジー検索は、例えば、ＦＡＳＴＡプログラムやＢＬＡＳＴプログラムなどを用いて行うことができる。Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｄａｔａ　Ｂａｎｋ（ＰＤＢ）などのアミノ酸配列データベースを対象としてＢＬＡＳＴプログラムを用いて配列番号１に記載のアミノ酸配のホモロジー検索を行った結果、既知のタンパク質の中で最も高いアミノ酸アイデンティティーを示したのは、配列番号２に記載のシュードモナス　エルギノーサ　ＰＡＯ１株のｃｏｎｓｅｒｖｅｄ　ｈｙｐｏｔｈｅｔｉｃａｌ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ＰＡ３５９８（６５％）（Ｓｔｏｖｅｒ、Ｃ．Ｋ．ら、〔Ｎａｔｕｒｅ、（２０００）、４０６（６７９９）：９５９−９６４〕）であった。次に相同性の高いタンパク質として、シノリゾビウム　メリロティ　１０１２株のｃｏｎｓｅｒｖｅｄ　ｈｙｐｏｔｈｅｔｉｃａｌ　ｐｒｏｔｅｉｎ　（ＮＣＢＩ登録番号：ＣＡＣ４７０７５）が検索されたが、そのアミノ酸アイデンティティーは３６％（Ｇａｌｉｂｅｒｔ、Ｆ．ら〔Ｓｃｉｅｎｃｅ、（２００１）、２９３（５５３０）：６６８−６７２〕）であり有意な相同性があるとはいえなかった。
【００２２】
また、「配列番号１または３のアミノ酸配列又はそのホモログのアミノ酸配列を分子内に含むタンパク質」とは、該タンパク質のＮ末端やＣ末端に蛋白質相互作用、リガンド結合機能又は別の特殊な機能を有するタンパク質を結合させた融合タンパク質を意味する。
融合タンパク質としては、例えば、通常の分子遺伝学的手法を用いてＧｉｌｂｅｒｔ　Ｈ．Ｊ．ら〔Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、４、７５９−７６７、（１９９０）〕やＳｈｏｓｅｙｏｖ　Ｏ．ら〔米国特許第５４９６９３４号〕が報告しているようなセルロース結合機能を有するアミノ酸配列を本発明のタンパク質のＮ末端やＣ末端に付加したもの、ニッケル結合機能を有するヒスチジンのヘキサマーを結合させて、該タンパク質に特異的結合能を与えたもの、またＫｉｍＧ．Ｊ．ら〔Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．　Ｂｉｏｅｎｇ．、６８、２１１−２１７、（２０００）〕記載のような手法により本発明のタンパク質を他の機能を有するタンパク質と融合させたもの等が挙げられる。
【００２３】
本発明のタンパク質は、そのアミノ酸配列が明らかになっているので、後述するように、配列番号１または３のアミノ酸配列の一部又は全部をコードする塩基配列を基にして作成したＤＮＡプローブを用いることにより、（Ｒ）−ピペラジン−２−カルボキサミド加水分解活性を有する任意の微生物から（Ｒ）−体選択的−ピペラジン−２−カルボキサミド加水分解活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡを単離することができる。また、ＤＮＡ合成装置を用いて（Ｒ）−体選択的ピペラジン−２−カルボキサミド加水分解活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡを合成することもできる。さらに、得られたＤＮＡを用いて分子遺伝学的手法により多量の該タンパク質を製造し、そこから通常の方法により該タンパク質単離することができる。また、上記ＤＮＡを有する微生物、例えばシュードモナス　エスピー　ＭＣＩ３４３４株の培養菌体より精製することも出来る。
【００２４】
尚、シュードモナス　エスピーＭＣＩ３４３４株、及びシュードモナス　エルギノーサ　ＰＡＯ１株はともに公知の微生物であり、前者は独立行政法人産業総合研究所特許生物寄託センターにＦＥＲＭ　Ｐ−１６１７０として寄託登録されており、後者はアメリカンタイプカルチャーコレクション（ＡＴＣＣ）においてシュードモナス　エルギノーサ　ＡＴＣＣ４７０８５として、またそのゲノムＤＮＡがＡＴＣＣ４７０８５Ｄとして登録されており、容易に入手可能である。
【００２５】
微生物の培養菌体から本発明のタンパク質を単離する方法としては、一般的なタンパク質の精製方法が応用できる。例えば、上記微生物を一般的な微生物用栄養培地、好ましくは窒素源としてニュートリエントブロス及び炭素源としてリンゴ酸を含む培地で培養することで十分に増殖させた後に遠心分離により回収し、超音波破砕処理やフレンチプレス処理により無細胞抽出液とする。この無細胞抽出液から、遠心分離、カラムクロマトグラフィー、電気泳動などの操作により蛋白質の物理化学的な性質の差異を利用して目的とするタンパク質を単離することができる。より推奨される手法としては、上記微生物から無細胞抽出液を調製し、イオン交換クロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィー、吸着クロマトグラフィー、及びサイズ排除クロマトグラフィー等を用いて本発明のタンパク質を精製できる。別法として、後述するように配列番号２または４記載のＤＮＡを適当な発現プロモーターとリボゾーム結合配列の下流に保有するベクターを組み込んだ組み換え体生物、好ましくはエシェリヒア　コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ（以下これを「Ｅ．ｃｏｌｉ」と略称することがある。））の培養菌体から、超音波破砕処理及び遠心分離により無細胞抽出液を調製し、硫安分画、及びイオン交換クロマトグラフィーを用いて本願タンパク質を単離することもできる。
【００２６】
以下に、シュードモナス　エスピー　ＭＣＩ３４３４株より単離された、配列番号１に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質の物理学的、及び酵素学的性質を示す。

２．サブユニット構成：　モノマー
３．アミダーゼ反応至適ｐＨ：　ｐＨ８．０
４．アミダーゼ反応至適温度：　４５℃
５．耐熱性：４５℃以下で安定である。
６．本タンパク質のアミダーゼ活性を完全に阻害する化合物：ｐ−クロロ水銀安息香酸、Ｍｎ^２＋、Ｃｏ^２＋、Ｎｉ^２＋、Ｃｕ^２＋、Ｚｎ^２＋、Ｃｄ^２＋、Ｈｇ^２＋、Ｐｂ^２＋。
７．基質特異性：β−アラニンアミド、Ｄ−グルタミンアミド、及び（Ｒ）体の含窒素複素環カルボン酸アミド類に対し、高いアミダーゼ活性を示す。より好ましい基質としては、（Ｒ）−ピペラジン−２−カルボキサミド、ピペリジン−３−カルボキサミド、（Ｒ）−Ｎ−ｔｅｒｔ−ブチルピペラジン−２−カルボキサミドなどが挙げられる。
８．立体選択性：ラセミ体ピペラジン−２−カルボキサミドに作用させた場合、Ｅ値は５９である。
【００２７】
また、シュードモナス　エルギノーサ　ＰＡＯ１株より単離された配列番号３に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質の物理学的、及び酵素学的性質を以下に示す。

２．サブユニット構成：　ホモダイマー
３．アミダーゼ反応至適ｐＨ：　ｐＨ８．０
４．アミダーゼ反応至適温度：　５０℃
５．耐熱性：４５℃以下で安定である。
６．本タンパク質のアミダーゼ活性を完全に阻害する化合物：Ｎ−エチルマレイミド、ｐ−クロロ水銀安息香酸、Ｃｕ^２＋、Ｚｎ^２＋、Ａｇ^＋、Ｃｄ^２＋、Ｈｇ^２＋、Ｔｌ^＋、Ｐｂ^２＋。
７．立体選択性：ラセミ体ピペラジン−２−カルボキサミドに作用させた場合、Ｅ値は３０である。
【００２８】
（２）本発明のＤＮＡ
本発明のＤＮＡとは上記（１）本発明のアミダーゼおよびタンパク質をコードするＤＮＡである。このＤＮＡには上記タンパク質のホモログをコードするＤＮＡ（以下これを「ＤＮＡホモログ」と略称することがある。）も含まれる。
上記タンパク質をコードするＤＮＡとしては、例えば、配列番号２または４で表される塩基配列を含むものが挙げられる。
本発明のタンパク質をコードするＤＮＡホモログとは、配列番号１または３に記載のアミノ酸配列に１もしくは複数のアミノ酸が欠失、置換、挿入及び／又は付加されたアミノ酸配列を含むタンパク質をコードするＤＮＡを含む。
【００２９】
当業者であれば、配列番号２または４記載のＤＮＡに部位特異的変異導入法（Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．１０，ｐｐ．６４８７（１９８２）、Ｍｅｔｈｏｄｓｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌ．１００，ｐｐ．４４８（１９８３）、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　２ｎｄＥｄｔ．，　Ｃｏｌｄ　ＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ（１９８９）ＰＣＲ　Ａ　Ｐｒａｃｔｉｃａｌ　Ａｐｐｒｏａｃｈ　ＩＲＬ　Ｐｒｅｓｓ　ｐｐ．２００（１９９１））等を用いて適宜置換、欠失、挿入及び／または付加変異を導入することによりＤＮＡホモログを得ることが可能である。
【００３０】
またＤＮＡホモログには、配列番号２または４で表される塩基配列またはその相補配列とストリンジェントな条件でハイブリダイズし、上記活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡも含まれる。
本明細書において「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡ」とは、ＤＮＡをプローブとして使用し、コロニーハイブリダイゼーション法、プラークハイブリダイゼーション法、あるいはサザンブロットハイブリダイゼーション法等を用いることにより得られるＤＮＡの塩基配列を意味し、例えば、コロニーあるいはプラーク由来のＤＮＡまたは該ＤＮＡの断片を固定化したフィルターを用いて、０．７〜１．０ＭのＮａＣｌ存在下６５℃でハイブリダイゼーションを行った後、０．１〜２×ＳＳＣ溶液（１×ＳＳＣの組成は、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、１５ｍＭクエン酸ナトリウム）を用い、６５℃条件下でフィルターを洗浄することにより同定できるＤＮＡ等を挙げることができる。
【００３１】
ハイブリダイゼーションは、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ、３ｒｄ　Ｅｄ．（ｅｄ．　ＳａｍｂｒｏｏｋＪ．　ａｎｄ　Ｒｕｓｓｓｅｌ　Ｄ．Ｗ．）、Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ、Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ、　２００１、以後　「モルキュラークローニング第３版」　と略称することがある。）等に記載されている方法に準じて行うことができる。
【００３２】
本発明のタンパク質をコードするＤＮＡは、例えば、以下のような方法によって取得することができる。先ず、（Ｒ）−ピペラジン−２−カルボキサミドのアミド結合加水分解活性を有する微生物、またはＰｒｏｔｅｉｎ　Ｄａｔａ　Ｂａｎｋ（ＰＤＢ）などのアミノ酸配列データベースを対象としてＢＬＡＳＴプログラムを用いてアミノ酸配のホモロジー検索により配列番号２、４、またはそれらのホモログを有することが判明した微生物から調製してきた染色体ＤＮＡを用いて、常法によりプラスミドライブラリー又はファージライブラリーを作製する。次に、該タンパク質の部分アミノ酸配列の情報を用いて、該タンパク質をコードするＤＮＡの部分断片を取得し、常法によりＤＮＡプローブを作製する。このＤＮＡプローブで上述染色体ＤＮＡライブラリーから本発明のタンパク質をコードするＤＮＡを特定し、適当なＤＮＡをサブクローニングすることにより該タンパク質をコードするＤＮＡを取得できる。
【００３３】
より具体的には、以下の方法により本発明に係るＤＮＡを取得できる。
１．シュードモナス　エスピー　ＭＣＩ３４３４株より得られた精製（Ｒ）−体選択的アミダーゼのＮ末端、及び内部アミノ酸配列の情報を基に、シュードモナス　エスピー　ＭＣＩ３４３４株の染色体ＤＮＡを鋳型としてｄｅｇｅｎｅｒａｔｅ　ＰＣＲ（ポリメラーゼチェインリアクションの略）を行い（Ｋｎｏｔｈ，Ｋ．ら、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．、（１９８８）、１６：１０９３２、及びＬｅｅ，Ｃ．Ｃ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、（１９８８）、２３９：１２８８−１２９１）、求める（Ｒ）−体選択的アミダーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡの部分断片を得る。これを放射性同位元素を含む核酸により標識し、ＤＮＡプローブを作製する。
２．シュードモナス　エスピー　ＭＣＩ３４３４株から染色体ＤＮＡを抽出し、適当な制限酵素（例えばＦｂａＩなど）で部分分解する。
３．上記２で得られたＤＮＡ断片と、１で作製したＤＮＡプローブを用い、サザンハイブリダイゼーションを行う。
４．上記３で特定されたＤＮＡを抽出精製し、適当なプラスミドベクターに結合し、大腸菌を形質転換する。
５．上記１で作製したＤＮＡプローブを用いてコロニーハイブリダイゼーションを行い、目的のＤＮＡ配列を含むクローンのプラスミドを取得する。
６．上記５で得られたプラスミドを用いて、ベクターに組み込まれたシュードモナス　エスピー　ＭＣＩ３４３４株由来のＤＮＡの塩基配列を決定する。
７．決定されたＤＮＡ塩基配列中に立体選択的アミダーゼのアミノ酸配列の読み取り枠を見いだし、上記工程で得られたＤＮＡ断片中に、アミダーゼの全コード領域が存在することを確認する。
【００３４】
上記工程中でＤＮＡ、及び組み換え体宿主としてのＥ．ｃｏｌｉの取り扱いに必要な一般的な操作は、当業者間で行われているものであり、例えばモルキュラークローニング第３版に従えば容易に実施できる。使用する酵素、試薬類も全て市販の製品を用いることができ、特に断らない限り製品で指定されている使用条件に従えば完全にそれらの目的を達成することができる。特に、上記１．において菌株からの染色体ＤＮＡ抽出は、例えばＳａｉｔｏら［Ｂｉｏｃｈｉｍ．　Ｂｉｏｐｈｙｓ．　Ａｃｔａ，７２，６１９−６２９（１９６３）］の方法に準じて行うことができる。また、ＤＮＡの標識化は従来から汎用されている放射性同位元素あるいはジゴキシゲニン、ビオチン、フルオレセイン等の非放射性化合物のいずれも使用可能であり、Ｒｅｄｉｐｒｉｍｅ^ＴＭＩＩ　ｒａｎｄｏｍ　ｐｒｉｍｅ　ｌａｂｅｌｌｉｎｇ　ｓｙｓｔｅｍ（アマシャムファルマシアバイオテク（株））やＡｌｋＰｈｏｓ^ＴＭ　Ｄｉｒｅｃｔ　Ｌａｂｅｌｌｉｎｇ　ａｎｄ　Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　Ｓｙｓｔｅｍ（アマシャムファルマシアバイオテク（株））等を用いれば容易に実施できる。
【００３５】
上記４．におけるベクターとしては、例えばｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＳＫ（−）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）等を使用することができる。
上記６．におけるＤＮＡ塩基配列の決定もモルキュラークローニング第３版等に記された公知の方法を用いることができる。例えば、Ｌｉ−ｃｏｒ　ＤＮＡ　Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ　ｍｏｄｅｌ　４０００Ｌ等の機器を付属のマニュアルインストラクションに従って使用すれば容易に実施できる。
【００３６】
さらに、配列番号２または４に表される塩基配列を有するＤＮＡ又はそのＤＮＡホモログと、それらのうちいずれかと相同性の高い塩基配列を有するＤＮＡをｉｎ　ｖｉｖｏまたはｉｎ　ｖｉｔｒｏでランダムに組み換えることのにより、アミダーゼ活性を有する新しい塩基配列のＤＮＡを取得することができる。この場合、「相同性が高い」とは核酸レベルのアイデンティティーが５０％以上ある塩基配列を示す。ｉｎ　ｖｉｖｏにおけるＤＮＡのランダムな組み換えについては、Ｃｈｅｒｒｙ　Ｊ．Ｒ．ら〔Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、１７、３３３−３３４（１９９９）〕の方法、ｉｎ　ｖｉｔｒｏにおけるＤＮＡのランダムな組み換えについては、Ｓｔｅｍｍｅｒ　Ｗ．Ｐ．Ｃ．〔Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９１、１０７４７−１０７５１（１９９４）〕の方法、またはＺｈａｏ　Ｈ．ら〔Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、１６、２５８−２６１（１９９８）〕の方法に従えば実施可能である。特に、ＣｒａｍｅｒｉＡ．ら〔Ｎａｔｕｒｅ、３９１、２８８−２９１（１９９８）〕の方法に従えば、お互いに相同性の高い、加水分解酵素をコードするＤＮＡを数種用いてｉｎｖｉｔｒｏで組み換えを行い、比活性や立体選択性が向上した立体特異的アミダーゼをコードするＤＮＡを取得することが可能である。
【００３７】
（３）本発明のベクター及び形質転換体
上記（２）で取得された本発明のタンパク質をコードするＤＮＡを公知の発現ベクターに挿入することにより、立体選択的アミダーゼ発現ベクターが提供される。また、この発現ベクターで生物細胞を形質転換することにより形質転換体（組み換え体）を得ることができ、得られた形質転換体を培養することにより、立体選択的アミダーゼを取得することができる。
【００３８】
本発明の立体選択的アミダーゼを発現させるための形質転換の対象となる宿主細胞としては、宿主自体が本酵素反応に悪影響を与えない限り特に限定されることはなく、宿主ベクター系が確立されている細菌、放線菌、酵母、カビなどの微生物、及び昆虫細胞、植物細胞、動物細胞が好適に利用できる。具体的には以下に示すような微生物、及び高等生物細胞を挙げることができる。
【００３９】
エシェリヒア属、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属、ブレビバクテリウム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、ロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）属、ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）属、サッカロマイセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、シゾサッカロマイセス（Ｓｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、ピキア（Ｐｉｃｈｉａ）属、キャンディダ（Ｃａｎｄｉｄａ）属、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属、蚕、菜種、大豆など。
【００４０】
上記で宿主細胞として好ましくは、エシェリヒア属、バチルス属、シュードモナス属、ブレビバクテリウム属、コリネバクテリウム属、及びロドコッカス属微生物であり、特に好ましくは、エシェリヒア属、シュードモナス属、ブレビバクテリウム属及びコリネバクテリウム属微生物である。
本発明のタンパク質をｉｎ　ｖｉｖｏで製造するには、宿主生物中において安定に存在するベクター中に本発明のＤＮＡを導入するか、もしくは、直接宿主ゲノム中に相同組み換え等の手法により本発明のＤＮＡを導入して組み換えＤＮＡ分子を作成し、その遺伝情報を転写・翻訳させる必要がある。
【００４１】
このとき、プロモーター及びリボゾーム結合部位（ＲＢＳ）を本発明のＤＮＡ鎖の５’側上流に、より好ましくは転写終結因子を３’側下流にそれぞれ組み込む必要がある。このプロモーター、ＲＢＳ及び転写終結因子としては、宿主として利用する細胞中において機能することが知られているプロモーター、ＲＢＳ及び転写終結因子であれば特に限定されず、これら各種生物において利用可能なベクター、プロモーター、ＲＢＳ、及び転写終結因子に関しては、例えばモルキュラークローニング第３版や「微生物学基礎講座８遺伝子工学・共立出版」などに詳述されている。
【００４２】
具体的には、例えばエシェリヒア属、特にＥ．ｃｏｌｉについては、べクターとしてｐＢＲ、ｐＵＣ系プラスミドが挙げられ、ｌａｃ（β−ガラクトシダーゼ）、ｔｒｐ（トリプトファンオペロン）、ｔａｃ、　ｔｒｃ、ｌｐｐ、λファージ　ＰＬ、ＰＲなどに由来するプロモーターなどが挙げられる。また、転写終結因子としては、ｔｒｐＡ由来、ファージ由来、リボゾーマルＲＮＡ由来、及びｌｐｐ由来などが挙げられる。このようにＥ．ｃｏｌｉをタンパク質合成系として用いる場合には、目的タンパク質は本願ＤＮＡを含むベクターの組み換え体Ｅ．ｃｏｌｉの生育に伴い構成的に、あるいはイソプロピルチオ−β−Ｄ−ガラクトシド（以下ＩＰＴＧ）などのタンパク質合成誘導剤の添加により誘導的に製造される。
【００４３】
上記記載の方法によりｉｎ　ｖｉｖｏで立体選択的アミダーゼを製造できるほか、Ｅ．ｃｏｌｉや小麦胚芽の無細胞蛋白質合成系を用いてｉｎ　ｖｉｔｒｏでも該アミダーゼを製造することができる。例えば、Ｅ．ｃｏｌｉではＫｉｇａｗａら［ＦＥＢＳ　Ｌｅｔｔｅｒｓ、４４２、１５−１９（１９９９）］、小麦胚芽を用いた該合成系についてはＭａｄｉｎら［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９７、５５９−５６４（２０００）］の方法に準じて行うことができる。
【００４４】
（４）本発明のアミダーゼを用いた光学活性なカルボン酸及び／またはアミド類の製造
また、本発明は、本発明のタンパク質又は上記で得られる形質転換体を下記一般式（Ｉ）
【００４５】
【化１０】

【００４６】
（式中、Ａは、置換されていてもよい主鎖原子数２〜５の炭化水素鎖を示し、該炭化水素鎖には二重結合が含まれていてもよいし、窒素原子または窒素原子以外のヘテロ原子が一個含まれていてもよい。Ｒ及びＲ’は、それぞれ独立に、水素原子、置換されていてもよいアルキル基又は置換されていても良いアリール基を示す。ｎは０または１を示す。）で表されるカルボン酸アミド類に作用させることにより、（Ｒ）−体のアミド結合を選択的に加水分解させた後、下記一般式（ＩＩ）
【００４７】
【化１１】

【００４８】
（式中、Ａ、Ｒ’及びｎは前記と同義である。）で表される（Ｒ）−体のカルボン酸類または／及び下記一般式（ＩＩＩ）
【００４９】
【化１２】

【００５０】
（式中、Ａ、Ｒ、Ｒ’及びｎは前記と同義である。）で表される（Ｓ）−体のカルボン酸アミド類を単離することを特徴とする光学活性なカルボン酸類及び／またはアミド類を製造する方法である。
上記一般式（Ｉ）中、Ａは、置換されていてもよい主鎖原子数２〜５の炭化水素鎖を示し、該炭化水素鎖には二重結合が含まれていてもよいし、窒素原子または窒素原子以外のヘテロ原子が一個含まれていてもよい。すなわちＡは、それが結合している窒素原子及び炭素原子と一体となって含窒素複素環基を形成する基であり、形成される含窒素複素環基には、窒素原子以外のヘテロ原子が含まれていても良い。ここで、炭化水素鎖Ａ置換基としては、例えばハロゲン原子、アルキル基、アリール基、水酸基、アミノ基、ニトロ基、カルボキシル基、アルコキシ基等が挙げられる。
【００５１】
上記含窒素複素環基として好ましくは５〜７員の含窒素複素環であり、より好ましくは窒素原子を１又は２個含有し、それ以外のヘテロ原子を含有しない含窒素複素環基が挙げられる。上記含窒素複素環基の好ましい具体例としては、ピペリジル基、ピペラジル基、ピラジル基、ピロリジル基が挙げられる。
また、上記含窒素複素環基は反応を阻害しない限りにおいて置換基を有していても良く、上記置換基の具体例としては、置換基Ｒ’及びＡの置換基と同様の原子または基、すなわちハロゲン原子、置換されていてもよいアルキル基、置換されていてもよいアリール基、水酸基、アミノ基、ニトロ基、カルボキシル基、アルコキシ基等が挙げられ、このうち好ましくは、炭素数１〜４のアルキル基が挙げられる。
【００５２】
上記一般式（Ｉ）中の置換基ＲおよびＲ’としては、水素原子、置換されていても良いアルキル基又は置換されていても良いアリール基を示す。
上記アルキル基は、直鎖、分岐鎖或いは環状のアルキル基が挙げられ、このうち好ましくは炭素数１〜６のものであり、上記アリール基としてはフェニル基又はナフチル基が挙げられる。
【００５３】
上記アルキル基又はアリール基の置換基としては、上記Ａの炭化水素鎖の置換基として記載したのと同様の基が挙げられる。
上記置換されていても良いアルキル基又はアリール基として好ましい具体例としては、メチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、ブチル基、イソブチル基、ｔ−ブチル基、シクロヘキシル基、ベンジル基、トリフルオロメチル基、１−ヒドロキシカルボニルエチル基、フェニル基、トリル基等が挙げられる。
【００５４】
上記置換基Ｒとして、好ましくは、水素原子又は炭素数１〜４のアルキル基又は置換基を有するフェニル基であり、より好ましくは水素原子又は炭素数１〜４のアルキル基及びｐ−ニトロフェニル基である。
この製造方法においては、本発明のタンパク質を蓄積している組み換え体生物、組み換え体生物処理物、本発明のタンパク質が蓄積した無細胞蛋白質合成系反応液及び／又はその処理物が酵素触媒として反応系に添加される。具体的には、上記組み換え体生物を培養して得られた細胞そのまま、あるいはトルエン、界面活性剤などの有機化合物による処理、凍結乾燥処理、物理的破砕処理など公知の手法にて処理した処理物、上記無細胞蛋白質合成系の反応液、さらには上記組み換え体生物処理物、及び無細胞蛋白合成反応液から本発明の立体選択的アミダーゼ活性画分を粗精製画分、又は精製物として取り出して用いることも可能である。さらには、このようにして得られた組み換え体生物、組み換え体生物処理物、酵素画分等をポリアクリルアミドゲル、カラギーナンゲル等の担体に固定化したもの等を用いることも可能である。以下、「高濃度酵素調製物」という用語を、上記組み換え体生物、、無細胞蛋白質合成系反応物、それらの処理物、酵素画分、及び固定化物の全ての概念を包含する言葉として用いる。
【００５５】
本反応において、反応原料であるラセミ体のカルボン酸アミド類は、基質濃度が高すぎると酵素が基質阻害を受ける可能性もあるため、通常、０．１ｍＭ〜１Ｍの濃度で、より好ましくは１０〜５００ｍＭの濃度で反応液に添加する。これらは、反応開始時に一括して添加しても良いが、生成物の蓄積濃度を向上させために連続的もしくは間欠的に添加することもできる。
【００５６】
本反応は、水性媒体中もしくは該水性媒体と有機溶媒との混合液中で行われ、上記、水性媒体としては、水、あるいは、リン酸カリウム水溶液、トリス−塩酸水溶液等の緩衝液が挙げられ、また、有機溶媒としては、エタノール、プロパノール等のアルコール類；アセトン等のケトン類；テトラヒドロフラン等のエーテル類；酢酸エチル、酢酸ブチル等のエステル類；トルエン等の芳香族炭化水素類；クロロホルム等のハロゲン化炭化水素類；ｎ−ヘキサン等脂肪族炭化水素類；ジメチルスルホキシド等の有機化合物が使用できる。
【００５７】
反応液のｐＨはアルカリ状態で反応が好適に進行するが、ｐＨ６．０〜９．５であることが好ましく、ｐＨ７．０〜９．５がより好ましい。この条件を満たすために、反応中、必要に応じて、希薄な酸またはアルカリ溶液を随時添加してｐＨを希望の範囲に維持することもできる。
反応温度は０〜５０℃で反応は進行するが、２５〜４５℃で維持することがより好ましい。反応液は必要に応じ攪拌混合される。
【００５８】
本発明のタンパク質は上記式（Ｉ）で表されるカルボン酸アミド類を立体選択的に加水分解する作用を有するので、反応液中に（Ｒ）−体のカルボン酸が生成し、（Ｓ）―体のアミド類が残存する。
上記反応で製造された（Ｒ）−体のカルボン酸及び／又は残存した（Ｓ）−体のアミド化合物（アミド類）は、溶媒抽出、クロマトグラフィー等、通常の分離・精製方法により単離することができる。
【００５９】
【実施例】
以下に実施例を挙げて本発明をさらに具体的に説明するが、本発明はこれに限定されるものではなく、その要旨を越えない限り本発明の技術分野における通常の変更をすることができる。
実施例１：シュードモナス　エスピー　ＭＣＩ３４３４株由来立体選択的アミダーゼの精製
シュードモナス　エスピー（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｓｐ．）　ＭＣＩ３４３４株を表１に示す培地２５．０リットルに接種し、２５℃で８時間培養し、遠心分離により菌体を取得した。
【００６０】
【表１】

【００６１】
得られた菌体を超音波破砕し、遠心分離により無細胞抽出液を調製した。これを１０ｍＭ　リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）で平衡化したＤＥＡＥ−Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ樹脂に吸着させイオン交換クロマトグラフィーを行い、その１００ｍＭの塩化ナトリウムを含む溶出画分の立体アミダーゼ活性を有する画分を順次硫酸アンモニウムを用いたＢｕｔｙｌ−Ｔｏｙｏｐｅａｒｌカラム、再度ＤＥＡＥ−Ｔｏｙｏｐｅａｒｌカラム、Ｇｉｇａｐｉｔｅカラム、及びＦＰＬＣ　Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００を用いてカラムクロマトグラフィーを行い、本タンパク質を単離した。該タンパク質の分子量を決定するべく、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、及びＴＳＫｇｅｌ　Ｇ３０００ＳＷ（東ソー（株））によるサイズ排除クロマトグラフィーにより測定したところ、それぞれ２９０００（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）、及び３６０００（サイズ排除クロマトグラフィー）であり、サブユニット構成はモノマーであると推定された。
【００６２】
実施例２：シュードモナス　エスピー　ＭＣＩ３４３４株由来立体選択的アミダーゼのＮ−末端アミノ酸配列の決定
実施例１で得られた精製立体特異的アミダーゼのＮ−末端アミノ酸配列を、自動エドマン分解アミノ酸シークエンサー　Ｐｒｏｓｅｑｕｅｎｃｅｒ　６６２５（ミリポア）を用いて分析した。上記により決定されたＮ−末端アミノ酸配列を、配列番号５に示す。
【００６３】
実施例３：シュードモナス　エスピー　ＭＣＩ３４３４株由来立体選択的アミダーゼをコードするＤＮＡの部分断片の取得
シュードモナス　エスピー　ＭＣＩ３４３４株をＴＧＹ培地（表２）１００ｍＬに接種し、３０℃で１２時間培養した。
【００６４】
【表２】

【００６５】
遠心分離により微生物菌体を取得し、フェノールクロロホルム法を用いて該微生物の染色体ＤＮＡを取得した。実施例２で判明した配列番号５のアミノ酸配列と配列相同性の高いアミノ酸配列を含むタンパク質をＢＬＡＳＴプログラムにより検索すると、細菌に由来する数種の加水分解酵素のアミノ酸配列がもっとも高い相同性（３０〜６０％程度）を示した。そこで、上記の高い相同性を示したシュードモナス　エルギノーサ　ＰＡＯ１株の機能未知蛋白質ＰＡ３５９８、ストレプトマイセス　コエリコロール　Ａ３（２）株の機能未知加水分解酵素ＳＣＬ６．１２ｃ（Ｒｅｄｅｎｂａｃｈ，Ｍら〔Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、（１９９６）、２１（１）：７７−９６）〕及びシュードモナス　フロレッセンス　のＰＱＱＦ　５’領域のＨｙｐｏｔｈｅｔｉｃａｌ　ｐｒｏｔｅｉｎ（Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ，Ｕ．ら〔Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、（１９９５）、６１（１１）：３８５６−３８６４〕）のアミノ酸配列をアラインメントしたところ共通に存在するアミノ酸配列を２ヶ所選択した（配列番号６：ＹＲＫＴＨＬ、配列番号７：ＤＩＥＦＰＥ）。これらの配列を基に、配列番号８及び９（３４３４ＨＡ５、及び３４３４ＨＡ７）に示すＰＣＲプライマーを設計し、耐熱型ＤＮＡポリメラーゼ存在下これらのプライマーを添加し、上記ＭＣＩ３４３４株染色体ＤＮＡを鋳型としてＰＣＲ反応を行った。本ＰＣＲ反応の産物をアガロースゲル電気泳動したところ、１２０ｂｐのＤＮＡが特異的に増幅されていたので、これをアガロース電気泳動ゲルから抽出精製した。そのＤＮＡの一部をｐＴ７Ｂｌｕｅ　Ｔ−Ｖｅｃｔｏｒ（Ｎｏｖａｇｅｎ社）にクローニングしてＬｉ−ｃｏｒ　ＤＮＡ　Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ　ｍｏｄｅｌ　４０００Ｌを用いて（操作方法は付属のマニュアルインストラクションに従った）塩基配列を決定した（配列番号１０）。得られた塩基配列を解析した結果、ＰＣＲにより増幅された断片はシュードモナス　エスピー　ＭＣＩ３４３４株由来立体選択的アミダーゼをコードするＤＮＡの部分断片であることが明らかになった。上記Ｄｅｇｅｎｅｒａｔｅ　ＰＣＲにより増幅した１２０ｂｐの精製ＤＮＡの残りをＲｅｄｉｐｒｉｍｅ^ＴＭＩＩ　ｒａｎｄｏｍ　ｐｒｉｍｅ　ｌａｂｅｌｌｉｎｇ　ｓｙｓｔｅｍ（アマシャムファルマシアバイオテク（株））により標識し、ＤＮＡプローブを得た。
【００６６】
実施例４：シュードモナス　エスピー　ＭＣＩ３４３４株由来立体選択的アミダーゼ遺伝子の単離とその塩基配列の決定
実施例３に記載の方法によりシュードモナス　エスピー　ＭＣＩ３４３４株から染色体ＤＮＡを抽出した。本ＤＮＡをＰｓｔＩ、ＥｃｏＲＶ、またはＦｂａＩで消化した後、実施例３で作製したＤＮＡプローブを用いてサザンハイブリダイゼーションを行った。手法はモルキュラークローニング第３版に従い、ハイブリダイゼーションは４０％ホルムアミド、２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳを含む緩衝液中、４２℃で行った。その結果、それぞれ約２．１ｋｂｐ、約５．５ｋｂｐ、約５．３　ｋｂｐのＤＮＡバンドが検出された。これらのＤＮＡをアガロースゲルから抽出精製し、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＳＫ（−）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）のそれぞれＰｓｔＩ、ＨｉｎｃＩＩまたはＢａｍＨＩ部位に挿入し、塩化カルシウムを用いた形質転換方法によりＥ．ｃｏｌｉ　ＪＭ１０９株に導入した。
【００６７】
得られたＥ．ｃｏｌｉ　ＪＭ１０９の形質転換株を８０μｇ／ｍＬアンピシリンを含むＬＢ寒天培地（１Ｌの水溶液中にＢａｃｔｏ　Ｔｒｙｐｔｏｎ　１０．０ｇ、Ｂａｃｔｏ　Ｙｅａｓｔ　Ｅｘｔｒａｃｔ　５．０ｇ、塩化ナトリウム　１０．０ｇ、寒天１５．０ｇを含む）に塗布し、３７℃で一晩培養した。生じたコロニーをニトロセルロース膜Ｈｙｂｏｎｄ^ＴＭ　ＥＣＬ^ＴＭ（アマシャムファルマシアバイオテク（株））にリフティングし、実施例３で取得したＤＮＡプローブを用い、４０％ホルムアミド、２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳを含む緩衝液中、４２℃でハイブリダイゼーションを行った。ハイブリダイゼーションの結果、それぞれの陽性のクローンからプラスミド（ｐＲＴＢ１−ＰｓｔＩ、ｐＲＴＢ１−ＥｃｏＲＶ、ｐＲＴＢ１−ＦｂａＩ）を取得し、Ｌｉ−ｃｏｒ　ＤＮＡ　Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ　ｍｏｄｅｌ　４０００Ｌを用いて、塩基配列を決定した。各配列のオーバーラップする部分をもとにしてつなげたＦｂａＩ−ＰｓｔＩのＤＮＡ断片６６６８ｂｐの配列を配列番号１１に示す。この６６６８ｂｐのＤＮＡ配列と配列番号１０の相同性、及び６６６８ｂｐのＤＮＡをアミノ酸に翻訳した場合の配列と配列番号５に記載してある精製立体特異的アミダーゼのＮ末端アミノ酸配列の相同性より、配列番号２のＤＮＡ配列が本立体特異的アミダーゼをコードするＤＮＡであることが確認された。配列番号１にＤＮＡ配列より予測されるシュードモナス　エスピー　ＭＣＩ３４３４株由来立体選択的アミダーゼのアミノ酸配列を記載する。
【００６８】
実施例５：シュードモナス　エスピー　ＭＣＩ３４３４株由来立体選択的アミダーゼのアミノ酸配列に相同性をもつタンパク質の検索
配列番号１記載のアミノ酸配列（２７４残基）を用いて、Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｃｅｎｔｅｒ　ｆｏｒ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（以下、ＮＣＢＩ）のＢＬＡＳＴプログラム（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ．／ＢＬＡＳＴ／）により相同性の高い蛋白質を検索した。最もアミノ酸アイデンティティーの高いタンパク質は、シュードモナス　エルギノーサ（ＰＡＯ１株）のＣｏｎｓｅｒｖｅｄ　ｈｙｐｏｔｈｅｔｉｃａｌｐｒｏｔｅｉｎ　ＰＡ３５９８であった（アミノ酸アイデンティティー：６５％）。次にアミノ酸アイデンティティーの高いタンパク質は、シノリゾビウム　メリロティ（１０２１株）のＣｏｎｓｅｒｖｅｄ　ｈｙｐｏｔｈｅｔｉｃａｌ　ｐｒｏｔｅｉｎ（ＮＣＢＩ登録番号：ＣＡＣ４７０７５）であったが、そのアミノ酸アイデンティティーは３６％であった。
【００６９】
実施例６：シュードモナス　エスピー　ＭＣＩ３４３４株由来立体選択的アミダーゼのＥ．ｃｏｌｉでの発現
ｐＲＴＢ１−ＥｃｏＲを鋳型として、プライマーＲＴＢ−ＦとＲＴＢ−Ｒ（配列番号１２及び１３）を用いてＰＣＲを行った。得られたＰＣＲ反応生成物を精製し、制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩ及びＸｂａＩで消化し、同様の酵素で消化したｐＵＣ１９（宝バイオ社製）に連結してｐＲＴＢ１ＥＸを作製後、Ｅ．ｃｏｌｉ　ＪＭ１０９に塩化カルシウム法で形質転換した。８０μｇ／ｍＬアンピシリンを含むＬＢ寒天培地に形質転換株を塗布し、生育したクローンを取得して、Ｅ．ｃｏｌｉ　ＪＭ１０９（ｐＲＴＢ１ＥＸ）を得た。
【００７０】
実施例７：Ｅ．ｃｏｌｉ　ＪＭ１０９（ｐＲＴＢ１ＥＸ）からの立体選択的アミダーゼ活性を有するタンパク質の精製
Ｅ．ｃｏｌｉ　ＪＭ１０９（ｐＲＴＢ１ＥＸ）を８０μｇ／ｍＬアンピシリンを含むＬＢ培地２．５Ｌで培養後、遠心分離により約１０．０ｇの菌体を得た。これを０．１ｍＭ　ジチオスレイトール、０．１ｍＭ　ＥＤＴＡ、及び５．０ｍＭ　２−メルカプトエタノールを含む１００ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）に懸濁し、超音波破砕及び遠心分離により無細胞抽出液を得た。これに硫酸アンモニウムを添加し、０〜４０％硫酸アンモニウム飽和画分を得た。さらにこれを０．１ｍＭ　ジチオスレイトール、０．１ｍＭ　ＥＤＴＡ、及び５．０ｍＭ　２−メルカプトエタノールを含む１０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）（緩衝液Ａ）に溶解・透析後、同緩衝液で平衡化したＤＥＡＥ−Ｔｏｙｏｐｅａｒｌカラムに吸着させ、１００ｍＭ塩化ナトリウムを含む緩衝液Ａで溶出した。目的の立体アミダーゼ活性を有する画分を集め、緩衝液Ａで透析した。これをＦＰＬＣ（アマシャムファルマシアバイオテク社製）のＭｏｎｏＱ　ＨＲ１０／１０カラムに供し、０〜５００ｍＭの塩化ナトリウムを含む緩衝液Ａの直線濃度勾配法で溶出した。溶出後、活性を含む画分を選択し、脱塩・濃縮し精製標品とした。
【００７１】
実施例８：シュードモナス　エスピー　ＭＣＩ３４３４株由来立体選択的アミダーゼの酵素学的性質
基質としてＮ−ｔｅｒｔ−ブチルピペラジン−２−カルボキサミドを用いて、実施例７で取得した精製酵素のアミド加水分解反応の至適ｐＨ、及び至適温度、また本酵素の温度耐性や１ｍＭ阻害剤の影響を、加水分解反応により生じるピペラジン−２−カルボン酸をＨＰＬＣで定量することにより行った。反応は３０℃で２０分行い、反応はエタノールの添加により停止し、ＨＰＬＣのサンプルとした。なお、温度耐性を測定するための熱処理は、各温度において５分のインキュベーションを行い、３０℃に調温後その活性を測定した。また阻害剤については、酵素を１ｍＭ阻害剤存在下で３０℃、５分間インキュベートした後、Ｎ−ｔｅｒｔ−ブチルピペラジン−２−カルボキサミドを添加し３０℃で２０分間インキュベーションした後、エタノールの添加により反応を停止して下記ＨＰＬＣ条件Ａを用いて生成したピペラジン−２−カルボン酸の定量をした。
【００７２】
ＨＰＬＣ条件Ａ
カラム：Ｓｕｍｉｃｈｉｒａｌ　ＯＡ−５０００
カラム温度：３０℃
溶離液：２ｍＭＣｕＳＯ_４　水溶液
流速：１．０ｍＬ／分
検出：ＵＶ２５４ｎｍ吸光度
その結果を以下の表３、表４にまとめた。
【００７３】
【表３】

【００７４】
【表４】

【００７５】
次に、シュードモナス　エスピー　ＭＣＩ３４３４株由来立体選択的アミダーゼの基質選択性を検討した。基質化合物は２０ｍＭの濃度で添加し、１００ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）中、３０℃で酵素反応し、分析は下記ＨＰＬＣ条件Ｂで行った。
ＨＰＬＣ条件Ｂ；
カラム：Ｓｍｉｃｈｉｒａｌ　ＯＡ−５０００、またはＯＡ−５０００Ｌ
カラム温度：３０℃
溶離液：２ｍＭ　ＣｕＳＯ_４水溶液
流速：１．０ｍＬ／分
検出：ＵＶ２５４ｎｍ吸光度
ピペラジン−２−カルボキサミドに対する活性を１００として、その相対活性を表５に示す。
【００７６】
【表５】

【００７７】
シュードモナス　エスピー　ＭＣＩ３４３４株由来立体選択的アミダーゼ活性は、ピペラジン−２−カルボキサミド、ピペリジン−３−カルボキサミド、及びβ−アラニンアミドに特に強い活性を示し、Ｄ−グルタミンアミドやピペリジン−４−カルボキサミドに弱い活性を示した。また、Ｎ−アルキルアミド化合物に対しても有意な活性を示したが、その他のＬ−あるいはＤ−アミノ酸アミド、ペプチド、脂肪族アミド、芳香族アミド、ニトリルは加水分解されなかった。
【００７８】
実施例９：シュードモナス　エスピー　ＭＣＩ３４３４株由来立体選択的アミダーゼの立体選択性の検討
Ｅ．ｃｏｌｉ　ＪＭ１０９（ｐＲＴＢ１ＥＸ）を８０μｇ／ｍＬのアンピシリン及び０．５ｍＭＩＰＴＧを含むＬＢ培地で培養し、菌体を遠心分離により得た。これの湿菌体重量を測定し、２００ｍＭの（ＲＳ）−ピペラジン−２−カルボキサミドを含む１００ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）１．０ｍＬに０．４８％になるよう添加し３０℃で１．１時間反応後エタノールで反応を停止し、ＨＰＬＣ条件Ａにより生成したピペラジン−２−カルボン酸の光学純度を測定した。（Ｒ）−ピペラジン−２−カルボン酸の光学純度は９７．４％ｅ．ｅ．であり、Ｅ値は５９．０であった。
【００７９】
実施例１０：Ｅ．ｃｏｌｉ　ＪＭ１０９（ｐＲＴＢ１ＥＸ）を用いた（ＲＳ）−Ｎ−ｔｅｒｔ−ブチルピペラジン−２−カルボキサミドの加水分解反応
Ｅ．ｃｏｌｉ　ＪＭ１０９（ｐＲＴＢ１ＥＸ）を８０μｇ／ｍＬのアンピシリン及び０．５ｍＭＩＰＴＧを含むＬＢ培地で培養し、菌体を遠心分離により得た。これの湿菌体重量を測定し、２００ｍＭの（ＲＳ）−Ｎ−ｔｅｒｔ−ブチルピペラジン−２−カルボキサミドを含む１００ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）１．０ｍＬにそれぞれ０．４％、及び２．０％になるよう添加し３０℃でインキュベートした。一定時間ごとにサンプリングを行い、エタノールで反応を停止後、上記ＨＰＬＣ条件Ａにより生成したピペラジン−２−カルボン酸の定量及び光学純度の測定を行った（図１）。その結果、生成した（Ｒ）−ピペラジン−２−カルボン酸の光学純度はそれぞれ９９．７％及び９９．５％ｅ．ｅ．であった。
【００８０】
実施例１１：シュードモナス　エルギノーサ　ＰＡＯ１株の機能未知タンパク質ＰＡ３５９８をコードする遺伝子のクローニング
実施例５で配列番号１記載のアミノ酸配列と最も高いアミノ酸アイデンティティー（６５％）を有することが明らかになったシュードモナス　エルギノーサ　ＰＡＯ１株の機能未知タンパク質ＰＡ３５９８をコードするＤＮＡを取得するため、公知の（Ｓｔｏｖｅｒ、Ｃ．Ｋ．ら、〔Ｎａｔｕｒｅ、（２０００）、４０６（６７９９）：９５９−９６４〕）シュードモナス　エルギノーサ　ＰＡＯ１株　のゲノムＤＮＡ配列に基づき、プライマーＰＡＥ１とＰＡＥ２（配列番号１４及び１５）を設計した。これらのプライマーを用いてＡＴＣＣより購入したシュードモナス　エルギノーサ　ＰＡＯ１株のゲノムＤＮＡを鋳型ＤＮＡとしＰＣＲを行った。本ＰＣＲの産物をアガロースゲル電気泳動し、０．９６ｋｂｐのＤＮＡをアガロース電気泳動ゲルから抽出精製した。そのＤＮＡの一部をｐＴ７Ｂｌｕｅ
Ｔ−Ｖｅｃｔｏｒ（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）にクローニングしてプラスミドｐＴＰＡを取得し、Ｌｉ−ｃｏｒ　ＤＮＡ　Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ　ｍｏｄｅｌ　４０００Ｌを用いて（操作方法は付属のマニュアルインストラクションに従った）挿入断片の塩基配列を決定し（配列番号１６）、得られたＤＮＡ断片が配列番号３に記載のＰＡ３５９８をコードするＤＮＡであることを確認した。
【００８１】
実施例１２：シュードモナス　エルギノーサ　ＰＡＯ１株由来ＰＡ３５９８をコードする遺伝子のＥ．ｃｏｌｉでの発現
実施例１１において作製したＰＡ３５９８遺伝子を含むプラスミドｐＴＰＡを鋳型としてプライマーＰＡＥＸ１とＰＡＥＸ２（配列番号１７及び１８）を用いてＰＣＲを行った。得られたＰＣＲ反応生成物を精製し、制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩ及びＸｂａＩで消化し、同様の酵素で消化したｐＵＣ１９（宝酒造（株））に連結してプラスミドｐＡＥＸを作製後、Ｅ．ｃｏｌｉ　ＪＭ１０９に塩化カルシウム法で形質転換した。８０μｇ／ｍＬアンピシリンを含むＬＢ寒天培地に形質転換株を塗布し、生育したクローンを取得して、Ｅ．ｃｏｌｉ　ＪＭ１０９（ｐＡＥＸ）を得た。
【００８２】
実施例１３：Ｅ．ｃｏｌｉ　ＪＭ１０９（ｐＰＡＥＸ）から立体選択的アミダーゼ活性を有するタンパク質の精製
Ｅ．ｃｏｌｉ　ＪＭ１０９（ｐＰＡＥＸ）を８０μｇ／ｍＬアンピシリンを含むＬＢ培地２．５Ｌで培養後、遠心分離により約１０．０ｇの菌体を得た。これを０．１ｍＭ　ジチオスレイトール、０．１ｍＭ　ＥＤＴＡ、及び５．０ｍＭ　２−メルカプトエタノールを含む１００ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）に懸濁し、超音波破砕及び遠心分離により無細胞抽出液を得た。これに塩化ナトリウムを４　Ｍ濃度になるように加え、４Ｍ　ＮａＣｌ、　０．１ｍＭ　ジチオスレイトール、０．１ｍＭ　ＥＤＴＡ、及び５．０ｍＭ　２−メルカプトエタノールを含む１０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）で平衡化したブチルトヨパールカラムに通し、素通り画分を集めた。これを０．１ｍＭ　ジチオスレイトール、０．１ｍＭ　ＥＤＴＡ、及び５．０ｍＭ　２−メルカプトエタノールを含む１０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）（緩衝液Ａ）で透析後、同緩衝液で平衡化したＤＥＡＥ−Ｔｏｙｏｐｅａｒｌカラムに吸着させ、１５０ｍＭ塩化ナトリウムを含む緩衝液Ａで溶出した。目的の立体アミダーゼ活性を有する画分を集め、緩衝液Ａで透析した。これをＦＰＬＣ（アマシャムファルマシアバイオテク社製）のＳｕｐｅｒｄｅｘ２００　ＨＲ１０／３０カラムに供し、１５０ｍＭの塩化ナトリウムを含む緩衝液Ａで溶出した。溶出後、活性を含む画分を選択し、脱塩・濃縮し精製標品とした。
【００８３】
実施例１４：シュードモナス　エルギノーサ　ＰＡＯ１株由来立体選択的アミダーゼの酵素学的性質
基質として（ＲＳ）−ピペラジン−２−カルボキサミドを用いて、実施例１３で取得した精製酵素のアミド加水分解反応の至適ｐＨ、及び至適温度、また本酵素の温度耐性や１ｍＭ阻害剤の影響を、加水分解反応により生じるピペラジン−２−カルボン酸をＨＰＬＣで定量することにより行った。反応は３０℃で２０分行い、反応はエタノールの添加により停止し、ＨＰＬＣのサンプルとした。なお、温度耐性を測定するための熱処理は、各温度において５分のインキュベーションを行い、３０℃に調温後その活性を測定した。また阻害剤については、酵素を１ｍＭ阻害剤存在下で３０℃、５分間インキュベートした後、（ＲＳ）−ピペラジン−２−カルボキサミドを添加し３０℃で２０分間インキュベーションした後、エタノールの添加により反応を停止して下記ＨＰＬＣ条件Ａを用いて生成したピペラジン−２−カルボン酸の定量をした。
その結果を以下の表６、表７にまとめた。
【００８４】
【表６】

【００８５】
【表７】

【００８６】
実施例１５：シュードモナス　エルギノーサ　ＰＡＯ１株由来立体選択的アミダーゼの立体選択性の検討
Ｅ．ｃｏｌｉ　ＪＭ１０９（ｐＡＥＸ）を８０μｇ／ｍＬのアンピシリン及び０．５ｍＭ　ＩＰＴＧを含むＬＢ培地で培養し、菌体を遠心分離により得た。これの湿菌体重量を測定し、２００ｍＭの（ＲＳ）−ピペラジン−２−カルボキサミドを含む１００ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）１．０ｍＬに０．５２％になるよう添加し３０℃で１．１時間反応後エタノールで反応を停止し、ＨＰＬＣ条件Ａにより生成したピペラジン−２−カルボン酸の光学純度を測定した。（Ｒ）−ピペラジン−２−カルボン酸の光学純度は９４．４％ｅ．ｅ．であり、Ｅ値は３０．０であった。
【００８７】
【配列表】

【００８９】

【００９０】

【００９１】

【００９２】

【００９３】

【００９４】

【００９５】

【００９６】

【００９７】

【００９８】

【００９９】

【０１００】

【０１０１】

【０１０２】

【０１０３】

【０１０４】

【０１０５】

【図面の簡単な説明】
【図１】Ｅ．ｃｏｌｉ　ＪＭ１０９（ｐＲＴＢ１ＥＸ）による（Ｒ）−ピペラジン−２−カルボン酸の生成を示す図である。図中、○は（Ｓ）−ピペラジン−２−カルボン酸（０．４％湿菌体）、●は（Ｒ）−ピペラジン−２−カルボン酸（０．４％湿菌体）、□は（Ｓ）−ピペラジン−２−カルボン酸（２．０％湿菌体）、及び■は（Ｒ）−ピペラジン−２−カルボン酸（２．０％湿菌体）を示す。（○は□と重なっているため表示されていない。）[0001]
TECHNICAL FIELD OF THE INVENTION
The present invention relates to an amidase protein that stereoselectively hydrolyzes an amide bond, a DNA encoding the protein, a recombinant DNA molecule and a vector containing the DNA, a transformed host cell having the vector or the recombinant DNA molecule or vector, Also, the present invention relates to a method for producing a chiral carboxylic acid and / or a chiral carboxylic acid amide useful as an intermediate material for medical and agricultural chemicals by reacting the protein or the transformed host cell or a processed product thereof with a carboxylic acid amide.
[0002]
[Prior art]
Conventionally, a method for producing a (R) -carboxylic acid and / or (S) -carboxamide useful as a medical or agricultural chemical intermediate by hydrolyzing a racemic nitrogen-containing heterocyclic-containing carboxamide in a biotechnological manner has been proposed. Pseudomonas azotoformans strain IAM1603 or a processed product thereof (see Patent Document 1), or Pseudomonas sp. MCI3433 strain or Pseudomonas sp. (R) -piperazine-2-carboxylic acid and / or (S) -N-tert-butylpiperazine-2-carboxylic acid having high optical purity by acting on racemic N-tertbutylpiperazine-2-carboxamide How to get the bromide is known.
[0003]
However, for example, in the method described in Patent Document 1, the cells or a processed product thereof are used as a hydrolysis catalyst, but the content of the enzyme that catalyzes the target reaction is insufficient, and the enzyme itself is unstable. In order to catalyze the reaction, it is necessary to prepare a large amount of cells, and further, purification of the reaction product requires a large load, so that this method is not economically advantageous. In addition, for example, in the method described in Patent Document 2, the microbial cells or the processed product thereof have insufficient stereoselectivity, and thus the optical purity of the produced (R) -form carboxylic acid is insufficient. Although the (S) -form carboxamide gives a product with high optical purity, it is not an economically advantageous method because of its low yield.
[0004]
[Patent Document 1]
JP-A-10-276794
[Patent Document 2]
JP-A-10-327890
[0005]
[Problems to be solved by the invention]
An object of the present invention is to obtain a novel amidase having the ability to stereoselectively hydrolyze the (R) -form of a nitrogen-containing heterocyclic-containing carboxylic acid amide and a DNA encoding the same, and to use the amidase. To provide a method for producing (R) -nitrogen-containing heterocyclic carboxylic acid-containing carboxylic acids and / or (S) -nitrogen-containing heterocyclic-containing carboxamides having high optical purity.
[0006]
[Means for Solving the Problems]
The present inventors have conducted intensive studies in order to solve the above-mentioned problems, and as a result, it has been found that Pseudomonas sp. MCI3434 known to hydrolyze (R) -N-alkylpiperazine-2-carboxamide insufficiently and insufficiently. An enzyme capable of selectively hydrolyzing (R) -N-alkylpiperazine-2-carboxamide was isolated from the obtained DNA, and a DNA encoding the enzyme was obtained. It has been found that a stereoselective amidase-rich recombinant organism or a high-concentration amidase solution produced using this DNA promotes a higher productivity and higher stereoselective carboxylic acid amide hydrolysis reaction. . Furthermore, a protein having a high degree of identity (65%) with the amino acid sequence of the above amidase is isolated from Pseudomonas aeruginosa PAO1 strain, and a transformed host cell having the DNA is prepared. The inventors have found that the produced protein acts on a carboxamide containing a racemic nitrogen-containing complex and hydrolyzes its amide bond specifically in the (R) -isomer, thereby completing the present invention.
[0007]
That is, according to the present invention, a stereoselective amidase having the following physicochemical properties is provided.
(A) the apparent molecular weight measured by SDS-PAGE is about 29,000 to 31,000;
(B) the optimal pH of the amidase reaction when using (RS) -piperazine-2-carboxamide or (RS) -N-tertbutylpiperazine-2-carboxamide as a substrate is around pH 8;
(C) the optimal temperature of the amidase reaction when (RS) -piperazine-2-carboxamide or (RS) -N-tertbutylpiperazine-2-carboxamide is used as a substrate is 45 to 50 ° C;
(D) stable at a temperature of 45 ° C. or lower around pH 8.0;
(E) p-chloromercuric benzoic acid, Cu²⁺, Zn²⁺, Cd²⁺, Hg²⁺, Pb²⁺Completely inhibits activity; and
(F) The stereoselectivity of the amidase reaction when (RS) -piperazine-2-carboxamide is used as a substrate is (R) -isomer selectivity, and the E value is 30 to 60.
[0008]
According to another aspect of the present invention, there is provided a protein having any one of the following amino acid sequences.
(A) the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1;
(B) an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3, or an amino acid sequence wherein one or more amino acids are deleted, added, or substituted in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 or 3, wherein piperazine-2 -An amino acid sequence that acts on carboxamide and has an activity of (R) -selectively hydrolyzing the amide bond; or
(C) an amino acid sequence having at least 60% identity to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 or 3, which acts on piperazine-2-carboxamide to selectively hydrolyze its amide bond to the (R) -isomer An amino acid sequence having a decomposing activity.
[0009]
According to still another aspect of the present invention, there is provided a DNA having any one of the following nucleotide sequences.
(A) a nucleotide sequence encoding the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1;
(B) an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3, or an amino acid sequence wherein one or more amino acids are deleted, added, or substituted in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 or 3, wherein piperazine-2 -A nucleotide sequence encoding an amino acid sequence having the activity of acting on carboxamide and selectively hydrolyzing the amide bond in the (R) -form;
(C) an amino acid sequence having at least 60% identity to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 or 3, which acts on piperazine-2-carboxamide to selectively hydrolyze its amide bond to the (R) -isomer A nucleotide sequence encoding a protein having a degrading activity;
(D) the base sequence of SEQ ID NO: 2;
(E) a base sequence of SEQ ID NO: 4, or a base sequence of SEQ ID NO: 2 or 4, wherein one or more bases are deleted, added, or substituted, and -A nucleotide sequence encoding a protein that acts on carboxamide and has an (R) -selectively hydrolyzing amide bond; or
(F) a nucleotide sequence which hybridizes under stringent conditions to the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2 or 4 or a complementary sequence thereof, which acts on piperazine-2-carboxamide to form an amide bond thereof by (R)- A nucleotide sequence encoding a protein having an activity of body-selectively hydrolyzing.
[0010]
According to still another aspect of the present invention, there is provided a recombinant DNA molecule or vector containing the above-described DNA of the present invention.
According to still another aspect of the present invention, there is provided a transformed host cell having the above-described recombinant DNA molecule or vector of the present invention.
According to still another aspect of the present invention, the following general formula (I)
[0011]
Embedded image

[0012]
(In the formula, A represents an optionally substituted hydrocarbon chain having 2 to 5 main chain atoms, and the hydrocarbon chain may contain a double bond, and may be a nitrogen atom or a nitrogen atom. R and R ′ each independently represent a hydrogen atom, an optionally substituted alkyl group or an optionally substituted aryl group, and n is 0 or 1) is reacted with the above-mentioned amidase or protein of the present invention, or a transformed host cell or a processed product thereof to selectively form an (R) -form amide bond. After hydrolysis to the following general formula (II)
[0013]
Embedded image

[0014]
(Wherein, A, R ′ and n are as defined above) and / or a (R) -form carboxylic acid represented by the following general formula (III):
[0015]
Embedded image

[0016]
(Wherein, A, R, R ′ and n have the same meanings as described above), wherein an (S) -form carboxylic acid amide represented by the formula (I) is isolated: Alternatively, a method for producing an amide is provided.
According to still another aspect of the present invention, the above-described DNA or recombinant DNA molecule or vector of the present invention and one or more types of DNA having 50% or more homology with the DNA are randomly recombined to obtain a three-dimensional DNA. There is provided a method for preparing a DNA encoding a protein having a stereoselective amidase activity, wherein the method is selected using the selective amidase activity as an indicator.
[0017]
Hereinafter, the present invention will be described in detail.
[0018]
BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION
Hereinafter, embodiments and an implementation method of the present invention will be described in detail.
(1) Amidase and protein of the present invention
The present invention relates to a stereoselective amidase having the following physicochemical properties.
(A) the apparent molecular weight measured by SDS-PAGE is about 29,000 to 31,000;
(B) the optimal pH of the amidase reaction when using (RS) -piperazine-2-carboxamide or (RS) -N-tertbutylpiperazine-2-carboxamide as a substrate is around pH 8;
(C) the optimal temperature of the amidase reaction when (RS) -piperazine-2-carboxamide or (RS) -N-tertbutylpiperazine-2-carboxamide is used as a substrate is 45 to 50 ° C;
(D) stable at a temperature of 45 ° C. or lower around pH 8.0;
(E) p-chloromercuric benzoic acid, Cu²⁺, Zn²⁺, Cd²⁺, Hg²⁺, Pb²⁺Completely inhibits activity; and
(F) The stereoselectivity of the amidase reaction when (RS) -piperazine-2-carboxamide is used as a substrate is (R) -isomer selectivity, and the E value is 30 to 60.
[0019]
Examples of the amidase of the present invention include, for example, a protein represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 or 3, an homologue thereof, and an enzyme which hydrolyzes piperazine-2-carboxamide selectively in the (R) -configuration. It is a protein having an activity, or a protein containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 or 3 or a homologue thereof in the molecule.
[0020]
Here, the homologue of the protein of the present invention refers to a protein having a homology of 60% or more, preferably 70% or more, more preferably 90% or more with the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 or 3, and It refers to a protein that acts on 2-carboxamide and has the activity of selectively hydrolyzing the amide bond in the (R) -isomer. These homologs include a protein represented by an amino acid sequence in which one or more amino acids are deleted, added or substituted in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 or 3, and include a piperazine-2-carboxamide. Also included are proteins having an activity of acting to selectively hydrolyze the amide bond in the (R) -isomer.
[0021]
Incidentally, the homology search of the protein can be performed using, for example, a FASTA program or a BLAST program. A homology search of the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 1 was performed using the BLAST program on an amino acid sequence database such as Protein \ Data \ Bank (PDB). As a result, the amino acid sequence showed the highest amino acid identity among known proteins. Was conserved {hypothetical} protein @ PA3598 (65%) of the Pseudomonas aeruginosa PAO1 strain described in SEQ ID NO: 2 (Stover, CK et al., [Nature, (2000), 406 (6799): 959-964]). . Next, as a protein having a high homology, a conserved {hypothetical} protein of NC10 strain (NCBI accession number: CAC47075) was searched, and its amino acid identity was 36% (Galibert, F. et al. [Science, (2001); 293 (5530): 668-672]), indicating that there is no significant homology.
[0022]
In addition, “a protein containing an amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 or 3 or an amino acid sequence of a homolog thereof in the molecule” refers to a protein interaction, ligand binding function or another special function at the N-terminal or C-terminal of the protein. A fusion protein to which a protein having the same is bound.
As the fusion protein, for example, Gilbert @ H. J. [Mol. Microbiol. 4, 759-767, (1990)] and Shoseyov @ O. A protein of the present invention having an amino acid sequence having a cellulose binding function added to the N-terminus or C-terminus as reported in US Pat. No. 5,496,934, and a histidine hexamer having a nickel-binding function bound thereto. , Which gave specific binding ability to the protein, and KimG. J. [Biotechnol. Bioeng. , 68, 211-217, (2000)] and fusion of the protein of the present invention with a protein having another function.
[0023]
Since the amino acid sequence of the protein of the present invention has been clarified, a DNA probe prepared based on a base sequence encoding a part or all of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 or 3 is used as described later. Thus, it is possible to isolate a DNA encoding a protein having (R) -isomer-selective-piperazine-2-carboxamide hydrolyzing activity from any microorganism having (R) -piperazine-2-carboxamide hydrolyzing activity. it can. Alternatively, DNA encoding a protein having (R) -isomer-selective piperazine-2-carboxamide hydrolyzing activity can be synthesized using a DNA synthesizer. Further, using the obtained DNA, a large amount of the protein can be produced by a molecular genetic technique, and the protein can be isolated therefrom by an ordinary method. It can also be purified from a microorganism having the above DNA, for example, a cultured cell of Pseudomonas sp. MCI3434.
[0024]
Pseudomonas sp. MCI3434 strain and Pseudomonas sp. Aeruginosa PAO1 strain are both known microorganisms. It is registered as Pseudomonas aeruginosa ATCC 47085 in the collection (ATCC), and its genomic DNA is registered as ATCC 47085D, and is easily available.
[0025]
As a method for isolating the protein of the present invention from cultured cells of a microorganism, a general protein purification method can be applied. For example, the microorganism is grown sufficiently by culturing it in a general microbial nutrient medium, preferably a medium containing nutrient broth as a nitrogen source and malic acid as a carbon source, and then collected by centrifugation and sonicated. A cell-free extract is obtained by treatment or French press treatment. From the cell-free extract, the target protein can be isolated by utilizing the difference in the physicochemical properties of the protein by operations such as centrifugation, column chromatography, and electrophoresis. As a more recommended technique, a cell-free extract is prepared from the microorganism, and the protein of the present invention can be purified using ion exchange chromatography, hydrophobic chromatography, adsorption chromatography, size exclusion chromatography, or the like. Alternatively, as described below, a recombinant organism, preferably Escherichia coli (hereinafter, referred to as "Escherichia coli") in which the DNA of SEQ ID NO: 2 or 4 is incorporated with an appropriate expression promoter and a vector having the downstream of the ribosome binding sequence incorporated therein. E. coli is sometimes abbreviated as "E. coli".) From the cultured cells, a cell-free extract is prepared by sonication and centrifugation, and the protein of the present invention is purified using ammonium sulfate fractionation and ion exchange chromatography. It can also be isolated.
[0026]
The physical and enzymatic properties of the protein having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 isolated from Pseudomonas sp. MCI3434 are shown below.

2. Subunit composition: monomer
3. Optimum pH for amidase reaction: ΔpH 8.0
4. Optimal amidase reaction temperature: 45 ° C
5. Heat resistance: stable at 45 ° C. or less.
6. Compounds that completely inhibit the amidase activity of the present protein: p-chloromercuric benzoic acid, Mn²⁺, Co²⁺, Ni²⁺, Cu²⁺, Zn²⁺, Cd²⁺, Hg²⁺, Pb²⁺.
7. Substrate specificity: exhibits high amidase activity against β-alanine amide, D-glutamine amide, and (R) -form nitrogen-containing heterocyclic carboxylic acid amides. More preferred substrates include (R) -piperazine-2-carboxamide, piperidine-3-carboxamide, (R) -N-tert-butylpiperazine-2-carboxamide, and the like.
8. Stereoselectivity: E value is 59 when acted on racemic piperazine-2-carboxamide.
[0027]
The physical and enzymatic properties of the protein having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3 isolated from Pseudomonas aeruginosa PAO1 strain are shown below.

2. Subunit composition: homodimer
3. Optimum pH for amidase reaction: ΔpH 8.0
4. Optimal amidase reaction temperature: 50 ℃
5. Heat resistance: stable at 45 ° C. or less.
6. Compounds that completely inhibit the amidase activity of the protein: N-ethylmaleimide, p-chloromercurybenzoic acid, Cu²⁺, Zn²⁺, Ag⁺, Cd²⁺, Hg²⁺, Tl⁺, Pb²⁺.
7. Stereoselectivity: E value is 30 when acted on racemic piperazine-2-carboxamide.
[0028]
(2) DNA of the present invention
The DNA of the present invention is (1) a DNA encoding the amidase and the protein of the present invention. The DNA also includes a DNA encoding a homolog of the above protein (hereinafter, this may be abbreviated as “DNA homolog”).
Examples of the DNA encoding the above protein include those containing the base sequence represented by SEQ ID NO: 2 or 4.
The DNA homolog encoding the protein of the present invention is a DNA encoding a protein containing an amino acid sequence in which one or more amino acids are deleted, substituted, inserted and / or added to the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 or 3. including.
[0029]
Those skilled in the art will appreciate that a site-directed mutagenesis method (Nucleic Acids Res. 10, pp. 6487 (1982), Methodsin Enzymol. 100, pp. 448 (1983), Molecular Cloning @ 2nd Ed to the DNA of SEQ ID NO: 2 or , Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989) PCR A Practical Approach IRL Press pp. 200 (1991)) or the like, and a DNA homolog can be obtained by appropriately introducing a substitution, deletion, insertion and / or addition mutation. It is.
[0030]
The DNA homolog also includes a DNA that hybridizes with the base sequence represented by SEQ ID NO: 2 or 4 or its complementary sequence under stringent conditions and encodes a protein having the above activity.
As used herein, the term "DNA that hybridizes under stringent conditions" refers to a DNA obtained by using a DNA as a probe and using a colony hybridization method, a plaque hybridization method, a Southern blot hybridization method, or the like. Means, for example, using a filter having immobilized DNA derived from colonies or plaques or a fragment of the DNA, hybridization at 65 ° C. in the presence of 0.7 to 1.0 M NaCl, DNA etc. which can be identified by washing the filter at 65 ° C. using a 0.1 to 2 × SSC solution (1 × SSC has a composition of 150 mM sodium chloride and 15 mM sodium citrate) can be mentioned.
[0031]
Hybridization was performed according to Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd Ed. (Ed. @ Sambrook J. and Russell D.W.), Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 2001, hereinafter sometimes abbreviated as "Molecular Cloning Third Edition". ) Can be carried out according to the method described in the above.
[0032]
The DNA encoding the protein of the present invention can be obtained, for example, by the following method. First, amino acid sequence homology search was performed using a BLAST program for a microorganism having an amide bond hydrolysis activity of (R) -piperazine-2-carboxamide or an amino acid sequence database such as Protein @ Data @ Bank (PDB). A plasmid library or a phage library is prepared by a conventional method using chromosomal DNA prepared from a microorganism which has been found to have homologues thereof or homologs thereof. Next, using information on the partial amino acid sequence of the protein, a partial fragment of DNA encoding the protein is obtained, and a DNA probe is prepared by a conventional method. The DNA encoding the protein of the present invention is identified from the chromosomal DNA library using the DNA probe, and the DNA encoding the protein can be obtained by subcloning an appropriate DNA.
[0033]
More specifically, the DNA according to the present invention can be obtained by the following method.
1. Based on the N-terminal and internal amino acid sequence information of the purified (R) -isomer selective amidase obtained from Pseudomonas sp. MCI3434, degenerate PCR (abbreviation of polymerase chain reaction) using chromosomal DNA of Pseudomonas sp. MCI3434 as a template (Knoth, K. et al., Nucleic Acids Res., (1988), 16: 10932, and Lee, CC et al., Science, (1988), 239: 1288-1291) to obtain the (R) -isomer. A partial fragment of DNA encoding a protein having selective amidase activity is obtained. This is labeled with a nucleic acid containing a radioisotope to prepare a DNA probe.
2. Chromosomal DNA is extracted from Pseudomonas sp. MCI3434 and partially digested with an appropriate restriction enzyme (for example, FbaI).
3. Southern hybridization is performed using the DNA fragment obtained in the above item 2 and the DNA probe prepared in the above item 1.
4. The DNA specified in the above 3 is extracted and purified, ligated to an appropriate plasmid vector, and transformed into Escherichia coli.
5. Colony hybridization is performed using the DNA probe prepared in 1 above to obtain a plasmid of a clone containing the target DNA sequence.
6. Using the plasmid obtained in the above step 5, the nucleotide sequence of the DNA derived from Pseudomonas sp. MCI3434 integrated into the vector is determined.
7. An open reading frame for the amino acid sequence of the stereoselective amidase is found in the determined DNA base sequence, and it is confirmed that the entire coding region of the amidase is present in the DNA fragment obtained in the above step.
[0034]
In the above steps, DNA and E. coli as a recombinant host were used. General operations required for handling E. coli are performed by those skilled in the art, and can be easily performed according to, for example, Molecular Cloning, Third Edition. Commercially available products can also be used for all the enzymes and reagents to be used. Unless otherwise specified, these objects can be completely achieved according to the use conditions specified for the products. In particular, 1. Extraction of chromosomal DNA from strains is described, for example, in Saito et al. [Biochim. {Biophys. {Acta, 72, 619-629 (1963)]. For labeling of DNA, any conventionally used radioisotope or a non-radioactive compound such as digoxigenin, biotin, or fluorescein can be used.^TMII @ random @ prime @ labelling @ system (Amersham Pharmacia Biotech Co., Ltd.) and AlkPhos^TMIt can be easily implemented by using, for example, Direct Labeling and Detection System (Amersham Pharmacia Biotech Co., Ltd.).
[0035]
4 above. For example, pBluescriptSK (-) (Stratagene) or the like can be used as a vector in the above.
6 above. In the determination of the DNA base sequence in the above, a known method described in Molecular Cloning Third Edition and the like can be used. For example, it can be easily implemented by using an instrument such as Li-cor \ DNA \ Sequencer \ model \ 4000L according to the attached manual instructions.
[0036]
Further, by randomly recombining a DNA having the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 2 or 4 or a DNA homologue thereof and a DNA having a nucleotide sequence highly homologous to any of them, in vivo or in vitro. Thus, a DNA having a new nucleotide sequence having amidase activity can be obtained. In this case, “highly homologous” refers to a nucleotide sequence having an identity at the nucleic acid level of 50% or more. For random recombination of DNA in in vivo, see Cherry, J. et al. R. [Nat. Biotechnol. , 17, 333-334 (1999)], and random recombination of DNA in vitro. P. C. [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91, 10747-10751 (1994)] or Zhao {H. [Nat. Biotechnol. , 16, 258-261 (1998)]. In particular, CrameriA. According to the method of [Nature, 391, 288-291 (1998)], recombination is performed in vitro using several kinds of DNAs encoding a hydrolase which are highly homologous to each other, and specific activity and stereoselectivity are obtained. Thus, it is possible to obtain a DNA encoding a stereospecific amidase having an improved DNA.
[0037]
(3) Vector and transformant of the present invention
By inserting the DNA encoding the protein of the present invention obtained in the above (2) into a known expression vector, a stereoselective amidase expression vector is provided. In addition, a transformant (recombinant) can be obtained by transforming a living cell with this expression vector, and a stereoselective amidase can be obtained by culturing the obtained transformant.
[0038]
The host cell to be transformed for expressing the stereoselective amidase of the present invention is not particularly limited as long as the host itself does not adversely affect the enzyme reaction, and a host vector system is established. Microorganisms such as bacteria, actinomycetes, yeasts, and molds, and insect cells, plant cells, and animal cells can be suitably used. Specific examples include the following microorganisms and higher organism cells.
[0039]
The genus Escherichia, the genus Bacillus, the genus Pseudomonas, the genus Brevibacterium, the genus Corynebacterium, the genus Rhodococcus, the genus Streptomyces (Streptomyces), Streptomyces (Streptomyces) And the genus Shizosaccharomyces, the genus Pichia, the genus Candida, the genus Aspergillus, silkworm, rapeseed, soybean, and the like.
[0040]
The host cells are preferably microorganisms of the genus Escherichia, Bacillus, Pseudomonas, Brevibacterium, Corynebacterium, and Rhodococcus, and particularly preferably Escherichia, Pseudomonas, Brevibacterium and Corynebacterium. It is a microorganism of the genus Bacterium.
In order to produce the protein of the present invention in vivo, the DNA of the present invention may be introduced into a vector stably present in a host organism, or may be directly introduced into the host genome by a technique such as homologous recombination. To produce a recombinant DNA molecule, and to transcribe and translate the genetic information.
[0041]
At this time, it is necessary to incorporate a promoter and a ribosome binding site (RBS) upstream of the 5 'side of the DNA strand of the present invention, more preferably, a transcription termination factor downstream of the 3' side. The promoter, RBS and transcription terminator are not particularly limited as long as they are a promoter, RBS and transcription termination factor known to function in cells used as a host, and vectors usable in these various organisms, Promoters, RBSs, and transcription termination factors are described in detail, for example, in Molecular Cloning Third Edition and "Basic Microbiology Course 8 Genetic Engineering / Kyoritsu Publishing".
[0042]
Specifically, for example, the genus Escherichia, particularly E. coli. For E. coli, vectors include pBR and pUC-based plasmids, and promoters derived from lac (β-galactosidase), trp (tryptophan operon), tac, Δtrc, lpp, λ phage ΔPL, PR, and the like. Examples of the transcription termination factor include trpA-derived, phage-derived, ribosomal RNA-derived, and lpp-derived. Thus, E. When E. coli is used as a protein synthesis system, the target protein is a recombinant E. coli of a vector containing the present DNA. It is produced constitutively with the growth of E. coli or inductively by adding a protein synthesis inducer such as isopropylthio-β-D-galactoside (hereinafter IPTG).
[0043]
In addition to being able to produce stereoselective amidases in vivo by the method described above, E. coli. The amidase can also be produced in vitro using a cell-free protein synthesis system of E. coli or wheat germ. For example, E. [FEBS @ Letters, 442, 15-19 (1999)] in E. coli, and Madin et al. [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 97, 559-564 (2000)].
[0044]
(4) Production of optically active carboxylic acids and / or amides using the amidase of the present invention
Further, the present invention provides a protein of the present invention or a transformant obtained as described above, represented by the following general formula (I):
[0045]
Embedded image

[0046]
(In the formula, A represents an optionally substituted hydrocarbon chain having 2 to 5 main chain atoms, and the hydrocarbon chain may contain a double bond, and may be a nitrogen atom or a nitrogen atom. R and R ′ each independently represent a hydrogen atom, an optionally substituted alkyl group or an optionally substituted aryl group, and n is 0 or 1)) to selectively hydrolyze the amide bond of the (R) -form by acting on a carboxylic acid amide represented by the following general formula (II):
[0047]
Embedded image

[0048]
(Wherein, A, R ′ and n are as defined above) and / or (R) -form carboxylic acids or / and the following general formula (III)
[0049]
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[0050]
Wherein A, R, R ′ and n have the same meanings as described above, wherein the (S) -form carboxylic amides are isolated. Or a method for producing amides.
In the above general formula (I), A represents an optionally substituted hydrocarbon chain having 2 to 5 main chain atoms, and the hydrocarbon chain may contain a double bond, One heteroatom other than an atom or a nitrogen atom may be contained. That is, A is a group that forms a nitrogen-containing heterocyclic group together with the nitrogen atom and carbon atom to which it is bonded, and the formed nitrogen-containing heterocyclic group contains a heteroatom other than a nitrogen atom. May be included. Here, examples of the hydrocarbon chain A substituent include a halogen atom, an alkyl group, an aryl group, a hydroxyl group, an amino group, a nitro group, a carboxyl group, and an alkoxy group.
[0051]
The nitrogen-containing heterocyclic group is preferably a 5- to 7-membered nitrogen-containing heterocyclic group, more preferably a nitrogen-containing heterocyclic group containing one or two nitrogen atoms and containing no other heteroatoms. . Preferred specific examples of the nitrogen-containing heterocyclic group include a piperidyl group, a piperazyl group, a pyrazyl group, and a pyrrolidyl group.
The nitrogen-containing heterocyclic group may have a substituent as long as it does not inhibit the reaction. Specific examples of the substituent include the same atoms or groups as those of the substituents R ′ and A, That is, examples thereof include a halogen atom, an alkyl group which may be substituted, an aryl group which may be substituted, a hydroxyl group, an amino group, a nitro group, a carboxyl group and an alkoxy group. Alkyl group.
[0052]
The substituents R and R 'in the general formula (I) represent a hydrogen atom, an optionally substituted alkyl group, or an optionally substituted aryl group.
Examples of the alkyl group include straight-chain, branched-chain and cyclic alkyl groups. Of these, those having 1 to 6 carbon atoms are preferable. Examples of the aryl group include a phenyl group and a naphthyl group.
[0053]
Examples of the substituent of the alkyl group or the aryl group include the same groups as those described above as the substituent of the hydrocarbon chain of A.
Preferred specific examples of the optionally substituted alkyl group or aryl group include a methyl group, an ethyl group, a propyl group, an isopropyl group, a butyl group, an isobutyl group, a t-butyl group, a cyclohexyl group, a benzyl group, and a trifluoro group. Examples include a methyl group, a 1-hydroxycarbonylethyl group, a phenyl group and a tolyl group.
[0054]
The substituent R is preferably a hydrogen atom or an alkyl group having 1 to 4 carbon atoms or a phenyl group having a substituent, more preferably a hydrogen atom or an alkyl group having 1 to 4 carbon atoms and a p-nitrophenyl group. It is.
In this production method, a recombinant organism accumulating the protein of the present invention, a processed product of the recombinant organism, a cell-free protein synthesis system reaction solution in which the protein of the present invention is accumulated, and / or a processed product thereof are reacted as an enzyme catalyst. Added to the system. Specifically, cells obtained by culturing the above-mentioned recombinant organisms as they are, or treated products by a known method such as treatment with an organic compound such as toluene or a surfactant, freeze-drying treatment, or physical crushing treatment The stereoselective amidase activity fraction of the present invention is taken out from the reaction solution of the cell-free protein synthesis system, the above-mentioned recombinant biotreated product, and the reaction solution of the cell-free protein synthesis as a crudely purified fraction or a purified product. It is also possible to use. Furthermore, it is also possible to use the thus obtained recombinant organisms, processed recombinant organisms, enzyme fractions and the like immobilized on a carrier such as polyacrylamide gel or carrageenan gel. Hereinafter, the term “high-concentration enzyme preparation” is used as a term encompassing all the concepts of the above-mentioned recombinant organism, cell-free protein synthesis reaction product, processed product thereof, enzyme fraction, and immobilized product.
[0055]
In this reaction, the racemic carboxylic acid amides, which are the reaction raw materials, are usually used at a concentration of 0.1 mM to 1 M, more preferably Add to the reaction at a concentration of ~ 500 mM. These may be added all at once at the start of the reaction, but may also be added continuously or intermittently to improve the accumulated concentration of the product.
[0056]
This reaction is carried out in an aqueous medium or a mixture of the aqueous medium and an organic solvent.Examples of the aqueous medium include water and a buffer solution such as a potassium phosphate aqueous solution and a tris-hydrochloric acid aqueous solution. Examples of the organic solvent include alcohols such as ethanol and propanol; ketones such as acetone; ethers such as tetrahydrofuran; esters such as ethyl acetate and butyl acetate; aromatic hydrocarbons such as toluene; Organic compounds such as halogenated hydrocarbons; aliphatic hydrocarbons such as n-hexane; and dimethyl sulfoxide can be used.
[0057]
The reaction of the reaction solution proceeds preferably in an alkaline state, but the pH is preferably 6.0 to 9.5, more preferably 7.0 to 9.5. In order to satisfy this condition, a dilute acid or alkali solution can be optionally added during the reaction to maintain the pH in a desired range.
The reaction proceeds at a reaction temperature of 0 to 50 ° C, but is preferably maintained at 25 to 45 ° C. The reaction solution is stirred and mixed as needed.
[0058]
Since the protein of the present invention has an action of stereoselectively hydrolyzing the carboxylic acid amides represented by the above formula (I), a (R) -form carboxylic acid is formed in the reaction solution, and (S) -The body amide remains.
The (R) -form carboxylic acid and / or the remaining (S) -form amide compound (amides) produced by the above reaction are isolated by a conventional separation / purification method such as solvent extraction and chromatography. be able to.
[0059]
【Example】
Hereinafter, the present invention will be described more specifically with reference to Examples, but the present invention is not limited thereto, and ordinary changes in the technical field of the present invention can be made without departing from the gist thereof. .
Example 1 Purification of Stereoselective Amidase Derived from Pseudomonas sp. MCI3434
Pseudomonas sp. MCI3434 strain was inoculated into 25.0 liters of the medium shown in Table 1, cultured at 25 ° C for 8 hours, and centrifuged to obtain cells.
[0060]
[Table 1]

[0061]
The obtained cells were sonicated and a cell-free extract was prepared by centrifugation. This was adsorbed to DEAE-Toyopearl resin equilibrated with 10 mM potassium phosphate buffer (pH 7.0) and ion exchange chromatography was performed. The fraction having stereoamidase activity in the eluted fraction containing 100 mM sodium chloride was separated. The protein was isolated by column chromatography using a Butyl-Toyopearl column using ammonium sulfate, a DEAE-Toyopearl column, a Gigapite column, and FPLC @ Superdex200 again. In order to determine the molecular weight of the protein, the protein was measured by SDS-PAGE and size exclusion chromatography using TSKgel @ G3000SW (Tosoh Corporation) to find that it was 29000 (SDS-PAGE) and 36000 (size exclusion chromatography), respectively. , The subunit configuration was assumed to be monomeric.
[0062]
Example 2: Determination of N-terminal amino acid sequence of stereoselective amidase derived from Pseudomonas sp. MCI3434
The N-terminal amino acid sequence of the purified stereospecific amidase obtained in Example 1 was analyzed using an automated Edman degradation amino acid sequencer {Prosequencer} 6625 (Millipore). The N-terminal amino acid sequence determined as described above is shown in SEQ ID NO: 5.
[0063]
Example 3: Obtaining a partial fragment of DNA encoding a stereoselective amidase derived from Pseudomonas sp. MCI3434
Pseudomonas sp. MCI3434 strain was inoculated into 100 mL of TGY medium (Table 2) and cultured at 30 ° C. for 12 hours.
[0064]
[Table 2]

[0065]
Microbial cells were obtained by centrifugation, and chromosomal DNA of the microorganism was obtained using the phenol-chloroform method. When a protein containing an amino acid sequence having high sequence homology to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 5 found in Example 2 was searched by the BLAST program, the amino acid sequences of several types of hydrolases derived from bacteria showed the highest homology (30%).程度 60%). Thus, the above-described homologous homologous protein PA3598 of the Pseudomonas aeruginosa PAO1 strain and the unknown function hydrolytic enzyme SCL6.12c of the Streptomyces coliericolor A3 (2) strain (Redenbach, M et al. [Mol. Microbiol. 1996), 21 (1): 77-96)] and the Hypothetical protein of the PQQF5 'region of Pseudomonas florescens (Schneider, U. et al. [Appl. Environ. Microbiol., (1995), 61 (11): 3856-). 3864]), two amino acid sequences commonly present were selected (SEQ ID NO: 6: YRKTHL, SEQ ID NO: 7: DIEFPE). Based on these sequences, PCR primers shown in SEQ ID NOs: 8 and 9 (3434HA5 and 3434HA7) were designed, and these primers were added in the presence of a heat-resistant DNA polymerase, and a PCR reaction was carried out using the MCI3434 strain chromosomal DNA as a template. went. When the product of this PCR reaction was subjected to agarose gel electrophoresis, 120 bp of DNA was specifically amplified. This was extracted and purified from the agarose electrophoresis gel. A part of the DNA was cloned into pT7Blue T-Vector (Novagen), and its base sequence was determined using Li-cor DNA Sequencer model 4000L (the operation method was in accordance with the attached manual instruction) (SEQ ID NO: 10). . As a result of analyzing the obtained nucleotide sequence, it was revealed that the fragment amplified by PCR was a partial fragment of a DNA encoding a stereoselective amidase derived from Pseudomonas sp. MCI3434. The remaining 120 bp of the purified DNA amplified by the above-mentioned Degenerate PCR was used for Rediprime.^TMLabeling was performed with II random primer prime labeling system (Amersham Pharmacia Biotech Co., Ltd.) to obtain a DNA probe.
[0066]
Example 4: Isolation of a stereoselective amidase gene derived from Pseudomonas sp. MCI3434 and determination of its base sequence
Chromosomal DNA was extracted from Pseudomonas sp. MCI3434 by the method described in Example 3. This DNA was digested with PstI, EcoRV, or FbaI, and then subjected to Southern hybridization using the DNA probe prepared in Example 3. The procedure was in accordance with Molecular Cloning Third Edition, and hybridization was performed at 42 ° C. in a buffer containing 40% formamide, 2 × SSC, and 0.1% SDS. As a result, DNA bands of about 2.1 kbp, about 5.5 kbp, and about 5.3 kbp were detected, respectively. These DNAs were extracted and purified from agarose gel, inserted into pBluescript SK (-) (Stratagene) at the PstI, HincII or BamHI sites, respectively, and transformed into E. coli by calcium chloride. coli JM109 strain.
[0067]
The obtained E. The transformant of E. coli JM109 was spread on an LB agar medium containing 80 μg / mL ampicillin (including 10.0 g of Bacto Trypton, 5.0 g of Bacto Yeast Extract 5.0 g, 10.0 g of sodium chloride, and 15.0 g of agar in a 1 L aqueous solution). And cultured overnight at 37 ° C. The resulting colonies are subjected to nitrocellulose membrane Hybond.^TMECL^TM(Amersham Pharmacia Biotech Co., Ltd.), and hybridization was performed at 42 ° C. in a buffer solution containing 40% formamide, 2 × SSC, and 0.1% SDS using the DNA probe obtained in Example 3. . As a result of the hybridization, plasmids (pRTB1-PstI, pRTB1-EcoRV, pRTB1-FbaI) were obtained from each positive clone, and the nucleotide sequence was determined using Li-cor \ DNA \ Sequencer \ model \ 4000L. The sequence of the DNA fragment 6668 bp of FbaI-PstI connected based on the overlapping portion of each sequence is shown in SEQ ID NO: 11. From the homology of this 6668 bp DNA sequence to SEQ ID NO: 10 and the homology of the N-terminal amino acid sequence of the purified stereospecific amidase described in SEQ ID NO: 5 to the sequence obtained by translating the 6668 bp DNA into amino acids, It was confirmed that the DNA sequence of No. 2 was a DNA encoding the present stereospecific amidase. SEQ ID NO: 1 describes the amino acid sequence of a stereoselective amidase derived from Pseudomonas sp. MCI3434 strain predicted from the DNA sequence.
[0068]
Example 5: Search for a protein having homology to the amino acid sequence of a stereoselective amidase derived from Pseudomonas sp. MCI3434
Using the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 1 (274 residues), homology was obtained with the BLAST program (http://www.ncbi.nlm.nih.gov./BLAST/) of National Center for Biotechnology Information (hereinafter referred to as NCBI). Highly likely proteins were searched. The protein with the highest amino acid identity was Conserved {hypothetical protein} PA3598 from Pseudomonas aeruginosa (strain PAO1) (amino acid identity: 65%). The protein with the next highest amino acid identity was Conserved / hypothetical / protein (NCBI accession number: CAC47075) of Sinorhizobium meliloti (strain 1021), but the amino acid identity was 36%.
[0069]
Example 6: Stereoselective amidase derived from Pseudomonas sp. expression in E. coli
PCR was performed using pRTB1-EcoR as a template and primers RTB-F and RTB-R (SEQ ID NOs: 12 and 13). The obtained PCR reaction product was purified, digested with the restriction enzymes HindIII and XbaI, ligated to pUC19 (manufactured by Takara Bio Inc.) digested with the same enzymes to produce pRTB1EX, coli JM109 was transformed by the calcium chloride method. The transformant was spread on an LB agar medium containing 80 μg / mL ampicillin, and the grown clone was obtained. coli @ JM109 (pRTB1EX) was obtained.
[0070]
Example 7: Purification of a protein having stereoselective amidase activity from E. coli JM109 (pRTB1EX)
E. FIG. After culturing E. coli @ JM109 (pRTB1EX) in 2.5 L of LB medium containing 80 μg / mL ampicillin, about 10.0 g of cells were obtained by centrifugation. This was suspended in a 100 mM Tris-HCl buffer (pH 8.0) containing 0.1 mM dithiothreitol, 0.1 mM EDTA, and 5.0 mM 2-mercaptoethanol, and was subjected to sonication and centrifugation to remove the cell-free extract. Got. Ammonium sulfate was added to this to obtain a 0-40% ammonium sulfate saturated fraction. This was further dissolved and dialyzed in a 10 mM Tris-HCl buffer (pH 8.0) (buffer A) containing 0.1 mM dithiothreitol, 0.1 mM EDTA, and 5.0 mM 2-mercaptoethanol, and then the same buffer was used. The column was adsorbed to a DEAE-Toyopearl column equilibrated in step 1 and eluted with buffer A containing 100 mM sodium chloride. Fractions having the desired stereoamidase activity were collected and dialyzed against buffer A. This was applied to a MonoQ @ HR10 / 10 column of FPLC (manufactured by Amersham Pharmacia Biotech), and eluted with a linear concentration gradient method of buffer A containing 0 to 500 mM sodium chloride. After elution, the fraction containing the activity was selected, desalted and concentrated to obtain a purified sample.
[0071]
Example 8: Enzymatic properties of a stereoselective amidase derived from Pseudomonas sp. MCI3434
Using N-tert-butylpiperazine-2-carboxamide as a substrate, the optimal pH and optimal temperature of the amide hydrolysis reaction of the purified enzyme obtained in Example 7, the temperature tolerance of the enzyme and the 1 mM inhibitor The effect was determined by quantifying the piperazine-2-carboxylic acid generated by the hydrolysis reaction by HPLC. The reaction was carried out at 30 ° C. for 20 minutes, and the reaction was stopped by adding ethanol to prepare a sample for HPLC. In the heat treatment for measuring temperature resistance, incubation was performed for 5 minutes at each temperature, and after adjusting the temperature to 30 ° C., the activity was measured. As for the inhibitor, the enzyme was incubated at 30 ° C. for 5 minutes in the presence of 1 mM inhibitor, N-tert-butylpiperazine-2-carboxamide was added, the mixture was incubated at 30 ° C. for 20 minutes, and the reaction was performed by adding ethanol. Was stopped, and the produced piperazine-2-carboxylic acid was quantified using the following HPLC condition A.
[0072]
HPLC condition A
Column: Sumichiral @ OA-5000
Column temperature: 30 ° C
Eluent: 2 mM CuSO₄Aqueous solution
Flow rate: 1.0 mL / min
Detection: UV 254 nm absorbance
The results are summarized in Tables 3 and 4 below.
[0073]
[Table 3]

[0074]
[Table 4]

[0075]
Next, the substrate selectivity of a stereoselective amidase derived from Pseudomonas sp. MCI3434 was examined. The substrate compound was added at a concentration of 20 mM, and an enzyme reaction was carried out at 30 ° C. in a 100 mM Tris-HCl buffer (pH 8.0), and the analysis was performed under the following HPLC conditions B.
HPLC condition B;
Column: Smichiral @ OA-5000 or OA-5000L
Column temperature: 30 ° C
Eluent: 2 mM @ CuSO₄Aqueous solution
Flow rate: 1.0 mL / min
Detection: UV 254 nm absorbance
The activity relative to piperazine-2-carboxamide is defined as 100, and the relative activity is shown in Table 5.
[0076]
[Table 5]

[0077]
Pseudomonas sp. MCI3434-derived stereoselective amidase activity shows particularly strong activity on piperazine-2-carboxamide, piperidine-3-carboxamide, and β-alaninamide, and weak activity on D-glutamine amide and piperidine-4-carboxamide. Indicated. In addition, although significant activity was shown for N-alkylamide compounds, other L- or D-amino acid amides, peptides, aliphatic amides, aromatic amides, and nitriles were not hydrolyzed.
[0078]
Example 9: Examination of stereoselectivity of stereoselective amidase derived from Pseudomonas sp. MCI3434
E. FIG. coli @ JM109 (pRTB1EX) was cultured in an LB medium containing 80 μg / mL ampicillin and 0.5 mM IPTG, and the cells were obtained by centrifugation. The wet cells were weighed, added to 1.0 mL of 100 mM Tris-HCl buffer (pH 8.0) containing 200 mM (RS) -piperazine-2-carboxamide so as to be 0.48%, and added at 30 ° C. After the reaction for 1.1 hours, the reaction was stopped with ethanol, and the optical purity of the produced piperazine-2-carboxylic acid was measured under HPLC condition A. The optical purity of (R) -piperazine-2-carboxylic acid is 97.4% e. e. And the E value was 59.0.
[0079]
Example 10: of (RS) -N-tert-butylpiperazine-2-carboxamide using E. coli JM109 (pRTB1EX)
E. FIG. coli @ JM109 (pRTB1EX) was cultured in an LB medium containing 80 μg / mL ampicillin and 0.5 mM IPTG, and the cells were obtained by centrifugation. The wet cell weight was measured, and 0.4% was added to 1.0 mL of 100 mM Tris-HCl buffer (pH 8.0) containing 200 mM (RS) -N-tert-butylpiperazine-2-carboxamide, and 0.4%, respectively. 2.0% was added and incubated at 30 ° C. After sampling at regular intervals and stopping the reaction with ethanol, quantification of piperazine-2-carboxylic acid produced under HPLC condition A and measurement of optical purity were performed (FIG. 1). As a result, the optical purity of (R) -piperazine-2-carboxylic acid produced was 99.7% and 99.5% e. e. Met.
[0080]
Example 11: Cloning of the gene encoding the protein PA3598 of unknown function of Pseudomonas aeruginosa PAO1
In order to obtain DNA encoding the unknown function protein PA3598 of Pseudomonas モ aeruginosa PAO1 strain, which was found to have the highest amino acid identity (65%) with the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 1 in Example 5, a known ( Primers PAE1 and PAE2 (SEQ ID NOs: 14 and 15) were designed based on the genomic DNA sequence of Stover, CK, et al., [Nature, (2000), 406 (6799): 959-964]) Pseudomonas {Aeruginosa {PAO1 strain}. . Using these primers, PCR was performed using genomic DNA of Pseudomonas aeruginosa PAO1 strain purchased from the ATCC as a template DNA. The product of this PCR was subjected to agarose gel electrophoresis, and a 0.96 kbp DNA was extracted and purified from the agarose electrophoresis gel. A part of the DNA was replaced with pT7Blue
Plasmid pTPA was obtained by cloning into T-Vector (manufactured by Novagen), and the base sequence of the inserted fragment was determined using Li-cor \ DNA \ Sequencer \ model \ 4000L (the operation method was in accordance with the attached manual instructions) (sequence). No. 16), it was confirmed that the obtained DNA fragment was DNA encoding PA3598 described in SEQ ID NO: 3.
[0081]
Example 12 Pseudomonas aeruginosa PAO1 strain-derived PA3598-encoding gene expression in E. coli
PCR was performed using the plasmid pTPA containing the PA3598 gene prepared in Example 11 as a template and the primers PAEX1 and PAEX2 (SEQ ID NOS: 17 and 18). The obtained PCR reaction product was purified, digested with restriction enzymes HindIII and XbaI, and ligated to pUC19 (Takara Shuzo Co., Ltd.) digested with the same enzymes to prepare plasmid pAEX. coli JM109 was transformed by the calcium chloride method. The transformant was spread on an LB agar medium containing 80 μg / mL ampicillin, and the grown clone was obtained. coli JM109 (pAEX) was obtained.
[0082]
Example 13: E. Purification of a protein having stereoselective amidase activity from E. coli JM109 (pPAEX)
E. FIG. After culturing E. coli @ JM109 (pPAEX) in 2.5 L of LB medium containing 80 μg / mL ampicillin, about 10.0 g of cells were obtained by centrifugation. This was suspended in a 100 mM Tris-HCl buffer (pH 8.0) containing 0.1 mM dithiothreitol, 0.1 mM EDTA, and 5.0 mM 2-mercaptoethanol, and was subjected to sonication and centrifugation to remove the cell-free extract. Got. To this was added sodium chloride to a concentration of 4 M, 10 mM Tris-HCl buffer (pH 8.0) containing 4 M NaCl, 0.1 mM dithiothreitol, 0.1 mM EDTA, and 5.0 mM 2-mercaptoethanol. The mixture was passed through a butyl toyopearl column equilibrated in step 1 and the flow-through fraction was collected. This was dialyzed against a 10 mM Tris-HCl buffer (pH 8.0) (buffer A) containing 0.1 mM dithiothreitol, 0.1 mM EDTA, and 5.0 mM 2-mercaptoethanol, and then equilibrated with the same buffer. The column was adsorbed to the DEAE-Toyopearl column and eluted with buffer A containing 150 mM sodium chloride. Fractions having the desired stereoamidase activity were collected and dialyzed against buffer A. This was applied to a Superdex200 @ HR10 / 30 column of FPLC (manufactured by Amersham Pharmacia Biotech), and eluted with a buffer A containing 150 mM sodium chloride. After elution, the fraction containing the activity was selected, desalted and concentrated to obtain a purified sample.
[0083]
Example 14: Enzymatic properties of a stereoselective amidase from Pseudomonas aeruginosa PAO1
Using (RS) -piperazine-2-carboxamide as a substrate, the optimum pH and temperature of the amide hydrolysis reaction of the purified enzyme obtained in Example 13, the temperature tolerance of the enzyme, and the effect of 1 mM inhibitor Was performed by quantifying piperazine-2-carboxylic acid generated by the hydrolysis reaction by HPLC. The reaction was carried out at 30 ° C. for 20 minutes, and the reaction was stopped by adding ethanol to prepare a sample for HPLC. In the heat treatment for measuring temperature resistance, incubation was performed for 5 minutes at each temperature, and after adjusting the temperature to 30 ° C., the activity was measured. As for the inhibitor, the enzyme was incubated at 30 ° C. for 5 minutes in the presence of 1 mM inhibitor, and then (RS) -piperazine-2-carboxamide was added and the mixture was incubated at 30 ° C. for 20 minutes, and then the reaction was performed by adding ethanol. After stopping, the produced piperazine-2-carboxylic acid was quantified using the following HPLC condition A.
The results are summarized in Tables 6 and 7 below.
[0084]
[Table 6]

[0085]
[Table 7]

[0086]
Example 15: Examination of stereoselectivity of stereoselective amidase derived from Pseudomonas aeruginosa PAO1 strain
E. FIG. coli JM109 (pAEX) was cultured in an LB medium containing 80 µg / mL ampicillin and 0.5 mM IPTG, and the cells were obtained by centrifugation. The wet cells were weighed, added to 1.0 mL of 100 mM Tris-HCl buffer (pH 8.0) containing 200 mM (RS) -piperazine-2-carboxamide to a concentration of 0.52%, and added at 30 ° C. After the reaction for 1.1 hours, the reaction was stopped with ethanol, and the optical purity of the produced piperazine-2-carboxylic acid was measured under HPLC condition A. The optical purity of (R) -piperazine-2-carboxylic acid is 94.4% e. e. And the E value was 30.0.
[0087]
[Sequence list]

[0089]

[0090]

[0091]

[0092]

[0093]

[0094]

[0095]

[0096]

[0097]

[0098]

[0099]

[0100]

[0101]

[0102]

[0103]

[0104]

[0105]

[Brief description of the drawings]
FIG. FIG. 2 is a diagram showing the production of (R) -piperazine-2-carboxylic acid by E. coli @ JM109 (pRTB1EX). In the figure, ○ indicates (S) -piperazine-2-carboxylic acid (0.4% wet cells), ● indicates (R) -piperazine-2-carboxylic acid (0.4% wet cells), and □ indicates ( S) -Piperazine-2-carboxylic acid (2.0% wet cells) and ■ indicate (R) -piperazine-2-carboxylic acid (2.0% wet cells). (○ is not displayed because it overlaps with □.)

Claims (12)

A stereoselective amidase having the following physicochemical properties.
(A) the apparent molecular weight measured by SDS-PAGE is about 29,000 to 31,000;
(B) the optimal pH of the amidase reaction when using (RS) -piperazine-2-carboxamide or (RS) -N-tertbutylpiperazine-2-carboxamide as a substrate is around pH 8;
(C) the optimal temperature of the amidase reaction when (RS) -piperazine-2-carboxamide or (RS) -N-tertbutylpiperazine-2-carboxamide is used as a substrate is 45 to 50 ° C;
(D) stable at a temperature of 45 ° C. or lower around pH 8.0;
(E) the activity is completely inhibited by p-chloromercuric benzoic acid, Cu ²⁺ , Zn ²⁺ , Cd ²⁺ , Hg ²⁺ , Pb ²⁺ ; and (F) using (RS) -piperazine-2-carboxamide as a substrate The stereoselectivity of the amidase reaction is (R) -isomer selectivity and the E value is 30 to 60. A protein having any one of the following amino acid sequences:
(A) the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1;
(B) an amino acid sequence in which one or more amino acids are deleted, added or substituted in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, which acts on piperazine-2-carboxamide to form an amide bond thereof by (R) An amino acid sequence having an activity of selectively hydrolyzing body; or (C) an amino acid sequence having 60% or more identity with the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, which acts on piperazine-2-carboxamide; An amino acid sequence having an activity of selectively hydrolyzing the amide bond in the (R) form. DNA having any one of the following base sequences.
(A) a nucleotide sequence encoding the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1;
(B) an amino acid sequence in which one or more amino acids are deleted, added or substituted in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, which acts on piperazine-2-carboxamide to form an amide bond thereof by (R) -A base sequence encoding an amino acid sequence having a body-selective hydrolysis activity;
(C) an amino acid sequence having at least 60% identity to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, acting on piperazine-2-carboxamide and selectively hydrolyzing the amide bond in the (R) -form A nucleotide sequence encoding a protein having activity;
(D) the base sequence of SEQ ID NO: 2;
(E) a base sequence in which one or more bases have been deleted, added or substituted in the base sequence described in SEQ ID NO: 2, which acts on piperazine-2-carboxamide to form an amide bond thereof by (R) -A nucleotide sequence encoding a protein having an activity of selectively hydrolyzing; or (F) a nucleotide sequence which hybridizes under stringent conditions to the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2 or its complementary sequence, A nucleotide sequence encoding a protein that acts on piperazine-2-carboxamide and has an (R) -isomer-selective hydrolysis of the amide bond. A recombinant DNA molecule or vector comprising the DNA of claim 3. A transformed host cell having the recombinant DNA molecule or vector according to claim 4. The following general formula (I)

(In the formula, A represents an optionally substituted hydrocarbon chain having 2 to 5 main chain atoms, and the hydrocarbon chain may contain a double bond, and may be a nitrogen atom or a nitrogen atom. R and R ′ each independently represent a hydrogen atom, an optionally substituted alkyl group or an optionally substituted aryl group, and n is 0 or 1) is reacted with the amidase or protein according to claim 1 or 2, or the transformed host cell according to claim 5 or a processed product thereof, whereby (R After selectively hydrolyzing the amide bond of the-)-form, the following general formula (II)

(Wherein, A, R ′ and n have the same meanings as described above) and / or a (R) -form carboxylic acid and / or the following general formula (III)

(Wherein, A, R, R ′ and n have the same meanings as described above), wherein an (S) -form carboxylic acid amide represented by the formula (I) is isolated: Or a method for producing amides. A protein having any one of the following amino acid sequences:
(A) an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3 or an amino acid sequence in which one or more amino acids are deleted, added or substituted in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3, and the amino acid sequence is represented by piperazine-2-carboxamide; (B) an amino acid sequence having an activity of selectively hydrolyzing the amide bond by (R) -isomer; or (B) an amino acid sequence having 60% or more identity with the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3. An amino acid sequence having the activity of acting on piperazine-2-carboxamide and selectively hydrolyzing the amide bond in the (R) -isomer. DNA having any one of the following base sequences.
(A) an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3 or an amino acid sequence in which one or more amino acids are deleted, added or substituted in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3, and the amino acid sequence is represented by piperazine-2-carboxamide; A base sequence encoding an amino acid sequence that acts and selectively hydrolyzes the amide bond in an (R) -isomer;
(B) an amino acid sequence having a degree of identity of 60% or more to the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 3, which acts on piperazine-2-carboxamide and selectively hydrolyzes the amide bond in the (R) -form. A nucleotide sequence encoding a protein having activity;
(C) a base sequence of SEQ ID NO: 4 or a base sequence in which one or more bases are deleted, added or substituted in the base sequence of SEQ ID NO: 4; A nucleotide sequence encoding a protein having an activity of acting and selectively hydrolyzing the amide bond in the (R) -isomer; or (D) the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 4 or its complementary sequence under stringent conditions. A nucleotide sequence encoding a protein having an activity of acting on piperazine-2-carboxamide and selectively hydrolyzing an amide bond thereof in an (R) -isomer. A recombinant DNA molecule or vector comprising the DNA of claim 8. A transformed host cell having the recombinant DNA molecule or vector according to claim 9. The following general formula (I)

(In the formula, A represents an optionally substituted hydrocarbon chain having 2 to 5 main chain atoms, and the hydrocarbon chain may contain a double bond, and may be a nitrogen atom or a nitrogen atom. R and R ′ each independently represent a hydrogen atom, an optionally substituted alkyl group or an optionally substituted aryl group, and n is 0 or 1) is reacted with the protein of claim 7 or the transformed host cell of claim 10 or a processed product thereof to form an (R) -form amide bond. Is selectively hydrolyzed, and then the following general formula (II)

(Wherein, A, R ′ and n have the same meanings as described above) and / or a (R) -form carboxylic acid and / or the following general formula (III)

(Wherein, A, R, R ′ and n have the same meanings as described above). An optically active (R) — is characterized by isolating a (S) -form carboxylic acid amide represented by the formula: A method for producing carboxylic acids and / or (S) -carboxamides. The DNA according to claim 3 or the recombinant DNA molecule or vector according to claim 4 and one or more DNAs having 50% or more homology with the DNA are randomly recombined to obtain a stereoselective DNA. A method for preparing a DNA encoding a protein having a stereoselective amidase activity, wherein the DNA is selected using the amidase activity as an indicator.

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