【０００１】
【発明が属する技術分野】
本発明は、ＣＤ４＋ＣＤ２５−Ｔ細胞及び／又はＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔ細胞を測定し、その免疫療法の有効性を判断するための新規な手段の提供に関する。
【０００２】
【従来の技術】
ガン（ｍａｌｉｇｎａｎｔ ｎｅｏｐｌａｓｍｓ）（ｃａｎｃｅｒ）の予防または治療のために有用な物質の選別には、従来、ガン細胞へのその直接的作用が重要視されていた。免疫賦活剤がガン治療に有用であることは認められていたが、免疫賦活剤として得られた化合物はいずれもその抗ガン効果が微弱であり、免疫療法単独または化学療法との併用治療によってもガンの十分な治療効果は達成されていない。
【０００３】
本発明者の医学博士、八木田は、先にガン治療における画期的な手法として、インターロイキン１２（ＩＬ−１２）を生体内で誘発する物質の有用性に着目し、キノコ菌糸体加工物がその機能を有することを発見し、新免疫療法（Ｎｏｖｅｌ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ ｆｏｒ ｃａｎｃｅｒ）（ＮＩＴＣ）ともいうべきガン治療法を確立した。従来ＩＬ−１２は、抗ガン効果があるものの生体内にＩＬ−１２自体を直接投与した場合には副作用を生じるために患者が治療に耐えられないという事実があり、それ自体を抗ガン剤として使用できなかった。しかし、八木田が報告したキノコ菌糸体加工物を含む製剤は、ガンの治療において著しい治癒・延命効果を達成した。つまり八木田は、ＩＬ−１２を生体内で誘発できる有効量のキノコ菌糸体加工物を投与することにより、ガンの治療目的を達成した（特開平１０−１３９６７０号公報）。
【０００４】
ＩＬ−１２は、ＴＮＦα→ＩＦＮγ→ＩＬ−１２→ＣＴＬ活性というルートでキラーＴ細胞の活性化効果と増強効果をもつ。つまりＩＬ−１２の産生増強は、キラーＴ細胞の活性化と増強により抗ガン効果が期待される。
【０００５】
八木田は、ＩＬ−１２の産生増強の系とは別にＮＫＴ細胞の活性化が抗ガン効果に有用であることを報告している。谷口等は、ＮＫＴ細胞が有するＶα２４Ｖβ１１という特異的なＴ細胞抗原受容体（ＴＣＲ）が認識する特異的な糖脂質抗原を発見し、この抗原が、αガラクトシルセラミドであることを報告している。更に、αガラクトシルセラミドを投与した担ガンマウスでは、ＮＫＴ細胞が活性化され、ガンの消失はみられないものの転移が抑制されることを証明した。
ＮＫＴ細胞には、もう一つの受容体としてＮＫ細胞抗原受容体（ＮＫＲ−Ｐ１；ナチュラルキラー受容体Ｐ１）があることは報告されている（特集 ＮＫＴ細胞の基礎と臨床：最新医学５５巻４号２０００年８１８〜８２３ページ）。ＮＫＲ−Ｐ１もＮＫＴ細胞の活性化に関与し、この活性化が抗ガン効果がより優位であることを八木田は見出している。
【０００６】
ＮＫ細胞についても生体の抗ガン作用に係わるという報告がなされているが、これまでＮＫ細胞の活性と臨床的な抗ガン効果とが相関せず、ＩＬ−１２の産生誘発量とＮＫ細胞の活性とが完全な逆相関を示すことが八木田により証明されており、ヒトにおける抗ガン作用についてのＮＫ細胞の関与は疑問視されていた。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、ＣＤ４＋ＣＤ２５−Ｔ細胞及び／又はＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔ細胞を測定し、各測定結果の検定の意味するところを分析し、新免疫療法の完成を課題とする。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
【０００９】
すなわち本発明は、
１．ＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔ細胞を測定し、それが活性化キラーＴ細胞に抑制的に働いていることと判定する癌の検査手段。
２．ＣＤ４＋ＣＤ２５−Ｔ細胞を測定し、それがＣＴＬ活性化に働いていることと判定する癌の検査手段。
３．ＣＤ４＋ＣＤ２５−Ｔ細胞／ ＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔ細胞の比を測定する癌治療の有効性の判定手段。
４．ガンの免疫治療剤のスクリーニング方法であって、ＣＤ４＋ＣＤ２５−Ｔ細胞／ ＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔ細胞の比を検定し、ＣＤ４＋ＣＤ２５−Ｔ細胞の優位をもって有効と判定するガンの免疫治療剤のスクリーニング方法。
５．前項１〜３の何れか一に記載の情報を自然法則を利用した媒体に担持した商業用媒体。
６．前項５の商業用媒体を利用した商業方法。
からなる。
【００１０】
【発明の実施の形態】
以下、本発明を詳しく説明するが、本明細書中で使用されている技術的および科学的用語は、別途定義されていない限り、本発明の属する技術分野において通常の知識を有する者により普通に理解される意味を持つ。
【００１１】
本発明者の医学博士八木田のガン新免疫療法とは４つの異なる作用機序を組み合わせることからなる治療手段である。
第一の作用機序は、血管新生阻害物質（ベターシャーク）を投与してガンへの血流を障害してガン縮小をはかる方法である。これは血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）を測定することでその効果は判定が可能である。血管新生阻害作用はＶＥＧＦ値のマイナス値（−ＶＥＧＦ）で評価できる。このＶＥＧＦ値の替わりにＦＧＦ、ＨＧＦなどのその他の血管増殖因子を用いることも血管新生阻害能を評価することが可能である。またＶＥＧＦの替わりに血管新生阻害因子の正数値でもその評価が可能である（例えばエンドスタチン値）。
【００１２】
他の一つの作用機序は、β１，３グルカン構造を担持する化合物を投与してＴｈ１サイトカイン（ＴＮＦα、ＩＦＮγ、ＩＬ−１２）を誘導してＣＴＬを活性化する方法である。ＣＴＬ活性はＣＤ８（＋）パーフォリン産生能力で判定が可能であるが、このＣＤ８（＋）パーフォリン値には細胞障害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）と免疫抑制性Ｔ細胞（ＳＴＣ； Ｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒ Ｔ ｃｅｌｌ）とがあり、前者はガン細胞を障害し、後者はガンの増殖に作用する。したがってその絶体値では評価はできない。しかし前者はＩＦＮγが１０ ＩＵ／ｍｌ以上かもしくはＩＬ−１２値が７．８ ｐｇ／ｍｌ以上であればＣＴＬであり、ＩＦＮγとＩＬ−１２が低値であればＳＴＣと判定される。そこでＣＴＬ活性は、ＩＦＮγ産生能力（ＩＦＮγ値）もしくはＩＬ−１２産生能力（ＩＬ−１２値）で評価が可能である。
【００１３】
第三及び第四の作用機序であるα１，３グルカン構造を担持する化合物の投与によって活性化されるｅｆｆｅｃｔｏｒ細胞はＮＫ細胞とＮＫＴ細胞である。このＮＫとＮＫＴ細胞とはＮＫＲ−Ｐ１（ＮＫ細胞受容体ＣＤ１６１（＋））を共有しており、前者はＣＤ３（−）ＣＤ１６１（＋）の表面マーカーでＮＫ細胞数は測定可能であり、その活性化はＣＤ３（−）ＣＤ１６１（＋）パーフォリン産生能力で判定が可能である。一方後者のＮＫＴ細胞はＣＤ３（＋）ＣＤ１６１（＋）でその細胞数は測定が可能となり、そのパーフォリン産生能力でＮＫＴ細胞の活性化は測定可能である。
【００１４】
本発明は、臨床における結果と、ＮＫ細胞の活性化能、ＮＫＴ細胞の活性化能、血管新生阻害能、ＩＬ−１２の誘導産生能、及びＩＦＮγの誘導産生能の相関性に加えて、ＣＤ４＋ＣＤ２５−Ｔ細胞及び／又はＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔ細胞の動態を検討することにより行われた。本発明者は、新免疫療法（ＮＩＴＣ）として、ガン患者にα１，３グルカン構造を担持する化合物、β１，３グルカン構造を担持する化合物と血管新生阻害作用物質（サメ軟骨）を併用し、ＩＬ−１２、ＩＦＮγ他の各種サイトカイン、ＣＤ４＋ＣＤ２５−Ｔ細胞、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔ細胞を測定した。その結果、ＣＤ４＋ＣＤ２５−Ｔ細胞及びＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔ細胞を測定し、その比を検定し、マーカーとすることはガンの検査手段として意義があることを見出した。
【００１５】
ＣＤ２５はインターロイキン２（ＩＬ−２）受容体α鎖である。最近、ヘルパーＴ細胞Ｔｈ（ＣＤ４）のなかにＣＤ２５（＋）とＣＤ２５（−）細胞とがあることが分かっている。ＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔ細胞が自己免疫疾患の発病に重要な役割を演じていることが知られている。しかし、癌免疫療法でどのような作用を示しているかは不明である。
【００１６】
今回、新免疫療法を施行している６５例において、この細胞がどのように関与しているかを検討し、ＣＤ４＋ＣＤ２５−Ｔ細胞はＣＴＬ活性化と関係があり、癌免疫療法の効果と密接な関係を有すること、ＣＤ４＋ＣＤ２５−Ｔ細胞／ＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔ細胞比は、ＣＤ４＋ＣＤ２５−Ｔ細胞の優位が癌免疫療法の効果と密接な関係を有することを見出した。
【００１７】
この意義を見出したことによりＣＤ４＋ＣＤ２５−Ｔ細胞、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔ細胞、及びＣＤ４＋ＣＤ２５−Ｔ細胞／ＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔ細胞比の測定は、有用なＣＴＬ活性化剤のスクリーニング方法に適用可能であり、このスクリーニング方法を利用すればＣＴＬ活性化能を担持する新規β１，３グルカンの特定が可能であることも見出した。
【００１８】
以上のような情報は、自然法則を利用した媒体に担持すれば有用な商業用媒体となり、またその商業用媒体は有用な商業方法を提供する。
【００１９】
本発明においてＣＴＬ活性化剤（ＩＬ−１２産生誘導剤、ＩＮＦγ産生誘導剤）は、本発明の測定法による結果を指標として、その活性化を誘導または増強し、さらに活性化を維持できる処方にて用いられる。すなわち、指標をもとに、その活性化を誘導または増強し、さらに活性化を維持できる投与量、ならびに投与期間を選択して用いられる。具体的には、その投与量は、ＣＴＬ活性化剤（ＩＬ−１２産生誘導剤、ＩＮＦγ産生誘導剤）であるβ−１，３グルカン構造を持つ化合物は１ｇ〜１０ｇ／日程度、好ましくは３ｇ〜６ｇ／日程度である。また、投与期間は一般的には１０日間〜２４ヶ月間、投与頻度は１〜３回／日で、好ましくは連日投与である。当該ＣＴＬ活性化剤（ＩＬ−１２産生誘導剤、ＩＮＦγ産生誘導剤）は、好適には経口摂取される。無論、投与量を減少させ、これらを非経口に耐え得る品質に調製することで、非経口摂取（静脈内または筋肉内投与などを含む）も可能である。
【００２０】
測定は、ガン患者の血液を用いて、血中細胞について細胞表面抗原であるＣＤ４、ＣＤ２５について陽性・陰性で区別し、各細胞の割合を、フローサイトメトリーを用いたＴｗｏ Ｃｏｌｏｒ検査により常法通り測定した。
【００２１】
（サイトカインを測定するための試料の調製）
まず、血液より単核球画分を分離調製する。ヘパリン加末梢血をリン酸緩衝生理食塩水（Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ Ｂｕｆｆｅｒｅｄ Ｓａｌｉｎｅ）（ＰＢＳ）で２倍に希釈して混和した後、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｃｏｎｒａｙ液（比重１．０７７）上に重層し、４００Ｇで２０分間遠沈後、単核球画分を採取する。洗浄後、１０％牛胎児血清（ＦＢＳ）を加えたＲＰＭＩ−１６４０培地を加え、細胞数を１×１０６個となるように調製する。得られた細胞浮遊液２００μｌにフィトヘマグルチニン（Ｐｈｙｔｏｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ）（ＤＩＦＣＯ社製）を２０μｇ／ｍｌの濃度となるように加え、９６穴マイクロプレートにて５％ＣＯ２存在下、３７℃で２４時間培養し、該培養した細胞溶液中のサイトカインを測定する試料とする。
【００２２】
（ＩＬ−１２の測定）
ＩＬ−１２量の測定は自体公知の臨床、生化学的検査を利用できるが、Ｒ＆Ｄ ＳＹＳＴＥＭＳ社やＭＢＬ社より入手することのできる酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）による測定キットが使用される。ここではＲ＆Ｄ ＳＹＳＴＥＭＳ社の測定キットを用いた。実際には９６穴マイクロプレートの各穴に測定用希釈液Ａｓｓａｙ Ｄｉｌｕｅｎｔ ＲＤ１Ｆを５０μｌ、標準液（ｓｔａｎｄａｒｄ）または実施例１で調製した試料を２００μｌずつ分注した後、室温にて静置して２時間反応させた。その後、西洋わさびパーオキシダーゼ（ｈｏｒｓｅ ｒａｄｉｓｈ ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ）（ＨＲＰ）標識抗ＩＬ−１２抗体を２００μｌずつ分注し２時間室温で静置した。各穴の反応液を除去し３回洗浄後、発色基質溶液を２００μｌずつ分注し、２０分間室温静置後、酵素反応停止溶液を５０μｌずつ分注した。５５０ｎｍを対照として４５０ｎｍにおける各穴の吸光度をＥｍａｘ（和光純薬株式会社製）にて測定した。ＩＬ−１２量は、ｐｇ／ｍｌとして表される。ここでＩＬ−１２産生誘発能とは、末梢血単核球画分が刺激により産生するＩＬ−１２量を、７．８ｐｇ／ｍｌ以上に増強せしめる機能、またはある物質を投与する前のＩＬ−１２産生量より増強せしめる機能を意味する。
【００２３】
（ＩＦＮγの測定）
ＩＦＮγの測定は、ＢｉｏＳｏｕｒｃｅ Ｅｕｒｏｐｅ Ｓ．社のＩＦＮγ ＥＡＳＩＡキットを用いて、酵素免疫測定法（ＥＩＡ法）で測定した。実際には９６穴マイクロプレートの各穴に標準液（ｓｔａｎｄａｒｄ）または上記調製した試料を２倍希釈したものを５０μｌずつ分注し、ＨＲＰ標識抗ＩＦＮ−γ抗体を５０μｌずつ分注し更に振盪しながら２時間室温で反応させた。各穴の反応液を除去し３回洗浄後、発色基質溶液を２００μｌずつ分注し、振盪しながら１５分間室温で反応させ、酵素反応停止溶液を５０μｌずつ分注した。６３０ｎｍを対照として４５０ｎｍおよび４９０ｎｍにおける各穴の吸光度をＥｍａｘ（和光純薬株式会社製）にて測定した。ＩＦＮγ量は、ＩＵ／ｍｌとして表される。
【００２４】
（パーフォリン産生細胞の測定）
末梢血中のリンパ球について、細胞表面抗原であるＣＤ８が陽性でかつパーフォリンが陽性の細胞の割合を、フローサイトメトリーを用いたＴｈｒｅｅ Ｃｏｌｏｒ検査により常法通り測定する。具体的には、採取した血液に固定液を加えて細胞を固定し、膜透過液を添加後抗パーフォリン抗体（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ社製）を添加して反応させ、さらにＰＲＥ−Ｃｙ５標識二次抗体（ＤＡＫＯ社性）を添加して反応させ、ついで抗ＣＤ８抗体を添加して反応させ、その後フローサイトメトリーで測定する。
【実施例】
以下に、実施例を用いて本発明を具体的に説明するが、本発明は本実施例に限定されるものではない。
【００２５】
【実施例１】
患者には、ＩＬ−Ｘ（東西医薬）、さめ軟骨（セイシン企業）、及びα１，３構造をもつ糖類が、各推奨処方により投与された。処置患者群についてＩＬ−１２の誘導産生能、ＩＦＮγ誘導産生能、及びＣＤ４＋ＣＤ２５−Ｔ細胞、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔ細胞、パーフォリン産生細胞の寄与の関係を分析した。
【００２６】
ＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔ細胞とＣＤ８＋パーフォリン産生細胞（ＣＤ８＋ＰＥＲ＋）との相関を検討したのが図１である。
全症例（６５例）、ＣＲ（治癒）（ｎ＝１７）、ＰＲ（部分治癒）（ｎ＝１４）、ＬＮＣ（長期間癌増殖無）（ｎ＝８）、ＳＮＣ（短期間癌増殖無）（ｎ＝７）、ＰＤ（無効）（ｎ＝１４）、初診（ｎ＝５）のいずれにおいても逆相関を示した。
この事実はＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔ細胞が活性化キラーＴ細胞に抑制的に働いていることを示している。
【００２７】
ＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔ細胞とＩＬ−１２との相関を検討し、図２に示した。ＩＬ−１２とＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔ細胞との相関は、全体では緩い正の相関を示している。またＣＲ（ｎ＝１７例）、ＰＲ（ｎ＝１４例）、ＬＮＣ（ｎ＝８例）ではそれぞれ正の相関を示す傾向が認められた。一方ＳＮＣ（ｎ＝７例）、ＰＤ（ｎ＝１４例）では逆相関の傾向が認められた。
【００２８】
ＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔ細胞とＩＦＮγとの相関を図３に示した。ＩＬ−１２と同様にＩＦＮγにおいてもＣＲ、ＰＲおよびＬＮＣで正の相関を示す傾向が認められ、ＳＮＣとＰＤ症例では逆相関の傾向を示している。この事実は有効例ではＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔ細胞の免疫抑制に抵抗してＴｈ１サイトカイン働いている可能性が示唆される。またＳＮＣとＰＤ症例においてＴｈ１サイトカイン値が高い症例ではＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔ細胞が抑制的に作用し、Ｔｈ１サイトカイン値が低い症例ではＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔ細胞が免疫抑制的に働いていることが示唆される。有効例ではＴｈ１サイトカインがＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔ細胞に打ち勝って免疫活性すなわちＣＤ８＋パーフォリン＋Ｔ細胞が働いていると考えられる。
一方、無効例ではＴｈ１サイトカイン値が低いかもしくはＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔ細胞のいずれかどちらかが免疫抑制的に働いていると考えられる。
【００２９】
ＩＬ−１０とＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔ細胞との相関を図４に示した。全症例でＩＬ−１０とＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔ細胞とは正の相関を示し、ＬＮＣ（ｎ＝８）以外は全て正の相関を示した。この事実はＮＩＴＣ治療例ではＩＬ−１０とＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔ細胞とはいずれも免疫抑制的に働いていることが示唆された。
【００３０】
ＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔ細胞はＴＧＦβを産生して免疫抑制的に働いている可能性も考えられる。そこでこの細胞とＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＴＧＦβ＋Ｔ細胞との相関を検討すると正の相関を示した。この事実はこのＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔ細胞が強力な免疫抑制作用を持つＴＧＦβを産生して抑制的に働いている可能性も考えられる（図５）。
【００３１】
ＣＤ４＋ＣＤ２５−Ｔ細胞はＩＬ−２とＩＦＮγを産生してキラーＴ細胞（ＣＤ８＋Ｔ細胞）を活性化するものと考えられている。そこでＩＦＮγとＣＤ４＋ＣＤ２５−Ｔ細胞との相関を検討したのが図６である。ＣＤ４＋ＣＤ２５−Ｔ細胞とＩＦＮγとは正の相関が認められた。
【００３２】
次にＣＤ４＋ＣＤ２５−Ｔ細胞のなかでＩＦＮγを産生する細胞（ＣＤ４＋ＣＤ２５−ＩＦＮγ＋）とＩＦＮγとの相関も正の相関を示した（図７）。
ＣＤ４＋ＣＤ２５−Ｔ細胞とＣＤ４＋ＣＤ２５−ＩＦＮγ＋Ｔ細胞との相関においても正の相関を示した。
【００３３】
ＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔ細胞が３０％以上を示す症例すなわちＣＤ８＋細胞に強力に抑制している症例について有効例と無効例とでその割合を比較した（図８）。
前者が２０．５％であったのに対し、後者の無効例では４７．６％と有意差が認められた（ｐ＜０．０５）。すなわちＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔ細胞がＣＤ８＋パーフォリン産生細胞を抑制し、ＮＩＴＣ治療症例で抑制的に働いていることが認められた。
【００３４】
また、ＣＤ４＋ＣＤ２５−Ｔ細胞／ ＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔ細胞の比を有効例（ＣＲ＋ＰＲ＋ＬＮＣ）の３９例と無効例（ＳＮＣ＋ＰＤ）の２１例と比較したが、有効例で高い値を示した（ｐ＜０．０１）。この事実はＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔ細胞の免疫抑制に働くカットオフ値は３０％が適切と考えられた。
【発明の効果】
以上の結果によれば、、ＣＤ４＋ＣＤ２５−Ｔ細胞、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔ細胞、ＣＤ４＋ＣＤ２５−Ｔ細胞／ ＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔ細胞比を検定することは、癌治療におけるマーカーとして有用であり、新規な意義を提供するものであり、ガン治療における画期的な成果を達成するものであることを確認した。
【００３５】
【図面の簡単な説明】
【図１】ＣＤ８＋ＰＥＲ＋とＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔ細胞の相関を示す。
【図２】ＩＬ−１２とＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔ細胞の相関を示す。
【図３】ＩＦＮγとＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔ細胞の相関を示す。
【図４】ＩＬ−１０とＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔ細胞の相関を示す。
【図５】ＣＤ４＋ＣＤ２５＋とＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＴＧＦβ＋の相関を示す。
【図６】ＣＤ４＋ＣＤ２５−Ｔ細胞とＩＦＮγの相関を示す。
【図７】ＣＤ４＋ＣＤ２５−とＣＤ４＋ＣＤ２５−ＩＦＮγ＋の相関を示す。
【図８】ＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔ細胞が３０％以上の症例を示す。[0001]
TECHNICAL FIELD OF THE INVENTION
The present invention relates to the provision of a novel means for measuring CD4 + CD25-T cells and / or CD4 + CD25 + T cells and judging the effectiveness of the immunotherapy.
[0002]
[Prior art]
In the selection of a substance useful for the prevention or treatment of cancer (malignant neoplasms) (cancer), its direct action on cancer cells has conventionally been emphasized. Although immunostimulants were found to be useful for treating cancer, all of the compounds obtained as immunostimulants had weak anticancer effects, and were not treated with immunotherapy alone or in combination with chemotherapy. A sufficient therapeutic effect of cancer has not been achieved.
[0003]
The present inventor's medical doctor, Yagida, first focused on the usefulness of a substance that induces interleukin 12 (IL-12) in vivo as an epoch-making technique in cancer treatment. They discovered that they have that function and established a cancer treatment that could be called a novel immunotherapy for cancer (NITC). Conventionally, IL-12 has an anticancer effect, but there is a fact that if IL-12 itself is directly administered into a living body, a patient cannot tolerate the treatment due to side effects. Could not be used. However, the preparation containing a processed mushroom mycelium reported by Yagida achieved a remarkable healing / life extension effect in the treatment of cancer. That is, Yagida achieved the purpose of treating cancer by administering an effective amount of a processed mushroom mycelium capable of inducing IL-12 in vivo (Japanese Patent Application Laid-Open No. 10-139670).
[0004]
IL-12 has an effect of activating and enhancing killer T cells through the route of TNFα → IFNγ → IL-12 → CTL activity. That is, enhancement of IL-12 production is expected to have an anticancer effect due to activation and enhancement of killer T cells.
[0005]
Yagida reports that activation of NKT cells, apart from a system for enhancing IL-12 production, is useful for anticancer effects. Taniguchi et al. Discovered a specific glycolipid antigen recognized by a specific T cell antigen receptor (TCR) called Vα24Vβ11 possessed by NKT cells, and reported that this antigen was α-galactosylceramide. Furthermore, it was demonstrated that NKT cells were activated in cancer-bearing mice to which α-galactosylceramide was administered, and metastasis was suppressed, although cancer disappearance was not observed.
It has been reported that NKT cells include the NK cell antigen receptor (NKR-P1; natural killer receptor P1) as another receptor (special issue: Basic and clinical aspects of NKT cells: the latest medicine, vol. 55, No. 4). 2000 pp. 818-823). Yagida has found that NKR-P1 is also involved in the activation of NKT cells, and this activation has a more superior anticancer effect.
[0006]
It has been reported that NK cells are also involved in the anticancer activity of the living body. However, the activity of NK cells has not been correlated with the clinical anticancer effect. Has been shown by Yagida to show a complete inverse correlation, and the involvement of NK cells in anticancer activity in humans has been questioned.
[0007]
[Problems to be solved by the invention]
An object of the present invention is to measure CD4 + CD25-T cells and / or CD4 + CD25 + T cells, analyze the meaning of the assay of each measurement result, and complete a new immunotherapy.
[0008]
[Means for Solving the Problems]
[0009]
That is, the present invention
1. A means for examining cancer that measures CD4 + CD25 + T cells and determines that they act suppressively on activated killer T cells.
2. A means for examining cancer that measures CD4 + CD25-T cells and determines that they are acting on CTL activation.
3. Means for determining the efficacy of cancer treatment by measuring the ratio of CD4 + CD25-T cells / CD4 + CD25 + T cells.
4. A method for screening an immunotherapeutic agent for cancer, comprising examining the ratio of CD4 + CD25-T cells / CD4 + CD25 + T cells, and determining that the cancer is effective with the superiority of CD4 + CD25-T cells.
5. A commercial medium in which the information according to any one of the preceding items 1 to 3 is carried on a medium utilizing the law of nature.
6. A commercial method using the commercial medium according to item 5 above.
Consists of
[0010]
BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION
Hereinafter, the present invention will be described in detail.Unless defined otherwise, technical and scientific terms used herein are commonly used by those skilled in the art to which this invention belongs. Have an understood meaning.
[0011]
The present inventor's medical doctor, Dr. Yagida's cancer immunotherapy is a therapeutic means consisting of combining four different mechanisms of action.
The first mechanism of action is a method of reducing the cancer by administering an angiogenesis inhibitor (better shark) to impair the blood flow to the cancer. This effect can be determined by measuring vascular endothelial cell growth factor (VEGF). The angiogenesis inhibitory effect can be evaluated by a negative value of the VEGF value (−VEGF). The use of other vascular growth factors such as FGF and HGF instead of this VEGF value can also evaluate the ability to inhibit angiogenesis. In addition, the evaluation can be performed by using a positive value of an angiogenesis inhibitor instead of VEGF (for example, an endostatin value).
[0012]
Another mechanism of action is a method of activating CTL by inducing Th1 cytokines (TNFα, IFNγ, IL-12) by administering a compound having a β1,3 glucan structure. The CTL activity can be determined by CD8 (+) perforin-producing ability. The CD8 (+) perforin level includes cytotoxic T cells (CTL) and immunosuppressive T cells (STC; Suppressor T cell). Yes, the former damages cancer cells, and the latter affects cancer growth. Therefore, it cannot be evaluated with its absolute value. However, the former is a CTL if IFNγ is 10 IU / ml or more or an IL-12 value is 7.8 pg / ml or more, and is determined to be STC if IFNγ and IL-12 are low. Therefore, the CTL activity can be evaluated based on the ability to produce IFNγ (IFNγ value) or the ability to produce IL-12 (IL-12 value).
[0013]
The effector cells activated by administration of the compound having the α1,3 glucan structure, which is the third and fourth mechanism of action, are NK cells and NKT cells. The NK and NKT cells share NKR-P1 (NK cell receptor CD161 (+)), and the former can measure the number of NK cells with the surface marker of CD3 (-) CD161 (+). Activation can be determined by the ability to produce CD3 (-) CD161 (+) perforin. On the other hand, the latter NKT cells can be measured with CD3 (+) CD161 (+) and the number of the cells can be measured, and NKT cell activation can be measured by its perforin-producing ability.
[0014]
The present invention relates to the correlation between the clinical results and the ability to activate NK cells, the ability to activate NKT cells, the ability to inhibit angiogenesis, the ability to induce and produce IL-12, and the ability to induce and produce IFNγ. -By examining the kinetics of T cells and / or CD4 + CD25 + T cells. As a new immunotherapy (NITC), the present inventor used a compound having a α1,3 glucan structure, a compound having a β1,3 glucan structure and an angiogenesis inhibitory substance (shark cartilage) in cancer patients in combination with IL. -12, various cytokines such as IFNγ, CD4 + CD25-T cells, and CD4 + CD25 + T cells were measured. As a result, it was found that CD4 + CD25-T cells and CD4 + CD25 + T cells were measured and their ratios were examined, and that using them as markers was significant as a means for testing cancer.
[0015]
CD25 is the interleukin 2 (IL-2) receptor α-chain. Recently, it has been found that among helper T cells Th (CD4), there are CD25 (+) and CD25 (−) cells. It is known that CD4 + CD25 + T cells play an important role in the pathogenesis of autoimmune diseases. However, it is unclear what effect it has on cancer immunotherapy.
[0016]
In this study, we examined how these cells are involved in 65 patients undergoing new immunotherapy and found that CD4 + CD25-T cells are related to CTL activation and closely related to the effects of cancer immunotherapy. And the ratio of CD4 + CD25-T cells / CD4 + CD25 + T cells was found to be dominant in CD4 + CD25-T cells and closely related to the effects of cancer immunotherapy.
[0017]
Based on the finding of this significance, the measurement of CD4 + CD25-T cells, CD4 + CD25 + T cells, and the ratio of CD4 + CD25-T cells / CD4 + CD25 + T cells can be applied to a useful method for screening for a CTL activator. It has also been found that it is possible to specify a novel β1,3 glucan having CTL activating ability.
[0018]
Such information becomes a useful commercial medium if it is carried on a medium utilizing the laws of nature, and the commercial medium provides a useful commercial method.
[0019]
In the present invention, the CTL activator (IL-12 production inducer, INFγ production inducer) is formulated into a formulation capable of inducing or enhancing its activation and further maintaining its activation, using the result of the measurement method of the present invention as an index. Used. That is, based on the index, a dose capable of inducing or enhancing its activation and further maintaining the activation, and an administration period are selected and used. Specifically, the dose of the compound having a β-1,3 glucan structure, which is a CTL activator (IL-12 production inducer, INFγ production inducer), is about 1 g to 10 g / day, preferably 3 g. ６6 g / day. In addition, the administration period is generally 10 days to 24 months, and the administration frequency is 1 to 3 times / day, preferably daily administration. The CTL activator (IL-12 production inducer, INFγ production inducer) is preferably taken orally. Of course, parenteral ingestion (including intravenous or intramuscular administration, etc.) is also possible by reducing the dosage and preparing them to a quality that can be tolerated parenterally.
[0020]
The measurement was performed using the blood of a cancer patient, and blood cells were discriminated as positive or negative for cell surface antigens CD4 and CD25, and the ratio of each cell was determined by a Two Color test using flow cytometry as usual. It was measured.
[0021]
(Preparation of sample for measuring cytokine)
First, a mononuclear cell fraction is separated and prepared from blood. Heparinized peripheral blood is diluted two-fold with phosphate buffered saline (PBS) and mixed, then overlaid on Ficoll-Conray solution (specific gravity 1.077) and centrifuged at 400 G for 20 minutes. After sedimentation, the mononuclear cell fraction is collected. After washing, RPMI-1640 medium supplemented with 10% fetal bovine serum (FBS) is added to adjust the number of cells to 1 × 10 6 . Phytohemagglutinin (manufactured by DIFCO) was added to 200 μl of the obtained cell suspension at a concentration of 20 μg / ml, and the cells were cultured in a 96-well microplate in the presence of 5% CO 2 at 37 ° C. for 24 hours. This is used as a sample for measuring cytokines in the cultured cell solution.
[0022]
(Measurement of IL-12)
Although the clinical and biochemical tests known per se can be used for the measurement of the amount of IL-12, a measurement kit based on enzyme immunoassay (ELISA) available from R & D SYSTEMS or MBL is used. Here, a measurement kit from R & D SYSTEMS was used. Actually, 50 μl of the assay diluent Assay Diluent RD1F and 200 μl of the standard solution (standard) or the sample prepared in Example 1 were dispensed into each well of the 96-well microplate, and then allowed to stand at room temperature for 2 hours. Allowed to react for hours. Thereafter, horseradish peroxidase (HRP) -labeled anti-IL-12 antibody was dispensed in 200 μl portions and left at room temperature for 2 hours. After removing the reaction solution in each well and washing three times, 200 μl of the chromogenic substrate solution was dispensed, and the mixture was allowed to stand at room temperature for 20 minutes, and then 50 μl of the enzyme reaction stop solution was dispensed. Using 550 nm as a control, the absorbance of each well at 450 nm was measured by Emax (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.). The amount of IL-12 is expressed as pg / ml. Here, the ability to induce IL-12 production refers to a function of enhancing the amount of IL-12 produced by stimulation of the peripheral blood mononuclear cell fraction to 7.8 pg / ml or more, or an IL-12 level before administering a certain substance. 12 means a function to enhance the production amount.
[0023]
(Measurement of IFNγ)
The measurement of IFNγ was performed using BioSource Europe S.D. The enzyme immunoassay (EIA method) was used for measurement using an IFNγ EASIA kit manufactured by KK. Actually, 50 μl of a standard solution or a two-fold diluted sample prepared above was dispensed into each well of a 96-well microplate, and 50 μl of the HRP-labeled anti-IFN-γ antibody was dispensed and shaken. For 2 hours at room temperature. After removing the reaction solution in each well and washing three times, 200 μl of the chromogenic substrate solution was dispensed, reacted at room temperature for 15 minutes while shaking, and 50 μl of the enzyme reaction termination solution was dispensed. Using 630 nm as a control, the absorbance of each hole at 450 nm and 490 nm was measured by Emax (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.). IFNγ amounts are expressed as IU / ml.
[0024]
(Measurement of perforin-producing cells)
For lymphocytes in peripheral blood, the proportion of cells positive for CD8, which is a cell surface antigen, and positive for perforin is measured by a Three Color test using flow cytometry in a usual manner. Specifically, a fixative is added to the collected blood to fix the cells, a membrane permeate is added, an anti-perforin antibody (Pharmingen) is added, and a reaction is performed. Further, a PRE-Cy5-labeled secondary antibody (DAKO) is added. And then reacting by adding an anti-CD8 antibody, and then measuring by flow cytometry.
【Example】
Hereinafter, the present invention will be described specifically with reference to Examples, but the present invention is not limited to the Examples.
[0025]
Embodiment 1
Patients were administered IL-X (East and West Pharmaceuticals), shark cartilage (Seishin Enterprise), and saccharides having an α1,3 structure according to each recommended regimen. The relationship between the induction-producing ability of IL-12, the induction-producing ability of IFNγ, and the contribution of CD4 + CD25-T cells, CD4 + CD25 + T cells, and perforin-producing cells was analyzed for the treated patient groups.
[0026]
FIG. 1 shows the correlation between CD4 + CD25 + T cells and CD8 + perforin-producing cells (CD8 + PER +).
All cases (65 cases), CR (healing) (n = 17), PR (partial healing) (n = 14), LNC (no long term cancer growth) (n = 8), SNC (short term cancer growth no) (N = 7), PD (ineffective) (n = 14), and first visit (n = 5) showed an inverse correlation.
This fact indicates that CD4 + CD25 + T cells are acting suppressively on activated killer T cells.
[0027]
The correlation between CD4 + CD25 + T cells and IL-12 was examined and is shown in FIG. The correlation between IL-12 and CD4 + CD25 + T cells shows a loose positive correlation as a whole. In addition, CR (n = 17 cases), PR (n = 14 cases), and LNC (n = 8 cases) tended to show a positive correlation, respectively. On the other hand, a tendency of inverse correlation was observed in SNC (n = 7 cases) and PD (n = 14 cases).
[0028]
The correlation between CD4 + CD25 + T cells and IFNγ is shown in FIG. Similarly to IL-12, IFNγ also showed a positive correlation between CR, PR and LNC, and SNC and PD cases showed a reverse correlation. This fact suggests that, in an effective example, the Th1 cytokine may act by resisting immunosuppression of CD4 + CD25 + T cells. Further, it is suggested that CD4 + CD25 + T cells act in a suppressive manner in cases where the Th1 cytokine level is high in SNC and PD cases, and that CD4 + CD25 + T cells act in an immunosuppressive manner in cases where the Th1 cytokine level is low. In an effective example, it is considered that the Th1 cytokine overcomes CD4 + CD25 + T cells and the immune activity, that is, CD8 + perforin + T cells are working.
On the other hand, in the ineffective cases, it is considered that either the Th1 cytokine level is low or either one of CD4 + CD25 + T cells acts immunosuppressively.
[0029]
The correlation between IL-10 and CD4 + CD25 + T cells is shown in FIG. In all cases, IL-10 and CD4 + CD25 + T cells showed a positive correlation, and all showed a positive correlation except for LNC (n = 8). This fact suggested that in the case of NITC treatment, both IL-10 and CD4 + CD25 + T cells worked immunosuppressively.
[0030]
It is also possible that CD4 + CD25 + T cells produce TGFβ and act immunosuppressively. Therefore, when the correlation between these cells and CD4 + CD25 + TGFβ + T cells was examined, a positive correlation was shown. This fact suggests that these CD4 + CD25 + T cells may produce TGFβ having a strong immunosuppressive action and act in a suppressive manner (FIG. 5).
[0031]
CD4 + CD25-T cells are thought to produce IL-2 and IFNγ to activate killer T cells (CD8 + T cells). Therefore, FIG. 6 shows the correlation between IFNγ and CD4 + CD25-T cells. A positive correlation was observed between CD4 + CD25-T cells and IFNγ.
[0032]
Next, among CD4 + CD25-T cells, the correlation between IFNγ-producing cells (CD4 + CD25-IFNγ +) and IFNγ also showed a positive correlation (FIG. 7).
The correlation between CD4 + CD25-T cells and CD4 + CD25-IFNγ + T cells also showed a positive correlation.
[0033]
The ratio was compared between effective cases and ineffective cases in cases where CD4 + CD25 + T cells showed 30% or more, that is, cases in which CD8 + cells were strongly suppressed (FIG. 8).
The former was 20.5%, while the latter invalid case showed a significant difference of 47.6% (p <0.05). That is, it was confirmed that CD4 + CD25 + T cells suppressed CD8 + perforin-producing cells, and acted suppressively in NITC-treated cases.
[0034]
In addition, the ratio of CD4 + CD25-T cells / CD4 + CD25 + T cells was compared with 39 cases of effective cases (CR + PR + LNC) and 21 cases of invalid cases (SNC + PD), and the effective cases showed high values (p <0.01). This fact suggests that a cut-off value of 30% that works for immunosuppression of CD4 + CD25 + T cells is appropriate.
【The invention's effect】
According to the above results, assaying CD4 + CD25-T cells, CD4 + CD25 + T cells, CD4 + CD25-T cells / CD4 + CD25 + T cell ratios is useful as a marker in cancer treatment and provides a novel meaning, and It was confirmed that it achieved a breakthrough in treatment.
[0035]
[Brief description of the drawings]
FIG. 1 shows the correlation between CD8 + PER + and CD4 + CD25 + T cells.
FIG. 2 shows the correlation between IL-12 and CD4 + CD25 + T cells.
FIG. 3 shows the correlation between IFNγ and CD4 + CD25 + T cells.
FIG. 4 shows the correlation between IL-10 and CD4 + CD25 + T cells.
FIG. 5 shows the correlation between CD4 + CD25 + and CD4 + CD25 + TGFβ +.
FIG. 6 shows the correlation between CD4 + CD25-T cells and IFNγ.
FIG. 7 shows the correlation between CD4 + CD25− and CD4 + CD25−IFNγ +.
FIG. 8 shows a case where CD4 + CD25 + T cells are 30% or more.
