JP2004081045A

JP2004081045A - Method and reagent for assaying d-mannose

Info

Publication number: JP2004081045A
Application number: JP2002244088A
Authority: JP
Inventors: Yoshiaki Nishiya; 西矢　芳昭; Tomohiro Tamura; 田村　具博; Noriko Tamura; 田村　範子
Original assignee: National Institute of Advanced Industrial Science and Technology AIST; Toyobo Co Ltd
Current assignee: National Institute of Advanced Industrial Science and Technology AIST; Toyobo Co Ltd
Priority date: 2002-08-23
Filing date: 2002-08-23
Publication date: 2004-03-18
Anticipated expiration: 2022-08-23
Also published as: JP3897661B2

Abstract

<P>PROBLEM TO BE SOLVED: To provide a method for assaying D-mannose, by which a large number of specimens are treated inexpensively, accurately and simply, and to obtain an assaying reagent. <P>SOLUTION: The method for assaying D-mannose comprises treating D-mannose in a sample with nicotinamide adenine dinucleotide-dependent dehydrogenase having ability for oxidizing D-mannose in the presence of oxidized nicotinamide adenine dinucleotide and determining formed reduced nicotinamide adenine dinucleotide. The reagent for assaying D-mannose comprises nicotinamide adenine dinucleotide-dependent dehydrogenase having ability for oxidizing D-mannose and oxidized nicotinamide adenine dinucleotide. <P>COPYRIGHT: (C)2004,JPO

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、酵素法による安価で正確かつ簡便なＤ−マンノースの測定方法及び測定用試薬に関する。
【０００２】
【従来の技術】
ヘキソースの１種であるＤ−マンノースは、生体内では、主に糖タンパク質や糖脂質などの糖鎖合成に利用されており、糖タンパク質の生合成や分泌、さらには、糖タンパク質の機能発現に重要な役割を果たしている。また、Ｄ−マンノースは、ヒト血中にも微量に存在しており、その供給経路は食物由来からの吸収はなく、主にグルコース代謝系（即ち、グルコース→グルコース−６−リン酸→フルクトース−６−リン酸→マンノース−６−リン酸）から供給されている。また、マンノース−６−リン酸から合成されるＧＤＰ−マンノース（マンノース−６−リン酸→マンノース−１−リン酸→ＧＤＰ−マンノース）は、マンノース糖鎖合成のドナーとして、重要な役割を果たしていることが知られている。
【０００３】
Ｄ−マンノースの血中濃度は、多くの報告があるが、平均値で１６〜８１μＭ、ＳＤの範囲では１１〜１４２μＭとされている（「日本臨牀」，　１９９５年，　第５３巻（増刊号），　ｐ．５７９−５８１）。血中のＤ−マンノース濃度は、血糖コントロール不良の糖尿病（「クリニカ・クリミカ・アクタ（Ｃｌｉｎ．　Ｃｌｉｍ．　Ａｃｔａ）」，　１９９６年，　第２５１巻，　ｐ．９１−１０３）や真菌感染症（「ジャーナル・オブ・クリニカル・マイクロバイオロジー（Ｊ．　Ｃｌｉｎ．　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．）」，　１９８５年，　第２１巻（６），　ｐ．９７２−９７９）の患者で上昇することが知られており、これら疾患の診断に有用であることが示唆されている。
【０００４】
糖尿病患者では、空腹時の血清マンノースが健常者の３〜５倍に上昇し、グルコースとよく相関することが知られている（「防衛医科大学校雑誌」，　１９９０年，　第１５巻（４），　ｐ．２１７−２２３；「クリニカ・クリミカ・アクタ（Ｃｌｉｎ．　Ｃｈｉｍ．　Ａｃｔａ）」，　１９９６年，　第２５１巻，　ｐ．９１−１０３）。特に、ケトアシドーシスの症例においては、約６７０μＭ（健常者平均値の５０倍）に達し、治療で約５０μＭにまで改善した（「防衛医科大学校雑誌」，　１９９０年，　第１５巻（４），　ｐ．２１７−２２３）。糖尿病の合併症では、網膜症の発症群で、血清マンノースが有意に高値だった（「糖尿病」，　１９９０年，　第３３巻（Ｓｕｐ．），　ｐ．１４４；「糖尿病」，　１９９１年，　第３４巻（Ｓｕｐ．），　ｐ．２７７）。白内障患者のレンズ中の糖鎖に含まれるマンノースの割合は、糖尿病群では非糖尿病群より高かった（「防衛医科大学校雑誌」，　１９９３年，　第１８巻（４），　ｐ．３０８−３１５）。妊娠糖尿病では、妊娠の初期、中期、後期を通じ、糖尿病群の血清マンノースは正常群より高く、妊娠初期のマンノース高値群で自然流産の頻度が高かった（「糖尿病」，　１９９０年，　第３３巻（９），　ｐ．７１９−７２５）などの報告がある。また、免疫力の低下した患者で問題になる真菌症、特に、カンジダ症においては、血清マンノースが１１０〜１，３１５μＭ（健常者平均値の６３倍）と、著しく上昇していたとの報告がある（「日本臨牀」，　１９９５年，　第５３巻（増刊号），　ｐ．５７９−５８１；「日本医事新報」，　１９８７年，　Ｎｏ．３２８６，　ｐ．４６−４８）。
【０００５】
生化学検査のほとんどの項目は、汎用の自動分析装置で測定されている。また、近年の医療費の高騰により、汎用の自動分析装置に対応できない、即ち、特殊な分析装置を必要とし、人手が必要で人件費のかかる検査項目は、事実上、臨床応用が困難な状況にある。これまで、Ｄ−マンノースの測定法として数多くの報告はあるが、何れも煩雑な操作を必要とするため、自動分析装置での測定は困難であった（「クリニカル・ケミストリー（Ｃｌｉｎ．　Ｃｈｅｍ．）」，　１９９７年，　第４３巻（３），　ｐ．５３３−５３８）。
【０００６】
最も信頼できるＤ−マンノースの測定法として、キャピラリー・ガスクロマトグラフィー（ＧＣ）法（防衛医科大学校雑誌　１５（４）　ｐ２１７−２２３（１９９０））やガスクロマトグラフィー・マススペクトロメトリー（ＧＣ−ＭＳ）法（「クリニカ・キミカ・アクタ（Ｃｌｉｎ．　Ｃｈｉｍ．　Ａｃｔａ）」，　１９９６年，　第２５１巻，　ｐ．９１−１０３）などの分離分析法が報告されているが、何れも、煩雑な前処理と高度なメンテナンス技術を要する特殊な装置を必要としていた。
【０００７】
また、酵素を用いたＤ−マンノースの測定法も幾つか報告されている。ひとつは、マンノースをヘキソキナーゼ（ＥＣ２．７．１．１）でリン酸化してマンノース−６−リン酸を生成させ、生成したマンノース−６−リン酸をマンノースリン酸イソメラーゼ（ＥＣ５．３．１．８）でフルクトース−６−リン酸へ異性化し、さらに、フルクトース−６−リン酸をグルコースリン酸イソメラーゼ（ＥＣ５．３．１．９）でグルコース−６−リン酸に異性化後、検体中のマンノース量に応じて生成したグルコース−６−リン酸を、補酵素の存在下にグルコース−６−リン酸脱水素酵素（ＥＣ１．１．１．４９）を用いて酸化し、この反応によって生じた補酵素の還元体を分光光度計で測定するものである（「クリニカル・ケミストリー（Ｃｌｉｎ．　Ｃｈｅｍ．），　１９８４年，　第３０巻（２），　ｐ．２９３−２９４）。この酵素系でＤ−マンノースを測定する場合、ヘキソキナーゼはグルコースもリン酸化するため、多量のグルコース−６−リン酸を生じ、これがグルコース−６−リン酸脱水素酵素と反応することになる。特に、ヒト血清中においては、グルコース量はマンノース量の１００倍ぐらいに達するため、測定前に、効率的に除去しておく必要がある。
【０００８】
ソヤマ（Ｓｏｙａｍａ）ら（「クリニカル・ケミストリー（Ｃｌｉｎ．　Ｃｈｅｍ．），　１９８４年，　第３０巻（２），　ｐ．２９３−２９４）及びアカザワ（Ａｋａｚａｗａ）ら（「ジャーナル・オブ・クリニカル・エンドクリノロジー・アンド・メタボリズム（Ｊ．　Ｃｌｉｎ．　Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．　Ｍｅｔａｂ．）」，　１９８６年，　第６２巻（５），　ｐ．９８４−９８９）は、グルコースオキシダーゼを用いてグルコースを除去する方法を報告している。具体的には、グルコースオキシダーゼとカタラーゼを用いて予め試料中のグルコースを除去し、アデノシン三リン酸の存在下、マンノースにヘキソキナーゼを作用させてマンノース−６−リン酸に変換し、続いてマンノース−６−リン酸イソメラーゼを作用させてフルクトース−６−リン酸に変換した後、更にグルコース−６−リン酸イソメラーゼを作用させてグルコース−６−リン酸とし、最後に、補酵素ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（以下、ＮＡＤと示す）の存在下、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼを作用させて生じた還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（以下、ＮＡＤＨと示す）の吸光度（３４０ｎｍ）を分光光度計で測定することにより、マンノースを定量している。しかしながら、本測定法では、グルコースの除去が不完全であったり、長時間に反応すると、マンノースまで反応してしまうという問題があった（「クリニカル・ケミストリー（Ｃｌｉｎ．　Ｃｈｅｍ．）」，　１９９７年，　第４３巻（３），　ｐ．５３３−５３８）。
【０００９】
上記酵素法の改良として、ピトカネン（Ｐｉｔｋａｎｅｎ）らにより、グルコースやフルクトースが共存する試料に、アデノシン三リン酸及びニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（以下、ＮＡＤＰと示す）存在下、ヘキソキナーゼ、グルコース−６−リン酸イソメラーゼを作用させて、グルコースやフルクトースをグルコース−６−リン酸に変換し、更にグルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼを添加してグルコース−６−リン酸をグルコン酸−６−リン酸に変換し、このときに生じる還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（以下、ＮＡＤＰＨと示す）を塩酸酸性下で分解することにより、グルコース等による影響を除去した後、上記方法と同様にして、マンノースにヘキソキナーゼ、マンノース−６−リン酸イソメラーゼ、グルコース−６−リン酸イソメラーゼ、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼを作用させて生じたＮＡＤＰＨの吸光度（３４０ｎｍ）を測定するマンノースの定量方法が報告されている（「ヨーロピアン・ジャーナル・オブ・クリニカル・ケミストリー・アンド・クリニカル・バイオケミストリー（Ｅｕｒ．　Ｊ．　Ｃｌｉｎ．　Ｃｈｅｍ．　Ｃｌｉｎ．　Ｂｉｏｃｈｅｍ．）」，　１９９７年，　第３５巻（１０），　ｐ．７６１−７６６）。
【００１０】
また、ジェームズ（Ｊａｍｅｓ）らは、グルコキナーゼ（ＥＣ２．７．１．２）を用いてグルコースを選択的にリン酸化し、生じたグルコース−６−リン酸をアニオン交換樹脂を充填した遠心型のミニカラムで吸着除去後、吸着されずに通過液中に回収されたマンノースを、前記の酵素を用いたマンノース測定法で検出している（「クリニカル・ケミストリー（Ｃｌｉｎ．　Ｃｈｅｍ．）」，　１９９７年，　第４３巻（３），　ｐ．５３３−５３８）。しかしながら、上述した酵素法は、数種の酵素反応を組み合わせた複雑な酵素共役系を介することから、すべての酵素の至適化を行なうことが困難であり、また、高価な酵素を多数組み合わせて用いるためコスト面でも問題があった。更に、生体試料由来の成分や夾雑物の影響を受け易い欠点があった。
【００１１】
また、特開平１１−２６６８９６号公報には、あらかじめ検体をピラノースオキシダーゼ又はＬ−ソルボースオキシダーゼ等のグルコースの２位酸化酵素、或いはピラノースオキシダーゼ又はＬ−ソルボースオキシダーゼ等のグルコースの２位酸化酵素とグルコースオキシダーゼ等のグルコースの１位酸化酵素を組み合わせて処理し、検体中に存在するグルコースを完全に除去してからマンノースを測定する方法が記載されている。更に、特開２００１−１９７９００号公報には、ＮＡＤＰ依存性アルドヘキソースデヒドロゲナーゼを用いたマンノースの定量方法が記載されている。しかしながら、ＮＡＤＰはＮＡＤより試薬として数倍高価であり、コスト面で優れる測定方法及び測定試薬の開発が望まれていた。
【００１２】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、安価であり、正確かつ簡便で多数の検体処理が可能なＤ−マンノースの測定方法及び測定用試薬を提供することにある。
【００１３】
【課題を解決するための手段】
上記目的を達成するため、本発明者らは、試料中のＤ−マンノースに、Ｄ−マンノースに対して酸化能を有するＮＡＤ依存性脱水素酵素をＮＡＤの存在下において作用させ、生成されたＮＡＤＨを定量することを特徴とするＤ−マンノースの測定方法を開発した。本発明により、試料中のＤ−マンノースを、安価で、正確かつ簡便に測定することが可能となった。また、本発明を用いることにより、Ｄ−マンノース測定において多数の検体処理が可能となった。
【００１４】
すなわち、本発明は以下のような構成からなる。
（１）試料中のＤ−マンノースに、Ｄ−マンノースに対して酸化能を有するＮＡＤ依存性脱水素酵素をＮＡＤの存在下において作用させ、生成されたＮＡＤＨを定量することを特徴とするＤ−マンノースの測定方法。
（２）ＮＡＤ依存性脱水素酵素が、アーキア由来のアルドヘキソースデヒドロゲナーゼである上記（１）のＤ−マンノースの測定方法。
（３）Ｄ−マンノースに対して酸化能を有するＮＡＤ依存性脱水素酵素とＮＡＤとを含むことを特徴とするＤ−マンノースの測定用試薬。
（４）ＮＡＤ依存性脱水素酵素が、アーキア由来のアルドヘキソースデヒドロゲナーゼである上記（３）のＤ−マンノースの測定用試薬。
【００１５】
本発明の測定方法において、試料がＤ−マンノースの他にＤ−グルコースを含有するものである場合には、試料中のＤ−グルコースをグルコキナーゼ及びアデノシン三リン酸などのグルコース消去剤によってＮＡＤ依存性脱水素酵素と反応しない構造に変化させた後、ＮＡＤ依存性脱水素酵素を作用させることが好ましい。また、本発明の測定方法において、ＮＡＤ依存性脱水素酵素はアーキア由来のアルドヘキソースデヒドロゲナーゼであることが好ましい。また、試料としては、特に限定されないが、生体試料、例えば、血液、血清、血漿、髄液及び尿などから調製された試料であることが好ましい。
【００１６】
本発明のＤ−マンノース測定用試薬は、更にグルコキナーゼ及びアデノシン三リン酸などのグルコース消去剤を含んでもよい。また、本発明の測定用試薬に用いられる酵素は、ＮＡＤ依存性脱水素酵素がアーキア由来のアルドヘキソースデヒドロゲナーゼであることが好ましい。
【００１７】
本発明によれば、主反応に関与する酵素はＤ−マンノースに対して酸化能を有するＮＡＤ依存性脱水素酵素のみであり、複雑な酵素共役系を介することなく、簡便にかつ正確にＤ−マンノースを定量できる。また、補酵素としてＮＡＤを用いるため、安価な測定系となる。更に、汎用の自動分析装置を用いて多数の検体処理が可能である。
【００１８】
【発明の実施の形態】
本発明において、試料（検体）としては、Ｄ−マンノースの濃度を測定したいものであれば特に制限はないが、血液、血清、血漿、髄液、尿等の生体試料、又はこれらの生体試料から調製された試料、例えば、Ｄ−マンノースを測定しやすいように各種の方法で前処理した試料等が好ましく使用される。このような前処理としては、例えば、Ｄ−グルコースが共存する試料において、グルコースを予め除去するなどの処理が挙げられる。
【００１９】
本発明に用いられる酵素としては、Ｄ−マンノースに対して酸化能を有するＮＡＤ依存性脱水素酵素であればよく、特に制限はないが、好ましくは、アーキア由来のＮＡＤ依存性アルドヘキソースデヒドロゲナーゼが挙げられる。具体的には、例えば、サーモプラズマ・アシッドフィラム（Ｔｈｅｒｍｏｐｌａｓｍａ　ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｍ）から得られるＮＡＤ依存性アルドヘキソースデヒドロゲナーゼが挙げられる。更に具体的には、本発明者らが単離したサーモプラズマ・アシッドフィラム（Ｔｈｅｒｍｏｐｌａｓｍａ　ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｍ）ＡＴＣＣ２５９０５株から得られるＮＡＤ依存性アルドヘキソースデヒドロゲナーゼが挙げられる。本発明に用いられる酵素は、該酵素を生産する微生物を培養して菌体を回収し、この菌体を超音波処理等により破砕して得られる破砕液を、必要に応じて、硫安分画、イオン交換クロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィー、ハイドロキシアパタイトゲル、ゲル濾過等のカラムクロマトグラフィを組み合わせて精製することにより得ることができる。
【００２０】
なお、ＮＡＤ依存性脱水素酵素の使用濃度は、特に限定されないが、０．００１〜５単位／ｍｌ、特に０．１〜２単位／ｍｌの範囲とすることが好ましい。
【００２１】
本発明においては、補酵素（電子受容体）としてＮＡＤを用いる。ＮＡＤの使用濃度は、０．０１〜１０ｍｍｏｌ／ｍｌ、特に０．５〜２ｍｍｏｌ／ｍｌの範囲が好ましい。
【００２２】
また、補酵素の還元体を定量するために、還元されることによって発色する発色剤を併用してもよい。かかる発色剤は、使用する補酵素に応じて適宜選択すればよいが、例えば、ＮＡＤの還元体であるＮＡＤＨを定量するために、電子キャリアーとして、フェナジンメトサルフェートやジアホラーゼとテトラゾリウム塩を共存させ、生成されるホルマザン色素を比色定量する方法が挙げられる。
【００２３】
更に、本発明に用いるＤ−マンノースに対して酸化能を有するＮＡＤ依存性脱水素酵素がＤ−マンノース以外にＤ−グルコースにも作用を示す場合、生体試料によっては、グルコースの影響を受けることがある。したがって、生体試料に対する測定精度をより高めるためには、グルコース消去剤を併用することがより好ましい。このグルコース消去剤としては、グルコース６位リン酸化酵素とアデノシン三リン酸とを含有するものが好ましく用いられ、具体的には、グルコキナーゼ、ヘキソキナーゼ等が挙げられ、市販のものを使用できるが、さらに好ましくはグルコースに特異性の高いグルコキナーゼが用いられる。それらの使用量は、試料中のグルコース量により異なるが、概ね０．１〜５０単位／ｍｌである。また、グルコースのリン酸化に必要なアデノシン三リン酸の量は、試料中のグルコース量により異なるが、概ね１〜２０ｍＭである。更に、グルコースリン酸化反応を促進するものとして通常、マグネシウムイオンを５〜５０ｍＭ程度含有させる。グルコース消去のためのグルコースリン酸化反応は、ｐＨ６〜１０の緩衝液中、２０〜５０℃、望ましくは２５〜３７℃で、添加直後から１０分程度行なわれる。
【００２４】
本発明において使用できる緩衝液としては、ｐＨ６〜１０のリン酸緩衝液、グリシン緩衝液、トリス塩酸緩衝液、グッド緩衝液、ホウ酸緩衝液等、通常使用されるものであれば、いずれも使用可能である。
【００２５】
本発明のＤ−マンノース測定用試薬は、グルコース消去剤と測定用酵素とを別々に組合せてもよい。より具体的には、ＮＡＤとグルコース消去剤とを含む第１試薬と、Ｄ−マンノースに対して酸化能を有するＮＡＤ依存性脱水素酵素を含む第２試薬との２試薬で構成するのが好ましい。
【００２６】
本発明のＤ−マンノース測定用試薬を生体試料に添加して反応を行わせた後、反応液中で還元された補酵素の測定は、例えば、補酵素ＮＡＤの還元体に特有な吸収波長における吸光度を測定したり、補酵素ＮＡＤの還元体によって発色する発色剤の発色強度を測定することなどによって行うことができる。
【００２７】
【実施例】
以下、実施例を挙げて本発明を具体的に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。
【００２８】
酵素製造例（ＮＡＤ依存性アルドヘキソースデヒドロゲナーゼの製造）
（１）染色体ＤＮＡの分離
サーモプラズマ・アシッドフィラム（Ｔｈｅｒｍｏｐｌａｓｍａ　ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｍ）ＡＴＣＣ２５９０５株の染色体ＤＮＡを次の方法で分離した。
同菌株を、酵母エキス（ディフコ社製）１ｇ／ｌ、グルコース１０ｇ／ｌ、（ＮＨ_４）_２ＳＯ_４　１．３２ｇ／ｌ、ＫＨ_２ＰＯ_４　０．３７２ｇ／ｌ、ＭｇＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ　０．２４７ｇ／ｌ、ＣａＣｌ_２・２Ｈ_２Ｏ　０．０７４ｇ／ｌ、１０ｍｌ／ｌの微量元素溶液（ＦｅＣｌ_３・６Ｈ_２Ｏ　１．９３ｇ／ｌ、ＭｎＣｌ_２・４Ｈ_２Ｏ　０．１８ｇ／ｌ、Ｎａ_２Ｂ_４Ｏ_７・１０Ｈ_２Ｏ　０．４５ｇ／ｌ、ＺｎＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ　２２ｍｇ／ｌ、ＣｕＣｌ_２・２Ｈ_２Ｏ　５ｍｇ／ｌ、ＮａＭｏＯ_４・２Ｈ_２Ｏ　３ｍｇ／ｌ、ＶＯＳＯ_４・２Ｈ_２Ｏ　３ｍｇ／ｌ、ＣｏＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ　１ｍｇ／ｌ）を加え、硫酸でｐＨを１．３に調節した培地で、５８℃、二晩振とう培養した後、遠心分離（４，０００ｒｐｍ、１５分間）により集菌した。遠心チューブ内に残存する培養液をキムワイプで拭き取った後、細胞１ｇあたり２０％シュークロース、１００ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ８．０）、５０ｍＭ　ＥＤＴＡ、０．１％　ＳＤＳを含んだ溶液１５ｍｌに懸濁し、１５０μｌのプロテアーゼＫ溶液（１０ｍｇ／ｍｌ）と１５０μｌのＲＮＡｓｅＡ（１０ｍｇ／ｍｌ）を加え、３７℃、１２時間保温した。これを等量のクロロホルム／フェノール溶液で処理後、遠心分離により水層を分取する操作を３回繰り返した。得られた水層に６００μｌの５Ｍ　ＮａＣｌを加え混合した後、０．８倍量のイソプロピルアルコールを加え、転倒混和後に出現するＤＮＡを硝子棒に巻き付け、精製ＤＮＡ標品とした。この精製ＤＮＡを５ｍｌの１ｍＭ　ＥＤＴＡを含んだ１０ｍＭトリス塩酸（ｐＨ８．０）溶液（以下、ＴＥと略記する）に再溶解し、２００μｌの５Ｍ　ＮａＣｌを加え混合した後、０．８倍量のイソプロピルアルコールを加え、再抽出したＤＮＡを７０％エタノール溶液で洗浄後、風乾してから、１ｍｌのＴＥで溶解した。
【００２９】
（２）ＮＡＤ依存性アルドヘキソースデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子を含有するＤＮＡ断片及び該ＤＮＡ断片を有する組換えベクターの調製
ＰＣＲ用プライマーＴａ０７５４ｓ（配列表の配列番号３）、Ｔａ０７５４ａｓ（配列表の配列番号４）を作製し、（１）のＤＮＡを鋳型とし、Ｐｆｕｔｕｒｂｏ　ＤＮＡポリメラーゼを用い、以下のサイクルでＰＣＲを行った。
ステップ１：９４℃、１分
ステップ２：５８℃、１分
ステップ３：７２℃、２．５分（３０サイクル）
得られたＰＣＲ産物を１％アガロースゲルにて泳動すると、０．７８ｋｂの大きさの特異的バンドが認められたので、これを常法にて単離し、制限酵素ＮｃｏＩとＸｈｏＩで消化し、同じくＮｃｏＩとＸｈｏＩで消化して得られたｐＥＴ２８開環物とライゲーション後、エシェリヒア・コリＸＬ１／Ｂｌｕｅを形質転換し、ｐＥＴ／Ｔａ０７５４を作製した。
【００３０】
（３）塩基配列の決定
ｐＥＴ／Ｔａ０７５４の約０．８ｋｂｐの挿入ＤＮＡについて、ＢｉｇＤｙｅ　Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ　Ｃｙｃｌｅ　Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ　Ｒｅａｄｙ　Ｒｅａｃｔｉｏｎ　Ｋｉｔ（アプライドバイオシステムズ社）とＡＢＩ３１００（アプライドバイオシステムズ社）を用いて塩基配列を決定した。決定した塩基配列及びアミノ酸配列をそれぞれ配列表の配列番号２及び１に示した。アミノ酸配列から求められるタンパク質の分子量は約２８，９００であった。
【００３１】
（４）形質質転換体の作製
エシェリヒア・コリＢＬ２１（ＤＥ３）ＲＩＬのコンピテントセルをｐＥＴ／Ｔａ０７５４で形質転換し、形質転換体エシェリヒア・コリＢＬ２１（ＤＥ３）ＲＩＬ（ｐＥＴ／Ｔａ０７５４）を得た。
【００３２】
（５）エシェリヒア・コリＢＬ２１（ＤＥ３）ＲＩＬ（ｐＥＴ／Ｔａ０７５４）からのＮＡＤ依存性アルドヘキソースデヒドロゲナーゼの製造
ＬＢ培地１００ｍｌを５００ｍＬフラスコに分注し、１２１℃、２０分間オートクレーブを行い、放冷後、別途無菌濾過した１０ｍｇ／ｍｌカナマイシン、３３ｍｇ／ｍｌクロラムフェニコール（ナカライテスク製）０．１ｍｌを添加した。この培地に、ＬＢ培地で予め３０℃、１７時間振とう培養したエシェリヒア・コリＢＬ２１（ＤＥ３）ＲＩＬ（ｐＥＴ／Ｔａ０７５４）の培養液１ｍｌを接種し、３７℃で９時間通気攪拌培養した。ＬＢ培地９００ｍｌを２Ｌフラスコに分注し、１２１℃、２０分間オートクレーブを行い、放冷後、別途無菌濾過した１０ｍｇ／ｍｌカナマイシン、３３ｍｇ／ｍｌクロラムフェニコール（ナカライテスク製）０．９ｍｌを添加した。この培地に、先程の９時間培養したエシェリヒア・コリＢＬ２１（ＤＥ３）ＲＩＬ（ｐＥＴ／Ｔａ０７５４）の培養液１００ｍｌを接種し、３７℃で１７時間通気攪拌培養した。培養終了時のＮＡＤ依存性アルドヘキソースデヒドロゲナーゼ活性は約４Ｕ／ｍｌであった。
上記菌体を遠心分離にて集菌し、５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ８．０）に懸濁した。上記菌体懸濁液を超音波で破砕し、遠心分離を行い、上清液を得た。得られた粗酵素液を６０℃、６０分間熱処理し、遠心分離を行い、上清液を得た。ポリエチレンイミンによる除核酸処理及び硫安分画を行った後、セファデックス（Ｓｅｐｈａｄｅｘ）Ｇ−２５（ファルマシアバイオテク製）によるゲル濾過により脱塩し、ＤＥＡＥセファロースＣＬ−６Ｂ（アマーシャム・ファルマシア・バイオテク製）カラムクロマトグラフィー、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ−２００（アマーシャム・ファルマシア・バイオテク製）カラムクロマトグラフィーにより分離、精製を行い、精製酵素標品を得た。本方法により得られたＮＡＤ依存性アルドヘキソースデヒドロゲナーゼ標品は、電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）的にほぼ単一なバンドを示し、この時の比活性は３８Ｕ／ｍｇ−ｓ−タンパク質であった。これをＮＡＤ依存性アルドヘキソースデヒドロゲナーゼの精製酵素液とし、以下の実施例に用いた。
【００３３】
実施例
上記酵素製造例で得られたＮＡＤ依存性アルドヘキソースデヒドロゲナーゼと、電子受容体として補酵素ＮＡＤ（オリエンタル酵母製）を用いて、以下に示すＤ−マンノース定量用試薬を作成した。
・試薬組成：
５０ｍＭ　トリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．５）
１．２ｍＭ　ＮＡＤ
２Ｕ／ｍｌ　ＮＡＤ依存性アルドヘキソースデヒドロゲナーゼ
そして、この試薬を用いて、以下に示すようにして、各種濃度（１〜１０ｍＭ）のＤ−マンノース溶液を測定した。
各濃度のＤ−マンノース溶液各１０μｌに対し、試薬２９０μｌを添加して３７℃で５分反応させ、波長３４０ｎｍの吸光度の１分間当りの変化をレイトアッセイにて測定した。これらの操作は、日立７０６０形自動分析装置により行った。この結果を図１に示す。
図１から、Ｄ−マンノース濃度０〜１０ｍＭまで、直線的な吸光度変化の上昇が得られ、正確なＤ−マンノースの定量が可能であることが分かる。
【００３４】
【発明の効果】
このように、本発明によれば、Ｄ−マンノースを含む試料にＮＡＤ依存性アルドヘキソースデヒドロゲナーゼ及び電子受容体としてＮＡＤを添加し作用させることにより、ＮＡＤ依存性アルドヘキソースデヒドロゲナーゼがＤ−マンノースに直接作用して、生成されたＮＡＤの還元体を測定することにより、正確なＤ−マンノースの定量が可能となる。本発明により、安価であり、正確かつ簡便なＤ−マンノースの測定方法及び測定用試薬が提供される。また、本発明は、反応系が簡単であるため、各種自動分析装置への適用も容易であり、多数の検体処理にも適している。
【００３５】
【配列表】

【図面の簡単な説明】
【図１】本発明によるＤ−マンノース測定の結果を示す。[0001]
TECHNICAL FIELD OF THE INVENTION
The present invention relates to an inexpensive, accurate and simple method for measuring D-mannose and a reagent for measurement by an enzymatic method.
[0002]
[Prior art]
D-mannose, a kind of hexose, is mainly used in vivo for the synthesis of sugar chains such as glycoproteins and glycolipids, and is used for the biosynthesis and secretion of glycoproteins, and also for the function expression of glycoproteins. Plays an important role. D-mannose is also present in trace amounts in human blood, and its supply route is not absorbed from food, and is mainly in the glucose metabolism system (namely, glucose → glucose-6-phosphate → fructose-). 6-phosphate → mannose-6-phosphate). Also, GDP-mannose synthesized from mannose-6-phosphate (mannose-6-phosphate → mannose-1-phosphate → GDP-mannose) plays an important role as a donor for mannose sugar chain synthesis. It is known.
[0003]
Although there are many reports on the blood concentration of D-mannose, it has been determined that the average value is 16 to 81 μM and the SD range is 11 to 142 μM (“Nippon Rinsho”, 1995, vol. 53 (extra number)). Pp. 579-581). Blood D-mannose levels can be measured in diabetes with poor glycemic control (“Clinica Clima Acta”, 1996, Vol. 251, pp. 91-103) and fungal infections (“Journal”). Of clinical microbiology (J. Clin. Microbiol.), 1985, vol. 21 (6), p. 972-979), and the diagnosis of these diseases is known. Has been suggested to be useful.
[0004]
In diabetic patients, it is known that fasting serum mannose increases 3 to 5 times that of healthy subjects and correlates well with glucose ("Defense Medical College Journal", 1990, Vol. 15, (4)). , Pp. 217-223; "Clinica Chimica Acta", 1996, Vol. 251, pp. 91-103). In particular, in the case of ketoacidosis, it reached about 670 μM (50 times the average value of healthy subjects), and improved to about 50 μM by treatment (“Defense Medical College Journal”, 1990, Vol. 15, (4), 217-223). Among the complications of diabetes, serum mannose was significantly higher in the group of retinopathy (“Diabetes”, 1990, Vol. 33 (Sup.), P. 144; “Diabetes”, 1991, 34). Vol. (Sup.), P. 277). The proportion of mannose contained in the sugar chain in the lens of the cataract patient was higher in the diabetic group than in the non-diabetic group ("Defense Medical College Journal", 1993, 18 (4), pp. 308-315). . In gestational diabetes mellitus, serum mannose was higher in the diabetic group than in the normal group, and spontaneous abortion was more frequent in the high mannose group in the early pregnancy throughout the early, middle and late stages of pregnancy ("Diabetes", 1990, Vol. 33 ( 9), pp. 719-725). In addition, it has been reported that serum mannose was significantly increased to 110 to 1,315 μM (63 times the average of healthy subjects) in mycosis, particularly candidiasis, which is a problem in patients with reduced immunity. ("Nippon Rinsho", 1995, vol. 53 (extra number), p. 579-581; "Nippon Medical Affairs News", 1987, No. 3286, p. 46-48).
[0005]
Most items in biochemical tests are measured by general-purpose automatic analyzers. In addition, due to the recent rise in medical costs, it is not possible to use general-purpose automatic analyzers. In other words, test items that require special analyzers, require human labor, and are labor-intensive are practically difficult to apply clinically. It is in. There have been many reports on D-mannose measurement methods, but all of them require complicated operations, and therefore, measurement with an automatic analyzer was difficult (“Clinical Chem.”). 1997, Vol. 43 (3), pp. 533-538).
[0006]
As the most reliable measurement method of D-mannose, capillary gas chromatography (GC) method (National Defense Medical College journal 15 (4) p217-223 (1990)) and gas chromatography / mass spectrometry (GC-MS) (“Clinica Chimica Acta”, 1996, Vol. 251, pp. 91-103), etc., all of which have been reported. Special equipment that required advanced maintenance technology was required.
[0007]
Some methods for measuring D-mannose using enzymes have also been reported. One is that mannose is phosphorylated by hexokinase (EC 2.7.1.1) to produce mannose-6-phosphate, and the produced mannose-6-phosphate is converted to mannose phosphate isomerase (EC 5.3.1. 8) isomerization to fructose-6-phosphate, and fructose-6-phosphate is further isomerized to glucose-6-phosphate with glucose phosphate isomerase (EC 5.3.1.9). Glucose-6-phosphate produced according to the amount of mannose is oxidized using glucose-6-phosphate dehydrogenase (EC 1.1.1.149) in the presence of a coenzyme, and is produced by this reaction. The coenzyme reduced form is measured by a spectrophotometer ("Clin. Chem.", 1984, 30 (2), pp. 293-294). When D-mannose is measured with this enzyme system, hexokinase also phosphorylates glucose, so that a large amount of glucose-6-phosphate is produced, which reacts with glucose-6-phosphate dehydrogenase. In particular, in human serum, the amount of glucose reaches about 100 times the amount of mannose, so that it is necessary to efficiently remove glucose before measurement.
[0008]
Soyama et al. ("Clin. Chem., 1984, 30 (2), pp. 293-294) and Akazawa et al. (" Journal of Clinical End Clinology. And Metabolism (J. Clin. Endocrinol. Metab.), 1986, Vol. 62 (5), pp. 984-989) reports a method for removing glucose using glucose oxidase. Specifically, glucose in a sample is removed in advance using glucose oxidase and catalase, and mannose is reacted with hexokinase in the presence of adenosine triphosphate to convert mannose to mannose-6-phosphate. 6-phosphate isomerase is reacted to convert it to fructose-6-phosphate, and then glucose-6-phosphate isomerase is further reacted to glucose-6-phosphate, and finally, the coenzyme nicotinamide adenine dinucleotide The absorbance (340 nm) of reduced nicotinamide adenine dinucleotide (hereinafter, referred to as NADH) generated by the action of glucose-6-phosphate dehydrogenase in the presence of (hereinafter, referred to as NAD) is measured with a spectrophotometer. Thus, mannose is quantified. However, in this measurement method, there was a problem that if glucose was removed incompletely or reacted for a long time, mannose would be reacted (“Clinical Chem.”, 1997). 43 (3), pp. 533-538).
[0009]
As an improvement of the above enzyme method, Pitkanen et al. Reported that hexokinase and glucose-6 were added to a sample containing glucose and fructose in the presence of adenosine triphosphate and nicotinamide adenine dinucleotide phosphate (hereinafter referred to as NADP). -By reacting phosphate isomerase to convert glucose and fructose to glucose-6-phosphate, and further adding glucose-6-phosphate dehydrogenase to convert glucose-6-phosphate to gluconate-6-phosphate The reduced nicotinamide adenine dinucleotide phosphate (hereinafter, referred to as NADPH) generated at this time is decomposed under acidic conditions of hydrochloric acid to remove the influence of glucose and the like. Hexokinase, mannose-6-phosphate A method for quantifying mannose, which measures the absorbance (340 nm) of NADPH produced by the action of merase, glucose-6-phosphate isomerase, and glucose-6-phosphate dehydrogenase, has been reported ("European Journal of Clinical). Chemistry and Clinical Biochemistry (Eur. J. Clin. Chem. Clin. Biochem.) ", 1997, 35 (10), pp. 761-766.
[0010]
In addition, James et al. Use a glucokinase (EC 2.7.1.2) to selectively phosphorylate glucose, and to generate glucose-6-phosphate by centrifugation using an anion exchange resin. After adsorption and removal with a mini-column, mannose that was not adsorbed and was recovered in the passing solution was detected by a mannose measurement method using the above-mentioned enzyme (“Clinical Chem.”, 1997). 43 (3), pp. 533-538). However, since the enzymatic method described above involves a complicated enzyme conjugate system combining several types of enzyme reactions, it is difficult to optimize all enzymes, and a large number of expensive enzymes are combined. There was also a problem in terms of cost due to use. Further, there is a drawback that the components are easily affected by components and contaminants derived from a biological sample.
[0011]
Japanese Patent Application Laid-Open No. 11-266896 discloses that a sample is prepared in advance by using glucose 2-position oxidase such as pyranose oxidase or L-sorbose oxidase, or glucose 2-position oxidase such as pyranose oxidase or L-sorbose oxidase and glucose oxidase. A method for treating mannose after completely removing glucose present in a sample by treating the sample with a combination of glucose 1-position oxidase and the like is described. Furthermore, JP-A-2001-197900 describes a method for quantifying mannose using NADP-dependent aldohexose dehydrogenase. However, NADP is several times more expensive as a reagent than NAD, and it has been desired to develop a measurement method and a measurement reagent which are superior in cost.
[0012]
[Problems to be solved by the invention]
An object of the present invention is to provide a method and a reagent for measuring D-mannose which are inexpensive, accurate, simple, and capable of treating a large number of samples.
[0013]
[Means for Solving the Problems]
In order to achieve the above object, the present inventors reacted D-mannose in a sample with a NAD-dependent dehydrogenase having an oxidizing ability for D-mannose in the presence of NAD, and produced NADH. A method for measuring D-mannose, characterized by quantification of According to the present invention, it has become possible to measure D-mannose in a sample at low cost, accurately and easily. Further, by using the present invention, a large number of specimens can be processed in D-mannose measurement.
[0014]
That is, the present invention has the following configuration.
(1) D-mannose in a sample is allowed to act with NAD-dependent dehydrogenase having an oxidizing ability on D-mannose in the presence of NAD, and the produced NADH is quantified. How to measure mannose.
(2) The method for measuring D-mannose according to (1) above, wherein the NAD-dependent dehydrogenase is an archaeal aldohexose dehydrogenase.
(3) A reagent for measuring D-mannose, comprising a NAD-dependent dehydrogenase having an oxidizing ability for D-mannose and NAD.
(4) The reagent for measuring D-mannose according to (3) above, wherein the NAD-dependent dehydrogenase is archaeal aldohexose dehydrogenase.
[0015]
In the measurement method of the present invention, when the sample contains D-glucose in addition to D-mannose, D-glucose in the sample is NAD-dependent by a glucose scavenger such as glucokinase and adenosine triphosphate. After the structure is changed to a structure that does not react with the sex dehydrogenase, it is preferable to make the NAD-dependent dehydrogenase act. In the measurement method of the present invention, it is preferable that the NAD-dependent dehydrogenase is archaeal aldohexose dehydrogenase. The sample is not particularly limited, but is preferably a biological sample, for example, a sample prepared from blood, serum, plasma, cerebrospinal fluid, urine, or the like.
[0016]
The reagent for measuring D-mannose of the present invention may further contain a glucose scavenger such as glucokinase and adenosine triphosphate. Further, in the enzyme used in the reagent for measurement of the present invention, the NAD-dependent dehydrogenase is preferably an archaeal aldohexose dehydrogenase.
[0017]
According to the present invention, the enzyme involved in the main reaction is only NAD-dependent dehydrogenase having the ability to oxidize D-mannose, and D-mannose can be simply and accurately prepared without using a complicated enzyme-coupled system. Mannose can be determined. Further, since NAD is used as a coenzyme, an inexpensive measurement system is provided. Furthermore, a large number of samples can be processed using a general-purpose automatic analyzer.
[0018]
BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION
In the present invention, the sample (specimen) is not particularly limited as long as it is one that wants to measure the concentration of D-mannose, but may be a biological sample such as blood, serum, plasma, cerebrospinal fluid, urine, or the like. A prepared sample, for example, a sample pretreated by various methods to easily measure D-mannose is preferably used. As such a pretreatment, for example, a treatment in which glucose is removed in advance in a sample in which D-glucose coexists is mentioned.
[0019]
The enzyme used in the present invention may be any NAD-dependent dehydrogenase having the ability to oxidize D-mannose, and is not particularly limited, and is preferably an archaea-derived NAD-dependent aldohexose dehydrogenase. Can be Specific examples include NAD-dependent aldohexose dehydrogenase obtained from Thermoplasma acidophilum. More specifically, the NAD-dependent aldohexose dehydrogenase obtained from the Thermoplasma acidophilum ATCC 25905 strain isolated by the present inventors is exemplified. The enzyme used in the present invention is obtained by culturing a microorganism that produces the enzyme, collecting cells, and crushing the cells by sonication or the like. , Ion exchange chromatography, hydrophobic chromatography, hydroxyapatite gel, gel filtration, and other column chromatography in combination.
[0020]
The use concentration of the NAD-dependent dehydrogenase is not particularly limited, but is preferably in the range of 0.001 to 5 units / ml, particularly preferably 0.1 to 2 units / ml.
[0021]
In the present invention, NAD is used as a coenzyme (electron acceptor). The working concentration of NAD is preferably in the range of 0.01 to 10 mmol / ml, particularly 0.5 to 2 mmol / ml.
[0022]
Further, in order to quantify the reduced form of the coenzyme, a color former that develops a color by being reduced may be used in combination. Such a color former may be appropriately selected depending on the coenzyme to be used. A method of colorimetrically determining the formazan dye to be produced is mentioned.
[0023]
Furthermore, when the NAD-dependent dehydrogenase having an oxidizing ability for D-mannose used in the present invention also acts on D-glucose in addition to D-mannose, some biological samples may be affected by glucose. is there. Therefore, it is more preferable to use a glucose scavenger in combination in order to further increase the measurement accuracy for a biological sample. As the glucose scavenger, those containing glucose 6-position phosphorylase and adenosine triphosphate are preferably used, and specific examples include glucokinase and hexokinase, and commercially available ones can be used. More preferably, glucokinase having high glucose specificity is used. Their usage varies depending on the amount of glucose in the sample, but is generally about 0.1 to 50 units / ml. The amount of adenosine triphosphate required for phosphorylation of glucose varies depending on the amount of glucose in the sample, but is generally 1 to 20 mM. Further, magnesium ions are usually contained in an amount of about 5 to 50 mM to promote the glucose phosphorylation reaction. The glucose phosphorylation reaction for eliminating glucose is carried out in a buffer having a pH of 6 to 10 at 20 to 50 ° C., preferably 25 to 37 ° C., for about 10 minutes immediately after the addition.
[0024]
Any buffer that can be used in the present invention, such as a phosphate buffer having a pH of 6 to 10, a glycine buffer, a Tris-HCl buffer, a Good buffer, a borate buffer, and the like, may be used. It is possible.
[0025]
In the reagent for measuring D-mannose of the present invention, a glucose scavenger and an enzyme for measurement may be separately combined. More specifically, it is preferable to comprise two reagents, a first reagent containing NAD and a glucose scavenger, and a second reagent containing NAD-dependent dehydrogenase having an oxidizing ability for D-mannose. .
[0026]
After adding the reagent for measuring D-mannose of the present invention to a biological sample to cause a reaction, measurement of the coenzyme reduced in the reaction solution is performed, for example, at an absorption wavelength specific to a reduced form of coenzyme NAD. It can be carried out by measuring the absorbance, or measuring the color intensity of a color former that develops a color with a reduced form of coenzyme NAD.
[0027]
【Example】
Hereinafter, the present invention will be described specifically with reference to Examples, but the present invention is not limited thereto.
[0028]
Example of enzyme production (production of NAD-dependent aldohexose dehydrogenase)
(1) Isolation of chromosomal DNA
Chromosomal DNA of Thermoplasma acidophilum ATCC 25905 strain was isolated by the following method.
The strain was subjected to yeast extract (manufactured by Difco) 1 g / l, glucose 10 g / l, (NH ₄ ) ₂ SO ₄ 1.32 g / l, KH ₂ PO ₄ 0.372 g / l, MgSO ₄ ・ 7H ₂ O 0.247 g / l, CaCl ₂ ・ 2H ₂ O 0.074 g / l, 10 ml / l trace element solution (FeCl ₃ ・ 6H ₂ O 1.93 g / l, MnCl ₂ ・ 4H ₂ O 0.18 g / l, Na ₂ B ₄ O ₇ ・ 10H ₂ O 0.45 g / l, ZnSO ₄ ・ 7H ₂ O 22mg / l, CuCl ₂ ・ 2H ₂ O 5mg / l, NaMoO ₄ ・ 2H ₂ O 3mg / l, VOSO ₄ ・ 2H ₂ O 3mg / l, CoSO ₄ ・ 7H ₂ O 1 mg / l), and cultured with shaking at 58 ° C for 2 nights in a medium adjusted to pH 1.3 with sulfuric acid, followed by centrifugation (4,000 rpm, 15 minutes). After the culture solution remaining in the centrifuge tube was wiped off with a Kim wipe, the suspension was suspended in 15 ml of a solution containing 20% sucrose, 100 mM Tris-hydrochloric acid (pH 8.0), 50 mM EDTA, 0.1% SDS per 1 g of cells, 150 μl of protease K solution (10 mg / ml) and 150 μl of RNAse A (10 mg / ml) were added, and the mixture was kept at 37 ° C. for 12 hours. This was treated with an equal volume of a chloroform / phenol solution, and the operation of separating the aqueous layer by centrifugation was repeated three times. After 600 μl of 5M NaCl was added to the obtained aqueous layer and mixed, 0.8 times the amount of isopropyl alcohol was added, and the DNA appearing after mixing by inversion was wound around a glass rod to obtain a purified DNA sample. The purified DNA was redissolved in a 10 mM Tris-HCl (pH 8.0) solution (hereinafter abbreviated as TE) containing 5 ml of 1 mM EDTA, and 200 μl of 5 M NaCl was added and mixed. Alcohol was added, and the re-extracted DNA was washed with a 70% ethanol solution, air-dried, and dissolved with 1 ml of TE.
[0029]
(2) Preparation of a DNA fragment containing a gene encoding NAD-dependent aldohexose dehydrogenase and a recombinant vector having the DNA fragment
PCR primers Ta0754s (SEQ ID NO: 3 in the sequence listing) and Ta0754as (SEQ ID NO: 4 in the sequence listing) were prepared, and PCR was performed using the DNA of (1) as a template and Pfuturbo DNA polymerase in the following cycle.
Step 1: 94 ° C, 1 minute
Step 2: 58 ° C, 1 minute
Step 3: 72 ° C., 2.5 minutes (30 cycles)
When the obtained PCR product was electrophoresed on a 1% agarose gel, a specific band having a size of 0.78 kb was observed. The band was isolated by a conventional method, and digested with restriction enzymes NcoI and XhoI. After ligation with the pET28-opened product obtained by digestion with NcoI and XhoI, Escherichia coli XL1 / Blue was transformed to prepare pET / Ta0754.
[0030]
(3) Determination of base sequence
The nucleotide sequence of the inserted DNA of about 0.8 kbp of pET / Ta0754 was determined using BigDye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit (Applied Biosystems) and ABI3100 (Applied Biosystems). The determined nucleotide sequence and amino acid sequence are shown in SEQ ID NOs: 2 and 1 in the sequence listing, respectively. The molecular weight of the protein determined from the amino acid sequence was about 28,900.
[0031]
(4) Preparation of transformant
Competent cells of Escherichia coli BL21 (DE3) RIL were transformed with pET / Ta0754 to obtain a transformant Escherichia coli BL21 (DE3) RIL (pET / Ta0754).
[0032]
(5) Production of NAD-dependent aldohexose dehydrogenase from Escherichia coli BL21 (DE3) RIL (pET / Ta0754)
100 ml of LB medium was dispensed into a 500 ml flask, autoclaved at 121 ° C. for 20 minutes, allowed to cool, and then 0.1 ml of 10 mg / ml kanamycin and 33 mg / ml chloramphenicol (manufactured by Nacalai Tesque), which were separately sterile-filtered, were added. did. To this medium, 1 ml of a culture solution of Escherichia coli BL21 (DE3) RIL (pET / Ta0754), which had been cultured with shaking at 30 ° C. for 17 hours in an LB medium, was inoculated, followed by aeration and stirring at 37 ° C. for 9 hours. 900 ml of LB medium was dispensed into a 2 L flask, autoclaved at 121 ° C. for 20 minutes, allowed to cool, and 0.9 ml of 10 mg / ml kanamycin and 33 mg / ml chloramphenicol (manufactured by Nacalai Tesque) separately filtered under aseptic conditions were added. did. This culture medium was inoculated with 100 ml of a culture solution of Escherichia coli BL21 (DE3) RIL (pET / Ta0754) cultured for 9 hours, and cultured with aeration and agitation at 37 ° C. for 17 hours. The NAD-dependent aldohexose dehydrogenase activity at the end of the culture was about 4 U / ml.
The cells were collected by centrifugation and suspended in a 50 mM potassium phosphate buffer (pH 8.0). The cell suspension was disrupted by ultrasonic waves and centrifuged to obtain a supernatant. The obtained crude enzyme solution was heat-treated at 60 ° C. for 60 minutes and centrifuged to obtain a supernatant. After performing nucleic acid removal treatment and ammonium sulfate fractionation with polyethyleneimine, desalting was performed by gel filtration using Sephadex G-25 (manufactured by Pharmacia Biotech), and DEAE Sepharose CL-6B (manufactured by Amersham Pharmacia Biotech) was used. Separation and purification were performed by chromatography and Superdex-200 (manufactured by Amersham Pharmacia Biotech) column chromatography to obtain a purified enzyme preparation. The NAD-dependent aldohexose dehydrogenase preparation obtained by this method showed a substantially single band by electrophoresis (SDS-PAGE), and the specific activity at this time was 38 U / mg-s-protein. This was used as a purified enzyme solution of NAD-dependent aldohexose dehydrogenase and used in the following Examples.
[0033]
Example
Using the NAD-dependent aldohexose dehydrogenase obtained in the above enzyme production example and the coenzyme NAD (manufactured by Oriental Yeast) as an electron acceptor, the following reagents for quantifying D-mannose were prepared.
・ Reagent composition:
50 mM Tris-HCl buffer (pH 8.5)
1.2 mM NAD
2U / ml NAD-dependent aldohexose dehydrogenase
Using this reagent, D-mannose solutions of various concentrations (1 to 10 mM) were measured as described below.
To 10 μl of each concentration of D-mannose solution, 290 μl of a reagent was added and reacted at 37 ° C. for 5 minutes, and a change in absorbance at a wavelength of 340 nm per minute was measured by a late assay. These operations were performed by a Hitachi 7060 automatic analyzer. The result is shown in FIG.
From FIG. 1, it can be seen that a linear increase in absorbance change is obtained up to a D-mannose concentration of 0 to 10 mM, and accurate quantification of D-mannose is possible.
[0034]
【The invention's effect】
As described above, according to the present invention, the NAD-dependent aldohexose dehydrogenase directly acts on D-mannose by adding NAD-dependent aldohexose dehydrogenase and NAD as an electron acceptor to a sample containing D-mannose and causing them to act. By measuring the generated NAD reduced form, accurate quantification of D-mannose becomes possible. According to the present invention, an inexpensive, accurate and simple method for measuring D-mannose and a measuring reagent are provided. In addition, since the present invention has a simple reaction system, it can be easily applied to various automatic analyzers and is suitable for processing a large number of samples.
[0035]
[Sequence list]

[Brief description of the drawings]
FIG. 1 shows the results of D-mannose measurement according to the present invention.

Claims

A nicotinamide adenine dinucleotide-dependent dehydrogenase capable of oxidizing D-mannose is allowed to act on D-mannose in the sample in the presence of oxidized nicotinamide adenine dinucleotide, and the reduced nicotinamide produced A method for measuring D-mannose, which comprises quantifying adenine dinucleotide.

2. The method for measuring D-mannose according to claim 1, wherein the nicotinamide adenine dinucleotide-dependent dehydrogenase is archaeal aldohexose dehydrogenase.

A reagent for measuring D-mannose, comprising a nicotinamide adenine dinucleotide-dependent dehydrogenase having an ability to oxidize D-mannose and an oxidized nicotinamide adenine dinucleotide.

The reagent for measuring D-mannose according to claim 3, wherein the nicotinamide adenine dinucleotide-dependent dehydrogenase is archaeal aldohexose dehydrogenase.