【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、肝臓や腎臓などの臓器に存在する星細胞の活性化を抑制する星細胞活性化抑制剤、及び、星細胞の活性化に伴う臓器線維症の予防又は治療剤に関する。
【０００２】
【従来の技術及び発明が解決しようとする課題】
臓器線維症は、臓器内の細胞が、ウイルス、アルコール、薬剤等の種々の原因により壊死した後、十分に再生せず、結合組織が増加して線維化することにより生じる疾患であり、肝硬変、腎硬化症、肺線維症等が知られている。線維化が進行した場合、現在、その予後を改善する治療法は皆無といっても過言ではない。
【０００３】
臓器線維症のうち、肝硬変は、慢性肝炎から高率で進行し、さらに、肝不全ないし肝癌に移行する確率が高いことが知られており、この慢性肝炎→肝硬変→肝癌という病態連鎖の進行を抑制することは重要である。
肝硬変の予防に関しては、インターフェロンやグリチルリチン製剤を用いる治療法が存在する。しかしながら、インターフェロン製剤は高価である上、有効性は３割程度しかなく、また、ウイルス性の肝障害にしか適応がない。また、グリチルリチン製剤は静脈内投与が必要であり、患者への頻回投与は困難である。
一方、腎硬化症に対する有効な薬剤についての報告はほとんどないのが現状である。
【０００４】
ところで、近年、肝構成細胞の分離および初代培養技術は著しい進歩を遂げている。ラットやマウスなどの小動物やヒトから、肝（実質）細胞のみならず、非実質細胞であるＫｕｐｆｆｅｒ細胞、内皮細胞、星細胞、ｐｉｔ細胞、胆管上皮細胞が分離可能となっており、これらの非実質細胞について数多くの研究がなされている。その結果、肝細胞代謝の恒常性維持と肝局所炎症反応における肝非実質細胞の重要性が認識されるようになり、特に、星細胞の機能が注目を集めている。
【０００５】
星細胞は、ＧＦＡＰ（グリア細胞線維性酸性蛋白質）、ネスチン、Ｎ−ＣＡＭ（神経細胞接着分子）、プリオンなどを発現することから、ｎｅｕｒａｌ ｃｒｅｓｔ由来の細胞であると考えられている。肝臓の星細胞は、通常、ビタミンＡ代謝において中心的な役割を果たすことが知られている。
【０００６】
星細胞は、肝炎等において惹起された炎症が持続すると、いわゆる「活性化」とよばれる機能変化をとげて、筋線維芽細胞へと形質転換する。
この活性化された星細胞においては、以下の１）〜４）などの現象が生じることが明らかになっている。
１）コラーゲンやプロテオグリカンなどの細胞外マトリックスの代謝が活性化する。
２）ＴＧＦβ （ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ β）等の、臓器線維化を促進する各種成長因子の産生が著明に増加する。
３）マトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）の阻害物質であるｔｉｓｓｕｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｏｆ ＭＭＰ（ＴＩＭＰ）の産生が増加する。
４）星細胞膜上に、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）に対する受容体（ＰＤＧＦＲβ）、インスリン様成長因子（ＩＧＦ−Ｉ）に対する受容体（ＩＧＦ−ＩＲβ）が発現誘導され、星細胞の増殖促進や遊走能の獲得がみられる。
【０００７】
したがって、星細胞の活性化が臓器線維化に関与していると考えられ、実際、ヒトの慢性肝炎や肝硬変組織の線維性隔壁部には、細胞外マトリックスとともに、活性化された星細胞が多数存在していることが確認されている。
それゆえに、星細胞の活性化を抑制することができれば、肝硬変等における臓器線維化を抑制することが可能になるだけでなく、軽減することも可能となると考えられる。
【０００８】
これまで、星細胞の活性化を抑制するいくつかの試みがなされてきた。例えば、ＴＧＦβの可溶型受容体を投与することによって内因性のＴＧＦβの作用を中和して線維化を抑制しようとする試み、ドミナントネガティブ型ＴＧＦβ受容体を発現させる遺伝子治療、ＰＤＧＦ受容体特異的チロシンキナーゼ阻害剤の開発などである。しかしながら、未だ、臨床使用の結果が公表されているものはない。
また、モルフォゲンとしての作用を有する肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）を用いた遺伝子治療も提案されている。しかしながら、ＨＧＦを長期投与した場合、種々の臓器での発癌が促進される可能性を否定できないことから、臨床応用できるかどうかははっきりしていない。
【０００９】
一方、上述のように、肝臓の線維化の分子機構とその制御戦略についての研究はなされているものの、腎臓や肺、膵臓、脾臓及び消化管等の臓器に関してはまだ解析が少ない。
しかし、これらの臓器にも星細胞が存在することはすでに確認されており、腎硬化症等の臓器線維症にも星細胞が関与していることが推察される。
【００１０】
それゆえに、星細胞の活性化を抑制することができれば、肝臓のみならず、腎臓や肺などの、星細胞が存在する多様な臓器の線維化についても抑制することができると考えられる。したがって、本発明は、有効かつ副作用の少ない星細胞活性化抑制剤、及び、肝臓、腎臓等の臓器線維症の予防又は治療剤を提供することを課題とする。
【００１１】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記目的を達成すべく鋭意研究をおこなった結果、大黄、又は特定のアントラキノン類もしくはその誘導体が星細胞の活性化及び増殖を抑制し、それらの細胞の増殖因子に対する反応性を減弱させることに極めて有効であることを見いだし、本発明に至った。
【００１２】
前記課題を解決する本発明の第一の発明は、大黄を有効成分とする星細胞活性化抑制剤である。
前記課題を解決する本発明の第二の発明は、下記一般式（Ｉ）：
【００１３】
【化３】
【００１４】
［式中、Ｒ１は水素原子、ヒドロキシ基又はメトキシ基を表し；Ｒ２はメチル基、ヒドロキシメチル基又はカルボキシ基を表す］
で表されるアントラキノン類又はその誘導体を有効成分とする星細胞活性化抑制剤である。前記アントラキノン類はエモジンであることが好ましい。
前記課題を解決する本発明の第三の発明は、大黄を有効成分とする臓器線維症の予防又は治療剤である。
前記課題を解決する本発明の第四の発明は、下記一般式（Ｉ）：
【００１５】
【化４】
【００１６】
［式中、Ｒ１は水素原子、ヒドロキシ基又はメトキシ基を表し；Ｒ２はメチル基、ヒドロキシメチル基又はカルボキシ基を表す］
で表されるアントラキノン類又はその誘導体を有効成分とする臓器線維症の予防又は治療剤である。前記アントラキノン類はエモジンであることが好ましい。
また、前記臓器線維症は、肝臓、腎臓、膵臓、肺臓、脾臓及び大腸の線維症のいずれかであることが好ましい。
【００１７】
【発明の実施の形態】
大黄は、タデ科の掌葉大黄（Ｒｈｅｕｍ ｐａｌｍａｔｕｍ Ｌ．）、葯用大黄（Ｒ． ｏｆｆｉｃｉｎａｌｅＢａｉｌｌ．）等の、通例、根茎である。古くから知られている生薬の１つであり、瀉下薬や健胃薬として多くの漢方処方に配合されているほか、緩下薬としても多量消費されている。含有成分としては、アントラキノン類（クリソファノール、エモジン、イソエモジン、エモジンのモノメチルエステル、アロエエモジン、レイン等）とそれらの配糖体、ジアントロン類（センノサイドＡ〜Ｆ、センニジンＡ等）、タンニン類（カテキン、ラタンニン、エピカテコール等）、スチルベン配糖体、ナフタレン配糖体、クロモン類等の多数の成分が確認されている。
大黄の薬理作用としては、瀉下作用や抗菌作用、血中尿素窒素（ＢＵＮ）低下作用、血液凝固抑制作用、抗炎症作用、変異原性抑制作用、環状ヌクレオチドに対する作用、インターフェロン誘起作用等が知られているが、星細胞の活性化や、肝臓、腎臓等の臓器の炎症に伴う臓器線維化に関連する報告はない。
【００１８】
本発明で用いられるアントラキノン類は、前記一般式（Ｉ）で表されるものであり、クリソファノール（Ｒ１が水素原子、Ｒ２がメチル基）、エモジン（Ｒ１がヒドロキシ基、Ｒ２がメチル基）、フィシオン（Ｒ１がメトキシ基、Ｒ２がメチル基）、アロエエモジン（Ｒ１が水素原子、Ｒ２がヒドロキシメチル基）、シトレオロセイン（Ｒ１がヒドロキシ基、Ｒ２がヒドロキシメチル基）、レイン（Ｒ１が水素原子、Ｒ２がカルボキシ基）等を例示することができる。
これらのアントラキノン類は、天然には、大黄やアロエ、センナ等に存在しており、その薬理作用としては、抗菌作用、利尿作用等のいくつかの報告はあるものの、星細胞の活性化や、肝臓、腎臓等の臓器の炎症に伴う臓器線維化に関連する報告はない。
【００１９】
本発明において、大黄は、通常、植物全体又は根茎をそのまま乾燥粉砕した粉末として用いてもよいし、あるいは溶媒抽出物の形態で用いることもできる。
粉末状の大黄としては、例えば、大黄末としてトチモト社、ツムラ社等から入手することができる。
溶媒抽出物は、植物由来の抽出物を抽出する際に一般的に用いられる抽出方法により得ることができる。すなわち、大黄の全体又は根茎を、生のまま又は必要により乾燥した後、そのまま若しくは粉砕して溶媒抽出に供することにより溶媒抽出物（植物抽出エキス）を得ることができる。
抽出溶媒としては、植物からその成分を抽出する際に一般的に用いられているものであれば特に制限はなく、例えば、熱水又は水；エタノール、イソプロピルアルコール、ｎ−ブタノール等の低級アルコール；プロピレングリコール、１，３−ブチレングリコール等の多価アルコール；これらのアルコール類の含水物；ｎ−ヘキサン、トルエン等の炭化水素系溶媒等を挙げることができる。特に、水、エタノール又は含水エタノールを用いれば、そのまま、製剤に使用することができるので好ましい。
抽出方法は、例えば水の場合、植物全体又は根茎を粉砕し、これに１０質量倍の水を加え、９５℃で１５〜３０分間抽出し、静置することにより抽出する。その後、必要に応じて、溶媒抽出物を適宜濃縮、乾燥して用いてもよい。
【００２０】
本発明において、アントラキノン類は、通常、遊離体で用いられるが、特に遊離体である必要はなく、誘導体、すなわち、薬理学的に許容される塩、例えばナトリウム、カリウム等のアルカリ金属塩、カルシウム、マグネシウム等のアルカリ土類金属塩、アンモニウム塩、トリエチルアミンやトリエタノールアミン等の有機アミン塩、リジンやアルギニン等の塩基性アミノ酸塩等の形態や、生体内で加水分解されて遊離体に変換される形態、例えばモノメチルエモジン等のエステルの形態、１−グルコシドや８−グルコシド等の配糖体の形態で用いることもできる。
これらの誘導体の形態での利用は、遊離体では溶解度が低く、沈殿が生じる危険がある場合に特に有効である。
【００２１】
本発明において、星細胞の活性化抑制効果を発揮するために必要な大黄の有効投与量は、１日あたり、好ましくは１ｍｇ／体重１ｋｇ以上、特に好ましくは１０〜１０００ｍｇ／体重１ｋｇである。また、アントラキノン類の有効投与量は、１日あたり、好ましくは０．２ｍｇ／体重１ｋｇ以上、特に好ましくは２〜２００ｍｇ／体重１ｋｇである。
【００２２】
本発明の星細胞活性化抑制剤は、肝臓等の臓器において、慢性炎症後などに惹起される臓器線維症の進行を抑制するための臓器線維症の予防又は治療剤としても使用可能である。
本発明の臓器線維症の予防又は治療剤が用いられる臓器線維症としては、肝硬変、腎硬化症、肺線維症、慢性膵炎、胃潰瘍、炎症性腸疾患等を挙げることができ、好ましくは肝硬変である。
【００２３】
本発明において、臓器繊維化抑制効果を発揮するために必要な大黄の有効投与量は、１日あたり、好ましくは１ｍｇ／体重１ｋｇ以上、特に好ましくは１０〜１０００ｍｇ／体重１ｋｇである。また、アントラキノン類の有効投与量は、１日あたり、好ましくは０．２ｍｇ／体重１ｋｇ以上、特に好ましくは２〜２００ｍｇ／体重１ｋｇである。
【００２４】
本発明の星細胞活性化抑制剤及び臓器繊維化抑制剤は、上記有効成分の他に、本発明の効果を損なわない範囲で、生理的に受容可能な液体又は固体の製剤担体を配合した薬剤組成物として使用することができる。
製剤担体としては、通常用いられる賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、被覆剤、溶解補助剤、乳化剤、懸濁化剤、安定化剤、溶剤等を添加することができる。
前記薬剤組成物は、投与方法に応じて、様々な製剤形態をとることができる。
該製剤形態としては、水剤、シロップ剤、懸濁剤、乳濁剤、錠剤、顆粒剤、散剤、丸剤、カプセル剤等の経口摂取可能な形態が好ましいが、注射剤、輸液等の形態であってもよい。
本発明の星細胞活性化抑制剤及び臓器繊維化抑制剤は、大黄又はアントラキノン類もしくはその誘導体、及びその他の任意の成分を原料として、定法に従って製造することができる。
投与方法としては、経口、経静脈、経中心静脈、経直腸投与等の任意の投与方法が可能であるが、特に、経口投与が好ましい。
前記薬剤組成物中における大黄、アントラキノン類又はそれらの誘導体の配合量は、特に制限はなく、剤形に合わせて適宜決定すればよい。
ただし、大黄を溶媒抽出物として用い、星細胞活性化抑制剤を溶液状とする場合は、星細胞活性化抑制剤中の配合量は、１〜１００μｇ／ｍｌ、特に２〜１０μｇ／ｍｌであることが好ましい。配合量が１μｇ／ｍｌ未満では、星細胞活性化抑制効果が充分に発揮されないおそれがあり、１００μｇ／ｍｌを超えると、製剤上の問題が生じる場合がある。なお、上記配合量は、抽出溶媒を除去後の乾固物としての質量である。
同様に、アントラキノン類又はその誘導体の星細胞活性化抑制剤中の配合量は、１〜１０μｇ／ｍｌ、特に２〜５μｇ／ｍｌであることが好ましい。
【００２５】
また、本発明の星細胞活性化抑制剤及び臓器繊維化抑制剤は、食品に添加して用いてもよく、その場合、上記の他に、通常、食品に添加可能な物質（酸化防止剤、着色料等）を添加することができる。
【００２６】
また、本発明の星細胞活性化抑制剤及び臓器繊維化抑制剤は、１日に１回又は数回に分けて投与することができる。
【００２７】
本発明において、大黄は、現在主に瀉下剤として常用量３〜１２ｇ／日用いられており、また、アントラキノン類は、大黄中に２〜４質量％（大黄中、エモジンは０．１〜１質量％）含有されている物質であるので、本発明の星細胞活性化抑制剤及び臓器線維化抑制剤は、有効投与量の範囲内において、安全で、副作用が生じるおそれが少ないと考えられる。また、経口摂取することが可能であり、各種医薬品、食品、栄養剤等に添加して用いることができる。
星細胞は、肝炎等において惹起された炎症が持続すると、いわゆる「活性化」とよばれる機能変化をとげて、筋線維芽細胞へと形質転換する。本発明の星細胞活性化抑制剤及び臓器線維化抑制剤は、星細胞の活性化を抑制することができるので、肝硬変等における臓器線維化を抑制することが可能であるだけでなく、軽減することも可能であると考えられる。
【００２８】
【実施例】
以下の試験例により、本発明およびその効果を具体的に説明するが、これらは本発明を限定するものではない。
なお、下記試験例では、大黄として、ツムラ社より入手した大黄末を使用した。また、エモジンとして、ＳＩＧＭＡ社製の生化学研究用（純度９５％以上）のものを使用した。
【００２９】
＜試験対象＞
ラットの肝臓から分離・培養した星細胞。
＜星細胞の分離・培養方法＞
ラット肝臓から、既報（Ｋｒｉｓｔｅｎｓｅｎ ＤＢ， Ｋａｗａｄａ Ｎ， ｅｔ ａｌ． Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ． ２０００３２：２６８−７７）に準じて星細胞を分離した。その手順を簡単に述べると、ラット肝臓を門脈から灌流して脱血したのち、コラゲナーゼとプロナーゼを含む酵素溶液でさらに灌流して消化した。肝臓を取りだしたのち、さらに、前記と同じ酵素溶液中で消化した。この消化産物を遠心して未消化の細胞群を集めたのち、この細胞群を８．２％ナイコデンツ溶液と混合して３２００回転、１５分間遠心すると、溶液の最上層に星細胞が得られた。得られた星細胞を遠心洗浄したのち１０％ウシ胎児血清を含むＤＭＥＭ中に浮遊させ、滅菌したプラスチックシャーレに注入して培養した。星細胞はシャーレ上で接着して成長した。
星細胞を数日間、１０％のウシ胎児血清を含むダルベッコＭＥＭ溶液（ＳＩＧＭＡ社製）中で、３５ｍｍプレート（Ｆａｌｃｏｎ３００３）に接着させ、３７℃、５％ＣＯ２存在下で、１プレートあたりの細胞数：７．５×１０５ｃｅｌｌｓにまで培養した。星細胞は、血清の存在下で培養すると細胞形態を変化させながら増殖した。
【００３０】
試験例１：肝臓由来の星細胞
（１−１）「星細胞の形態に対する大黄の効果」
星細胞の形態に対する大黄の影響を、以下の手順により評価した。
培養液を血清非存在下にした上で、各種濃度（１，５，１０μｇ／ｍｌ）となるように、大黄末をＤＭＳＯ（和光純薬工業社製）に溶解させたものを添加し、培養星細胞を４８時間培養した。コントロールとして、大黄を添加しなかった以外は同様の手順で星細胞を培養した。なお、上記大黄の濃度は、培養液中に含まれる、溶媒を除去した後の固形分の濃度である。
培養した細胞を顕微鏡下で撮影し、形態変化を評価した。
【００３１】
＜結果＞
図１に、結果を示す。１μｇ／ｍｌ以上の大黄を添加した場合に、星細胞は静式に近い状態で保たれていたことがわかる。
【００３２】
（１−２）「星細胞の形態に対するエモジンの効果」
大黄に換えてエモジン１、２、５μｇ／ｍｌを用いた以外は上記（１−１）と同様の手順で星細胞の形態に対するエモジンの影響を評価した。
【００３３】
＜結果＞
図２に、結果を示す。２μｇ／ｍｌ以上のエモジンを添加した場合に、星細胞は静式に近い状態で保たれていたことがわかる。
【００３４】
（１−３）「星細胞の増殖に対する大黄の効果」
星細胞の増殖に対する大黄の影響を評価するために、星細胞の細胞核への５’−ブロモ−２’−デオキシウリジン（ＢｒｄＵ）の取込みを、以下の手順により評価した。
培養液を血清非存在下にした上で、各種濃度（１，５，１０μｇ／ｍｌ）となるように大黄を添加し、培養星細胞を２４時間培養した。２４時間後、一旦培養液を交換して、再度、上記と同じ濃度の大黄を添加し、それと同時に、最終濃度１００μＭのＢｒｄＵを培養液に添加して、さらに２４時間培養した。コントロールとして、大黄を添加しなかった以外は同様の手順で星細胞を培養した。
培養終了後、細胞を、９５％エタノールと５％酢酸の混合溶液で固定した。
細胞核へのＢｒｄＵの取込みは、ＢｒｄＵを免疫染色した細胞を顕微鏡下で撮影し、全細胞中の、染色されている細胞（ＢｒｄＵが取込まれた細胞）の割り合いを計算して評価した。
【００３５】
＜結果＞
図３に、結果を示す。１μｇ／ｍｌ以上の大黄を添加した場合に、染色されている細胞（ＢｒｄＵ陽性細胞）が減少しており、有意にＢｒｄＵの取込みが阻害されたことがわかる。
【００３６】
（１−４）「星細胞の増殖に対するエモジンの効果」
大黄に換えてエモジン１、２、５μｇ／ｍｌを用いた以外は上記（１−３）と同様の手順で星細胞の増殖に対するエモジンの影響を評価した。
【００３７】
＜結果＞
図４に、結果を示す。コントロールでは１５．７％の星細胞がＢｒｄＵ陽性であったのに対し、２μｇ／ｍｌ以上のエモジンを添加した場合に有意にＢｒｄＵの取込みが阻害され、その割合は３．９％であった。
【００３８】
【発明の効果】
本発明の星細胞活性化抑制剤は、大黄、又はアントラキノン類もしくはそれらの誘導体を有効成分とするものであり、肝臓などに存在する星細胞の活性化を抑制することが可能である、臓器線維症の一因である星細胞の活性化を抑制することができるので、肝臓などの臓器において、慢性炎症後などに惹起される臓器線維症の予防又は治療剤としても有用である。
【図面の簡単な説明】
【図１】試験例１−１の結果を示す図である。
【図２】試験例１−２の結果を示す図である。
【図３】試験例１−３の結果を示す図及びグラフである。
【図４】試験例１−４の結果を示す図及びグラフである[0001]
TECHNICAL FIELD OF THE INVENTION
The present invention relates to an agent for suppressing the activation of stellate cells present in organs such as the liver and kidney, and an agent for preventing or treating organ fibrosis accompanying activation of stellate cells.
[0002]
Problems to be solved by the prior art and the invention
Organ fibrosis is a disease that occurs when cells in an organ are necrotic due to various causes such as viruses, alcohol, drugs, etc., do not sufficiently regenerate, increase connective tissue and become fibrotic, and cirrhosis, Renal sclerosis, pulmonary fibrosis and the like are known. When fibrosis progresses, it is no exaggeration to say that there is currently no treatment to improve the prognosis.
[0003]
Among organ fibrosis, cirrhosis progresses at a high rate from chronic hepatitis, and it is known that there is a high probability of transition to liver failure or liver cancer. It is important to control.
Regarding the prevention of cirrhosis, there are treatments using interferon and glycyrrhizin preparations. However, interferon preparations are expensive, only about 30% effective, and are only indicated for viral liver damage. Also, glycyrrhizin preparations require intravenous administration, and frequent administration to patients is difficult.
On the other hand, there are few reports on effective drugs for renal sclerosis.
[0004]
By the way, in recent years, the technology of separating and primary culturing liver constituent cells has made remarkable progress. Not only liver (parenchymal) cells but also non-parenchymal cells such as Kupffer cells, endothelial cells, stellate cells, pit cells, and bile duct epithelial cells can be separated from small animals such as rats and mice and humans. Numerous studies have been made on parenchymal cells. As a result, the importance of non-parenchymal liver cells in maintaining homeostasis of hepatocyte metabolism and hepatic local inflammatory response has been recognized, and in particular, the function of stellate cells has attracted attention.
[0005]
Stellate cells are considered to be cells derived from neural crest because they express GFAP (glial fibrillary acidic protein), nestin, N-CAM (neural cell adhesion molecule), prion and the like. It is known that hepatic stellate cells usually play a central role in vitamin A metabolism.
[0006]
When the inflammation caused by hepatitis or the like continues, the stellate cells undergo a functional change called "activation" and transform into myofibroblasts.
It has been clarified that phenomena such as the following 1) to 4) occur in the activated stellate cells.
1) Metabolism of extracellular matrix such as collagen and proteoglycan is activated.
2) Production of various growth factors that promote organ fibrosis, such as TGFβ (transforming growth factor β), is significantly increased.
3) The production of tissue inhibitor of MMP (TIMP), which is an inhibitor of matrix metalloprotease (MMP), is increased.
4) Receptor (PDGFRβ) for platelet-derived growth factor (PDGF) and receptor for insulin-like growth factor (IGF-I) (IGF-IRβ) are induced on the stellate cell membrane to promote the proliferation and migration of stellate cells Acquisition of Noh is seen.
[0007]
Therefore, it is considered that the activation of stellate cells is involved in organ fibrosis.In fact, a large number of activated stellate cells are present together with extracellular matrix in the fibrous septum of human chronic hepatitis and cirrhosis tissue. Confirmed to be present.
Therefore, if the activation of stellate cells can be suppressed, it is considered that organ fibrosis in cirrhosis and the like can be suppressed as well as reduced.
[0008]
Several attempts have been made to suppress the activation of stellate cells. For example, attempts to neutralize the action of endogenous TGFβ to suppress fibrosis by administering a soluble receptor for TGFβ, gene therapy to express dominant negative TGFβ receptor, PDGF receptor specific And development of specific tyrosine kinase inhibitors. However, no results have yet been published for clinical use.
Gene therapy using hepatocyte growth factor (HGF) having a morphogen action has also been proposed. However, it is not clear whether HGF can be applied clinically since long-term administration of HGF cannot promote the possibility of promoting carcinogenesis in various organs.
[0009]
On the other hand, as described above, although studies have been made on the molecular mechanism of liver fibrosis and its control strategy, analysis on organs such as kidney, lung, pancreas, spleen, and gastrointestinal tract is still limited.
However, it has already been confirmed that stellate cells also exist in these organs, and it is presumed that stellate cells are also involved in organ fibrosis such as renal sclerosis.
[0010]
Therefore, if activation of stellate cells can be suppressed, it is considered that not only liver but also fibrosis of various organs in which stellate cells exist, such as kidney and lung, can be suppressed. Therefore, an object of the present invention is to provide an agent for suppressing stellate cell activation which is effective and has few side effects, and an agent for preventing or treating organ fibrosis such as liver and kidney.
[0011]
[Means for Solving the Problems]
The present inventors have conducted intensive studies to achieve the above object, and as a result, rhubarb, or specific anthraquinones or derivatives thereof inhibit the activation and proliferation of stellate cells, and the reactivity of those cells to growth factors Was found to be extremely effective in attenuating, and led to the present invention.
[0012]
A first invention of the present invention for solving the above-mentioned problems is a stellate cell activation inhibitor comprising rhubarb as an active ingredient.
According to a second aspect of the present invention, which solves the above problems, the following general formula (I):
[0013]
Embedded image
[Wherein, R 1 represents a hydrogen atom, a hydroxy group or a methoxy group; R 2 represents a methyl group, a hydroxymethyl group or a carboxy group]
Is a stellate cell activation inhibitor containing an anthraquinone represented by the formula (1) or a derivative thereof as an active ingredient. The anthraquinones are preferably emodin.
A third invention of the present invention that solves the above-mentioned problems is a prophylactic or therapeutic agent for organ fibrosis comprising rhubarb as an active ingredient.
A fourth invention of the present invention that solves the above-mentioned problems has the following general formula (I):
[0015]
Embedded image
[0016]
[Wherein, R 1 represents a hydrogen atom, a hydroxy group or a methoxy group; R 2 represents a methyl group, a hydroxymethyl group or a carboxy group]
Or an anthraquinone or a derivative thereof represented by the formula (1) as an active ingredient. The anthraquinones are preferably emodin.
Further, the organ fibrosis is preferably any one of liver, kidney, pancreas, lung, spleen and colon fibrosis.
[0017]
BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION
Rhubarb is usually a rhizome, such as rhubarb (Rheum palmatum L.) and Ranulis (R. officinaleBail.) For anthers of the Polygonaceae family. It is one of the herbal medicines known for a long time. It is used as a laxative and a stomachic in many Kampo prescriptions, and is also consumed in large quantities as a laxative. The contained components include anthraquinones (chrysophanol, emodin, isoemodin, monomethyl ester of emodin, aloe-emodin, rhein, etc.) and their glycosides, dianthrones (sennosides A to F, senninidine A, etc.), tannins (catechin , Rattanin, epicatechol, etc.), stilbene glycosides, naphthalene glycosides, chromones and many other components have been identified.
The pharmacological effects of rhubarb include purgative effects, antibacterial effects, blood urea nitrogen (BUN) lowering effects, anticoagulant effects, anti-inflammatory effects, mutagenic effects, effects on cyclic nucleotides, interferon-inducing effects, and the like. However, there is no report relating to activation of stellate cells or organ fibrosis accompanying inflammation of organs such as liver and kidney.
[0018]
The anthraquinones used in the present invention are represented by the above general formula (I), and include chrysophanol (R 1 is a hydrogen atom, R 2 is a methyl group), emodin (R 1 is a hydroxy group, R 2 Is a methyl group, physion (R 1 is a methoxy group, R 2 is a methyl group), aloe-emodin (R 1 is a hydrogen atom, R 2 is a hydroxymethyl group), citreoserose (R 1 is a hydroxy group, R 2 is a hydroxymethyl group) ), Rhein (R 1 is a hydrogen atom, R 2 is a carboxy group) and the like.
These anthraquinones are naturally present in rhubarb, aloe, senna, etc., and their pharmacological actions include antibacterial action, diuretic action, etc. There are no reports related to organ fibrosis associated with inflammation of organs such as liver and kidney.
[0019]
In the present invention, rhubarb may be used as a powder obtained by drying and pulverizing the whole plant or rhizome as it is, or may be used in the form of a solvent extract.
Powdered rhubarb can be obtained, for example, as rhubarb powder from Tochimoto, Tsumura, or the like.
The solvent extract can be obtained by an extraction method generally used when extracting a plant-derived extract. That is, the whole or rhizome of rhubarb can be obtained as it is or after drying as necessary, and then used as it is or pulverized and subjected to solvent extraction to obtain a solvent extract (plant extract).
The extraction solvent is not particularly limited as long as it is generally used when extracting its components from plants. For example, hot water or water; lower alcohols such as ethanol, isopropyl alcohol, and n-butanol; Polyhydric alcohols such as propylene glycol and 1,3-butylene glycol; hydrates of these alcohols; and hydrocarbon solvents such as n-hexane and toluene. In particular, it is preferable to use water, ethanol or hydrated ethanol, since it can be used as it is for the preparation.
In the case of water, for example, in the case of water, the whole plant or rhizome is pulverized, water of 10 times by mass is added thereto, and the mixture is extracted at 95 ° C. for 15 to 30 minutes and left to stand for extraction. Thereafter, if necessary, the solvent extract may be appropriately concentrated and dried before use.
[0020]
In the present invention, anthraquinones are usually used in a free form, but need not be in a free form. Derivatives, that is, pharmacologically acceptable salts, for example, alkali metal salts such as sodium and potassium, calcium , Forms such as alkaline earth metal salts such as magnesium, ammonium salts, organic amine salts such as triethylamine and triethanolamine, and basic amino acid salts such as lysine and arginine, and are converted into free forms by hydrolysis in vivo. For example, in the form of an ester such as monomethylemodin, or in the form of a glycoside such as 1-glucoside or 8-glucoside.
Use of these derivatives in the form of a derivative is particularly effective when the solubility of the free form is low and there is a risk of precipitation.
[0021]
In the present invention, the effective dose of rhubarb required for exhibiting the effect of inhibiting activation of stellate cells is preferably 1 mg / kg or more, more preferably 10 to 1000 mg / kg of body weight per day. The effective dose of anthraquinones is preferably 0.2 mg / kg or more, more preferably 2 to 200 mg / kg of body weight per day.
[0022]
The stellate cell activation inhibitor of the present invention can also be used as an agent for preventing or treating organ fibrosis in an organ such as the liver to suppress the progress of organ fibrosis caused after chronic inflammation.
Organ fibrosis in which the agent for preventing or treating organ fibrosis of the present invention is used includes cirrhosis, renal sclerosis, pulmonary fibrosis, chronic pancreatitis, gastric ulcer, inflammatory bowel disease, and the like. is there.
[0023]
In the present invention, the effective dose of rhubarb required to exhibit the effect of suppressing organ fibrosis is preferably 1 mg / kg or more, more preferably 10 to 1000 mg / kg of body weight per day. The effective dose of anthraquinones is preferably 0.2 mg / kg or more, more preferably 2 to 200 mg / kg of body weight per day.
[0024]
The stellate cell activation inhibitor and the organ fibrosis inhibitor of the present invention are, in addition to the above-mentioned active ingredients, a drug containing a physiologically acceptable liquid or solid pharmaceutical carrier as long as the effects of the present invention are not impaired. It can be used as a composition.
As the pharmaceutical carrier, commonly used excipients, binders, disintegrants, lubricants, coating agents, dissolution aids, emulsifiers, suspending agents, stabilizers, solvents and the like can be added.
The pharmaceutical composition can take various formulation forms depending on the administration method.
The preparation is preferably in a form that can be taken orally, such as a solution, a syrup, a suspension, an emulsion, a tablet, a granule, a powder, a pill, and a capsule. It may be.
The stellate cell activation inhibitor and the organ fibrosis inhibitor of the present invention can be produced according to a standard method using rhubarb or anthraquinones or derivatives thereof and other optional components as raw materials.
As an administration method, any administration method such as oral, intravenous, transvenous, or rectal administration is possible, but oral administration is particularly preferable.
The amount of rhubarb, anthraquinones or their derivatives in the drug composition is not particularly limited, and may be appropriately determined according to the dosage form.
However, when rhubarb is used as a solvent extract and the stellate cell activation inhibitor is in the form of a solution, the compounding amount in the stellate cell activation inhibitor is 1 to 100 μg / ml, particularly 2 to 10 μg / ml. Is preferred. If the amount is less than 1 μg / ml, the effect of inhibiting the activation of stellate cells may not be sufficiently exerted. If the amount exceeds 100 μg / ml, there may be a problem in formulation. In addition, the said compounding quantity is a mass as dry matter after removing an extraction solvent.
Similarly, the amount of the anthraquinone or derivative thereof in the stellate cell activation inhibitor is preferably 1 to 10 μg / ml, particularly preferably 2 to 5 μg / ml.
[0025]
In addition, the stellate cell activation inhibitor and the organ fibrosis inhibitor of the present invention may be used by adding to food, in which case, in addition to the above, usually, a substance (antioxidant, Coloring agents, etc.).
[0026]
The stellate cell activation inhibitor and the organ fibrosis inhibitor of the present invention can be administered once or several times a day.
[0027]
In the present invention, rhubarb is currently mainly used as a laxative in an ordinary dose of 3 to 12 g / day, and anthraquinones are contained in rhubarb in an amount of 2 to 4% by mass (emodin in rhubarb is 0.1 to 1%). % By mass), the stellate cell activation inhibitor and the organ fibrosis inhibitor of the present invention are considered to be safe and less likely to cause side effects within the effective dose range. Also, it can be taken orally and can be used by adding it to various pharmaceuticals, foods, nutrients and the like.
When the inflammation caused by hepatitis or the like continues, the stellate cells undergo a functional change called "activation" and transform into myofibroblasts. Since the stellate cell activation inhibitor and the organ fibrosis inhibitor of the present invention can suppress the activation of stellate cells, they can not only suppress organ fibrosis in cirrhosis and the like, but also reduce it. It is considered possible.
[0028]
【Example】
The present invention and its effects are specifically described by the following test examples, but these do not limit the present invention.
In addition, in the following test examples, a large yellow powder obtained from Tsumura Corporation was used as the large yellow. Further, emodin used for biochemical research (purity: 95% or more) manufactured by SIGMA was used.
[0029]
<Test target>
Stellate cells isolated and cultured from rat liver.
<Method for separating and culturing stellate cells>
Stellate cells were isolated from rat liver according to a previously reported report (Kristensen DB, Kawada N, et al. Hepatology. 200032: 268-77). Briefly, the procedure was as follows: rat liver was perfused through the portal vein to bleed and then perfused with an enzyme solution containing collagenase and pronase for digestion. After removing the liver, it was further digested in the same enzyme solution as described above. After undigested cells were collected by centrifugation of the digestion product, the cells were mixed with an 8.2% Nycodenz solution and centrifuged at 3,200 rpm for 15 minutes to obtain stellate cells in the uppermost layer of the solution. The obtained stellate cells were washed by centrifugation, suspended in DMEM containing 10% fetal bovine serum, injected into a sterilized plastic petri dish, and cultured. The stellate cells adhered and grew on the petri dish.
The stellate cells were allowed to adhere to a 35 mm plate (Falcon 3003) in Dulbecco's MEM solution (manufactured by SIGMA) containing 10% fetal bovine serum for several days, and the cells per plate were incubated at 37 ° C. in the presence of 5% CO 2. Number: Cultured up to 7.5 × 10 5 cells. Stellate cells grew while changing cell morphology when cultured in the presence of serum.
[0030]
Test Example 1: Liver-derived stellate cell (1-1) "Effect of rhubarb on morphology of stellate cell"
The effect of rhubarb on stellate cell morphology was evaluated by the following procedure.
After the culture solution was in the absence of serum, a solution prepared by dissolving large yellow powder in DMSO (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) so as to have various concentrations (1, 5, 10 μg / ml) was added, followed by culturing. Stellate cells were cultured for 48 hours. As a control, stellate cells were cultured in the same procedure except that rhubarb was not added. The concentration of rhubarb is the concentration of solids contained in the culture solution after removing the solvent.
The cultured cells were photographed under a microscope to evaluate morphological changes.
[0031]
<Result>
FIG. 1 shows the results. It can be seen that the stellate cells were kept in a nearly static state when rhubarb of 1 μg / ml or more was added.
[0032]
(1-2) “Effect of emodin on stellate cell morphology”
The effect of emodin on the morphology of stellate cells was evaluated in the same procedure as in (1-1) above, except that emodin 1, 2, 5 μg / ml was used instead of rhubarb.
[0033]
<Result>
FIG. 2 shows the results. It can be seen that when 2 μg / ml or more of emodin was added, the stellate cells were kept in a nearly static state.
[0034]
(1-3) "Effect of rhubarb on proliferation of stellate cells"
To evaluate the effect of rhubarb on stellate cell proliferation, incorporation of 5'-bromo-2'-deoxyuridine (BrdU) into the nuclei of stellate cells was evaluated by the following procedure.
After the culture solution was in the absence of serum, rhubarb was added to various concentrations (1, 5, 10 μg / ml), and the cultured star cells were cultured for 24 hours. Twenty-four hours later, the culture medium was changed once, and the same concentration of rhubarb was added again, and at the same time, BrdU having a final concentration of 100 μM was added to the culture medium, followed by culturing for another 24 hours. As a control, stellate cells were cultured in the same procedure except that rhubarb was not added.
After completion of the culture, the cells were fixed with a mixed solution of 95% ethanol and 5% acetic acid.
BrdU incorporation into cell nuclei was evaluated by photographing cells immunostained for BrdU under a microscope and calculating the percentage of cells stained (BrdU-incorporated cells) in all cells.
[0035]
<Result>
FIG. 3 shows the results. When rhubarb at 1 μg / ml or more was added, the number of stained cells (BrdU-positive cells) decreased, indicating that BrdU uptake was significantly inhibited.
[0036]
(1-4) “Effect of emodin on proliferation of stellate cells”
The effect of emodin on the proliferation of stellate cells was evaluated in the same procedure as in the above (1-3) except that emodin 1, 2, 5 μg / ml was used instead of rhubarb.
[0037]
<Result>
FIG. 4 shows the results. In the control, 15.7% of stellate cells were BrdU-positive, whereas when 2 μg / ml or more of emodin was added, BrdU incorporation was significantly inhibited, and the ratio was 3.9%.
[0038]
【The invention's effect】
The stellate cell activation inhibitor of the present invention contains rhubarb, or anthraquinones or a derivative thereof as an active ingredient, and can suppress the activation of stellate cells present in the liver and the like. Since it can suppress the activation of stellate cells, which contribute to the disease, it is also useful as a preventive or therapeutic agent for organ fibrosis caused by chronic inflammation in organs such as the liver.
[Brief description of the drawings]
FIG. 1 is a diagram showing the results of Test Example 1-1.
FIG. 2 is a diagram showing the results of Test Example 1-2.
FIG. 3 is a diagram and a graph showing the results of Test Example 1-3.
FIG. 4 is a diagram and a graph showing the results of Test Examples 1-4.
