JP2004081216A - 網膜芽腫−関連タンパク質をコードする細胞性遺伝子 - Google Patents

Abstract

【課題】　網膜芽種遺伝子の細胞内関係部分を同定し特徴づけること。
【解決手段】　網膜芽腫−関連タンパク質をコードする単離した核酸分子、および転写因子Ｅ２Ｆの生物学的活性およびＲＢ−結合活性を有する単離されたタンパク質。網膜芽腫−関連タンパク質をコードする単離された核酸分子を含むベクター。；そのようなベクターを含む哺乳動物細胞。；網膜芽腫−関連タンパク質に対する抗体；およびそのようなタンパク質に対するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマライン。ならびに、そのような抗体を診断におよび予知に用いる方法。
【選択図】　図４

Description

　本発明は、網膜芽腫−関連タンパク質をコードする細胞性遺伝子の分子クローニングに関する。より特定的な局面では、本発明は転写因子Ｅ２Ｆの特性を有する遺伝子の同定に関する。

　本出願を通じて、種々の出版物をかっこ内の部分的な引用によって参照する。これらの出版物の開示は全体として、本発明が属する技術の状態をより完全に記載するために本出願中に参考として援用される。

　網膜芽種遺伝子（ＲＢ）は、同定された最初の腫瘍サプレッサー遺伝子であり、脊椎動物に遍在的に発現する核リンタンパク質をコードする（Ｆｒｉｅｎｄら、１９８６；Ｌｅｅら、１９８７ｂ；Ｆｕｎｇら、１９８７）。この遺伝子の正常な機能を不活性化する突然変異は１００％の網膜芽種においてのみならず、小細胞性肺癌（Ｈａｒｂｏｕｒら、１９８８　；Ｙｏｋｏｔａ　ら、１９８８）、骨内種（Ｔｏｇｕｃｈｉｄａら、１９８８）、膀胱癌（Ｈｏｒｏｗｉｔｚら、１９８９）、前立腺癌（Ｂｏｏｋｓｔｅｉｎら、１９９０ａ）および胸部癌（Ｌｅｅら、１９８８）を含む多くの他の成人癌においても発見されていた。多様なＲＢ−欠乏腫瘍細胞と野生型ＲＢとの再構成は、ヌードマウスに腫瘍を形成させる能力を含むその新生物表現型を抑制する（Ｈｕａｎｇら、１９８８；Ｓｕｍｅｇｉら、１９９０；Ｂｏｏｋｓｔｅｉｎら、１９９０ｂ；Ｌｅｅら、１９９０；Ｇｏｏｄｒｉｃｈら、１９９２；Ｔａｋａｈａｓｈｉら、１９９１；Ｃｈｅｎら、１９９２）。これらの結果は、ＲＢタンパク質が信頼し得る腫瘍抑制剤であるという直接的な証拠を提供する。

　ＲＢは、細胞周期の初期Ｇ１／Ｇ０期においていくつかの観察により実証された機能を成し遂げる：第一に、おそらくはＣｄｋキナーゼファミリーの一構成部によるＲＢのリン酸化（Ｌｉｎら、１９９１；Ｌｅｅら、１９９１）が細胞周期でのゆらぐこと（Ｃｈｅｎら、１９８９；Ｂｕｃｈｋｏｖｉｃｈら、１９８９；ＤｅＣａｐｒｉｏら、１９８９）；第二に、未リン酸化型ＲＢがＧ０／Ｇ１期において支配的に存在すること（Ｃｈｅｎら、１９８９；ＤｅＣａｐｒｉｏら、１９８９）；第三に、未リン酸化型ＲＢの初期Ｇ１期にある細胞内へのマイクロインジェクションが、それらのＳ期への進行を妨げること（Ｇｏｏｄｒｉｃｈら、１９９１）。これらの観察は、ＲＢが細胞周期内への侵入の臨界的な調節因子として働き得、そして正常細胞におけるその不活性化は不規則な増殖を導くことを示す。

　ＲＢがどのように機能するかが、真剣な調査の主題である。ＲＢタンパク質の２つの既知の生化学的特性が、記載されていた；一つは、そのＣ−末端３００アミノ酸残基に位置した固有のＤＮＡ結合活性である（Ｌｅｅら、１９８７ｂ；Ｗａｎｇら、１９９０ｂ）；他はその、ＤＮＡ腫瘍ウィルスのいくつかの腫瘍タンパク質と相互作用する能力である（ＤｅＣａｐｒｉｏら、１９８８；Ｗｈｙｔｅら、１９８８；Ｄｙｓｏｎら、１９８９）。この相互作用は、Ｔ−結合ドメインとして示されるアミノ酸３７９−５４５および５７５−６７８において、２つの不連続な領域に位置づけられた（Ｈｕら、１９９０；Ｈｕａｎｇら、１９９０）。興味深いことに、腫瘍中のＲＢタンパク質の突然変異は、しばしばこれらの同じ領域に位置していた（ＢｏｏｋｓｔｅｉｎおよびＬｅｅ、１９９１）。これらの結果はＲＢタンパク質のＴ−結合ドメインが機能的に重要でありそしてＲＢとこれら腫瘍タンパク質との相互作用が深遠な生物学的意義を有し得ることを意味する。ＴのＲＢへの結合を模倣する細胞性タンパク質の同
定により、潜在的に複雑なネットワークがしめされた。ｃ−ｍｙｃ（Ｒｕｓｔｇｉら、１９９１）、Ｒｂ−ｐ１，ｐ２（Ｄｅｆｅｏ−Ｊｏｎｅｓら、１９９１）を含むいくつかのタンパク質、および８−１０の他のタンパク質（Ｋａｅｌｉｎら、１９９１；　Ｌｅｅら、１９９１　Ｈｕａｎｇら、１９９１）が、ｉｎ　ｖｉｔｒｏ　でＲＢに結合することが示された。

　前記が証明するように、網膜芽種遺伝子の細胞内関係部分を緊急に同定し特徴づけることが必要なことは明白である。本発明はこの要求を満たし、関連する長所を同様に提供する。

　本発明は、網膜芽腫−関連タンパク質をコードする単離された核酸分子、および、転写因子Ｅ２Ｆ生物学的活性およびＲＢ−結合活性を有する単離されたタンパク質を提供する。

　本発明はさらに、細菌細胞、酵母細胞、または哺乳動物細胞での発現に適合した網膜芽腫−関連タンパク質をコードするＤＮＡ分子を含むプラスミドおよびウィルスのようなベクターを提供する。

　本発明は、網膜芽腫−関連タンパク質をコードするＤＮＡ分子を含む哺乳動物の細胞を提供する。

　本発明は、網膜芽腫−関連タンパク質に特異的に結合可能な抗体を提供する。本発明はまた、モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマセルラインおよびこれらの抗体を診断および予知に用いる方法を提供する。

　本発明によれば、網膜芽種−関連ポリペプチドをコードする、単離された核酸分子が提供される。

　好適な実施態様に於いては、コードされた網膜芽種−関連ポリペプチドが転写因子Ｅ２Ｆの生物学的活性を有する、単離された核酸分子が提供される。

　さらに好適な実施態様に於いては、コードされた網膜芽種−関連ポリペプチドがＲＢ結合活性を有する、単離された核酸分子が提供される。

　さらに好適な実施態様に於いては、前記核酸分子が、ＤＮＡ分子、ｃＤＮＡ分子、またはＲＮＡ分子である、単離された核酸分子が提供される。

　さらに好適な実施態様に於いては、ストリンジェント条件下でハイブリッド形成して、単離された核酸分子を形成する、核酸分子が提供される。

　さらに好適な実施態様に於いては、網膜芽種−関連ポリペプチドをコードする、単離された核酸分子によってコードされた、単離および精製されたポリペプチドが提供される。

　さらに好適な実施態様に於いては、コードされた網膜芽種−関連ポリペプチドが転写因子Ｅ２Ｆの生物学的活性を有する、単離された核酸分子によってコードされた、単離および精製されたポリペプチドが提供される。

　さらに好適な実施態様に於いては、コードされた網膜芽種−関連ポリペプチドがＲＢ結合活性を有する、単離された核酸分子によってコードされた、単離および精製されたポリペプチドが提供される。

　さらに好適な実施態様に於いては、網膜芽種−関連ポリペプチドをコードする、単離された核酸分子を含む、ベクターが提供される。

　さらに好適な実施態様に於いては、前記ベクターを含む、プラスミドが提供される。

　さらに好適な実施態様に於いては、前記ベクターを含む、ウィルスが提供される。

　さらに好適な実施態様に於いては、前記ベクターを含む、宿主細胞が提供される。

　さらに好適な実施態様に於いては、前記宿主細胞が細菌、酵母細胞、または哺乳動物細胞である、宿主細胞が提供される。

　さらに好適な実施態様に於いては、前記細胞核内にある、網膜芽種−関連ポリペプチドに特異的に結合し得る、抗体が提供される。

　さらに好適な実施態様に於いては、前記抗体の、免疫学的に活性なポリペプチドフラグメントが提供される。

　さらに好適な実施態様に於いては、前記抗体がモノクローナル抗体である、抗体が提供される。

　さらに好適な実施態様に於いては、前記抗体が検出可能なマーカーで標識された、抗体が提供される。

　さらに好適な実施態様に於いては、検出可能なマーカーで標識された、前記抗体を産生する、ハイブリドーマセルラインが提供される。

　さらに好適な実施態様に於いては、以下の　ａ、ｂ　および　ｃ　を含む試料中の網膜芽種−関連タンパク質を検出する方法が提供される：
ａ．　抗体−抗原複合体を形成させる条件下で、請求項１４の抗体を試料と接触させる方法；　ｂ．　形成されたすべての複合体の存在を検出する方法；　ｃ．　該複合体の存在が試料中の網膜芽種−関連タンパク質の存在を指示する方法。

　さらに好適な実施態様に於いては、網膜芽種−関連タンパク質を組換えにより産生する方法であって、該タンパク質を産生する好適な条件下で前記ベクターを含む、宿主細胞を増殖し、およびそのようにして得られた該タンパク質を回収および精製する方法を包含する、方法が提供される。

　さらに好適な実施態様に於いては、組換えにより産生した、網膜芽種−関連タンパク質が提供される。

　本発明によれば、前記が明白に証明するような、網膜芽種遺伝子の細胞内関係部分を緊急に同定し特徴づけることの必要性を満たし、関連する長所が同様に提供される。

　網膜芽種タンパク質は多くの細胞性タンパク質と相互作用して、正常な生理的機能に対して決定的であり得る複合体を形成する。これらのタンパク質を同定するために、９つの異なる遺伝子ｃＤＮＡを、精製したＲＢタンパク質をプローブとして用いるｃＤＮＡ発現ライブラリーの直接スクリーニングによりクローンした。これらのクローンの仮の特徴づけは、これらの遺伝子の大部分が新規のタンパク質をコードすることを示す。それらの１つ、Ａｐ１２は、細胞周期依存型の　２．８　Ｋｂ　ｍＲＮＡを発現する。

　Ａｐ１２の最長ｃＤＮＡの単離物は、転写因子に特徴的ないくつかの特徴をもつ４７６のアミノ酸からなる推定タンパク質をコードする。Ａｐ１２のＣ−末端の１１４アミノ酸は未リン酸化ＲＢと、Ｔ−抗原が結合して転写活性化活性を有するのと類似の領域で結合する。

　Ｎ−末端付近の領域は、塩基性残基と側面を接する推定ロイシンジッパーを含み、Ｅ２Ｆと同起源の配列に特異的に結合可能である。サル腎臓ＣＶ１細胞におけるＡｐ１２の発現は、Ｅ２Ｆ−依存性転写活性を著明に増強した。Ｅ２Ｆ遺伝子がクローンされておらず、その同一性が特異的なＤＮＡを認識して結合する能力のみに基づいているにもかかわらず、これらの結果は新規なクローン転写因子Ｅ２Ｆの既知の特性を有しＲＢに結合するタンパク質をコードすることを確立する。

　それゆえに、本発明は網膜芽腫−関連タンパク質をコードする単離された核酸分子を提供する。ここで用いる、用語「単離された核酸分子」は、自然界には発生しない形態の核酸分子に関する。ヒト網膜芽腫核酸分子を単離する１つの手段は、当業者に公知の方法（Ｍａｎｉａｔｉｓら、（１９８９）参照、ここに参考として援用される）を用いて、自然のまたは人為的に設計された網膜芽種に対する抗体でヒトｃＤＮＡ発現ライブラリーをプローブすることである。ヒト網膜芽腫−関連ポリペプチドをコードするＤＮＡおよびｃＤＮＡ分子は、ヒト、哺乳類または他の動物起源の相補ゲノムのＤＮＡ、ｃＤＮＡまたはＲＮＡを得るために用い得る。単離された核酸はまた、ｃＤＮＡライブラリーをスクリーンしてＲＢ−関連タンパク質をコードする他の遺伝子を単離するのに用い得る。

　本発明は、ＤＮＡ結合およびＲＢ結合活性を有する可溶性の網膜芽種−関連ポリペプチドを提供する。例示の目的だけのために、このポリペプチドをコードする核酸配列が図４および１０−１５において同定される。可溶性の網膜芽種−関連ポリペプチドをコードする核酸配列は、図４および１０−１５に示される配列中に含まれる。

　ここで用いる「網膜芽種−関連ポリペプチド」は、ＤＮＡ結合活性とＲＢ−結合活性とを有するポリペプチドを意味する。網膜芽種−関連ポリペプチドの例は、図４に示されるクローンＡｐ１２のアミノ酸配列、またはクローンＡｐ　２，４，８，１０および１５、またはそれらの活性フラグメントの核酸配列によりコードされたアミノ酸配列と、実質的に同一である。ここで用いる「活性フラグメントまたは生物学的−活性フラグメント」は、図４に示す網膜芽種−関連ポリペプチド、または図１０−１５に示すクローンＡｐ　２，４，８，１０および１５によりコードされたポリペプチドのすべての部分に関する。ポリペプチドがＲＢに結合し得るかどうかを検定する方法は当業者に知られており、例えば、本出願に示される。

　ここで用いる、用語「精製した」は、本来のまたは自然の環境に通常伴う汚染物質を実質的に含まない分子または化合物を意味する。ここで開示した精製したポリペプチドは、可溶性ポリペプチドを含む。例えば、精製した可溶性ポリペプチドは、多くの方法によって得られ得る。タンパク質の精製に有用な方法は、沈澱、ゲル濾過、イオン交換、逆相およびアフィニテイークロマトグラフィーを含む。他の公知の方法は、Ｄｅｕｔｓｃｈｅｒら、　Ｇｕｉｄｅ　ｔｏ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ：　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ　Ｖｏｌ．　１８２，　（Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ　１９９０）に記載されており、ここに参考として援用する。その代わりに、本発明の精製したポリペプチドはまた、例えば、ここに参考として援用したＭａｎｉａｔｉｓら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ：　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ　第２版（Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　１９８９）に記載されているような公知の組換え法によっても得られ得る。この、可溶性網膜芽種−関連ポリペプチドを調製する手段の一つの例は、網膜芽種−関連ポリペプチドをコードする核酸を細菌、酵母または哺乳動物細胞のような好適な宿主細胞中に、公知の技術を用いて発現することであり、発現した可溶性タンパク質を、再び公知の技術を用いて回収することである。可溶性ポリペプチドおよびその生物学的に活性なフラグメントは化学合成によっても生成され得る。合成ポリペプチドは、Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，　Ｉｎｃ．製Ｍｏｄｅｌ　４３０Ａまたは４３１Ａ自動ポリペプチドシンセサイザーおよび業者によって提供される化学を用いて生成し得る。可溶性ポリペプチドはまた、以下にさらに詳細に記載する発現ベクターによって形質転換された細胞から直接単離し得る。

　本発明はまた、図に示す核酸分子とは異なるが同じ表現型の効果のある核酸分子を含む。これらの変性した、しかし表現型としては等価の核酸分子を、「等価の核酸分子」と呼ぶ。本発明はまた、本願上記記載の核酸分子と比較したときそれによって産生されるポリペプチドの表現型を変性しない、非−コード化領域における変化よって特徴づけられた核酸分子を含む。本発明はさらに、ハイブリッド化して本発明の核酸分子を形成する核酸分子を含む。ここで用いる用語「核酸」は、一本鎖および二本鎖のＤＮＡおよびｃＤＮＡと同様にＲＮＡを含む。加えて、ここで用いる用語「ポリペプチド」は、人工的な組換え型と同様にすべての自然発生の対立遺伝子変異体を含む。

　本発明はさらに、他の調節配列と同様に、ＲＮＡ転写のプロモーターに作動的に連鎖した単離核酸分子を提供する。ここで用いる用語「作動的に連鎖した」は、プロモーターがＲＮＡ転写を指示して核酸分子を離すようにする状態で位置することを意味する。そのようなプロモーターの例は、ＳＰ６、Ｔ４、およびＴ７である。プロモーターおよび挿入ＤＮＡ片がそのプロモーターに作動的に連鎖したクローニング部位の両方を含むベクターは、当業者に知られている。好ましくは、これらのベクターはｉｎ　ｖｉｔｒｏまたはｉｎ　ｖｉｖｏでのＲＮＡ転写をなし得る。そのようなベクターの例は、ｐＧＥＭシリーズ（Ｐｒｏｍｅｇａ　Ｂｉｏｔｅｃｈ；　Ｍａｄｉｓｏｎ，　ＷＩ）である。

　本発明は、網膜芽種−関連ポリペプチドをコードする単離核酸分子を含むベクターを提供する。ベクターの例は、バクテリオファージ、バキュロウィルスおよびレトロウィルスのようなウィルス、コスミド、プラスミドまたは他の組換えベクターである。核酸分子を当業者に知られる方法でベクターゲノム中に挿入する。例えば、挿入物およびベクターＤＮＡを双方とも制限酵素に当て、両分子の相補的末端にそれぞれ対をなす塩基を作り出させて、次にリガーゼと結合させる。その代わりに、合成核酸リンカーをベクターＤＮＡの制限部位に対応する挿入ＤＮＡに結合させ得、次に特別なヌクレオチド配列を認識する制限酵素で消化する。その他に、終止コドンを含むオリゴヌクレオチドおよび適切な制限部位を、以下のいくつかまたはすべてを含むベクター内に挿入するために、結合し得る。そのようなベクターとは例えば：哺乳動物細胞における安定または一過性トランスフェクタントを選択するネオマイシン遺伝子のような選択マーカー遺伝子；ヒトサイトメガロウィルス（ＣＭＶ）の即時初期遺伝子から得た高レベルの転写のためのエンハンサー／プロモーター配列；ｍＲＮＡ安定性のためのＳＶ４０から得た転写終止およびＲＮＡプロセシングシグナル；ＳＶ４０ポリオーマの複製起点および正しいエピソーム複製のためのＣｏ１Ｅ１；多用途多重クローニング部位；およびセンスおよびアンチセンスＲＮＡのｉｎ　ｖｉｔｒｏ転写のためのＴ７およびＳＰ６　ＲＮＡプロモーター。用い得る他の手段は当業者に公知である。

　また、細菌細胞、酵母細胞、哺乳動物細胞および他の動物細胞中で発現するように適合した、ヒト網膜芽腫−関連ポリペプチドをコードするＤＮＡ分子を包含するベクターを提供する。このベクターは他に、細菌、酵母、哺乳類または他の動物細胞中のＤＮＡを発現するのに必要で、かつ網膜芽腫−関連ポリペプチドをコードするＤＮＡを発現するようそのＤＮＡに関連して位置づけられた調節成分を含む。発現に必要な調節成分は、ＲＮＡポリメラーゼに結合するプロモーター配列およびリボソーム結合の転写開始配列を含む。例えば、細菌性発現ベクターは、ｌａｃ　プロモーターのようなプロモーターおよび転写開始のためのＳｈｉｎｅ−Ｄａｌｇａｒｎｏ配列および開始コドンＡＵＧ（Ｍａｎｉａｔｉｓら、前記、１９８９）を含む。同様に、真核性発現ベクターは、ＲＮＡポリメラーゼＩＩの異種または同種プロモーター、下流ポリアデニル化シグナル、開始コドンＡＵＧ、およびリボソーム剥離の終止コドンを含む。そのようなベクターは、商業的に入手されるかまたは当業者に知られる方法、例えば一般的にベクターを構築するための上記の方法に記載された配列によって集められ得る。発現ベクターはポリペプチドを発現する細胞を産生するのに有用である。

　本発明は、宿主細胞、例えばヒト網膜芽腫−関連ポリペプチドをコードする核酸分子を含む哺乳動物細胞を、提供する。例えば哺乳動物細胞中で発現するために適合したプラスミドを含む哺乳動物細胞である。プラスミドは、網膜芽腫−関連ポリペプチドをコードする核酸分子およびポリペプチドの発現に必要な調節成分を有する。例えば、マウス繊維芽細胞ＮＩＨ３Ｔ３、ＣＨＯ細胞、ＨｅＬａ細胞、Ｌｔｋ−細胞などを含む、種々の哺乳動物細胞が宿主として有用であり得る。上に記載されたような発現プラスミドを、リン酸カルシウム沈降、ＤＥＡＥ−デキストラン、電気穿孔法またはマイクロインジェクションのような当業者に知られた方法で哺乳動物細胞をトランスフェクトするのに用い得る。

　また、抗−Ａｐ１２抗体またはすべての網膜芽腫−関連ポリペプチドと特異的な反応性を有する抗体のような、本発明の網膜芽腫−関連ポリペプチドと特異的な反応性を有する抗体を提供する。抗体の免疫学的に活性なフラグメントは、「抗体」の定義中に含まれる。免疫学的に活性なフラグメントの同定は、例えば以下に記載するように行い得る。本発明の抗体は、当業者に知られたどの方法によっても産生し得る。例えば、ポリクローナルおよびモノクローナル抗体が、以下に記載する当業者に知られた方法、例えば、ここに参考として援用したＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ　（Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　１９８８）にある方法によって産生し得る。ポリペプチド、特に本発明の網膜芽腫−関連ポリペプチドは、そのような抗体の生成において免疫抗原として用い得る。キメラ性、ヒト型、ＣＤＲ−移植または二機能性抗体のような変性抗体もまた、当業者によって知られる方法によって産生し得る。そのような抗体は、例えばＭａｎｉａｔｉｓらによってここに参考として援用した上に記載された中の、ハイブリドーマ、化学合成または組換え法によっても産生し得る。これらの抗体は、本発明の網膜芽腫−関連ポリペプチドの存在を決定するため、または精製のために使用され得る。そのようなポリペプチドに関しては、これらの抗体を、ｉｎ　ｖｉｔｒｏ　診断または機能性ＲＢタンパク質の喪失を伴う病理の診断または予知のためのｉｎ　ｖｉｖｏ　イメージング法に用い得る。

　試料中の標的とする網膜芽腫−関連ポリペプチドのｉｎ　ｖｉｔｒｏ　検出に有用な免疫学的方法は、検出可能な抗体を用いるイムノアッセイを含む。そのようなイムノアッセイは、例えば、当業者に知られるＥＬＩＳＡ、Ｐａｎｄｅｘマイクロフルオリメトリックアッセイ、凝集反応アッセイ、フローサイトメトリー、血清診断アッセイおよび免疫組織化学的染色法を含む。抗体は、当業者に知られる種々の方法によって検出可能となる。例えば、検出可能なマーカーを、直接または間接に抗体に取り付け得る。有用なマーカーは、例えば、放射性核種、酵素、発蛍光団、色原体、および化学発光ラベルを含む。

　（実施例１：　ＲＢ−関連タンパク質の同定）
　ＲＢ機能の最も簡単なモデルは、細胞機能において中心的な役割を演ずる相対的にごく僅かな標的分子が網膜芽腫タンパク質によって調節されることである。リン酸化（Ｃｈｅｎら、１９８９；ＤｅＣａｐｒｉｏら、１９８９）、突然変異（Ｓｈｅｗら、１９９０）または癌タンパク質摂動（ＤｅＣａｐｒｉｏら、１９８８；Ｇｏｏｄｒｉｃｈら、１９９１；Ｗｈｙｔｅら、１９８８）、の３つの方法のうちのいずれか１つによるＲＢの不活化は、潜在的にＲＢ結合を分離し、不規則な増殖へ導き得た。この報告までは、無論、機能未知の２つのタンパク質、ｐ１およびｐ２、ｍｙｃタンパク質および８−１０の他の未同定タンパク質のような、限られた数の分子がＲＢと相互作用し得ることが知られるのみであった。遺伝学的および生化学的にＲＢネットワークを分析するために、ＲＢの相互作用相手をコードする遺伝子をできるだけ多く同定することが不可欠である。クローニングの可能性を最大にするため、２つの異なるアプローチを企てた。一つのアプローチでは、Ｆｉｅｌｄおよび彼の同僚によって開発された（ＦｉｅｌｄｓおよびＳｕｎｇ、１９８９）ｉｎ　ｖｉｖｏでのタンパク質−タンパク質相互作用を選択する酵母ＧＡＬ４系に基づいた　２−ハイブリッド法を用いる。ここに記載した他のアプローチでは、λｇｔ１１　ｃＤＮＡ発現ライブラリーをスクリーンするＲＢ−サンドイッチを用いた。このワン−ステップＲＢ−サンドイッチ法を用いることの利点は、簡単であること、直接的なことにあり、単離されたクローンは、潜在する架橋タンパク質なしに直接ＲＢと相互作用する融合タンパク質をコードし得た。スクリーニングは、ＳＶ４０ラージＴ抗原を陽性対照として用いて行った。Ｔ抗原を発現するλｇｔ１１ファージを、この目的のために構成し、そしてＲＢおよびＴの会合体は本法により容易に検出され得る。

　このアプローチを用いて、９つのクローンを単離した。これらのクローンによりコードされたすべてのタンパク質を、核内に配置した。これは、生物学的に重要な方法でＲＢと相互作用し得るすべてのタンパク質に対する重要な基準である。なぜなら相互作用は、おそらくは核内で起こるから（Ｌｅｅら、１９８７ｂ）である。

　（実施例２：　ＲＢタンパク質による調節の標的としての転写因子）
　ＲＢの細胞機能が細胞のＧ１への侵入を制限すること（Ｇｏｏｄｒｉｃｈら、１９９１）であるならば、Ｇ１進行およびＳ期への進入に対して重要な遺伝子は、ＲＢによって直接または間接に調節されなければならない。転写因子Ｅ２Ｆは、細胞周期依存性の方法で、Ｇ０／Ｇ１期には優勢であるがＳ期またはＭ期には優勢でないタイトな会合体でＲＢに会合することが知られている（Ｍｕｄｒｙｊら、１９９１；Ｓｈｉｒｏｄｋａｒら、１９９２）。ｍｙｃ、ＤＨＦＲ、およびｍｙｂを含むいくつかの遺伝子が、Ｅ２Ｆ転写制御にかけられ得る（Ｈｉｅｂｅｒｔら、１９８９；Ｍｕｄｒｙｊら、１９９０）。ＲＢがＧ０／Ｇ１期のＥ２Ｆを不活性なコンフォーメーションで隔離することを企てるのは合理的である。ＲＢ複合体からの放出は、Ｅ２Ｆ　ＤＮＡ−結合部位および転写機構全般との相互作用を通して標的遺伝子に影響し得る活性なコンフォーメーションを仮定せしめる。重要な挑戦は、Ｅ２Ｆ標的遺伝子の同一性を決定し、細胞周期の制御におけるそれらの役割を確かめることである。

　この簡単なＲＢ機能のモデルを支持する証拠は増加しており、９つの新しくクローンされたＲＢ関連タンパク質の収集において、一つはリボソームＲＮＡプロモーターを認識して結合し、ＳＬ１との協同的な相互作用を通してＲＮＡポリメラーゼに仲介される転写を活性化する（Ｊａｎｔｚｅｎら、１９９０）、既知の真核性の上流結合因子（ＵＢＦ）であり、他は、Ｅ２Ｆ転写因子に対して企てられたＲＢ−関連タンパク質と矛盾しない特性を有するＡｐ１２であることの発見で、このモデルは現在はさらに支持される。血漿による刺激後６時間中のＡｐ１２　ｍＲＮＡの蓄積は、遅延−早期増殖応答遺伝子の発現パターンと一致する（ＬａｕおよびＮａｔｈａｎｓ、１９９１）。Ａｐ１２　ｍＲＮＡの最大レベルはＧ１／Ｓ境界において蓄積し、細胞のＳ期への侵入の制御における役割を有することを確立した。また、このタンパク質は、未リン酸化ＲＢと、Ｔが結合するのと類似のドメインにおいてのみ結合する。最も興味あることには、Ａｐ１２はＥ２Ｆと同源の配列を認識し、そしてそのような特異的な配列を運ぶプロモーターをトランス活性する。

　（実施例３：Ａｐ１２は、推定ｂＺＩＰ転写因子をコードする）
　この遺伝子の予備特性付けから、最も長いオープンリーディングフレームから推定された推定タンパク質は、開始メチオニンはまだ判明していないが、４７６アミノ酸の長さである。この推定タンパク質の予測分子量は約５１ｋｄであり、これは、抗Ａｐ１２抗体により免疫沈降される６０ｋｄのタンパク質に近い。ＲＢタンパク質に結合し、トランス活性化活性を有するＡｐ１２のＣ末端領域は、非常に酸性であり、ＧＡＬ４およびＶＰ１６（Ｓａｄｏｗｓｋｉら、１９８８；　ＭｉｔｃｈｅｌｌおよびＴｊｉａｎ，　１９８９）のような、いくつかの公知の転写因子のトランス活性化ドメインの特徴である。ＤＮＡ結合ドメインは、塩基性アミノ酸範囲によって両端に隣接されている、推定上のロイシンジッパーモチーフを特徴づけるタンパク質中央の領域に位置していると考えられる。Ａｐ１２は、Ｅ２Ｆの特徴であるほとんどの特徴を有するので、Ｅ２ＦかＥ２Ｆ族のタンパク質のいずれかをコードすると考えられ得る。従って、Ｅ２Ｆはまた細胞増殖（例えば、ｆｏｓおよびｊｕｎ）および分化（例えば、Ｃ／ＥＢＰ）に密接に関連する一クラスの転写因子であるので、Ｅ２Ｆはまた、興味のあるｂＺＩＰタンパク質であるようだ。ｂＺＩＰ族のもう一つの特徴は、Ｅ２Ｆの制御に調節の新しい層を加える、メンバー中のヘテロ二量体会合体の多様な配列を形成する傾向である。

　この多様な配列の可能性は、細胞周期の完ぺきな制御にかかわるタンパク質を複雑に調節するために、細胞に対してほとんど無限の機会を提供する。Ａｐ１２／Ｅ２Ｆクローンの有用性は、ＲＢ、Ｅ２Ｆおよび細胞増殖間の関係の解明を、さらに容易にする。

　ＲＢの細胞関連物の同定、およびＲＢ相互に作用する細胞ネットワークの解明を始めるために、ＲＢ関連タンパク質をコードする遺伝子をクローン化するいくつかの研究がなされた。本明細書に記載されている事は、これらの研究のうちの一つからの結果、すなわちプローブとしてＲＢを用いたλｇｔ１１発現ライブラリーのスクリーニングである。９つの個別の遺伝子をクローン化し、その一つであるのＡｐ１２は、転写因子Ｅ２Ｆをコードすることを示唆する特徴を有する。クローンＡｐ　２、４、８、１０、１２、および１５は全てＲＢ関連タンパク質をコードし、およびすべて細胞周期の制御にかかわる。

　（実施例４：ＲＢ関連タンパク質（ＲｂＡｐｓ）の同定）
　２つのλｇｔ１１　ｃＤＮＡ発現ライブラリーを構築し、Ｔー結合ドメインおよびプローブとして完全なＣ末端領域（Ｌｅｅら、１９９１）の両方を含む、精製ｐ５６−ＲＢタンパク質（アミノ酸３７６−９２８）を用いてスクリーニングした。このプローブは、ＲＢタンパク質、ウサギ抗ＲＢ抗体、（０．４７）（Ｗａｎｇら、１９９０ａ）、およびアルカリホスファターゼ複合体化ヤギ抗ウサギＩｇＧを含むので、ＲＢーサンドイッチと呼ばれる。（材料および方法参照。）図１は、サンドイッチスクリーニング法の図式を説明する（１Ａおよび１Ｂ）。ＲＢとＳＶ４０　Ｔ抗原との関係は、十分に引照付けられているので（ＤｅＣａｐｒｉｏら、１９８８）、λｇｔ１１　ファージ発現Ｔ抗原を構築し、ＲＢ−サンドイッチを用いてスクリーニングし、正の制御として使用した（図１−Ｄに示す）。例のように（図１ーＣ）、この方法によって、クローンの一つ（Ａｐ１２）の融合生成物を容易に検出した。各フィルターの半分をＲＢーサンドイッチ結合用に、そして残りの半分をＲＢタンパク質欠損サンドイッチ結合用に使用した。後者のプローブは、ＲＢ抗体あるいはヤギ抗ウサギ抗体の、細菌タンパク質とのあらゆる交差反応のためにバックグラウンド結合の対照として使用した。１　ｘ　１０^４の組換えファージのスクリーニングを５回行った後、１２のクローンがＲＢ関連タンパク質をコードする候補的遺伝子として出現した。これらのクローンを、ＲｂＡｐ１、２、４、６、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５と呼ぶ。

　これらの１２の推定ＲｂＡｐ　ｃＤＮＡをｐＧＥＭプラスミドにサブクローン化して、各クローンから５００から６００ｂｐの部分配列を得た。ＧＥＮＢＡＮＫデータベースにある公知の遺伝子配列と比較して、ＲｂＡｐ１、２、４、８、１０、１２、１３、１４、１５は、公知のいかなる遺伝子に対しても重要な相同性を含まない新規遺伝子である。しかし、３つのクローンが以前に同定されている遺伝子と一致した。ＲｂＡｐ６は、核ラミン　Ｃ（ＭｃＫｅｏｎ，　１９８６；　Ｆｉｓｈｅｒ，　１９８６）と同一であり；ＲｂＡｐ９は、Ｇタンパク質のβサブユニットと部分的に相同の生成物をコードし（Ｇｕｌｌｅｍｏｎｔら、１９８９）；そして、ＲｂＡｐ１１は、リボソームＲＮＡ遺伝子プロモーターに結合する上流の結合因子（ＵＢＦ）をコードする（Ｊａｎｔｚｅｎら、１９９０）。クロスハイブリッド形成および配列決定データは、ＲｂＡｐ１、１０、１３、および１４が同一であることを示した。表１に、クローン化された全てのＲｂＡｐ類の予備特徴付けを要約する。

　ＲｂＡｐクローン２、４、８、１０、１２、および１５は、細胞周期制御での、ＲＢ、ｐｌｌ０^ＲＳ、結合、および全機能に対する標的である。ＲｂＡｐクローンによってコードされる網膜芽腫関連タンパク質は、細胞増殖に対する正の要素であることは可能である。Ｒｂは、これらのクローンのタンパク質生成物に結合し、それゆえに、それらの増殖機能を阻害する。結果として、ＲｂＡｐタンパク質生成物は、正には機能し得ないので、従って細胞周期の進行を促進し得ない。ＲｂＡｐのＲＢに結合する能力の変質で、発ガン性の影響を生じ得る。このような変質および／あるいは変異を検出するアッセイは、過増殖性疾患を診断する手段として、悪性および機能を測定し得る。過増殖性の病状の例には、限定はされないが、甲状腺過形成、乾せん、乳癌を含むＬｉ−Ｆｒａｕｍｅｎｉ症候群、肉腫および他の新生物、膀胱癌、結腸癌、肺癌、良性前立腺肥大、ならびに種々の白血病およびリンパ腫が含まれる。本発明はまた、癌および他の過増殖性病状の治療に使用する、このような変質および／あるいは変異ＲｂＡｐの拮抗薬を提供する。

　表１．ＲＢ関連タンパク質の最初の特徴付け：
　各クローンのｃＤＮＡの大きさは、ファージＤＮＡをＥｃｏＲＩにより消化した後に、アガロースゲルのＥｔＢｒ染色により決定した。ｍＲＮＡの大きさは、マーカーに２８ｓおよび１８ｓｒＲＮＡを用いたＲＮＡブロットアッセイにより測定した。各クローンからの部分配列を、クローンの同一性の決定のためにＧＥＮＢＡＮＫデータベースのサーチに使用した。核の局在化を免疫染色法および細胞分画（データは示していない）により測定した。ｎｄは測定していないことを示す。

　（実施例５：インビトロにおけるＲｂＡｐ類のＲＢへの結合）
ＲＢタンパク質のＲｂＡｐ類との関連を確認するために、クローン化したｃＤＮＡ挿入断片をプラスミドｐＦＬＡＧ（ＩＢＩ）にサブクローン化した。このプラスミドを、細菌での融合体のフラッグセグメントに対する抗体を使用して検出し得る、フラッグ−融合タンパク質の発現用に当てた。結合アッセイを促進するために、ｐ５６−ＲＢを、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（Ｇｓｔ）遺伝子と融合させ、発現させて、そしてグルタチオンアガロースクロマトグラフィー（Ｇｓｔ−ＲＢ）（ＳｍｉｔｈおよびＪｏｈｎｓｏｎ，　１９８８）により精製した。ＲＢ−結合アッセイを行うために、ＦＬＡＧ−Ａｐ溶解産物を、Ｇｓｔ−ＲＢあるいはＧｓｔビーズのみ（ＲＢを含まない）と混合した。付加された負の制御として、ＦＬＡＧ−ＢＡＰ（細菌アルカリホスファターゼ）を、ＧｓｔおよびＧｓｔ−ＲＢビーズとさらに混合した。広範囲にわたる洗浄後、結合された融合タンパク質を溶出し、抗ＦＬＡＧモノクローナル抗体を用いたウエスタンブロッティングにより分析した。結果は、実験した全てのＲｂＡｐ類はＧｓｔ−ＲＢビーズには結合し得るが、対照のＧｓｔビースには結合し得ないことを立証した（図２）。これらのクローンでは、結合親和性には、最も弱いＡｐ１５から最も強いＡｐ１２まで様々であった。

　Ａｐ１２　ｍＲＮＡレベルは、細胞周期中に調節される。Ａｐ１２は、スクリーニング中に、最も強い結合シグナルを一貫して示したので、さらなる研究用に選択した。このクローンは、約１．０　ｋｂの非翻訳領域を伴った１．４　ｋｂの挿入断片、および１１４アミノ酸のオープンリーディングフレームを有する。ＲＮＡブロット分析をおこなって、ｍＲＮＡの大きさおよび細胞周期の進行中の発現の様式を決定した。正常なサルのＣＶ１腎細胞を、１０％血清を含む新鮮培地にプレートして、ロバスタチンの存在下で３６時間培養する（細胞をＧ１期で停止させるために）（Ｊａｋｏｂｉｓｉａｋら，１９９１；Ｋｅｙｏｍａｒｓｉら，１９９１）か、あるいはアフィジコリン（ａｐｈｉｄｉｃｏｌｉｎ）（１０　μｇ／ｍｌ）の存在下に１６時間培養（細胞をＧ１／Ｓ境界期で停止させるために）し、次に、４時間放置する（細胞をＳ期で同調させるために）か、あるいはナコダゾール（ｎａｃｏｄａｚｏｌｅ）の存在下にさらに１６時間インキュベートする（細胞をＭ期に進めるために）（Ｇｏｏｄｒｉｃｈら、１９９１）。各期からの全てのＲＮＡを、Ａｐ１２　ｃＤＮＡをプローブとして用いたブロット分析のために調製した。２．８　ｋｂのｍＲＮＡを、Ｇ１／Ｓ境界期およびＳ期において検出したが、Ｇ１の初期あるいはＭ期では検出しなかった（図３）。対照として、細胞周期中のＡｐ９の発現の様式は変えなかった。この観察と一致して、Ａｐ１２　ｍＲＮＡ発現の増加は、血清刺激後の２から６時間の間に観察された。これらの結果は、Ａｐ１２が細胞周期の進行にかかわり得ることを証明する。

　（実施例６：Ａｐ１２の配列決定）
　最初のＡｐ１２　ｃＤＮＡクローン（Ｇ１２）は、相当するｍＲＮＡの大きさにより短かかったことは明かである。ｃＤＮＡライブラリーを再度スクリーニングして、その中からいくつかのより長いクローンを単離し、Ａ６およびＢ６の２つのクローンについて、もとのクローン（Ｇ１２）とともにさらに特徴付けを行った（図４）。２，４９２ヌクレオチドからの最も長いオープンリーディングフレームは、４７６アミノ酸の推定タンパク質をコードする。推定タンパク質の特有の特徴には、非常に酸性であるＣ末端の１００アミノ酸、および１５のプロリン残基に占められるＮ末端の４３アミノ酸領域が含まれる。プロリン高含有領域の後ろに、典型的なロイシン繰返し体（Ｌａｎｄｓｃｈｕｌｚら、１９８８；　Ｖｉｎｓｏｎら、１９８９）があり、塩基性アミノ酸の範囲により両端に隣接されて、ポテンシャルＤＮＡ結合ドメインを示唆している。これらの特徴は、真核生物の転写因子のいくつかの異なるクラスを示している。さらに、３８９ー４１１位のアミノ酸の範囲（ＬＸＳＸＥ−−−−ＤＥＤ）は、ＲＢタンパク質への結合に応答可能なＴ抗原の配列に類似している（ＤｅＣａｐｒｉｏら、１９８８）。さらに、アミノ酸１５９ー１６１（ＫＳＰ）および３４６ー３４９（ＳＰＧＫ）に、Ｃｄｋキナーゼに対する２つの潜在的なリン酸化部位が存在し、これは、このタンパク質の機能を調節し得る。

　（実施例７：Ａｐ１２は、ＳＶ４０　Ｔ抗原の結合に要求される領域に類似した領域で、ＲＢの低リン酸化形態にのみ結合する）
　Ａｐ１２のＲＢー結合特性を分析するために、もとのクローン（Ｇ１２）をＧｓｔ−融合タンパク質（Ｐ３）として発現させ、グルタチオンアガロースクロマトグラフィーにより精製した。この融合タンパク質を、Ａｐ１２タンパク質の、Ｍｏｌｔ４細胞の細胞溶解産物から調製した全長のＲＢへの結合を試験するために使用した。このＭｏｌｔ４細胞は、ＲＢタンパク質の高リン酸化形態および低リン酸化形態の両方を発現する。この実験に、２つの付加された制御が含められた。１つは、正の制御としてのＧｓｔ−Ｔ抗原融合タンパク質であり、他方は、負の制御としてのＧｓｔのみであった。図５Ａに示すように、Ｐ３タンパク質は、低リン酸化形態にのみ結合し、結合親和性は、Ｔの親和性に非常に類似している。Ｇｓｔのみでは、検出可能なＲＢタンパク質に結合しない。ＲＢのどのドメインがＡｐ１２に結合するかを限定するために、細菌ｐＥＴ−Ｔ７発現系（Ｓｔｕｄｉｅｒら，１９９０）で発現させたＲＢ変異体パネルをＰ３ビーズと混合するか、あるいは平行に、ＧｓｔーＴビーズと混合した。ビーズに結合された野生型あるいは変異ＲＢタンパク質の量を、モノクローナル抗ＲＢ抗体（ｍＡｂ２４５）を用いたウエスタンブロット分析により測定した。図５Ｃおよび５Ｄに示すように、Ｔへの結合に欠ける変異ＲＢもまた、Ａｐ１２には結合しない。これらの結果は、Ａｐ１２およびＴの両方が、同様の領域で、ＲＢのリン酸化されていない形態に結合することを示し、このことは、Ａｐ１２−ＲＢ関連が生物学的に重要であることを示している。

　（実施例８：Ａｐ１２のＣ末端領域は、ＲＢへの結合に要求される）
　Ａｐ１２の１１４アミノ酸を含有する最初のＰ３融合タンパク質は、ＲＢに結合するので、付加された実験は、ＲＢへの結合に要求されるＡｐ１２の領域をマップするために当てられた。Ｎ末端あるいはＣ末端の異なる欠失のある、４つのＧｓｔ−Ａｐ１２融合タンパク質を構築し、ＸＨ９は、Ａｐ１２　ｃＤＮＡの完全なコーディング配列を含み、ＳＨ５（Ｓｍａ　ＩからＨｉｎｄ　ＩＩＩまで）は、Ｃ末端の３１４アミノ酸を含む。ＸＸ４およびＳＸ４は、それぞれ、ＸＨ９およびＳＨ５由来であり、Ｃ末端で２１アミノ酸を欠失している。細菌で発現されたＲＢタンパク質（ｐＥＴＲｂｃ）を、これらのＧｓｔ−Ａｐ１２誘導体と混合して、上記のようにウエスタンブロッティングにより分析した。ＸＨ９、ＳＨ５、およびＰ３は、同様の親和性でＲＢに結合し、このことは、Ａｐ１２のＮ末端配列が、ほとんどＲＢ結合に寄与しないことを示唆している。しかし、ＸＸ４およびＳＸ４は、両方ともＣ末端から２１アミノ酸を欠失し、そして（ＬＸＳＸＥ−−−ＤＤＥ）配列（ＤｅＣａｐｒｉｏら、１９８８；　Ｐｈｅｌｐｓら、１９９２）を含むが、ＲＢには結合しない（図６）。これらの結果から総合して、Ａｐ１２のＣ末端領域がＲＢ結合に必要とされ、（ＬＸＳＸＥ−−−ＤＤＥ）配列のみでは結合には十分でないことが示され、このことは、ＲＢ−Ａｐ１２相互作用の様式は、ＲＢ−ＴあるいはＲＢ−Ｅ１Ａ相互作用の様式とは異なり得ることを示唆する。

　（実施例９：Ａｐ１２は、Ｅ２Ｆ認識配列に特異的に結合する）
　ＲＢは転写因子Ｅ２Ｆと複合体を形成すること（Ｂａｇｃｈｉら、１９９１；　Ｂａｎｄａｒａら、１９９１；　Ｃｈｅｌｌａｐｐａｎら、１９９１）、およびＡｐ１２が潜在的なＤＮＡ結合ドメインを有することが示されているので、Ａｐ１２が、Ｅ２Ｆ結合部位と相互作用し得るかどうかを決定するために実験を行った。細菌で発現させたＧｓｔ−Ａｐ１２（ＳＨ５）融合タンパク質を、以
前に記載された条件（Ｙｅｅら、１９８９）を用いて、２つのＥ２Ｆ認識部位を含むＤＮＡフラグメントのＤＮＡ移動度変位分析に使用した。図７Ａに示すように、ＳＨ５は、特異的にそのプローブと結合する。なぜなら、その複合体は、野生型Ｅ２Ｆ同系配列を含む無標識ＤＮＡと効果的に競合するが、たった２つのヌクレオチドによって野生型とは異なる変異配列（Ｙｅｅら、１９８９）とは競合しないからである。正の制御としての、ＨｅＬａ細胞由来の部分精製Ｅ２Ｆタンパク質は、予測通りにＤＮＡプローブに特異的に結合する。

　ＲＢがＡｐ１２−ＤＮＡ配列特異複合体と相互作用し得るかを決定するために、精製ｐ　５６−ＲＢタンパク質を、ＤＮＡ移動度変位分析に含有した。実験を２つの方法で行い、いづれかのＳＨ５をＲＢと混合し、次に、Ｅ２Ｆプローブに加えるか、あるいはその融合タンパク質を、まずＥ２Ｆプローブに結合させ（図７Ｂ、レーン３）、その後、ＲＢを加えた（図７Ｂ、レーン６）。いずれの場合においても、Ａｐ１２−ＤＮＡ複合体は、ＲＢの添加により過変位して位置はより遅く移動した。このことは、ＲＢが特異Ａｐ１２−ＤＮＡ複合体と相互作用する能力を有することを示す。これらの結果は、Ａｐ１２タンパク質が、Ｅ２Ｆに示される活性と同様のＤＮＡ結合活性およびＲＢ結合活性を有することを示している。

　ロイシン繰返し体を含む領域が、ＤＮＡ結合に必要であるかどうかを決定するために、３つのＧｓｔ−Ａｐ１２融合タンパク質、Ｐ３、ＳＨ５およびＸＨ９を、ＤＮＡ移動度変位分析用に選択した。図７Ｃに示すように、推定ロイシンジッパーおよび塩基性アミノ酸残基の範囲（ｂＺＩＰ）（Ｖｉｎｓｏｎら、１９８９）を含むＳＨ５およびＸＨ９は、Ｅ２Ｆ認識配列に結合するのに対して、Ａｐ１２（Ｐ３）のＣ末端領域は結合しなかった。さらに、他のいくつかの対照、Ａｐ９、Ａｐ１５およびＧｓｔ単独もまた試験では陰性であった。この結果は、推定ｂＺＩＰモチーフを含む領域は、Ａｐ１２−ＤＮＡ特異相互作用に必要であることを立証する。

　（実施例１０：Ａｐ１２のＣ末端は、トランス活性化ドメインとして機能し得る）
　高度に酸性で、両親媒性のαヘリックス領域は、通常は、真核生物の転写因子の活性化ドメインとして作用する（ＭｉｔｃｈｅｌｌおよびＴｊｉａｎ，　１９８９を再参照）。Ａｐ１２のＣ末端領域もまた、これらの特徴を示した。このことは、同様の様式で機能し得ることを示唆する。このことを試験するために、アミノ酸２２ー４７６あるいはＣ末端の１１４アミノ酸（３６２ー４７６）のいずれかをコードするＡｐ１２の配列を、酵母発現ベクター上に存在する、酵母ＧＡＬ４タンパク質のＤＮＡ結合ドメインに対応する配列（アミノ酸１ー１４７）（Ｋｅｅｇａｎら、１９８６）と融合した。このＧＡＬ４フラグメントは、特異的にその認識部位（ＵＡＳ_Ｇ）（Ｋｅｅｇａｎら、１９８６）に結合し得るが、活性化ドメインを欠いている。従って、ＵＡＳ_Ｇを有するプロモターから転写を命令する手段として、活性化機能を提供するために、キメラタンパク質は、融合セグメントをたよる。哺乳動物の活性化因子を含むこのような融合体のいくつかは、ｐ５３を含めて、酵母では機能性であることが示された（ＦｉｅｌｄｓおよびＪａｎｇ，　１９９０）。図８に示すように、ＵＡＳ_Ｇ制御下での、Ｅ．　ｃｏｌｉ　ｌａｃＺ遺伝子を有する酵母株の形質転換の後、ＧＡＬ４−Ａｐ１２両融合体は、βーガラクトシダーゼ活性により明白になる、リポーターの転写を活性化し得たが、それに対してＧＡＬ４−ＲＢ対照は、活性化し得なかった。この結果は、Ａｐ１２が活性化ドメインを含むこと、およびＣ末端の１１４アミノ酸がこの機能に対して十分であることを示す。

　（実施例１１：ＣＶ１細胞でのＡｐ１２発現は、Ｅ２Ｆ認識配列を有するプロモーターをトランス活性化する）
　Ａｐ１２がＥ２Ｆ結合部位依存の様式で転写を活性化し得るかどうかを決定するために、２つのプラスミド、ＣＭＶ−Ａｐ１２−ＳｔｕおよびＣＭＶ−Ａｐ１２−ＲＨを構築して、Ａｐ１２を、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）ーＩＥプロモーター（Ｎｅｉｌｌら、１９９１）（図９Ａ）の制御下に、哺乳動物の細胞中で発現させた。２つのリポータープラスミド、ＣＡＴリポーター遺伝子の上流に２つのＥ２Ｆ部位を有するｐＥ２ＦＡ_１０ＣＡＴ、および、Ｅ２Ｆ部位を含まないｐＡ_１０ＣＡＴを（Ｙｅｅら、１９８９）このアッセイに使用した。図９Ｂは、ｐＡ_１０ＣＡＴではなくｐＥ２ＦＡ_１０ＣＡＴをともにトランスフェクトしたときには、ＣＭＶ−Ａｐ１２−ＳｔｕあるいはＣＭＶ−Ａｐ１２−ＲＨの発現が、著しくＣＡＴ活性を高めたことを示した。ＣＭＶ−Ｅ４の発現には、リポータープラスミドのみによってトランスフェクトされた対照細胞に比較しても明かな効果はない。これらのデータは、Ａｐ１２が、Ｅ２Ｆ認識配列を有するプロモーターを活性化する、機能性転写因子をコードすることを示唆した。

　（実施例１２：ＲＢ関連タンパク質をコードする細胞遺伝子の単離）
　２つのｃＤＮＡライブラリーを、以前に記載されている方法（Ｍａｎｉａｔｉｓら、１９８２）により、ＨｅＬａ細胞およびＳａｏｓ２細胞から単離したポリＡ^＋ＲＮＡから構築した。二本鎖ｃＤＮＡをセファロースＣ１−４Ｂクロマトグラフィーを使ってサイズ分画し、λｇｔ１１アームに連結した。インビトロでパッケージしたライブラリーの大きさは、ＨｅＬａ細胞では２．０　ｘ　１０^７組換え体であり、Ｓａｏｓ２細胞では１．５　ｘ　１０^７　であり、挿入断片の平均の大きさは１．６　ｋｂであった。そのｃＤＮＡライブラリーを１００個の１５０ｍｍディッシュに、ディッシュあたり１ー２　ｘ　１０^４組換え体をプレートし、４２℃で、プラークがちょうど目に見える時点（３．５時間）までインキュベートし、次に、３７℃で一晩ＩＰＴＧ（１０　ｍＭ）で飽和したニトロセルロースフィルターに移した。そのフィルターを変性し、６Ｍ　グアニジンＨＣｌ中で再生して、結合緩衝液（２５　ｍＭヘペス、ｐＨ　７．５、　５０　ｍＭ　ＮａＣｌ、５　ｍＭ　ＭｇＣｌ_２、５　ｍＭ　ＤＴＴ、０．１％　ＮＰ−４０、５％ミルク、１　ｍｇ／ｍｌ　ＢＳＡ）中で、４℃で４時間、ＲＢーサンドイッチプローブとインキュベートした。ＲＢーサンドイッチは、結合緩衝液１ｍｌあたり、１μｇの精製細菌発現ｐ５６−ＲＢ（Ｈｕａｎｇら，１９９１）、１００μｌの予め吸収させたポリクローナル抗ＲＢ抗体（抗−ＲＢ　０．４７、１：１００　希釈）と、１μｌアルカリホスファターゼ複合の二次抗体とを混合し、４℃で２時間インキュベートして調製した。ＲＢを含まない対照のサンドイッチは、ＲＢ抗体と二次抗体とを混合して調製し、クローンと抗ＲＢ抗体との交差反応を抑制する対照として使用した。結合されたフィルターを、次に、ＴＢＳＴ（２０　ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ　７．５、１５０　ｍＭ　ＮａＣｌ、０．０５％　Ｔｗｅｅｎ−２０）中で、各３分間で５回洗浄し、ＢＣＩＰ／ＮＢＰ（Ｐｒｏｍｅｇａ，　ＷＩ）中で発色させた。最初のスクリーニングで陽性であったクローンを取り出して、第二回および第三回スクリーニングを行った。次に、ＲＢを含まないサンドイッチではなく、ＲＢ−サンドイッチで一貫して陽性シグナルを示したクローンを、それから第４回および第５回スクリーニングのために、低密度で対照のファージと混合してプレートし、続いてバックグラウンドに対して強い陽性シグナルを与える均質な単離物を選抜した。

　（実施例１３：プラスミドの構築および融合タンパク質の発現）
　ＲｂＡｐｓクローンのｃＤＮＡ挿入断片を、配列決定分析用にｐＧＥＭ１にサブクローン化した。インビトロにおいて、ＲｂＡｐ融合タンパク質を発現させるために、ｃＤＮＡ挿入断片をｐＦＬＡＧ融合タンパク質発現系（ＩＢＩ）にフレームであわせて再構築した。ＦＬＡＧ融合タンパク質の発現を０．２　ｍＭ　ＩＰＴＧで誘導し、細菌溶解産物を、凍結ー解凍、その後の溶解緩衝液Ｂ（５０　ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ　７．５、１００　ｍＭ　ＮａＣｌ、５　ｍＭ　ＤＴＴ、０．２％　ＮＰ−４０、１　ｍＭ　ＰＭＳＦ、１μｇ／ｍｌ　ロイペプチン、５　μｇ／ｍｌアプロチニン（Ａｐｒｏｔｉｎｉｎ）、１μｇ／ｍｌアンチパイン）中での音波処理を２回繰り返して調製し、そして遠心分離により透明にした。インビトロでＲＢタンパク質を発現させるために、ＲＢ　ｃＤＮＡフラグメントのｐ５６型を、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）融合タンパク質ｐＧＥＸ−２Ｔ（ＳｍｉｔｈおよびＪｏｈｎｓｏｎ，　１９８８）を発現するプラスミドにサブクローン化し、細菌で発現されたＧＳＴ−ＲＢ融合体を調製して、ＧＳＴアガロースビーズを用いて精製した。

　（実施例１４：インビトロ結合アッセイ）
　ＦＬＡＧ−ＲｂＡｐｓを約０．５μｇ含む細菌溶解産物（１００　μｌ）を、１ー２μｇの融合タンパク質を有する２０μｌのＧＳＴ−ＲＢビーズあるいはＧＳＴビーズと、４００μｌの溶解緩衝液Ｂ中
で、４℃で６０分間混合した。結合されたビーズを、１　ｍｌ　ＰＢＳ／０．２％　ＮＰ−４０中で連続して５回洗浄し、タンパク質複合体をＳＤＳ負荷緩衝液中で煮沸した。結合されたＦＬＡＧ融合タンパク質を、次にＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動により分析し、イムノブロットを行い、抗ＦＬＡＧモノクローナル抗体（ＩＢＩ）で精査した。

　（実施例１５：細菌ｐＥＴ−Ｔ７系で発現される変異ＲＢタンパク質の構築）
　ｐＥＴＲｂｃ、ｐＥＴＭ６およびｐＥＴＭ９（Ｈｕａｎｇら、１９９１）に加えて、ｐＥＴＢ２、ｐＥＴＳｓｐ、およびｐＥＴＭ８を、ｐＢ２、ｐＳｓｐ、およびｐＭ８（Ｈｕａｎｇら、１９９０）からのＡｈａＩＩ−ＢａｍＨＩフラグメントを対応のｐＥＴ発現ベクターにクローン化して構築した。細菌溶解産物を前章に記載のように調製した。

　（実施例１６：ＧＳＴ−ＲｂＡｐ１２融合タンパク質の構築）
　ＲｂＡｐ１２クローン由来のＤＮＡフラグメントを、ＧＳＴ融合プラスミドにサブクローン化した。ＧＳＴ−Ｐ３を、もとのＣ末端の１．３ｋｂのｃＤＮＡ（Ｇ１２）からのＥｃｏ　ＲＩ−Ｓｐｈ　Ｉフラグメントを、ｐＧＥＸ−２Ｔ（Ｓｍｉｔｈ，　１９８８）からの誘導体であるｐＧＥＰＫ（Ｃｈｅｎ，　未発表）にクローン化して構築した。ＧＳＴ−ＳＨ５は、クローンＢ６からのＳｍａＩ−ＨｉｎｄＩＩＩフラグメントを含有し、ＧＳＴ−ＸＨ９は、クローンＡ６のＥｃｏＲＩ−ＨｉｎｄＩＩＩフラグメントを含有し、このフラグメントは、完全なコーディング配列を含んでいる。ＧＳＴ−ＳＸ４およびＧＳＴーＸＸ４は、それぞれ、ＧＳＴ−ＳＨ５およびＧＳＴ−ＸＨ９由来であるが、Ｃ末端ＸｈｏＩ−ＨｉｎｄＩＩＩフラグメントは欠失している。

　（実施例１７：ＲＮＡブロット分析）
　グアニジンイソチオシアネートーＣｓＣｌ法（Ｍａｎｉａｔｉｓら、１９８２）により抽出した全てのＲＮＡを、５０％ホルムアミド、２．２Ｍホルムアルデヒド、２０ｍＭ　ホウ酸ナトリウム（ｐＨ　８．３）中で変性し、１．０％　アガロースゲル電気泳動により分析した。次に、ＲＮＡをハイボンドペーパー（Ａｍｅｒｓｈａｍ）に移し、ブロットをＵＶ交差結合により保持させた。プレハイブリダイゼーションおよびハイブリダイゼーションを、５０％ホルムアミド、５ｘ　ＳＳＰＥ、５ｘ　デンハルト（Ｄｅｎｈａｒｄｔ’ｓ）、１％　ＳＤＳ、および１００μｇ／ｍｌサケ精子ＤＮＡ中で実施し、ハイブリダイゼーションは、^３２Ｐ標識の１．３ｋｂ　ＲｂＡｐ１２挿入断片ＤＮＡの存在下に４５℃で１８時間行った。最初の洗浄は、２ｘ　ＳＳＣ、０．１％　ＳＤＳ中で室温で行い、最終の洗浄は、０．１ｘ　ＳＳＣ、０．１％　ＳＤＳ中で、６５℃において４５分間行った。

　（実施例１８：ＤＮＡゲル移動度変位分析）
　２つのＥ２Ｆ認識配列（ＴＴＴＣＧＣＧＣ−−−ＧＣＧＣＧＡＡＡ）を含有するプラスミドからの挿入断片を、ゲル移動度変位分析用のプローブとして使用し、また競合因子として作用させた。変異Ｅ２Ｆ部位（ＴＴＴＡＧＣＧＣ−−−ＧＣＧＣＴＡＡＡ）を有するプラスミド（Ｈｕａｎｇら、１９９２）もまた、これはＥ２Ｆには結合しないが、競合因子として使用した。分析は、以前に記載（Ｙｅｅら、１９８９）されたように実施した。希釈したＧＳＴ−Ａｐ１２細菌溶解産物（ＳＨ５およびＸＨ９融合タンパク質に対して２０ｎｇ、Ｐ３、Ｇｓｔ、ＧｓｔＡｐ９、およびＧｓｔＡｐ１５に対して２００ｎｇ）を、１ｘ結合緩衝液（２０ｍＭヘペス、ｐＨ　７．６、１ｍＭ　ＭｇＣｌ_２、０．１ｍＭ　ＥＧＴＡ、４０ｍＭ　ＫＣｌ、１０％グリセロール）、０．１％　ＮＰ４０、１ｍｇ／ｍｌサケ精子ＤＮＡと、室温で、１５分間インキュベートし、そして^３２Ｐ末端標識（Ｋｌｅｎｏｗによって充填）プローブを加えてさらに３０分間インキュベートした。タンパク質ーＤＮＡ複合体を、４℃、０．２５ｘ　ＴＢＥ緩衝液中の４％アクリルアミドゲル電気泳動により分析した。

　（実施例１９：酵母の発現ベクターおよび菌株）
　酵母に使用する発現ベクターは、ｐＡＳ１ベクターに基づいた。簡単には、そのプラスミドは、ＧＡＬ４　ＤＮＡ結合ドメインの発現を差動するＡＤＨ１プロモーターと、その後下流にポリリンカーを含む。ベクターは、さらに、２μ複製起点および酵母での維持および選択用のＴＲＰ１遺伝子を有する。ｐＡＳ／Ｇ１２は、Ｇ１２から単離したＥｃｏＲＩフラグメントをｐＡＳ１の単一のＥｃｏＲＩ部位にサブクローン化して構築した。同様に、ｐＡＳ／１２Ｂ６は、ｐ１２Ｂ６からのＥｃｏＲＩフラグメント用いて、ｐＡＳ１　ＥｃｏＲＩ部位にサブクローン化して構築した。ｐＡＳＲｂ２は、ほかにも記載される（Ｄｕｒｆｅｅら、未発表）。

　使用したＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｖｉｓｉａｅ株は、Ｙ１５３（ＭＡＴａ，　ｔｒｐ１−９０１，ｌｅｕ２−３，　−１１２，　ａｄｅ２−１０１，　ｕｒａ３−５２：：ＵＲＡ３（ＧＡＬ１−ｌａｃＺ），　ＭＥＬ（ＧＡＬ１−ｌａｃＺ）；（Ｄｕｒｆｅｅら、未発表）であった。

　（実施例２０：酵母の形質転換およびβーガラクトシダーゼアッセイ）
　酵母の形質転換を、以前に記載（ＳｃｈｉｅｓｔｌおよびＧｉｅｔｚ，　１９８９）のＬｉＯＡｃ法により実施した。形質転換後、細胞を、トリプトファンを含まない合成ドロップアウト培地にプレートし、プラスミドの存在を選択した。その後、３０℃で２ー３日増殖させ、各形質転換からの単一コロニーを他の選択プレート上に線状に移し、さらに２４時間増殖させた。次に、コロニーの色によるβーガラクトシダーゼ活性アッセイは、細胞を透過可能にするために、ニトロセルロースフィルターを液体窒素中に約３０ー６０秒浸漬したこと以外は、記載（ＢｒｅｅｄｅｎおよびＮａｓｍｙｔｈ，　１９８５）通りに
実施し、次に、ＬａｃＺ−Ｘ−Ｇａｌ溶液（ＢｒｅｅｄｅｎおよびＮａｓｍｙｔｈ，　１９８５）で飽和したＷｈａｔｍａｎフィルター上に重層する前に、室温で解凍した。ＡＰ１２クローンの場合には、約２０分以内に発色した。ｐＡＳ／Ｒｂ２クローンでは、一晩感光しても色の変化は認められなかった。

　（実施例２１：一過性のトランスフェクションアッセイ）
　トランスフェクションは、従来のリン酸カルシウム沈降法により、ＣＶ１細胞を用いて行った。プラスミドｐＣＭＶＡｐ１２Ｓｔｕを、クローンＡ６からのＳｔｕＩフラグメントをｐＣＭＶのＳｍａＩ部位にクローン化して構築し、そしてプラスミドｐＣＭＶＡｐ１２ＲＨは、クローンＢ６からのＥｃｏＲＩ−ＨｉｎｄＩＩＩフラグメントを含有する。プラスミドｐＣＭＶＥ４を対照として使用した。ＣＭＶ構築物を、プラスミドｐＥ２ＦＡ_１０ＣＡＴ（２つのＥ２Ｆ結合部位を有する）と、ｐＡ_１０ＣＡＴ（Ｅ２Ｆ結合部位を含まない）とを用いて、同数（５　ｘ　１０^６）の細胞を使用して共にトランスフェクトし、ＣＡＴ活性を、以前に記載（Ｇｏｒｍａｎら、１９８２）のように４８時間後に測定した。

　本発明は、網膜芽腫−関連タンパク質をコードする単離した核酸分子、および転写因子Ｅ２Ｆの生物学的活性およびＲＢ−結合活性を有する単離されたタンパク質を、提供する。本発明はまた、網膜芽腫−関連タンパク質をコードする単離された核酸分子を含むベクター、そのようなベクターを含む哺乳動物細胞、網膜芽腫−関連タンパク質に対する抗体およびそのようなタンパク質に対するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマラインを、提供する。本発明はさらに、そのような抗体を診断におよび予知に用いる方法を提供する。

　本発明はまさに好ましい実施態様を参考として記載しているが、種々の改変が、本発明の範囲を逸脱することなくなされ得ることを理解されるべきである。従って、本発明は、下記の特許請求の範囲によってのみ限定される。

　本発明は国立衛生研究所発行の許可Ｎｏ．　ＥＹ　０５７５８および対ＷＨＬタバコ研究委員会許可の下に、部分的に政府の支援を受けてなされた。政府は、本発明において何らかの権利を有し得る。

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　ＤｅＣａｐｒｉｏ，Ｊ．Ａ．，Ｌｕｄｌｏｗ，Ｊ．Ｗ．，Ｆｉｇｇｅ，Ｊ．，Ｓｈｅｗ，Ｊ．−Ｙ．，Ｈｕａｎｇ，Ｃ．−Ｍ．，Ｌｅｅ，Ｗ．−Ｈ．，Ｍａｒｓｉｌｌｏ，Ｅ．，Ｐａｕｃｈａ，Ｅ．ａｎｄ　Ｌｉｖｉｎｇｓｔｏｎ，Ｄ．Ｍ．（１９８８）．ＳＶ４０　ｌａｒｇｅ　ｔｕｍｏｒ　ａｎｔｉｇｅｎ　ｆｏｒｍｓ　ａ　ｓｐｅｃｉｆｉｃ　ｃｏｍｐｌｅｘ　ｗｉｔｈ　ｔｈｅ　ｐｒｏｄｕｃｔ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｒｅｔｉｎｏｂｌａｓｔｏｍａ　ｓｕｓｃｅｐｔｉｂｉｌｉｔｙ　ｇｅｎｅ．Ｃｅｌｌ．５４，２７５−２８３。

　ＤｅＣａｐｒｉｏ，Ｊ．Ａ．，Ｌｕｄｌｏｗ，Ｊ．Ｗ．，Ｌｙｎｃｈ，Ｄ．，Ｆｕｒｕｋａｗａ，Ｙ．，Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ｊ．，Ｐａｗｎｉｃａ−Ｗｏｒｍｓ，Ｈ．，Ｈｕａｎｇ，Ｃ．−Ｍ．ａｎｄ　Ｌｉｖｉｎｇｓｔｏｎ，Ｄ．Ｍ．（１９８９）．　Ｔｈｅ　ｐｒｏｄｕｃｔ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｒｅｔｉｎｏｂｌａｓｔｏｍａ　ｓｕｓｃｅｐｔｉｂｉｌｉｔｙ　ｇｅｎｅ　ｈａｓ　ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ　ｏｆ　ａ　ｃｅｌｌ　ｃｙｃｌｅ　ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ　ｅｌｅｍｅｎｔ．　Ｃｅｌｌ．５８，１０８５−１０９５。

　Ｄｅｆｅｏ−Ｊｏｎｅｓ，Ｄ．，Ｈｕａｎｇ，Ｐ．Ｓ．，Ｊｏｎｅｓ，Ｒ．Ｅ．，Ｈａｓｋｅｌｌ，Ｋ．Ｍ．，Ｖｕｏｃｏｌｏ，Ｇ．Ａ．，Ｈａｎｏｂｉｋ，Ｍ．Ｇ．，Ｈｕｂｅｒ，Ｈ．Ｅ．ａｎｄ　Ｏｌｉｆｆ，Ａ．（１９９１）．Ｃｌｏｎｉｎｇ　ｏｆ　ｃＤＮＡｓ　ｆｏｒ　ｃｅｌｌｕｌａｒ　ｐｒｏｔｅｉｎｓ　ｔｈａｔ　ｂｉｎｄ　ｔｏ　ｔｈｅ　ｒｅｔｉｎｏｂｌａｓｔｏｍａ　ｇｅｎｅ　ｐｒｏｄｕｃｔ．Ｎａｔｕｒｅ．３５２，２５１−２５４。

　Ｄｙｓｏｎ，Ｎ．，Ｈｏｗｌｅｙ，Ｐ．Ｍ．，Ｍｕｎｇｅｒ，Ｋ．　ａｎｄ　Ｈａｒｌｏｗ，Ｅ．（１９８９）．　Ｔｈｅ　ｈｕｍａｎ　ｐａｐｉｌｌｏｍａ　ｖｉｒｕｓ−１６　Ｅ７　ｏｎｃｏｐｒｏｔｅｉｎ　ｉｓ　ａｂｌｅ　ｔｏ　ｂｉｎｄ　ｔｏ　ｔｈｅ　ｒｅｔｉｎｏｂｌａｓｔｏｍａ　ｇｅｎｅ　ｐｒｏｄｕｃｔ．Ｓｃｉｅｎｃｅ．２４３，９３４−９３７。

　Ｆｉｅｌｄｓ，Ｓ．，Ｊａｎｇ，Ｓ．Ｋ．（１９９０）．Ｐｒｅｓｅｎｃｅ　ｏｆ　ａ　ｐｏｔｅｎｔ　ｔｒａｓｃｒｉｐｔｉｏｎ　ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ　ｓｅｑｕｅｎｃｅ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｐ５３　ｐｒｏｔｅｉｎ．Ｓｃｉｅｎｃｅ．２４９，１０４６−１０５１。

　Ｆｉｅｌｄｓ，Ｓ．ａｎｄ　Ｓｕｎｇ，　Ｏ−Ｋ．（１９８９）．Ａ　ｎｏｖｅｌ　ｇｅｎｅｔｉｃ　ｓｙｓｔｅｍ　ｔｏ　ｄｅｔｅｃｔ　ｐｒｏｔｅｉｎ−ｐｒｏｔｅｉｎ　ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ．Ｎａｔｕｒｅ．３４０，２４５−２４６。

　Ｆｉｓｈｅｒ，Ｄ．Ｚ．，Ｃｈａｕｄｈａｒｙ，Ｎ．，Ｂｌｏｂｅｌ，Ｇ．（１９８６）．ｃＤＮＡ　ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ　ｏｆ　ｎｕｃｌｅａｒ　ｌａｍｉｎｓ　Ａ　ａｎｄ　Ｃ　ｒｅｖｅａｌｓ　ｐｒｉｍａｒｙ　ａｎｄ　ｓｅｃｏｎｄａｒｙ　ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ　ｈｏｍｏｌｏｇｙ　ｔｏ　ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅ　ｆｉｌａｍｅｎｔ　ｐｒｏｔｅｉｎｓ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．８３，６４５０−６４５４。

　Ｆｒｉｅｎｄ，Ｓ．Ｈ．，Ｂｅｒｎａｒｄｓ，Ｒ，Ｒｏｇｅｉｊ，Ｓ．，Ｗｅｉｎｂｅｒｇ，Ｒ．Ａ．，Ｒａｐａｐｏｒｔ，Ｊ．Ｍ．，Ａｌｂｅｒｔ，Ｄ．Ｍ．ａｎｄ　Ｄｒｙｊａ，Ｔ．Ｐ．（１９８６）．Ａ　ｈｕｍａｎ　ＤＮＡ　ｓｅｇｍｅｎｔ　ｗｉｔｈ　ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｇｅｎｅ　ｔｈａｔ　ｐｒｅｄｉｓｐｏｓｅｓ　ｔｏ　ｒｅｔｉｎｏｂｌａｓｔｏｍａ　ａｎｄ　ｏｓｔｅｏｓａｒｃｏｍａ．Ｎａｔｕｒｅ（Ｌｏｎｄｏｎ）．３２３，６４３−６４６。

　Ｆｕｎｇ，Ｙ．Ｋ．Ｔ．，Ｍｕｒｐｈｒｅｅ，Ａ．Ｌ．，ＴＡｎｇ，Ａ．，Ｑｉａｎ，Ｊ．，Ｈｉｎｒｉｃｈｓ，Ｓ．Ｈ．ａｎｄ　Ｂｅｎｅｄｉｃｔ，Ｗ．Ｆ．（１９８７）．Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ　ｅｖｉｄｅｎｃｅ　ｆｏｒ　ｔｈｅ　ａｕｔｈｅｎｔｉｃｉｔｙ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｈｕｍａｎ　ｒｅｔｉｎｏｂｌａｓｔｏｍａ　ｇｅｎｅ．Ｓｃｉｅｉｎｃｅ．２３６，１６５７−１６６１。

　Ｇｏｏｄｒｉｃｈ，Ｄ．Ｗ．，Ｃｈｅｎ，Ｙ．，Ｓｃｕｌｌｙ，Ｐ．ａｎｄ　Ｌｅｅ，Ｗ．−Ｈ．（１９９２）．Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｒｅｔｉｎｏｂｌａｓｔｏｍａ　ｇｅｎｅ　ｐｒｏｄｕｃｔ　ｉｎ　ｂｌａｄｄｅｒ　ｃａｒｃｉｎｏｍａ　ｃｅｌｌｓ　ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ　ｗｉｔｈ　ａ　ｌｏｗ　ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ　ｏｆ　ｔｕｍｏｒ　ｆｏｒｍａｔｉｏｎ．Ｃａｎ．Ｒｅｓ．５２，１９６８−１９７３。

　Ｇｏｏｄｒｉｃｈ，Ｄ．Ｗ．，Ｗａｎｇ，Ｎ．Ｐ．，Ｑｉａｎ，Ｙ．−Ｗ．，Ｌｅｅ，Ｅ．Ｙ．−Ｈ．Ｐ．ａｎｄ　Ｌｅｅ，Ｗ．−Ｈ．（１９９１）．Ｔｈｅ　ｒｅｔｉｎｏｂｌａｓｔｏｍａ　ｇｅｎｅ　ｐｒｏｄｕｃｔ　ｒｅｇｕｌａｔｅｓ　ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎ　ｔｈｒｏｕｇｈ　ｔｈｅ　Ｇ１　ｐｈａｓｅ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｃｅｌｌ　ｃｙｃｌｅ．Ｃｅｌｌ．６７，２９３−３０２。

　Ｇｏｒｍａｎ，Ｃ．Ｍ．，Ｍｏｆｆａｔ，Ｌ．Ｆ．，Ｈｏｗａｒｄ，Ｂ．Ｈ．（１９８２）．Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　ｇｅｎｏｍｅｓ　ｗｈｉｃｈ　ｅｘｐｒｅｓｓ　ｃｈｌｏｒａｍｐｈｅｎｉｃｏｌ　ａｃｅｔｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ　ｉｎ　ｍａｍｍａｌｉａｎ　ｃｅｌｌｓ．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ　Ｂｉｏｌ．２，１０４４−１０５１。

　Ｇｕｌｌｅｍｏｎｔ，Ｆ．，Ｂｉｌｌａｕｌｔ，Ａ．，Ａｕｆｆｒａｙ，Ｃ．（１９８９）．Ｐｈｙｓｉｃａｌ　ｌｉｎｋａｇｅ　ｏｆ　ｇｕａｎｉｎｅ　ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−ｂｉｎｄｉｎｇ　ｐｒｏｔｅｉｎ−ｒｅｌａｔｅｄ　ｇｅｎｅ　ｔｏ　ｔｈｅ　ｃｈｉｃｋｅｎ　ｍａｊｏｒ　ｈｉｓｔｏｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙ　ｃｏｍｐｌｅｘ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．８６，４５９４−４５９８。

　Ｈａｒｂｏｕｒ，Ｊ．Ｗ．，Ｌａｉ，Ｓ．−Ｈ．，Ｗｈａｎｇ−Ｐｅｎｇ，Ｊ．，Ｇａｚｄａｒ，Ａ．Ｆ．，Ｍｉｎｎａ，Ｊ．Ｄ．ａｎｄ　Ｋａｙｅ，Ｆ．Ｊ．（１９８８）．Ａｂｎｏｒｍａｌｉｔｉｅｓ　ｉｎ　ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ　ａｎｄ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｈｕｍａｎ　ｒｅｔｉｎｏｂｌａｓｔｏｍａ　ｇｅｎｅ　ｉｎ　ＳＣＬＣ．Ｓｃｉｅｎｃｅ．２４１，３５３−３５７。

　Ｈｉｅｂｅｒｔ，Ｓ．Ｗ．，Ｌｉｐｐ，Ｍ．，Ｎｅｖｉｎｓ，Ｊ．Ｒ．（１９８９）．Ｅ１Ａ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ　ｔｒａｎｓ−ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ　ｏｆｔｈｅ　ｈｕｍａｎ　ＭＹＣ　ｐｒｏｍｏｔｅｒ　ｉｓ　ｍｅｄｉａｔｅｄ　ｂｙ　ｔｈｅ　Ｅ２Ｆ　ｆａｃｔｏｒ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．８６，３５９４−３５９８。

　Ｈｏｒｏｗｉｔｚ，Ｊ．Ｍ．，Ｙａｎｄｅｌｌ，Ｄ．Ｗ．，Ｐａｒｋ，Ｓ．Ｈ．，Ｃａｎｎｉｎｇ，Ｓ．，Ｗｈｙｔｅ，Ｐ．，Ｂｕｃｈｋｏｖｉｃｈ，Ｋ．，Ｈａｒｌｏｗ，Ｅ，Ｗｅｉｎｂｅｒｇ，Ｒ．ａｎｄ　Ｄｒｙｊａ，Ｔ．（１９８９）．Ｐｏｉｎｔ　ｍｕｔａｔｉｏｎａｌ　ｉｎａｃｔｉｖａｔｉｏｎ　ｏｆｔｈｅ　ｒｅｔｉｎｏｂｌａｓｔｏｍａ　ａｎｔｉｏｎｃｏｇｅｎｅ．Ｓｃｉｅｎｃｅ．２４３，９３７−９４０。

　Ｈｕ，Ｑ．，Ｄｙｓｏｎ，Ｎ．ａｎｄ　Ｈａｒｌｏｗ，Ｅ．（１９９０）．Ｔｈｅ　ｒｅｇｉｏｎｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｒｅｔｉｎｏｂｌａｓｔｏｍａ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｎｅｅｄｅｄ　ｆｏｒ　ｂｉｎｄｉｎｇ　ｔｏ　ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ　Ｅ１Ａ　ｏｒ　ＳＶ４０　Ｔ　ａｎｔｉｇｅｎ　ａｒｅ　ｃｏｍｍｏｎ　ｓｉｔｅｓ　ｆｏｒ　ｍｕｔａｔｉｏｎｓ．ＥＭＢＯ　Ｊ．９，１１４７−１１５５。

　Ｈｕａｎｇ，Ｈ．−Ｊ．Ｓ．，Ｙｅｅ，Ｊ．−Ｋ．，Ｓｈｅｗ，Ｊ．−Ｙ．，Ｃｈｅｎ，Ｐ．−Ｌ．，Ｂｏｏｋｓｔｅｉｎ，Ｒ，Ｆｒｉｅｄｍａｎｎ，Ｔ．，Ｌｅｅ，Ｅ．Ｙ．−Ｈ．Ｐ．ａｎｄ　Ｌｅｅ，Ｗ．−Ｈ（１９８８）．Ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｎｅｏｐｌａｓｔｉｃ　ｐｈｅｎｏｔｙｐｅｂｙ　ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｒｅｔｉｎｏｂｌａｓｔｏｍａ　ｇｅｎｅ　ｐｒｏｄｕｃｔ　ｉｎ　ｈｕｍａｎ　ｃａｎｃｅｒ　ｃｅｌｌｓ．Ｓｃｉｅｎｃｅ．２４２，１５６３−１５６６。

　Ｈｕａｎｇ，Ｓ．，Ｓｈｉｎ，Ｅ．，Ｓｈｅｐｐａｒｄ，Ｋ−Ａ．，Ｃｈｏｋｒｏｖｅｒｔｙ，Ｌ．，Ｓｈａｎ，Ｂ．，Ｑｉａｎ，Ｙ−Ｗ．，Ｌｅｅ，Ｅ．Ｙ−ＨＰ．，Ｙｅｅ，ＡＳ．（１９９２）．Ｔｈｅ　ｒｅｔｉｎｏｂｌａｓｔｏｍａ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｒｅｇｉｏｎ　ｒｅｑｕｉｒｅｄ　ｆｏｒ　ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ　ｗｉｔｈ　ｔｈｅ　Ｅ２Ｆ　ｔｒａｓｃｒｉｐｔｉｏｎ　ｆａｃｔｏｒ　ｉｎｃｌｕｄｅｓ　ｔｈｅ　Ｔ／Ｅ１Ａ　ｂｉｎｄｉｎｇ　ａｎｄ　Ｃ−ｔｅｒｍｉｎａｌ　ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ．ＤＮＡ　ａｎｄ　Ｃｅｌｌ　Ｂｉｏｌｏｇｙ．ｉｎ　ｐｒｅｓｓ。

　Ｈｕａｎｇ，Ｓ．，Ｌｅｅ，Ｗ．−Ｈ．ａｎｄ　Ｌｅｅ，Ｅ．Ｙ．−Ｈ．Ｐ．（１９９１）．Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　ａ　ｃｅｌｌｕｌａｒｐｒｏｔｅｉｎ　ｔｈａｔ　ｃｏｍｐｅｔｅｓ　ｗｉｔｈ　ＳＶ４０　Ｔ　ａｎｔｉｇｅｎ　ｆｏｒ　ｂｉｎｄｉｎｇ　ｔｏ　ｔｈｅ　ｒｅｔｉｎｏｂｌａｓｔｏｍａ　ｇｅｎｅ　ｐｒｏｄｕｃｔ．Ｎａｔｕｒｅ．１６０−１６２。

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　Ｊａｋｏｂｉｓｉａｋ，Ｍ．，Ｂｒｕｎｏ，Ｓ．，Ｓｋｉｅｒｓｋｉ，Ｊ．Ｓ．ａｎｄ　Ｄａｒｚｙｎｋｉｅｗｉｃｚ，Ｚ．（１９９１）．Ｃｅｌｌ　ｃｙｃｌｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ　ｅｆｆｅｃｔｓ　ｏｆ　ｌｏｖａｓｔａｔｉｎ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．８８，３６２８−３６３２。

　Ｊａｎｔｚｅｎ，Ｈ．−Ｍ．，Ａｄｍｏｎ，Ａ．，Ｂｅｌｌ，Ｓ．Ｐ．，Ｔｊｉａｎ，Ｒ．（１９９０）．Ｎｕｃｌｅｏｌａｒ　ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ　ｆａｃｔｏｒ　ｈＵＢＦ　ｃｏｎｔａｉｎｓ　ａ　ＤＮＡ−ｂｉｎｄｉｎｇ　ｍｏｔｉｆ　ｗｉｔｈ　ｈｏｍｏｌｏｇｙ　ｔｏ　ＨＭＧ　ｐｒｏｔｅｉｎｓ．Ｎａｔｕｒｅ．３４４，８３０−８３６。

　Ｋａｅｌｉｎ，Ｗ．Ｇ．Ｊ．，Ｐａｌｌａｓ，Ｄ．Ｃ．，ＤｅＣａｐｒｉｏ，Ｊ．Ａ．，Ｋａｙｅ，Ｆ．Ｊ．ａｎｄ　Ｌｉｖｉｎｇｓｔｏｎ，Ｄ．Ｍ．（１９９１）．Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｃｅｌｌｕｌａｒ　ｐｒｏｔｅｉｎｓ　ｔｈａｔ　ｃａｎ　ｉｎｔｅｒａｃｔ　ｓｐｅｃｉｆｉｃａｌｌｙ　ｗｉｔｈ　ｔｈｅ　Ｔ／Ｅ１Ａ−ｂｉｎｄｉｎｇ　ｒｅｇｉｏｎ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｒｅｔｉｎｏｂｌａｓｔｏｍａ　ｇｅｎｅ　ｐｒｏｄｕｃｔ．Ｃｅｌｌ．６４，５２１−５３２。

　Ｋｅｅｇａｎ，Ｌ．，Ｇｉｌｌ，Ｇ．ａｎｄ　Ｐｔａｓｈｎｅ，Ｍ．（１９８６）．Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ　ｏｆ　ＤＮＡ　ｂｉｎｄｉｎｇ　ｆｒｏｍ　ｔｈｅｔｒａｓｃｒｉｐｔｉｏｎ−ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ　ｆｕｎｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ａ　ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ　ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ　ｐｒｏｔｅｉｎ．Ｓｃｉｅｎｃｅ．２３１，６９９−７０４。

　Ｋｅｙｏｍａｒｓｉ，Ｋ，Ｓａｎｄｏｖａｌ，Ｌ．，Ｂａｎｄ，Ｖ．ａｎｄ　Ｐａｒｄｅｅ，Ａ．Ｂ．（１９９１）．Ｓｙｎｃｈｒｏｎｉｚａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｔｕｍｏｒ　ａｎｄ　ｎｏｒｍａｌ　ｃｅｌｌｓ　ｆｒｏｍ　Ｇ１　ｔｏ　ｍｕｌｔｉｐｌｅ　ｃｅｌｌ　ｃｙｃｌｅｓ　ｂｙ　ｌｏｖａｓｔａｔｉｎ．Ｃａｎ．Ｒｅｓ．５１，３６０２−３６０９。

　Ｌａｎｄｓｃｈｕｌｚ，Ｗ．Ｈ．，Ｊｏｈｎｓｏｎ，Ｐ．Ｆ．，ＭｃＫｎｉｇｈｔ，Ｓ．Ｌ．（１９８８）．Ｔｈｅ　ｌｅｕｃｉｎｅ　ｚｉｐｐｅｒ：ａ　ｈｙｐｏｔｈｅｔｉｃａｌ　ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ　ｃｏｍｍｏｎ　ｔｏ　ａ　ｎｅｗ　ｃｌａｓｓ　ｏｆ　ＤＮＡ　ｂｉｎｄｉｎｇ　ｐｒｏｔｅｉｎｓ．Ｓｃｉｅｎｃｅ　２４０，１７５９−１７６４。

　Ｌａｕ，Ｌ．Ｆ．，Ｎａｔｈａｎｓ，Ｄ．（１９９１）．Ｇｅｎｅｓ　ｉｎｄｕｃｅｄ　ｂｙ　ｓｅｒｕｍ　ｇｒｏｗｔｈ　ｆａｃｔｏｒｓ．Ｔｈｅ　Ｈｏｒｍｏｎａｌ　ｃｏｎｔｒｏｌ　ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｇｅｎｅ　ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ　ｅｄ．Ｐ．Ｃｏｈｅｎ　＆　Ｊ．Ｇ．Ｆｏｕｌｋｅｓ．Ｅｌｓｅｖｉｅｒ　Ｓｃｉｅｎｃｅ　Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ．ｐｐ２５７−２９３。

　Ｌｅｅ，Ｅ．Ｙ．−Ｈ．Ｐ．，Ｔｏ，Ｈ，Ｓｈｅｗ，Ｊ．−Ｙ．，Ｂｏｏｋｓｔｅｉｎ，Ｒ，Ｓｃｕｌｌｙ，Ｐ．ａｎｄ　Ｌｅｅ，Ｗ．−Ｈ．（１９８８）．Ｉｎａｃｔｉｖａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｒｅｔｉｎｏｂｌａｓｔｏｍａ　ｓｕｓｃｅｐｔｉｂｉｌｉｔｙ　ｇｅｎｅ　ｉｎ　ｈｕｍａｎ　ｂｒｅａｓｔ　ｃａｎｃｅｒｓ．Ｓｃｉｅｎｃｅ．２４１，２１８−２２１。

　Ｌｅｅ，Ｗ．−Ｈ．，Ｈｏｌｌｉｎｇｓｗｏｒｔｈ，Ｒ．Ｅ．，Ｑｉａｎ，Ｙ−Ｗ．，Ｃｈｅｎ，Ｐ−Ｌ．，Ｈｏｎｇ，Ｆ．，Ｌｅｅ，ＥＹ−ＨＰ．（１９９１）．Ｔｈｅ　ＲＢ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　ａｓ　ａ　Ｃｅｌｌｕｌａｒ　’Ｃｏｒｒａｌ’　ｆｏｒ　Ｇｒｏｗｔｈ−Ｐｒｏｍｏｔｉｎｇ　Ｐｒｏｔｅｉｎｓ．Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｓｙｍｐ．Ｑｕａｎｔｉ．Ｂｉｏｌ．：Ｃｅｌｌ　Ｃｙｃｌｅ．６１，２１１−２１７。

　Ｌｅｅ，Ｗ．−Ｈ．，Ｂｏｏｋｓｔｅｉｎ，Ｒ，Ｈｏｎｇ，Ｆ．，Ｙｏｕｎｇ，Ｌ．−Ｊ．，Ｓｈｅｗ，Ｊ．−Ｙ．ａｎｄ　Ｌｅｅ，Ｅ．Ｙ．−Ｈ．Ｐ．（１９８７ａ）．Ｈｕｍａｎ　ｒｅｔｉｎｏｂｌａｓｔｏｍａ　ｓｕｓｃｅｐｔｉｂｉｌｉｔｙ　ｇｅｎｅ：　ｃｌｏｎｉｎｇ，ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ，ａｎｄ　ｓｅｑｕｅｎｃｅ　Ｓｃｉｅｎｃｅ．２３５，１３９４−１３９９。

　Ｌｅｅ，Ｗ．−Ｈ．，Ｓｈｅｗ，Ｊ．−Ｙ．，Ｈｏｎｇ，Ｆ．，Ｓｅｒｙ，Ｔ．，Ｄｏｎｏｓｏ，Ｌ．Ａ．，Ｙｏｕｎｇ，Ｌ．Ｊ．，Ｂｏｏｋｓｔｅｉｎ，Ｒ．ａｎｄ　Ｌｅｅ，Ｅ．Ｙ．−Ｈ．Ｐ．（１９８７ｂ）．Ｔｈｅ　ｒｅｔｉｎｏｂｌａｓｔｏｍａ　ｓｕｓｃｅｐｔｉｂｉｌｉｔｙ　ｇｅｎｅ　ｐｒｏｄｕｃｔ　ｉｓ　ａ　ｎｕｃｌｅａｒ　ｐｈｏｓｐｈｏｐｒｏｔｅｉｎ　ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ　ｗｉｔｈ　ＤＮＡ　ｂｉｎｄｉｎｇ　ａｃｔｉｖｉｔｙ．Ｎａｔｕｒｅ．３２９，６４２−６４５。

　Ｌｅｅｓ，Ｊ．Ａ．，Ｂｕｃｈｋｏｖｉｃｈ，Ｋ．Ｊ．，Ｍａｒｓｈａｋ，Ｄ．Ｒ．，Ａｎｄｅｒｓｏｎ，Ｃ．Ｗ．ａｎｄ　Ｈａｒｌｏｗ，Ｅ．（１９９１）．Ｔｈｅ　ｒｅｔｉｎｏｂｌａｓｔｏｍａ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｉｓ　ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｅｄ　ｏｎ　ｍｕｌｔｉｐｌｅ　ｓｉｔｅｓ　ｂｙ　ｈｕｍａｎ　ｃｄｃ２．ＥＭＢＯ　Ｊ．１０，４２７９−４２９０。

　Ｌｉｎ，Ｂ．Ｔ．，Ｇｒｕｅｎｗａｌｄ，Ｓ．，Ｍｏｒｉａ，Ａ．Ｏ．，Ｌｅｅ，Ｗ．−Ｈ．ａｎｄ　ｗａｎｇ，Ｊ．Ｙ．（１９９１）．Ｒｅｔｉｎｏｂｌａｓｔｏｍａ　ｃａｎｃｅｒ　ｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒ　ｇｅｎｅ　ｐｒｏｄｕｃｔ　ｉｓ　ａ　ｓｕｂｓｔｒａｔｅ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｃｅｌｌ　ｃｙｃｌｅ　ｒｅｇｕｌａｔｏｒ　ｃｄｃ２　ｋｉｎａｓｅ．ＥＭＢＯ　Ｊ．１０，８５７−８６４。

　ＭｃＫｅｏｎ，Ｆ．，Ｋｉｒｓｃｈｎｅｒ，Ｍ．，Ｃａｐｕｔ，Ｄ．（１９８６）．Ｈｏｍｏｌｏｇｉｅｓ　ｉｎ　ｂｏｔｈ　ｐｒｉｍａｒｙ　ａｎｄ　ｓｅｃｏｎｄａｒｙ　ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ　ｂｅｔｗｅｅｎ　ｎｕｃｌｅａｒ　ｅｎｖｅｌｏｐｅ　ａｎｄ　ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅ　ｆｉｌａｍｅｎｔ　ｐｒｏｔｅｉｎｓ．Ｎａｔｕｒｅ．３１９，４６３−４６８。

　Ｍｉｔｃｈｅｌｌ，Ｐ．Ｊ．ａｎｄ　Ｔｊｉａｎ，Ｒ．（１９８９）．Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ　ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ　ｉｎ　ｍａｍｍａｌｉａｎ　ｃｅｌｌｓ　ｂｙ　ｓｅｑｕｅｎｃｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ　ＤＮＡ　ｂｉｎｄｉｎｇ　ｐｒｏｔｅｉｎｓ．Ｓｃｉｅｎｃｅ．２４５，３７１−３７８。

　Ｍｕｄｒｙｊ，Ｍ．，Ｈｉｅｂｅｒｔ，，Ｓ．Ｗ．，Ｎｅｖｉｎｓ，Ｊ．Ｒ．（１９９０）．Ａ　ｒｏｌｅ　ｆｏｒ　ｔｈｅ　ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ　ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ　Ｅ２Ｆ　ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ　ｆａｃｔｏｒ　ｉｎ　ａ　ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ　ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ　ｓｉｇｎａｌ　ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ　ｐａｔｈｗａｙ．ＥＭＢＯ　Ｊ．９，２１７９−２１８４。

　Ｍｕｄｒｙｊ，Ｍ．，Ｄｅｖｏｔｏ，Ｓ．Ｈ．，Ｈｉｅｂｅｒｔ，Ｓ．Ｗ．，Ｈｕｎｔｅｒ，Ｔ．，Ｐｉｎｅｓ，Ｊ．，Ｎｅｖｉｎｓ，Ｊ．Ｒ．（１９９１）．Ｃｅｌｌ　ｃｙｃｌｅ　ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｅ２Ｆ　ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ　ｆａｃｔｏｒ　ｉｎｖｏｌｖｅｓ　ａｎ　ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ　ｗｉｔｈ　ｃｙｃｌｉｎ　Ａ．Ｃｅｌｌ．２８，１２４３−１２５３。

　Ｎｅｉｌｌ，Ｓ．Ｄ．，Ｎｅｖｉｎｓ，Ｊ．Ｒ．（１９９１）．Ｇｅｎｅｔｉｃ　ａｎａｌｙｓｉｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ　Ｅ４　６／７ｔｒａｎｓ　ａｃｔｉｖａｔｏｒ　ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ　ｗｉｔｈ　Ｅ２Ｆ　ａｎｄ　ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ａ　ｓｔａｂｌｅ　ＤＮＡ−ｐｒｏｔｅｉｎ　ｃｏｍｐｌｅｘ　ａｒｅ　ｃｒｉｔｉｃａｌ　ｆｏｒ　ａｃｔｉｖｉｔｙ．Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６５，５３６４−５３７３。

　Ｐｈｅｌｐｓ，Ｗ．Ｃ．，Ｍｕｎｇｅｒ，Ｋ．，Ｙｅｅ，Ｃ．Ｌ．，Ｂａｒｎｅｓ，Ｊ．Ａ．，Ｈｏｗｌｅｙ，Ｐ．Ｍ．（１９９２）．Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ−ｆｕｎｃｔｉｏｎ　ａｎａｌｙｓｉｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｈｕｍａｎ　ｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｕｓ　ｔｙｐｅ　１６　Ｅ７　ｏｎｃｏｐｒｏｔｅｉｎ．Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６６，２４１８−２４２７。

　Ｒｕｓｔｇｉ，Ａ．Ｋ．，Ｄｙｓｏｎ，Ｎ．ａｎｄ　Ｂｅｒｎａｒｄｓ，Ｒ．（１９９１）．Ａｍｉｎｏ−ｔｅｒｍｉｎａｌ　ｄｏｍａｉｎｓ　ｏｆ　ｃ−ｍｙｃ　ａｎｄ　Ｎ−ｍｙｃ　ｐｒｏｔｅｉｎｓ　ｍｅｄｉａｔｅ　ｂｉｎｄｉｎｇ　ｔｏ　ｔｈｅ　ｒｅｔｉｎｏｂｌａｓｔｏｍａ　ｇｅｎｅ　ｐｒｏｄｕｃｔ．Ｎａｔｕｒｅ．３５２，５４１−５４４。

　Ｓａｄｏｗｓｋｉ，Ｌ，Ｍａ，Ｊ．，Ｔｒｉｅｚｅｎｂｅｒｇ，Ｓ．，Ｐｔａｓｈｎｅ，Ｍ．（１９８８）．ＧＡＬ４−ＶＰ１６　ｉｓ　ａｎ　ｕｎｕｓｕａｌｌｙ　ｐｏｔｅｎｔ　ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ　ａｃｔｉｖａｔｏｒ．Ｎａｔｕｒｅ．３３５，５６３−５６４。

　Ｓｃｈｉｅｓｔｌ，Ｒ．Ｈ．ａｎｄ　Ｇｉｅｔｚ，Ｒ．Ｄ．（１９８９）．Ｈｉｇｈ　ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ　ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｉｎｔａｃｔ　ｙｅａｓｔ　ｃｅｌｌｓ　ｕｓｉｎｇ　ｓｉｎｇｌｅ　ｓｔｒａｎｄｅｄ　ｎｕｃｌｅｉｃ　ａｃｉｄｓ　ａｓ　ａ　ｃａｒｒｉｅｒ．Ｃｕｒｒ．Ｇｅｎｅｔ　１６，３３９−３４６。

　Ｓｈｅｎｏｙ，Ｓ．，Ｃｈｏｉ，Ｊ．−Ｋ，Ｂａｇｒｏｄｉａ，Ｓ．，Ｃｏｐｅｌａｎｄ，Ｔ．Ｄ．，Ｍａｌｌｅｒ，Ｊ．Ｌ．ａｎｄ　Ｓｈａｌｌｏｗａｙ，Ｄ．（１９８９）．Ｐｕｒｉｆｉｅｄ　ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ　ｐｒｏｍｏｔｉｎｇ　ｆａｃｔｏｒ　ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｅｓ　ｐｐ６０ｃ−ｓｒｃ　ａｔｔｈｅ　ｓｉｔｅｓ　ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｅｄ　ｄｕｒｉｎｇ　ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ　ｍｉｔｏｓｉｓ．Ｃｅｌｌ．５７，７６３−７７４。

　Ｓｈｅｗ，Ｊ．−Ｙ．，Ｌｉｎ，Ｂ．，Ｃｈｅｎ，Ｐ．−Ｌ．，Ｔｓｅｎｇ，Ｂ．Ｙ．，Ｙａｎｇ−Ｆｅｎｇ，Ｔ．Ｌ．ａｎｄ　Ｌｅｅ，Ｗ．−Ｈ．（１９９０）．Ｃ−ｔｅｒｍｉｎａｌ　ｔｒｕｎｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｔｈｅ　ＲＢ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｌｅａｄｓ　ｔｏ　ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ　ｉｎａｃｔｉｖａｔｉｏｎ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８７，６−１０。

　Ｓｈｉｒｏｄｋａｒ，Ｓ．，Ｅｗｅｎ，Ｍ，Ｄｅｃａｐｒｉｏ，Ｊ．Ａ．，Ｍｏｒｇａｎ，Ｊ．，Ｌｉｖｉｎｇｓｔｏｎ，Ｄ．Ｍ．，Ｃｈｉｔｔｅｎｄｅｎ，Ｔ．（１９９２）．Ｔｈｅ　ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ　ｆａｃｔｏｒ　Ｅ２Ｆ　ｉｎｔｅｒａｃｔｓ　ｗｉｔｈ　ｔｈｅ　ｒｅｔｉｎｏｂｌａｓｔｏｍａｐｒｏｄｕｃｔ　ａｎｄ　ａ　ｐ１０７−ｃｙｃｌｉｎ　Ａ　ｃｏｍｐｌｅｘ　ｉｎ　ａ　ｃｅｌｌ　ｃｙｃｌｅ−ｒｅｇｕｌａｔｅｄ　ｍａｎｎｅｒ．Ｃｅｌｌ．６８，１５７−１６６。

　Ｓｍｉｔｈ，Ｄ．Ｂ．，Ｊｏｈｎｓｏｎ，Ｋ．Ｓ．（１９８８）．Ｓｉｎｇｌｅ−ｓｔｅｐ　ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅｓｅｘｐｒｅｓｓｅｄ　ｉｎ　Ｅ．　ｃｏｌｉ　ａｓ　ｆｕｓｉｏｎｓ　ｗｉｔｈ　ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ　Ｓ−ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ．Ｇｅｎｅ．６７，３１−４０。

　Ｓｔｕｄｉｅｒ，Ｆ．Ｗ．，Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ，Ａ．Ｈ．，Ｄｕｎｎ，Ｊ．Ｊ．，Ｄｕｂｅｎｄｏｒｆｆ，Ｊ．Ｗ．（１９９０）．Ｕｓｅ　ｏｆ　Ｔ７　ＲＮＡ　ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ　ｔｏ　ｄｉｒｅｃｔ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｆ　ｃｌｏｎｅｄ　ｇｅｎｅｓ．Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ．１８５，６０−８９。

　Ｓｕｍｅｇｉ，Ｊ．，Ｕｚｖｏｌｇｙｉ，Ｅ．ａｎｄ　Ｋｌｅｉｎ，Ｇ．（１９９０）．Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｆ　ｔｈｅ　ＲＢ　ｇｅｎｅ　ｕｎｄｅｒ　ｔｈｅ　ｃｏｎｔｒｏｌ　ｏｆ　ＭｕＬＶ−ＬＴＲ　ｓｕｐｐｒｅｓｓｅｓ　ｔｕｍｏｒｉｇｅｎｉｃｉｔｙ　ｏｆ　ＷＥＲＩ−Ｒｂ−２７　ｒｅｔｉｎｏｂｌａｓｔｏｍａ　ｃｅｌｌｓ　ｉｎ　ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｅｃｔｉｖｅ　ｍｉｃｅ．Ｃｅｌｌ　Ｇｒｏｗｔｈ　Ｄｉｆｆｅｒ．１，２４７−２５０。

　Ｔａｋａｈａｓｈｉ，Ｒ．，Ｈａｓｈｉｍｏｔｏ，Ｔ．，Ｈｏｎｇ−Ｊｉ，Ｘ．，Ｈｕ，Ｓ．−Ｘ．，Ｍａｔｓｕｉ，Ｔ．，Ｍｉｋｉ，Ｔ．，Ｂｉｇｏ−Ｍａｒｓｈａｌｌ，Ｈ．，Ａａｒｏｎｓｏｎ，Ｓ．Ａ．ａｎｄ　Ｂｅｎｅｄｉｃｔ，Ｗ．Ｆ．（１９９１）．Ｔｈｅ　ｒｅｔｉｎｏｂｌａｓｔｏｍａ　ｇｅｎｅ　ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ　ａｓ　ａ　ｇｒｏｗｔｈ　ａｎｄ　ｔｕｍｏｒ　ｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒ　ｉｎ　ｈｕｍａｎ　ｂｌａｄｄｅｒ　ｃａｒｃｉｎｏｍａ　ｃｅｌｌｓ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．８８，５２５７−５２６１。

　Ｔｏｇｕｃｈｉｄａ，Ｊ．，Ｉｓｈｉｚａｋｉ，Ｋ．，Ｓａｓａｋｉ，Ｍ．Ｓ．，Ｉｋｅｎａｇａ，Ｍ．，Ｓｕｇｉｍｏｔｏ，Ｍ．，Ｋｏｔｏｕｒａ，Ｙ．ａｎｄ　Ｙａｍａｍｕｒｏ，Ｔ．（１９８８）．Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍａｌ−ｒｅｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ　ｆｏｒ　ｔｈｅ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｆ　ｒｅｃｅｓｓｉｖｅ　ｍｕｔａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｒｅｔｉｎｏｂｌａｓｔｏｍａ　ｓｕｓｃｅｐｔｉｂｉｌｉｔｙ　ｇｅｎｅ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｏｆ　ｏｓｔｅｏｓａｒｃｏｍａ．Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ．４８，３９３９−３９４３。

　Ｖｉｎｓｏｎ，Ｃ．Ｒ．，Ｓｉｇｌｅｒ，Ｐ．Ｂ．，ＭｃＫｎｉｇｈｔ，Ｓ．Ｌ．（１９８９）．Ｓｃｉｓｓｏｒｓ−Ｇｒｉｐ　Ｍｏｄｅｌ　ｆｏｒ　ＤＮＡ　ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ　ｂｙ　ａ　ｆａｍｉｌｙ　ｏｆ　ｌｅｕｃｉｎｅ　ｚｉｐｐｅｒ　ｐｒｏｔｅｉｎｓ．Ｓｃｉｅｎｃｅ．２４６，９１１−９１６。

　Ｗａｎｇ，Ｎ．−Ｐ．，Ｃｈｅｎ，Ｐ．−Ｌ，Ｈｕａｎｇ，Ｓ．，Ｄｏｎｏｓｏ，Ｌ．Ａ．，Ｌｅｅ，Ｗ．−Ｈ．ａｎｄ　Ｌｅｅ，Ｅ．Ｙ．−Ｈ．Ｐ．（１９９０ａ）．ＤＮＡ−ｂｉｎｄｉｎｇ　ａｃｔｉｖｉｔｙ　ｏｆ　ｒｅｔｉｎｏｂｌａｓｔｏｍａ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｉｓ　ｉｎｔｒｉｎｓｉｃ　ｔｏ　ｉｔｓ　ｃａｒｂｏｘｙｌ−ｔｅｒｍｉｎａｌ　ｒｅｇｉｏｎ．Ｃｅｌｌ　Ｇｒｏｗｔｈ　Ｄｉｆｆ．１，２３３−２３９。

　Ｗａｎｇ，Ｎ．Ｐ．，Ｑｉａｎ，Ｙ．，Ｃｈｕｎｇ，Ａ．Ｅ．，Ｌｅｅ，Ｗ．−Ｈ．ａｎｄ　Ｌｅｅ，Ｅ．Ｙ．−Ｈ．Ｐ．（１９９０ｂ）．Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｈｕｍａｎ　ｒｅｔｉｎｏｂｌａｓｔｏｍａ　ｇｅｎｅ　ｐｒｏｄｕｃｔ　ｐｐ１１０ＲＢ　ｉｎ　ｉｎｓｅｃｔ　ｃｅｌｌｓ　ｕｓｉｎｇｔｈｅ　ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ　ｓｙｓｔｅｍ．Ｃｅｌｌ　Ｇｒｏｗｔｈ　Ｄｉｆｆ．１，４２９−４３７。

　Ｗｈｙｔｅ，Ｐ．，Ｂｕｃｈｋｏｖｉｃｈ，Ｋ．Ｊ．，Ｈｏｒｏｗｉｔｚ，Ｊ．Ｍ．，Ｆｒｉｅｎｄ，Ｓ．Ｈ．，Ｒａｙｂｕｃｋ，Ｍ．，Ｗｅｉｎｂｅｒｇ，Ｒ．Ａ．ａｎｄ　Ｈａｒｌｏｗ，Ｅ．（１９８８）．Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ　ｂｅｔｗｅｅｎ　ａｎ　ｏｎｃｏｇｅｎｅ　ａｎｄ　ａｎ　ａｎｔｉ−ｏｎｃｏｇｅｎｅ：ｔｈｅ　ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ　Ｅ１Ａ　ｐｒｏｔｅｉｎｓ　ｂｉｎｄ　ｔｏ　ｔｈｅ　ｒｅｔｉｎｏｂｌａｓｔｏｍａ　ｇｅｎｅ　ｐｒｏｄｕｃｔ．Ｎａｔｕｒｅ．３３４，１２４−１２９。

　Ｙｅｅ，Ａ．Ｓ．，Ｒａｙｃｈａｕｄｈｕｒｉ，Ｐ．，Ｊａｋｏｉ，Ｌ，Ｎｅｖｉｎｓ，Ｊ．Ｒ．（１９８９）．Ｔｈｅ　ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ−ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ　ｆａｃｔｏｒ　Ｅ２Ｆ　ｓｔｉｍｕｌａｔｅｓ　ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ　ａｆｔｅｒ　ｓｐｅｃｉｆｉｃ　ＤＮＡ　ｂｉｎｄｉｎｇ．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ　Ｂｉｏｌ．９，５７８−５８５。

　Ｙｏｋｏｔａ，Ｊ．，Ａｋｉｙａｍａ，Ｔ．，Ｆｕｎｇ，Ｙ．−Ｋ．Ｔ．，Ｂｅｎｅｄｉｃｔ，Ｗ．Ｆ．，Ｎａｍｂａ，Ｙ．，Ｈａｎａｏｋａ，Ｍ．，Ｗａｄａ，Ｍ．，Ｔｅｒａｓａｋｉ，Ｔ．，Ｓｈｉｍｏｓａｔｏ，Ｙ．，Ｓｕｇｉｍｕｒａ，Ｔ．ａｎｄ　Ｔｅｒａｄａ，Ｍ．（１９８８）．Ａｌｔｅｒｅｄ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｒｅｔｉｎｏｂｌａｓｔｏｍａ　（ＲＢ）　ｇｅｎｅ　ｉｎ　ｓｍａｌｌ−ｃｅｌｌ　ｃａｒｃｉｎｏｍａ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｌｕｎｇ．Ｏｎｃｏｇｅｎｅ．３，４７１−４７５。

図１は、ＲＢ−サンドイッチスクリーニングの結果を示す。λｇｔ１１　ｃＤＮＡ発現ライブラリーをプレートして、精製したｐ５６−ＲＢ、抗ＲＢ抗体、およびアルカリホスファターゼを抱合した第二の抗体を含むＲＢ−サンドイッチを用いてスクリーニングした。ＡおよびＢは、ＲＢ−サンドイッチスクリーニングの図解である。ＣおよびＤは、ＲＢ−サンドイッチ（フィルターの左半分）を伴うハイブリッド化したフィルターであり、そこにおいて正の記号はＲｂＡｐ−ＲＢ複合体（Ｃ）またはＴ−抗原−ＲＢ複合体（Ｄ）を示す。フィルターの右半分はＲＢ−マイナスサンドイッチをプローブとした。 図２は、ｉｎ　ｖｉｔｒｏ　でのＲｂＡｐのＲＢとの結合を示す。それぞれのクローン（Ａｐ４，６，９，１０，１１，１２，１５）によるｃＤＮＡ挿入物をｐＦＬＡＧプラスミド中にサブクローンし、ＦＬＡＧ−Ａｐ融合タンパク質の溶解物をＧＳＴ−ＲＢビーズ（Ｒ）またはＧＳＴビーズ単独（Ｃ）と混合した。次に結合タンパク質を抗−ＦＬＡＧモノクローナル抗体を用いる免疫ブロットにより分析した。矢印は、抗−ＦＬＡＧ抗体により検出された、ＧＳＴ−ＲＢビーズに結合したＦＬＡＧ−Ａｐｓを示す。ＢＡＰ＝ＦＬＡＧ細菌性アルカリホスファターゼ融合タンパク質。 図３は、Ａｐ１２の細胞周期依存性発現を示す。ＣＶ１細胞から得た、細胞周期の種々の段階に同調させた全ＲＮＡを変性し、ホルムアルデヒドゲル電気泳動により分析した。ＲＮＡブロットを^３２ｐ−標識　Ａｐ１２　ｃＤＮＡ挿入物（Ｇ１２）とハイブリッド化した。レーン１はＧ１初期；レーン２はＧ１／Ｓ境界；レーン３はＳ期（アフィジコリン放出４時間後）；レーン４はＳ期（飢餓細胞再プレート１８時間後）；レーン５はＭ期である。ｍＲＮＡ（矢印で示す）の大きさは、ＲＮＡ試料に隣合う平行レーンを走るｒＲＮＡ　２８Ｓおよび１８Ｓの移動により測定した。 図４は、Ａｐ１２の制限マップおよび核酸およびアミノ酸配列を示す。クローンＡ６，　２，４９２ヌクレオチドの完全な配列が得られた。Ａ：　最長オープンリーデイングフレームを有するＡｐ１２（Ａ６）の制限マップ。Ｇ１２はＲＢ−サンドイッチスクリーニングで得られた最初のＡｐ１２クローンである。Ａ６およびＢ６をｃＤＮＡライブラリーの再スクリーニングにより単離した。Ａｐ１２誘導体の構築において使用した制限部位のみを示す。Ｂ：　Ａｐ１２の配列および予測されたアミノ酸配列。四角はロイシンの反復を示す。２つの推定されたＣｄｋリン酸化部位をアンダーラインで示す。 図５は、Ａｐ１２がＲＢの低リン酸化型とＴ類似部位で特異的に結合することを示す。Ａ、レーン１：モノクローナル抗−ＲＢ抗体、ｍＡｂ１１Ｄ７を用いたＭｏｌｔ４溶解物免疫沈降物。レーン２：分子マーカー。レーン３−５：Ｍｏｌｔ４細胞溶解物（５×１０^６ｃｅｌｌｓ）を、ＧＳＴビーズ（レーン３）、ＧＳＴ−Ａｐ１２（レーン４）およびＧＳＴ−Ｔ（レーン５）ビーズと混合した。洗浄後、ＧＳＴ融合物に結合したＲＢをモノクローナル抗−ＲＢ抗体、ｍＡｂ１１Ｄ７を用いる免疫ブロツテイングにより分析した。Ｂ：　細菌性ｐＥＴ−Ｔ７発現系で発現したＲＢ変異タンパク質のパネル。Ｔ−結合ドメインを強調する。Ｃ−Ｄ：細菌性に発現した野生型（ｐＥＴＲｂｃ）または変異ＲＢタンパク質（ｐＥＴＢ２，Ｓｓｐ，Ｘｓ，Ｍ８，Ｍ６，Ｍ９，Ｎｍ）を、ＧＳＴ−Ａｐ１２（Ｃ）またはＧＳＴ−Ｔ（Ｄ）ビーズと混合し、そして結合タンパク質をモノクローナル抗−ＲＢ抗体、ｍＡｂ２４５を用いるウェスタンブロット分析により測定した。 図６は、ＲＢ−結合にＡｐ１２のＣ−末端領域が必要であることを示す。一連のＧＳＴ−Ａｐ１２誘導体、Ｐ３、ＳＨ５、ＸＨ９、ＳＸ４、およびＸＸ４、を構築し（パネルＢに示す）、そしてＲＢ結合に使用した。細菌性に発現したｐＥＴＲｂｃ（野生型ＲＢ）をＧＳＴ−Ａｐ１２ビーズと混合して、モノクローナル抗−ＲＢ抗体、ｍＡｂ２４５を用いるウェスタンブロットにより分析した。Ｐ３に対する領域をコードするポリペプチドはアミノ酸３６２−４７６；ＳＨ５に対してはアミノ酸１６２−４７６；ＸＨ９に対してはアミノ酸１−４７６；ＳＸ４に対してはアミノ酸１６２−４５５；ＸＸ４に対してはアミノ酸１−４５５である。矢印はｐ１１０−ＲＢの位置を示す。 図７は、Ａｐ１２がＥ２Ｆ認識配列に特異的に結合することを示す。細菌性に発現したＧＳＴ−Ａｐ１２の誘導体（ｐ３，ＳＨ５，ＸＨ９）から調製した溶解物、およびＧＳＴ−Ａｐ９、ＧＳＴ−Ａｐ１５、および単独のＧＳＴをＤＮＡ移動度シフトアッセイに用いた。プローブはＫｌｅｎｏｗの補欠反応により^３２Ｐ−末端−標識した、２つのＥ２Ｆ認識部位を含むＤＮＡフラグメントで（材料と方法を参照）あった。Ａ：ＧＳＴ−Ａｐ１２ＳＨ５はＥ２Ｆ−特異性配列に結合する。陽性対照として、ＨｅＬａ細胞から得られる部分的に精製したＥ２Ｆタンパク質も同様に用いた。野生型Ｅ２Ｆ部位または変異型Ｅ２Ｆ部位のいずれかを含むＤＮＡフラグメントを競合物として用いた（材料と方法を参照）。レーン１：プローブ単独；レーン２：Ｅ２Ｆ　＋　プローブ；レーン３：Ｅ２Ｆ　＋　プローブ　＋　ｗｔ競合物；レーン４：Ｅ２Ｆ　＋　プローブ　＋変異株競合物；レーン５：ＳＨ５　＋プローブ；レーン６：ＳＨ５　＋プローブ＋　ｗｔ競合物；レーン７：ＳＨ５　＋プローブ＋変異株競合物。Ｂ：ＲＢはＡｐ１２−Ｅ２Ｆ　ＤＮＡ複合体と相互作用する。レーン１：プローブ単独；レーン２：ＳＨ５　＋プローブ；レーン３：ＳＨ５　＋　ｐ５６−ＲＢ（０．２５μｇ）、１５分間インキュベートした後、プローブを添加した；レーン４：ｐ５６−ＲＢ　＋プローブ；レーン５：ＳＨ５　＋プローブ；レーン６：ＳＨ５　＋プローブで１５分間、次にｐ５６−ＲＢを添加した。Ｃ：Ａｐ１２のＤＮＡ結合ドメインは潜在するｂＺＩＰモチーフを含む領域に位置する。レーン１：Ｐ３，２００ｎｇ；レーン２：Ｐ３，４００ｎｇ；レーン３：ＳＨ５，２０ｎｇ；レーン４：ＳＨ５，４０ｎｇ；レーン５：ＸＨ９，２０ｎｇ；レーン６：ＸＨ９，４０ｎｇ；レーン７：ＧＳＴ単独，２００ｎｇ；レーン８：ＧＳＴ−Ａｐ９，２００ｎｇ；レーン９：ＧＳＴ−Ａｐ１５，２００ｎｇ。 図８は、Ａｐ１２のＣ−末端が、酵母中のＧＡＬ４　ＤＮＡ結合ドメインと融合させたときに活性化ドメインとして役立つことを示す。ＧＡＬ４（アミノ酸　１−１４７）およびＧ１２（ＡＰ１２、アミノ酸　３６２−４７６）、１２Ｂ６（ＡＰ１２、アミノ酸　２２−４７６）、またはＲｂ２（ＲＢ、アミノ酸　３０１−９２８）のいずれかの融合タンパク質を、材料および方法の中に詳細に記載したようにして酵母中で発現した。プラスミドを用いて、Ｙ１５３をトリプトファン要求株に形質転換し、それぞれの形質転換体の単一コロニーをトリプトファン欠乏ドロップアウト培地上に筋状に植え付けた。３０℃で１日間培養した後、コロニーリフトアッセイを用いて細胞のβ−ガラクトシダーゼ活性を分析した。 図９は、Ａｐ１２がＥ２Ｆ認識部位を伴うプロモーターをトランス作用活性化することを示す。Ａ：Ａｐ１２　ｃＤＮＡ発現ベクターの図解。ＰＡ、ポリ（Ａ）。Ｂ：Ｅ２Ｆ認識配列を伴うプロモーターの転写活性化。ｐＡ_１０ＣＡＴまたはｐＥ２ＦＡ_１０ＣＡＴのいずれかの１０μｇを、ＣＭＶ−Ａｐ１２−ＳｔｕまたはＣＭＶ−Ａｐ１２−ＲＨの１０μｇとともにサル腎臓ＣＶ１細胞中に共トランスフェクションした。４８時間後、細胞を取り出してＣＡＴ活性を測定した。ＣＭＶ−Ｅ４をリポータープラスミドと共トランスフェクションして、リポータープラスミド単独の場合と同様に対照として用いた。 図１０は、クローンＡｐ２の核酸配列の一部を示す。ｐ＝５’配列；ｒ＝３’配列。 図１１は、クローンＡｐ８の核酸配列の一部を示す。ｐ＝５’配列；ｒ＝３’配列。 図１２は、クローンＡｐ１５の核酸配列の一部を示す。ｐ＝５’配列；ｒ＝３’配列。 図１３は、クローンＡｐ４の核酸の全配列を示す。 図１４は、クローンＡｐ１０の核酸の全配列を示す。 図１５は、クローンＡｐ１０の核酸の全配列を示す。

Claims (20)

1. 単離された核酸分子であって、該核酸分子は、ストリンジェントな条件下で、以下：
   １）ＲｂＡｐ２ｐ
   

   

   ２）ＲｂＡｐ２ｒ
   

   

   ３）ＲｂＡｐ８ｐ
   

   

   ４）ＲｂＡｐ８ｒ
   

   

   ５）ＲｂＡｐ１０
   

   

   

   

   

   ６）ＲｂＡｐ１５ｐ
   

   

   および、
   ７）ＲｂＡｐ１５ｒ
   

   

   からなる群より選択される配列を有する核酸分子またはそれらの相補体に対してハイブリダイズし、かつＲＢタンパク質に結合する活性を有するポリペプチドをコードする、単離された核酸分子。
2. 請求項１に記載の単離された核酸分子であって、該核酸分子が、ＲｂＡｐ１０
   

   

   

   

   

   の配列を有し、かつＲＢタンパク質に結合する活性を有するポリペプチドをコードする、単離された核酸分子。
3. １または数個のヌクレオチドの付加、欠失または置換によって、請求項２に記載の単離された核酸分子から誘導された、単離された核酸分子であって、該核酸分子は、ＲＢタンパク質に結合する活性を有するポリペプチドをコードする、単離された核酸分子。
4. 請求項１〜３のいずれか一つに記載の単離された核酸分子であって、該単離された核酸分子が、以下：
   　ａ）Ｅ２Ｆ認識配列に対して特異的に結合する能力；
   　ｂ）Ｅ２Ｆ認識配列を有するプロモーターをトランス活性化する能力；および
   　ｃ）Ｅ２Ｆ認識配列に対して特異的に結合し、かつＥ２Ｆ認識配列を有するプロモーターをトランス活性化する能力
   からなる群より選択される能力を有するポリペプチドをコードする、単離された核酸分子。
5. 哺乳動物ｃＤＮＡライブラリーから得られる単離された核酸分子であって、該核酸分子は、ストリンジェントな条件下で、以下：
   １）ＲｂＡｐ２ｐ
   

   

   ２）ＲｂＡｐ２ｒ
   

   

   ３）ＲｂＡｐ８ｐ
   

   

   ４）ＲｂＡｐ８ｒ
   

   

   ５）ＲｂＡｐ１０
   

   

   

   

   

   ６）ＲｂＡｐ１５ｐ
   

   

   および、
   ７）ＲｂＡｐ１５ｒ
   

   

   からなる群より選択される配列を有する核酸分子またはそれらの相補体に対してハイブリダイズし、かつＲＢタンパク質に結合する活性を有するポリペプチドをコードする、単離された核酸分子。
6. 前記核酸分子が、ＤＮＡ分子、ｃＤＮＡ分子、またはＲＮＡ分子である、請求項１〜５のいずれか１つに記載の単離された核酸分子。
7. 請求項１〜５のいずれか１つに記載の核酸分子によってコードされた、単離および精製されたポリペプチド。
8. 請求項１〜６のいずれか１つに記載の単離された核酸分子を含む、ベクター。
9. 請求項８に記載のベクターを含む、プラスミド。
10. 請求項８に記載のベクターを含む、ウィルス。
11. 請求項８に記載のベクターを含む、宿主細胞。
12. 請求項１１に記載の宿主細胞であって、該宿主細胞が細菌、酵母細胞、または哺乳動物細胞である、宿主細胞。
13. 請求項７に記載のポリペプチドに特異的に結合し得る、抗体。
14. 請求項１３に記載の抗体の、免疫学的に活性なポリペプチドフラグメント。
15. 請求項１３に記載の抗体であって、該抗体がモノクローナル抗体である、抗体。
16. 請求項１３に記載の抗体であって、該抗体が検出可能なマーカーで標識された、抗体。
17. 請求項１５または１６に記載の抗体を産生する、ハイブリドーマセルライン。
18. 試料中において、請求項７に記載のポリペプチドを検出する方法であって、該方法は、以下の工程：
    　ａ．抗体−抗原複合体を形成させる条件下で、請求項１３に記載の抗体を該試料と接触させる工程；
    　ｂ．形成された任意の複合体の存在を検出する工程；
    　ｃ．該複合体の存在が、該試料中における請求項７に記載のポリペプチドの存在を示す工程
    を包含する、方法。
19. 請求項７に記載のポリペプチドを組換えにより産生する方法であって、該方法は、該ポリペプチドを産生する好適な条件下で請求項１１に記載の宿主細胞を増殖する工程、およびそのようにして得られた該ポリペプチドを回収および精製する工程を包含する、方法。
20. 請求項１９に記載の方法によって組換え産生された、ポリペプチド。

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